QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA 704500 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA 704500 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM F-Actin IgA είναι μια ανοσοπροσροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημι-ποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων IgA στο συστατικό F-ακτίνη των λείων μυών σε ανθρώπινο ορό. Σε ασθενείς με κλινικά ευρήματα σύμφωνα με κοιλιακή νόσο, η παρουσία αντισωμάτων IgA αντι-f-ακτίνης μπορεί να βοηθήσει στην εκτίμηση της πιθανότητας σοβαρής ατροφίας των εντερικών λαχνών. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Τα αυτοαντισώματα αντι-f-ακτίνης αποτελούν το κύριο συστατικό των αποκαλούμενων αντισωμάτων λείων μυών (ASMA). Αυτά τα αντισώματα εμφανίζουν ειδικότητα προς το συστατικό F-ακτίνη του κυτταρικού σκελετού και παραδοσιακά εντοπίζονται με έμμεσο ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας λεπτά τμήματα ήπατος, νεφρού ή στομάχου τρωκτικών ως υπόστρωμα. 1-3 Τα αντισώματα λείων μειών κατευθύνονται έναντι διαφόρων συστατικών, το σπουδαιότερο από τα οποία είναι η F-ακτίνη, αλλά ο ανοσοφθορισμός μπορεί επίσης να εντοπίσει αντισώματα στην τουβουλίνη και ενδιάμεσα νημάτια. 4,5 Σε ασθενείς με αυτοάνοση ηπατίτιδα (AIH), η αντιδραστικότητα των αντισωμάτων αντι-λείων μυών κυρίως αντικατοπτρίζει αντισώματα αντι-f-ακτίνης, ενώ σε ιογενείς λοιμώξεις, όπως λοιμώδης μονοπυρήνωση, ιογενής ηπατίτιδα, ιλαρά και παρωτίτιδα, η αντιδραστικότητα των αντισωμάτων αντι-λείων μυών οφείλεται στην αντιδραστικότητα σε κυτοπλασματικά αντιγόνα μη-f-ακτίνης. 4-8 Αντισώματα IgG αντι-f-ακτίνης αναφέρθηκαν στο 52-85% των ασθενών με AIH και στο 22% των ασθενών με πρωτοπαθή χολική κίρρωση (PBC). 7-9,12-16 Αντισώματα IgG αντι-f-ακτίνης (συνήθως σε χαμηλούς τίτλους), αναφέρθηκαν στο 3-18% ορών από το γενικό υγιή πληθυσμό. 17 Σε αντίθεση με τα αντισώματα IgG αντι-f-ακτίνης τα οποία είναι χαρακτηριστικά των ασθενών με αυτοάνοση ηπατίτιδα, τα αντισώματα IgA αντι-f-ακτίνης είναι κλινικά σχετικά για ασθενείς με κοιλιακή νόσο. Πρόσφατες μελέτες κατέδειξαν ότι αντισώματα IgA στην F-ακτίνη εμφανίζουν ισχυρή συσχέτιση με το βαθμό της ατροφίας των εντερικών λαχνών που είναι παρούσα σε ασθενείς με κοιλιακή νόσο. 18-24 Οι Clemente et al, χρησιμοποιώντας μια ανάλυση ανοσοφθορισμού (IFA) για την ανίχνευση των αντισωμάτων IgA αντι-fακτίνης σε ειδικά επεξεργασμένα εντερικά κύτταρα, βρήκαν ότι το 98.2% των ασθενών με κοιλιακή νόσο με επίπεδο βλεννογόνο, το 89% των ασθενών με ατροφία των εντερικών λαχνών μερικού συνόλου, το 30% των ασθενών με μερική ατροφία των λαχνών και το 0% των ατόμων ελέγχου που ήταν αρνητικοί για αντισώματα ενδομυΐου και τρανσγλουταμινάση ιστού ήταν θετικοί για αντισώματα IgA αντι-f-ακτίνης. 25 Οι Pedreira, S. et al. ανέφεραν ότι το 95% των ασθενών με κοιλιακή νόσο χωρίς θεραπευτική αγωγή είχαν αυξημένες τιμές αντισωμάτων IgA αντι-f-ακτίνης σε σύγκριση με τα φυσιολογικά άτομα ελέγχου. 23 Αυτή η ομάδα βρήκε επίσης ότι οι υψηλότεροι τίτλοι αντισωμάτων αντι-f-ακτίνης συσχετίζονταν με σοβαρότερη εντερική βλάβη. Τα αντισώματα IgA αντι-f-ακτίνης μειώνονται μετά την καθιέρωση μιας διατροφής χωρίς γλουτένη, και προτείνεται ότι η μέτρηση αυτών των αντισωμάτων θα μπορούσε να παίξει ρόλο στην παρακολούθηση της συμμόρφωσης σε μια διατροφή χωρίς γλουτένη. 22 Οι διαδικασίες ανοσοφθορισμού για τον εντοπισμό αντισωμάτων F-ακτίνης ή λείων μυών είναι υποκειμενικές, με την απόδοση της ανάλυσης να εξαρτάται από τον τύπο του χρησιμοποιούμενου ιστού, την ειδικότητα του συζεύγματος, την ισχύ του συστήματος μικροσκοπίου που χρησιμοποιείται για την ανάγνωση του αποτελέσματος, καθώς και από την τεχνική εμπειρία του παρατηρητή. Οι μέθοδοι ELISA για τον εντοπισμό των αντισωμάτων F-ακτίνης, που αναφέρθηκαν για πρώτη φορά από τα μέσα της δεκαετίας του 1980 έως τις αρχές της δεκαετίας του 1990 4,5,7,8, παρέχουν τη δυνατότητα για περισσότερο τυποποιημένη, λιγότερο απαιτητική από την άποψη της τεχνικής και αυτοματοποιήσιμη απόδοση. 7,9-12 Αρχη Μεθοδου Renat F-Actin antigen är bundet till väggarna i brunnarna på en mikrotiterplatta. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας στα F-Actin αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgΑ αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgΑ αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων ορών αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο F-Actin (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα F-Actin) 3. F-Actin IgA ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο F-Actin, προαραιωμένο, 1.2ml 4. F-Actin IgA ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο F-Actin, προαραιωμένο, 1.2ml 1

5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος κίτρινος, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 28 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. 2

Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 29 Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 F-Actin ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος F-Actin IgA ELISA Low Χαμηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος F-Actin IgA ELISA High Υψηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgA (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 3

5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A3 toυnccls για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 30 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του F-Actin IgA ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του F-Actin IgA ELISA Low. Η τιμή του F-Actin IgA ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X F-Actin IgA oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. F-Actin IgA ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Τα δείγματα ερμηνεύονται ως αρνητικά, Αμφίβολα ή θετικά σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Μονάδες Αρνητικό < 20 Αμφίβολα 20.1-24.9 Θετικό > 25 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα IgA αντι-f-ακτίνης σε ασθενείς με κοιλιακή νόσο υποδεικνύει μια αυξημένη πιθανότητα σοβαρής ατροφίας των εντερικών λαχνών 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων F-Actin IgA ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 4

3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA. Οι τιμές F-Actin IgA που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων ανοσοσφαίρινων συσσωρευμάτων στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο από μη-συγκεκριμένο δέσιμο και να παράγει ψεύτικα θετικά σε αυτή την ανάλυση. 2. Δεν είναι όλοι οι ασθενείς με κοιλιακή νόσο θετικοί για αντισώματα IgA στην F-ακτίνη. 3. Δεν έχουν όλα τα δείγματα που είναι θετικά για αντισώματα λείων μυών αντισώματα IgA στην F- ακτίνη. 4. Ο εντοπισμός αντισωμάτων IgA στην F-ακτίνη σε ασθενείς με ηπατική νόσο πρέπει να ερμηνεύεται με προσοχή, δεδομένου ότι η παρουσία αντισωμάτων IgG στην F-ακτίνη στη συγκεκριμένη ομάδα ασθενών συνοδεύεται συχνά από αντισώματα IgA στην F-ακτίνη τα οποία μπορεί να μη συνδέονται με την παθολογία του εντέρου. Τα αντισώματα IgA στην F-ακτίνη πρέπει να μετρώνται μόνο σε ασθενείς με κοιλιακή νόσο ως βοήθημα στην αξιολόγηση της εντερικής βλάβης. 5. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 6. Τα χαρακτηριστικά της ανάλυσης της διαδικασίας δεν ισχύουν εκτός από του ορού. Δεδομένα απόδοσης Αναμενόμενες Τιμές Φυσιολογικές Tιμές Ένα σύνολο 500 δειγμάτων που συλλέχθηκαν από εμφανώς υγιή άτομα (250 άνδρες και 250 γυναίκες) αναλύθηκαν με το κιτ QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA. Το εύρος ηλικίας ήταν 18-80 (διάμεση τιμή=41). Η ειδικότητα της ανάλυσης ήταν 92.2% (461/500). Τρία από τα 39 δείγματα ήταν θετικά για αντισώματα ttg IgA και συνεπώς μπορεί να υποδεικνύουν μη διαγνωσμένους ασθενείς με κοιλιακή νόσο. Ένα από αυτά τα τρία δείγματα ήταν επίσης θετικό για αντισώματα ενδομυΐου και είναι ουσιαστικά βέβαιο ότι αποτελεί πραγματική περίπτωση κοιλιακής νόσου. Ο επιπολασμός της κοιλιακής νόσου στον φυσιολογικό πληθυσμό των Η.Π.Α.εκτιμάται σε 1:133 και συνεπώς ο εντοπισμός μη διαγνωσμένων ασθενών με κοιλιακή νόσο στη φυσιολογική κοόρτη δεν μπορεί να αποκλειστεί. 26 Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση Εφόσον ο σκοπός χρήσης της ανάλυσης QUANTA Lite TM F-Actin IgA assay είναι η αξιολόγηση της πιθανότητας εντερικής βλάβης σε ασθενείς με κοιλιακή νόσο, η ευαισθησία και η ειδικότητα υπολογίστηκαν βάσει 445 δειγμάτων που είχαν αποτελέσματα βιοψίας. Από τα 445 δείγματα, 157 είχαν παθολογία Marsh 3 και 288 είχαν παθολογία Marsh 0, 1 ή 2. 27 N =445 Marsh Αποτέλεσμα F-Actin IgA Μονάδες M3a/b/c M0,M1,M2 Σύνολο Θετικό (>24.9 μονάδες) 76 14 90 Αρνητικό (<24.9 μονάδες) 81 274 355 Σύνολο 157 288 445 Αμφίβολα αποτελέσματα μετρούμενα ως αρνητικά (δηλ. όχι θετικά) Κλινικές Ευαισθησία: 48.4% (76/157) (95% CI, 40.4% to 56.5%) Κλινικές Ειδίκευση: 95.1% (274/288) (92.0 97.3%) Θετικό Προβλεπτική αξία: 84.4% Αρνητικό Προβλεπτική αξία: 88.4% Αποδοτικότητα: 78.7% If the calculations are performed using only M3c (total villous atrophy) as the reference index, the sensitivity and specificity are 59.4% and 91.3% respectively as shown below. N =445 Marsh Αποτέλεσμα F-Actin IgA Μονάδες M3c Όχι-M3c Σύνολο Θετικό (>24.9 μονάδες) 60 30 90 Αρνητικό (<24.9 μονάδες) 41 314 355 Σύνολο 101 344 445 Αμφίβολα αποτελέσματα μετρούμενα ως αρνητικά (δηλ. όχι θετικά) Κλινικές Ευαισθησία: 59.4% (60/101) (95% CI, 49.2% to 69.1%) Κλινικές Ειδίκευση: 91.3% (314/344) (87.7 94.0%) Θετικό Προβλεπτική αξία: 66.7% Αρνητικό Προβλεπτική αξία: 88.5 Αποδοτικότητα: 78.7% Σύγκριση με κατηγορηματική μέθοδο Το QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA συγκρίθηκε με μια μέθοδο εγκεκριμένη από το FDA για την 5

ανίχνευση αντισωμάτων IgA στο δείκτη κοιλιακής νόσου τρανσγλουταμινάση ιστού (ttg). Η θετική ποσοστιαία συμφωνία ήταν 74/128 = 57.8% και η αρνητική ποσοστιαία συμφωνία ήταν 27/29 = 93.1% όταν ασθενείς με κοιλιακή νόσο με Marsh 3a 3b ή 3c αναλύθηκαν με τις δύο μεθόδους. Όταν αναλύθηκαν μόνο ασθενείς με Marsh 3c (ολική ατροφία των λαχνών), η θετική ποσοστιαία συμφωνία ήταν 60/98 = 61.2% και η αρνητική ποσοστιαία συμφωνία ήταν 3/3 = 100%. Ενώ τα περισσότερα θετικά για IgA στην F-ακτίνη δείγματα είναι επίσης ttg θετικά, μόνο ασθενείς με κοιλιακή νόσο με σοβαρή εντερική βλάβη είναι θετικοί για IgA στην F-ακτίνη. Μελέτη Aλληλεπίδρασης Οροί από 36 ασθενείς με αντισώματα για αυτοάνοση/μολυσματική νόσο ή οροί ειδικής κατάστασης νόσου, που συμπεριλάμβαναν γαστρικά τοιχωματικά κύτταρα, RNP, SS-A,SS-B, Scl-70, Jo-1, σπειραματική βασική μεμβράνη, LKM-1, διαλυτό ηπατικό αντιγόνο, κεντρόμερο, χρωματίνη, αυτοάνοση ηπατίτιδα, πρωτοπαθή χολική κίρρωση, ιό ηπατίτιδας B, ιό ηπατίτιδας C, πρωτοπαθή σκληρυντική χολαγγειίτιδα, αναλύθηκαν για διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με το QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA. Αρκετά δείγματα με ηπατική νόσο ήταν θετικά για αντισώματα IgA στην F-ακτίνη. Ο εντοπισμός αντισωμάτων IgA στην F-ακτίνη σε ασθενείς με ηπατική νόσο πρέπει να ερμηνεύεται με προσοχή, δεδομένου ότι η παρουσία αντισωμάτων IgG στην F-ακτίνη στη συγκεκριμένη ομάδα ασθενών συνοδεύεται συχνά από αντισώματα IgA στην F-ακτίνη, τα οποία μπορεί να μη συνδέονται με την παθολογία του εντέρου. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε εξετάζοντας 6 δείγματα 7 φορές συνολικά. Πίνακας 1: Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA Spec.1 Spec.2 Spec.3 Spec.4 Spec.5 Spec.6 Μέσες Μονάδες 104.2 152 37 38.8 14 17.4 Τυπική απόκλιση 2.4 7 0.3 1.5 0.4 0.4 Συντελεστής διακύμανσης % 2.3 4.6 0.9 3.8 3.0 2.6 Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε ελέγχοντας εις διπλούν 6 δείγματα, τον υψηλό θετικό ορό ελέγχου (HPC) του κιτ και τον αρνητικό ορό ελέγχου (NC) δύο φορές καθημερινά (μία φορά το πρωί και μία φορά το απόγευμα) για 3 ημέρες. Πίνακας 2: Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA HPC Spec.1 Spec.2 Spec.3 Spec.4 Spec.5 Spec.6 NC Μέσες Μονάδες 78.3 104.8 156.8 41.5 41.1 14.8 17.0 1.0 Τυπική απόκλιση 4.7 6.6 5.8 1.7 2.6 0.7 0.8 0.1 Συντελεστής διακύμανσης % 6.0 6.3 3.7 4.2 6.4 5.0 4.7 10.5 Βιβλιογραφία 1. Gabbiani, G. et al. Human smooth muscle autoantibody. Its identification as antiactin antibody and a study of its binding to "nonmuscular" cells. Am J Pathol 72, 473-88 (1973). 2. Anderson, P. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26, 57-56 (1976). 3. Bottazzo, G. F. et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 29, 403-10 (1976). 4. Toh, B. H. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38, 621-8 (1979). 5. Toh, B. H. et al. Viral infections and IgM autoantibodies to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37, 76-82 (1979). 6. Andersen, P., Small, J. V., Andersen, H. K. & Sobieszek, A. Reactivity of smooth-muscle antibodies with F- and G-actin. Immunology 37, 705-9 (1979). 7. Bretherton, L. et al. ELISA assay for IgG autoantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51, 611-6 (1983). 8. Kurki, P. Determination of anti-actin antibodies by a solid-phase immunoenzymatic assay and by indirect immunofluorescence technique. Clin Immunol Immunopathol 11, 328-38 (1978). 9. Dighiero, G., Lymberi, P., Monot, C. & Abuaf, N. Sera with high levels of anti-smooth muscle and anti-mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin Exp Immunol 82, 52-6 (1990). 10. De Scheerder, I. et al. Post-cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56, 631-3 (1985). 11. Leibovitch, L., George, J., Levi, Y., Bakimer, R. & Shoenfeld, Y. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Lett 48, 129-32 (1995). 12. Frenzel, C. et al. Evaluation of F-Actin ELISA for the diagnosis of autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol 101, 2731-6 (2006). 13. Czaja, A. J., Cassani, F., Cataleta, M., Valentini, P. & Bianchi, F. B. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24, 1068-73 (1996). 14. Kurki, P. et al. Different types of smooth muscle antibodies in chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis: their diagnostic and prognostic significance. Gut 21, 878-84 (1980). 15. Granito, A. et al. Antibodies to filamentous actin (F-Actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 59, 280-4 (2006). 6

16. Liaskos, C., Bogdanos, D. P., Davies, E. T. & Dalekos, G. N. Diagnostic relevance of anti-filamentous actin antibodies in autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 60, 107-8 (2007). 17. Fagraeus, A. & Norberg, R. Anti-actin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82, 1-13 (1978). 18. Carroccio, A. et al. IgA anti-actin antibodies ELISA in coeliac disease: A multicentre study. Dig Liver Dis 39, 818-23 (2007). 19. Carroccio, A. et al. Anti-actin antibodies in celiac disease: correlation with intestinal mucosa damage and comparison of ELISA with the immunofluorescence assay. Clin Chem 51, 917-20 (2005). 20. Clemente, M. G. et al. Immune reaction against the cytoskeleton in coeliac disease. Gut 47,520-6 (2000). 21. Clemente, M. G. et al. Detection of Autoantibodies against Enterocyte Actin Filaments as Serological Predictive Test for Intestinal Villous Atrophy in Celiac Disease: Results of a Polycentric Study. Gastroenterology 124, A-660 (2003). 22. Granito, A. et al. Anti-actin IgA antibodies in severe coeliac disease. Clin Exp Immunol 137, 386-92 (2004). 23. Pedreira, S. et al. Significance of smooth muscle/anti-actin autoantibodies in celiac disease. Acta Gastroenterol Latinoam 35, 83-93 (2005). 24. Norman, G. L. et al. in Association of Medical Laboratory Immunologists (Chicago, Ill, 2007). 25. Clemente, M. G. et al. Enterocyte actin autoantibody detection: a new diagnostic tool in celiac disease diagnosis: results of a multicenter study. Am J Gastroenterol 99, 1551-6 (2004). 26. Fasano, A. et al. Prevalence of celiac disease in at-risk and not-at-risk groups in the United States: a large multicenter study. Arch Intern Med 163, 286-92 (2003). 27. Antonioli, D. A. Celiac disease: a progress report. Mod Pathol 16, 342-6 (2003). 28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 29. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38): 2004. 30. CLSI (NCCLS). Feb 1999. Statistical quality control: Principles and definitions: Approved Guideline Third Edition. CLSI Document C24-A3, Vol 26(25):1999 Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 624500GRC April 2008 Revision 0 7