ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ «Μελέτη του νευροπροστατευτικού νευροστεροειδούς BNN 50 σε φυσιολογικούς και παρκινσονικούς (weaver) μύες σε σχέση με την υπεροξείδωση λιπιδίων και πρωτεϊνών» ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Καδόγλου Κορνηλία Βιολόγος ΠΑΤΡΑ ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ 2014 1

ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΕΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΥΠΟΓΡΑΦΕΣ Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Γεωργίου Χρήστος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Παναγόπουλος Νικόλαος Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Ματσώκης Νικόλαος Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Ο Επιβλέπων Καθηγητής Γεωργίου Χρήστος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών 2

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι μεταλλαγμένοι μύες weaver αποτελούν ένα μοναδικό γενετικό μοντέλο της νόσου Πάρκινσον. Πρόκειται για μια νευροβιολογική μετάλλαξη η οποία συμβολίζεται ως wv και περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Lane (1964). Πρόκειται για μετάλλαξη με λάθος νόημα στο γονίδιο Girk 2 που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 16 του ποντικού σε μια περιοχή ανάλογη με την περιοχή του 21 χρωμοσώματος του ανθρώπου που ευθύνεται για το σύνδρομο Down και οδηγεί σε τροποποίηση της λειτουργίας ενός διαύλου καλίου. Επειδή ο εγκέφαλος των θηλαστικών είναι από τους πιο ευαίσθητους ιστούς πολλές μελέτες έχουν γίνει για τις επιδράσεις των φαρμάκων (νευροστεροειδών), στην παθογένεια και στην αντιμετώπιση των νευροεκφυλιστικών νόσων. Ο παράγοντας BNN 50 είναι ένα νευροστεροειδές που έχει συνώνυμο το BNN 20. Παράγεται από το ανδρογόνο νευροστεροειδές δεϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA) με εποξείδωση της 17-κετομάδας του με χρήση trimethylsulfonium methylide (τριμεθυλοσούλφωνο-μεθυλίδιο). Έχει το πλεονέκτημα ότι δεν μεταβολίζεται σε οιστρογόνα ενδογενώς, όπως το DHEA, κι επομένως ενδέχεται να είναι καταλληλότερο για φαρμακευτική χρήση. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η επίδραση στο οξειδωτικό στρες του νευροστεροειδούς BNN 50 σε εγκεφάλους μυών κατά την 21 ημέρα με ταυτόχρονο προσδιορισμό των επιπέδων υπεροξείδωσης λιπιδίων και πρωτεϊνών στις ακόλουθες περιοχές: α) CE (παρεγκεφαλίδα), β) HIP (ιππόκαμπος), γ) CX (εγκεφαλικός φλοιός). Για το σκοπό αυτό τα πειραματόζωα χωρίστηκαν στις ακόλουθες 4 ομάδες: 1) φυσιολογικοί μύες (control) χωρίς BNN 50, με saline 2) control με BNN 50, 3) weaver χωρίς BNN 50 με saline και 4) weaver με ΒΝΝ 50. Οι μύες (control-weaver) δέχονταν BNN 50 (100 mg/kg σωματικού βάρους) ημερησίως από την πρώτη μέρα της ζωής (με ενδοπεριτοναϊκή ένεση) και για διάστημα 18 ημερών. Μετά την τελευταία ένεση, οι μύες θανατώθηκαν και οι εγκεφαλικοί ιστοί απομονώθηκαν σε ειδικό αντιοξειδωτικό ρυθμιστικό διάλυμα. Για τον προσδιορισμό του βαθμού λιπιδικής υπεροξείδωσης στα ομογενοποιήματα των ιστών 3

χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης η MDA (μηλονική δυαλδεύδη), σε ελεύθερη μορφή και συνδεδεμένη με πρωτεΐνες (FrMDA και PrMDA, αντιστοίχως). Επίσης, ποσοτικοποιήθηκαν και τα υδροϋπεροξείδια των λιπιδίων και των πρωτεϊνών (LOOH και PrOOH, αντιστοίχως). Όσον αφορά τα αποτελέσματα βρέθηκε ότι: (1) το νευροστεροειδές BNN 50 δρα αντιοξειδωτικά στις δυο από τις τρεις περιοχές εγκεφάλου που μελετήθηκαν (ιππόκαμπος και παρεγκεφαλίδα), και (2) οι μύες weaver στους οποίους είχε χορηγηθεί το φάρμακο είχαν χαμηλότερες τιμές σε τρεις από τους τέσσερις δείκτες ελέγχου για λιπιδική και πρωτεϊνική υπεροξείδωση εκτός από τα πρωτεϊνικά υπεροξείδια. Συνεπώς η αντιοξειδωτική δράση των νευροστεροειδών ενδέχεται να συντελέσει στην ανάπτυξη νέων μεθόδων θεραπείας για την αντιμετώπιση των νευροεκφυλιστικών νόσων. 4

ABSTRACΤ The mutant mouse weaver constitutes a unique genetic model of Parkinson's disease. It is a neurobiological mutation denoted wv and first described by Lane (1964). This mutation in the wrong sense Girk 2 gene located on chromosome 16 of the mouse in a region similar to the region of human chromosome 21 that is responsible for the syndrome Down and leads to modulation of the function of a potassium channel. Because the brain of mammals is among the most sensitive tissues many studies have been done on the effects of drugs (neurosteroids) in the pathogenesis and treatment of neurodegenerative diseases. The agent BNN 50 is a neuroactive steroids having synonymous BNN 20. Produced by neuroactive steroids androgen dehydroepiandrosterone (DHEA) by epoxidation of 17- keto group of using trimethylsulfonium methylide (trimethylsulfonium - methylide). It has the advantage that it is metabolized to endogenous estrogens, such as DHEA, and therefore may be suitable for pharmaceutical use. The purpose of this study is to investigate the effect of oxidative stress neurosteroid BNN 50 in brains muscle at day 21 with simultaneous determination of the levels of lipid peroxidation and protein in the following areas: a) CE (cerebellum), b) HIP (hippocampus) c) CX (cerebral cortex). For this purpose, the animals were divided in the following four groups: 1) normal muscles (control) without BNN 50, with saline 2) control with BNN 50, 3) weaver without BNN 50 with saline and 4) weaver with BNN 50. Muscles accept BNN 50 (100 mg / kg body weight) per day from the first day of life (by intraperitoneal injection) and for 18 days. After the last injection, the mice were sacrificed and brain tissues were isolated in a special antioxidant buffer. For determining the degree of lipid peroxidation in tissue homogenates was used as the index of MDA (dyaldefdi malonate), in free form and bound protein (FrMDA and PrMDA, respectively). Also quantitated and hydroperoxides of lipids and proteins (LOOH and PrOOH, respectively). Regarding the results found that: (1) the neuroactive steroids BNN 50 acts antioxidants in two of the three brain regions studied (hippocampus and cerebellum), and (2) the weaver mice dosed with the drug were lower in three of four indicators for monitoring lipid peroxidation and protein than the protein peroxides. Therefore, the antioxidant activity of neurosteroids may contribute to the development of new therapies for the treatment of neurodegenerative diseases. 5

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή διεκπεραιώθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, του Πανεπιστημίου Πατρών κατά το χρονικό διάστημα 2011-2013. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Χρήστο Γεωργίου για την ευκαιρία μου έδωσε να αντιμετωπίσω το συγκεκριμένο εργαστηριακό θέμα, την υπομονή και τη συμπαράσταση σε όλη την διάρκεια των πειραμάτων και τη συμμετοχή του στα προβλήματα που προέκυπταν καθώς και τη συνεχή καθοδήγηση του. Ακόμη ένα μεγάλο ευχαριστώ στον αναπληρωτή καθηγητή κ. Νικόλαο Ματσώκη και τον λέκτορα κ. Νικόλαο Παναγόπουλο για την πρόσβαση στον Τομέα Φυσιολογίας Ζώων, τις σημαντικές παρατηρήσεις τους και την συμβολή τους στις θυσίες των πειραματόζωων, την πρόθυμη στάση τους και όλες τις σημαντικές πληροφορίες που μου παρείχαν. Θα ήταν μεγάλη παράβλεψη να μην ευχαριστήσω την συμφοιτήτριά μου Θεοδώρα Μούρτζη για όλες τις ώρες που αφιέρωσε στο εργαστήριο κοντά μου, και τη συμμετοχή στην διαδικασία των θυσιών και της απομόνωσης των εγκεφαλικών περιοχών, καθώς και στην παραχώρηση σημαντικών πληροφοριών. Ένα ακόμη ευχαριστώ στον υποψήφιο διδάκτορα Δημήτριο Ζησιμόπουλο που ήταν κοντά μου από την αρχή μέχρι την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής, με υπομονή, ηρεμία κατανόηση και προθυμία, κάνοντας αυτή την συνεργασία αποδοτική και αποτελεσματική. 6

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 3 ABSTRACΤ... 5 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ... 11 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ (ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ)... 12 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 12 1.1 ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ... 13 1.2 ΕΛΕΥΘΕΡΕΣ ΡΙΖΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ... 14 1.3 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ - ΒΛΑΒΕΣ ΣΤΑ ΒΙΟΜΟΡΙΑ... 20 1.3.1 Δράση σε νουκλεϊκά οξέα... 20 1.3.2 Δράση σε πρωτεΐνες... 21 1.3.3 Δράση στα λιπίδια... 22 1.3.4 Δράση στα ιόντα του Ca ++... 24 1.3.5 Δράση στην επικοινωνία των κυττάρων... 24 1.4 Δευτερογενή προϊόντα υπεροξείδωσης λιπαρών οξέων.... 25 1.4.1 Μηλονική δυαλδεΰδη (MDA)... 25 1.4.2 4-Υδροξυ-2-νονενάλη (HNE)... 27 2. ΔΕΙΚΤΕΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ ΣΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ... 27 2.1 ΕΞΩΓΕΝΕΙΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΕΣ ΠΗΓΕΣ... 27 2.2 ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΙ ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ... 28 2.2.1 ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΕΣ... 28 2.2.2 Υπεροξεική δισμουτάση (SOD)... 29 2.2.3 Καταλάση (CAT)... 30 2.2.4 Υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης (GPxs)... 30 2.2.5 Αναγωγάση της οξειδωμένης γλουταθειόνης (GR)... 31 2.2.6 Θειοαναγωγάσες TRX... 31 2.2.7 Μεταλλοθειονίνες... 32 2.3 ΜΗ ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΕΣ... 32 2.3.1 Ασκορβικό οξύ... 32 2.3.2 Βιταμίνη Ε... 33 2.3.3 Το συνένζυμο Q 10... 33 2.3.4 Καροτενοειδή... 34 7

2.3.5 Ουρικό οξύ... 34 2.3.6 Γλουταθειόνη (GSH)... 35 2.3.7 Πρωτεϊνικές θειόλες... 36 3. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ, ΚΛΙΝΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ... 36 4. ΝΟΣΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ... 40 4.1 ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ... 41 4.1.1 Περιβαλλοντικές τοξίνες... 42 4.1.2 Λοιμώδη αίτια... 43 4.1.3 Γενετική προδιάθεση... 43 4.1.4 Μοριακοί παθογενετικοί παράγοντες... 43 4.1.5 Οι παράγοντες ζωής... 43 5. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΚΑΙ ΔΙΑΤΑΡΑΧΗ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΩΝ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΩΝ... 45 6. ΣΥΝΕΠΕΙΕΣ ΤΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΗΣ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΣΤΗ ΝΟΣΟ ΤΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ... 45 7. ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΤΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΤΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ I... 46 8. ΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΤΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΤΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ Ι... 47 9. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ, ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΚΑΙ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ... 47 10. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΝΕΥΡΟΦΛΕΓΜΟΝΗ ΚΑΙ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ.. 47 11. ΑΝΑΤΟΜΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΟ Κ.Ν.Σ ΤΟΥ ΜΥΟΣ WEAVER... 51 11.1 Η μετάλλαξη weaver... 51 11.2 ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑ... 52 11.3 ΡΑΒΔΩΤΟ ΣΩΜΑ... 52 11.4 ΜΕΣΕΓΚΕΦΑΛΟΣ... 52 11.5 ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΣ... 53 12. ΖΩΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ... 56 12.1 Το μοντέλο της ρεζερπίνης... 57 12.2 Το μοντέλο της μεθαμφεταμίνης... 57 12.3 Τριχλωροαιθυλένιο (TCE)... 58 12.4 6-Υδροξυντοπαμίνη (6-ΟΗDΑ)... 58 12.5 1-Μεθυλ-4-φαινυλ-1, 2, 3, 6-τετραϋδροπυριδίνη (ΜΡΤΡ)... 60 8

12.6 Παρακουάτ (paraquat)/maneb... 62 12.7 Ροτενόνη (Rotenone)... 63 12.8 Το μοντελο της 3-nitrotyrosine... 65 13. ΜΕΛΕΤΕΣ ΣΕ ΜΟΝΤΕΛΑ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ... 66 13.1 Νευροστεροειδή και νευροπροστασία... 67 13.2 Νέες προοπτικές... 68 14. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΣΕ ΜΟΝΤΕΛΑ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ... 69 14.1 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 72 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 76 1. ΜΟΝΤΕΛΟ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗΣ ΠΟΡΕΙΑ... 76 1.1 ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ... 77 2. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΕΘΟΔΩΝ... 78 2.1 Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών με τη νέα υπερευαίσθητη μέθοδο Bradford... 78 2.2 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης (standard curve) για την ευαίσθητη Bradford... 79 2.3 Φωτομετρικός προσδιορισμός των οργανικών υδροϋπεροξειδίων (LOOH) και των πρωτεϊνικών υδροϋπεροξειδίων (PrOOH) με την μέθοδο FΟΧ.... 81 2.4 Φωτομετρικός προσδιορισμός των οργανικών υδροϋπεροξειδίων (LOOH)... 83 2.5 Φωτομετρικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών υδροϋπεροξειδίων (PrOOH)... 83 2.6 Φθορισμομετρικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών (PrMDA) και μη πρωτεϊνικών (FrMDA) αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων... 84 2.7 Φθορισμομετρικός προσδιορισμός των μη πρωτεϊνικών (FrMDA) αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης λιπιδίων... 86 2.8 Φθορισμομετρικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών (PrMDA) αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων... 86 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 88 1. Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες σε μυες ηλικίας 21 ημερών control και weaver και η επίδραση του φαρμάκου ΒΝΝ 50 σε σχέση με την νευροπροστασία στους δείκτες αυτούς στην παρεγκεφαλίδα (CE).... 88 9

2. Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες σε μυες ηλικίας 21 ημερών control και weaver και η επίδραση του φαρμάκου ΒΝΝ 50 σε σχέση με την νευροπροστασία στους δείκτες αυτούς στον ιππόκαμπο (HIP).... 99 3. Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες σε μυες ηλικίας 21 ημερών control και weaver και η επίδραση του φαρμάκου ΒΝΝ 50 σε σχέση με την νευροπροστασία στους δείκτες αυτούς στον εγκεφαλικό φλοιό (CX)... 97 4. ΣΥΓKΡΙΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΤΟΥ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΥΠΟ ΜΕΛΕΤΗ ΠΕΡΙΟΧΕΣ... 101 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 106 1. Επίδραση της χορήγησης του νευροστεροειδούς ΒΝΝ 50 στα επίπεδα των LOOH φυσιολογικών (control) και weaver (wv/wv) μεταλλαγμένων μυών σε παρεγκεφαλίδα, ιππόκαμπο και στον εγκεφαλικό φλοιό.... 107 2. Επίδραση της χορήγησης του νευροστεροειδούς ΒΝΝ 50 στα επίπεδα των PrOOH φυσιολογικών (control) και weaver (wv/wv) μεταλλαγμένων μυών σε παρεγκεφαλίδα, ιππόκαμπο και στον εγκεφαλικό φλοιό.... 108 3. Επίδραση της χορήγησης του νευροστεροειδούς ΒΝΝ 50 στα επίπεδα των PrMDA φυσιολογικών (control) και weaver (wv/wv) μεταλλαγμένων μυων σε παρεγκεφαλίδα, ιππόκαμπο και στον εγκεφαλικό φλοιό.... 108 4. Επίδραση της χορήγησης του νευροστεροειδούς ΒΝΝ 50 στα επίπεδα των FrMDA φυσιολογικών (control) και weaver (wv/wv) μεταλλαγμένων μυών σε παρεγκεφαλίδα, ιππόκαμπο και στον εγκεφαλικό φλοιό.... 109 5. Εκτίμηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων και της νευροπροστασίας. 110 6. Εκτίμηση της νευροπροστατευτικής επίδρασης του φαρμάκου (ΒΝΝ 50) στη λιπιδική υπεροξείδωση (δείκτης οξειδωτικού στρες).... 112 7. Εκτίμηση της μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό των δεικτών του οξειδωτικού στρες.... 114 8. Συμπεράσματα... 115 Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 117 10

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ROS: δραστικές μορφές οξυγόνου PrMDA: πρωτεϊνικά δεσμευμένη MDA PrOOH: πρωτεϊνικά υδροϋπεροξείδια FrMDA: μη πρωτεϊνική (ελεύθερη) MDA LOOH: λιπιδικά (οργανικά) υδροϋπεροξείδια TBA: θειοβαρβιτουρικό οξύ MDA: μηλονική δυαλδεϋδη OH : ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου H 2 O 2 : υπεροξείδιο του υδρογόνου ΒΗΑ: Butyl hydroxylanisole GSH: αναγμένη γλουταθειόνη 11

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ (ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ) 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Τα αίτια των έμμεσα τοξικών ιδιοτήτων του οξυγόνου ήταν άγνωστα πριν από την δημοσίευση της θεωρίας των Gershman και συν το 1954, σύμφωνα με την οποία η τοξικότητα του οξυγόνου οφείλονταν σε μερικώς αναχθείσες μορφές οξυγόνου. Η παρουσία δραστικών ριζών οξυγόνου στα βιολογικά υλικά περιγράφηκε για πρώτη φορά πριν από 50 χρόνια περίπου. Λίγο αργότερα ο Denham Harman διατύπωσε την υπόθεση ότι οι ρίζες οξυγόνου μπορεί να παράγονται in vivo ως παραπροϊόντα των βιολογικών αντιδράσεων. Ο όρος οξειδωτική κατάσταση άρχισε να χρησιμοποιείται στα τέλη της δεκαετίας του 60 (free radical theory) ενώ η πρώτη οργανική ελεύθερη ρίζα που απομονώθηκε ήταν το τριφαινυλομεθύλιο από τον Moses Gomberg. Σχήμα 1. Σχηματισμός της ρίζας τριφαινυλομεθυλίου (ένωση 2) από το τριφαινυλοχλωρομεθάνιο (ένωση 1) [Gomberg, 1900]. Η ανακάλυψη του ενζύμου δισμουτάση του υπεροξειδίου από τους McCord και Fridovich το 1969 αποτέλεσε την απαρχή μιας νέας εποχής για την διερεύνηση των δράσεων των δραστικών ριζών οξυγόνου στους ζώντες οργανισμούς. Μια τρίτη εποχή έρευνας σχετικά με τις δράσεις των δραστικών ριζών οξυγόνου ξεκίνησε όταν εμφανίστηκαν οι πρώτες αναφορές που περιέγραφαν ευεργετικές δράσεις, ο Mittal και Murard το 1977 ανάφεραν ότι το ανιόν του υπεροξειδίου (Ο -. 2 ), δια της ρίζας υδροξυλίου που παράγεται από αυτό διεγείρει την ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης και τον σχηματισμό του δεύτερου αγγελιοφόρου cgmp. Παρόμοιες δράσεις αναφέρθηκαν για το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Έγινε επίσης γνωστός ο 12

ρόλος του μονοξειδίου του αζώτου στην χάλαση των λείων μυϊκών ινών και στην αναστολή της προσκόλλησης των αιμοπεταλίων. Οι Roth και Droge το 1987 ανέφεραν ότι στα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα το ανιόν υπεροξειδίου ή οι χαμηλές συγκεντρώσεις υπεροξειδίου του υδρογόνου αυξάνουν την παραγωγή του αυξητικού παράγοντα των Τ κυττάρων, ιντερλευκίνη-2. Οι Stortz και συν το 1985 ανέφεραν την επαγωγή γονίδιων στα βακτήρια από το υπεροξείδιο του υδρογόνου και οι Schreck και Baeuerle το 1995 ανέφεραν την επαγωγή του μεταγραφικού παράγοντα NFκΒ από το υπεροξείδιο του υδρογόνου στα κύτταρα των θηλαστικών. Στις αρχές του 21 αιώνα έχει γίνει πλέον σαφές όχι μόνο ότι οι ζώντες οργανισμοί έχουν προσαρμοστεί στα αυξημένα επίπεδα ελεύθερων ριζών οξυγόνου, αλλά και ότι έχουν αναπτύξει μηχανισμούς για την χρησιμοποίηση αυτών σε μεγάλο αριθμό φυσιολογικών λειτουργιών. 1.1 ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ Ως οξειδωτικές ουσίες ορίζονται γενικά μόρια ή μοριακά θραύσματα που έχουν μονήρες ηλεκτρόνιο στο μόριο τους (Slater 1984). Αυτές συμβολίζονται συνήθως με μια άνω τελεία μετά το μόριο της ένωσης R.. Ως οξειδωτικό στρες ορίζεται η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ των προ-οξειδωτικών και αντί-οξειδωτικών ουσιών του κυττάρου και οφείλεται είτε σε αυξημένη παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου είτε σε ανεπάρκεια των κυτταρικών αντί-οξειδωτικών μηχανισμών. Σαν αντιοξειδωτικές ορίζονται ουσίες που έχουν την ιδιότητα σε μικρή συγκέντρωση να εμποδίζουν την δημιουργία ή την δράση οξειδωτικών ουσιών. Η περίσσεια των δραστικών ριζών προκαλεί βλάβες στα κυτταρικά λιπίδια, τις πρωτεΐνες ή το DNA αναστέλλοντας έτσι την λειτουργία τους. Κατά συνέπεια το οξειδωτικό στρες ενοχοποιείται στην παθοφυσιολογία πολλών νοσημάτων καθώς και στην διεργασία της γήρανσης. Η λεπτή ισορροπία ανάμεσα στις ευεργετικές και τις βλαβερές δράσεις των δραστικών ριζών έχει ιδιαίτερη σημασία για τους ζώντες οργανισμούς και διαφυλάσσεται με μηχανισμούς γνωστούς ως «οξειδο-αναγωγική ρύθμιση (redox regulation)». Η οξειδο-αναγωγική ρύθμιση διατηρεί την οξειδο-αναγωγική ομοιόσταση και προστατεύει τους ζώντες οργανισμούς από το οξειδωτικό στρες. Σύμφωνα μάλιστα με ένα νέο ορισμό που έχει πρόσφατα προταθεί, το οξειδωτικό στρες μπορεί να οριστεί ως η διαταραχή της οξειδοαναγωγικής ρύθμισης. 13

1.2 ΕΛΕΥΘΕΡΕΣ ΡΙΖΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Είναι πλέον γνωστό ότι οι ελεύθερες ρίζες αποτελούν προϊόντα του φυσιολογικού κυτταρικού μεταβολισμού και παίζουν διττό ρόλο άλλοτε είναι ευεργετικές για τα κύτταρα και τους οργανισμούς και άλλοτε βλαπτικές. Υπό φυσιολογικές συνθήκες οι κύριες πηγές παραγωγής ελεύθερων ριζών οξυγόνου είναι η διαρροή ηλεκτρονίων από τις μιτοχονδριακές και τις μικροσωμιακές αλυσίδες μεταφοράς ηλεκτρονίων, η φαγοκύττωση και τα ενδογενή ενζυμικά συστήματα. Οι ευεργετικές δράσεις των ελεύθερων ριζών οξυγόνου παρατηρούνται σε χαμηλές, μέτριες συγκεντρώσεις και αφορούν σε φυσιολογικούς ρόλους την κυτταρική απόκριση στο στρες, την μεταγωγή σήματος, την κυτταρική διαφοροποίηση, την μεταγραφή γονιδίων, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την φλεγμονή και την απόπτωση. Ως ελεύθερη ρίζα ορίζεται ένα άτομο ή μόριο με δυνατότητα αυτοδύναμης ύπαρξης το οποίο περιέχει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Η έννοια που ασύζευκτου ηλεκτρονίου υποδηλώνει ότι ένα ηλεκτρόνιο κινείται μόνο του σε μια τροχιά γύρω από τον πυρήνα του ατόμου σε αντίθεση με το σύνηθες φαινόμενο της ύπαρξης δυο ηλεκτρονίων σε κάθε τροχιά, τα οποία παρουσιάζουν αντίθετη στροφορμή ή spin. Η παρουσία ασύζευκτου ηλεκτρονίου προσδίδει στις ρίζες οξυγόνου ιδιαίτερη δραστικότητα και μπορούν είτε να λάβουν ηλεκτρόνιο από άλλα μόρια, είτε να δώσουν συμπεριφερόμενες έτσι ως οξειδωτικές ή αναγωγικές ουσίες. Οι ελεύθερες ρίζες μπορούν να είναι θετικά ή αρνητικά φορτισμένες ή και ουδέτερες. R + OH R + OH O 2 + e - O 2 -. O 2 - + H 2 O HO 2 + OH - Οι ελεύθερες ρίζες μπορούν να παραχθούν με την διάσπαση ενός ομοιοπολικού δεσμού ή με αντιδράσεις μεταφοράς ηλεκτρονίου: A:B A + B [Autor, 1982] A - : + B A + B- [Babior, 1982] 14

Εικόνα 1. Πηγές σχηματισμού των ελευθέρων ριζών. Οι ελεύθερες ρίζες παράγονται στα μιτοχόνδρια κατά τη μεταφορά ηλεκτρονίων στο Ο 2 κατά την οξειδωτική φωσφορυλίωση, στις φλεγμονώδεις καταστάσεις, αλλά και λόγω της έκθεσης σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) και η ιονίζουσα ακτινοβολία, η ρύπανση της ατμόσφαιρας και το κάπνισμα (www.ehowtogetridofstretchmarks.com%252fthe-effects-of-free-radicals-onskin%252f%3b492%3b372). Τέτοιες αντιδράσεις συμβαίνουν κατά την απορρόφηση ακτινοβολίας από μοριακές ενώσεις ή κατά την διάρκεια οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων. Η πρόπτωση ιονίζουσας ακτινοβολίας μπορεί να οδηγήσει στην δημιουργία μιας πληθώρας ελεύθερων ριζών. Όσον αφορά υδατικά διαλύματα η ιονίζουσα ακτινοβολία οδηγεί στην δημιουργία ελεύθερων ριζών Η, ΟΗ, και eaq που στην συνέχεια μπορούν να αντιδράσουν με γειτονικά μόρια και να ξεκινήσουν την αλληλουχία οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων. Μη ιονίζουσα ακτινοβολία με κατάλληλο μήκος κύματος μπορεί να προκαλέσει την διάσπαση ομοιοπολικών δεσμών (ο C-C δεσμός χρειάζεται περίπου 350 Kj/mol για να διασπαστεί) ενώ ακτινοβολίες με μεγαλύτερα μήκη κύματος μπορούν να προκαλέσουν τη δημιουργία ελεύθερων ριζών, αν δράσει ως διαμεσολαβητής κάποιο φωτοευαίσθητο μόριο το οποίο αρχικά θα ενεργοποιηθεί και στην συνέχεια θα οδηγήσει στην δημιουργία ελεύθερων ριζών. Οι ελεύθερες ρίζες είναι μόρια εξαιρετικά ασταθή και έχουν την τάση να αντιδρούν ταχύτατα με γειτονικά μόρια και να σταθεροποιούνται ενεργοποιώντας όμως με τον τρόπο αυτό μια αλυσίδα αντιδράσεων που ως τελικό αποτέλεσμα μπορεί να έχει την διάσπαση, την απενεργοποίηση, ή την τροποποίηση της διαμόρφωσης ενός σημαντικού μορίου ή 15

την παραγωγή ενός νέου μορίου. Λόγω της μεγάλης αστάθειάς τους οι ελεύθερες ρίζες δρουν στο άμεσο τους περιβάλλον και συνήθως αντιδρούν με ένα ανενεργό μόριο και δεν ενεργοποιούν την αλυσίδα οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων. Συνηθέστερα το άτομο που συμμετέχει στην δημιουργία των ΕΡ είναι το οξυγόνο και οι αντίστοιχες ρίζες ονομάζονται Ενεργές Μορφές Οξυγόνου (Reactive Οxygen Species, ROS). Οι κυριότερες από αυτές είναι το όζον, το υπεροξείδιο του υδρογόνου, η ρίζα του υδροξυλίου, υπεροξείδια οργανικών οξέων, υποχλωριώδες οξύ και υπεροξείδια του αζώτου. Πίνακας 1: Οι κυριότερες ελεύθερες ρίζες και αντιδράσεις απο τις οποίες προκύπτουν Α) Μοριακό οξυγόνο Στο μοριακό οξυγόνο παρατηρείται μια μοναδική ηλεκτρονική διαμόρφωση η οποία το καθιστά ελεύθερη ρίζα. Σχηματίζεται όταν ένα από τα δύο ασύζευκτα περιφερικά ηλεκτρόνια μεταπηδήσει σε ανώτερη ηλεκτρονική στιβάδα υπό την επίδραση ενέργειας. Το άτομο είναι εξαιρετικά ασταθές και έχει την τάση να επανέρχεται στην αρχική του κατάσταση με αποβολή ενέργειας. Σχηματίζεται μέσα στο σώμα υπό την επίδραση υπεροξειδασών και λιποξυγενασών αλλά και σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις του δέρματος. 16

Β) Όζον Ισχυρή οξειδωτική δράση εμφανίζει το όζον, που βρίσκεται στα ανώτερα επίπεδα της ατμόσφαιρας και δρα προστατευτικά απορροφώντας την υπεριώδη ακτινοβολία. Παράγεται από την συνένωση μοριακού με ατομικό οξυγόνο. Εντός του οργανισμού προσβάλλει κυρίως διπλούς δεσμούς δημιουργώντας οζονίδια τα οποία με την σειρά τους διασπώνται σε οργανικές ελεύθερες ρίζες και Η 2 Ο 2. Γ) Υπεροξείδιο του υδρογόνου Παράγεται εντός του οργανισμού από πολλές αντιδράσεις όπως κατά την ενσωμάτωση ιωδίου στο μόριο της θυροξίνης και κατά την διάρκεια της λύσης των βακτηρίων που έχουν υποστεί φαγοκύττωση. Είναι λιποδιαλυτό και μπορεί να διαπερνά τις κυτταρικές μεμβράνες. Το ίδιο δεν είναι ιδιαίτερα δραστικό καθώς διασπάται από την δράση της καταλάσης σε Η 2 Ο και σε οξυγόνο. Έχει όμως την δυνατότητα να σχηματίσει ρίζα υδροξυλίου κατά την αντίδραση Fenton. Δ) Υπεροξείδιο του οξυγόνου Παράγεται κατά τις αντιδράσεις παραγωγής ενέργειας στον οργανισμό όταν το Ο 2 προσλάβει ένα επιπλέον ηλεκτρόνιο. Ο ρυθμός παραγωγής του εξαρτάται από τον ρυθμό παροχής οξυγόνου στα μιτοχόνδρια. In vivo, το Ο - 2 παράγεται τόσο ενζυμικά όσο και μη ενζυμικά. Στις ενζυμικές πηγές συμπεριλαμβάνονται οι NADPH οξειδάσες που εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη των πολυμορφοπύρηνων, των μακροφάγων και των ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και οι εξαρτώμενες από το κυτόχρωμα P 450 οξυγενάσες. Μια άλλη πηγή Ο - 2 και Η 2 Ο 2 αποτελεί η πρωτεολυτική μετατροπή της αναγωγάσης της ξανθίνης σε οξειδάση της ξανθίνης. Η μη ενζυμική παραγωγή του Ο - 2 γίνεται όταν μονήρες ηλεκτρόνιο μεταφέρεται άμεσα στο οξυγόνο είτε από αναχθέντα συνένζυμα είτε από προσθετικές ομάδες ή από ξενοβιοτικά τα οποία προηγουμένως έχουν αναχθεί από ορισμένα ένζυμα. Η αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων των μιτοχονδρίων διαθέτει πολλά οξειδοαναγωγικά κέντρα από τα οποία μπορούν να διαφύγουν ηλεκτρόνια προς το οξυγόνο συνιστώντας έτσι την κύρια πηγή Ο - 2 για τους περισσότερους ιστούς. Το οξυγόνο στην συνέχεια μπορεί να οδηγήσει στην δημιουργία άλλων ελεύθερων ριζών και κυρίως ριζών υδροξυλίου μέσω της αντίδρασης Harber-Weiss. Η τελευταία αποτελείται από δυο επιμέρους αντιδράσεις; 17

Fe +3 + O 2 - Fe +2 + O 2 Η δεύτερη αντίδραση είναι γνωστή και ως αντίδραση Fenton όπου ο δισθενής σίδηρος αντιδρά με το υπεροξείδιο του υδρογόνου προς ρίζα υδροξυλίου και ανιόν υδροξυλίου. Fe 2 +2 + H 2 O 2 Fe +3 + OH + OH Αθροίζοντας τις δυο αντιδράσεις παίρνουμε την τελική αντίδραση που έχει ως εξής: O 2 - + H 2 O 2 HO - + OH + O 2 Φαίνεται ότι ο σίδηρος σε όλη την αντίδραση λειτουργεί καταλυτικά. Το Ο - 2 έχει την ικανότητα να αποσπά Fe +2 από τις πρωτεΐνες και να οδηγεί μέσω της αντίδρασης Fenton στην παραγωγή ριζών υδροξυλίου. Σχήμα 2: H αντίδραση κατά Fenton και Haber-Weiss Ε) Ρίζα υδροξυλίου Είναι οι πιο δραστικές ελεύθερες ρίζες καθώς μπορούν να αλληλεπιδράσουν με κάθε μόριο προκαλώντας τα επιβλαβή τους αποτελέσματα. Έχει χρόνο ημιζωής in vivo περίπου 10-9 και αντιδρά πλησίον της θέσης σχηματισμού της. Προκαλεί υπεροξείδωση λιπιδίων, βλάβες στο DNΑ, σε πρωτεΐνες και σχεδόν σε κάθε μακρομόριο. Μοναδική προστασία έναντι στην δράση τους προσφέρουν κυτταρικά αντιοξειδωτικά ένζυμα όπως είναι η γλουταθειόνη. 18

ΣΤ) Ρίζα υπεροξυνιτριλίου Παράγεται κατά την αλληλεπίδραση της ρίζας οξυγόνου και του μονοξειδίου του αζώτου. Είναι λιπόφιλη με την πρόσληψη ενός πρωτονίου μετατρέπεται σε υπεροξυνιτρώδες οξύ το οποίο μπορεί να διασπαστεί σε ΝΟ 2 και ΟΗ. Το υποχλωριώδες οξύ παράγεται κυρίως από ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα με την δράση της μύελουπεροξειδάσης όταν το Η 2 Ο 2 αντιδράσει με ιόντα χλωρίου. H 2 O 2 + Cl HOCl +OH Το υποχλωριώδες οξύ είναι ένα ασθενές οξύ αλλά εμφανίζει ισχυρή αντισηπτική δράση. Μπορεί να οδηγήσει στην δημιουργία ΟΗ σύμφωνα με τις παρακάτω αντιδράσεις: ΗΟCl Cl - + OH ΗΟCl + O 2 - Cl - + OH + Ο 2 Ζ) Άλλες δραστικές ρίζες Άλλες ελεύθερες ρίζες είναι τα οργανικά υπεροξείδια (ROO) που παράγονται όταν ελεύθερες ρίζες μικρού μοριακού βάρους αντιδρούν με οργανικά μακρομόρια, ρίζα μονοξειδίου του αζώτου το οποίο έχει αγγειοδιασταλτική δράση, ρίζα νιτρικού υπεροξειδίου (ΟΟΝΟ) με δράση και συμπεριφορά παρόμοια του υποχλωριώδες οξέος. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι υπάρχουν ελεύθερες ρίζες στις οποίες το άτομο που φέρει το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο δεν είναι το οξυγόνο αλλά κάποιο άλλο μόριο όπως το άζωτο, ο άνθρακας, το θείο και το υδρογόνο. Τα υπεροξεισώματα υπό φυσιολογικές συνθήκες παράγουν Η 2 Ο 2 αλλά όχι Ο 2. Τα υπεροξεισώματα είναι κύρια οργανίδια τα οποία καταναλώνουν οξυγόνο στο κύτταρο και συμμετέχουν σε πολλές βιολογικές διεργασίες που χρησιμοποιούν οξυγόνο. Η κατανάλωση οξυγόνου στα υπεροξεισώματα οδηγεί στην παραγωγή Η 2 Ο 2 το οποίο στην συνέχεια χρησιμοποιείται για την οξείδωση μεγάλου αριθμού μορίων. 19

1.3 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ - ΒΛΑΒΕΣ ΣΤΑ ΒΙΟΜΟΡΙΑ Οι ελεύθερες ρίζες ενοχοποιούνται για μια πληθώρα παθολογικών καταστάσεων. Λόγω όμως του ιδιαίτερα ασταθούς χαρακτήρα τους και του ελάχιστου χρόνου ζωής τους είναι δύσκολο να εξακριβωθεί ο μηχανισμός δράσης τους. Επίσης σε πολλές περιπτώσεις δεν είναι εύκολο να αποσαφηνιστεί αν οι ελεύθερες ρίζες είναι η γενεσιουργός αιτία της διαταραχής ή το αποτέλεσμά της. Για παράδειγμα είναι γνωστό ότι με την πάροδο της ηλικίας επιδεινώνεται η οξειδωτική κατάσταση χωρίς όμως να μπορεί να διευκρινιστεί αν είναι η αύξηση της ηλικίας που προκαλεί την έκπτωση αυτή ή αν η αύξηση των ελεύθερων ριζών προκαλεί βλάβη των μεταβολικών μηχανισμών με συνέπεια την γήρανση. 1.3.1 Δράση σε νουκλεϊκά οξέα Οι βάσεις του DNA είναι επίσης ιδιαίτερα ευαίσθητες στην επίδραση των ελεύθερων ριζών, η ρίζα υδροξυλίου αντιδρά με όλα τα συστατικά του και προκαλεί βλάβες στις βάσεις πουρίνης και πυραμιδίνης αλλά και στον σκελετό της δεοξυριβόζης. Η μόνιμη τροποποίηση του γενετικού υλικού από αυτήν την οξειδωτική βλάβη αποτελεί το πρώτο βήμα στην καρκινογένεση, την μεταλλαξιογένεση και την γήρανση. Ειδικά το μιτοχονδριακό DNA λόγω της εγγύτητας στους μηχανισμούς παραγωγής ενέργειας και της μικρότερης αναγεννητικής και επιδιορθωτικής του ικανότητας είναι πιο ευαίσθητο στην βλαπτική επίδραση των ελεύθερων ριζών. Το οξειδωτικό στρες προκαλεί αστάθεια στις μικροδορυφορικές περιοχές. Η μεθυλίωση στις GpC περιοχές του DNA είναι επίσης σημαντικός επιγενετικός μηχανισμός ο οποίος μπορεί να οδηγήσει σε γονιδιακή σιώπηση. Οξείδωση των 5-MeCyt σε 5-OH MeTra μπορεί διαμέσου τέτοιων διαδικασιών στην θυμίνη ή την κυτοσίνη να μεταβάλλει την γονιδιακή έκφραση και την οργάνωση του δικτύου της χρωματίνης. Σχήμα 3: Οι βασικές τροποποιήσεις που προκαλούνται στα μόρια των νουκλεικών οξέων από τις ελεύθερες ρίζες. 20

1.3.2 Δράση σε πρωτεΐνες Όσον αφορά τις πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι όλα τα αμινοξέα μπορούν να υποστούν την δράση των ελεύθερων ριζών. Οι μηχανισμοί που συμμετέχουν στην οξείδωση των πρωτεϊνών από τις δραστικές ρίζες οξυγόνου έχουν γίνει γνωστοί από μελέτες στις οποίες αμινοξέα, πεπτίδια και πρωτεΐνες εκτέθηκαν σε ιονίζουσα ακτινοβολία υπό συνθήκες που οδήγησαν στον σχηματισμό ριζών υδροξυλίου-ανιόντος υπεροξειδίου. Μια συχνή συνέπεια της οξείδωσης είναι η δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών, γεγονός που μπορεί να έχει σαν συνέπεια την αλλαγή της διαμόρφωσης της πρωτεΐνης και πιθανόν την απώλεια της δράσης της ή την έναρξη της δράσης ενός αδρανούς μορίου. Είναι εύκολα αντιληπτό ότι η αλλαγή της διαμόρφωσης ενός ενζύμου μπορεί να σημάνει την διακοπή της δράσης του. Οι πλάγιες άλυσοι των αμινοξέων κυστεϊνης και μεθειονίνης είναι ιδιαίτερα ευάλωτες στην οξείδωση από τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου-αζώτου. Η οξείδωση των υπολειμμάτων της κυστεϊνης μπορεί να οδηγήσει σε αναστρέψιμο σχηματισμό μεικτών δισουλφιδίων ανάμεσα στις ομάδες θειόλης των πρωτεϊνών και τις μικρού μοριακού βάρους θειόλες, ιδιαίτερα την γλουταθειόνη. Αυτός φαίνεται να είναι ο μηχανισμός θανάτου των νευρικών κυττάρων σε πολλές από τις λεγόμενες νευροεκφυλιστικές νόσους του κεντρικού νευρικού συστήματος. Έτσι έχει βρεθεί ότι στην χορεία του Huntington το οξειδωτικό στρες οδηγεί στην παραγωγή της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης χαντινγκτίνης και την επαγωγή μηχανισμών κυτταρικού θανάτου. Η συγκέντρωση των ομάδων καρβονυλίων που παράγονται με διαφορετικούς μηχανισμούς αποτελούν καλό μέτρο της προκαλούμενης από τις ελεύθερες ρίζες οξείδωσης των πρωτεϊνών. Ιδιαίτερα ευαίσθητες μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για την μέτρηση των ομάδων καρβονυλίων των πρωτεϊνών. Εικόνα 2: Βλάβες των ελεύθερων ριζών (ROS) στις πρωτεΐνες. 21

1.3.3 Δράση στα λιπίδια Η υπεροξείδωση των λιπιδίων, αποτέλεσμα της οξειδωτικής καταστροφής των κυτταρικών μεμβρανών που σχετίζεται με την ανάπτυξη σοβαρών ασθενειών, επάγεται μέσω τριών μηχανισμών: α) Αύτο-οξείδωση μέσω της δράσης των ελευθέρων ριζών Η υπεροξείδωση των λιπιδίων αποτελεί μια από τις πιο σημαντικές και καλά μελετημένες εκδηλώσεις του οξειδωτικού στρες και των αλληλεπιδράσεων των ελεύθερων ριζών στα κύτταρα. Η έκθεση των λιπιδικών υπεροξειδίων σε ιόντα σιδήρου ή χαλκού του περιβάλλοντος των μεμβρανών μπορεί να προκαλέσει την αποικοδόμηση τους σε διάφορα μόρια που αποτελούν τα τελικά προϊόντα της υπεροξείδωσης των λιπιδίων όπως εποξείδια, κορεσμένες αλδεϋδες, ακόρεστες αλδεϋδες, αλκενάλες, κετόνες, υδρογονάνθρακες, μηλονική δυαλδεύδη και ισοπροστάνες. Ιδιαίτερα ευάλωτα στην επίδραση των δραστικών ριζών οξυγόνου είναι τα υπολείμματα πολυακόρεστων λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων, τα οποία χαρακτηρίζονται από μεγάλη ευαισθησία στην οξείδωση. Η υπεροξείδωση λιπιδίων περιλαμβάνει τρία στάδια: 1) Στάδιο έναρξης (initiation): αρχίζει όταν κάποιο μόριο ROS υψηλής δραστικότητας όταν αποσπάσει ένα άτομο υδρογόνου από μια ομάδα μεθυλενίου. Η παραπάνω διαδικασία οδηγεί στην δημιουργία μιας ασταθούς ελεύθερης ρίζας άνθρακα με ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο το οποίο συνήθως υφίσταται μια ενδομοριακή αναδιάταξη και μεταπίπτει σε συζυγές διένιο. 2) Στάδιο διάδοσης (propagation): πρόκειται για μια ανατροφοδοτούμενη αλυσιδωτή αντίδραση μέσω της οποίας παράγονται συνεχώς εκ νέου οξειδωτικά προϊόντα. Η ρίζα άνθρακα που σχηματίζεται συνδέεται με ένα μόριο Ο 2 και δημιουργείται μια υπεροξυλ-ρίζα. Η ελεύθερη υπεροξυλ-ρίζα είναι πολύ δραστική και μπορεί να αποσπάσει ένα άτομο υδρογόνου από κάποιο γειτονικό μόριο PUFA μετατρεπόμενη στο αντίστοιχο υδροϋπεροξείδιο. Πρόκειται για μια αντίδραση που οδηγεί στον σχηματισμό μιας νέας ελεύθερης ρίζας άνθρακα η οποία μπορεί να αντιδράσει με Ο 2 και να δώσει εκ νέου ρίζα υπεροξυλίου που με την σειρά της μπορεί να αποσπάσει ένα υδρογόνο από άλλο μόριο PUFA από ΟΗ. Αυτή η συνεχώς ανατροφοδοτούμενη αλυσιδωτή αντίδραση μπορεί να διακοπεί με τους εξής τρόπους: α) με επίθεση της ρίζας υπεροξυλίου σε γειτονικό διπλό δεσμό της ίδιας ανθρακικής αλυσίδας οπότε σχηματίζεται κυκλικό ενδουπεροξείδιο, β) με οξειδωτική επίθεση των ριζών CH ή L-O-O σε άλλα μεμβρανικά συστατικά, και γ) με 22