ΚΙΤ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΟΡΟΥ SPE Beckman REF 655900 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση 1
MΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Η ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης έχει χρησιμοποιηθεί για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών του ανθρώπινου ορού, σε πέντε βασικές και καλά διαχωριζόμενες ζώνες οι οποίες αποτελούνται από περισσότερα επιμέρους μέρη πρωτεϊνών. Η ηλεκτροφόρηση βασίζεται στο ότι οι πρωτεΐνες, όταν τοποθετούνται σε ένα ηλεκτρικό πεδίο μετακινούνται όλες μαζί προς τον ένα πόλο ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Στο Kit της Paragon SPE για τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών τα δείγματα τοποθετούνται σε πήκτωμα αγαρόζης και τρέχουν σε ηλεκτρικό πεδίο αφού πρώτα δαιβραχούν με κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα καλό αγωγό του ηλεκτρισμού που φορτίζει όλες τις πρωτεΐνες με αρνητικό φορτίο. Αφότου η ηλεκτροφόρηση τελειώσει, οι πρωτεΐνες σταθεροποιούνται στο gel με σταθεροποιητικό διάλυμα και αποτυπώνεται η γέλη του πηκτώματος σε μια μεμβράνη. Οι πρωτεΐνες θα γίνουν ορατές όταν βαφτεί η μεμβράνη με ειδικές χρώσεις πρωτεϊνών. Ακολουθεί πυκνομετρία για ποιοτική και ποσοτική ερμηνεία του αποτελέσματος. ΠΕΡΙΕΧΕΙ Περιεχόμενα - Ποσότητα SPE GELS 10 B-2 BARBITAL ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΌ 1 φιάλη PARAGON, ΜΠΕΛ ΧΡΩΣΤΙΚΗ 1 φιάλη ΠΡΟΤΥΠΟ, ΜΠΕΛ 10 TEMPLATE BLOTTERS 10 GEL BLOTTERS 20 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΕΩΣ 1 Δραστικά Συστατικά: SPE GEL: 1,0% Αγαρόζη, 1,2% Barbital Ρυθμιστικό, > 0,1% Αζίδιο του Νατρίου και μη δραστικά συστατικά που απαιτούνται για βέλτιστη απόδοση. Το συντηρητικό του αζίδιο του νατρίου μπορεί να σχηματίσει εκρηκτικές ενώσεις σε μεταλλικούς αγωγούς αποχέτευσης. B-2 BARBITAL ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΌ 18,2 gr: 5,5 Διαιθυλοβαρβιτουρικό οξύ, 10 mmol/l Aνασύσταση ; 5,5 Διαιθυλοβαρβιτουρικό οξύ άλας νατρίου 50 mmol/l PARAGON, ΜΠΕΛ ΧΡΩΣΤΙΚΗ, 5 gr: 8-αμινο-7-(3-νιτροφαινυλαζο) -2 - (φαινυλαζω)-1-ναφθολ-3,6- δισουλφονικό οξύ δινάτριο άλας, 0,5% (β / ο) Ανασυσταθέν. Πρόσθετα Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Αντιδραστήρια - Εξοπλισμός Παγόμορφο οξικό οξύ Μεθανόλη Απιονισμένο νερό Συσκευή ηλεκτροφόρησης Τροφοδοτικό 2
Στεγνωτήριο Πιπέτα με πολλά ρύγχη Πυκνόμετρο Ένα πυκνόμετρο ικανό να σαρώσει μια μεμβράνη 3 x 4 στα εκατό nm. Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για τη λειτουργία και τη βαθμονόμηση του απαιτείται ειδική διαδικασία. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ, ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ SPE GEL: Ακριβώς πριν από τη χρήση, αφαιρέστε προσεκτικά ένα gel από το περίβλημα αλουμινίου. Τα πηκτώματα θα πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου 18ºC έως 26ºC μέχρι την ημερομηνία λήξης. Aκατάλληλες συνθήκες θερμοκρασίας ή αποθήκευση μπορεί να οδηγήσει σε λάθος αποτελέσματα. Μην αποθηκεύεται τα πηκτώματα κοντά σε συσκευές που εκπέμπουν θερμότητα, για παράδειγμα κοντά σε οθόνες υπολογιστών ή στην κορυφή οργάνων. ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΤΑ ΤΟΠΟΘΕΤΗΣΕΤΕ ΣΤΟ ΨΥΓΕΙΟ Ή ΣΤΗΝ ΚΑΤΑΨΥΞΗ B-2 BARBITAL ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΌ, ph = 8,6: Διαλύστε σε 1500 ml απιονισμένου νερού το περιεχόμενο της φιάλης του ρυθμιστικού διαλύματος. Τα ανοιγμένα μπουκάλια ρυθμιστικού διαλύματος θα πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου, 18ºC έως 26ºC μέχρι την ημερομηνία λήξης. Έτοιμο ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να αποθηκευτεί σε ένα δοχείο σε θερμοκρασία δωματίου για 60 μέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης όποιο από τα δυο συμβεί πρώτα. ΟΞΕΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΑΛΚΟΟΛΗΣ 20%, ΟΞΙΚΟ ΟΞΥ 30% ΜΕΘΑΝΟΛΗ: Σε 1000 ml απιονισμένου νερού, προστίθενται 600 ml μεθανόλης και 400 ml κρυσταλλικού οξικού οξέος. Καλή ανάμιξη και αποθήκευση σε κλειστό δοχείο σε θερμοκρασία δωματίου 18 ºC έως 26 ºC. ΔΙΑΛΥΜΑ ΟΞΕΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ 5%: Στα 2850 ml απιονισμένου νερού προστίθενται 150 ml κρυσταλλικού οξικού οξέος. Αναμείξτε καλά. Το διάλυμα θα πρέπει να φυλάσσεται σε ένα κλειστό δοχείο σε θερμοκρασία δωματίου από 18 ºC έως 26ºC. PARAGON, ΜΠΕΛ ΧΡΩΣΤΙΚΗ 0,5%: Διαλύονται τα περιεχόμενα της φιάλης με τη χρωστική σε 1000 ml 5% διαλύματος οξικού οξέος. Αναμείξτε καλά. Το κλειστό φιαλίδιο της χρωστικής θα πρέπει να φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου 18 ºC έως 26ºC μέχρι την ημερομηνία λήξης. Έτοιμη χρωστική μπορεί να αποθηκευτεί σε δοχείο σε θερμοκρασία δωματίου για 60 μέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης όποιο από τα δυο συμβεί πρώτα. ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Το δείγμα βιολογικού υγρού θα πρέπει να συλλέγεται όπως κάθε δείγμα που προορίζεται για μια εργαστηριακή δοκιμή. Προτιμούμενο είναι το δείγμα από πρόσφατα ληφθέντα ορό, αλλά δείγματα που έχουν αποθηκευτεί έως και 72 ώρες στους 2ºC έως 8ºC μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν. Αμολημένα ή λιπαιμικά δείγματα δεν συνιστώνται. 3
ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Δείγματα Ορού: 1. Αν χρησιμοποιείται τον εφαρμογέα (applicator) δειγμάτων της Paragon αραιώστε το δείγματα ορού και τα δείγματα ελέγχου με B-2 BARBITAL ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ αναμιγνύοντας ένα μέρος δείγματος με τέσσερα μέρη ρυθμιστικού διαλύματος. Το διάλυμα του δείγματος θα πρέπει να παρασκευάζεται την ημέρα της χρήσης. 2. Με την πιπέτα με πολλά ρύγχη της Paragon δεν χρειάζεται αραίωση. Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό και Δείγματα Ούρων: 1. Προσδιορίστε την ολική πρωτεΐνη στο δείγμα. 2. Όταν η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης είναι μικρότερη από 700 mg/dl, απαιτείται. περισσότερη ποσότητα δειγμάτων του εγκεφαλονωτιαίου υγρού και ούρων. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ 1. Προετοιμάστε όλα τα δείγματα και τα controls σύμφωνα με τις οδηγίες στην προετοιμασία του δείγματος. 2. Γεμίζετε κάθε διαμέρισμα της συσκευής ηλεκτροφόρησης Paragon με 45 ml B-2 BARBITAL ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΌ. 3. Γεμίστε τα «μπανάκια» χρώσης με τα παρακάτω διαλύματα: Διάλυμα Όξινης αλκοόλης I 300 ml Διάλυμα Paragon Μπλέ Χρωστικής 300 ml Διάλυμα Οξικού Οξέος 5%, I 300 ml Διάλυμα Όξινης αλκοόλης II 300 ml Διάλυμα Οξικού Οξέος 5% II 300 ml ΠΡΟΣΟΧΗ. Τα παραπάνω διαλύματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν μέχρι και για 4 πηκτώματα πριν από την αντικατάσταση τους από νέα φρέσκα διαλύματα. 4. Αφαιρέστε το πήκτωμα SPE πηκτώματα από την αλουμινένια συσκευασία του και τοποθετείστε το σε χαρτί. 5. Εφαρμόστε πάνω του ένα template. a. Λυγίστε το template κατά μήκος όπως φαίνεται. 4
b. Ευθυγραμμίστε με το πρότυπο 'Α' στις θέσης των τελειών που βρίσκονται στις άκρες του πηκτώματος. c. Κολλήστε το template στο gel με τρόπο ώστε οι οπές του template να επικοινωνούν πρώτα με την επιφάνεια. d. Πιέστε ελαφρά με το δάκτυλο κατά μήκος του προτύπου έτσι ώστε να διασφαλιστεί η αποτύπωση του σχεδίου. 6. Εάν χρησιμοποιείται τον εφαρμογέα δειγμάτων (Applicator) της Paragon τοποθετήστε 3 με 5 μl από τα αραιωμένα δείγματα κατά μήκος κάθε σχισμής του προτύπου. Στη συνέχεια απαλά σκουπίστε το πρότυπο με ένα στυπόχαρτο. Απορρίψτε το πρότυπο και το στυπόχαρτο. 7. Αν χρησιμοποιείται πιπέττα με πολλά ρύγχη τοποθετείστε 0,5 μl του αραιωμένου δείγματος ορού στο κέντρο του κάθε template. Χρειάζονται 2 λεπτά μέχρις ότου να γίνει πλήρης διάχυση και του τελευταίου δείγματος στην σχισμή. Στη συνέχεια, αφαιρέστε απαλά το template και απορρίψτε το. Το στύπωμα δεν είναι απαραίτητο. 8. Εάν χρησιμοποιήσετε το ίδιο gel για δείγματα ΕΝΥ ή ούρων τότε τοποθετήστε 3 με 5 μl από ΕΝΥ και ούρα αντίστοιχα και 0,5 μl από δείγμα ούρων στις σχισμές του template. Στη συνέχεια, στεγνώστε απαλά με το στυπόχαρτο. Απορρίψτε το στυπόχαρτο. 9. Τοποθετήστε το gel στο πάνω μέρος της γέφυρας συνδεσμολογίας του πηκτώματος ευθυγραμμίζοντας το gel στη θετικής (+) και αρνητικής (-) πλευράς όπως είναι σημειωμένο στην γέφυρα συνδεσμολογίας. Τοποθετήστε τα καλώδια στην συσκευή ηλεκτροφόρησης Paragon και καλύψτε τις κυψέλες. 10. Τοποθετήστε την συσκευή ηλεκτροφόρησης Paragon σε μια πηγή ρεύματος. Ρυθμίστε την συσκευή στα 100 Volts. Το «τρέξιμο» των πρωτεϊνών στη συσκευή ηλεκτροφόρησης θα διαρκέσει 25 λεπτά. 11. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης αφαιρέστε το gel από την συσκευή ηλεκτροφόρησης της Paragon και τοποθετήστε το μέσα στο πλαίσιο για το gel. 12. Τοποθετήστε το gel σε διάλυμα όξινης αλκοόλης για 3 λεπτά. 5
13. Αφαιρέστε το gel από το διάλυμα όξινης αλκοόλης Ι. Σκουπίστε την περίσσεια από την πίσω μεριά του πηκτώματος και τοποθετήστε το στο στεγνωτήρα της Paragon έως ότου στεγνώσει πλήρως. 14. Για την διαδικασία ξήρανσης του πηκτώματος ακολουθήστε την παρακάτω λίστα με την εξής σειρά: A. Διάλυμα Paragon Μπλέ Χρωστική 3 λεπτά B. Διάλυμα Οξικού Οξέος I 2 λεπτά C. Διάλυμα Όξινης αλκοόλης II 2 λεπτά D. Διάλυμα Οξικού Οξέος II 2 λεπτά 15. Αφαιρέστε το gel από το Διάλυμα Οξικού Οξέος II. 16. Αφαιρέστε το gel από το πλαίσιο. 17.Σκουπήστε το gel με στυπόχαρτο και τοποθετήστε το στο στεγνωτήριο της Paragon μέχρι να στεγνώσει πλήρως. Μην τοποθετήσετε το gel πίσω στο πλαίσιο. 6
18. Αξιολογήστε το gel οπτικά ή με σάρωση με το πυκνόμετρο στα 600 nm. ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ Εάν ένα ποσοτικό αποτέλεσμα πρέπει να εκτεθεί, η απόδοση του πυκνόμετρου πρέπει να επαληθεύεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Συνιστάται ότι οι «δεξαμενές ορών ελέγχου» ή εμπορικά διαθέσιμοι οροί ελέγχου πρέπει να περιλαμβάνονται σε κάθε διαδικασία ηλεκτροφόρησης. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το διάβασμα των αποτελεσμάτων μπορεί να γίνει είτε οπτικά είτε με ειδικό όργανο το «πυκνόμετρο». Συγκρίνονται τα κλάσματα των πρωτεϊνών κάθε δείγματος με τα κλάσματα ενός προτύπου που έχει ηλεκτροφορηθεί μαζί με τα δείγματα. Η σύγκριση αφορά την χρωματική τους πυκνότητα. Αντίθετα με τη χρήση ενός πυκνομέτρου μπορεί να υπολογιστεί το σχετικό ποσοστό κάθε ζώνης πρωτεΐνης. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ 1. Αμολημένα δείγματα μπορούν να αυξήσουν τις τιμές σφαιρίνης. 2. Πηκτώματα που δεν αποθηκεύονται σε οριζόντια θέση μπορεί να παράγουν άτυπα ηλεκτροφορητικά αποτελέσματα. 3. Εάν τα 0,5 μl των δειγμάτων δεν τοποθετούνται στο κέντρο της σχισμής του template μπορεί να προκύψουν χρωματικές αλλοιώσεις. 4. Ανεπαρκές σκούπισμα του ρύγχους της πιπέτας Paragon μετά την άνοδο της μπορεί να προκαλέσει αραίωση του δείγματος με αποτέλεσμα την μικρότερη φωτεινότητα στην ηλεκτροφόρηση. 5. Τα λιπαιμικά δείγματα δεν συνιστώνται για ανάλυση ΤΙΜΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Οι ακόλουθες τιμές αναφοράς προσδιορίσθηκαν για το Paragon SPE Kit με εύρος τιμών ±2, για κάθε πρωτεϊνικό κλάσμα από έναν πληθυσμό 60 φαινομενικά υγιών ενηλίκων ανδρών και γυναικών από τη νότια Καλιφόρνια: ΕΚΑΤΟΣΤΙΑΙΑ ΑΝΑΛΟΓΙΑ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Αλβουμίνη: 58,8 με 69,6% α1: 1,8 με 3,8% α2: 3,7 με13,1% β: 8,9 με 13,6% γ: 8,4 με 18,3% Αναλογία A/G: 1,39 με 2,23 Συνιστάται κάθε εργαστήριο να καθιερώσει το δικό του εύρος φυσιολογικών τιμών. 7
ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Aκρίβεια Συντελεστές των τιμών μεταβολής μικρότερης από 5% λήφθηκαν για όλα τα κλάσματα πρωτεϊνών σε μια αξιολόγηση της ακρίβειας εντός του πυκτώματος χρησιμοποιώντας 10 επαναληπτικές αναλύσεις 1 δείγματος ελέγχου ορού σε ένα συγκεκριμένο gel. Αυτός ο βαθμός ακρίβειας λήφθηκε σε τυπικές διαδικασίες δοκιμής και δεν προορίζεται για να αντιπροσωπεύει προδιαγραφές απόδοσης για το συγκεκριμένο αντιδραστήριο. 8
9