Εισαγωγή στην Μοριακή διαγνωστική για τον HPV

Transcript

1 Εισαγωγή στην Μοριακή διαγνωστική για τον HPV Ιωαννίδης Αναστάσιος BSc, MD, PhD Επίκουρος Καθηγητής Μικροβιολογίας Πανεπιστήμιο Πελοποννήσου Επιστημονικός Υπεύθυνος Εργαστηρίου Medisyn

2 Κλασική έναντι μοριακής διάγνωσης Η επανάσταση στη μοριακή βιολογία έχει επηρεάσει: Επιστήμε ς Ιατρική Κοινωνία Διάγνωση / Κλινική διαχείριση Μοριακά Διαγνωστικά Εξατομικευμένη ιατρική Πρόκληση για τον 21 ο αιώνα

3 DNA ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΔΥΟ ΠΟΛΥΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ ΠΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΖΟΥΝ ΣΤΟ ΧΩΡΟ ΜΙΑ ΔΕΞΙΟΣΤΡΟΦΗ ΕΛΙΚΑ Η ΚΑΘΕ ΑΛΥΣΙΔΑ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ ΠΟΥ ΛΕΓΟΝΤΑΙ ΔΕΣΟΞΥΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ

4 Στις βάσεις του DNA βρίσκεται αποθηκευμένη η γενετική πληροφορία

5 RNA ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ MIA ΠΟΛΥΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚH ΑΛΥΣΙΔA Η ΑΛΥΣΙΔΑ AYTH ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ ΠΟΥ ΛΕΓΟΝΤΑΙ ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ

6 Διαχείριση κλινικών δειγμάτων & μοριακή ανάλυση Κλινικό Δείγμα Λύση-Καθαρισμός Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος mrna Ιϊκό RNA rrna Γενωμικό DNA RT-PCR cdna PCR Κλωνοποίηση Αλληλούχηση Προϊόντα Ηλεκτροφόρηση

7 Απομόνωση πυρηνικών οξέων Σπάσιμο των κυττάρων Απελευθέρωση των πυρηνικών οξέων σε διαλυτή μορφή Προστασία των πυρηνικών οξέων από την αποικοδόμηση Διαχωρισμός των πυρηνικών οξέων, από κυτταρικά Υπολείμματα, πρωτεΐνες και ένζυμα Το DNA δεν διαλύεται στην αιθανόλη Συμπύκνωσή τους σε μικρό όγκο Συλλογή σε υδατικό περιβάλλον

8 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης PCR DNA (0,01 0,1 μg) PRIMER 1-FORWARD (20 pmol) PRIMER 2-REVERSE (20 pmol) Tris HCL (20mM, ph 8) MgCl 2 (2 mm) 50μM datp, dctp, dgtp, dttp. ΘΕΡΜΟΑΝΘΕΚΤΙΚΗ DNA ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ (2 IU) dh 2 O ΕΩΣ μl ΣΥΝΟΛΙΚΟΥ ΟΓΚΟΥ. ΟΡΓΑΝΟ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ : ΘΕΡΜΟΚΥΚΛΟΠΟΙΗΤΗΣ (THERMOCYCLER)

9 PCR 1. DNA ΑΠΟΔΙΑΤΑΞΗ 94 ο C. 30 sec

10 PCR 2. DNA ANNEALING (ΕΠΑΝΑΔΙΑΤΑΞΗ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΜΕ ΤΙΣ ΜΟΝΟΚΛΩΝΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ DNA) 45 ο - 60 ο C (30 sec)

11 PCR 3. DNA EXTENSION (ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ) 72 Ο C (1 min)

12 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ 1 ου ΚΥΚΛΟΥ 2 ΔΙΚΛΩΝΑ ΜΟΡΙΑ DNA

13

14 RT - PCR RT PCR Το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιεί ένα συμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιο για να ξεκινήσει την σύνθεση DNA από ένα μόριο RNA. Η μονόκλωνη αλυσίδα του DNA που παράγεται, χρησιμοποιείται σαν «μητρική» για τη σύνθεση και μιας δεύτερης αλυσίδας DNΑ.

15 Τα προϊόντα PCR αναλύονται σε μια ξεχωριστή διαδικασία που πραγματοποιείται μετά το τέλος της PCR ή κατά την διάρκεια αυτής, ανάλογα με το είδος της αντίδρασης

16

17 Πρόληψη επιμολύνσεων Διαχωρισμός χώρων πραγματοποιήσεως PCR Καλή εργαστηριακή πρακτική Φυσικές μέθοδοι διαχωρισμού Παρασκευή DNA/RNA σε BSC ή hood ή PCR-workstation Φίλτρα στα tips Yπεριώδης ακτινοβολία Αντιδραστήρια PCR σε μικρές ποσότητες Χρησιμοποίηση μαρτύρων Αδρανοποίηση προϊόντων πολλαπλασιασμού με χημικές/βιοχημικές μεθόδους Κλειστά συστήματα

18 DNA του Ιου είναι~8 kbp Πάνω από 200 HPV γονότυποι Διαφέρουν μεταξύ τους κατά τουλάχιστον κατά 10% στο επίπεδο ακολουθίας DNA WHITE, E. A Manipulation of Epithelial Differentiation by HPV Oncoproteins. Viruses, 11. ZHU, Y., WANG, Y., HIRSCHHORN, J., WELSH, K. J., ZHAO, Z., DAVIS, M. R. & FELDMAN, S Human Papillomavirus and Its Testing Assays, Cervical Cancer Screening, and Vaccination. Adv Clin Chem, 81,

19 ESCOBAR-ESCAMILLA, N., RAMIREZ-GONZALEZ, J. E., CASTRO-ESCARPULLI, G. & DIAZ-QUINONEZ, J. A Utility of highthroughput DNA sequencing in the study of the human papillomaviruses. Virus Genes, 54,

20 * HR-HPV ** * LR-HPV * HR Status not certain

21 Ασθένεια Τύπος του HPV Απλά Κονδυλώματα 2, 7 Πελματικά Κονδυλώματα 1, 2, 4 Δερματικά Κονδυλώματα 3, 10 Γενετικά Κονδυλώματα 6,11,40,42,43,44,55,61,70,72,81,83,84,89 Δυσπλασίες (καρκίνος) γεννητικών οργάνων 16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,7 0,73,82,85 Στοματική Ενδοεπιθηλιακή Υπερπλασία 13, 32 Κονδυλώματα του στόματος 6, 7, 11, 16, 32

22 Συχνότεροι HPV τύποι Οι τύποι 6,11 προκαλούν το 90% των κονδυλωµάτων Τύπος 6 Τύπος 11 Οι τύποι 16,18 προκαλούν το 70% των καρκίνων του τραχήλου Τύπος 16 Τύπος 18

23 Η μόλυνση με τον HPV μεταδίδεται σεξουαλικά

24 Ο ιός διεισδύει στον τράχηλο Papillomavirus Uterus Layers of epithelial cells Cervix HPV infection Vagina

25 WHITE, E. A Manipulation of Epithelial Differentiation by HPV Oncoproteins. Viruses, 11.

26 Ο HPV ΚΑΙ Ο ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ Προκαλείται από στελέχη HPV υψηλού κινδύνου E6 και E7 είναι τα κύρια HPV ογκογονίδια E6 και E7 ογκογονίδια εκφράζονται από τα καρκινικά κύτταρα και η συνεχής έκφραση τους είναι απαραίτητη για τη συντήρηση του κακοήθους φαινοτύπου KIM, K. Y., LEWIS, J. S., JR. & CHEN, Z Current status of clinical testing for human papillomavirus in oropharyngeal squamous cell carcinoma. J Pathol Clin Res, 4,

27 ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ: Η μέχρι χθες κατάσταση Φυσιολογικές συνθήκες Απαρχή της νόσου Υποκλινική νόσος Κλινική νόσος Προχωρημένη νόσος Τεστ Παπανικολάου Πρωτογενής πρόληψη Δευτερογενής πρόληψη

28 ΝΕΑ ΕΠΟΧΗ ΣΤΗΝ ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ Φυσιολογικές Απαρχή Υποκλινική Κλινική Προχωρημένη συνθήκες της νόσου νόσος νόσος νόσος HPV Εμβόλιο HPV DNA test Τεστ Παπανικολάου Πρωτογενής πρόληψη Δευτερογενής πρόληψη

29 Ευαισθησία της κυτταρολογίας για την ανίχνευση CIN2+ (όλες οι ηλικίες) HART Tuebingen Hannover Jena French Public French Private Seattle Canada CIN 2+ Combined 0% 10% 30% 50% 70% 90% 100% Cytology Positivity

30 Ευαισθησία του HPV Test για την ανίχνευση CIN2+ (όλες οι ηλικίες) HART Tuebingen Hannover Jena French Public French Private Seattle Canada CIN 2+ Combined 0% 10% 30% 50% 70% 90% 100% HPV Positivity

31

32

33 Self-Collection Instruction Guide

34 TSAKOGIANNIS, D., GARTZONIKA, C., LEVIDIOTOU-STEFANOU, S. & MARKOULATOS, P Molecular approaches for HPV genotyping and HPV-DNA physical status. Expert Rev Mol Med, 19, e1.

35 ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗ DNA

36 ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΥΒΡΙΔΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ (Microarray Comparative Genomic Hybridization MCGH)

37 ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΟΛΟΚΛΗΡΟΥ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ (Whole-Genome Sequencing-WGS)

38 (Mahmoodi et al., 2019)

39 HPV testing ως μέθοδος πληθυσμιακού ελέγχου Λιγότερο εκτεθειμένο σε ανθρώπινα λάθη Πιο ευαίσθητο στην ανίχνευση CIN2+ Πιο ασφαλές για την γυναίκα Επιτρέπει την διεύρυνση των χρονικών μεσοδιαστημάτων μεταξύ δύο εξετάσεων Θα οδηγήσει σε ελάττωση του κόστους Συνολικά θα οδηγήσει στην βελτίωση της ποιότητας και της αποτελεσματικότητας του πληθυσμιακού ελέγχου (screening)

40 Success story of medicine Nobel Price for Medicine 2008 to Harald zur Hausen for the proof that cervical cancer is induced by Human Papillomaviruses (HPV)

41