استفاده از سرم دكستروز %5 حاوي پلاسماي خودي جهت جداسازي مونوسيتها 4 3 2 1 الهام بيرانوند دكتر سعيد عابديان كناري بهنوش بيرانوند هادي حسننيا 4 2 1 كارشناسي ارشد ميكروبشناسي دانشيار گروه ايمني شناسي كارشناسي ارشد ايمنيشناسي پزشكي جنديشاپور اهواز مجله پزشكي هرمزگان سال شانزدهم شماره ششم بهمن و اسفند 91 صفحات 429-435 دانشگاه علوم پزشكي مازندران 3 پزشك عمومي دانشگاه علوم نويسنده مسي ول: دكتر سعيد عابديان كناري گروه ايمنيشناسي دانشگاه علوم پزشكي مازندران ساري - ايران تلفن: +98 912 198 5667 پست الكترونيكي: abdeianlab@yahoo.co.uk دريافت مقاله: 90/3/11 چكيده مقدمه: كشت سلولهاي پستانداران يكي از روشهاي مهم و با اهميت است كه در زمينههاي مختلف از جمله توليد پروتي ين هاي نوتركيب آنتي بادي مونوكلونال و هورمونها كاربرد دارد. مونوسيتها و ماكروفاژها از سلولهاي مو ثر در پاسخهاي ايمني در مقابل آنتي ژن هاي بيگانه هستند. جداسازي اين سلولها از سلولهاي تك هستهاي خون محيطي با روشهاي مختلفي صورت ميگيرد يكي از روشهاي متداول در جداسازي مونوسيتها از سلولهاي تك هستهاي خون محيطي استفاده از فلاسك كشت سلولي حاوي محيط RPMI 1640 است. هدف از اين مطالعه طراحي محيط كشت سلولي با استفاده از دكستروز 5 درصد همراه با پلاسماي اتولوگ به منظور توليد محيط كشت ارزان و در دسترس براي جداسازي مونوسيتها بوده است. روش كار: در اين مطالعهاي تجربي از 40 داوطلب سلولهاي تك هستهاي خون محيطي جدا شده و در شرايط يكساني در محيطهاي RPMI 1640 و سرم دكستروز 5 درصد حاوي پلاسماي اتولوگ plasma) (autologous تحت شرايط دماي 37 درجه و %5 دي اكسيد كربن كشت داده شد. سپس تعداد ميزان زنده بودن و مرفولوژي سلولها با استفاده از رنگ تريپان بلو و ميكروسكوپ Invert مورد بررسي قرار گرفت. است. نتايج: 106 2-1/8 سلول از محيط كشت RPMI و 2-2/2 106 سلول از سرم دكستروز %5 حاوي پلاسماي خودي جدا شد كه از نظر آماري بين دو روش تفاوت معنيداري وجود نداشت. همچنين تفاوت مورفولوژيكي بين دو محيط مشاهده نشد. نتيجهگيري: نتايج ما نشان داد كه از سرم دكستروز %5 ميتوان در جداسازي مونوسيتها از سلولهاي تك هستهاي خون محيطي استفاده كرد. بنابراين ميتوان نتيجه گرفت كه اين روش يكي از تكنيكهاي ساده براي جداسازي مونوسيتها كليدواژهها: كشت سلولي - سرم مونوسيتها اصلاح نهايي: 91/1/25 پذيرش مقاله: 91/2/4 مقدمه: سلولهاي عرضهكننده آنتيژن شامل مونوسيتها و ماكروفاژها نقش اساسي و مهمي در پاسخهاي ايمني در مقابل آنتيژنهاي بيگانه و عوامل خارجي دارند لذا در شروع پاسخهاي ايمني از اهميت ويژهاي برخوردارند (1). كشت سلولهاي پستانداران يكي از روشهاي مهم و با اهميت است كه در زمينههاي مختلف از جمله توليد پروتي ينهاي نوتركيب ساخت واكسنهاي ويروسي آنتيبادي مونوكلونال هورمونها و داروها كاربرد دارد (2). در تكثير و تمايز سلولهاي تك هستهاي خون محيطي محيطهاي مختلفي از جمله RPMI 1640 به كار ميرود كه به صورت روتين براي كشت و جداسازي اين سلولها مورد استفاده قرار ميگيرد (3). همچنين در تهيه محيطهاي كشت استفاده از مواد و تركيبات بكار رفته بايستي بر اين اساس تنظيم شده باشند كه سبب تكثير حد اكثر سلولها شوند (4 5). در تهيه محيطهاي كشت سرم به عنوان يك مكمل رايج و معمول است كه حاوي ماكرومولكولهايي مثل ليپيد
و عناصر ضروري و فاكتورهاي رشد و مولكولهاي غذايي با وزن پايين است كه معمولا از Fetal bovine serum (FBS%10) استفاده ميشود (6) كه در اين عصاره جنيني با منشا حيواني احتمال آلودگي با ويروسها و باكتريهاي پاتوژن وجود دارد. از مهمترين باكتريهايي كه به طور رايج آلودهكننده محيط كشت ميباشند ميتوان به مايكوپلاسما با قطري در حدود 125-250 نانومتر اشاره كرد (7). همچنين آلودگي محيطهاي كشت با ويروسهاي انكوژنيكي مثل رتروويروسها ميتواند موجب پروليفراسيون سلولي و تغيير شرايط طبيعي تكثير و تمايز سلولها شود (8). لذا وجود هر گونه آلودگي منجر به ايجاد متابوليسم اگزوژني شده كه متابوليسم اندوژن سلولي را تحت تا ثير قرار ميدهد (9). امروزه در سيستمهاي كشت سلولي به منظور غنيسازي محيطهاي كشت از سرمهاي ويژه با عنوان Serum Free ه ب عنوان ماده مغذي جايگزين سرم گوساله استفاده ميشود. كه در اين راستا استفاده از Fetal bovin serum كم كم جاي خود را به پلاسماي اتولوگ جهت مشابه سازي شرايط كشت با محيط بدن داده است (10). با توجه به اين كه رعايت استانداردهاي محيطهاي كشت از اهداف اساسي و مهم در تهيه محيط كشت مناسب (Good GCCP practice) cell culture محسوب ميشود (11) و پايه و اساس كشت سلول و يا بافت مشابهسازي محيط Invitro با محيط Invivo است (4 5). لذا هدف از اين مطالعه طراحي محيط كشت سلولي با استفاده از دكستروز 5 درصد همراه با پلاسماي اتولوگ به منظور توليد محيط كشت مناسب براي جداسازي مونوسيتها و توليد سلولهاي ماكروفاژ و مقايسه آن با محيط كلاسيك RPMI1640 به عنوان جايگزيني مناسب بوده است. روش كار: در اين مطالعه تجربي از 40 داوطلب به صورت غيرانتخابي با ميانگين سني (25 30/52 مرد و 15 زن) پس از رضايت آگاهانه و معاينات باليني دقيق 20 سي سي نمونه خون محيطي در 200 ميكروليتر ماده ضد انعقاد EDTA گرفته شده است سپس نمونه خون بدست آمده را به دو قسمت مساوي تقسيم كرده و سلولهاي تك هستهاي خون محيطي (PBMC) آنها را تا با استفاده از شيب گراديانت فايكول USA) 1.077 و (Sigma به روش زير جدا نموديم. جدا كردن سلولهاي تك هستهاي خون محيطي :(peripheral blood mononuclear cells ) - نمونهها در دور ) 2000 g 400) به مدت 5 دقيقه جهت جداسازي پلاسما سانتريفوژ شدند و سپس هم حجم گلبولهاي متراكم PBS افزوده تا رقيق شود. - در يك لوله استريل به ميزان نصف نمونه رقيق شده محلول فايكول 1/077 در شرايط كاملا استريل ريخته شد. - نمونه به آرامي با استفاده از يك پيپت پاستور بر روي فايكول اضافه و سپس در g400 به مدت 20 دقيقه به منظور جدا كردن سلولهاي تك هستهاي سانتريفوژ شدند. - پس از سانتريفوژ از 4 لايه ايجاد شده لايه سلولهاي تك هستهاي كه بين فايكول 1/077 در زير و PBS در بالا قرار داشت را جدا كرديم. - سلولهاي تك هستهاي را دو بار با PBS شسته و پس از آخرين شستشو به حجم يك ميليليتر رسانده سپس يك قطره از آن را جهت شمارش استفاده كرديم (12 13). سپس سوسپانسيون سلولي را به دو فلاسك كشت 25 سانتيمتر مكعبي (Nunc,USA) اضافه كرديم يكي از فلاسكها حاوي 4 6 سي سي RPMI 1640 (همراه با 10 درصد Fetal bovin serum و 100 ميكروليتر از محلول پني سيلين- استرپتومايسين) و ديگري داراي 4 تا 6 سي سي سرم دكسترز 5% (همراه با يك سي سي 20 درصد) پلاسماي خود شخص و 100 ميكروليتر از محلول پني سيلين-استرپتومايسين) بوده است. اين سلولها در شرايط كاملا استريل در زير هود بيولوژيك كلاس B كشت داده شده و پس از 3 ساعت و سي دقيقه انكوباسيون در دماي 37 درجه و حضور 5 درصد (14) CO2 مونوسيتها به كف فلاسك چسبيده و پس از برداشتن مايع رويي با cell scraper مونوسيتها را از كف فلاسك به آرامي جدا كرده سپس سلولها را به نسبت 1 هب 5 با تريپان بلو رقيق كرده و با استفاده از لام ني وبار از نظر مورفولوژي و تعداد بررسي شدند. برسي وضعيت مورفولوژي و حيات سلولي: در فواصل 2 1 و 3 ساعت پس از كشت سلولي مورفولوژي سلولها مورد بررسي و مقايسه قرا گرفت و تغييرات ٤٣٠
سلولي با مشاهده ميكروسكوپي با استفاده از ميكروسكوپ اينورت مورد بررسي قرار گرفتند. به علاوه تعداد سلولهاي كشت داده شده در دو محيط كشت با استفاده از ماده رنگي تريپان بلو شمارش و ميزان حيات سلولي مورد بررسي قرار گرفت. ميزان زنده بودن سلولهاي بدست آمده با روش تريپان بلو: پس از تهيه سوسپانسيون سلولي 20 ميكروليتر از اين سوسپانسيون را با 20 ميكروليتر تريپان بلو مخلوط كرده سپس بر روي لام ني وبار قرار داديم. در طي يك تا دو دقيقه سلولهاي زنده (سلولهايي كه رنگ به داخل آنها نفوذ نكرده بود) در قسمت 25 خانهاي لام ني وبار شمارش گرديد. تعداد سلولهاي زنده در هر ميليليتر و ميزان زنده بودن سلولها به با استفاده از روش زير محاسبه گرديد: ميزان زنده بودن سلول = تعداد سلولهاي زنده 100 تقسيم بر تعداد كل سلولهاي شمارش شده. پس از شمارش سلولها و لگاريتم گيري با استفاده از آزمون t زوجي و استفاده از نرمافزار SPSS دادههاي بدست آمده تحليل گرديد. P-value كمتر از 0/05 از لحاظ آماري معنيدار در نظر گرفته شده است. شكل 1 - سلولهاي تك هستهاي خون محيطي پس از جدا سازي با استفاده از فايكول 1/077 در محيط هاي سرم دكستروز 5% و RPMI 1640 كشت داده شد. اين تصوير مور فولوژي خاص سلولهاي مونوسيت را در ابتداي شروع كشت سلولي نشان داده است(بزرگ نمايي 40 ) دكستروز %5 نتايج: سلولهاي جدا شده از هر دو محيط كشت از نظر تعداد مورفولوژي و حيات سلولي test) (Viability مورد بررسي قرار گرفتند كه نتايج حاصل از تست حيات سلولي نشان ميدهد كه بيش از 95 درصد سلولها در دو محيط زنده بودند و اختلاف آنها از لحاظ آماري معنيدار نبوده است (0/05>P). به علاوه شمارش سلولهاي كشت داده شده در دو محيط نشان ميدهد كه تفاوت معنيداري بين دو محيط از نظر تعداد (جدول شماره 1) و مورفولوژي سلولها (شكل 2 و 1) وجود ندارد (0/711=P). جدول شماره 1 - تعداد سلولهاي جدا شده از محيط دكستروزو محيط كشت RPMI RPMI شكل 2 - بررسي مورفولوژي سلولها در محيط كشت سرم دكستروز %5 (1 و) (2) RPMI پس از 3 ساعت انكوباسيون و در زمان شروع توليد مايكروفاژ (بزرگ نمايي 40 ) P-value نوع محيط كشت تعداد سلولهاي جدا شده سرم دكستروز 5 درصد 2-2/2 10 6 P=0/711 1/8-2 10 5 RPMI 1640 431
بحث و نتيجهگيري: در اين مطالعه استفاده از سرم دكستروز 5 درصد به عنوان محيط قابل دسترس و مناسب همراه با پلاسماي خودي به عنوان محيطي مناسب جهت جداسازي سلولهاي مونوسيت از گلبولهاي سفيد خون محيطي در مقايسه با محيط كلاسيك RPMI 1640 استفاده شده است. استفاده از محيطهاي جايگزين و ارزان و قابل دسترس سبب سهولت انجام تحقيقات كاربردي و لذا باعث ارتقا سطح دانش كشت سلولي ميگردد. از اساسيترين مواردي كه در سيستمهاي كشت بافت و يا سلول بايد رعايت شود مشابهسازي محيط In vivo با محيط Invitro و فراهم كردن شرايطي كه سلولها بتوانند حداكثر تكثير را داشته باشند (4 5). با توجه به اين كه استفاده از روشهاي آزمايشگاهي كشت سلولي پيشرفت قابل توجهي داشته است (15) و بكارگيري سرم با منشا حيوانات آزمايشگاهي با محدوديتهاي قابل توجهي مواجه است (17 16) لذا رعايت استاندارهاي محيطهاي كشت سلولي از اهداف مهم و اساسي در ايجاد محيط كشت مناسب (GCCP) محسوب ميشود (11). با توجه به اين كه در تهيه محيطهاي كشت سلول از جمله RPMI 1640 استفاده از سرم با منشا حيواني به عنوان يك مكمل و تا مينكننده نيازهاي تغذيهي سلولها رايج و معمول است (6) و احتمال آلودگي اين عصاره جنيني با منشا حيواني با ويروسها و باكتريهاي پاتوژن از جمله مايكوپلاسما و ويروسهاي انكوژنيك مانند رترو ويروسها وجود دارد (7 8). بنابراين هر گونه آلودگي اگزوژن ميتواند متابوليسم داخل سلولي را تغيير دهد همچنين (9). امروزه در سيستمهاي كشت سلولي استفاده از پلاسماي اتولوگ جايگزين سرمهاي كلاسيك از جمله Fetal bovin serum جهت مشابهسازي شرايط كشت با محيط بدن شده (18-20). است لذا در اين مطالعه با توجه به محدوديتهاي موجود جهت نيل به كاهش مواد مداخلهگر ازسرم دكستروز 5 درصد همراه با پلاسماي اتولوگ پس از چندين بار آزمايش (Optimization) در اين تحقيق استفاده شد. مطالعات قبلي ما نشان ميدهد كه استفاده از محيط كشت سلولي RPMI همراه با سايتوكاينهاي مناسب توانايي و توليد سلولهاي دندريتيك از مونوسيتهاي خون محيطي را دارا ميباشد و تغيير در عوامل مكمل در بهينهسازي محيطهاي كشت سلولي بسيار مو ثر است (21). با توجه به اين كه جداسازي مونوسيتهاي خون محيطي با استفاده از مولكولهاي آنتي بادي مونوكلونال (22) Elispot (23) (24) Magnetic activated cell sorter 5% بسيار پرهزينه ميباشد در اين مطالعه سعي شده با بكارگيري سرم دكستروز حاوي پلاسماي خود شخص (autologous plasma) احتمال آلودگي با عوامل پاتوژن خارجي حذف شود. لذا ميتوان از محيط ياد شده همراه با پلاسماي خودي به عنوان پايه اصلي در كشت سلولي استفاده كرد. هر چند استفاده از محيط كشت RPMI 1640 از جايگاه مناسب و قوي در توليد سلول و نيز تمايز سلولي برخوردار است اما بهرهگيري از محيطهاي جايگزيني مناسب ميتوانند سبب ارتقاء دانش كشت سلولي و تكرارپذيري تحقيقات بنيادين شود. لذا در اين تحقيق با توجه به نتايج بدست آمده بين دو محيط تفاوت معنيداري از لحاظ آماري وجود ندارد بنابراين سرم دكستروز 5 درصد حاوي پلاسماي خود شخص plasma) (autologous ميتواند جايگزين مناسبي براي محيط RPMI 1640 در جداسازي مونوسيتها باشد. ٤٣٢
References منابع 1. Theurl I, Fritsche G, Ludwiczek S, Garimorth K, Bellman N, Weiler R, Weiss G. The macrophage: A cellular factory at the interphase between iron and immunity for the control of infections. BioMetals. 2005;18:359-367. 2. Ruckenstuhl C, Buttner S, Carmona-Gutierrez D, Eisenberg T, Kroemer G, Sigrist SJ, et al. The Warburg effect suppresses oxidative stress induced apoptosis in a yeast model for cancer. Plos One. 2009;2:1-6. 3. Mahbod AA, Pishbin Sh, Mosavi SR. Serology and blood bank, 2 nd ed. Tehran: Mire Press; 2006;180-181. [Persian] 4. van der Valk J, Brunner D, De Smet K, Fex Svenningsen A, Honegger P, Knudsen LE, et al. Optimization of chemically defined cell culture media Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicol in Vitro. 2010;24:1053-1063. 5. Davis JM. Basic Cell Culture. A Practical Approach. 2 nd ed. London: Oxford University Press; 2002. 6. Gstraunthaler G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. Altex. 2003;20:275-281. 7. Erickson GA, Bolin SR, Landgraf JG. Viral contamination of fetal bovine serum used for tissue culture: Risks and concerns. Dev Biol Stand. 1991;75:173-175. 8. Nicklas W, Kraft V, Meyer B. Contamination of transplantable tumours, cell lines an monoclonalantibodies with rodent viruses. Lab Anim Sci. 1993;43:296-300. 9. Cuperlović-Culf M, Barnett DA, Culf AS, Chute I. Cell culture metabolomics: applications and future directions. Drug Discov Toduy. 2010;15:610-621. 10. Tallheden T, van der Lee J, Brantsing C, Mansson JE, Sjögren-Jansson E, Lindahl. A Human serum for culture of articular chondrocytes. Cell Transplant. 2005;14:469-479. 11. Hartung T, Balls M, Bardouille C, Blanck O, Coecke S, Gstraunthaler G, et al. Good cell culture practice. Ecvam Good Cell Culture Practice Task Force Report. Altern Lab Anim. 2002;30:407-414. 12. Heimdal JH, Aarstad HJ, Aakvaag A, Olofsson J. In vitro T-lymphocyte function in head and neck cancer patients. Eur Arch Otorhinolaryngol. 1997; 254:318 322. 13. Boyum A. Isolation of human blood monocytes with Nycodenz, a new non-ionic iodinated gradient medium. Scand J Immunol.1983;17:429 436. 14. Elkord E, Williams PE, Kynaston H, Rowbottom AW. Human monocyte isolation methods influence cytokine production from in vitro generated dendritic cells. Immunology. 2005;114:204-212. 15. Balls M, Goldberg AM, Fentem JH, Feutem JH, Broadhead CL, Burch RL, et al. The three Rs: the way forward The report and recommendations of ECVAM Workshop11. Altern Lab Anim. 1995;23:838-866. 16. Faser MJ. The baculovirus-infected insect cell as a eukaryotic gene expression system. Curr Top Microbiol Immunol. 1992;158:131-172. 17. Jarvis DL. Baculovirus expression vectors. A review and update. Annals of the New York Academy of Sciences. 1991;646:240-247. 18. Badrul AH, Aminuddin BS, Sharaf I, Samsudin OC, Munirah S, Ruszymah BH. The effects of autologous human serum on the growth of tissue engineered human articular cartilage. Med J Malaysia. 2004;59:11-12. 19. Kamil SH, Kojima K, Vacanti MP, Zaporojan V, Vacanti CA, Eavey RD. Tissue engineered cartilage: utilization of autologous serum and serum-free media for chondrocyte culture. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2007;71:71-75. 20. Chua KH, Aminuddin BS, Fuzina NH, Ruszymah BH. Basic fibroblast growth factor with human serum supplementation: enhancement of human chondrocyte proliferation and promotion of cartilage regeneration. Singapore Med J. 2007;48:324-332. 433
21. Abediankenari S, Ghasemi M.Generation of Immune inhibitory dendritic cell and CD4+ Regulatory T cells Inducing by TGF-β. Iranian Jornal of Allergy Asthma Immunol. 2009;8:25-30. 22. Haringman JJ, Gerlag DM, Smeets TJ, Baeten D, Bosch FVD, Bresnihan B, et al. A randomized controlled trial with an Anti-CCL2 (Anti Monocyte Chemotactic Protein 1) monoclonal antibody in patients with rheumatoid Arthritis. Arthritis. 2006;54:2387-392. 23. Aung H, Sherman J, Tary-Lehman M, Toossi Z. Analysis of transforming growth factor-beta 1 (TGF-beta1) expression in human monocytes infected with Mycobacterium avium at a single cell level by ELISPOT assay. J Immunol Methods. 2002;259:25-32. 24. Kuhara M, Takeyama H, Tanaka T, Matsunaga T. Magnetic cell separation using antibody binding with protein A expressed on bacterial magnetic particles. Anal Chem. 2004;76:6207-6213. ٤٣٤
Monocyte isolation using serum dextrose 5% with autologous plasma E. Beiranvand, MSc 1 S. Abediankenari, PhD 2 B. Beiranvand, MSc 3 H. Hasannia, MSc 4 MSc of Microbiology 1, Associate Professor Department of Immunology 2, MSc of Immunology 4, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran. General Practioner 3, Ahvaz Jondiahapour University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran. ABSTRACT (Received 1 Jun, 2011 Accepted 23 Apr, 2012) Correspondence: A. Abedian Konari, PhD. Department of Immunology, Mazandaran University of Medical Sciences. Sari, Iran Tel:+98 912 198 5667 Email: abedianlab@yahoo.co.uk Introduction: Mammalian cells culture is an important method for producing recombinant proteins, monoclonal antibody, and hormones application. One of the common methods in the monocyte isolation is using flask adherent cell culture in RPMI-1640 medium. We aimed, in this study, cell culture medium using dextrose 5% with autologous plasma to produce inexpensive medium for isolation of monocytes. Methods: In this experimental study, we isolated peripheral blood mononuclear cells from 40 healthy volunteers, the isolated cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum and in the media supplemented serum dexterous 5%containing autologous plasma under 37 C and 5% CO2 in a cell incubator. Then, count, viability and morphological cells were surveyed by trypan blue and invert microscope. Results: We isolated 1.8-2 10 6 cells /ml of RPMI culture media and 2-2.2 10 6 /ml macrophage of serum dexterous 5% containing autologous plasma. There was not a significant difference between two methods (P>0.05). Also, we did not see any morphological variation in two culture media. Conclusion: Our results showed that dextrose 5% can be used in monocyte isolation from peripheral blood mononuclear cells. Key words: Cell Culture Serum Monocytes 435