دوره 1 شماره 4 زمستان 66-64( 29 ) مقاله پژوهشي مهار تكثير به طور وابسته به زمان تحت تاثير مهاركننده غير نوكلئوتيدي تلومراز از طريق كاهش رونويسي زير واحد كاتاليتيك 6 9 داود بشاش سيد حميداله غفاري مريم كازراني كبريا هزاوه 4 4 4 كامران علي مقدم اردشير قوامزاده چكيده سابقه و هدف به دليل فعاليت تلومراز در تکثير نامحدود اکثر سلوله يا سرطاني از جمله بدخيميه يا خوني مانندد لوسدمي پروميلوسيتيکي حاد( APL ) مهار تلومراز روش مناسبي جهت درمان ميباشد. در اين مطالعده بده بررسدي اثدر مهارکننده غيرنوکلئوزيديکي بر روي مهار تکثير سلولي و بيان ژن که به عندوان جدز اصلي در فعاليت تلومراز نقش دارد پرداختيم. مواد و روشها در يك مطالعه تجربي به منظور بررسي اثر سلولها در حضور غلظته يا مختلفي از دارو کشت داده شددند و آزمدونهداي BrdU cell proliferation assay Trypan blue exclusion assay و Quantitative real-time PCR جهت بررسي اثر دارو بر درصد زنددهمداني تكثيدر سدلولي و بيدان mrna ژن در زمانه يا متفاوت صورت گرفت. يافتهها قادر به کاهش درصد زندهماني و مهار تكثير سلولها ميباشد. تيمار سلولهدا بدا در غلظته يا 1 61 1 و 21 ميکروموالر پس از طي 44 94 و 29 ساعت به صورت وابسته بده دوز و زمدان منجر به کاهش ميزان ساخت DNA سلولها گرديد. عالوه بر اين نتايج نشان ميدهدد کده داروي همراه با افزايش غلظت دارو و زمان تيمار سلولها به طور قابل توجهي منجدر بده کداهش ميدزان mrna ژن ميگردد. نتيجه گيري با توجه به طول تلومر کوتداه و فعاليدت بداالي آندزيم تلدومراز در بيمداران APL و هدمچندين اثدر بخشدي داروي در القاي اثر آنتي پروليفراتيو در رده سلولي ميتوان درمانهاي مبتني بر اسدتراتژي آنتيتلومرازي را به عنوان راهكار درماني مناسب در بيماران APL مد نظر قرار داد. كلمات كليدي: لوسمي پروميلوسيتي حاد تلومراز تاريخ دريافت : 4 19/6/ تاريخ پذيرش : 19/8/ 9- PhD خونشناسي و بانك خون استاديار دانشكده پيراپزشكي دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي تهران ايران 2- مؤلف مسؤول: PhD ژنتيك مولكولي دانشيار مركز تحقيقات خون انكولوژي و پيوند بنيادي بيمارستان شريعتي و دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران كارگر شمالي تهران ايران كدپستي: 94999 - كارشناس ارشد خونشناسي دانشگاه علوم پزشكي تهران بيمارستان شريعتي تهران ايران 4- فوق تخصص خون و انكولوژي استاد مركز تحقيقات خون انكولوژي و پيوند بنيادي بيمارستان شريعتي و دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران تهران ايران
مهار تكثير و مهاركننده غيرنوكلئوتيدي داود بشاش و همكاران مقدمه لوسمي پروميلوسيتيک حاد) APL ( يکي از زير (AML-M) ميباشد. APL معمو ا در گروههاي AML سنين 4-5 سالگي رخ داده و حدود %95-%9 انوا AML را به خود اختصاص ميدهد) 9 (. اين بيماري در اثر نقص در بلوغ گلبوله يا سفيد در رده ميلوئيدي به وجود ميآيد که ي آن روند بلوغ در رده گرانولوسيتي در مرحله پروميلوسيت متوقف ميشود. تقريبا %15 از بيماران مبت به APL داراي جابهجايي بين کروموزوم 95 و 9۱ هستند[) 22 [t)95:9۱(q)92 : که منرر به الحاق ژن با RARα ژن PML )DIC( گرانوله يا )ژن کدکننده گيرنده رتينوئيک اسيد( ميگردد) 2 (. به دليل انعقاد داخل عروقي منتشر که ظاهرا ناشي از آزاد شدن مواد پيش انعقادي از سلوله يا لوسميک است مشک ت خونريزي در اين بيماري شايع بوده و از جمله علل اصلي مرگ و مير اين بيماران محسوب ميشود) (. در سال 9185 معرفي ATRA تاريخچه درمان که مشتقي از ويتامين A APL است افقي جديد در گشود و از ميزان مرگ و مير بيماري به ور قابل توجهي کاست. با اين حال و عليرغ اثر بخشي اين دارو در درمان APL درصدي از بيماران دچار عود شده و در نهايت به مرگ بيمار منرر ميشود) 4 (. عليرغ اين حقيقت که ماهيت باليني سر ان بسيار متنو است اما اکثر تومورها در تعداد محدودي از ويژگيها ه چون توانايي تکثير نامحدود رشد غير قابل کنترل تهاج به بافتها و انتشار متاستاتيک مشتر ميباشند) 5 (. مطالعههاي انرام شده ي دو دهه گذشته نشان داده است که کسب توانايي تکثير نامحدود که با حفظ ول تلومر مرتبط است مه سر ان ميباشد) 6 (. ه مه ترين مرحله در ايراد چنين مشخص شده است که ترين مکانيس براي غلبه بر محدوديت تکثير ناشي از کوتاه شدن ول تلومر فعال شدن آنزيمي به نام تلومراز است که افزايش فعاليت آن در بيش از %85 بدخيميهاي انسان گزارش شده است) ۱ (. تلومراز آنزيمي است که از يک جزء RNA به نام hterc و يک جزء کاتاليتيک تحت عنوان که فعاليت تلومراز تشکيل شده است) 8 (. مشخص شده است ي روند بلوغ و تکامل عمدتا از ريق رونويسي ژن تنظي ميشود) 1 (. از آنجايي که اکثر سلوله يا سوماتيک را بيان نميکنند فاقد فعاليت تلومراز ميباشند از سوي ديگر اکثريت سلوله يا سر اني را بيان کرده و تلومراز مثبت ميباشند) 1 (. با توجه به اين امر تلومراز و به ويژه به عنوان اهداف درماني بسيار اميدوارکننده جهت درمان سر انها معرفي شده و اخيرا مهارکنن دگان تل ومراز ب ه عن وان راهکارهاي درماني جديد مورد توجه شايان قرار گرفتهاند. در ميان اين دسته از داروها که ي ک مهارکننده غيرنوکلئوزيدي - غيرپپتيدي است افق بسيار روشني در درمان سر انها گشوده است) 9 (. اين دارو به ور اختصاصي موجب مهار آنزي تلومراز ميشود و بر روي آنزي ه يا DNA پ يل مراز RNA پ يل مراز و ه چنين ساير اعضاي آنزي هاي ترانس کريپتاز معکوس بيتاثير است. اين ترکي ب ي ک مهارکننده غير رقابتي آنزي تلومراز محسوب ميشود به اين ترتيب که محل اتصال دارو متمايز از محل داکسي ريبو نوکلئوتيدها و آغازگر است) 99 (. در واقع به محل کاتاليتي ک آنزي متصل نميشود و همين امر آن را از ساير مهارکنندهها از جمله ترکيبات نوکلئوزيديک و يا اليگونوکلئوتيدي متمايز ميسازد) 92 (. تاکنون بررسيه يا گوناگوني در مورد تاثير اين ترکي ب بر روي سلوله يا سر اني مختلف صورت گرفته و نشان داده شده است که موجب مهار تکثير سلوله يا سر اني ريه سينه فيبروسارکوما و پروستات ميشود) 9 (. اين دارو داراي اثرات وابسته به دوز بوده و سرعت و اثر آن به ول اوليه تلومر در سلول سر اني بستگي دارد. با توجه به آن که تقريبا %1 بيماران مبت به APL داراي تلومرهايي با ول کوتاه و فعاليت تلومراز با مي باشند لذا به نظر ميرسد اين بيماران کانديد مناسب براي درمان با مهارکنندگان تلومراز باشند) 9 (. به اين منظور و براي بررسي کارآيي استفاده از استراتژي آنتيتلومراز در بيماري APL سلوله يا رده گرفت. با غلظته يا متفاوت از داروي تيمار شدند و نتايج آن مورد بررسي قرار
دوره 9 شماره 4 زمستان 12 مواد و روشها کشت سلولي: در يك مطالعه ترربي انساني )APL mm حاوي RPMI 164 پنيسيلين به ميزان )رده سلولي به صورت سوسپانسيون در محيط کشت FBS 2 از L -گلوتامين %9 و استرپتومايسين به ميزان unit/ml در دماي ۱ درجه سانتيگراد و فشار %5 از µg/ml CO 2 کشت داده شدند. از بانک سلولي انستيتو پاستور تهيه شد و براي بررسي حضور )9۱; 95(t با روش استاندارد کاريوتايپينگ انرام شد. ه چنين اين رده سلولي براي حضور mrna ژن ترکيبي PML/RARα نيز مورد مطالعه قرار گرفت. تيمار دارويي با : براي تيمار دارويي سلولها از داروي )آمريكا بيوساينس( که به صورت پودر ميباشد استفاده شد. محلول يخيره در غلظت 9 mm و به واسطه حل کردن اين دارو در DMSO استريل %/9 تهيه شد. محلول يخيره را در ميکروتيوبها تقسي کرده و آنها را در دماي 2- درجه سانتيگراد تا زمان مصرف نگهداري کردي. به منظور تعيين اثرات بهينه دارو ٢ متغير دوز و زمان در اين تحقيق در نظر گرفته شد. سر اني با غلظتهاي 6 9 و 1 ميكرومو ر از داروي تيمار شدند و به ترتيب پس از زمانهاي 4٨ ٢4 و ٢٢ ساعت مورد مطالعه قرار گرفتند. در ضمن به منظور افزايش بهرهوري کار و بررسي مقايسهاي تمامي آزمايشها براي هر دوز و زمان به صورت داپليکيت انرام شد. تعيين درصد زنده بودن و بررسي منحني رشد لگاريتمي سلولها: براي بررسي اثر مهاري داروي بر روي شاخص زنده ماني و منحني رشد لگاريتمي سلولها حضور يا عدم حضور داروي به تعداد * 9 5 9 سلول در هر ml در انکوبه شده و به مدت 9 روز نگهداري شدند. سلولها هر سه روز يک بار پاساژ داده شده و مرددا تيمار ميشدند. به ور پيوسته هر 24 ساعت شاخص زندهماني سلولها با استفاده از رنگآميزي تريپانبلو بررسي شد. براي انرام آزمايش در شرايط استريل ميزان ميکروليتر از سوسپانسيون سلولي را برداشته و داخل يک ميکروتيوب ريختي. سپس ه حر آن تريپانبلو اضافه كرده و پس از گذشت چند دقيقه يک قطره از آن را برداشته و با استفاده از م نئوبار و در خانههاي مربوط به شمارش گلبول سفيد شمارش انرام شد)ضريب رقت 2 ميباشد(. در ادامه با شمارش مرده و با استفاده از فرمول زير درصد زنده بودن سلولها تعيين گرديد. = درصد زنده بودن سلولها * بررسي ميزان ساخت DNA و درصد تکثير سلولي: اثر مهاري بر روي تکثير از ريق تعيين ميزان مشارکت برمو داکسي يوريدين در DNA با استفاده از BrdU-based cell proliferation ELISA kit بق دستورالعمل کيت اندازهگيري شد. به ور خ صه سلولها به تعداد 5 در هر چاهک درون پليت 16 تايي در حضور يا عدم حضور داروي کشت داده شدند. 92 ساعت مانده به انتهاي زمان انکوباسيون 9 ميکروليتر محلول BrdU که در کيت موجود ميباشد به سلولها افزوده شد. در ادامه و با استفاده از محلول شده و FixDenat DNA عليه BrdU سلولها فيکس آنها دناتوره گرديد. سلولها با آنتيبادي که با آنزي پراکسيداز کنژوگه ميباشد به مدت 9 ساعت در دماي اتاق انکوبه شده و در انتهاي اين زمان ميکروليتر سوبستراي TMB افزوده گرديد. پس از گذشت دقيقه در دماي اتاق و آن ه به منظور پايان دادن به عملکرد آنزي پراکسيداز از محلول اسيد سولفوريک 9 مو ر استفاده شد. در انتها ميزان رنگ ايراد شده در هر چاهک با استفاده از دستگاه ا يزا ريدر در ول موج 45nm خوانده شد. براي محاسبه اثر مهاري داروي تعداد زنده مرمو زنده و مرده بر روي تکثير و بررسي ميزان کاهش ساخت DNA تيمار شده از فرمول زير
مهار تكثير و مهاركننده غيرنوكلئوتيدي داود بشاش و همكاران ND-1 استفاده شد: - 9= )%( ميزان مهار تكثير * در اين فرمول OD exp و OD cont به ترتيب بيانگر جذب نوري تيمار شده و تيمار نشده )کنترل( ميباشد. اندازهگيري فعاليت متابوليك سلولي: در اين مطالعه به منظور بررسي تاثير سايتوتوکسيک دارو بر توان متابوليك سلول از روش MTT استفاده شد. پس از تيمار سلولي ميکروليتر سوسپانسيون حاوي * 9 5 سلول به چاهکهاي پليت 16 خانهاي اضافه گشت)هر سري به صورت سه تايي انرام شد(. چاهکي که فقط حاوي محيط کشت فاقد سلول بود به عنوان ب نک دستگاه ا يزا ريدر و چاهکهاي شامل محيط کشت و سلول)بدون افزودن دارو( به عنوان کنترل زنده سلول به کار رفت. پليت مورد آزمايش در دماي ۱ درجه سانتيگراد و فشار %5 از CO 2 قرار گرفت. بعد از اتمام زمان انکوباسيون به هر چاهک ميکروليتر محلول MTT افزوده شده و پس از شيک به مدت 5 دقيقه پليت به مدت ساعت ديگر انکوبه شد. سپس پليت را با دور 5 به مدت 9 دقيقه g سانتريفوژ نمودي پس از سانتريفوژ مايع رويي را دور ريخته و به رسوب ته پليت ميکروليتر DMSO اضافه كردي. پس از مخلوط نمودن به مدت 5 دقيقه پليت را در دماي ۱ درجه سانتيگراد به مدت 5 دقيقه انکوبه نمودي. سپس پليت را جهت قرائت در دستگاه ا يزا ريدر قرار داده و جذب نوري چاهکها را در ول موج 5۱ نانومتر خواندي استخراج RNA و ساخت : cdna کيت. براي استخراج RNA از مورد مطالعه از High Pure RNA Isolation )ر وش( استفاده شد. پس از تيمار بق دستورالعمل با داروي و متعاقب گذشت زمانهاي 48 24 و ۱2 ساعت RNA سلولها استخراج شده و کميت آنها با روش اسپکتروفتومتري با استفاده از دستگاه نانو درا معکوس از اندازهگيري شد. براي انرام واکنش رونويسي (Takara BIO) Revert Aid First Strand cdna Synthesis Kit استفاده شد. حر مورد نظر براي انرام اين واکنش 2 ميکروليتر بود و محتويات آن شامل 4µL بافر 2µL PCR 5X 9µL DNTP µl DEPC از ران دم هگزامر 9µL آب تيمار شده با 9 µl )2 9 مهار کننده U/µL( RNase ترانس کريپتاز معکوس M-MULV 9 از )2 و µg U/µL( RNA مورد آزمايش به ازاء هر واکنش ميباشد. محتوي مذکور به مدت 5 دقيقه در دماي 65 درجه سانتيگراد 5 دقيقه در دماي 25 درجه سانتيگراد و 9 ساعت در دماي 42 درجه سانتيگراد انکوبه شدند و در نهايت واکنش ساخت cdna به واسطه انکوباسيون 5 دقيقهاي در دماي ۱ درجه پايان پذيرفت. cdna ساخته شده در دماي 2- درجه سانتيگراد نگهداري شد. انرام آزمون : Real-time PCR آزمون Real-time PCR و در حر در دستگاه light cycler )ر وش( 2 ميکروليتر انرام شد. به ازاء هر واکنش از 9µL SYBR Premix Ex Taq محصول µl cdna )تاكارا بيو( 2µL از /5 از هر يک از آغازگرها) pmol 9( ۱ آب عاري از نوکلئاز استفاده شد. شرايط دمايي و µl مورد استفاده شامل يک مرحله فعالسازي اوليه در دماي 15 درجه سانتيگراد به مدت ثانيه و در ادامه 45 سيکل براي دناتوراسيون) 5 ثانيه در 15 درجه سانتيگراد( و مرحله آنيلين گ/اكستنش ن توام )2 ثانيه در 6 درجه سانتيگراد( ميباشد. براي بررسي اختصاصيت محصول تکثير شده منحني يوب مورد بررسي قرار گرفت. در انتها براي محاسبه نسبي تعداد نسخه mrna تکثير شده از فرمول 2 استفاده شد)جدول 9(. ct آناليز آماري: براي انرام مطالعههاي آماري از 98 SPSS استفاده شد. اخت ف معنادار بين متغيرهاي آزمايش با استفاده از آزمون student two tailed p< /5 تعيين شد. مقادير به دست آمده با از نظر آماري معنادار در نظر گرفته شده است. OD exp OD cont
دوره 9 شماره 4 زمستان 12 جدول : توالي آغازگرهاي مورد استفاده جهت انجام آزمون Real-time PCR ژن Accession number NM-914 HPRT آغازگر جلوبرنده )'6-'( TGGACAGGACTGAACGTCTTG آغازگر معكوس )'6-'( CCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTA سايز) bp ( 999 15 CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC TGACACCTCACCTCACCCAC NM-91825 يافتهها به ور وابسته به دوز و زمان باعا كاهش زندهماني ميشود: پس از کشت رده سلولي در حضور غلظتهاي مختلف دارو درصد زندهماني سلولها جهت بررسي تاثير دارو به صورت روزانه مورد بررسي قرار گرفت. نتايج نشان ميدهد که داروي بر روي داراي اثر مستقي آنتيپروليفراتيو وابسته به دوز و زمان ميباشد به وري که درصد زندهماني تيمار شده در محيط کشت با افزايش غلظت دارو و در ول زمان در مقايسه با تيمار نشده)کنترل( به ور قابل توجه کاهش يافت)نمودار 9(. تيمار سلولها در حضور تمام غلظ ت هاي دارويي به غير از غلظت 9 ميكرومو ر در اثر گذشت زمان با كاهش زندهماني سلولها همراه بوده است)جدول 2(. كاهش درصد زندهماني سلولها 24 ساعت پس از تيمار با دوز 1 ميكرومو ر آغاز شده و تمامي تيمار شده با اين غلظت دارويي در روز هفت مرده بودند. همان گونه كه در نمودار 9 ارايه شده است با افزايش غلظت دارو شاهد افزايش تاثير آنتيپروليفراتيو عليه رده سلولي ميباشي در اين خصوص دوزهاي 6 و 1 ميكرومو ر در روز شش به ترتيب %8 و %15 زندهماني سلولها را كاهش دادند اين در حالي است كه تاثير دوز ميكرومو ر كمتر بوده و با كاهش 26 درصدي در اين روز همراه بوده است. بررسي سلولها تا روز ده نشان ميدهد كه تيمار با دوز 9 ميكرومو ر بر روي زندهماني تاثير نداشته است. مهار تكثير سلولي و كاهش ميزان ساخت : DNA به منظور بررسي اثر آنتي پروليفراتيو داروي و تعيين اثربخشي آن بر روي تکثير و ساخت DNA در رده سلولي آزمون BrdU انرام شد در اين آزمون ميزان مشارکت برمو داکسي يوريدين در DNA تيمار شده بيانگر ميزان ساخت DNA در اين سلولها ميباشد. ي بررسيهاي وابسته به دوز در زمانهاي 24 48 و ۱2 ساعت مشخص گرديد که داروي ه به ور وابسته به دوز و ه وابسته به زمان قادر به مهار تکثير است. غلظت 9 µm دارو هيچگونه اثري در مهار ميزان ساخت DNA سلولها نداشت در حالي که در غلظت µm فعاليت تکثير سلولها در زمانهاي يکر شده به ترتيب به %16 %8 و %۱6 کاهش يافت)نمودار 2(. با افزايش غلظت دارو و مطالعه نتايج به دست آمده مشخص شد که کاهش تکثير و مهار ساخت DNA در غلظتهاي 6 و 1 ميکرومو ر بيشتر از غلظت ميکرومو ر بوده است به گونهاي که ميزان تکثير تيمار شده به مدت ۱2 ساعت با دوزهاي 6 و 1 ميکرومو ر به ترتيب به 55 و درصد کاهش پيدا کرد. نتايج به دست آمده نمايانگر مؤثر بودن داروي در مهار رشد سر اني APL بوده و با توجه به اين نتايج ميتوان به اين نکته پي برد که هر چه سلولها زمان ميشود. ه و نيتري تحت تيمار با داروي قرار گرفته باشند مي زان رشدشان کمتر چنين در دوزهاي با تر ممانعت از رشد سلولي سريعتر و به ميزان بيشتري صورت ميگيرد. به ور وابسته به دوز و زمان باعا كاهش فعاليت متابوليك ميشود: در اين مطالعه و به منظور بررسي اثر داروي در مهار فعاليت متابوليک رده سلولي آزمايش MTT انرام شد. در ي بررسيهاي وابسته به دوز
درصد زنده مانی سلول ها مهار تكثير و مهاركننده غيرنوكلئوتيدي داود بشاش و همكاران در زمانهاي 48 24 و ۱2 ساعت مشخص گرديد که داروي ه قادر به مهار فعاليت متابوليک ميباشد. همان گونه که در نمودار مشاهده ميشود غلظت 9 µm دارو هيچ گونه اثري در مهار فعاليت متابوليک سلولها ندارد در حالي که در غلظت µm دارو فعاليت متابوليک سلولها در زمانهاي يکر شده به ترتيب به %15/6 %88 و %۱1 رسيد. چنين تيمار سلولها با غلظتهاي 6 µm 1 و µm دارو ي زمانهاي 48 24 و ۱2 ساعت به ترتيب سبب دوز) µm ( كسب فعاليت متابوليک %81 %۱5 %59 و %8 %54 و %2۱ گشت. نتايج حاصل از آزمايش MTT مؤيد آن است كه داروي كاهش فعاليت متابوليك جدول 9: نتايج درصد زنده ماني سلولها بر حسب روز به ور وابسته به دوز و زمان باعا 4 6 9 1 زمان)روزها ) ميشود. کاهش رونويسي ژن به ور وابسته به دوز و زمان ي تيمار با داروي : مشخص شده است که فعاليت تلومراز ي روند بلوغ و تکامل عمدتا از ريق رونويسي ژن تنظي 1 1۱ 4 2 11 55 4 1۱ 65 6 4 2 2 11 ۱9 9 18 ۱4 9۱ 5 11 82 2۱ 1 18 85 8 2 1 5۱ 6 1 65 1 91 2 4 5 BIBR 952 BIBR 952 BIBR 952 BIBR 952 9 6 1 19µM µm 66µM 91µM µm µm µm µm زمان )روز( زمان )روز( 92 12 1 8 8 6 4 2 نمودار : تاثير داروي بر روي درصد زندهماني سلوله يا طي روز ابتدايي تيمار. كاهش درصد زندهماني سلولها 94 ساعت پس از تيمار با دوز 21 ميكروموالر آغاز شده و تمامي تيمار شده با اين غلظت دارويي در روز هفتم مرده بودند. با افزايش غلظت دارو شاهد افزايش تاثير آنتي پروليفراتيو عليه رده سلولي ميباشيم در اين خصوص دوزهاي 1 و 21 ميكروموالر در روز پنجم به ترتيب %26 و %2 زندهماني سلولها را كاهش دادند اين در حالي است كه تاثير دوز 61 ميكروموالر كمتر بوده و با كاهش 4 درصدي در اين روز همراه بود. بررسي سلولها نشان ميدهد كه تيمار با دوز 1 ميكروموالر بر روي زندهماني تاثير نداشته است. 4
درصد تكثير سلولي درصد تکثير سلولی دوره 9 شماره 4 زمستان 12 نمودار 9: اثر داروي بر ميزان تکثير سلوله يا ساخت DNA سلولها ندارد در حالي که در غلظت 61µM فعاليت تکثير سلولها در زمانه يا به طور وابسته به دوز و زمان. غلظت 1 µm دارو هيچگونه اثري در مهار ميزان 44 94 و 29 ساعت به ترتيب به %2 %46 و 1 و 12 92 1 8 8 6 6 4 4 2 2 %2 کاهش يافت. با افزايش غلظت دارو و مطالعه نتايج به دست آمده مشخص شد که کاهش تکثير و مهار ساخت DNA در غلظته يا تيمار شده به مدت 29 ساعت با دوزهاي 9 1 µm µm 6 µm 9 µm 6 )µm( (µm) غلظت 1 24 24h h 48 48h h 72۱2h h 21 ميکروموالر بيشتر از غلظت 61 ميکروموالر بوده است به گونهاي که ميزان تکثير سلوله يا 1 و 21 ميکروموالر به ترتيب به % و %61 کاهش پيدا کرد. شکل 4 : منحني ذوب ژن و. HPRT همين طور که مشاهده ميشود در نمودارها پس از مشتقگيري منحني درجه دومي به دست ميآيد که وجود پيکه يا ذوب با نقاط ماکزيمم واحد بر اين موضوع داللت دارد که رشته DNA تکثير شده به طور اختصاصي رشتهDNA ژن هدف و ژن مرجع HPRT ميباشد.
فعاليت متابوليك)درصد( Metabolic activity (%) سطح رونویسی ژن مهار تكثير و مهاركننده غيرنوكلئوتيدي داود بشاش و همكاران 12 92 1 نمودار 4: اثر داروي بر ميزان فعاليت متابوليك به طور وابسته به دوز و زمان. غلظت 1 µm دارو هيچگونه اثري در مهار فعاليت متابوليک سلولها ندارد در حالي که در غلظت 61 µm دارو فعاليت متابوليک سلولها در زمانهاي 44 94 و 29 ساعت به ترتيب به %2/ %44 و %22 رسيد. هم چنين تيمار سلولها با غلظتهاي 1 µm و 21 µm دارو طي زمانهاي 44 94 و 29 ساعت به ترتيب سبب كسب فعاليت متابوليک %42 %2 % و %46 %4 و %92 گشت. 8 8 6 6 4 4 2 2 µl 1 µl µl 6 µl 9 µl µl 9 µl µl 6 µl 1 µl Concentrations (µm) 24 hr 48 48hr hr 72۱2hr hr غلظت (µm) 9/2 1.2 91 /8.8 /6.6 /4.4 /2.2 24 24 h 48 48 h 72۱2 h سطح رونويسي ژن 9 1 µm µm 6 6 µm 9 1 µm غلظت (µm) غلظت (µm) نمودار 4: اثر داروي بر سطح رونويسي ژن به طور وابسته به دوز و زمان. نتايج به دست آمده از بررسي بيان ژن مبين اين موضوع است که داروي به طور وابسته به دوز در غلظتهاي 1 61 1 و 21 ميکروموالر موجب کاهش رونويسي ژن شده است همان طور که در اين شکل آورده شده است بيشترين کاهش در ميان غلظتهاي متفاوت مربوط به تيمار سلولي با دوز 21 ميکروموالر ميباشد. هم چنين نتايج به دست آمده از آزمايشهاي وابسته به زمان بيانگر تاثير گذشت زمان در تشديد کاهش ميزان نسخهبرداري از ژن ميباشد بدين ترتيب که حداکثر ميزان کاهش در رونويسي زير واحد کاتاليتيک تلومراز طي تيمار 29 ساعته با دوز 21 ميکروموالر به دست آمد که با کاهش 46 درصدي بيان ژن همراه بود. ميشود) 94 (. در اين راستا و جهت بررسي اثر بر رونويسي ژن )که مه ترين عامل تنظي کننده فعاليت تلومراز ميباشد( ميزان بيان mrna در تيمار شده در مقايسه با کنترل به روش Real-Time RT-PCR ارزيابي گرديد. بدين ژن منظور RNA مربوط به تحت تيمار با 4
دوره 9 شماره 4 زمستان 12 BIBR512 و کنترل استخراج شد cdna هاي شناسايي است و همين فعاليت با خود منرر به پايداري ساخته مربو ه و سپس تغيير در بيان ژن بررسي تلومرها و به دنبال آن توانايي تکثير نامحدود و ناميرايي شد) زا ژن HPRT به عنوان ژن مرجع استفاده گرديد(. از آن جايي که سايبرگرين نميتواند بين محصو ت مختلف تفاوتي قائل باشد با استفاده از منحني يوب اختصاصيت محصو ت در فرآيند PCR مشخص گشت. آناليز منحني يوب نشان ميدهد که هيچگونه آغازگر دايمر و يا تکثير DNA به هاي اضافي وجود نداشته و رشته DNA تکثير شده ور اختصاصي رشته DNA ژن هدف () ميباشد)شکل 9(. نتايج به دست آمده از بررسي بيان ژن مبين اين موضو است که داروي به ور وابسته به دوز در غلظتهاي 6 9 و 1 ميکرومو ر به ترتيب موجب کاهش رونويسي ژن شده است)نمودار 4(. همانطور که در اين شکل آورده شده است بيشترين کاهش در ميان غلظتهاي متفاوت مربوط به تيمار سلولي با دوز 1 ميکرومو ر ميباشد. ه ژن چنين نتايج به دست آمده از آزمايشهاي وابسته به زمان بيانگر تاثير گذشت زمان در تشديد کاهش ميزان نسخهبرداري از ميباشد بدين ترتيب حداکثر ميزان کاهش در رونويسي زير واحد کاتاليتيک تلومراز ي تيمار ۱2 ساعته با دوز 1 ميکرومو ر به دست آم د که با کاه ش 8 درصدي بيان ژن همراه بود. سر اني ميگردد) 98 (. با توجه به اين که سر اني جهت بقاي خود وابسته به آنزي تلومراز بوده و از سوي ديگر به عنوان يک بخش کاتاليتيک کليدي در تنظي فعاليت تلومراز محسوب ميشود به همين دليل در بسياري از روشهاي درماني ضد سر ان مبتني بر تلومراز زير واحد مورد هدف قرار ميگيرد) 91 (. در سال 29 يک ک س جديد از مهارکنندههاي غيرپپتيديک - غيرنوکلئوزيديک تلومراز توسط کمپاني Boehring Ingelheim مه ت رين عضو اين خانواده داروي ميباشد) 9 (. امروزه براي درمان APL معرفي شد که از ATRA و به تازگي از آرسنيک استفاده ميشود اما با توجه به عود بيماران درمان شده با اين راهكار درماني سعي بر آن است تا روشهاي درماني جديدي در مورد اين بيماري مورد بررسي قرار گيرد) 2 (. همان گونه که پيشتر بيان شد يکي از روشهاي درماني مفيد هدف قرار دادن آنزي تلومراز با استفاده از داروهاي آنتيتلومراز است. اکثر داروهاي آنتيتلومراز از جمله در مورد داراي فاز تاخيري هستند. اين خاصيت زماني مشخص شد که براي اولين بار تومورال رده سلولي زايا )GCT( تحت تاثير بحث توموري جهت حفظ ول تلومر و به دنبال به همراه داروي ضد سر ان سيس پ تين قرار گرفتند نتايج اين آزمايشها نشان دادند که براي کوتاه آن حفظ توانايي تکثير نامحدود خود مکانيزمهاي مختلفي شدن ول تلومر به روز زمان نياز ميباشد) 29 (. به را در پيش ميگيرند. يکي از مه ترين مکانيزمها در اين همين دليل به نظر ميرسد که داروهاي آنتيتلومرازي به رابطه و به منظور غلبه بر ساعت تلومريک فعال شدن دليل دارا بودن فاز تاخيري و رابطه اين فاز با ول اوليه مردد و افزايش بيان آنزي تلومراز است) 96 95(. آنزي تلومر و کوتاه شدن تدريري آن در هر تقسي سلولي تلومراز در اصل يک آنزي ريبونوکلئوپروتئيني است که در )حدود 5-2bp در هر تقسي سلولي( بر روي انسان از يک زير واحد RNA به نام hterc و يک زير ي که ول تلومر کوتاهتري دارند ميتوانند مؤثرتر واحد پروتئيني تحت عنوان تشکيل شده عمل کنند. ي مطالعهاي که اخيرا در آزمايشگاه ما انرام است) 9۱ (. در بسياري از سوماتيک فعاليت شد مشخص گشت که کوتاهي ول تلومر و با بودن تلومرازي وجود ندارد و تواليهاي تلومري ي تقسيمات فعاليت تلومراز دو مشخصه مه سر اني APL سلولي از بين ميروند اين در حالي است که در حدود ميباشد) 9 (. ه چنين نتايج حاصل از اين تحقيق بيانگر %1 از سر اني فعاليت با ي تلومراز قابل ارتباط بين اين دو ويژگي با ميزان پيشرفت و عود بيماري 4
مهار تكثير و مهاركننده غيرنوكلئوتيدي داود بشاش و همكاران نيز بود. در اين راستا و با توجه به نقش مه آنزي تلومراز در پيشرفت و عود اين بيماري و ه چنين کوتاهي ول تلومر اين بيماران هدف قرار دادن آنزي تلومراز با داروهاي آنتي تلومراز ه چون مفيد و مؤثر در درمان اين بيماران باشد. ميتواند روشي براي بررسي اثر بخشي درمان آنتي تلومراز در در مراورت دوزهاي مختلف APL تيمار شدند. پس از انرام آزمايشها مشخص گرديد که دوزهاي با ي دارو) ميکرومو ر( قادرند بر روي درصد زندهماني و ه ي مدت کوتاه چنين قدرت تکثير سلولها تاثير مهاري قابل م حظهاي بگذارند اين در حالي است که دوز پايين دارو) 9µM ( ي گذشت مدت زمان کوتاه قادر به مهار رشد و کاهش درصد زندهماني نميباشد. در مطالعه ال- دالي و همکارانش نيز نتايج به همين ترتيب بود به وري که آنها به بررسي اثر CLL پرداختند و نشان دادند که بر روي ردههاي AML و -8µM داراي اثر سايتوتوکسيک مستقي ميباشد) 22 (. ه در غلظتهاي و کوتاه مدت چنين مشخص شده است که بيماران مبت به AML با سطال با ي بيان در زمان تشخيص دوره بهبودي پايينتر دوره بقاي کوتاهتر و ه چنين افزايش احتمال عود بيماري داشتهاند) 2 (. با در نظر گرفتن اين مطلب به نظر ميرسد که بررسي کمي mrna ژن ميتواند در بررسي پيش آگهي و کنترل بيماري مؤثر باشد. ه چنين هدف قرار دادن بيان ميتواند راهي مؤثر در زمينه درمان بيماران مبت باشد. نتايج حاصل از اين مطالعه نشان ميدهد که به ور وابسته به دوز و زمان قادر به كاهش رونويسي ژن است. در نتيره با مطالعه انرام شده مشخص شد كه تيمار با داروي BIBR152 دوز و زمان با سركوب رونويسي از ژن تكثير و ساخت DNA و ه به ور وابسته به مهار چنين كاهش درصد زندهماني سلولها همراه است. با توجه به ول تلومر کوتاه و فعاليت با ي آنزي تلومراز در بيماران APL و ه داروي سلولي چنين اثربخشي در القاي اثر آنتي پروليفراتيو در رده ميتوان درمانهاي مبتني بر استراتژي آنتيتلومرازي را به عنوان راهكار درماني مناسب در بيماران APL مد نظر قرار داد. نتيجهگيري با توجه به ول تلومر كوتاه و فعاليت با ي آنزي تلومراز در بيماران APL و ه چنين اثر بخشي داروي در القاي اثر آنتي پروليفراتيو در رده سلولي ميتوان درمانهاي مبتني بر استراتژي آنتيتلومرازي را به عنوان راهكار درماني مناسب در بيماران نظر قرار داد. مد APL References: 1- Mantadakis E, Samonis G, Kalmanti M. A comprehensive review of acute promyelocytic leukemia in children. Acta Haematol 28; 119(2): 7-82. 2- Martens JH, Brinkman AB, Simmer F, Francoijs KJ, Nebbioso A, Ferrara F, et al. PML-RARalpha/RXR Alters the Epigenetic Landscape in Acute Promyelocytic Leukemia. Cancer Cell 21; 17(2): 17-85. - de Thé H, Chen Z. Acute promyelocytic leukaemia: novel insights into the mechanisms of cure. Nat Rev Cancer 21; 1(11): 775-8. 4- Zhang XW, Yan XJ, Zhou ZR, Yang FF, Wu ZY, Sun HB, et al. Arsenic trioxide controls the fate of the PML-RARalpha oncoprotein by directly binding PML. Science 21; 28(5975): 24-. 44 5- Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2; 1(1): 57-7. 6- Kelland L. Targeting the limitless replicative potential of cancer: the telomerase/telomere pathway. Clin Cancer Res 27; 1(17): 496-. 7- Blackburn EH, Greider CW, Szostak JW. Telomeres and telomerase: the path from maize, Tetrahymena and yeast to human cancer and aging. Nat Med 26; 12(1): 11-8 8- Mason M, Schuller A, Skordalakes E. Telomerase structure function. Curr Opin Struct Biol 211; 21(1): 92-1. 9- Wojtyla A, Gladych M, Rubis B. Human telomerase activity regulation. Mol Biol Rep 211; 8(5): 9-49. 1- Damm K, Hemmann U, Garin-Chesa P, Hauel N,
دوره 9 شماره 4 زمستان 12 Kauffmann I, Priepke H, et al. A highly selective telomerase inhibitor limiting human cancer cell proliferation. EMBO J 21; 2(24): 6958-68. 11- Pascolo E, Wenz C, Lingner J, Hauel N, Priepke H, Kauffmann I, et al. Mechanism of human telomerase inhibition by, a synthetic, non-nucleosidic drug candidate. J Biol Chem 22; 277(18): 15566-72. 12- Shay JW, Keith WN. Targeting telomerase for cancer therapeutics. Br J Cancer 28; 98(4): 677-8 1- Ghaffari SH, Shayan-Asl N, Jamialahmadi AH, Alimoghaddam K, Ghavamzadeh A. Telomerase activity and telomere length in patients with acute promyelocytic leukemia: indicative of proliferative activity, disease progression, and overall survival. Ann Oncol 28; 19(11): 1927-4. 14- Horikawa I, Barrett JC. Transcriptional regulation of the telomerase gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms. Carcinogenesis 2; 24(7): 1167-76. 15- Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 1994; 266(519): 211-5. 16- Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer 1997; (5): 787-91. 17- Zeng Z, Min B, Huang J, Hong K, Yang Y, Collins K, et al. Structural basis for Tetrahymena telomerase processivity factor Teb1 binding to single-stranded telomeric-repeat DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 211; 18(51): 257-61. 18- Ouellette MM, Wright WE, Shay JW. Targeting telomerase-expressing cancer cells. J Cell Mol Med 211; 15(7): 14-42. 19- Deville L, Hillion J, Ségal-Bendirdjian E. Telomerase regulation in hematological cancers: a matter of stemness? Biochim Biophys Acta 29; 1792(4): 229-9. 2- Lengfelder E, Hofmann WK, Nowak D. Impact of arsenic trioxide in the treatment of acute promyelocytic leukemia. Leukemia 212; 26(): 4-42. 21- Mueller S, Hartmann U, Mayer F, Balabanov S, Hartmann JT, Brummendorf TH, et al. Targeting telomerase activity by as a therapeutic approach in germ cell tumors. Invest New Drugs 27; 25(6): 519-24. 22- El-Daly H, Kull M, Zimmermann S, Pantic M, Waller CF, Martens UM. Selective cytotoxicity and telomere damage in leukemia cells using the telomerase inhibitor. Blood 25; 15(4): 1742-9. 2- Huh HJ, Huh JW, Yoo ES, Seong CM, Lee M, Hong KS, et al. mrna levels by real-time RT-PCR in acute myelogenous leukemia. Am J Hematol 25; 79(4): 267-7. 4
مهار تكثير و مهاركننده غيرنوكلئوتيدي 1(4): 5-46 214; Transfus Organ داود Blood بشاش و Sci J Iran همكاران Original Article Time-Dependent Inhibitory Effect of Non-Nucleosidic Telomerase Inhibitor on Cell Proliferation through Transcriptional Suppression of Catalytic Subunit Bashash D. 1, Ghaffari S.H. 2, Kazerani M. 2, HezavehK. 2, Alimoghaddam K. 2, Ghavamzadeh A. 2 1 Faculty of Allied Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran 2 Hematology, Oncology and Stem Cell Research Center of Shariati Hospital, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran Abstract Background and Objectives Since stimulated telomerase activity provides nearly all of human malignancies including acute promyelocytic leukemia (APL) with unlimited proliferative potential, targeting telomerase seems to be an effective approach in cancer treatment. In this regard,, a smallmolecule inhibitor of telomerase, has been shown to increase the therapeutic window of current chemotherapeutic regimens. This study was aimed to investigate the effects of on cell proliferation as well as transcriptional alteration of (the catalytic subunit of telomerase). Materials and Methods leukemic cells were treated with various concentrations of and succeeding trypan blue exclusion assay, BrdU cell proliferation assay, and quantitative real-time PCR were applied to investigate cell viability index, cell proliferation and time-dependent alteration of mrna levels. Results decreased cell viability index and exerted an antiproliferative effect against leukemic cells; we found that exposing cells with at, 6 and 9 μm for 72 h inhibited DNA synthesis rate by 24, 45 and 7%, respectively. Furthermore, transcriptional suppression of was found upon treatment by in a time- and dosedependent manner. Conclusions Based on the short telomere length and high terlomerase activity in APL as well as antiproliferative effect of against cells, anti-telomerase-based therapy might be regarded as a successful strategy in APL therapy. Key words: Acute Promyelocytic Leukemia,, Telomerase Received: 25 Aug 212 Accepted: 2 Nov 212 Correspondence: Ghaffari SH., PhD of Molecular Genetics. Associate Professor of Hematology, Oncology and Stem Cell Research Center, Tehran University of Medical Sciences, Shariati Hospital, Kargar Street. Postal code: 14111, Tehran, Iran. Tel: (+9821) 8492665; Fax: (+9821) 88414 E-mail: shghaffari@tums.ac.ir 4