ΑΣΚΗΣΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΙ Τίτλος Εργαστηριακής Άσκησης: Προσδιορισμός Σχετικής Μοριακής Μάζας (Μ r ) Πρωτεΐνης με την Xρησιμοποίηση Φασματομετρίας Μάζας Ηλεκτροψεκασμού (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) Εισαγωγή Πρώτος ο John Fenn το 1984 ανέδειξε τη δυνατότητα χρησιμοποίησης της φασματομετρίας μάζας ηλεκτροψεκασμού (electrospray ionization - mass spectrometry, ESI-MS) για την ανάλυση βιολογικών μορίων μεγάλου μοριακού βάρους. Για την τεχνική που ανέπτυξε τιμήθηκε με μέρος του βραβείου Nobel Χημείας το 2002. Ο ηλεκτροψεκασμός είναι μια τεχνική ήπιου ιοντισμού (δηλαδή δεν προκαλεί θραυσματοποίηση των μορίων που αναλύει), ο οποίος πραγματοποιείται υπό ατμοσφαιρική πίεση και υπερισχύει έναντι άλλων τεχνικών φασματομετρίας μάζας στην ανάλυση ισχυρά πολικών, μη-πτητικών και θερμικά ασταθών ενώσεων, μικρού και μεγάλου μοριακού βάρους. Τα παραπάνω χαρακτηριστικά έχουν καθιερώσει τη φασματομετρία μάζας ηλεκτροψεκασμού ως μια από τις κυριότερες και πιο ευαίσθητες μεθόδους ανάλυσης πρωτεϊνών, καθώς και άλλων μεγαλομορίων. Ιοντισμός Μορίων με Ηλεκτροψεκασμό (Μεταφέροντας ιόντα από την υγρή στην αέρια φάση) Στην τεχνική του ηλεκτροψεκασμού τα ιόντα του αναλύτη, τα οποία προϋπάρχουν στο διάλυμα του δείγματος, μεταφέρονται στην αέρια φάση, μέσω ψεκασμού του υγρού δείγματος, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου (ηλεκτροψεκασμός Electrospray). Πιο συγκεκριμένα, ένα αραιό διάλυμα του αναλύτη διέρχεται με ροή 3-10 μl/min, μέσω ενός τριχοειδούς σωλήνα από ανοξείδωτο χάλυβα ( εσωτερικής διαμέτρου 100 μm), στο άκρο του οποίου εφαρμόζεται υψηλό δυναμικό (2-5 kv), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1α. Το δυναμικό αυτό, θετικό ή αρνητικό ανάλογα με το είδος των ιόντων που θέλουμε να αναλύσουμε, δημιουργεί βαθμιδωτό ηλεκτρικό πεδίο μεταξύ του τριχοειδούς σωλήνα και της εισόδου του φασματομέτρου μάζας, ικανό να διαχωρίσει τα ιόντα αντίθετου φορτίου και να εμπλουτίσει την επιφάνεια του υγρού με θετικά ή αρνητικά ιόντα. Με την εφαρμογή θετικού δυναμικού στην άκρη του τροχοειδούς σωλήνα, τα θετικά ιόντα είναι εκείνα τα οποία κινούνται προς την επιφάνεια και την εμπλουτίζουν, ενώ τα αρνητικά απομακρύνονται από αυτήν (Σχήμα 1β). Το τμήμα του διαλύματος που εξέρχεται από το άκρο του τριχοειδούς και φέρει περίσσεια φορτίου, σχηματίζει τον κώνο του Taylor (Taylor Cone, Σχήμα 1γ). Όταν το διάλυμα που σχηματίζει τον κώνο του Taylor υπερβεί το όριο Rayleigh (το σημείο όπου η απωστική δύναμη Coulomb μεταξύ των φορτίων εξισορροπείται από την επιφανειακή τάση του υγρού), ο κώνος υφίσταται σχάση και φορτισμένες μικρές σταγόνες οι οποίες περιέχουν τον αναλύτη αποσπώνται (Σχήμα 1δ). Η διάμετρος των σταγόνων εξαρτάται από το εφαρμοζόμενο δυναμικό, την ταχύτητα ροής του διαλύματος και την φύση του διαλύτη ή του ρυθμιστικού διαλύματος. Οι επιφανειακά φορτισμένες σταγόνες στη συνέχεια κατευθύνονται προς την είσοδο του φασματομέτρου μάζας, παρέχοντας στην πορεία φορτισμένα μόρια του αναλύτη στην αέρια φάση (είτε μετά από πλήρη εξάτμιση του διαλύτη ή μετά από απομάκρυνση του φορτισμένου μορίου του αναλύτη από την σταγόνα). Ροή αζώτου στο θάλαμο της
πηγής ηλεκτροψεκασμού βοηθά την εξάτμιση του διαλύτη και έτσι ενισχύει την παραγωγή των ιόντων του αναλύτη στην αέρια φάση ( Σχήμα 1δ). Ουσιαστικά, κατά τον ηλεκτροψεκασμό, τα ιόντα του αναλύτη, τα οποία προϋπάρχουν στο διάλυμα, μεταφέρονται στην αέρια φάση απαλλαγμένα από μόρια διαλύτη. Στη συνέχεια, τα ιόντα αυτά διαχωρίζονται και καταγράφονται στο φασματόμετρο μάζας με βάση το λόγο της μάζας προς το φορτίο τους ( m/z). Η καταγραφή της έντασης των ιόντων συναρτήσει του λόγου m/z μας δίνει το φάσμα μάζας τους. α Διάταξη ηλεκτροψεκασμού Παροχή υγρού δείγματος β Διαχωρισμός φορτίων με εφαρμογή δυναμικού - - - - - γ Σχηματισμός κώνου Taylor δ Σχηματισμός φορτισμένων σταγόνων με ηλεκτροψεκασμό Σχήμα 1. Διάταξη ηλεκτροψεκασμού με εικογράφηση των διεργασιών σχηματισμού ιόντων στην αέρια φάση. Ηλεκτροψεκασμός και Πρωτεΐνες Οι πρωτεΐνες, ανάλογα με τα αμινοξέα που τις αποτελούν, περιέχουν ελεύθερες βασικές και όξινες ομάδες οι οποίες, ανάλογα με το ph του διαλύματος, μπορούν να δώσουν συνολικό θετικό ή αρνητικό φορτίο στην πρωτεΐνη. Ο ηλεκτροψεκασμός μεταφέρει στην αέρια φάση τα ιόντα που ήδη υπάρχουν στο διάλυμα, άρα στην περίπτωση των πρωτεϊνών εισάγει πολλαπλά φορτισμένα ιόντα πρωτεϊνών στην αέρια
φάση, τα οποία στη συνέχεια αναλύονται με φασματομετρία μάζας, με βάση το m/z τους. Χαρακτηριστικό φάσμα μάζας ηλεκτροψεκασμού για την πρωτεΐνη κυτόχρωμα c δίνεται στο Σχήμα 2. Όλες οι κορυφές ιόντων του φάσματος αντιστοιχούν στην ίδια πρωτεΐνη. Η διαφορά m/z κάθε κορυφής, όμως, οφείλεται στο διαφορετικό αριθμό φορτίων που περιέχει το κάθε ιόν πρωτεΐνης, δηλ. στη διαφορά των πρωτονίων που έχει πάρει το κάθε μόριο πρωτεΐνης. Όταν η πρωτεΐνη που μελετάμε έχει στην πολυπεπτιδική της αλυσίδα βασικά αμινοξέα, όπως ιστιδίνη, αργινίνη και λυσίνη, τότε αυξάνεται η ικανότητά της να προσλάβει πολλαπλά πρωτόνια, άρα και να αποκτά πολλαπλά θετικά φορτία (z>>1). Relative Abundance 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 825.4 774.0 728.5 688.1 884.3 952.1 1031.3 1125.1 1237.5 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z Σχήμα 2. Φάσμα μάζας ηλεκτροψεκασμού για την πρωτεΐνη κυτόχρωμα c (Σημείωση: άξονας-y Relative abundance σημαίνει σχετική αφθονία και είναι μέτρο του αριθμού των ιόντων που ανιχνεύονται). Βιβλιογραφία Για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με το θεωρητικό υπόβαθρο της τεχνικής ESΙ-MS και τον τρόπο υπολογισμού της σχετικής μοριακής μάζας της πρωτεΐνης είναι απαραίτητο να διαβάσετε το κεφ. 22 του Β' Τόμου του Daniel C. Harris «Ποσοτική Χημική Ανάλυση» (παράγραφος: Ηλεκτροψεκασμός και πρωτεΐνες). Για περισσότερα σχετικά με το μηχανισμό και τις εφαρμογές του ηλεκτροψακασμού διαβάστε: Electrospray: Principles and Practice Simon J. Gaskell, Journal of Mass Spectrometry, 32, 677-688 (1997). 1374.7 651.8 1546.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Με μια σύριγγα, παίρνουμε 100 μl από διάλυμα της πρωτεΐνης συγκέντρωσης από 50-100 μg/ml. Κατόπιν συνδέουμε τη σύριγγα με τον τριχοειδή σωλήνα μέσω ειδικού συνδέσμου. Τοποθετούμε τη σύριγγα στην θέση της αντλίας σύριγγας και μέσω του λογισμικού του φασματομέτρου μάζας θέτουμε σε κίνηση το έμβολο της σύριγγας βάζοντας ταυτόχρονα σε λειτουργία και το δυναμικό της πηγής ηλεκτροψεκασμού (4-5 kv). Στη συνέχεια παρακολουθούμε την εμφάνιση του φάσματος στην οθόνη του υπολογιστή (παίρνει περίπου μισό λεπτό να φθάσει το διάλυμα στην πηγή του
ηλεκτροψεκασμού). Το φάσμα καταγράφεται και κατόπιν το αποθηκεύετε σε USB memory stick. ΓΡΑΠΤΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΕΚΘΕΣΗ 1. Περιγράψτε το όργανο φασματομετρίας μάζας που χρησιμοποιήθηκε. 2. (α) Να σχολιάσετε την μορφή του φάσματος μάζας ηλεκτροψεκασμού της πρωτεΐνης που καταγράψατε. (β) Ποιος ο λόγος που βάζουμε οξύ στο διάλυμα της πρωτεΐνης; 3. Στην έκθεση σας θα υπολογίσετε τη σχετική μοριακή μάζα της πρωτεΐνης. Να φαίνονται αναλυτικά οι υπολογισμοί σας και το αποτέλεσμα να δίνεται ως: σχετική μοριακή μάζα πρωτεΐνης (M r ) ± τυπική απόκλιση (s.d.). 4. Συγκρίνετε την τιμή που βρήκατε με αντίστοιχες που αναφέρονται στην διεθνή βιβλιογραφία για τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη που αναλύσατε. Να αναφέρετε τις βιβλιογραφικές πηγές που χρησιμοποιήσατε. Με βάση τις τιμές αυτές να προσδιορίσετε το απόλυτο σφάλμα της μέτρησής σας. Περγαντής Σπύρος, Καθηγητής Αναλυτικής Χημείας, Πανεπιστήμιο Κρήτης Κανάκη Κατερίνα, Διδάκτωρ Χημείας Πανεπιστημίου Κρήτης
5