Επισκεφτήκαμε το ινστιτούτο νευρολογίας και γενετικής όπου μας μίλησε ο κύριος Βάσος Νεοκλέους και η κ. Αλέξια Φαίδωνος για τη μηχανή Polymerase Chain Reaction (pcr)- Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.η PCR είναι πολύ σημαντική σε πολλούς κλάδους (κυρίως της γενετικής) γιατί παίρνοντας ένα πολύ μικρό δείγμα DNA π.χ από τριχες, αποτηπόματα ή ακομη και από οστα, με αυτή μπορούμε να τα απομονώσουμε και να τα πολλαπλασιάσουμε. 1
H Pcr είναι μια μεθοδος της βιοχημείας και μοριακής Βιολογίας που χρησιμοποιείται για την απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό μίας συγκεκριμένης περιοχής του γονιδιώματος μέσω της ενζυμικής αναπαραγωγής του DNA,δεδομένου ότι είναι γνωστή η νουκλεοτιδική του αλληλουχία. Η PCR είναι μία in vitro μέθοδος δηλ. μεσα στο γυαλλί- σε δοκιμαστικό σωλήνα, που περιλαμβάνει επαναλαμβανόμενους κύκλους σε διαφορετικές θερμοκρασίες,, με γρήγορη μετάβαση από την μία θερμοκρασία στην άλλη. Η τεχνική αυτή αναπτύχθηκε από τον Dr. Kary Mullis στις αρχές της δεκαετίας του 1980 και θεωρήθηκε τόσο σημαντική για την προαγωγή της επιστήμης, ώστε το 1993 του απονεμήθηκε το βραβείο Nobel χημείας. 2
Για την διαδικασία αυτή θα χρειαστούμε καποια αντιδραστήρια που είναι απαραίτητα, τα όποια βάζουμε στους μικρούς δοκ. σωλήνες (tubes) 1.στόχος DNA(template DNA):που είναι το κομματι του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε 2. Εκκινητές( Primer) : είναι ουσιαστικά ένα συνθετικό DNA - που αποτελείτε από ολιγονουκλεοτίδια, το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με την χρήση τους - αντιπροσωπεύουν τα νουκλεοτιδικά άκρα του DNA στόχου - για την κατασκευή και καλύτερη επιλογή εκκινητών υπάρχουν ειδικά προγράμματα τα οποία είναι διαθέσιμα από το διαδίκτυο 3.Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntps): - απαραίτητα για την σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας κατά την διάρκεια του πολυμερισμού (datp, dttp, dctp, dgtp) - πρέπει να βρίσκονται σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους για να μην γίνονται λάθη κατά την αντιγραφή του στόχου DNA 4. DNA πολυμεράση (DNA polymerase): ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη του δικλονου DNA και προσκοληση ( υβριδισμός) των εκκινητών. 5. ιόντα μαγνησίου (Mg ++ ): -επηρεάζουν - τον υβριδισμό του εκκινητή - τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων 3
- τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές, - την εξειδίκευση των προϊόντων - δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης 6. ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης - πρέπει να δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνεται η αναδιάταξη του εκκινητή με το στόχο DNA 3
Εικόνα : Μας δίχνει την οθόνη μιας μηχανής PCR που βρίσκεται σε λειτουργία. Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια: 1.Αποδιάταξη του DNA 2. Αναδιάταξη 3.Πολυμερισμός 4
στόχος DNA Εκκινητές Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια DNA πολυμεράση Για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA χρησιμοποιώντας την PCR, το δείγμα του DNA αρχικά θερμαίνεται στους 94 C έτσι ώστε να αποδιαταχθεί το δίκλωνο DNA και να διαχωριστεί σε δυο μονόκλωνα τμήματα. Οι Eκκινητήρες προσαρμόζονται με υβριδισμό( προσκολλούνται) με ψύξη του δείγματος στους 37 60 C. Στη συνέχεια η DNA πολυμεράση, συνθέτει δυο συμπληρωματικούς κλώνους DNA χρησιμοποιώντας τους αρχικούς κλώνους ως πρότυπα. Αυτή η διαδικασία καταλήγει στον πολλαπλασιασμό του DNA, με κάθε ένα από τα καινούργια μόρια να περιέχει έναν παλιό και έναν καινούργιο κλώνο DNA. Ο κύκλος αυτός αποδιάταξης και σύνθεσης νέου DNA μπορεί να επαναληφθεί πολλές φορές, συνήθως 30 ή 40, καταλήγοντας στο σχηματισμό περισσότερων από 1 δισεκατομμύριο αντιγράφων του αρχικού τμήματος του DNA. 5
Σήμερα, η όλη διαδικασία της PCR έχει αυτοματοποιηθεί και με τα καινούργια και τελειότερα μηχανήματα μπορεί να τελειώσει σε λίγες μόνο ώρες. Η όλη διαδικασία των κύκλων της θέρμανσης και της μείωσης της θερμοκρασίας προγραμματίζεται από ένα μηχάνημα το οποίο ονομάζεται θερμικός κυκλοποιητής (PCR thermal cycler), το οποίο έχει τη δυνατότητα να αυξομειώνει την θερμοκρασία της αντίδρασης κάθε λίγα λεπτά ή δευτερόλεπτα, έτσι ώστε να επιτρέψει τη σύνθεση νέων τμημάτων DNA. 6
Καθώς όλο και περισσότεροι επιστήμονες ήρθαν σε επαφή με την PCR, εισήγαγαν μετατροπές της μεθόδου και χρησιμοποίησαν την τεχνική σε νέες ασθένειες και με νέους τρόπους. Σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα η PCR έγινε μια τεχνική ρουτίνας για την έρευνα και ακολούθησαν και οι πρακτικές της εφαρμογές. Από τη στιγμή που θα πολλαπλασιαστούν τα τμήματα του DNA, μπορούν να αναλυθούν με πολλές εργαστηριακές τεχνικές. Για παράδειγμα, οι περισσότερες τεχνικές της χαρτογράφησης του DNA που χρησιμοποιούνται στην αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου γονιδιώματος (Human Genome Project). Επίσης, η PCR είναι πολύ χρήσιμη σε πολλές καινούργιες μεθόδους, όπως το DNA Finger Printing, η διάγνωση βακτηριδίων και ιών και η διάγνωση γενετικών ανωμαλιών. Ακόμη, χρησιμοποιείται σαν βοηθητικό εργαλείο για την διάγνωση του ιού του AIDS και για ταυτοποίηση αγνοουμένων. 7
Σας ευχαριστούμε για την προσοχή σας!!!! <3 8