Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Transcript

1 Κεφάλαιο 7 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Δ. Παλαιολόγου, Ε. Κατσαρέλη και Γ. Παπανικολάου Περίληψη Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι η μέθοδος που έφερε πραγματική επανάσταση στη μοριακή βιολογία από την ανακάλυψή της το Η PCR είναι ένας απλός τρόπος πολλαπλασιασμού συγκεκριμένων τμημάτων του αρχικού γενετικού υλικού, έτσι ώστε να είναι είναι εφικτή η περαιτέρω μελέτη του με διάφορες μεθόδους, όπως η αλληλούχηση, η πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες, η ηλεκτροφόρηση κ.ά. Η ταχύτητα, η ειδικότητα, η μεγάλη ευαισθησία και το χαμηλό της κόστος την έχουν κάνει μια από τις συχνότερα χρησιμοποιούμενες μεθόδους σε ερευνητικό και διαγνωστικό επίπεδο. Η αντίδραση εκτελείται σε τρία επαναλαμβανόμενα στάδια: (α) αποδιάταξη του γενετικού υλικού, (β) υβριδισμός των εκκινητών στη συμπληρωματική τους αλληλουχία του DNA και (γ) επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας DNA. Μέχρι σήμερα έχουν ανακαλυφθεί πολυάριθμες παραλλαγές της PCR. Στο κεφάλαιο αυτό αναπτύσσεται συνοπτικά η αντίστροφη μεταγραφή (reverse transcription, RT), που χρησιμοποιείται για τη μετατροπή μορίων RNA σε συμπληρωματικά μόρια DNA, και η ποσοτική PCR. Στο πρακτικό μέρος της άσκησης θα σχεδιαστούν εκκινητές για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου TAS2R38 και θα πραγματοποιηθεί PCR για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου που φέρει τον πολυμορφισμό rs Προαπαιτούμενη γνώση Κατανόηση της δομής των μορίων DNA και RNA και βασικές γνώσεις της διαδικασίας αντιγραφής του DNA. 7.1 Θεωρητικό μέρος Κλασική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) είναι ίσως η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη μέθοδος της μοριακής βιολογίας, με αναρίθμητες εφαρμογές τόσο σε ερευνητικό όσο και σε διαγνωστικό επίπεδο. Ανακαλύφθηκε το 1983 από τον βιοχημικό Karry Mullis, που εργαζόταν σε μια εταιρεία βιοτεχνολογίας της Καλιφόρνιας. Για την ανακάλυψη αυτή τιμήθηκε 10 χρόνια αργότερα με το βραβείο Νόμπελ. Η PCR είναι μια ενζυμική μέθοδος ενίσχυσης συγκεκριμένων τμημάτων γενετικού υλικού in vitro. Κατά τη διάρκεια μιας τυπικής αντίδρασης PCR το επιθυμητό τμήμα γενετικού υλικού πολλαπλασιά- 129

2 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ζεται μέχρι και ένα τρισεκατομμύριο φορές, γεγονός που είναι απαραίτητο για μετέπειτα χειρισμούς, όπως η ηλεκτροφόρηση, η πέψη με ένζυμα περιορισμού, η ανάγνωση της αλληλουχίας βάσεων κ.ά. Τα στάδια της PCR Η αντίδραση PCR πραγματοποιείται σε τρία στάδια, τα οποία επαναλαμβάνονται διαδοχικά (εικόνα 7.1): Εικόνα 7.1 Τα στάδια της αντίδρασης PCR. 1. Αποδιάταξη: Οι δύο αλυσίδες του DNA διαχωρίζονται (αποδιατάσσονται) με θέρμανση σε θερμοκρασία C για περίπου 30 sec έως 1 min. 2. Υβριδισμός εκκινητών: Με μείωση της θερμοκρασίας στους C για περίπου 30 sec έως 1 min, οι εκκινητές υβριδίζονται στις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες στο εκμαγείο DNA. 3. Επιμήκυνση: Για τη σύνθεση της νέας αλυσίδας αυξάνουμε τη θερμοκρασία στους 72 C, τη βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της Taq πολυμεράσης. Η πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινητές εισάγοντας τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (Deoxynucleotide triphosphates, dntps) χρησιμοποιώντας τη συμπληρωματική αλληλουχία DNA ως εκμαγείο. Η ταχύτητα σύνθεσης της νέας αλυσίδας είναι της τάξης των 1000 bp ανά λεπτό. Τα παραπάνω στάδια επαναλαμβάνονται από 25 έως 35 φορές. Η PCR εκτελείται στον θερμικό κυκλοποιητή (Thermal cycler), συσκευή που φέρει θερμαινόμενη πλάκα που μπορεί να εναλλάσσει θερμοκρασίες με ταχύτητα και ακρίβεια. Ο θερμικός κυκλοποιητής είναι μια προγραμματιζόμενη συσκευή, στην οποία μπορούμε να ρυθμίσουμε την επιθυμητή θερμοκρασία και τη διάρκεια κάθε σταδίου αλλά και τη διαδοχή τους. Ένα τυπικό πρόγραμμα PCR στον θερμικό κυκλοποιητή για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA μεγέθους 500 bp φαίνεται στoν πίνακα 7.1. Τα συστατικά της PCR Τα βασικά συστατικά για τη διενέργεια της αντίδρασης PCR είναι: 1. DNA πολυμεράση 2. Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές 3. Γενετικό υλικό αλληλουχία στόχος 4. Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης και Mg Νουκλεοτίδια (dntps) 130

3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Εικόνα 7.2 Θερμικός κυκλοποιητής όπου πραγματοποιείται η κλασική αντίδραση PCR. Στην οθόνη του μηχανήματος απεικονίζεται το πρόγραμμα των διαδοχικών κύκλων για τη διενέργεια της αντίδρασης. Φωτογραφία: «Θερμικός κυκλοποιητής», Αιματολογικό Εργαστήριο Α Προπαιδευτικής Παθολογικής Κλινικής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ. Διανέμεται με άδεια CC-BY-SA 3.0. Στάδια της PCR Θερμοκρασία ( C) Χρόνος 1.Αρχική αποδιάταξη 2.Αποδιάταξη 3.Υβριδισμός εκκινητών 4.Επιμήκυνση (1 kb/min) min sec sec 45 sec Επανάληψη σταδίων 2-4 για φορές 5.Τελική επιμήκυνση 72 5 min Πίνακας 7.1 Tυπικό πρόγραμα PCR για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA μεγέθους 500 bp. 131

4 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ DNA πολυμεράση Η DNA πολυμεράση είναι ένζυμο που υπάρχει σε όλους τους οργανισμούς (ευκαρυωτικοί, προκαρυωτικοί και ιοί) και συμμετέχει στην αντιγραφή του DNA. Δεν μπορεί να συνθέσει ένα νέο μόριο DNA, μπορεί όμως να αντιγράψει ένα υπάρχον που χρησιμοποιείται ως εκμαγείο. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται στην PCR έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus (Taq), το οποίο έχει ως φυσικό περιβάλλον τις θερμές πηγές. Η Taq πολυμεράση έχει τη βασική ιδιότητα να παραμένει δραστική σε υψηλές θερμοκρασίες. Η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της είναι 72 C, ενώ δεν καταστρέφεται από τη θέρμανση ακόμη και στους 95 C για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα (εικόνα 7.3). Εικόνα 7.3 Tο βακτήριο Thermus aquaticus ανακαλύφθηκε στις θερμές πηγές στην περιοχή Great Fountain του Lower Geyser Basin στο Εθνικό Πάρκο Yellowstone των ΗΠΑ. Εικόνα: «Steamboat Geyser in Yellowstone» από Brocken Inaglory με άδεια CC-BY-SA 3.0. Πηγή: https: //commons.wikimedia.org/wiki/file:steamboat_geyser_in_yellowstone.jpg#/media/file: Steamboat_Geyser_in_Yellowstone.jpg. H DNA πολυμεράση μπορεί να συνθέσει μια συμπληρωματική αλυσίδα DNA χρησιμοποιώντας ένα μονόκλωνο μόριο ως αρχικό εκμαγείο και έναν εκκινητή ως σημείο εκκίνησης. Η κατεύθυνση της σύνθεσης της νέας αλυσίδας είναι 5-3. Με την πάροδο των κύκλων της PCR η λειτουργικότητα και η πιστότητα της αντιγραφής φθίνουν και αντίστοιχα αυξάνεται ο αριθμός των λανθασμένων βάσεων που εισάγονται στη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα του DNA. Η απλή DNA πολυμεράση κάνει περίπου ένα λάθος στις βάσεις. Οι πολυμεράσες υψηλής πιστότητας (Proofreading polymerase), οι οποίες έχουν δραστικότητα 3-5 εξωνουκλεάσης, μπορούν να διορθώσουν τα λάθη που δημιουργούν κατά τη σύνθεση του μορίου DNA. Έτσι επιτυγχάνουν μικρότερα ποσοστά λαθών, της τάξης του Εκκινητές Οι εκκινητές (Primers) είναι ολιγονουκλεοτίδια που οριοθετούν το τμήμα DNA που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί. Ο σωστός σχεδιασμός των εκκινητών επηρεάζει σημαντικά το αποτέλεσμα της PCR. Υπάρχουν στο διαδίκτυο ειδικά λογισμικά που μας βοηθούν να σχεδιάσουμε εκκινητές, όπως το πρόγραμμα primer3 ( που θα χρησιμοποιήσουμε στο πρακτικό μέ- 132

5 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) ρος της άσκησης. Ο σχεδιασμός των εκκινητών ακολουθεί συγκεκριμένες αρχές, που περιγράφονται παρακάτω: Μέγεθος των εκκινητών: Οι εκκινητές είναι συνήθως ολιγονουλεοτίδια βάσεων. Μικρότεροι εκκινητές οδηγούν σε μη ειδικό υβριδισμό, ενώ μεγαλύτεροι εκκινητές έχουν μεγαλύτερη ειδικότητα, αλλά αυξάνεται η πιθανότητα δημιουργίας δευτερογενών δομών που μειώνουν την αποτελεσματικότητα του υβριδισμού. Αλληλουχία των εκκινητών: Οι εκκινητές πρέπει να έχουν απόλυτη συμπληρωματικότητα προς την αληλουχία στόχο, αλλά ελάχιστη έως καθόλου συμπληρωματικότητα μεταξύ τους. Ο υβριδισμός μεταξύ των εκκινητών οδηγεί στο σχηματισμό διμερών εκκινητών (Primer dimers) που έχουν μέγεθος bp και μειώνουν την αποτελεσματικότητα της PCR. Επίσης, η ύπαρξη περιοχών συμπληρωματικότητας μέσα στον εκκινητή αυξάνει την πιθανότητα δημιουργίας δευτερογενών δομών που μειώνουν την αποτελεσματικότητα του υβριδισμού στην αλληλουχία στόχο. Η θερμοκρασία αποδιάταξης των εκκινητών: Η θερμοκρασία αποδιάταξης, Melting temperature (T m ), είναι η θερμοκρασία στην οποία το 50% των μορίων DNA βρίσκεται σε μονόκλωνη μορφή. H T m εξαρτάται από το μέγεθος της αλληλουχίας και τη σύσταση των βάσεων της αλληλουχίας. Υψηλό ποσοστό σε βάσεις G και C αυξάνει την T m, καθώς οι βάσεις G και C ενώνονται με τις συμπληρωματικές τους στο δίκλωνο DNA με τρεις δεσμούς υδρογόνου, σε αντίθεση με τις βάσεις Α και Τ που ενώνονται με δύο δεσμούς υδρογόνου. Εικόνα 7.4 Kαμπύλη αποδιάταξης μορίων δίκλωνου DNA. Στην αντίδραση PCR η T m των εκκινητών κυμαίνεται τυπικά στους C. Οι δύο εκκινητές δεν πρέπει να έχουν πολύ διαφορετικές T m μεταξύ τους, με μια διαφορά <3-5 C να θεωρείται αποδεκτή. Υπάρχουν πολλοί τύποι για τον υπολογισμό της T m των ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών. Ένας από τους ευρύτερα χρησιμοποιούμενους είναι ο ακόλουθος: T m = 2(A + T ) + 4(G + C) 133

6 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Αν και ο παραπάνω τύπος ισχύει με ακρίβεια για ολιγονουκλεοτίδια μέχρι 7 βάσεων, στην πράξη χρησιμοποιείται για τον αδρό υπολογισμό της T m εκκινητών μέχρι και νουκλεοτιδίων. H T m των εκκινητών επηρεάζει άμεσα τη θερμοκρασία υβριδισμού τους στην αλληλουχία στόχο. Αν και η βέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού πρέπει να προσδιοριστεί πειραματικά, ένα καλό σημείο εκκίνησης είναι 3 C λιγότεροι από τη χαμηλότερη T m των δύο εκκινητών. Γενετικό υλικό (αλληλουχία στόχος) Ως αρχικό υλικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί DNA ή RNA το οποίο θα έχει μεταγραφεί στην πιο σταθερή μορφή του, το συμπληρωματικό DNA (Complementary DNA, cdna). Πολύ μικρές ποσότητες DNA (της τάξης των ng ανά αντίδραση τελικού όγκου 50 μl) είναι επαρκείς για τις περισσότερες αντιδράσεις PCR. Μεγάλη ποσότητα DNA μπορεί να αναστείλει την αντίδραση. Για τη βέλτιστη απόδοση της PCR τo DNA πρέπει να είναι μακρομοριακό και υψηλής καθαρότητας, απαλλαγμένο από υπολείμματα αιθανόλης ή αλάτων που μπορούν να αναστείλουν την αντίδραση. Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης και συγκέντρωση Mg 2+ Το διάλυμα της αντίδρασης διατηρεί το ph και τη συγκέντρωση αλάτων στις βέλτιστες συνθήκες διεξαγωγής της αντίδρασης. Περιέχει επίσης ιόντα Mg 2+, που είναι απαραίτητος συμπαράγοντας της DNA πολυμεράσης. Τα ιόντα Mg 2+ σχηματίζουν διαλυτά σύμπλοκα με τα dntps, το DNA εκμαγείο και τους εκκινητές. Περίσσεια Mg 2+ οδηγεί σε μη ειδική σύνδεση των εκκινητών με το DNA, αυξάνοντας τα μη ειδικά προϊόντα στην αντίδραση. Επίσης μειώνει την πιστότητα αντιγραφής της Taq πολυμεράσης. Χαμηλές συγκεντρώσεις Mg 2+ οδηγούν σε μείωση της ποσότητας του παραγόμενου προϊόντος. Η βέλτιστη συγκέντρωση Mg 2+ για κάθε αντίδραση PCR πρέπει να προσδιορίζεται εμπειρικά με δοκιμή διαδοχικών συγκεντρώσεων από 1 έως 4 mm. Νουκλεοτίδια Τα δομικά μόρια που χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση της νέας αλυσίδας είναι τα τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (deoxynucleotide triphosphates, dntps). Τα dntps χρησιμοποιούνται ως ισομοριακό μίγμα των τεσσάρων νουκλεοτιδίων (ATP, TTP, CTP και GTP) σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται στα μμ. Κινητική της αντίδρασης PCR Στη θεωρία, η αύξηση των προϊόντων της PCR είναι εκθετική, γιατί κάθε μόριο DNA που παράγεται μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα στον επόμενο κύκλο (εικόνα 7.5). Στην πραγματικότητα όμως η PCR χωρίζεται σε τρεις φάσεις (εικόνα 7.6): 1. Εκθετική φάση: Μόλις έχει αρχίσει ο πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας στόχου. Όλα τα αντιδραστήρια βρίσκονται σε επάρκεια και η αντίδραση είναι πολύ αποτελεσματική.σε κάθε κύκλο διπλασιάζονται τα μόρια της αλληλουχίας στόχου. 2. Γραμμική φάση: Παρατηρείται μειωμένη παραγωγή αντιγράφων της αλληλουχίας στόχου εξαιτίας της μείωσης της ποσότητας των αντιδραστηρίων. 3. Φάση πλατώ: Δεν συντίθενται νέα μόρια DNA εξαιτίας της εξάντλησης ενός ή περισσοτέρων αντιδραστηρίων. 134

7 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Εικόνα 7.5 Η κινητική της αντίδρασης PCR. Η αύξηση των προϊόντων της PCR είναι εκθετική γιατί κάθε μόριο DNA που παράγεται μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα στον επόμενο κύκλο της PCR. Βελτιστοποίηση της αντίδρασης PCR Τα βασικά χαρακτηριστικά μιας αντίδρασης PCR είναι η ειδικότητα (Specificity) και η απόδοση (Efficiency). Για να επιτύχουμε τη βέλτιστη ειδικότητα (δηλαδή να λαμβάνουμε ένα μοναδικό προϊόν) και τη μέγιστη απόδοση (την παραγωγή πολλών μορίων των PCR προϊόντων) μπορούμε να τροποποιήσουμε πολλούς παράγοντες, όπως τη συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+, των εκκινητών, των dntps, της πολυμεράσης και τη θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών. Οι παράγοντες που τροποποιούνται συχνότερα είναι η συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+ και η θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών. Βελτιστοποίηση της PCR με τροποποίηση της συγκέντρωσης Mg 2+ Τα ιόντα Mg 2+ σχηματίζουν διαλυτά σύμπλοκα με τα dntps, το DNA εκμαγείο και τους εκκινητές και είναι απαραίτητος συμπαράγοντας της DNA πολυμεράσης. Υψηλή συγκέντρωση Mg 2+ οδηγεί σε μη ειδικό υβριδισμό των εκκινητών στο DNA, οδηγώντας σε παραγωγή μη ειδικών προϊόντων. Χαμηλές συγκεντρώσεις Mg 2+ οδηγούν σε μείωση της ποσότητας του παραγόμενου προϊόντος. Η βέλτιστη συγκέντρωση Mg 2+ για κάθε αντίδραση PCR πρέπει να προσδιορίζεται εμπειρικά, με δοκιμή διαδοχικών συγκεντρώσεων 1-4 mm. Βελτιστοποίηση της PCR με τροποποίηση της θερμοκρασίας υβριδισμού των εκκινητών Η θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών είναι καθοριστικής σημασίας για την ειδικότητα της αντίδρασης. Χαμηλή θερμοκρασία μειώνει την ειδικότητα του υβριδισμού, δηλαδή οι εκκινητές μπορούν να προσδεθούν σε αλληλουχίες DNA που δεν είναι απόλυτα συμπληρωματικές προς τη δική τους. Σε αυτή την περίπτωση παράγονται μη επιθυμητά παραπροϊόντα στην αντίδραση PCR (εικόνα 7.18). Σε υψηλές θερμοκρασίες λιγότερα μόρια εκκινητών υβριδίζονται στο DNA, με αποτέλεσμα τη μείωση της απόδοσης της αντίδρασης. Η βέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού συνήθως προσδιορίζεται πειραματικά. Ως σημείο εκκίνησης 135

8 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 7.6 Οι φάσεις της αντίδρασης PCR. Η αντίδραση χωρίζεται σε τρεις φάσεις: στην αρχική εκθετική φάση τα προϊόντα της PCR σχηματίζονται με εκθετικό ρυθμό, κατά τη γραμμική φάση ο ρυθμός σύνθεσης επιβραδύνεται και στη φάση του πλατώ δεν συντίθενται πλέον νέα προϊόντα PCR. χρησιμοποιείται μια θερμοκρασία περίπου 3 C κάτω από τη χαμηλότερη T m των δύο εκκινητών. Γι αυτό είναι επιθυμητό οι T m των δύο εκκινητών να μη διαφέρουν πάνω από 3-5 C Αντίστροφη μεταγραφή Αντίστροφη μεταγραφή, Reverse Transcription (RT), ονομάζεται η σύνθεση μιας συμπληρωματικής (complementary) αλυσίδας DNA (cdna) έχοντας ως εκμαγείο ένα μόριο RNA. Η αντίδραση αυτή καταλύεται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (ή αντίστροφη τρανσκριπτάση), το οποίο στη φύση βρίσκεται σε RNA-ιούς (ρετροϊούς) όπως ο ιός HIV. Το ένζυμο μετατρέπει το γενετικό υλικό του ιού από τη μορφή του μονόκλωνου RNA σε δίκλωνο DNA, έτσι ώστε να μπορεί να ενσωματωθεί στο γενετικό υλικό των κυττάρων ξενιστών. Η αντίστροφη μεταγραφάση ανακαλύφθηκε, ταυτόχρονα και ανεξάρτητα, το 1970 από τους H. Temin και D. Baltimore. Η ανακάλυψη του ενζύμου οδήγησε στη διαμόρφωση του κεντρικού δόγματος της βιολογίας στη σημερινή του μορφή και χάρισε στους δύο ερευνητές το Νόμπελ ιατρικής το Έδωσε σημαντική ώθηση στη μοριακή βιολογία και στην έρευνα, καθώς επέτρεψε τη μετατροπή των ευαίσθητων μορίων RNA σε σταθερά, συμπληρωματικά μόρια DNA, τα οποία μπορούν να υποστούν χειρισμούς και να μελετηθούν όπως τα υπόλοιπα μόρια DNA (PCR, κλωνοποίηση, αλληλούχηση κ.λπ.). Επίσης, έδωσε νέες δυνατότητες στη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης, ενώνοντας την αντίστροφη μεταγραφή με την κλασική ή την ποσοτική PCR. Με αυτόν τον τρόπο σταδιακά εγκαταλείφθηκε για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης η χρονοβόρος και επικίνδυνη, λόγω χρήσης ραδιενέργειας, μέθοδος του στυπώματος κατά Northern. Σύνθεση της πρώτης αλυσίδας του cdna Η αντίδραση σύνθεσης της πρώτης αλυσίδας του cdna (First strand cdna synthesis) πραγματοποιείται στον θερμικό κυκλοποιητή και τα απαραίτητα αντιδραστήρια είναι η αντίστροφη μεταγραφάση, το αρχικό υλικό RNA, τα dntps και οι κατάλληλοι εκκινητές. Οι ευρύτερα χρησιμοποιούμενες μεταγραφάσες είναι η μεταγραφάση του ιού μυελοβλαστώματος των πτηνών, Αvian Myeloblastosis Virus transcriptase (AMV), και η μεταγραφάση του ιού Moloney της λευχαιμίας των ποντικών, Moloney Murine Leukemia Virus transcriptase (M-MLV)). Για τη σύνθεση cdna μπορούν να χρησιμοποιηθούν τρία είδη εκκινητών (εικόνα 7.7): 136

9 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Εικόνα 7.7 Διαφορετικοί εκκινητές για τη σύνθεση του cdna. Για τη σύνθεση του cdna μπορούν να χρησιμοποιηθούν τρία είδη εκκινητών, οι oligo-dt εκκινητές, εκκινητές ειδικοί για κάθε γονίδιο και τυχαίοι εξανουκλεοτιδικοί εκκινητές. 1. Oligo-dT: Οι εκκινητές αυτοί είναι ολιγονουκλεοτίδια θυμίνης που υβριδίζονται στην πολυ-a ουρά των mrnas. Με τη χρήση τους μπορούν να συντεθούν ακέραια (ολόκληρα) τα μόρια mrna, η χρήση τους όμως δεν συνιστάται σε περιπτώσεις μεγάλων μορίων mrna, >4 Kb (το 5 άκρο τους δεν θα αντιπροσωπεύεται επαρκώς) ή όταν τα μόρια του RNA στόχου δεν έχουν πολυ-α ουρά (RNA προκαρυωτικών οργανισμών). 2. Μίγμα τυχαίων εξανουκλεοτιδικών εκκινητών: Οι εκκινητές αυτοί απαρτίζονται από ένα μίγμα ολιγονουκλεοτιδίων μήκους 6 βάσεων που έχουν τυχαία νουκλεοτιδική σύσταση. Θεωρείται ότι με τη χρήση του μίγματος των τυχαίων εξανουκλεοτιδικών εκκινητών επιτυγχάνεται πληρέστερη κάλυψη όλων των μορίων RNA (ανεξαρτήτως πολυ-α ουράς και σε όλο το μήκος τους). Στην πράξη χρησμοποιείται συνήθως ένα μίγμα oligo-dt και εξανουκλεοτιδικών εκκινητών. 3. Εκκινητές ειδικοί για το γονίδιο στόχο: Όταν το ζητούμενο είναι η αυξημένη ευαισθησία και ο έλεγχος ενός μόνο ή μικρού αριθμού γονιδίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκκινητές ειδικοί για τα επιθυμητά γονίδια. Στην πράξη, αυτή η μέθοδος δεν έχει ευρεία εφαρμογή, γιατί απαιτείται προτύπωση των συνθηκών της αντίδρασης για κάθε ξεχωριστό εκκινητή. Η σύνθεση cdna εκτελείται τυπικά στους C, ανάλογα με το ένζυμο που χρησιμοποιείται, για χρονικό διάστημα από 15 min έως 1 h. Μετά το πέρας της αντίδρασης σχηματίζεται ένα δίκλωνο υβριδικό μόριο που περιέχει μια αλυσίδα RNA και μια αλυσίδα DNA. Στη συνέχεια, με θέρμανση σε υψηλή θερμοκρασία (85 C) καταστρέφονται η αντίστροφη μεταγραφάση και η αλυσίδα του RNA. Το νεοσυντεθέν cdna είναι συμπληρωματικό του αρχικού RNA και η ουρακίλη έχει αντικατασταθεί από τη θυμίνη. Το cdna μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αρχικό υλικό στην κλασική αντίδραση PCR, όπως έχει περιγραφεί στις προηγούμενες ενότητες (εικόνα 7.8) Ποσοτική PCR Η κλασική PCR όπως την έχουμε περιγράψει έως τώρα χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό του επιθυμητού τμήματος DNA. To προϊόν της μπορεί να υποβληθεί σε αλληλούχηση, σε κλωνοποίηση σε πλασμιδισκούς φορείς, σε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης ή ακρυλαμίδης, ή σε πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες και επακόλουθη ηλεκτροφόρηση. Σε όλες τις περιπτώσεις ηλεκτροφόρησης το αποτέλεσμα που παίρνουμε είναι ποιοτικό, της μορφής «ναι ή όχι», ή αλλιώς «υπάρχει ή δεν 137

10 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 7.8 Τα στάδια σύνθεσης του cdna. Στο μόριο RNA υβριδίζονται οι εκκινητές και η αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα DNA. Με αποδιάταξη σε υψηλή θερμοκρασία απομακρύνεται το RNA και προκύπτει η πρώτη, μονή αλυσίδα του cdna. υπάρχει», όπως για παράδειγμα «υπάρχει η μετάλλαξη που δημιουργεί ή καταργεί θέση αναγνώρισης από ένζυμα περιορισμού;», «υπάρχει η σημειακή μετάλλαξη που αναγνωρίζει ο ειδικός εκκινητής;» κ.λπ. Πολύ σύντομα μετά την ευρεία εφαρμογή της, λοιπόν, έγινε προφανές ότι η κλασική PCR δεν μπορούσε να απαντήσει σε ένα άλλο βασικό ερώτημα των ερευνητών, που ήταν το «πόσο;». Το κενό αυτό ήρθε να καλύψει η ποσοτική PCR, που ανακαλύφθηκε το 1993 από τον Russel Higuchi και τους συνεργάτες του, οι οποίοι πρόσθεσαν βρωμιούχο αιθίδιο στο διάλυμα της αντίδρασης και εφάρμοσαν μια κάμερα κλειστού κυκλώματος πάνω στον θερμικό κυκλοποιητή. Βασικές αρχές της ποσοτικής PCR Η ποσοτική PCR έχει εξελιχθεί πολύ από το 1993 μέχρι σήμερα και πλέον αποτελεί μια γρήγορη, ευαίσθητη και αξιόπιστη μέθοδο ποσοτικοποίησης μορίων DNA και cdna. Εκτελείται σε εξειδικευμένα μηχανήματα (θερμικοί κυκλοποιητές πραγματικού χρόνου), εξοπλισμένα με ένα πολύπλοκο σύστημα κατόπτρων και φίλτρων που «διαβάζουν» τον φθορισμό που εκπέμπεται από διάφορες φθορίζουσες χρωστικές, καθώς αυτές ενσωματώνονται στα προϊόντα της PCR. Σήμερα είναι δυνατή η ταυτόχρονη χρήση μέχρι και 21 διαφορετικών χρωστικών σε μια αντίδραση PCR. Η βασική διαφορά ανάμεσα στην ποσοτική και την κλασική PCR είναι η φάση της αντίδρασης, στην οποία συλλέγονται τα δεδομένα και εξάγονται τα αποτελέσματα (εικόνα 7.9). Στην κλασική PCR πρέπει πρώτα να ολοκληρωθούν όλοι οι κύκλοι της αντίδρασης (25-35) και η αντίδραση να φτάσει στη φάση κορεσμού (πλατώ). Στη συνέχεια τα δείγματα υφίστανται περαιτέρω χειρισμό, όπως για παράδειγμα ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης, και αξιολογείται το αποτέλεσμα της PCR. 138

11 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Αντίθετα, στην ποσοτική PCR τα δεδομένα συλλέγονται όταν η αντίδραση είναι ακόμη στη φάση της εκθετικής αύξησης. Η σημαντικότερη παράμετρος για την ποσοτικοποίηση είναι η τιμή C p, που αντιστοιχεί στον κύκλο κατά τον οποίο ο φθορισμός των προϊόντων της PCR ξεπερνά το βασικό επίπεδο (baseline). Εικόνα 7.9 Γραφική παράσταση της καμπύλης της αντίδρασης της ποσοτικής PCR. Η οριζόντια γραμμή δείχνει το κατώφλι (threshold) στο οποίο ο φθορισμός των προϊόντων της PCR αρχίζει να ξεχωρίζει από το βασικό επίπεδο (baseline). Ο κύκλος στον οποίο συμβαίνει αυτό αποδίδεται με την τιμή C t, που αντιστοιχεί στον κύκλο κατά τον οποίο ο φθορισμός ξεπερνά το κατώφλι ανίχνευσης. Το σημείο αυτό είναι αλλιώς γνωστό ως σημείο διασταύρωσης, C p (Crossing Point). Η τιμή C p είναι απαραίτητη για την ποσοτικοποίηση του δείγματος. Δείγματα με πολλά αντίγραφα του γονιδίου στόχου έχουν μικρότερο C p από δείγματα με λιγότερα αντίγραφα του γονιδίου στόχου. Το C p αντιστοιχεί στον κύκλο της αντίδρασης στον οποίο η ένταση του φθορισμού θα ξεπεράσει το βασικό επίπεδο και θα φτάσει έναν συγκεκριμένο ουδό (κατώφλι) καταγραφής. Το όριο αυτό υπολογίζεται αυτόματα από το μηχάνημα ανάλογα με τη διακύμανση των τιμών του βασικού επιπέδου. Εάν θεωρήσουμε ότι στο σημείο του C p η αντίδραση είναι ακόμη στην εκθετική φάση, δηλαδή σε κάθε κύκλο τα προϊόντα της PCR διπλασιάζονται, τότε η απόδοση της αντίδρασης είναι ίση με 2. Επομένως, σύμφωνα με τον παρακάτω τύπο, μπορούν να υπολογιστούν τα αντίγραφα του γονιδίου στόχου σε κάθε δείγμα, με μοναδικές άγνωστες παραμέτρους το C p και τα αντίγραφα του γονιδίου στόχου στο C p (εικόνα 7.10): N o = N t /(E + 1) Cp όπου N o είναι τα αντίγραφα του γονιδίου στόχου στο αρχικό δείγμα, N t είναι τα αντίγραφα του γονιδίου στόχου στο C p, E (Efficiency) είναι η απόδοση της αντίδρασης (στην εκθετική φάση E = 2) και C p το σημείο διασταύρωσης, δηλαδή ο κύκλος της αντίδρασης κατά τον οποίο η ένταση του φθορισμού ξεπερνά τον ουδό του βασικού επιπέδου. Το C p υπολογίζεται αυτόματα από το μηχάνημα. Τα αντίγραφα του γονιδίου στόχου στο C p υπολογίζονται από την πρότυπη καμπύλη. Αντίστοιχα υπάρχουν και άλλοι μαθηματικοί τύποι υπολογισμού 139

12 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ που περιλαμβάνουν διόρθωση για τη μείωση της αποτελεσματικότητας της αντίδρασης που παρατηρείται με το πέρασμα των κύκλων πολλαπλασιασμού. O ποσοτικός προσδιορισμός βασίζεται στο ότι όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των μορίων DNA ή cdna στο αρχικό δείγμα τόσο μικρότερος είναι ο αριθμός των κύκλων πολλαπλασιασμού που χρειάζονται για να παραχθεί ικανός αριθμός προϊόντων ώστε ο φθορισμός του δείγματος να ξεπεράσει το επίπεδο ανίχνευσης. Επομένως δείγματα με πολλά αντίγραφα του γονιδίου στόχου έχουν μικρότερο C p από δείγματα με λιγότερα αντίγραφα. Επίσης είναι καλό να σημειωθεί ότι η παραγωγή του προϊόντος της PCR έχει γραμμική συσχέτιση με τον παραγόμενο φθορισμό. Απόλυτη ποσοτικοποίηση, πρότυπη καμπύλη και γονίδιο αναφοράς Η απόλυτη ποσοτικοποίηση στην ποσοτική PCR πραγματοποιείται βάσει μια πρότυπης καμπύλης, η οποία δημιουργείται από δείγματα με γνωστή συγκέντρωση ή καλύτερα με γνωστό αριθμό αντιγράφων του γονιδίου που πρόκειται να ποσοτικοποιηθεί (standards). Εικόνα 7.10 Απόλυτη ποσοτικοποίηση των αντιγράφων ενός γονιδίου με χρήση πρότυπης καμπύλης. Η πρότυπη καμπύλη δημιουργείται υποβάλλοντας σε PCR δείγματα που έχουν γνωστό αριθμό αντιγράφων του γονιδίου που πρόκειται να ποσοτικοποιηθεί (standards) και συνήθως έχουν 1 log διαφορά μεταξύ τους. Η συσχέτιση των σημείων διασταύρωσης (C p ) των standards και του λογαρίθμου της συγκέντρωσής τους μας δίνει την πρότυπη καμπύλη. Στη συνέχεια, γνωρίζοντας μόνο το σημείo διασταύρωσης (C p ) ενός άγνωστου δείγματος, μπορούμε να υπολογίζουμε τον αριθμό των αντιγράφων του υπό μελέτη γονιδίου. Για παράδειγμα, η πρότυπη καμπύλη για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου ABL1 140

13 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) κατασκευάζεται από δείγματα αναφοράς (standards) που περιέχουν 10 1, 10 2, 10 3, 10 4 και 10 5 αντίγραφα του γονιδίου ABL1. Συνήθως χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τέσσερα standards, που έχουν 1 log διαφορά μεταξύ τους. Η πρότυπη καμπύλη, ιδανικά, πρέπει να καλύπτει όλο το εύρος των συγκεντρώσεων που μπορεί να ανιχνευθούν πειραματικά. Για κάθε γονίδιο κατασκευάζεται διαφορετική πρότυπη καμπύλη, γιατί κάθε αντίδραση PCR ζεύγους εκκινητών έχει διαφορετική απόδοση. Συνεπώς κάθε αντίδραση ποσοτικής PCR περιλαμβάνει τα δείγματα που πρόκειται να ποσοτικοποιηθούν και τα standards της πρότυπης καμπύλης. Ο αριθμός αντιγράφων του κάθε γονιδίου στο C p υπολογίζεται με βάση την πρότυπη καμπύλη όπως φαίνεται στην εικόνα Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της απόλυτης ποσοτικοποίησης το αποτέλεσμα για την έκφραση ενός γονιδίου δίνεται ως αριθμός ανά μονάδα αρχικού δείγματος, π.χ. 130 αντίγραφα του κυτταρομεγαλοϊού (CMV) ανά ml αίματος, ανά κύτταρο, ανά mg ιστού. Με αυτόν τον τρόπο πραγματοποιείται η ποσοτικοποίηση αντιγράφων γονιδίων που είναι εξωγενή ως προς το ανθρώπινο γονιδίωμα, όπως οι ιοί CMV, HIV, HCV κ.ά. Στην περίπτωση που γίνεται ποσοτικοποίηση γονιδίων που εκφράζονται ενδογενώς στον άνθρωπο (ή στο εκάστοτε πειραματικό σύστημα), είναι απαραίτητη η χρήση ενός γονιδίου αναφοράς. Το γονίδιο αναφοράς πρέπει να έχει σταθερή έκφραση στις δεδομένες πειραματικές συνθήκες και χρησιμοποιείται για να εξομαλύνει τις διαφορές που υπάρχουν ανάμεσα στα δείγματα είτε λόγω αποκλίσεων στην απόδοση της σύνθεσης του cdna είτε λόγω μικροδιαφορών στο πιπεττάρισμα κατά την προσθήκη γενετικού υλικού στην αντίδραση. Τα πιο συνηθισμένα γονίδια αναφοράς είναι το Abelson murine Leukemia viral oncogene homolog 1 (ABL1) και η ακτίνη-β (ACTB). Το αποτέλεσμα έχει πλέον μόνο αριθμητική μορφή και είναι του τύπου: Αριθμός αντιγράφων δείγματος = αριθμός αντιγράφων γονιδίου στόχου αριθμός αντιγράφων γονιδίου αναφοράς Εκτός από την απόλυτη, μπορεί να πραγματοποιηθεί και σχετική ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης. Σε αυτή την περίπτωση συγκρίνονται τα C p του γονιδίου στόχου και του γονιδίου αναφοράς ανάμεσα σε δύο δείγματα και το αποτέλεσμα είναι του τύπου: «x φορές υψηλότερη ή χαμηλότερη έκφραση του γονιδίου στο δείγμα 1 σε σχέση με το δείγμα 2». Έχουν αναπτυχθεί πολλά μαθηματικά μοντέλα που περιγράφουν αυτή τη μορφή σχετικής ποσοτικοποίησης. Το απλούστερο και ευρύτερα χρησιμοποιούμενο είναι το ακόλουθο [1]: [ Cp δείγματος Cp R = 2 γονιδίου αναφοράς] R = 2 [ Cp] Φθορίζουσες χρωστικές Οι φθορίζουσες χρωστικές που χρησιμοποιούνται σήμερα στην ποσοτική PCR διακρίνονται σε ειδικές και μη ειδικές. Οι μη εδικές φθορίζουσες χρωστικές, όπως το SYBR Green I (εικόνα??), παρουσιάζουν ελάχιστο ή μηδενικό φθορισμό όταν είναι ελεύθερες στο διάλυμα (Α) και φθορίζουν όταν ενσωματώνονται στη μικρή αύλακα των δίκλωνων μορίων DNA (Β και Γ). Κατά την ποσοτική PCR πραγματοποιείται μέτρηση φθορισμού σε κάθε κύκλο μετά το τέλος της επιμήκυνσης των μορίων DNA. Όσο περισσότερα PCR προϊόντα παράγονται τόσο περισσότερο αυξάνει ο φθορισμός που καταγράφεται από το μηχάνημα. Οι ειδικές χρωστικές δεν είναι ελεύθερες στο διάλυμα, αλλά είναι προσδεδεμένες πάνω σε μικρά μόρια DNA (25-30 βάσεις) και υβριδίζονται στο γονίδιο στόχο ανάμεσα στους δύο εκκινητές. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες χρωστικές είναι οι ιχνηθέτες τύπου Taqman (Taqman Probes) (εικόνα 7.12). Στο 5 άκρο του ιχνηθέτη υπάρχει ένα φθοριοφόρο μόριο και στο 3 άκρο ένα μόριο παρεμπόδισης 141

14 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 7.11 Μη ειδικές φθορίζουσες χρωστικές. Οι μη ειδικές φθορίζουσες χρωστικές, με γνωστότερη το SYBR Green I, ενσωματώνονται στο δίκλωνο μόριο dsdna καθώς αυτό συντίθεται και φθορίζουν μόνο όταν είναι συνδεδεμένες. φθορισμού (α). Στο στάδιο του υβριδισμού ο ιχνηθέτης υβριδίζεται στο γονίδιο στόχο (β). Υδρόλυση του ιχνηθέτη Taqman μέσω της 5-3 εξωνουκλεολυτικής δράσης της Taq πολυμεράσης διαχωρίζει το φθοριοφόρο από τον καταστολέα, με αποτέλεσμα την εκπομπή φθορισμού από το πρώτο (γ). Η μέτρηση του φθορισμού πραγματοποιείται σε κάθε κύκλο, μετά το τέλος της επιμήκυνσης των μορίων DNA, και η αύξηση του φθορισμού συνάδει με αύξηση των παραγόμενων μορίων DNA (δ). Εικόνα 7.12 Ειδικές φθορίζουσες χρωστικές. Οι ειδικές φθορίζουσες χρωστικές (στην εικόνα περιγράφονται οι ιχνηθέτες τύπου Taqman) είναι συνδεδεμένες πάνω σε μικρά μόρια DNA. Υβριδίζονται στο γονίδιο στόχο και κατά την επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας η Taq πολυμεράση διασπά τον ιχνηθέτη, διαχωρίζοντας έτσι το φθοριοφόρο από τον καταστολέα, με αποτέλεσμα την εκπομπή φθορισμού από το πρώτο. Το σαφές πλεονέκτημα των ιχνηθετών Taqman είναι ότι καθιστούν δυνατή τη μέτρηση και ποσοτικοποίηση μόνο του επιθυμητού προϊόντος της PCR. Τα διμερή εκκινητών ή άλλα παραπροϊόντα που τυχόν παράγονται κατά την αντίδραση δεν μετέχουν στην ποσοτικοποίηση, καθώς ο ιχνηθέτης δεν υβριδίζεται πάνω τους και κατά συνέπεια δεν δημιουργείται σήμα φθορισμού. Βέβαια, οι ιχνηθέτες αυτοί έχουν σχετικά υψηλό κόστος αγοράς και για κάθε PCR πρέπει να σχεδιαστεί ο κατάλληλος ιχνηθέτης. Αντίθετα, οι μη ειδικές χρωστικές (όπως το SYBR Green I) είναι φθηνές και κοινές για όλα τα ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην ποσοτική PCR. Για να χρησιμοποιηθούν σωστά όμως πρέπει η αντίδραση να σχηματίζει ένα και μοναδικό προϊόν και όχι διμερή εκκινητών ή άλλα παραπροϊόντα. Αυτό μπορεί να επιβεβαιωθεί με μελέτη της καμπύλης τήξης των προϊόντων της PCR μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης της ποσοτικής PCR. 142

15 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 7.2 Πρακτικό μέρος Σχεδιασμός εκκινητών για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου TAS2R38 Στο πρακτικό μέρος της άσκησης θα ξεκινήσουμε από τον σχεδιασμό των ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών για την ενίσχυση του τμήματος του γονιδίου TAS2R38 που φέρει τον πολυμορφισμό rs , τον οποίο θα μελετήσουμε σε επόμενη άσκηση με εκτέλεση PCR και πέψη του προϊόντος της PCR με χρήση κατάλληλης περιοριστικής ενδονουκλεάσης. Στόχος είναι να ανιχνεύσουμε το γονότυπο της πολυμορφικής θέσης rs στα δείγματα που θα εξετάσουμε. Για να πραγματοποιήσουμε την άσκηση θα χρειαστούμε τη νουκλεοτιδική αλληλουχία του γονιδίου που ανακτήσαμε στο πλαίσιο του πρακτικού μέρους του κεφαλαίου 2 του παρόντος οδηγού. Θυμηθείτε ότι η αλληλουχία που ανακτήσαμε προέρχεται από την εγγραφή NM_ της RefSeq. Εξετάζοντας τον πολυμορφισμό rs στην dbsnp, διαπιστώνουμε ότι αφορά την αλλαγή μιας θυμίνης (Τ) σε κυτοσίνη (C) στη θέση 869 (g.869c>t) της αλληλουχίας της εγγραφής NM_ της RefSeq, που έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του αμινοξέως βαλίνη (V) σε αλανίνη (A) στην κωδικοποιούσα αλληλουχία της πρωτεΐνης (p.v262a). Το πολυμορφικό νουκλεοτίδιο Τ εμφανίζεται σε άτομα που δεν αντιλαμβάνονται την πικρή γεύση του φαινυλοθειοκαρβαμιδίου (PTC), ενώ το πολυμορφικό νουκλεοτίδιο C στα άτομα που την αντιλαμβάνονται. Προκειμένου να γονοτυπήσουμε τον πολυμορφισμό rs θα χρειαστεί να ενισχύσουμε ένα τμήμα του γονιδίου TAS2R38, το οποίο απαραίτητα θα πρέπει να περιέχει τη θέση 869 (ξεκινώντας την αρίθμηση από το πρώτο νουκλεοτίδιο της αλληλουχίας της εγγραφής NM_ ). Επειδή περίπου 70 βάσεις καθοδικά της θέσης 869 βρίσκεται μία επιπλέον θέση αναγνώρισης της περιοριστικής ενδονουκλεάσης που θα χρησιμοποιήσουμε, επιδιώκουμε η θέση αυτή να μη συμπεριλαμβάνεται στην αλληλουχία που θα ενισχύσουμε (την επιλογή αυτή θα την επανεξετάσουμε τεκμηριωμένα στις εργασίες του κεφαλαίου 9, όταν θα κληθούμε να επανασχεδιάσουμε την αντίδραση). Η ενίσχυση ενός τμήματος βάσεων είναι επαρκής για να πραγματοποιήσουμε την ενζυμική πέψη του προϊόντος της PCR. Έτσι, στοχεύουμε στην ενίσχυση ενός τμήματος περίπου μεταξύ των νουκλεοτιδίων 550 και 940 της αλληλουχίας μας. 1. Ακολουθώντας τις οδηγίες της σελίδας 40 ανακτούμε την κωδικοποιούσα αλληλουχία του γονιδίου και τις 5 και 3 αμετάφραστες περιοχές (Untranslated Region, UTRs). Αποθηκεύουμε την αλληλουχία μας σε ένα αρχείο τύπου FASTA με το όνομα TAS2R38.fnn. 2. Μεταβαίνουμε στη διεύθυνση προκειμένου να χρησιμοποιήσουμε τη διαδικτυακή έκδοση του προγράμματος primer3 (Primer3web version 4.0.0) [2], [3]. 3. Επικολλούμε την αλληλουχία του TAS2R38 στο αντίστοιχο πεδίο και επιλέγουμε τη χρησιμοποίηση των βιβλιοθηκών που περιέχουν τα πρότυπα των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών του ανθρώπινου γονιδιώματος προκειμένου να αποφύγουμε τον σχεδιασμό εκκινητών σε περιοχές επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών (επιλογή Mispriming Libray HUMAN) (εικόνα 7.13). 4. Υπάρχουν πολλές ρυθμίσεις που μπορούν να γίνουν κατά την αναζήτηση κατάλληλων εκκινητών, όπως για παράδειγμα το επιθυμητό μήκος τους, το εύρος των T m τους, το μέγεθος της αλληλουχίας που επιθυμούμε να ενισχύσουμε και πολλές άλλες που δεν θα μας απασχολήσουν, καθώς οι προεπιλογές του προγράμματος καλύπτουν τις ανάγκες μας. 5. Προκειμένου να οριοθετήσουμε την περιοχή της αλληλουχίας που επιθυμούμε να ενισχυθεί, την τοποθετούμε σε αγκύλες (π.χ. [ΑΤΤΑ...ΤΤΤGCT]) στο πεδίο που την έχουμε επικολλή- 143

16 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 7.13 Το περιβάλλον της εφαρμογής Primer3web. Στα πεδία φαίνονται οι ρυθμίσεις που περιγράφονται στο κείμενο. σει. Εναλλακτικά, ορίζουμε την αλληλουχία στόχο στο πεδίο «Targets» συμπληρώνοντας τον αριθμό του νουκλεοτιδίου εκκίνησης και, διαχωρισμένο με κόμμα, το μήκος της αλληλουχίας σε βάσεις. Για παράδειγμα. στην περίπτωσή μας γράφουμε «600,300», υποδεικνύοντας ότι θα πρέπει να ενισχυθεί η αλληλουχία από το νουκλεοτίδιο 600 έως το νουκλεοτίδιο 900 ( ) (εικόνα 7.13). 6. Μπορούμε να εξαιρέσουμε περιοχές στις οποίες δεν επιθυμούμε να δημιουργηθούν εκκινητές συμπληρώνοντας το πεδίο «Excluded Regions». Επειδή δεν επιθυμούμε την συμπερίληψη της δεύτερης θέσης αναγνώρισης της περιοριστικής ενδονουκλεάσης στην ενισχυόμενη αλληλουχία, περιορίζουμε το όριο της αλληλουχίας όπου θα αναζητηθεί ο ανάστροφος (reverse ή right) εκκινητής. Στην περίπτωσή μας μπορούμε να αποκλείσουμε την αναζήτηση εκκινητή πέραν του νουκλεοτιδίου 940 βάζοντας τιμές 940,200, που σημαίνει ότι αποκλείσαμε την περίπτωση να αναζητήσει το πρόγραμμα εκκινητή από το νουκλεοτίδιο 940 μέχρι το τέλος του γονιδίου, συνολικού μήκους 1141 νουκλεοτιδίων. Το ίδιο μπορεί να επιτευχθεί τοποθετώντας το αντίστοιχο τμήμα της αλληλουχίας ανάμεσα στα σύμβολα <, > (εικόνα 7.13). 7. Μπορούμε να ορίσουμε το επιθυμητό εύρος του μεγέθους του προϊόντος στην επιλογή «Product Size Ranges». Στην περίπτωσή μας μια επιλογή νουκλεοτιδίων είναι μέσα στο εύρος που μας ικανοποιεί. 144

17 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 8. Υπάρχουν διαφορετικές προσεγγίσεις που μπορούμε να ακολουθήσουμε για να ορίσουμε τις προϋποθέσεις και τις περιοχές που επιθυμούμε να ενισχυθούν και εκείνες όπου επιθυμούμε να αναζητήσουμε τους εκκινητές. Αφιερώστε λίγο χρόνο να κοιτάξετε τις διάφορες ρυθμίσεις χωρίς να χρειάζεται να αλλάξει κάτι άλλο στις προεπιλογές για τις ανάγκες της παρούσας εργασίας. 9. Πατώντας το κουμπί Pick Primers λαμβάνουμε στην οθόνη μας μια αναφορά που έχει τρία κυρίως τμήματα (εικόνες 7.14 και 7.15): Στο άνω μέρος βρίσκεται το προτεινόμενο ζεύγος των εκκινητών με ορισμένες πληροφορίες που τους αφορούν, όπως το νουκλεοτίδιο έναρξης, το μήκος, η T m, η περιεκτικότητα σε GC, το μέγεθος της ενισχυόμενης αλληλουχίας κ.ά. (εικόνα 7.14). Στο μεσαίο τμήμα της αναφοράς δίνεται αναλυτικά η αλληλουχία στην οποία πραγματοποιήσαμε αναζήτηση και σημειώνονται οι θέσεις των εκκινητών πάνω σ αυτή. Επίσης σημειώνονται οι διάφορες ρυθμίσεις που κάναμε σε σχέση με την αλληλουχία στόχο, τις περιοχές που πρέπει να εξαιρεθούν από την αναζήτηση εκκινητών κ.λπ. (εικόνα 7.15). Στο κατώτερο τμήμα δίνονται εναλλακτικά ζεύγη εκκινητών, σε περίπτωση που για κάποιο λόγο δεν επιθυμούμε να χρησιμοποιήσουμε το πρώτο προτεινόμενο ζεύγος. Εικόνα 7.14 Αρχικό τμήμα της αναφοράς του προγράμματος Primer3. Δίνονται οι αλληλουχίες του πρώτου ζεύγους εκκινητών μαζί με πληροφορίες που τους αφορούν, όπως η θέση τους στην αλληλουχία, η T m, η σύστασή τους σε βάσεις CG και το μέγεθος της αλληλουχίας που ενισχύουν σε ζεύγη βάσεων. 10. Αποθηκεύστε την αναφορά σας σε ένα αρχείο απλού κειμένου για μελλοντική χρήση. Παρατηρήστε την εικόνα Με το σύμβολο > επισημαίνονται τα νουκλεοτίδια όπου εντοπίζεται η θέση των εκκινητών. Εξετάζοντας τις αλληλουχίες των εκκινητών παρατηρήστε ότι μόνο η αλληλουχία του αριστερού εκκινητή είναι αναγνωρίσιμη στην αλληλουχία σας, του δεξιού όμως όχι. Η εξήγηση είναι απλή. H αλληλουχία μας (όπως άλλωστε όλες οι αλληλουχίες) είναι γραμμένη σε κατεύθυνση 5 3. Κατά συνθήκη η αλληλουχία της συμπληρωματικής αλυσίδας παραλείπεται. Ο αριστερός forward εκκινητής πρόκειται να υβριδιστεί όχι στην αλληλουχία που βλέπουμε, αλλά στη συμπληρωματική της αλυσίδα, έτσι ώστε να ξεκινήσει η σύνθεση μιας αλυσίδας όμοιας με την 5 3 αλληλουχία. Είναι ευνόητο λοιπόν ότι ο forward εκκινητής έχει αλληλουχία όμοια με αυτή της αλληλουχίας που βλέπουμε και μπορούμε εύκολα να τον αναγνωρίσουμε. Ο δεξιός (reverse) εκκινητής, 145

18 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ του οποίου η αλληλουχία δεν μπορεί να αναγνωριστεί άμεσα, πρόκειται να υβριδιστεί στην αλυσίδα της οποίας την αλληλουχία εξετάζουμε, άρα θα πρέπει να είναι συμπληρωματικός προς αυτή. Επιπλέον, πρέπει να είναι και ανάστροφος, εφόσον η κατεύθυνση της αντιγραφής της συμπληρωματικής αλυσίδας από την DNA πολυμεράση είναι 5 3. Το σημείο αυτό αξίζει την προσοχή σας, καθώς γεννά συχνά απορίες και δημιουργεί σύγχυση. Κατά την παραγγελία των ολιγονουκλεοτιδικών αλληλουχιών των εκκινητών από το εργαστήριο που θα τους συνθέσει αναγράφουμε τις αλληλουχίες με κατεύθυνση 5 3. Εικόνα 7.15 Μέρος της αναφοράς του προγράμματος Primer3, στην οποία σημειώνονται η θέση των εκκινητών (>), η αλληλουχία στόχος της ενίσχυσης (*) και οι περιοχές που εξαιρέθηκαν από την αναζήτηση εκκινητών (Χ), σύμφωνα με τις ρυθμίσεις που αναφέρονται στο κείμενο. 146

19 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) In silico PCR Γνωρίζοντας τις αλληλουχίες ενός ζεύγους εκκινητών μπορούμε να πραγματοποιήσουμε μια εικονική αντίδραση PCR στον υπολογιστή (in silico PCR). Διαθέτοντας το σύνολο του ανθρώπινου γονιδιώματος μπορούμε να εξακριβώσουμε εάν οι εκκινητές μας ενισχύουν μία ή περισσότερες περιοχές στο ανθρώπινο γονιδίωμα, αν δηλαδή η ενίσχυση είναι ειδική. Το ανθρώπινο γονιδίωμα εμφανίζει περιοχές που επαναλαμβάνονται και περιοχές με τα λεγόμενα ψευδογονίδια. Ένας τέτοιος απλός έλεγχος μας βοηθά να εξασφαλίσουμε την ειδικότητα της σχεδιαζόμενης αντίδρασης πριν προχωρήσουμε στην παραγγελία των εκκινητών. Στον περιηγητή γονιδιωμάτων UCSC η αναζήτηση αυτή είναι απλή και μπορεί να γίνει με το εργαλείο «In Silico PCR», που είναι διαθέσιμο επιλέγοντας τον αντίστοιχο υπερσύνδεσμο στην αρχική σελίδα του περιηγητή. Για να πραγματοποιήσουμε In Silico PCR με το ζεύγος των εκκινητών που σχεδιάσαμε με τη βοήθεια του προγράμματος Primer3web ακολουθούμε τα παρακάτω βήματα: 1. Μεταβαίνουμε στην αρχική σελίδα του περιηγητή γονιδιωμάτων UCSC και επιλέγουμε τον υπερσύνδεσμο «In Silico PCR» στην αριστερή στήλη της ιστοσελίδας. 2. Επικολλούμε τις αλληλουχίες των εκκινητών που σχεδιάσαμε στα πεδία Forward και Reverse primer αντίστοιχα. Επιλέγουμε το κουμπί υποβολής (εικόνα 7.16). Εικόνα 7.16 Το περιβάλλον της εφαρμογής «In Silico PCR» του περιηγητή UCSC. 3. Εξετάζουμε τα αποτελέσματα της αναζήτησης. Αν παρουσιαστεί μία και μοναδική εγγραφή, τότε το ζεύγος των εκκινητών μας ενισχύει θεωρητικά μία μοναδική αλληλουχία στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Σε αντίθετη περίπτωση, περισσότερες από μία αλληλουχίες εμφανίζονται στα αποτελέσματα της αναζήτησης, μαζί με τις χρωμοσωμικές συντεταγμένες των περιοχών που ενισχύθηκαν (εικόνα 7.17). 4. Αποθηκεύουμε την αλληλουχία μας σε ένα απλό αρχείο κειμένου προκειμένου να τη χρησιμοποιήσουμε αργότερα. Υπάρχουν διάφορες ρυθμίσεις που μπορούμε να κάνουμε στην εφαρμογή, όπως την έκταση της μη συμπληρωματικότητας των εκκινητών με την αλληλουχία στόχο ή την αναζήτηση μόνο σε μεταγραφόμενες περιοχές του γονιδιώματος, αν αυτό είναι απαραίτητο. Προς το παρόν οι προεπιλογές της εφαρμογής επαρκούν για τις ανάγκες της εργασίας μας Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου TAS2R38 Σκοπός της πειραματικής διαδικασίας είναι να ενισχύσουμε στο εργαστήριο τμήμα της αλληλουχίας του γονιδίου TAS2R38 που περιέχει τον πολυμορφισμό rs Το προϊόν της αντίδρασης θα υποστεί στη συνέχεια πέψη με περιοριστική ενδονουκλεάση, προκειμένου να διαπιστωθεί ο γονότυπος. Στην αντίδραση θα χρησιμοποιηθούν οι ακόλουθοι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές [4]: 147

20 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 7.17 Αποτελέσματα της In Silico PCR. Στο άνω μέρος της αλληλουχίας αναγράφονται οι χρωμοσωμικές συντεταγμένες στο χρωμόσωμα 7, το μέγεθος της ενισχυόμενης αλληλουχίας (376 bp) και οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν. Παρατηρούμε ότι οι εκκινητές αναγράφονται με κεφαλαία στην αλληλουχία που ακολουθεί. Οι δύο εκκινητές προβλέπεται ότι θα ενισχύσουν μόνο την περιοχή του χρωμοσώματος 7 που μας ενδιαφέρει και το προϊόν της PCR έχει το προβλεπόμενο μέγεθος. Forward: 5 -AACTGGCAGAATAAAGATCTCAATTTAT-3 Reverse: 5 -AACACAAACCATCACCCCTATTTT-3 Το τμήμα του γονιδίου TAS2R38 που πρόκειται να ενισχυθεί έχει μέγεθος 303 ζεύγη βάσεων. Τα αντιδραστήρια που θα χρησιμοποιηθούν για την αντίδραση PCR είναι τα ακόλουθα: Εκκινητές Forward και Reverse dntps (10 mm) MgCl 2 (25 mm) 5 Χ Taq buffer (ελεύθερο μαγνησίου) Taq Polymerase (5 units/μl) Η αντίδραση θα πραγματοποιηθεί σε τελικό όγκο διαλύματος 25 μl. Η ποσότητα του αρχικού DNA θα είναι 125 ng, δηλαδή 5 μl από το διάλυμα εργασίας συγκέντρωσης 25 ng/μl που παρασκευάσαμε στο πλαίσιο του πρακτικού μέρους του κεφαλαίου 6. Στον πίνακα 7.2 μπορούμε να δούμε αναλυτικά τους όγκους του κάθε αντιδραστηρίου που θα χρησιμοποιηθεί (μέχρι τελικού όγκου 25 μl) και την τελική τους συγκέντρωση στο διάλυμα της αντίδρασης. 148

21 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Αντιδραστήρια Όγκος (μl) Τελική συγκέντρωση Primer F (10 μμ) 0,5 0,2 μμ Primer R (10 μμ) 0,5 0,2 μμ dntps (10 mm) 0,5 0,2 mm κάθε dntp MgCL 2 (25 mm) 1,5 1,5 mm 5x Mg free Taq Buffer 5 1x Taq Polymerase (5 units/μl) 0,3 1,5 units/25 μl DNA (25 ng/μl) ng / 25 μl H 2 O 11,7 Τελικός όγκος 25 Πίνακας 7.2 Τα αντιδραστήρια και οι συγκεντρώσεις τους στον τελικό όγκο των 25 μl. Οι συνθήκες της αντίδρασης στο θερμικό κυκλοποιητή δίνονται στον πίνακα 7.3. Διαδικασία Τ ( C) Χρόνος Κύκλοι Αρχική αποδιάταξη 95 5 min 1 Αποδιάταξη 95 1 min Σύνδεση εκκινητών sec 30 Επιμήκυνση sec Τελική επιμήκυνση min 1 Πίνακας 7.3 Συνθήκες διεξαγωγής της αντίδρασης στο θερμικό κυκλοποιητή. Για την προετοιμασία της αντίδρασης ακολουθούμε τα παρακάτω βήματα: 1. Σημειώνουμε με ανεξίτηλο μαρκαδόρο τον αριθμό του δείγματός μας σε ένα σωληνάριο πολυπροπυλενίου (τύπου eppendorf) 1,5 ml. 2. Το προσωπικό του εργαστηρίου θα προσθέσει στο σωληνάριο 20 μl μίγματος (Master Mix) με τα απαραίτητα συστατικά για τη διενέργεια της αντίδρασης (εκτός από το DNA σας), όπως παρουσιάζονται στον πίνακα 7.2. Τα αντιδραστήρια για τη παρασκευή του μίγματος (Master Mix) διατηρούνται σε πάγο σε όλη την πορεία της προετοιμασίας των δειγμάτων. 3. Προσθέτουμε στο σωληνάριο 5 μl από το διάλυμα DNA συγκέντρωσης 25 ng/μl που παρασκευάσαμε μετά την αραίωση (δηλ. συνολικά περίπου 125 ng DNA). 4. Ανακατεύουμε ελαφρά το περιεχόμενο του σωληναρίου με πιπεττάρισμα. 5. Τοποθετoύμε το δείγμα μας στην κεφαλή του θερμικού κυκλοποιητή. 6. Επιλέγουμε το αποθηκευμένο πρόγραμμα με τις επιθυμητές συνθήκες της PCR. 149

22 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ 7. Μετά το τέλος της διαδικασίας καταστρέφουμε τα δείγματα DNA σύμφωνα με τις οδηγίες που μας δόθηκαν. Ταυτόχρονα με τα δείγματα που περιέχουν DNA, τοποθετούνται στον θερμικό κυκλοποιητή δείγματα που αποτελούνται μόνο από μίγμα αντιδραστηρίων (τυφλά δείγματα). Τα τυφλά δείγματα λειτουργούν ως μάρτυρες. Αν διαπιστωθεί ενίσχυση γενετικού υλικού στα τυφλά δείγματα, που κανονικά δεν πρέπει να περιέχουν DNA, σημαίνει ότι υπάρχει επιμόλυνση με DNA και τα αποτελέσματα των αντιδράσεών μας δεν είναι αξιόπιστα. Η επιμόλυνση αυτή μπορεί να οφείλεται είτε σε επιμόλυνση κάποιου από τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή του μίγματος είτε σε επιμόλυνση των πλαστικών ρυγχών ή κάποιας από τις πιπέττες που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή τους. Σε τέτοια περίπτωση η πηγή της επιμόλυνσης θα πρέπει να ανευρεθεί προκειμένου να επαναληφθεί η αντίδραση χωρίς επιμολύνσεις. Μετά το πέρας της αντίδρασης, το προσωπικό του εργαστηρίου θα ηλεκτροφορήσει τα δείγματα σε πήκτωμα αγαρόζης προκειμένου να διαπιστωθεί αν η αντίδραση ήταν πετυχημένη. 7.3 Ερωτήσεις - εργασίες 1. Έχετε εκτελέσει μια αντίδραση PCR με στόχο τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος του γονιδίου TAS2R38. Μετά το πέρας της αντίδρασης ηλεκτροφορείτε το προϊόν και διαπιστώνετε ότι δεν υπάρχει ορατή ζώνη στο πήκτωμα αγαρόζης. Δώστε μία ή περισσότερες εξηγήσεις για το τι μπορεί να έχει συμβεί. Απάντηση: Δεν έχει προστεθεί DNA στο σωληνάριο της PCR. Δεν έχει προστεθεί πολυμεράση ή κάποιο άλλο από τα συστατικά της αντίδρασης. Το DNA που προστέθηκε δεν ήταν καλής ποιότητας (ήταν κατακερματισμένο) ή περιείχε αναστολείς, για παράδειγμα υπολείμματα αιθανόλης. Υπήρξε διακοπή ρεύματος κατά τη διάρκεια της PCR και η αντίδραση δεν ολοκληρώθηκε. Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν λάθος. Μπορεί το αποθηκευμένο πρόγραμμα της PCR να είχε τροποποιηθεί από άλλον χειριστή. Εάν στο πήκτωμα αγαρόζης δεν είναι ορατός ούτε ο μάρτυρας γνωστού μοριακού βάρους (ladder), τότε μπορεί να μην έχει προστεθεί η κατάλληλη φθορίζουσα χρωστική κατά την παρασκευή του πηκτώματος. 2. Ποιες αλλαγές θα προτείνατε (και γιατί) για να βελτιστοποιήσετε μια αντίδραση PCR στην οποία εκτός από το βασικό προϊόν συντίθενται και παραπροϊόντα; Απάντηση: Αύξηση της θερμοκρασίας υβριδισμού των εκκινητών, με σκοπό την αύξηση της ειδικότητας του υβριδισμού (οι εκκινητές θα υβριδιστούν μόνο στις περιοχές προς τις οποίες έχουν απόλυτη συμπληρωματικότητα). Μείωση της συγκέντρωσης των ιόντων μαγνησίου, με σκοπό να αυξηθεί η ειδικότητα της αντίδρασης. Μείωση της ποσότητας της πολυμεράσης που προστίθεται στην αντίδραση. 150

23 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Επανασχεδιασμός των εκκινητών με στόχο τη δημιουργία νέων εκκινητών, που θα είναι ειδικοί μόνο προς την περιοχή του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε. 3. Ποιες αλλαγές θα προτείνατε (και γιατί) για να βελτιστοποιήσετε μια αντίδραση PCR η οποία έχει χαμηλή απόδοση (δεν συντίθεται αρκετό προϊόν); Σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης του μαγνησίου μέχρι το σημείο που αρχίζουν να εμφανίζονται παραπροϊόντα. Προσθήκη περισσότερου ή καλύτερης ποιότητας γενετικού υλικού. Προσθήκη περισσότερης πολυμεράσης στο διάλυμα της αντίδρασης. Αύξηση των κύκλων της αντίδρασης, με ανώτερο όριο τους κύκλους. Τα νουκλεοτίδια και οι εκκινητές συνήθως προστίθενται εξαρχής σε περίσσεια, επομένως περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσής τους δεν έχει ουσιαστική επίδραση στην απόδοση της αντίδρασης. 4. Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων μιας αντίδρασης PCR με διαβάθμιση θερμοκρασίας υβριδισμού (Gradient PCR) για ενίσχυση τμήματος 494 bp του γονιδίου Tas1R2 σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Η συγκεκριμένη PCR επιτρέπει την επιλογή της καταλληλότερης θερμοκρασίας ως θερμοκρασίας υβριδισμού των εκκινητών (primer annealing temperature) για ένα συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητών. Χρησιμοποιώντας έναν κυκλοποιητή με δυνατότητα κλίσης θερμοκρασιών, μπορούμε να ταυτοποιήσουμε τη θερμοκρασία σύνδεσης των εκκινητών της αντίδρασης η οποία θα παρέχει αποδοτική και ειδική ενίσχυση των προϊόντων, εφόσον οι υπόλοιποι παράγοντες που καθορίζουν την απόδοση της αντίδρασης παραμένουν σταθεροί. Στην περίπτωσή μας (εικόνα 7.18) έγινε PCR με κλίση θερμοκρασιών από 51 έως 64 C. Με βάση τα παραπάνω επιλέξτε εσείς την καταλληλότερη θερμοκρασία σύνδεσης των εκκινητών για τη συγκεκριμένη αντίδραση PCR. Εικόνα 7.18 Hλεκτροφόρηση των προϊόντων αντίδρασης PCR για ενίσχυση τμήματος 494 bp του γονιδίου Tas1R2 με διαβάθμιση θερμοκρασίας υβριδισμού (gradient PCR) σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Απάντηση: Σε θερμοκρασίες 51-58,8 C έχει γίνει ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων και έχουν σχηματιστεί διμερή εκκινητών (primer dimers). Επίσης η ζώνη στο αναμενόμενο μέγεθος (περίπου 500 bp) δεν είναι έντονη. Κατάλληλη θερμοκρασία θεωρείται εκείνη στην οποία η ζώνη στο αναμενόμενο μέγεθος είναι έντονη και με σαφή όρια (δεν παρουσιάζει smear). Για τη συγκεκριμένη PCR θα μπορούσε να επιλεγεί μια θερμοκρασία από 62 έως 64 C (εικόνα 7.19). 151

24 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 7.19 Σε θερμοκρασίες υβριδισμού των εκκινητών 51-58,8 C παρατηρούμε ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων και σχηματισμό διμερών εκκινητών (primer dimers). 7.4 Βιβλιογραφία [1] J. Winer, C. K. Jung, I. Shackel, et al., Development and validation of real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro, Anal. Biochem., vol. 270, no. 1, pp , May doi: /abio [2] A. Untergasser, I. Cutcutache, T. Koressaar, et al., Primer3 new capabilities and interfaces, Nucleic Acids Res., vol. 40, no. 15, e115, Aug doi: /nar/gks596. [3] T. Koressaar and M. Remm, Enhancements and modifications of primer design program Primer 3, Bioinformatics, vol. 23, no. 10, pp , May doi: /bioinformatic s/btm091. [4] R. B. Merritt, L. A. Bierwert, B. Slatko, et al., Tasting phenylthiocarbamide (ptc): a new integrative genetics lab with an old flavor, The American Biology Teacher, vol. 5, no. 70, e23 e28, [Online]. Available: Χρήσιμες ηλεκτρονικές διευθύνσεις Εκπαιδευτικό βίντεο για την κλασική αντίδραση PCR Σύνθεση cdna Pfaffl, Michael W., «Quantification strategies in real-time PCR», από το βιβλίο A-Z of quantitative PCR, International University Line, La Jolla, Ca, Υπολογισμός παραμέτρων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών 152