اسپكتروفلومتري روشي براي سنجش كارآيي بيوسايدهاي متداول در كنترل قارچهاي مخرب در آثار و بناهاي تاريخي پريسا محمدي (س) تهران دانشگاه الزهرا دانشكده علوم گروه زيست شناسي تاريخ دريافت: 88/4/2 تاريخ پذيرش: 89/12/10 چكيده مقدمه مشكل تخريب زيستي آثار و بناهاي باستاني مورد توجه بسياري از دانشمندان علاقه مند به آثار باستاني قرار گرفته است. در اين رابطه قارچها به عنوان يكي از مهم ترين عوامل مخرب سنگها معرفي شده اند و مطالعات گسترده اي جهت كنترل اين عوامل بيولوژيكي در دست بررسي است. هدف از پژوهش حاضر پيدا كردن و بهينه كردن روشي است كه با كاربرد آن بتوان كارآرايي تيمارهاي شيميايي كه براي حفظ آثار باستاني مورد استفاده قرار مي گيرند را ارزيابي نمود. يكي از معيارهايي كه در ارزيابي موفق تيمارهاي شيميايي مورد استفاده قرار مي گيرند سنجش تعداد سلول هاي زنده است. در اين پژوهش سلولهاي قارچيabietis (A18)Trimmatostroma و (J26) Exophilia jeanselmei تحت تا ثير آلكيل بنزيل دي متيل آمونيوم كلرايد (Cal AM) كلسي ين ام (FDA) يك درصد قرار گرفت. ابتدا سلولهاي قارچي با رنگ هاي فلورسي ين دي استات (BAC) پروپيديوم يديد (PI) و تركيبي از آنها رنگ آميزي گرديد. سپس با استفاده از فلورومترتغييرات فلورسانس سلولهاي زنده اندازه گيري شد. سلولهاي رنگ آميزي شده با FDA به شدت رنگ گرفتند به طوري كه اين رنگ پذيري با ميكروسكوپ فلورسانس و نيز با سنجش فلورومتري قابل مشاهده بود. سلولهاي قارچي در حضور Cal AM رنگ پذيري ضعيفي را نشان دادند. اين در حالي است كه سلول هاي رنگ شده با PI هيچ گونه فلورسانسي را نشان ندادند. زماني كه تلفيق رنگها مورد استفاده قرار گرفت به لحاظ كمي و كيفي فلورسانس سلولي كاهش يافت. كاهش شدت فلورسانس FDA در تركيب با ساير رنگها نيز مشاهده شد. بنابراين با توجه به نتايج به دست آمده FDA مي تواند براي سنجش تيمارهاي شيميايي قارچهاي صخره اي مورد استفاده قرار گيرد. با استفاده از اين رنگ مي توان كارآيي تيمارهاي فيزيكي يا شيميايي را كمي كرد. نتايج نشان داد كه فلورومتري FDA روشي دقيق قابل تكرار و به لحاظ زمان و مواد مصرفي بسيار مقرون به صرفه مي باشد. واژه هاي كليدي: قارچ هاي ساكن صخره فلوروسي ين دي استات واسپكتروفلورومتري نويسنده مسي ول تلفن: 88058912 پست الكترونيكي: p.mohammadi@alzahra.ac.ir فرسودگي زيستي آثار باستاني و هنري در كشورهايي با تاريخ كهن و داشتن ابنيهء تاريخي مورد توجه بسياري از دانشمندان قرار گرفته است. صخره ها و سنگها محيطهاي سر سختي براي زندگي ميكروارگانيسم ها و حضور بيوفيلم ها هستند كه چنين ميكروارگانيسم هايي تغييرات شديد رطوبت و حرارت محدوديت مواد غذايي قابل دسترس و غلظت بالاي الكتروليتهاي مختلف را تحمل مي كنند. صخره ها و سنگها همچنين در معرض تابش شديد اشعه هاي خورشيدي هستند. با وجود اين شرايط سخت فعاليت بيولوژيكي در سطح و در داخل صخره هايي كه در تماس با اتمسفر قرار مي گيرند بوفور ديده ميشود (26). تحقيقات نشان داده است كه فقط انواع خاصي از ارگانيسم 818
ها قادرند بر روي صخره هاي برهنه تثبيت شوند و البته اجتماعات اندوليتيك چنين ارگانيسم هايي در لايه هاي زيرين صخره ها و سنگها نيز مشاهده شده است (11). چنين موجوداتي در تشديد عوامل فرسايش زيستي شركت نموده و ميكروارگانيسم هاي پويكيلوتروف ناميده مي شوند( 24 و 25). شايد بتوان معادل فارسي ميكرو ارگانيسم هاي خونسرد را به چنين ميكروارگانيسم هايي اطلاق نمود. در حقيقت اين موجودات ميكروارگانيسم هاي خبره اي هستند كه توانايي سوخت و ساز در محدوده هاي بسيار گسترده اي از شرايط زيست محيطي را دارند. محيط زيست چنين موجوداتي مي تواند خيلي عادي باشد ويا تغييرات اساسي و شديد را در پايين ترين و بالاترين سطح خود به نمايش بگذارد. اين تغييرات ميتواند در دوره هاي زماني منظم و يا نامنظم رخ دهد. موجودات مورد نظر بايد ويژگيهايي را به نمايش بگذارند كه ساير موجودات فاقد آنند يعني تحمل و داشتن ابزاري براي بقاء در شرايط تغييرات شديد زيستي كه به طور منظم و يا نامنظم در محيط اتفاق مي افتد. جداسازي چنين ميكروبهايي اولين بار توسط كرومباين در سال 1966 انجام شد (9). استيلي در سال 1982 قارچهاي خاص پويكيلوترف جداشده از صحراها را قارچهاي ميكروكلني ناميد (16). اين دسته از ميكروارگانيسم هاي شيميوارگانوتروف منابع آلي و آبي مورد نياز خود را از محيط زيست به دست مي آورند. اين موجودات به خوبي با ميكروسكوپ قابل مشاهده هستند و تعيين فعاليت متابوليسمي آنها با روشهاي بيوشيميايي قابل اندازه گيري مي باشد ولي كشت آنها در آزمايشگاه مشكل و گاه بسيار زمانبر است. محمدي و همكاران چنين ميكروارگانيسم هاي سخت رشدي را از منطقه تخت جمشيد جدا و شناسايي نمودند (10). ترتياچ و همكاران ارزيابي بيوسايد هايي نظير Koretrel BAC و Rocima 110 را با بررسي تغيير پالسهاي فلورسنت تقويت شده بر روي گلسنگهاي آندوليتيك مورد مطالعه قرار دادند( 18 ). برخي از چنين ميكروارگانيسم هايي را به راحتي نمي توان در آزمايشگاه كشت داد اگرچه آثار مخرب آنها با روشهاي ميكروسكپي و شيميايي قابل اثبات است. تعداي از چنين ميكروارگانيسم هايي نيز در آزمايشگاههاي مختلف دنيا جدا و شناسايي شده اند كه رشد كندي را در شرايط آزمايشگاه نشان مي دهند. براي زدودن اين اشكال بيولوژيك از سطوح هنري نياز به استفاده از بيوسايد يا روشهاي فيزيكي است لذا يافتن روشي كه در كوتاه ترين زمان ممكن بتواند اثر تيمارهاي فيزيكوشيميايي را نشان دهد و همچنين به لحاظ اقتصادي مقرون به صرفه باشد ضروري به نظر مي رسد. امروزه در بسياري از مراكز تحقيقاتي جهت ارزيابي اثر بيوسايد هايي چون BAC Bismuth dimercapto ethanol Prevntolو,Tricyclazole كه برروي ميكروارگانيسم ها و به طور كلي بيوفيلمهاي دخيل در تخريب آثار هنري و تاريخي استفاده مي شود از روش كشت نمونه ها در محيط هاي عمومي و اختصاصي و تعيين CFU استفاده مي گردد (11). لذا مطالعات مربوط به اثر بيوسايدها بر روي قارچهاي مو ثر در تخريب بسترهاي سنگي كه رشد بسيار آهسته اي دارند بسيار زمان بر است. در ضمن روش كلاسيك كشت و تعيين CFU نمي تواند ميكروارگانيسم هاي زنده اي كه قابليت كشت خود را از دست داده اند در محاسبه وارد نمايد. با توجه به مطالب ذكر شده هدف از پژوهش حاضر يافتن و بهينه كردن روشي قابل اعتماد و سريع است كه با آن بتوان اثر تيمارهاي فيزيكوشيميايي مربوط به حوزه مرمت وترميم آثار باستاني را روي ارگانيسم هاي دخيل در امر فرسودگي زيستي مورد ارزيابي قرار داد. مواد و روشها بيوسايد: BAC از تركيبات چهارتايي آمونيوم است. اين ماده به عنوان كاهش دهنده كشش سطحي و نيز به عنوان ضدعفوني كننده در پزشكي و صنعت مورد استفاده قرار 819
مي گيرد. از اين تركيب كه طيف اثر وسيعي دارد در مرمت و ترميم آثار هنري و تاريخي نيز استفاده مي شود. در اين بررسي از غلظت BAC يك درصد براي جلوگيري از رشد سلولهاي قارچي مورد استفاده قرار گرفت. سويه هاي قارچي: دو سويه قارچي براي اين منظور استفاده شد. اولين نمونه قارچي (A18) Trimatostroma abietis و دومين آن( J26 ) Exophilia jeanselmei بود كه به ترتيب ازسطح بناهاي تاريخي مربوط به دوران يونان باستان در اكراين و كليسايي در آلمان جدا شده بود و از بانك ميكروبي دانشگاه الدنبورگ تهيه گرديد. سويه هاي قارچي روي محيط مالت آگار و در دماي 28 درجه سانتي گراد كشت داده شد. سوسپانسيوني از سلولهاي قارچي در بافر فسفات تهيه شد. مشاهدات ميكروسكوپي وجود مقادير كافي از سلولها را كه غالبا به شكل تجمع يافته ديده مي شدند را نشان داد. توده سلولي با استفاده از دستگاه هموژنايزر مدل Ultra-Turrax T25 يكنواخت گرديد. به منظور جدا نمودن بهتر سلولها از دستگاه اولتراسونيكاتور مدلRk100 Bandelin Sonorex به مدت 15 10 5 و 30 دقيقه استفاده شد. با استفاده از چهار لايه گاز استريل معمولي سوسپانسيون يكنواختي از سلولها ايجاد شد. از لام توما براي شمارش 10 سلول در ميلي ليتر استفاده گرديد. 5 براي بررسي تغييرات احتمالي تعداد سلولهاي زنده از روش ميكروسكوپي و فلوريمتري استفاده شد. رنگها: محلول كاري FDA (سيگما) با غلظت 20μl/ml درTris-HCL از محلول ذخيره (0.05 درصد)ساخته شد. محلول كاريAM Cal (سيگما) با غلظتμl/ml 3 در آب مقطر از محلول ذخيره ( 1μg/ml )آن تهيه شد. محلول كاري از رنگ PI (سيگما) نيز در PBS تهيه گرديد.كليه رنگها در تاريكي و در 4 درجه سانتي گراد به مدت يك ماه نگهداري شد. روش رنگ آميزي سلولهاي قارچي: μl براي ارزيابي كار آرايي روش رنگ آميزي نياز به سلولهاي مرده و زنده بود. 10 سلولهاي قارچي در 5 100 از سوسپانسيون مجاورت BAC به مدت 18 ساعت گرما گذاري شد. پس از شستشوي سلولها با PBS استريل رنگ آميزي سلولي انجام گرديد. در روش ديگر سلولهاي مرده قارچي با قرار دادن نيمي از سوسپانسيون سلولي به مدت يك ساعت در مجاورت گلوتارآلدي يد 8 درصد تهيه گرديد. نهايتا سلولها چندين بار با PBS استريل شستشو داده شد و به نسبت 1/2 با سلولهاي زنده مخلوط گرديد. 100 μl از اين سلولها با حجم مساوي از رنگهاي تهيه شده مخلوط شد و در 28 درجه سانتي گراد به مدت 45 30 15 10 5 1 و 60 دقيقه گرما گذاري شد. رنگ آميزي سويه هاي قارچي با تركيبي از رنگها به دو روش انجام شد. ابتدا حجم مساوي از FDA و PI مخلوط شد. مخلوط اين دو رنگ براي رنگ آميزي استفاده گرديد. در روش ديگر سلولها ابتدا با رنگ FDA رنگ آميزي شد. سپس سلولها در PBS شسته و سانتريفيوژ شد. عمل شستشو دو بار تكرار شد. سلول هاي شسته شده در اين مرحله با PI به عنوان رنگ زمينه رنگ آميزي و نهايتا به ميكروپليت هاي 96 خانه اي سياه (Nunc) منتقل گرديد. براي مشاهده سلولهاي رنگ شده از ميكروسكوپ فلورسانس زايس مجهز به دو فيلتر 450-490 و 510-560 nm براي پرتوهاي انگيزش 520 و Cal AM براي پرتوهاي انتشار به ترتيب براي nm 590 FDA,و PI استفاده شد. شدت فلورسانس سلولها با دستگاه اسپكتروفلورومتر مدل Optima Fluostar سنجيده شد. از دو فيلتر 485 و nm 544 براي پرتوهاي انگيزش و فيلتر 520 و nm 544 براي پرتوهاي انتشار به ترتيب براي Cal AM,FDAو PI استفاده گرديد. 820
821 نتايج سلولهاي زنده و فعال قارچي با دو رنگ Cal AM وFDA رنگ سبز روشن فلورسانس را به نمايش گذاشتند در حالي كه سلولهاي مرده رنگ نشدند يا به عبارتي در اين موارد تصوير كاملا سياهي از نمونه ها به دست آمد. با مشاهدات ميكروسكوپي زمان 30 دقيقه براي رنگ آميزي سلولها انتخاب گرديد. نتايج بررسيها نشان داد كه از ميان اين دو رنگ FDA توانست با شدت بيشتري سلولهاي قارچي را رنگ نمايد (شكل 1). ميزان فلورسانس سلولهايي كه واجد مقادير زيادي ملانين بودند در مقايسه با سلولهاي جوان تر پايين بود. مقايسه رنگ آميزي دو سلول قارچي نشان داد كه سلولهاي A18 بهتر از J26 رنگ گرديدند (نمودار 1). بنابر اين در مراحل بعدي از سلولهاي A18 براي رنگ آميزي و سنجش استفاده شد. شكل 1- سلولهاي قارچي رنگ آميزي شده با FDA سلولهاي قارچي واجد مقادير زياد ملانين به رنگ تيره ديده مي شوند. ميزان فلورسانس سلولهاي قارچي رنگ شده با FDA و PI به ترتيب و با مخلوط PI-FDA و در نهايت FDA وسپس PI با اسپكتروفلورومتر اندازه گيري شد (نمودار ). 2 در كنار سلولهاي رنگ شده ميزان فلورسانس بافر و رنگ سنجش گرديد. نتايج فلورومتري نشان داد كه هيچ گونه فلورسانسي از سلولهاي رنگ شده با PI مشاهده نگرديد. به عبارتي برآورد ميزان مرگ سلولها با PI امكان پذير نبود. رنگ آميزي سلولهاي قارچي با مخلوط و PI- FDA همچنين رنگ آميزي سلولها در دو مرحله موجب كاهش ميزان فلورومتري شد. اين در حالي است كه سلولهاي قارچي به خوبي با FDA به تنهايي رنگ شدند. نمودار 1- ميزان فلورسانس دو سلول A18 و J26 رنگ شده با FDA و Cal AM ميزان فلورسانس خود به خودي رنگهاي مذكور بحث و بافر موازي با نمونه هاي تيمار شده با BAC سنجش شد. بيوفيلم ساختارهاي پيچيده اي از ميكروارگانيسم هاست كه در بستر پليمري كه توسط خود ميكروارگانيسم ها توليد مي شود قرار مي گيرد( 13 ). اين ساختار ويژه به طرق مختلف از جمله توليد پليمرهاي ترشحي مي تواند به سطوح مختلف بچسبد و شرايط سخت محيطي از جمله اسيديته بالا حرارت بالا مقاومت به تغييرات فشار اكسيژن را تحمل كند. زماني كه صحبت ازميكرو كلني به ميان مي آيد منظور توده اي از چند صد سلول است. اين توده سلولي اگر بر روي محيط كشت قرار بگيرد به عنوان يك واحد در نظر گرفته مي شود كه سنجشها و محاسبات را دچار اشكال مي نمايد. براي غلبه بر چنين مشكلي و جدا كردن سلولها و به دست آوردن سوسپانسيون يكنواختي از آنها از روشهاي فيزيكي و شيميايي استفاده مي شود. از جمله عوامل فيزيكوشيميايي مي توان به استفاده از EDTA,Tween,Junlon و استفاده از هموژنايزر و سونيكاتور اشاره كرد. روشهاي فيزيكي و مكانيكي غير اختصاصي اند
و در مقايسه با ساير روشها كاربرد وسيع تر و كارآيي بالاتري دارند. برخي از قارچهاي مو ثر در تخريب بسترهاي سنگي رشد بسيار آهسته اي دارند لذا مطالعات مربوط به اثر بيوسايدها بر روي آنها بسيار زمان بر است. در مقالات مختلف به تركيبات متفاوت شيميايي براي كنترل رشد عوامل بيولوژيك مو ثر در فرسودگي زيستي اشاره شده است. BAC تركيبلت چهارتايي آمونيوم بر پايه سيلان نانوذرات نقره زي وليتهاي مس و نقره و بيوسايدهاي قديمي استارات سيلان و تركيب كلريني پيريدين از جمله اين موارد هستند (18 و 22). هنوزبا گذشت بيش از هفتاد سال از معرفي BAC از آن در جلوگيري از تخريب زيستي سطوح چوبي و سنگي استفاده مي شود (3 و 21). نتايج محققين نشان داده است كه كاربرد توأم بيوسايدهاي سنتي همراه با تيمارهاي آنزيمي مثل پروتي از ليپاز و گلوكزاكسيداز نتايج بهتري را در پاك كردن سطوح از عوامل بيولوژيك اراي ه مي دهد (19). Fluorescence Intensity 4500.00 4000.00 3500.00 3000.00 2500.00 2000.00 1500.00 1000.00 500.00 0.00 A18 نمودار 2- ميزان فلورسانس سلولهاي A18 بدون رنگ آميزي و پس از رنگ آميزي با FDA و PI اندازه گيزي شد. براي كنترل كارآمدي روش از مخلوط سلول هاي زنده و مرده استفاده شد. مخلوط سلول هاي مرده و زنده به دو روش رنگ آميزي شد كه در بخش روش ها آمده است. Cal AM فلوروكرومهايي كه براي رنگ آميزي سلولي استفاده 13). مي شوند بر پايه پتانسيل اكسيد و احياي سيتوپلاسمي فعاليت زنجيره انتقال الكترون فعاليت آنزيمي پتانسيل غشاي سلولي و بر اساس حفظ تماميت غشاء عمل مي كنند (1 و 6). گزارشهاي متعددي مبني بر استفاده از رنگهاي فلورسانت يا مواد شيميايي مبتني بر فعاليت آنزيمي وجود دارد (17 و 20). ازمشتقات FDA بعنوان رنگ حياتي در رنگ آميزي سلولهاي باكتريهاي موجود در آب پساب و مواد پروبيوتيكي استفاده شده است (2 و فلوروكروم ديگري است كه مي تواند سلولهاي زنده و مرده را از يكديگر تفكيك نمايد. مطالعات نشان داده است كه ميزان فلورسانس پايين سلولهاي پستانداران رنگ شده باAM Cal حكايت از وجود سيستمهاي انتقال رنگ به بيرون از سيتوپلاسم دارد (8). در نيز اين پژوهش سلولهاي رنگ آميزي شده با فلورسانس پاييني را نشان دادند. Cal AM ميزان فلورسانس بدو طريق ميكروسكوپي و فلورومتري بررسي شد. اين نتايج با تحقيقات انجام شده برروي مخمر ساكاروميسس سرويزيه 822
لذا كه توسط كانشيرو و همكارانش انجام شده بود مطابقت داشت (5). ميزان پايين رنگ پذيري سلولهاي قارچي با رنگ مذكورمي تواند ناشي از غير قابل نفوذ بودن سلولها به رنگ و يا تفاوت در جايگاه اتصال رنگ در سلول باشد. Cal AM مناسب نبود. براي رنگ آميزي سلولهاي برعكس FDA تحقيق حاضر رنگ مناسبي براي ارزيابي سلولهاي زنده مورد نظر تشخيص داده شد. اين نتايج با كارهاي علمي كه ديگران انجام دادند مطابقت داشت. تحقيقات نشان داد كه رنگ FDA قادر است غشاي سلولهاي به لحاظ متابوليكي فعال را از سلولهاي غيرفعال متمايز نمايد (15 و 23). حسن و همكاران در سال 2002 از FDA براي رنگ آميزي Trichoderma harizanium استفاده نمودند (4). آنان نشان دادند كه قسمتهاي فعال هيف قارچي از ساير قسمتها غير فعال به راحتي قابل تمايز بود. لازم به ذكر است كه سلولهايي كه شديدا ملانيني بودند رنگ پذيري كمتري را نسبت به سلولهاي جوان تر نظر به نشان دادند. منافذ ديواره سلولي مي رسد كه ملانين و در نتيجه رنگ تواند اندازه مي پذيري قارچها را كاهش دهد. لوپس و همكاران نشان دادند كه تلفيق دو رنگ فلورسانس به خوبي مي تواند سلولهاي زنده و مرده را از يكديگر متمايز نمايد (7) كه ا ني نتايج با گزارش اسپيكما حاضر وهمكاران همخواني نداشت (14). نتايج تحقيق نشان داد كه با توجه به غير قابل نفوذ بودن سلولهاي زنده و مرده به رنگ PI استفاده همزمان اين دو رنگ ممكن نمي باشد. همچنين به نظر مي رسد كه افزايش مراحل شستشو به هنگام استفاده از دو رنگ موجب از دست رفتن تعداد بيشتري از سلولها شده و در نتيجه ميزان فلورسانس سلولهاي قارچي كاهش مي يابد. مطالعات نشان داده است قارچهايي كه در شرايط سخت محيطي رشد مي كنند داراي غشاهاي ضخيم و مقادير بالايي از ملانين هستند كه اين ويژگي رنگ پذيري آنها را از ساير سلولها متمايز ميكند. در ضمن در روش كلاسيك كشت و تعيين CFU ميكروارگانيسم هاي زنده اي كه قابليت كشت خود را از دست داده اند در محاسبه وارد نمي گردد. در بررسيهاي انجام شده قبلي توسط نويسنده نشان داده شد كه تا ثير بيوسايد ها موجب از دست رفتن قابليت كشت بسياري از سلولهاي زنده تيمار شده مي شود كه در روش كشت و تعيين CFU مقدار آنها محاسبه نمي گردد (تحت چاپ). به طور كلي مي توان نتيجه گيري كرد كه تكنيك فلورومتري روشي ساده و سريع براي نشان دادن ميكروبهاي پويكيلوتروف است. FDA مي تواند سلولهاي مورد نظر را رنگ نمايد. ميزان رنگ آميزي سلولها با روشهاي ميكروسكوپي و فلورومتري قابل مشاهده و اندازه گيري متفاوت شدت است. مي باشد. رنگ پذيري در سلولهاي مختلف تفاوت ساختار ديواره سلولي قارچها منجر به نتايج مختلف ميكروسكوپي و فلورومتري سلولها گرديد. از دو تكنيك به كار رفته روش فلورومتري بهتر از روش ميكروسكوپي قادر به نشان دادن تغييرات فعاليت سلولي قارچهاي پويكيلوتروف مي باشد. روش فلورومتري براي كمي كردن فعاليت بيوسايدها عليه ميكروارگانيسم هاي مو ثر در تخريب آثار باستاني مي تواند بكار رود. تشكر و قدرداني: بدين وسيله از معاونت محترم پژوهشي دانشگاه الزهرا در حمايت از انجام اين پژوهش تشكر مي گردد. اين كار بدون حمايتهاي فكري و علمي همكاران گروه زيست دانشگاه الزهرا و دانشگاه الدنبورگ ممكن نبود كه بدين ترتيب تقدير مي گردد. 1. Breeuwer, P. and T. Abee (2000). "Assessment of viability of microorganisms employing منابع fluorescence techniques." International Journal of Food Microbiology 55(1-3): 193-200. 823
2. Bunthof, C. J., S. van den Braak, P. Breeuwer, F. M. Rombouts and T. Abee (1999). "Rapid fluorescence assessment of the viability of stressed Lactococcus lactis." Applied and Environmental Microbiology 65(8): 3681-3689. 3. Chelsea Wao, Bob Daniels, Rod Stirling, Paul Morris. (2010). "Tebuconazole and propiconazole tolerance and possible degradation by Basidiomycetes: A wood-based bioassay. International Biodeterioration & Biodegradation, Volume 64, 5, August, 403-408 4. Hassan, M., G. Corkidi, E. Galindo and C. Flores, Serrano-Carre n,l (2002). "Accurate and rapid viability assessment of Trichoderma harzianum using fluorescence-based digital image analysis." Biotechnology and Bioengineering 80(6): 677-684. 5. Kaneshiro, E. S., M. A. Wyder, Y. P. Wu and M. T. Cushion (1993). "Reliability of CalceinAcetoxy Methyl-Ester and Ethidium Homodimer or Propidium Iodide for Viability Assessment of Microbes." Journal of Microbiological Methods 17(1): 1-16. 6. Kepner, R. L. and J. R. Pratt (1994). "Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present." Microbiological Reviews 58(4): 603-615. 7. Lopes, M. A., O. Fischman, W. Gambale and B. Correa (2003). "Fluorescent method for studying the morphogenesis and viability of dermatophyte cells." Mycopathologia 156(2): 61-66. 8. Millard, P. J., B. L. Roth, H. P. T. Thi, S. T. Yue and R. P. Haugland (1997). "Development of the FUN-1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts." Applied and Environmental Microbiology 63(7): 2897-2905. 9. Mohammadi, P., (2007). "Rock Inhabiting and Deteriorating Fungi from Carbonate Monuments of Persepolis - Isolation, Characterization, and Inhibitory Treatment." PhD Thesis, University of Oldenburg, Germany 10. Mohammadi, P., Gorbushina, A., Marquadt, J and Krumbein, WE (2011). "Isolated Fungi from Persepolis Rocks; a Study to Identify the Biodeteriorating Agents of Cultural Heritage in Iran."Iranian Journal of Biology (23)5:1-7. 11. Nugari M. P, Pietrini A. M, Caneva G, Imperi F, Visca P, (2009), Biodeterioration of mural painting in a rocky habitat: The crypt of original 824 Sin (Matera, Italy), "International Biodeterioration&Biodegradation ".63:705-711. 12. Porter, J., J. Robinson, R. Pickup and C. Edwards (1995). "Recovery of a Bacterial Subpopulation from Sewage Using Immunofluorescent Flow-Cytometry and Cell Sorting." Fems Microbiology Letters 133(1-2): 195-199. 13. Sauer K, (2003). The genomic and proteomics of biofilm formation. Genome Biology, 4:219 14. Sipkema, D., A. P. L. Snijders, C. Schroen, R. Osinga and R. H. Wijffels (2004). "The life and death of sponge cells." Biotechnology and Bioengineering 85(3): 239-247. 15. Söderstreom, B. E. (1977). "Vital Staining of Fungi in Pure Cultures and in Soil with Fluorescein Diacetate." Soil Biology & Biochemistry 9(1): 59-63. 16. Staley, J. T., F. Palmer and J. B. Adams (1982). "Microcolonial Fungi - Common Inhabitants on Desert Rocks." Science 215(4536): 1093-1095. 17. Taylor, S. (1992). "Composition and activity of bacterial populations found on decaying stonework." PhD thesis, University of Portsmouth, England. 18. Tretiach Mauro, Stefano BertuzziandOrnella Salvadori, (2010), Chlorophyll a fluorescence as a practical tool for checking the effects of biocide treatments on endolithic lichens. International Biodeterioration & Biodegradation,64:452-460 19. Valentini F, Diamanti A, Palleschi G, (2010), New bio-cleaning strategies on porous building materials affected by biodeterioration event, Applied Surface Science, 256: 6550-6563 20. Warscheid, T. (1990). "Untersuchungen zur Biodeterioration von Sandsteinen unter besondere Berücksichtigung der chemoorganotrophen Bakterien."PhD thesis, University of Oldenburg, Germany. 21. White C. S, Collins J. L and Newman, (1938), The clinical use of alkyl-dimethyl benzylammonium chloride: A preliminary report, The American Journal of Surgery, 39:607-609 22. Willem De Muynck, Anibal Maury Ramirez, Nele De. Belie, Willy Verstraete, (2009) Evaluation of strategies to prevent algal fouling on white architectural and cellular concrete Original Research International Biodeterioration & Biodegradation, Volume 63: Pages 679-689
23. Ziegler, G., E. Ziegler and R. Witzenhausen (1975). "Vital fluorescent staining of microorganisms by 3', 6'-diacetyl-fluoresceine for determination of their metabolic activity." ZentralblBakteriol: 30(2): 252-64. 24. (1999) Microbiology and Biogeochemistry of Hypersaline Environments, CRC Press, pp: 75-86. 25. (1999) The Phototrophic Prokaryotes".(edt) Kluwer Academic/Plenum publisher, New York, pp: 657-663 26. (2000) Microbial Sediments, Springer, and Berlin: 161-170 Spectrofluorometry as a tool to evaluate biocide efficiency on deteriorating rock fungi Mohammadi P. Biology Dept., Faculty of Science, Alzahra University, Tehran, I.R. of IRAN Abstract Biodeterioration of monuments is one of the principal fields of interest for researchers in the conservation of cultural heritage. Microorganisms which are living on inorganic substrate can settle and spread on and into the rock materials and cause biological damages.the aim of this study was to assay effectiveness of chemical treatment which is applied in the restoration and renovation of cultural heritage by using a fluorometric method. Because cell viability is a critical parameter for assessment of success of biocide treatments, one of the objectives of research was to find a reliable method to estimate the efficacy of chemicals on rock fungi. The fluorometry tests were performed with two isolates A18 (Trimmatostroma abietis) and J26 (Exophilia jeanselmei). The cells were treated by Alkyl benzyl dimethyl ammonium chloride (BAC) 1%. Then the cells were stained with FDA (fluorescein diacetate) and Cal AM (Calcein AM), PI (Propidium Iodide), and combinations of them. The fluorometric method was done to measure the alterations of cell viability after chemical treatment. FDA stained cells performed a strong staining under microscopic as well as fluorometric recording. After cells were incubated in presence of Cal AM, fluorescence of individual cells was measured and a weak fluorescence was observed. Fungi stained by PI were not visible in any microscopic experiment. Furthermore, the fluorometric method did not show any considerable fluorescence intensity of PI stained cells. When combination of dyes was used, stained cells had not only a low yield qualitatively and quantitatively, also the fluorescence intensity of FDA was decreased. On the contrary, when FDA was used alone, strong fluorescence intensity was shown and it could well be used for chemical treatment assays and to quantify the efficacy of the chemical treatment. FDA fluorometry is accurate, reproducible and economic in both time and materials spent. Keywords: rock fungi, fluorescein diacetate, spectrofluorometry 825