МОЛЕКУЛСКА АНАЛИЗА НА ПОЛИМОРФИЗМОТ НА КИР ГЕНИТЕ И АЛЕЛИТЕ ВО РЕПУБЛИКА МАКЕДОНИЈА

Медицински факултет, Универзитет Св. Кирил и Методиј, Институт за имунобиологија и хумана генетика, Скопје, Република Македонија МОЛЕКУЛСКА АНАЛИЗА НА ПОЛИМОРФИЗМОТ НА ГЕНИТЕ И АЛЕЛИТЕ ВО РЕПУБЛИКА МАКЕДОНИЈА Асистент д-р Александар Петличковски -докторска теза- Скопје, ноември 2012 година

КРАТЕНКИ КПУ, клетки природни убијци, (Killer cell Immunoglobulin-like Receptors), имуноглобулиновидни рецептори на клетките природни убијци ИФН, интерферон ТНФ, тумор некротизирачки фактор ГМ-КСФ, гранулоцитно-моноцитен колонии стимулирачки фактор ИЛ-2, интерлеукин 2 ЦТЛ, цитотоксичен Т лимфоцит КД, кластер на диференцијација ХЛА, хумани леукоцитни противгени РАГ, гени активитори на рекомбинација ЛРК, леукоцитен рецепторски комплекс Мб, мегабази, 1000 нуклеотидни бази ХУГО, организација за хуманиот геном ИТИМ, имунорецепторен тирозински инхибиторен мотив ИТАМ, имунорецепторен тирозински акивирачки мотив ДНК, дезоксирибонуклеинска киселина АРДС, акутен респираторен дистрес синдром CURB-65, правило за клиничка проценка на болни со пневмонија врз основа на конфузност, уреа>7ммол/л, респираторна фреквенција > 30, систолен притисок < 90 мм и дијастолен притисок < 60 мм и возраст > 65 години ЦНС, централен нервен систем Г-КСФ, гранулоцитен колонии стимулирачки фактор ССП, секвенцно специфични прајмери (започнувачи) ПВР, полимеразно верижна реакција Ф, фреквенција ГФ, генска фреквенција НП, неврамнотежена поврзаност НФ, набљудувана фреквенција ПФ, предвидена фреквенција, пресметана според: ПФ=1- (1-Ф) С.Д., стандардна девијација Д a, класичен коефициент на неврамнотежена поврзаност Д, стандардизиран коефициент на неврамнотежена поврзаност СГД, стандардна генетска дистанца ТКС, трансплантација на коскена срцевина РКПД, реакција на калем против домаќин АМЛ, акутна миелобластна леукемија АЛЛ, акутна лимфобластна леукемија ЦМЛ, хронична миелоидна леукемија ЦЛЛ, хронична лимфоцитна леукемија АБ, акутна болест КР, комплетна ремисија ПМК, периферни матични клетки BU-CY, бусулфан циклофосфамид FLAG-IDA, флударабин, цитарабин, идарубицин и гранулоцитен-колониистимулирачки фактор М, мелфалан 2

ИЗВАДОК Имуноглобулиновидните рецептори на клетките природни убијци (KIR, Killer cell Immunoglobulin-like Receptors) се површински клеточни молекули, важни во регулацијата на активноста на клетките природни убијци и некои видови на Т клетки. Тие дејствуваат преку интеракција со лиганди кои се наоѓаат на целните клетки по што се создава активациски или инхибиторен сигнал. Постои екстензивно различие во генскиот локус. Во оваа докторска дисертација беше поставено за цели да се утврди фреквенцијата на гените и генотиповите во популации од Република Македонија и да се испитаат евентуални асоцијации (позитивни и негативни) помеѓу поединечни гени и/или генотипови и избрани болести. Беа анализирани вкупно 421 ДНК примероци од несродни, доброволни, здрави дарители од Македонската банка за хумана ДНК (214 Македонци, 104 Албанци и 103 Роми), 63 пациенти со потврдена инфекција со пандемска инфлуенца предизвикана од Х1Н1 вирусот, 4 пациенти со инфекција со Западно- Нилски вирус и 63 пациенти со хематолошка малигна болест и 24 доброволни дарители на коскена срцевина. Сите 16 гени беа откриени во македонската популација со различни фреквенции, а беа типизирани вкупно 56 различни генотипови, од кои четрнаесет нови генотипови кои се пријавени и вклучени во базата www.allelefrequencies.net. Споредбата на генските фреквенции помеѓу Албанците и Македонците од Република Македонија открива статистички значајна разлика за 2ДЛ1 (П=0,001) и 2ДС4 (П=0,050). Во албанската популација беа откриени вкупно 45 различни генотипови, од кои 5 нови (необјавени) генотипови од групата Бх. Споредбата на генските фреквенции помеѓу Ромите и Македонците од Република Македонија открива статистички значајни разлики во фреквенцијата на KИР3ДЛ1 (П=0,038) и KИР2ДС1 (П=0,011). Во ромската популација беа откриени вкупно 35 различни генотипови, од кои 6 нови (необјавени) генотипови од групата Бх. Споредбата пак на генските фреквенции кај сите пациенти со Х1Н1 инфекција и здравите контроли откри статистички значајна разлика за 2ДЛ1 (Ф=1 во групата пациенти, а Ф=0,994 во групата контроли, П=0.045). Дури 3 од 4-те пациенти со тешка форма на вирусен енцефалит предизвикан од Западно-Нилскиот вирус, имаа ист генотип (Бх71), додека еден имаше генотип Бх89. Споредбата на фреквенциите помеѓу 63 хематолошки пациенти и здравите Македонци откри статистички значајна разлика за 3ДЛ2 рамковниот ген (Ф=1 во контролната група, а Ф=0,95 кај пациентите, П=0,001). Кога беше издвоена хомогена група од 39 пациенти со акутна миелоидна леукемија, 2ДС1 и 2ДС5 беа статистички значајно почести кај пациентите (П=0.002 и П=0,005, соодветно). Статистички значајна разлика беше откриена за фреквенцијата на Бх3 и Бх439 и двата почести во групата хематолошки пациенти отколку во котролната група (П= 0.017 и П= 0.009, соодветно). При споредба на фреквенциите за 16-те анализирани гени во паровите прмател-дарител со 214 здрави македонски испитаници, откриена е статистички значајна разлика за 2ДС1 кој беше значително почест во групата на сите дарители (П=0.004), а особено во подгрупата од 13 дарители во чии парови беше забележана реакција на калем против домаќин (П=0.002). Овие резултати може да се користат во антрополошки студии, но може да помогнат и во разјаснување на влијанието на молекулите во развојот/исходот на вирусни инфекции, како и нивната поврзаност со развојот на хематолошки малигни болести и исходот на трансплантацијата на коскена срцевина. Клучни зборови: генски полиморфизам, ССП генотипизирање, македонска популација, албанска популација, ромска популација, Х1Н1 пандемска инфлуенца, Западно-Нилски вирус, асоцијациска студија, хематолошка малигна болест, трансплантација на коскена срцевина, реакција калем против домакин, Република Македонија. 3

ABSTRACT The killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR) are surface molecules important for regulation of the activity of natural killer (NK) cells and some subsets of T cells. They act through interaction with ligands found on target cells producing activating or inhibitory signal. An extensive diversity exists in the KIR gene locus. In this PhD thesis we have set an aim to determine the KIR gene and genotype frequencies in different populations from Republic of Macedonia and to analyze eventual associations (both positive and negative) between certain KIR genes/genotypes and selected diseases. Тotal of 421 DNA samples from unrelated volunteer healthy donors from the Macedonian human DNA bank (214 Macedonians, 104 Albanians and 103 Roma), 63 patients with confirmed infection with H1N1 pandemic influenza virus, 4 patients infected with West Nile encephalitis virus and 63 patients with haematological malignancy, and 24 volunteer donors of bone marrow were analyzed. All the 16 KIR genes were determined in the Macedonian population, аnd total of 56 different KIR genotypes were genotyped in the Macedonian population, of which 14 new genotypes that were referred to the database www.allelefrequencies.net. The comparison of KIR gene frequencies between Albanians and Macedonians living in Republic of Macedonia reveals statistically significant difference for КIR2DL1 (p=0.001) and КIR2DS4 (p=0.050). Total of 45 different KIR genotypes were found in the studied Albanian population, of which five new. The comparison of KIR gene frequencies between Roma and Macedonians from Republic of Macedonia reveals statistically significant difference for KIR3DL1 (p=0.038) and KIR2DS1 (p=0.011). Total of 35 different КIR genotypes were found in the Roma population, of which six were new. The comparison of KIR gene frequencies between patients with H1N1 infection and healthy controls from Republic of Macedonia reveals statistically significant difference for КIR2DL1 (F=1 in the patients group, and F=0.994 in the controls group, p=0.045). As much as 3 of the 4 patients with severe form of encephalitis caused by the West Nile virus, had the same KIR genotype (Bх71), while the fourth patient had genotype Bх89. The comparison of KIR gene frequencies between 63 haеmatological patients and healthy Macedonians reveals statistically significant difference for the КIR3DL2 framework gene (F=1 in the control group, and F=0.95 in patients group, p=0.001). When we analyzed only patients with acute myeloid leukemia, we have found the KIR2DS1 and KIR2DS5 genes to be significantly more frequent in patients than in controls. Statistically significant difference was found for the frequencies of Bх3 and Bх439 both present more often in the group of haematological patients then the control group (p= 0.017 and p=0.009, respectively). When comparing the frequencies of the 16 analyzed KIR genes in the pairs patient-donor with 214 healthy Macedonians, a statistically significant difference was found for КIR2DS1 which was more frequent in the group of sibling donors (p=0.004), and especially frequent in the subgroup of 13 donors from pairs where severe graft versus host reaction was seen (p=0.002). These results may be used in anthropological studies, but can also be helpful in clarification of the impact of the KIR molecules in the development and/or progression of the viral infections, and their association with the haematological malignant diseases and the course of the transplantation of bone marrow. Keywords: КIR gene polymorphism, SSP genotyping, Macedonian population, Albanian population, Roma population, H1N1 pandemic influenza, West Nile encephalitis virus, association study, haematological malignant disease, bone marrow transplantation, graft versus host reaction, Republic of Macedonia. 4

СОДРЖИНА ИЗВАДОК ABSTRACT 1. ВОВЕД 1.1. генски локус 1.2. генска организација 1.3. Номенклатура на гените 1.4. хаплотипови 1.5. Прикажување на молекулите 1.6. лиганди 1.7. и болести кај луѓето 2. ЦЕЛИ НА ИСТРАЖУВАЊЕТО 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ 3.1. Примероци 3.1.1.Популациски студии 3.1.1.1. Македонска популација 3.1.1.2. Популација на македонски Албанци 3.1.1.3. Популација на македонски Роми 3.1.2. Асоцијациски студии 3.1.2.1.Пандемска инфлуенца предизвикана од Х1Н1 вирусот 3.1.2.2. Асоцијација на гените со Западно-Нилски вирус 3.1.2.3. Асоцијација на гените со хематолошки малигни болести 3.2. Методи 3.2.1. ДНК примероци 3.2.2. генотипизирање 3.2.3. Статистичка анализа 4. РЕЗУЛТАТИ 4.1. Популациски студии 4.1.1. Македонска популација 4.1.1.1. генски фреквенции 4.1.1.2. Неврамнотежена поврзаност 4.1.1.3. Генотипски фреквенции 4.1.1.4. Генетски дистанци и филогенетско дрво 4.1.1.5. Складирање на резултатите од генотипизирањето на 4.1.2. Албанска популација 4.1.2.1. генски фреквенции 4.1.2.2. Неврамнотежена поврзаност 4.1.2.3. Генотипски фреквенции 4.1.3. Ромска популација 4.1.3.1. генски фреквенции 4.1.3.2. Неврамнотежена поврзаност 4.1.3.3. Генотипски фреквенции 5

4.2. Асоцијациски студии 4.2.1. Асоцијација на KИР гените со инфлуенца А (Х1Н1 инфекција) 4.2.1.1. генски фреквенции 4.2.1.2. Неврамнотежена поврзаност 4.2.1.3. генотипски фреквенции 4.2.2. Асоцијација на гените со Западно-Нилски вирус 4.2.2.1. генски фреквенции 4.2.2.2. Генотипски фреквенции 4.2.3. генски полиморфизам кај пациенти со хематолошки малигни болести 4.2.3.1. генски фреквенции 4.2.3.2. генотипски фреквенции 4.2.4. Асоцијација на гените со реакција на калем против домаќин кај хематолошки пациенти со трансплантирана коскена срцевина (ТКС) од сродни дарители 5. ДИСКУСИЈА 5.1. Популациски студии 5.2. Асоцијациски студии 6. ЗАКЛУЧОЦИ 7. ЛИТЕРАТУРА 6

1. ВОВЕД Имуноглобулиновидните рецептори на клетките природни убијци (KIR, Killer cell Immunoglobulin-like Receptors) се површински клеточни молекули, важни во регулацијата на активноста на клетките природни убијци (КПУ) и некои видови на Т клетки. Тие дејствуваат преку интеракција со лиганди кои се наоѓаат на целните клетки по што се создава активациски или инхибиторен сигнал. За прв пат нивната повраност со специфичната цитолиза од страна на КПУ била идентификувана кон крајот на 80-тите и почетокот на 90-тите години на минатиот век (1, 2). КПУ се важна компонента на вродениот имун систем. Тие учествуваат во раниот одговор кон заразени или малигно трансформирани клетки преку создавање на цитокини како на пример ИФН-гама, ТНФ-алфа и ГМ-КСФ, но не ИЛ-2 и/или директна цитотоксичност (3-7). Тие ја контролираат виралната репликација за време на првите 5-7 дена од инфекцијата, додека се активираат, пролиферираат и диференцираат прекурсорите на цитотоксичните Т лимфоцити (ЦТЛ) во функционални ЦТЛ. Цитотоксичните Т лимфоцити стапуваат во интеракција со комплексот ХЛА класа 1-пептид на целната клетка преку Т-клеточниот рецептор и доколку пептидот биде препознаен како туѓ, започнуваат цитолитичка активност. Овој механизам на уништување на заразени или трансформирани клетки може да биде заобиколен со надолното регулирање на прикажувањето на ХЛА класа 1 молекулите, но од друга страна, намаленото ниво на класа 1 молекулите на површината на сопствена клетка води до деструкција на клетката од страна на КПУ (8-10). Фенотипски, КПУ се КД3-, КД2+ КД16+, КД56+, КД14- и КД19- клетки. Врз основа на густината на прикажани КД56 и КД16 молекули, КПУ припаѓаат на два подвида, кои се 7

разликуваат според нивниот потенцијал за пролиферација, функционалните карактеристики, одговорот на различни цитокини, како и претежната локализација. Значително позастапен во крвта (околу 90%) е подтипот со КД3-, КД56 бледо и КД16+. Овој подтип е со поизразена цитотоксичност, прикажува средно афинитетни рецептори кон ИЛ-2 и повисоко ниво на. Другиот подтип е КД56 силно, КД16- и има помал капацитет за цитотоксичност, но поголем капацитет за создавање цитокини (11, 12). Иако сеуште не е познат деталниот начин на активирање на КПУ, општо е прифатено дека нормалните клетки се заштитени од убивање од страна на ЦТЛ или КПУ со прикажување на соодветен лиганд за инхибиторен рецептор на цитотоксичната клетка (Слика 1.1). КПУ Активирачки рецептор Инхибиција Инхибирачки рецептор ХЛА класа 1 молекула Здрава клетка КПУ Активирачки рецептор Активација Инхибирачки рецептор Лиганд ХЛА класа 1 молекула Променета клетка Слика 1.1. Здравите клетки се заштитени од цитотоксичното дејство на КПУ со прикажување соодветен ХЛА лиганд 8

Притоа, забележана е фенотипска доминација на -посредуваната инхибиција над активацијата на КПУ (13-16). Со откривањето на, расветлена е дополнителна функција на ХЛА класа 1 молекулите. Денес се знае дека одредени класа 1 ХЛА алели преку интеракција со инхибиторни изотипови ги штитат здравите клетки од цитолиза посредувана од КПУ, додека пак други изотипови ја стимулираат активноста на КПУ. Од тука произлегува важната улога на во регулацијата на имуниот одговор, како и поврзаноста помеѓу одредени гени и развојот и текот на некои болести (17-19). Најважните функции на КПУ кај човекот се сумирани подолу: 1. КПУ се многу важни за одбрана на домаќинот од вирусни инфекции, внатреклеточни паразити и малигни трансформации: тие ги препознаваат клетките инфицирани од вирус и ги убиваат без претходна сензибилизација со нивните противгениј. Покрај директното убивање, КПУ секретираат и противмикробни пептиди наречени алфа-дефензини. Слично како и активираните Т клетки, КПУ можат да создаваат интерферон-гама, кој го попречува размножувањето на вирусите. ИФН-гама е исто така моќен активатор на макрофагите, а ја помага и диференцијацијата на наивните КД4+ Т клетки во ефекторни помагачки Т клетки од тип 1 (20). Со ова, покрај раниот моментен ефект, КПУ го засилуваат и помагаат и специфичниот Т лимфоцитен одговор кој следува покасно. 2. Покрај нивната улога како ефекторни клетки во вродниот имун систем, КПУ имаат и имунолошко паметење. Иако точниот механизам не е потполно расветлен, постојат докази за постоење на имунолошка меморија кај глувци со нокаутирани РАГ гени кои немаат ни Т ни Б лимфоцити (21). Оваа релативно ново-откриена способност на КПУ отвора нови можности и нови стратегии за вакцинација и развивање на имунолошко паметење кон патогени и/или тумори. 9

3. Во последните 10-тина години интензивно се испитува улогата на КПУ во бременоста. Денес се знае дека е неопходна интеркација на мајчините КПУ со феталниот екстравилозен трофобласт за да се ремоделира васкулатурата на матката и да се обезбеди потребниот проток на крв за фетусот. Неуспешна или недоволна рана инвазија на трофобластот и/или отсуство на ремоделирање на спиралните артерии на матката доведува до нарушено крвоснабдување на плацентата и потенцијално, до пре-еклампсија. Оваа состојба се јавува во третиот триместер од бременоста (после 20-та гестациска недела) и е една од најчестите причини за предвремено породување. Последниве неколку години, неколку истражувачки групи ја испитуваат хипотезата дека хиперреактивност на КПУ би можела да е причина за повторувачки (три или повеќе) абортуси (22-24). Некои од нив покажуваат дека жени со повторувачки абортуси имаат значително зголемен број на КПУ кои прикажуваат активирачки, споредено со нормални, фертилни жени (24). Сепак, овие податоци не се потврдени од сите истражувачки групи (25, 26). 4. Покажано е дека КПУ имаат значајна улога во контролирањето на малигна трансформација на туморски и леукемични клетки во клеточни култури, како и на животински модели (27). Во многу убедлива студија Koh et al. покажале дека блокирањето на интеракцијата помеѓу инхибирачките и нивните ХЛА лиганди, ја зголемува против-туморската активност на КПУ и ја засилува контролата на туморскиот раст кај глувци (28). Уште еден важен аспект на ХЛА/ компатибилноста е поврзаноста со процентот на успех во терапијата на некои хематолошки болести со трансплантација на хематопоетски клетки (29, 30). 10

1.1. генски локус Од откривањето на гените, повеќе студии го испитуваат и потврдуваат екстензивното различие во генскиот локус, кое потекнува од постоењето на повеќе гени, како и повеќе алелски варијанти за различните гени (31), од што произлегува многу мала веројатност за постоење на ист генотип кај случајно избрани несродни индивидуи (32). генскиот комплекс се наоѓа на хромозомот 19ку13.4, во рамките на леукоцитниот рецепторен комплекс (ЛРК) со големина од 1 Мб. Тој содржи фамилија на полиморфни, високо хомологни гени (Слика 1.2). 19п13.3 19п13.2 19п13.12 19п13.11 19п11 19ку11 19ку12 19ку13.12 19ку13.2 19ку13.32 19ку13.4 19ку13.43 ~1Мб DAP CD66 FcGRT SIGLEC LILR LAIR LILR FcαR NCR1 ~150Kб 3ДЛ3 2ДЛ3 2ДП1 2ДЛ1 Слика 1.2. Локацијата на генскиот комплекс со големина од 1 Мб на хромозомот 19ку13.4, во рамките на леукоцитниот рецепторен комплекс (ЛРК). 3ДП1 2DL4 3ДЛ1 2ДС4 3ДЛ2 1.2. генска организација Егзон-интрон структурата на различните гени е прилично конзистентна со следнава шема: сигналната секвенца е кодирана од првите 2 егзони, секој имуноглобулински домен (Д0, Д1 или Д2, почнувајќи од аминокрајот) е кодиран од посебен егзон (егзоните 3-5, соодветно), поврзувачкиот (линкерот) и трансмембранскиот регион се повторно кодирани од поединечни 11

егзони (егзон 6 и егзон 7), а цитоплазматскиот домен е кодиран од двата последни егзони (егзони 8 и 9) (33-35) (Слика 1.3). Егзон 1 Егзон 2 Егзон 3 Егзон 4 Егзон 5 Егзон 6 Егзон 7 Егзон 8 Егзон 9 Тип 1 2ДЛ (2ДЛ1-3) 34 36 282 300 294 51 102/105 53 177 Тип 1 2ДС (2ДС1-5) 34 36 282 300 294 51 105 53 42 Тип 2 2Д (2ДЛ4/5) 34/40 36 285 294 51 105 53 270 34 36 285 300 294 51 105 53 177/210 3ДЛ1/2 3ДС1 34 36 285 300 294 51 105 53 8 34 36 285 300 294 105 53 126 3ДЛ3 34 0/36 285 300 294 3ДП1 34 36 282 299 294 51 105 53 177 2ДП1 Лидер Д0 домен Д1 домен Д2 домен Стебло Трансмембрански Цитоплазматски Слика 1.3. генска организација. гените се групирани според нивната структурна организација, а специфичните гени се прикажани поединечно. Кодирачките региони на егзоните се прикажани како сини правоаголници, а нивната големина изразена преку број на базни парови е прикажана над нив. Псевдоегзонот 3 и делетираниот егзон 2 од 3ДП1 се прикажани со црвена боја. Во заграда, во долниот дел на сликата е прикажано кој протеински домен или регион го кодира соодветниот егзон. Должината на гените во геномската ДНК варира од 4 до 16 Кб, а може да содржат 4 до 9 егзони. Според нивните структурни карактеристики, гените се класифицирани во три групи: 1) тип 1 2Д гени, кои кодираат протеини со два надворклеточни домени и имаат Д1 и Д2 конформација; 2) тип 2 2Д гени кои исто така кодираат протеини со два надворклеточни домени, но имаат Д0 и Д2 конформација; и 3) 3Д гени кои кодираат три надворклеточни, имуноглобулиновидни домени (Д0, Д1 и Д2) (36). Инхибиторните гени 12

откриени до сега, ги вклучуваат 2ДЛ1, 2ДЛ2/3 (алели), 2ДЛ4, 2ДЛ5a, 2ДЛ5б, 3ДЛ1 и 3ДЛ2 (37, 38). Откриени се шест активирачки гени и тие ги вклучуваат 2ДС1-5 и 3ДС1. Додека сите активирачки гени претставуваат независни локуси на хромозомот, 3ДС1 претставува алелска варијанта на 3ДЛ1 и кодира активирачки рецептори со кратки опашки (37). Малку е необично прикажувањето на 2ДЛ4; тој не се прикажува клонално врз КПУ како останатите инхибиторни (39). Тој се прикажува на сите КПУ кај човек и има карактеристики и на активирачки и на инхибиторен рецептор. Реагира со ХЛА-Г (некласичен ХЛА класа 1 противген). 1.3. Номенклатура на гените До денес се идентификувани 15 различни прикажани гени, а постојат два различни системи за нивно именување. Почесто користениот систем за номенклатура (систем според организацијата на хуманиот геном или ХУГО систем) ја отсликува нивната протеинска структура и содржи 4 главни подподелби направени врз основа на две карактеристики: бројот на екстраклеточните домени (2Д или 3Д) и постоење на карактеристична секвенца во цитоплазматската опашка (инхибиторна - ИТИМ или активаторна - ИТАМ). Вториот систем за именување се базира на приближниот центромернотеломерен редослед на гените во хромозомот 19, а ознаките припаѓаат на КД номенклатурата (на пр, КД158а, КД158б итн.). Вториот систем на именување е помалку прифатен бидејќи не ја отсликува структурата, функцијата, прикажувањето, ниту пак локализацијата на гените (40). 13

Првиот опишан 2ДЛ протеин Долга (long) цитоплазматска опашка Два имуноглобулиновидни домени Акроним Член на третата серија на 2ДЛ1 протеини Се разликува од останатите 2ДЛ1*003 протеини по синонимна ДНК замена во кодирачки реигон Се разликува од другите 2ДЛ1*00302 алели по ДНК замена во некодирачки регион 2ДЛ1*0030202 Слика 1.4. Номенклатура на гените. Следејќи го успехот на номенклатурата користена за именување на ХЛА алелите и алелите од генскиот систем се именувани на сличен начин. По името на генот, одделено со звездичка следи бројот на алелот. Првите 3 цифри укажуваат на алели кои се разликуваат во протеинските секвенци. Следните 2 цифри се користат да се разликуваат алели кои се разликуваат во синонимни (некодирачк) разлики во кодирачката секвенца. Крајните 2 цифри одредуваат алели кои се разликуваат по замени во интрон, промотор или други некодирачки региони на секвенцата. 1.4. хаплотипови Содржината на гените варира од човек до човек, слично како и ХЛА гените. За различието на гените клучни се 2 механизми: 1. гените се високо полиморфни; 2. Постојат различни хаплотипови кои содржат различни гени. Генерално, опишани се две групи на хаплотипови: А и Б (31,40,41). Сите хаплотипови на нивниот центромерен крај, се ограничени со 3ДЛ3, а на нивиниот теломерен крај со 3ДЛ2, заедно со 3ДП1 и 2ДЛ4. Ова ја сочинува т.н. генска рамка, која во различни хаплотипови е дополнета со различни гени. (33, 42, 43) Според последната хаплотипска дефиниција (14-та Интернационална работилница за ХЛА и имуногенетика, 2005) хаплотипот А ги содржи 3ДЛ3, 2ДЛ3, 2ДП1, 2ДЛ1, 3ДП1, 2ДЛ4, 3ДЛ1, 2ДС4 и 3ДЛ2 гените, додека сите останати хаплотипови се опишуваат како хаплотип Б. 14

Хаплотиповите од група А се помалку варијабилни. Тие не содржат активирачки гени, освен 2ДС4. Хаплотиповите од група Б пак, содржат различен број на гени кои ги нема во група А хаплотиповите (на пр. 2ДС1, 2ДС2, 2ДС3, 2ДС5, 3ДС1 и 2ДЛ5). На хаплотиповите од оваа група често (но не секогаш) им недостасува 2ДС4. Логично, Б хаплотиповите се со многу поголемо различие и во однос на генската содржина и во однос на алелскиот полиморфизам (44) (Слика 1.5). Центромер Теломер 3ДЛ1 3ДЛ 2ДЛ 2ДС 2ДЛ 2ДЛ5 2ДС 2ДП 2ДЛ 3ДП 2ДЛ 2ДЛ5 2ДС 2ДС 2ДС 3ДС1 3ДЛ Хаплотип А 3ДЛ3 2ДЛ3 2ДЛ1 3ДП 2ДЛ4 3ДЛ1 2ДС4 3ДЛ2 Хаплотип Б 3ДЛ3 2ДС 2ДЛ2 2ДЛ1 3ДП 2ДЛ4 3ДС1 2ДЛ5А 2ДС 2ДС1 3ДЛ2 Слика 1.5. Распоред и содржина на различни гени кај хаплотип А и хаплотип Б. 1.5. Прикажување на молекулите Секоја клетка задолжително прикажува барем еден инхибиторен рецептор, кој би овозможил преживување на клетката и би можел да компензира евентуално отсуство на соодветна -лиганд комбинација (45-48). Сите познати гени (со исклучок на нул-алелите и веројатно 3ДЛ3) се прикажуваат на површината на клетките. Кај хетерозиготни индивидуи, КПУ клоновите може да прикажат еден, два или ниеден од 3ДЛ1 и 3ДЛ2 гените, но вообичаено ги прикажуваат и двата алела на 2ДЛ4 (49). Бидејќи гените се наследуваат независно од ХЛА гените, можно е прикажување на молекули за кои не е присутен ХЛА лиганд (45, 50, 51), како и прикажување на кај индивидуи со многу мало прикажување на ХЛА класа 1 (52) (Слика 1.6). 15

ген Рецептор Егзон 1 Сигнален пептид Егзон 2 Егзон 3 Д0 Егзон 4 Д1 Егзон 5 Д2 Егзон 6 Егзон 7 Стебло Плазматска мембрана Егзон 8 Егзон 9 Цитоплазматска опашка Слика 1.6. Шематски претставен прикажан рецептор врз површината на клетката 1.6. лиганди Дво-доменските молекули ги препознаваат и се врзуваат за ХЛА-Ц молекулите врз клетките на домакинот. Овие можат да припаѓаат на група 1 или група 2, во зависност од присуството на аспарагин или лизин соодветно, на позиција 80 во аминокиселинската секвенца. Така, 2ДЛ2 и 2ДЛ3 ги препознаваат ХЛА-Ц1 молекулите (ХЛА-Цв *01, *03, *07, *08, *12, *13, *14 и *1601/4 ). Од друга страна, 2ДЛ1 и неговите алелски варијанти кодираат рецептор кој ги препознава ХЛА-Ц2 молекулите (ХЛА-Цв*02, *04, *05, *06, *15, *1602, *17 и *18 ). На ваков начин, било која позната ХЛА-Ц молекула би требало да биде препозната или од 2ДЛ1 или од 2ДЛ2/3 рецептор (49-53). Интересно е што афинитетот за врзување на соодветните лиганди варира помеѓу различните -ови. Така, 2ДЛ1 се врзува за ХЛА-Ц2 со висок афинитет, додека 2ДЛ3 се врзува за соодветните ХЛА-Ц1 лиганди со релативно слаб афинитет. Овие варијации во афинитетот имаат и 16

функционална импликација: доколку човек е хомозигот за ХЛА-Ц2 и прикажува 2ДЛ1, неговите КПУ би биле под многу построга контрола/инхибиција, спордено со човек кој е хомозигот за ХЛА-Ц1 и прикажува 2ДЛ3 (38, 49, 50, 54, 55). Аналогно на дво-доменските молекули, три-доменските 3ДЛ1 и 3ДС1 се врзуваат за ХЛА-Бв4 молекулите кои имаат изолеуцин на позиција 80 во аминокиселинската секвенца, а се врзуваат релативно слабо за ХЛА-Бв4 молекулите кои имаат треонин на истата позиција (56, 57). Останува отворено прашањето за постоење други ХЛА и не-хла лиганди за многу од рецепторите, но генерално важи дека активирачките рецептори се врзуваат за соодветните ХЛА лиганди релативно послабо, споредено со инхибирачките рецептори. би можеле да влијаат на развојот на КПУ (58) имплицирајќи некаква форма на селекција на рецепторскиот репертоар на КПУ. За време на зреењето на КПУ, секвенционалното прикажување на би можело да обезбеди самотолеранција (59, 60). Клоналното прикажување на одреден подтип на кај КПУ е стабилно во тек на времето и е доминантно одредено од генотипот, со многу мало влијание од страна на ХЛА (32). може да се прикажуваат на αβ- и γδ- Т клетките и се карактеристични за памтечките KД8+ клетки, каде би можеле да го модифицираат повторниот одговор кон одреден противген (62-65). Инхибицијата на активноста на Т клетките преку би овозможила секундарен одговор да се појави само доколку опасноста е доволно сериозна/голема. Понатаму, прикажувањето на инхибиторни од Т клетките за време на активен одговор би можеле да помогнат на цитолитичките Т клетки да останат фокусирани на инфицираните клетки (62). Присуство на активирачки на Т клетки и/или отсуство на соодветен инхибиторни би можеле да 17

доведат до прекумерно оштетување на сопствени клетки (66), како што и аберантното прикажување на инхибиторни на Т клетки може да е причина за неефикасно отстранување на променети или инфицирани клетки (62). 1.7. и болести кај луѓето Генетските студии кои ги проучуваат гените се движат главно во две насоки: се испитуваат и споредуваат фреквенциите на гените и хаплотиповите во различни популации и; се прават асоцијациски студии во кои се споредуваат фреквенциите на различни гени и/или хаплотипови помеѓу здрави испитаници и пациенти со различни болести. До денес, асоцијациските болести главно се фокусирани на вирусни и автоимуни болести. Според општо прифатениот модел на поврзаност на со некои болести, кај индивидуите со -ХЛА комбинации (на пр. хомозиготи за 2ДЛ1 и ХЛА-Ц ЛИЗ80 и без активирачки гени) има доста строга инхибиција на КПУ која веројатно ќе спречи развој на автоимуна болест. Од друга страна, овие индивидуи би можеле да страдаат од прееклампсија и веројатно ќе бидат посклони кон вирусни инфекции, како и туморски процеси. Индивидуите пак, со -ХЛА комбинации (на пр. 2ДЛ3 и ХЛА-Ц АСП80, со еден или повеќе активирачки гени), покажуваат послаба инхибиција на КПУ и затоа веројатно поефикасно ги контролираат вирусните инфекции и малигните трансформации. Затоа пак, кај овие индивидуи е можна почеста појава на автоимуни болести, како и повторувачки спонтани абортуси. Претпоставките кои произлегуваат од овој модел, барем делумно имаат своја поткрепа во поновите асоцијациски студии (66-71). 18

2. ЦЕЛИ НА ИСТРАЖУВАЊЕТО Цели на оваа докторска теза се: 1. Да се утврди фреквенцијата на гените и алелите во македонската популација од Република Македонија; 2. Да се утврди фреквенцијата на гените и алелите во албанската популација од Република Македонија; 3. Да се утврди фреквенцијата на гените и алелите во ромската популација од Република Македонија; 4. Да се утврдат фреквенциите на А и Б генотиповите во испитаните популации и евентуално откриените нови (необјавени) генотипови да се пријават во базата за генотипови: allelefrequencies.net; 5. Да се утврди соодносот помеѓу и ХЛА-Ц лигандите во испитуваната популација; 6. Да се испитаат евентуални асоцијации (позитивни и негативни) помеѓу поединечни гени и/или генотипови со избрани болести (инфекција со вирус на грип од типот Х1Н1, инфекција со Западно-Нилски вирус, хематолошки малигни болести) ; 7. Да се испита евентуална поврзаност на гените и/или генотиповите со реакција на калем против домаќин кај пациенти со хематолошка малигна болест, трансплантирани со хематопоетски клетки од сродни, ХЛА идентични дарители. 19

3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ 3.1. Примероци 3.1.1.Популациски студии Беа анализирани вкупно 421 ДНК примероци од несродни, доброволни, здрави дарители од Македонската банка за хумана ДНК (214 Македонци, 104 Албанци и 103 Роми) (72). 3.1.1.1. Македонска популација Студијата на македонска популација вклучи 214 здрави доброволни испитаници, жители на различни региони од Македонија, За сите испитаници вклучени во оваа студија, услов беше македонска националност на директните претходници, во најмалку три претходни генерации, што беше утврдено со интервју еден на еден за секој поединечен испитаник. 3.1.1.2. Популација на македонски Албанци Во популациското испитување на албанската популација во Република Македонија беа вклучени 104 здрави доброволни испитаници кои не беа во крвно срдоство, жители на различни региони од Македонија (Гостивар, Скопје, Тетово). За сите испитаници вклучени во оваа студија, услов беше албанска националност на директните претходници, најмалку три генерации на назад, што беше утврдено со индивидуално интервју со секој поединечен испитаник. Индивидуи со само еден родител од албанска националност не беа вклучени во студијата. 3.1.1.3. Популација на македонски Роми Ромската популација беше анализирана на примерок од 103 здрави доброволни несродни испитаници, жители на различни региони од Македонија (Гостивар, Скопје, Кочани). За сите испитаници вклучени во оваа студија, услов беше ромска националност на директните претходници, најмалку три генерации 20

на назад, што беше утврдено со индивидуално интервју со секој поединечен испитаник. Индивидуи со само еден родител од ромска националност не беа вклучени во студијата. 3.1.2. Асоцијациски студии 3.1.2.1.Пандемска инфлуенца предизвикана од Х1Н1 вирусот Во оваа студија беа вклучени 63 несродни пациенти (38 машки и 25 женски) со лабораториски потврдена пандемска инфлуенца предизвикана од инфекција со Х1Н1 вирусот. Од консекутивните пациенти примени на Клиниката за инфективни болести во периодот декември 2009 март 2010 година, беа селектирани само оние со тежок тек на болеста (со неопходна потреба од механичка вентилација). Пациентите понатаму беа поделени во две подгрупи, група на многу тешко болни и група на помалку тешко болни. Болните беа дефинирани како многу тешко критични болни ако: развиле дисфункциски синдром на повеќе органи (Н=3), им бил дијагностициран акутен респираторен дистрес синдром (АРДС) (Н=6), имале менингоенцефалитис (Н=3), или според клиничките, рендгенските параметри или CURB-65 резултат > 3 биле класифицирани како пациенти со поголем ризик за смртен исход (Н=19). Од оваа група 12 пациенти завршиле со летален исход. 3.1.2.2. Асоцијација на гените со Западно-Нилски вирус Во оваа студија беа анализирани 4 последователни пациенти (3 машки и 1 женско) со лабораториски потврдена инфекција со Западно-Нилски вирус. Пациентите биле задржани на лекување на Клиниката за инфективни болести во периодот септември-октомври 2011 година, заради тешка форма на болеста со засегање на ЦНС. 21

3.1.2.3. Асоцијација на гените со хематолошки малигни болести Во оваа студија беа испитани 63 пациенти со хематолошка малигна болест, хоспитализирани на Клиниката за хематологија во периодот 2001-2011 година. Од нив, 39 имале акутна миелоидна леукемија (61,9%), 12 (19,04%) имале хронична миелоидна леукемија, 8 (12,7%) имале акутна лимфобластна леукемија, 2 (3,17%) имале нон-хоџкин лимфом, и по 1 пациент (1,59%) имале апластична анемија и хронична лимфоцитна леукемија. Во тек на нивното лекување, а со цел планирање на тераписка трансплантација на коскена срцевина, тие и нивните сродни, доброволни дарители на коскена срцевина беа упатени на ИИБХГ заради ХЛА типизација. Од оваа група, 24 пациенти (16 со акутна миелоидна леукемија (66,7%), 4 (16,7%) со хронична миелоидна леукемија, 3 (12,5%) со акутна лимфобластна леукемија и 1 (4.16%) со хронична лимфоцитна леукемија) со трансплантирана коскена срцевина од сроден ХЛА идентичен дарител, беа понатаму анализирани заедно со нивните дарители за евентуална поврзаност на гените со појавата на реакција калем-против-домаќин. Како извор на хематопоетски клетки беа користени периферни матични клетки или аспират од коскената срцевина на дарителите. Просечно биле инфундирани 3,24x10 6 /кг т.т. КД34+ клетки. Дваесет од овие пациенти биле кондиционирани со миелоаблативен хемо-тераписки режим бусулфан-циклофосфамид, а 4 биле припремени со не-миелоаблативен третман кој вклучувал флударабин, цитарабин, идарубицин и Г-КСФ кај тројца, односно флударабин-мелфалан кај еден пациент. Заради хетерогеноста на групата пациенти со хематолошка болест, хомогената група која вклучуваше 39 пациенти со акутна миелоидна леукемија беше посебно издвоена и анализирана. 22

3.2. Методи 3.2.1. ДНК примероци. ДНК беше изолирана од периферните бели крвни клетки со користење на методот на фенол-хлороформска екстракција (73) (Слика 3.1). Примероците на крв беа земани од доброволните дарители и од пациентите по потпишување на писмена согласност за дарување и складирање на ДНК примерок. Изолираните ДНК примероци се складирани во Македонската банка за хумана ДНК. А Г Б ВД В Ѓ Слика 3.1. Изолација на ДНК од периферна крв со фенолхлороформска екстракција: А) Плакнење на полната крв со ретикулоцитен раствор; Б) Аспирирање на плазма; В) Издвоени бели крвни клетки; Г) Екстракција на клеточните протеини со фенол; Д) Издвојување на водената фаза која ја содржи ДНК; Ѓ) Преципитирање ДНК 3.2.2. - генотипизирање: За одредување на генотипот беше користен комерцијално достапан комплет од Dynal Biotech, (Pel-Freez Clinical Systems, Brown Deer, WI, USA), кој базира на полимеразно верижна амплификација со користење на секвенцно специфични започнувачи (ССП метод). Комплетот започнувачи ги амплифицира гените опишани од интернационалниот Комитет за номенклатура на Светската здравствена организација (СЗО). Овој комплет за генотипизирање е дизајниран да го детектира присуството или отсуството на поединечните гени. Се користат специфични започнувачи за амплификација на геномска ДНК во плочки со 96 бунарчиња. Тие се претходно распоредени во бунарчињата, а дополнително се 23

смешуваат и додаваат реакциски пуфер, ДНК од испитаникот и ДНК полимераза. Потоа плочките кои ја содржат комплетната смеша, топлотно се циклираат под следните услови: иницијална денатурација од 5 минути на 95 C, следена од 30 циклуси на денатурација (20 секунди на 94 C), анилирање (20 секунди на 63 C) и елонгација (90 секунди на 72 C) (Слика 3.2). Слика 3.2. Полимеразно-верижна реакција во PTC-100 (MJ Research) апарат за топлотно циклирање. Условите за циклирање беа: Иницијална денатурација на 95 C, 30 циклуси на денатурација (20 секунди на 94 C), анилирање (20 секунди на 63 C) и елонгација (90 секунди на 72 C) По завршувањето на циклирањето, ПВР продуктите беа аплицирани на 2% агарозен гел со 0,5 мкг/мл финална концентрација на етидиум бромид за електрофоретско раздвојување и идентификување на специфичните амплификати (Слика 3.3А и 3.3Б). По завршената електрофореза, гелот се фотографира и резултатот од генотипизирањето се толкува со употреба на работен лист (Слика 3.4). 24

Слика 3.3A. Припремање на 2% агарозен гел обоен со етидиум бромид Слика 3.3Б. Аплицирање на продуктите од ПВР и фотографирање на резултатот Сите ПВР реакции содржеа внатрешна позитивна контрола, која се состои од дополнителен пар на започнувачи специфични за генот на хормонот за раст, а во секоја реакција беше вклучена и негативна контрола. Како позитивни за одреден ген (присутен ген) беа типизирани примероците со присутен амплификат со очекувана големина. Примероците беа типизирани како негативни за специфичен ген, кога беше отсутен амплификат со очекуваната големина во присуство на амплификат за генот на хормонот за раст (внатрешната контрола) (Слика 2.4). За проверка на методот, неколку типизирања по случаен избор беа повторени по период од неколку месеци и резултатите секогаш се совпаѓаа. 25

Слика 2.4. Лево. Формулар за документација на гелот. Горе. Формулар за читање и толкување на резултатите од електрофорезата на секој поединечен примерок. 3.2.3. Статистичка анализа: За анализа на молекулскиот полиморфизам на локусите беше користен статистичкиот пакет за популациски анализи Арлекин верзија 2000 (Лабораторија за генетика и биометрија, Универзитет во Женева, Швајцарија) (74). Беше анализирана фреквенцијата на гените и генотиповите од генскиот систем кај здравите испитаници и пациентите. Присуството на одреден ген (фреквенција = Ф) беше добиено со директно броење. Генската фреквенција (ГФ) беше пресметана според формулата ГФ=1- (1-Ф), при што бевме свесни за ограничувањето на оваа формула при пресметувањето на ГФ за гени со ниска фреквенција. Вредностите за неврамнотежена поврзаност (НП) за асоцијации помеѓу два локуси беа пресметани со користење на 2 2 табели. Бидејќи НП не е независна од алелските фреквенции, беа пресметани нормализирани вредности на НП. Назначувањето на генотиповите беше направено со користење на алатка од веб-базираната база на податоци: www.allelefrequencies.net (Слика 3.5). Споредбите на фреквенциите на гените и/или генотиповите, како и тестирањето на значајност во отстапувањата беа направени со помош на χ2 тест. Како 26

статистички значајни отстапувања се сметаа вредностите на П помали од 0,05. Сите пресметки беа правени во интервал на доверба од 95%. Слика 3.5. Веб - база за назначување на генотипови www.allelefrequencies.net. Allele frequency net: a database and online repository for immune gene frequencies in worldwide populations. Gonzalez-Galarza FF, Christmas S, Middleton D and Jones AR Nucleic Acid Research 2011, 39, D913-D919. 27

4. РЕЗУЛТАТИ 4.1. Популациски студии 4.1.1. Македонска популација 4.1.1.1. генски фреквенции Присуството и отсуството на 16-те гени за македонските испитаници е прикажано на Табела 4.1. Сите 16 гени беа откриени во Македонската популација, а рамковните гени 3ДЛ3, 2ДЛ4 и 3ДЛ2 беа присутни кај сите испитаници. Фреквенциите на останатите гени беа следни: 2ДЛ1 (94%), 2ДЛ2 (59%), 2ДЛ3 (89%), 2ДЛ5 (41%), 3ДЛ1 (93%), 2ДП1 (98%), 2ДС1 (48%), 2ДС2 (56%), 2ДС3 (36%), 2ДС4 (94%), 2ДС5 (30%), 3ДС1 (39%) и 3ДП1 (99,5%) (Табела 4.1). Taбела 4.1: Набљудувани и предвидени генски фреквенции за македонска популација (Н = 214). генски фреквенции за македонска популација (Н = 214) Псевдогени Инхибирачки Активирачки 2ДП1 3ДП1 2ДЛ1 2ДЛ2 2ДЛ3 2ДЛ4 2ДЛ5 3ДЛ1 3ДЛ2 3ДЛ3 2ДС1 2ДС2 2ДС3 2ДС4 2ДС5 3ДС1 НФ 0.98 0.995 0.949 0.589 0.897 1 0.416 0.939 1 1 0.481 0.565 0.360 0.944 0.304 0.392 С.Д. на НФ 0.009 0.005 0.015 0.034 0.021 0 0.034 0.016 0 0 0.034 0.034 0.033 0.16 0.031 0.033 ПФ 0.86 0.90 0.76 0.36 0.67 1 0.24 0.74 1 1 0.28 0.34 0.20 0.76 0.17 0.22 НФ, набљудуваната фреквенција е добиена со директно броење; С.Д. на НФ, стандардна девијација на набљудуваната фреквенција; ПФ, предвидена фреквенција, пресметана според формулата ПФ=1- (1-Ф) 4.1.1.2. Неврамнотежена поврзаност Класичниот коефициент на неврамнотежена поврзаност (Д а ), стандардизираниот коефициент на неврамнотежена поврзаност (Д ), како и статистичката значајност (П) се прикажани во Табела 4.2. Гените кои беа присутни кај сите испитаници не беа вклучени во анализата. Паровите од локуси со статистички значајна неврамнотежена поврзаност (позитивна или негативна) се прикажани во Табела 4.3. 28

Табела 4.2: Анализа на неврамнотежената поврзаност во локусите во македонска популација 2ДС2 2ДЛ2 2ДЛ3 2ДП1 2ДЛ1 3ДП1 3ДЛ1 3ДС1 2ДЛ5 2ДС3 2ДС5 2ДС1 2ДС4 2ДС2 2ДЛ2 2ДЛ3 2ДП1 2ДЛ1 3ДП1 3ДЛ1 3ДС1 2ДЛ5 Д a 0.2278-0.0447-0.0447-0.0081-0.0177-0.0020-0.0077 0.0304 0.0779 0.1190 0.0198 0.0316 Д 0.9799-1.0000-1.0000-1.0000-0.7908-1.0000-0.2920 0.1782 0.4312 0.7609 0.1504 0.1511 р 2 0.8725 0.0881 0.0881 0.0146 0.0260 0.0036 0.0042 0.0158 0.1017 0.2501 0.0076 0.0163 П <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0767 0.0182 0.3795 0.3409 0.0662 <0.0001 <0.0001 0.2027 0.0620 Д -0.0423-0.0077-0.0165-0.0019-0.0110 0.0399 0.0822 0.1153 0.0314 0.0390-0.0090 Д -1.0000-1.0000-0.7789-1.0000-0.4388 0.2473 0.4808 0.7789 0.2517 0.1973-0.3920 р 2 0.0800 0.0133 0.0230 0.0033 0.0087 0.0276 0.1150 0.2382 0.0193 0.0252 0.0064 П <0.0001 0.0916 0.0266 0.4022 0.1725 0.0151 <0.0001 <0.0001 0.0421 0.0202 0.2427 Д 0.0168 0.0134 0.0042 0.0031-0.0157-0.0227-0.0424-0.0108-0.0113-0.0011 Д 1.0000 0.2907 1.0000 0.0569-0.2517-0.3775-0.6450-0.1513-0.2113-0.1894 р 2 0.1662 0.0400 0.0410 0.0018 0.0112 0.0229 0.0848 0.0060 0.0055 0.0002 П <0.0001 0.0034 0.0031 0.5318 0.1209 0.0268 <0.0001 0.2566 0.2774 0.8192 Д 0.0131 0.0046-0.0011-0.0067-0.0016 0.0067-0.0037-0.0003-0.0010 Д 0.7365 1.0000-1.0000-0.5885-0.1440 1.0000-0.2819-0.0360-1.0000 р 2 0.1906 0.2465 0.0012 0.0102 0.0006 0.0107 0.0035 0.0000 0.0011 П <0.0001 <0.0001 0.6076 0.1394 0.7304 0.1301 0.3889 0.9398 0.6227 Д -0.0002 0.0156-0.0172-0.0207 0.0091-0.0171-0.0173 0.0158 Д -1.0000 0.3225-0.5510-0.6887 0.4947-0.4777-0.6495 0.3258 р 2 0.0003 0.0871 0.0255 0.0361 0.0075 0.0283 0.0246 0.0968 П 0.8155 <0.0001 0.0196 0.0054 0.2066 0.0138 0.0217 <0.0001 Д -0.0003-0.0028 0.0019 0.0017 0.0014 0.0022-0.0003 Д -1.0000-1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000-1.0000 р 2 0.0003 0.0073 0.0033 0.0026 0.0020 0.0044 0.0003 П 0.7988 0.2124 0.3977 0.4524 0.5079 0.3344 0.8070 Д -0.0276-0.0215-0.0109-0.0330-0.0315 0.0480 Д -0.7467-0.6049-0.2791-0.7790-1.0000 0.9113 р 2 0.0558 0.0332 0.0090 0.0900 0.0697 0.7628 П 0.0005 0.0077 0.1661 <0.0001 0.0001 <0.0001 Д 0.1311 0.0690 0.1284 0.1522-0.0294 Д 0.5720 0.3159 0.6961 0.7475-0.8628 р 2 0.2969 0.0868 0.3271 0.3891 0.0684 П <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0001 Д 0.1074 0.1027 0.1223-0.0234 Д 0.5109 0.5786 0.5668-0.7147 р 2 0.2060 0.2051 0.2465 0.0426 29

П <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0025 Д -0.0065 0.0605-0.0079 2ДС3 Д -0.0593 0.3240-0.2190 р 2 0.0009 0.0636 0.0051 П 0.6673 0.0002 0.2977 Д 0.1482-0.0297 2ДС5 Д 0.9407-0.7606 р 2 0.4160 0.0788 П <0.0001 <0.0001 Д -0.0291 2ДС1 Д -1.0000 р 2 0.0640 П 0.0002 Д a, Класичниот коефициент на неврамнотежена поврзаност го мери отстапувањето од случајната поврзаност помеѓу алелите во различни локуси; Д, Стандардизиран коефициент на неврамнотежена поврзаност; р 2, друг начин за стандардизирање на едноставна мерка за неврамнотежено поврзување; П, статистичка значајност. 30

Taбела 4.3. Парови на локуси кои покажуваат статистички значајна неврамнотежена поврзаност (НП) (п<0.05) во македонската популација локус Позитивна НП Негативна НП 2ДС2 2ДЛ2, 2ДС3, 2ДС5, 3ДП1 2ДЛ3, 2ДП1 2ДЛ2 2ДС2, 3ДС1, 2ДЛ2, 2ДС3, 2ДС5, 2ДС1 2ДЛ3, 2ДЛ1 2ДЛ3 2ДП1, 2ДЛ1, 3ДП1 2ДС2, 2ДЛ2, 2ДЛ5, 2ДС3 2ДП1 2ДЛ3, 2ДП1, 3ДП1 2ДС2 2ДЛ1 2ДЛ3, 2ДП1 2ДЛ2 3ДП1 2ДЛ3, 2ДП1 2ДС2 3ДЛ1 2ДЛ1 3ДС1, 2ДЛ5, 2ДС5, 2ДС1, 2ДС4 3ДС1 2ДЛ2, 2ДЛ5, 2ДС3, 2ДС5, 2ДС1 2ДЛ1, 3ДЛ1, 2ДС4 2ДЛ5 2ДЛ2, 3ДС1, 2ДС3, 2ДС5, 2ДС1 2ДЛ3, 2ДЛ1, 3ДЛ1, 2ДС4 2ДС3 2ДС2, 2ДЛ2, 3ДС1, 2ДЛ5, 2ДС1 2ДЛ3 2ДС5 2ДС2, 2ДЛ2, 2ДС1, 2ДЛ5, 2ДС1 2ДЛ1, 3ДЛ1, 2ДС4 2ДС1 2ДЛ2, 2ДС1, 2ДЛ5 2ДЛ1, 3ДЛ1, 2ДС4 4.1.1.3. Генотипски фреквенции генотиповите, групите и идентификацијата на генотиповите, како и бројот на индивидуи и процентот на застапеност на секој откриен генотип се прикажани во Табела 4.4. Во испитуваната популација се откриени вкупно 56 различни генотипови. Откриен е само еден генотип од групата АА (генотип со идентификација 1) и тоа кај 46 индивидуи (21.5%), 33 генотипови од групата АБ и 22 генотипови од групата ББ. Најчести генотипови во групата АБ се генотиповите со идентификација 4 (кај 27 индивидуи или 12,62%) и 2 (кај 11 индивидуи или 5,14%). Најчести генотипови во групата ББ беа генотип 73 (2,34%) и генотип 71 (1,87%). Најдовме пет нови (претходно необјавени во базата www.allelefrequencies.net) генотипови од групата АБ и девет нови генотипови од групата ББ. Сите тие се пријавени и вклучени во споменатата база (Табела 4.4). 31

Табела 4.4. Типизираните профили ( генотипови) и бројот на индивидуи кои го имаат секој поединечен профил. Група Генотип 3ДЛ1 2ДЛ1 2ДЛ3 2ДС4 2ДЛ2 2ДЛ5 3ДС1 2ДС1 2ДС2 2ДС3 2ДС5 2ДЛ4 3ДЛ2 3ДЛ3 2ДП1 3ДП1 AA 1 46 21,50 АБ 2 11 5,14 АБ 3 4 1,87 АБ 4 27 12,62 АБ 5 8 3,74 АБ 6 8 3,74 АБ 7 6 2,80 АБ 8 2 0,93 АБ 9 5 2,34 АБ 10 1 0,47 АБ 11 6 2,80 АБ 13 6 2,80 АБ 14 3 1,40 АБ 15 9 4,21 АБ 16 1 0,47 АБ 18 2 0,93 АБ 19 1 0,47 АБ 23 1 0,47 АБ 28 1 0,47 АБ 33 1 0,47 АБ 62 3 1,40 АБ 63 2 0,93 АБ 200 1 0,47 АБ 202 3 1,40 АБ 205 1 0,47 АБ 233 5 2,34 АБ 260 2 0,93 АБ 268 1 0,47 АБ 319 2 0,93 АБ 336 нов 1 0,47 АБ 370 нов 3 1,40 АБ 371 нов 1 0,47 АБ 372 нов 1 0,47 АБ 373 нов 2 0,93 ББ 69 2 0,93 ББ 70 2 0,93 ББ 71 4 1,87 ББ 72 1 0,47 ББ 73 5 2,34 ББ 76 2 0,93 ББ 87 1 0,47 ББ 90 2 0,93 ББ 113 1 0,47 ББ 159 1 0,47 ББ 294 1 0,47 ББ 317 3 1,40 ББ 318 1 0,47 ББ 359 нов 1 0,47 ББ 363 нов 1 0,47 ББ 374 нов 1 0,47 ББ 375 нов 1 0,47 ББ 376 нов 1 0,47 ББ 377 нов 3 1,40 ББ 378 нов 1 0,47 ББ 379 нов 1 0,47 ББ 380 нов 1 0,47 Темните полиња означуваат присутен, а светлите полиња отсутен ген. Идентификацијата на генотиповите се однесува на класификацијата според www.allelefrequencies.net Индивидуи 32 %

4.1.1.4. Генетски дистанци и филогенетско дрво За споредба на генските фреквенции и анализа на генетската дистанца, беа користени податоци за генскиот полиморфизам објавени и достапни во базата http://www.allelefrequencies.net. Бројот на анализирани гени депонирани во оваа база се разликува помеѓу популациите, во зависнот од методто кој е користен за типизирање. Во нашата студија беа вклучени оние популации за кои постоеја комплетни податоци за 14 различни гени. Според овој критериум, од вкупно 82 популации, беа селектирани 33 популации. Врз основа на споредбата на генските фреквенции беше конструирано филогенетско дрво (Слика 4.1) кое ја отсликува поврзаноста и соодносите на македонската популација со другите популации користени во споредбата. Најблиска генетска дистанца е забележана помеѓу македонската популација и шпанска популација од регионот Гранада (СГД=0,00), додека како генетски најдалечни се прикажуваат популациите од Јужно-Африканското племе Ксоза (СГД=4,33) и Мексиканските староседелци од племето Тарахумара (СГД=4,04). Популациите од Оман, Либан, Белгија, Шпански Гваделупе, Сенегал и Ксоза се групирани во ист кластер, на долниот дел од филогенетското дрво. На спротивниот крај од дрвото, се наоѓаат Индусите од Северна Индија, Карачи Пакистанците и Јужно-Азијците во еден подкластер, а заедно со Азијати од Западна Англија, бела популација од Југо-Источен Бразил, Романци, Баски и белци од Западна Англија, Француски Реунион, Македонија и Шпанска Гранада. Останатите популации се групирани во средниот кластер (Слика 4.1). 33

Индуси од Северна Индија Пакистанци од Карачи Јужно-Азијати Азијати од Западна Англија Белци од Југо-Источен Бразил Романци Местицо од Вера Круз Мексико Баски Бела популација од Западна Англија Француски Реунион Македонија Шпанска Гранада Северна Ирска Африканци Афрокарибијци од Западна Англија Италија Франција Аргентина Финска Хонг Конг Кореа Јапонија Местицо Хуикол Пурепека Тарахумара Шведска Оман Либан Белгија Гваделупе Сенегал Јужно-Афричка Ксоза 0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 Слика 4.1: Филогенетско дрво од генетските дистанци базирано на генските фреквенции на македонската и 32 други популации. 34

4.1.1.5. Складирање на резултатите од генотипизирањето на Добиените резултати за испитуваната македонска популација беа пријавени, прифатени и објавени во интернет базата www.allelefrequencies.net, од каде се слободно достапни за секој заинтересиран и регистриран научник. За новите генотипови кои за првпат се откриени во нашата популација Слика 4.2. Складирани резултати за гени/генотипови од македонска популација во интернет базата www.allelefrequencies.net 35