ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Καθηγητής Βασίλης Σπηλιώτης Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας Άσκηση : Μικροβιακή κινητική (Τρόποι μέτρησης βιοκαταλυτών) Σκοπός Άσκησης Σκοπός της άσκησης αυτής, είναι η παρακολούθηση της εξέλιξης μιας μικροβιακής καλλιέργειας, όπως και η μέτρηση της δραστηριότητας των μικροβίων, μετά από επώαση σε διαφορετικούς χρόνους. Πορεία Εργασίας (μέθοδοι μέτρησης). Μέτρηση Ξηρού Βάρους Ζυγίσαμε σε ζυγό ακριβείας το φίλτρο. Διηθήσαμε το δείγμα με αντλία κενού και βάλαμε το φίλτρο με το ίζημα στον ξηραντήρα, στους 90 o C για 0min. Υπολογίσαμε τη βιομάζα, ως τη διαφορά αρχικού και τελικού βάρους του φίλτρου και την εκφράσαμε σε g ανά L.. Μέτρηση Οπτικής Πυκνότητας Μετρήσαμε την οπτική πυκνότητα σε φασματοφωτόμετρο. 3. Μέτρηση Αριθμού Κυττάρων (Μέθοδος Newbauer) Μετρήσαμε απ ευθείας στο μικροσκόπιο τον αριθμό των κυττάρων σε πλάκες Newbauer. 4. Ποσοτικός Προσδιορισμός Γλυκόζης (Μέθοδος Kolthoff) Σε 5mL ουδέτερου διαλύματος, προσθέσαμε 0mL διαλύματος ιωδίου 0,N και 5mL διαλύματος NaOH 0,5N, σε κωνική των 50mL και την βάλαμε στο σκοτάδι για 5min. Στη συνέχεια οξυνίσαμε το διάλυμα με 5mL H SO 4 και ογκομετρήσαμε την περίσσεια του ιωδίου με διάλυμα Na S O 3 0,N παρουσία δείκτη αμύλου. Κάναμε και ένα τυφλό προσδιορισμό όπου καταναλώθηκαν 9ml Na S O 3. Η διαφορά μεταξύ των δύο ογκομετρήσεων αντιστοιχούσε στην ποσότητα διαλύματος 0,N ιωδίου που καταναλώθηκε από το δείγμα. Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας
Πίνακας Αποτελεσμάτων Ομάδα Συγκέντρωση Χρόνος Ξηρό Βάρος Οπτική Αριθμός Υποστρώματος S ζύμωσης ( g Πυκνότητα Κυττάρων Ν ln N ) (h) L (O.D.) (Newbauer) ( g ) L ln S Α 0,07 0,5 6 4,8 0 5,38 96,56 5,8 Β 6 0,9 0,78 Γ,67 4,50 Δ 8 5,00 6,70 7 7,3 0 8,0 96,46 4,56 8,5 0 9,33 5,09,6 8 5,0 0 0,03,0 0,0 Πίνακας Διαγράμματα. ln N=f(t) ln N=f(t) 0 9 ln N 8 7 6 5 0 3 4 5 6 7 8 9 0 3 4 5 6 7 8 9 Χρόνος ζύμωσης (h) Διάγραμμα Από το παραπάνω διάγραμμα δεν έχουμε σαφή ένδειξη για τις φάσεις προσαρμογής και θανάτου, μπορούμε όμως να πούμε ότι η φάση επιβράδυνσης ξεκινά περίπου στις h. Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας
. O.D.=f(t) O.D.=f(t) Οπτική πυκνότητα (O.D.) 7 6 5 4 3 0 0 3 4 5 6 7 8 9 0 3 4 5 6 7 8 9 Χρόνος ζύμωσης (h) Διάγραμμα Παρατηρώντας το παραπάνω διάγραμμα, της οπτικής πυκνότητας, μπορούμε να βγάλουμε καλύτερα συμπεράσματα, ειδικά για τις φάσεις προσαρμογής, επιβράδυνσης και τη λογαριθμική, σε σχέση με το διάγραμμα μεταβολής του κυτταρικού πληθυσμού. Έτσι είναι, η φάση προσαρμογής από 0h έως 4h, όπου ξεκινά η φάση εκκίνησης μέχρι τις 6h. Μετά τις 6h και μέχρι τις h περίπου είναι η λογαριθμική φάση η οποία δίνει τη σειρά της στη φάση επιβράδυνσης από τις h. Καθώς η συγκεκριμένη μέθοδος μετρά και ζωντανά και νεκρά κύτταρα δεν είναι δυνατόν να βγάλουμε ένα συμπέρασμα για τις φάσεις στασιμότητας και θανάτου. 3. ln S=f(t) ln S=f(t) 6 5 4 ln S 3 0 0 3 4 5 6 7 8 9 0 3 4 5 6 7 8 9 Χρόνος ζύμωσης (h) Διάγραμμα 3 Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας 3
4. Ξ.Β.=f(t) Ξ.Β.=f(t) 6 5 Ξηρό Βάρος 4 3 0 0 3 4 5 6 7 8 9 0 3 4 5 6 7 8 9 Χρόνος ζύμωσης (h) Διάγραμμα 4 Υπολογισμοί. Ειδικός ρυθμός αύξησης (μ) ln N t ln N t 9,33 8,0,3 0,05 6 6. Ειδικός ρυθμός αποικοδόμησης του υποστρώματος (μ ) ln S ln S,6-4,56,94 ' t t - 6 6 0,49 3. Συντελεστής μετατροπής του υποστρώματος.. 5,00,07 3,93... 0,0 S,0 96,56 95,54 Δικαιολόγηση Αποτελεσμάτων Παρατηρούμε πως η φάση προσαρμογής ξεκινά από 0h μέχρι περίπου τις 4h. Στη συνέχεια ξεκινά η φάση εκκίνησης, μέχρι τις 6h, όπου παρατηρούμε εκκίνηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και ακολουθεί η λογαριθμική φάση μεταξύ των 6h και h περίπου, όπου βλέπουμε πως ο αριθμός των κυττάρων αυξάνεται σημαντικά. Στο διάγραμμα παρατηρούμε ότι μεταξύ h και 8h η καμπύλη τείνει να σταθεροποιηθεί, έτσι θεωρούμε ότι πλέον η καλλιέργεια έχει περάσει αρχικά στη φάση στασιμότητας και ακολουθεί η φάση θανάτου. Δεν έχουμε σαφή ένδειξη για τις παραπάνω φάσεις και ειδικά για τη φάση θανάτου, εξαιτίας του μικρού αριθμού δοκιμών και της μεγάλης διαφοράς μεταξύ των χρόνων ζυμώσεως. Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας 4
ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Καθηγητής Βασίλης Σπηλιώτης Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας Άσκηση 4 : Μικροβιακή παραγωγή Αλκοόλης Σκοπός Άσκησης Σκοπός της άσκησης αυτής είναι η μελέτη και η σύγκριση της απόδοσης δύο διαφορετικών τύπων βιοαντιδραστήρων, αυτού της ελεύθερης μορφής και αυτού της ακινητοποιημένης μορφής. Και οι δύο τύποι θα αξιολογηθούν με βάση, την παραγωγή αλκοόλης (που οφείλεται στη ζύμωση της γλυκόζης) και την κατανάλωση του παρεχόμενου υποστρώματος (γλυκόζη), από το μικροοργανισμό Saccharomyces cerevisiae. Συνοπτική Πειραματική Πορεία Ακινητοποίηση Προστίθενται 7,5mL εναιωρήματος μαγιάς σε διάλυμα αλγινικού νατρίου. Το μίγμα μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη και προστίθεται σταγόνα-σταγόνα σε 500mL CaCl 0,M. Εμβολιασμός βιοαντιδραστήρων Έχουμε τέσσερεις βιοαντιδραστήρες όπου, στους δύο προστίθεται θρεπτικό υπόστρωμα (γλυκόζη) συγκέντρωσης 00 g και στους άλλους δύο 50 g. Οι βιοαντιδραστήρες ανά δύο L L εμβολιάζονται, σε άσηπτες συνθήκες, οι μεν με μαγιά σε ακινητοποιημένη μορφή και οι δε με μαγιά σε ελεύθερη μορφή. Μέτρηση τελικής συγκέντρωσης γλυκόζης Για τον προσδιορισμό της τελικής συγκέντρωσης γλυκόζης χρησιμοποιείται η μέθοδος Kolthoff. Προσδιορισμός αλκοόλης Μετά την πλήρωση του όγκου του βιοαντιδραστήρα στα 00mL, με χρήση αποσταγμένου νερού, 50mL αυτού τοποθετούνται για απόσταξη. Μετά το τέλος της απόσταξης, γίνεται πλήρωση του όγκου του αποστάγματος στα 00mL, ξανά με χρήση αποσταγμένου νερού. Στο τελευταίο αυτό διάλυμα γίνεται μέτρηση των αλκοολικών βαθμών με χρήση αλκοολομέτρου. Αποτελέσματα (έπειτα από επώαση μίας εβδομάδας) Ισχύουν τα εξής, για τα μεγέθη που αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα : S 0 Αρχική συγκέντρωση υποστρώματος g L S f Τελική συγκέντρωση υποστρώματος g L Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας
0ffP 0 Αρχική συγκέντρωση προϊόντος g L P f Τελική συγκέντρωση προϊόντος g L (S 0 - S f ) Υπόστρωμα που καταναλώθηκε (P f - P 0 ) Προϊόν που παρήχθηκε S0 S f Pf P0 Συντελεστής απόδοσης Πίνακας Αποτελεσμάτων Ομάδα S 0 Μορφή μ/ο Παρουσία O S f SΑ P 0 P f (S0 - Sf) (Pf - P0) P SP 0 00 Ακινητοποιημένη -,73 0 9,49 97,7 9,49 3,30 Β 00 Ελεύθερη - 0,66 0 4,80 99,34 4,80 6,7 Γ 50 Ακινητοποιημένη -,56 0 6,85 48,44 6,85,87 Δ 50 Ελεύθερη + 4,8 0 45,8 45,8 Πίνακας SS0f Τι εκφράζει ο λόγος PP; f0 Ο παραπάνω λόγος είναι ο συντελεστής απόδοσης της μικροβιακής παραγωγής αλκοόλης και αφορά τη σχέση μεταξύ του παραγόμενου προϊόντος (αλκοόλη) και του καταναλωθέντος υποστρώματος (γλυκόζη), όπου ισχύει, θεωρητικά, ότι για κάθε ένα mol γλυκόζης (ακολουθώντας την αναερόβια οδό) παράγονται δύο mol αιθανόλης. Μέσω της στοιχειομετρίας καταλήγουμε στο ότι, από 80g γλυκόζης παράγονται 9g αιθανόλης. Σε αυτή την ιδανική περίπτωση, ο συντελεστής απόδοσης είναι,96. Κάθε τιμή, μεγαλύτερη της προηγούμενης τιμής είναι απολύτως φυσιολογική καθώς όπως είπαμε, αυτή αφορά ιδανικές συνθήκες (μέγιστη κατανάλωση υποστρώματος-μέγιστη παραγωγή προϊόντος). Μικρότερη τιμή αυτής, οφείλεται σε πειραματικό σφάλμα, το οποίο ερμηνεύεται ως υπολογιστικό λάθος ή πιθανή ύπαρξη κάποιας άλλης πηγής παραγωγής αλκοόλης. Σχολιασμός Αποτελεσμάτων Παρατηρούμε πως, σε όλα τα αναερόβια συστήματα είχαμε παραγωγή αλκοόλης ενώ στο αερόβιο σύστημα όχι. Αυτό το γεγονός οφείλεται στο ότι, στο αερόβιο σύστημα (κύκλος Krebs) είχαμε τελική παραγωγή CO, H O και βιομάζας. Όσων αφορά την κατανάλωση υποστρώματος, παρατηρούμε πως σε όλες τις περιπτώσεις καταναλώθηκε σχεδόν όλη η γλυκόζη. Επίσης έγινε σαφές πως, η αρχική συγκέντρωση υποστρώματος επηρεάζει άμεσα την τελική παραγωγή προϊόντος, με μεγαλύτερες, εντός ορίων (χωρίς να προκληθούν φαινόμενα αναστολής), συγκεντρώσεις να οδηγούν σε μεγαλύτερη παραγωγή αλκοόλης. Τέλος παρατηρήθηκε πως, πέρα από τα πλεονεκτήματα επαναχρησιμοποίησης και διατηρησιμότητας που παρουσιάζει η ακινητοποιημένη μορφή, οδηγεί και σε μεγαλύτερη παραγωγή προϊόντος. Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας
ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Καθηγητής Βασίλης Σπηλιώτης Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας Άσκηση 3 : Παράγοντες που επιδρούν στη παραγωγή μεταβολιτών Σκοπός Άσκησης Σκοπός της άσκησης αυτής, είναι η μελέτη των κυριότερων παραγόντων που επηρεάζουν την ταχύτητα της ζύμωσης της αρτόμαζας από τον μικροοργανισμό Saccharomyces cerevisiae. Πιο συγκεκριμένα, είναι η μελέτη των δυνατοτήτων ανάπτυξης του μικροοργανισμού καθώς και ο προσδιορισμός των άριστων συνθηκών παραγωγής αερίου (CO ) από αυτόν. Πορεία Εργασίας Πορεία η Σε τρεις ογκομετρικούς κυλίνδρους προσθέσαμε 00mL χυλό, αλεύρου και νερού, και 3% νωπή μαγιά. Τοποθετήσαμε τους ογκομετρικούς κυλίνδρους σε θερμοκρασίες, 4 o C (ψυγείο), 0 o C (περιβάλλον) και 37 o C (κλίβανος), για 0min. Μετά το πέρας των 0min, υπολογίσαμε τη μεταβολή του όγκου ως παραγωγή CO. Συγκεντρώνοντας τα αποτελέσματα από όλες τις ομάδες καταλήξαμε στον παρακάτω πίνακα. Πορεία η Σε τρεις ογκομετρικούς κυλίνδρους προσθέσαμε 00mL χυλό, αλεύρου και νερού, και 3% νωπή μαγιά. Αφήσαμε τον ένα ογκομετρικό έτσι όπως ήταν, στον δεύτερο προσθέσαμε την απαραίτητη ποσότητα οξέος (HCl) για να έχει ph ίσο με 4 και στον τρίτο την κατάλληλη ποσότητα βάσης (NaOH) για να έχει ph ίσο με 7,5. Τοποθετήσαμε τους ογκομετρικούς κυλίνδρους για επώαση επί 0min στους 37 o C. Μετά το πέρας των 0min, υπολογίσαμε τη μεταβολή του όγκου ως παραγωγή CO. Συγκεντρώνοντας τα αποτελέσματα από όλες τις ομάδες καταλήξαμε στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας Αποτελεσμάτων Θερμοκρασία Ποσοστό μαγιάς Ποσοστό ζάχαρης Είδος μαγιάς Παρουσία Ο 4 o C 0 o C 37 o C 0% % 5% 0% % 0% Ξηρή Νωπή -Ο +Ο ΔV 0 0 48 0 3 85 35 30 5 0 55 43 0 Πίνακας Πίνακας Αποτελεσμάτων ph Ποσοστό NaCl Ποσότητα λιπαρών Βελτιωτικό Συντηρητικό 4 6, 7,5 0% 3% 0% 0mL ml 6mL 0% % 0% ΔV 0 0 30 74 8 30 36 6 8 40 0 Πίνακας Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας
Διαγράμματα :. ΔV=f(T) ΔV=f(T) 50 40 30 ΔV 0 0 0 0 5 0 5 0 5 30 35 40 Θερμοκρασία Διάγραμμα. ΔV=f(ποσοστό μαγιάς) ΔV=f(ποσοστό μαγιάς) ΔV 90 80 70 60 50 40 30 0 0 0 0 3 4 5 6 Ποσοστό μαγιάς Διάγραμμα Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας
3. ΔV=f(Ποσοστό πηγής άνθρακα) ΔV=f(Ποσοστό πηγής άνθρακα) 40 35 ΔV 30 5 0 0 4 6 8 0 Ποσοστό ζάχαρης Διάγραμμα 3 4. ΔV=f(pH) ΔV=f(pH) 35 30 ΔV 5 0 5 3 4 5 6 7 8 ph Διάγραμμα 4 Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας 3
5. ΔV=f(Ποσοστό NaCl) ΔV=f(Ποσοστό NaCl) 80 ΔV 70 60 50 40 30 0 0 0 3 4 5 6 7 8 9 0 Ποσοστό NaCl Διάγραμμα 5 6. ΔV=f(Ποσότητα λιπαρών) ΔV=f(Ποσότητα λιπαρών) 40 35 ΔV 30 5 0 3 4 5 6 7 Ποσότητα λιπαρών Διάγραμμα 6 Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας 4
Δικαιολόγηση Αποτελεσμάτων Στο διάγραμμα, παρατηρούμε ότι η μεταβολή του όγκου είναι ανάλογη της αυξανόμενης θερμοκρασίας. Γνωρίζουμε όμως ότι κάθε μικροοργανισμός έχει μια βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης, όπου για τον Saccharomyces cerevisiae είναι οι 37 o C. Στο διάγραμμα 3, παρατηρούμε ότι η μεταβολή του όγκου μειώνεται. Έτσι καταλαβαίνουμε ότι μεγάλη ποσότητα σακχάρων δρα ανασταλτικά, αντί να ευνοεί την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην μείωση της a w και στην παρουσία οσμωτικών φαινόμενων. Στο διάγραμμα 5, παρατηρούμε ξανά, μείωση της μεταβολής του όγκου κατά την αύξηση της περιεκτικότητας σε αλάτι, γεγονός που οφείλεται σε ωσμωτικά φαινόμενα. Στο διάγραμμα 6 παρατηρούμε, πως ενώ αρχικά ο όγκος αυξάνεται, στη συνέχεια μειώνεται δραστικά. Έτσι καταλήγουμε στο ότι, συγκεκριμένη ποσότητα λιπαρών ευνοεί το πλέγμα αμύλου και δεν αφήνει το CO να ξεφύγει, καθώς, όπως παρατηρήθηκε, μεγαλύτερη ποσότητα επιφέρει αντίθετα αποτελέσματα. Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας 5
ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Καθηγητής Βασίλης Σπηλιώτης Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας Κατασκευή πρότυπης καμπύλης BacΤrac Παρακάτω παρουσιάζονται οι μετρήσεις χρόνων θετικοποίησης συναρτήσει του λογαρίθμου μικροβιακού πληθυσμού, για δείγματα γάλακτος, όπως αυτές καταγράφηκαν από τη συσκευή BacΤrac. Α/Α Χρόνος θετικοποίησης (h) Log N Α/Α Πίνακας μετρήσεων Χρόνος θετικοποίησης (h) Log N Α/Α Χρόνος θετικοποίησης (h) Log N,06 8,9 5,98 5,8 7,70,36, 8,8 6,06 4,36 7,83 3,8 3,4 8,8 3 6,7 5,9 3 8,90,9 4,6 7,8 4 6,40 4,8 4 9,4,8 5 4,39 6,8 5 6,67 5,8 5 9,5,8 6 4,63 6,36 6 6,77 4,9 6 9,4,9 7 4,73 6,9 7 6,87 4,8 7 9,57,34 8 5,37 5,36 8 7,0 3,36 8 9,7 0,9 9 5,43 7,8 9 7,9 3,9 0 5,49 6,8 0 7,58 3,8 Πίνακας Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας
Με βάση τις τιμές του πίνακα κατασκευάζουμε, στο παρακάτω διάγραμμα, την πρότυπη καμπύλη BacTrac : Πρότυπη καμπύλη BacTrac Log N 0 9 8 7 6 5 4 3 0 y = -0,9549x + 0,77 R = 0,9553 3 4 5 6 7 8 9 0 Χρόνος θετικοποίησης (h) Διάγραμμα Παρατήρηση : Οι τιμές 9, και 8 (παρουσιάζονται με μπλε χρώμα στο διάγραμμα) του πίνακα, δε χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή της παραπάνω καμπύλης, καθώς ελάττωναν την τιμή του συντελεστή συσχέτισης R.
Γνωρίζοντας από το διάγραμμα την εξίσωση της πρότυπης καμπύλης BacTrac, μπορούμε να υπολογίσουμε για κάθε χρόνο θετικοποίησης τον αντίστοιχο Log N και τελικά το μικροβιακό πληθυσμό, καθώς και το αντίστροφο. Έτσι, για τους χρόνους θετικοποίησης που πήραμε από τα 6 δείγματα άγνωστου μικροβιακού πληθυσμού, ισχύουν τα δεδομένα του παρακάτω πίνακα : Δείγμα Χρόνος θετικοποίησης (h) Πίνακας δειγμάτων άγνωστου μικροβιακού πληθυσμού Log N (όπως υπολογίστηκε από την εξίσωση ευθείας) 3,5 7,38 4, 6,7 3 4,9 6,05 4 5,6 5,38 5 7,8 3,8 6 9,5,65 Πίνακας N (μικροβιακός πληθυσμός) 7,400 6 5,50 6,0 5,400 3,900 4,47 0 Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας 3