ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΙΚΩΝ ΑΝΩΜΑΛΙΩΝ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ Μεταπτυχιακή διατριβή ΦΑΙΔΡΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΠΑΡΘΕΝΙΟΥ ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΕΣ ΖΑΧΑΡΙΑΣ ΣΚΟΥΡΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΔΡΟΣΟΠΟΥΛΟΥ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ Θεσσαλονίκη, 2008

2 Περιεχόμενα Πρόλογος....4 1. Στόχος της εργασίας.. 5 2. Εισαγωγή 2.1 Τα χρωμοσώματα του ανθρώπου.6 2.2 Ο αριθμός των χρωμοσωμάτων...9 2.3 Τρόπος μελέτης των χρωμοσωμάτων..9 2.3.1 Τεχνικές χρώσης που δε δίνουν ζωνώσεις 10 2.3.2 Τεχνικές χρώσης που δίνουν ζωνώσεις.14 2.3.3 Ονοματολογία των χρωμοσωμάτων.. 17 2.4 Χρωμοσωματικές ανωμαλίες.19 2.4.1 Αριθμητικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες 19 2.4.1.1 Αριθμητικές ανωμαλίες των αυτοσωμάτων..21 2.4.1.2 Αριθμητικές ανωμαλίες των φυλετικών χρωμοσωμάτων.28 2.4.2 Δομικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες 36 2.4.2.1 Ελλείμματα...37 2.4.2.2 Διπλασιασμοί.44 2.4.2.3 Ισοχρωμοσώματα..44 2.4.2.4 Δακτυλιωτά χρωμοσώματα...45 2.4.2.5 Δικεντρικά χρωμοσώματα.46 2.4.2.6 Χρωμοσώματα δείκτες (marker) 47 2.4.2.7 Αναστροφές 48 2.4.2.8 Μεταθέσεις...51 2.4.3 Μονογονική δισωμία (UPD-Uniparental Disomy)....54 2.4.4 Μωσαϊκισμός....55 2.5 Προγεννητικός έλεγχος.. 57 2.5.1. Ενδείξεις για προγεννητικό έλεγχο 57 2.5.2 Μέθοδοι προγεννητικού ελέγχου....58 2.5.2.1 Υπερηχογραφία...58 2.5.2.2 Έλεγχοι στον ορό της μητέρας 59 2.5.2.3 Παρακέντηση του ομφάλιου λώρο.59

3 2.5.2.4 Αμνιοπαρακέντηση...60 2.5.2.5 Δειγματοληψία χοριακών λαχνών.....61 2.5.3 Μέθοδοι ταχείας προγεννητικής διάγνωσης. 63 2.5.3.1 Φθορίζων in situ υβριδισμός.64 2.5.3.2 Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR)..65 2.5.3.3 Multiplex Ligation-depended Probe Analysis (MLPA) 66 2.5.4 Γενετική συμβουλευτική....68 3. Υλικά και μέθοδοι 70 3.1 Κυτταρογενετική ανάλυση.70 3.1.1 Καλλιέργεια κυττάρων περιφερικού αίματος 70 3.1.2 Καλλιέργεια κυττάρων αμνιακού υγρού... 74 3.1.3 Καλλιέργεια χοριακών λαχνών.76 3.1.4 Καλλιέργεια ιστού από προϊόν αποβολής.77 3.2 Φθορίζων in situ υβριδισμός (FISH)..78 3.3 MLPA.79 3.4 Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR)...79 4. Αποτελέσματα...81 4.1 Προϊόντα αποβολής....81 4.2 Χοριακές λάχνες.88 4.3 Αμνιακό υγρό.90 5. Συζήτηση... 106 6. Βιβλιογραφία 111

4 Πρόλογος Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο πρότυπο κέντρο ερευνών και εφαρμοσμένης μοριακής βιολογίας και γενετικής «ΕΥΡΩΓΕΝΕΤΙΚΗ Α.Ε.» και στον τομέα Γενετικής Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, στο πλαίσιο της κατεύθυνσης «Εφαρμοσμένη Γενετική και Βιοτεχνολογία», του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών του τμήματος Βιολογίας, του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κατά το ακαδημαϊκό έτος 2007-2008, υπό την επίβλεψη του καθηγητή κ. Ζαχαρία Σκούρα και της λέκτορα κ. Ελένης Δροσοπούλου. Ολοκληρώνοντας αυτή την προσπάθεια, θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στον επιβλέποντα καθηγητή κ. Ζαχαρία Σκούρα για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντάς μου το συγκεκριμένο θέμα, και για την καθοδήγηση και τις πολύτιμες συμβουλές του σε όλα τα στάδια εκπόνησης της εργασίας αυτής. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τη λέκτορα κ. Ελένη Δροσοπούλου για την όλη εποπτεία του πειραματικού μέρους της εργασίας και τις εύστοχες υποδείξεις και συμβουλές της. Για τη διάθεση του εργαστηριακού εξοπλισμού, ευχαριστώ θερμά τη διεύθυνση της Ευρωγενετικής Α.Ε. και ιδιαίτερα τον κ. Γιάννη Παπουλίδη και τον κ. Γιώργο Πανταζίδη, για την καθοδήγηση και τη συμπαράστασή τους. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στο προσωπικό του εργαστηρίου κ. Ελίζα Σιώμου, κ. Χριστίνα Μαλαμάκη, κ. Τζένη Μαυροματίδου, κ. Σπύρο Βήττα, κ. Τατιάνα Αλεξίου για την άψογη συνεργασία και τη βοήθεια που μου προσέφεραν. Τέλος θα ήταν παράλειψή μου να μην ευχαριστήσω τους δικούς μου ανθρώπους και τους φίλους μου για τη συμπαράσταση και την κατανόησή τους.

5 1. Στόχος της εργασίας Η συχνότητα των χρωμοσωματικών ανωμαλιών υπολογίζεται σε 6 στις 1000 γεννήσεις και αυξάνεται σημαντικά όταν μελετάται το σύνολο των συλλήψεων. Η προγεννητική διάγνωση ξεκίνησε το 1966 και στόχος της, δεν είναι απλώς να ανιχνεύσει ανωμαλίες του εμβρύου και να επιτρέψει τον τερματισμό της εγκυμοσύνης, όταν το έμβρυο βρεθεί μη φυσιολογικό, αλλά έχει και τους εξής σκοπούς: 1. να παρέχει κατόπιν ενημέρωσης, ένα εύρος επιλογών στους γονείς οι οποίοι διατρέχουν κίνδυνο να αποκτήσουν παιδί με ανωμαλία, 2. να μειώνει την ανησυχία και την αβεβαιότητα, ιδιαίτερα μεταξύ των ομάδων υψηλού κινδύνου, 3. να επιτρέπει στα ζευγάρια που διατρέχουν κίνδυνο με χρωμοσωματική ανωμαλία, να ξεκινήσουν μία εγκυμοσύνη γνωρίζοντας ότι η παρουσία ή απουσία της διαταραχής μπορεί να διαπιστωθεί. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανίχνευση και καταγραφή των χρωμοσωματικών ανωμαλιών σε προγεννητικό έλεγχο. Επίσης, έγινε μία προσπάθεια να συσχετισθούν οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες που παρατηρήθηκαν σε προγεννητικό επίπεδο με την ηλικία της εγκύου, τα υπερηχογραφικά ευρήματα και άλλους δείκτες. Τέλος, όπου κρίθηκε απαραίτητο, έγινε λεπτομερέστερη διερεύνηση των χρωμοσωματικών ανωμαλιών με μοριακές τεχνικές.

6 2. Εισαγωγή 2.1 Τα χρωμοσώματα του ανθρώπου Ένα από τα γνωρίσματα που χαρακτηρίζουν τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, και τον άνθρωπο, είναι η μεγάλη ποσότητα του DNA που υπάρχει στον πυρήνα του κάθε κυττάρου. Ο διπλοειδής πυρήνας του ανθρώπου περιέχει κατά μέσο όρο 6*10 9 ζεύγη βάσεων. Δεδομένου ότι 300 διαδοχικά ζεύγη βάσεων έχουν μήκος ενός μικρού, το συνολικό DNA ενός πυρήνα έχει μήκος 2*10 6 μm, ενώ η διάμετρος του πυρήνα δεν ξεπερνά τα 10μm. Συνεπώς, μέσα στον πυρήνα πρέπει το DNA να είναι «πακεταρισμένο» πολύ καλά. Όμως, στα κύτταρα του ανθρώπου, το DNA δεν είναι ένα απλό συνεχές δίκλωνο μόριο, αλλά οργανώνεται σε πολλά ανεξάρτητα χρωμοσώματα που ποικίλουν σε μέγεθος (Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 2003). Στο μεσοφασικό πυρήνα δύσκολα αναγνωρίζονται μεμονωμένα χρωμοσώματα. Συνήθως βρίσκονται στην πιο χαλαρή μορφή τους, είναι διασκορπισμένα παντού στον πυρηνικό χώρο και χαρακτηρίζονται με τον όρο χρωματίνη. Όταν απομονώνεται χρωματίνη από μεσοφασικούς πυρήνες με τη χρησιμοποίηση ισοτονικών διαλυμάτων, η ποσότητα της πρωτεΐνης που λαμβάνεται είναι διπλάσια από αυτή του DNA. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι κυρίως οι ιστόνες, μία οικογένεια βασικών πρωτεϊνών που διακρίνεται σε πέντε κυρίως τύπους: Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4. Τα αμινοξέα που απαρτίζουν τις ιστόνες, πολύ συχνά, υφίστανται μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, με την προσθήκη φωσφορικών, μεθυλικών ή οξικών ομάδων, με αποτέλεσμα, μετά από ηλεκτροφόρηση υψηλής ανάλυσης, οι πέντε κύριοι τύποι των ιστονών να διαχωρίζονται σε περισσότερους υποτύπους. Η σύγκριση της πρωτοταγούς ακολουθίας των αμινοξέων των ιστονών Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4 φανερώνει τη μεγάλη ομοιότητα που παρουσιάζουν μεταξύ τους. Η ομοιότητα αυτή επεκτείνεται και σε ιστόνες πολύ απομακρυσμένων φυλογενετικά ειδών. Αντίθετα με τα παραπάνω κλάσματα ιστονών, η ιστόνη Η1 παρουσιάζει μεγαλύτερη ποικιλομορφία μεταξύ των ειδών (Σκούρας, 1997). Η μελέτη των φυσικών και χημικών ιδιοτήτων της χρωματίνης έγινε με συνδυασμένες μεθόδους μοριακής βιολογίας, ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και κρυσταλλογραφίας. Η χρωματίνη που έχει απομονωθεί από πυρήνες μέσα σε ένα διάλυμα χαμηλής ιονικής ισχύος, όταν παρατηρείται στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο δίνει την εντύπωση κομπολογιού. Στην περίπτωση αυτή το DNA συνδέει τις «χάντρες» του κομπολογιού που έχουν διάμετρο 11nm. Όταν αυξηθεί η ιονική

7 συγκέντρωση του διαλύματος απομόνωσης της χρωματίνης, ή αυξηθεί η ποσότητα των δισθενών κατιόντων, τότε το μέγεθος της ίνας αυξάνει σε μία διάμετρο 30nm. Εφαρμογή μερικής πέψης στην απομονωμένη χρωματίνη με νουκλεάση κατέστησε δυνατή την απομόνωση διμερών, τριμερών ή και ολιγομερών «χαντρών», ενώ πλήρης πέψη παρείχε απλές «χάντρες». Οι «χάντρες» αυτές ονομάστηκαν νουκλεοσώματα και οι δομές που προκύπτουν μετά από την περιέλιξη 6 διαδοχικών Οκταμερές ιστονών Ιστόνη Η1 Νουκλεόσωμα Ιστόνη Η1 Οκταμερές ιστονών Εικόνα 2.1: Η διπλή περιέλιξη του DNA γύρω από το οκταμερές δημιουργεί τη δομή του νουκλεοσώματος (http://www.bio.miami.edu/dana/104/nucleosome.jpg). νουκλεοσωμάτων, σωληνοειδή (Εικόνα 2.1). Κρυσταλλογραφική αλλά και μοριακή ανάλυση των νουκλεοσωμάτων έδειξε ότι ένα νουκλεόσωμα συνίσταται από ένα πυρήνα που αποτελείται από ιστόνες και γύρω του περιελίσσεται το δίκλωνο μόριο του DNA. Ο πυρήνας αυτός είναι ένα οκταμερές σύμπλοκο που αποτελείται από δύο μόρια από κάθε μία από τις ιστόνες Η2Α, Η2Β, Η3, Η4. Τα νουκλεοσώματα συνδέονται μεταξύ τους με ένα κομμάτι DNA, που αποτελείται από 60 ζεύγη βάσεων στο οποίο συνδέεται ένα μόριο ιστόνης Η1. Το μήκος του DNA που περιελίσσεται στο οκταμερές, μετά από προσεκτικούς χειρισμούς πέψεων και απομονώσεων, βρέθηκε ότι είναι της τάξης των 140 ζευγών βάσεων. Το μήκος αυτό επαρκεί για μία διπλή περιέλιξη στο οκταμερές των ιστονών (Σκούρας, 1997). Τα χρωμοσώματα τα οποία είναι ορατά κατά τη διάρκεια της μίτωσης έχουν μήκος γύρω στα 5μm. Αυτό σημαίνει ότι θα πρέπει να υπάρχουν αρκετές ακόμη ανώτερες μορφές οργάνωσης των χρωμοσωμάτων από τη μορφή του νουκλεοσώματος και του σωληνοειδούς. Η ιστόνη Η1 φαίνεται ότι στην περίπτωση αυτή παίζει σημαντικό ρόλο, καθόσον έχει βρεθεί ότι στα μεταφασικά χρωμοσώματα

8 είναι εξαιρετικά φωσφορυλιωμένη (έχουν βρεθεί πάνω από πέντε με έξι φωσφορυλιωμένες σερίνες για κάθε μόριο ιστόνης Η1). Τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης της ιστόνης Η1 πέφτουν στο 20%, όταν ολοκληρωθεί η μίτωση, για να επανέλθουν στα εξαιρετικά υψηλά επίπεδα στο τέλος της μεσόφασης, πριν δηλαδή αρχίσει ο επόμενος κύκλος συσπείρωσης σε χρωμοσώματα. Σύμφωνα με τον Brown, η συσπείρωση της χρωματινικής ίνας για τη δημιουργία του μεταφασικού χρωμοσώματος γίνεται ως εξής: το δίκλωνο μακρομοριακό DNA διαμέτρου 2nm περιελίσσεται γύρω από το οκταμερές των ιστονών, δημιουργείται το νουκλεόσωμα και τελικά η χρωμοσωματική ίνα διαμέτρου 11nm. Περιέλιξη 6 νουκλεοσωμάτων δημιουργεί το σωληνοειδές, και τελικά τη χρωμοσωματική ίνα διαμέτρου 30nm. Περαιτέρω περιέλιξη της σωληνοειδούς χρωματινικής ίνας δημιουργεί την ίνα των 300nm, και στη συνέχεια την υπερδομή των 700nm, από την οποία συνίστανται οι χρωμοσωματικοί βραχίονες, για να καταλήξει στη δομή 1400nm, τη δομή του μεταφασικού χρωμοσώματος (Σκούρας, 1997) (Εικόνα 2.2). Εικόνα 2.2:Το πακετάρισμα του DNA (http://images.google.gr/imgres?imgurl=http://bp1.blogger.com/).

9 2.2 Ο αριθμός των χρωμοσωμάτων Το 1956 οι Tjio και Levan βρήκαν και δημοσίευσαν πρώτοι ότι ο σωστός αριθμός των χρωμοσωμάτων του ανθρώπου είναι 46 (23 ζεύγη) και όχι 48 όπως πίστευαν μέχρι τότε. Τα 22 ζεύγη, που είναι όμοια σε αρσενικά και θηλυκά άτομα, καλούνται αυτοσωμικά ενώ το 23 ο είναι το φυλετικό ζευγάρι, που αποτελείται από τα χρωμοσώματα Χ και Υ στα αρσενικά και δύο χρωμοσώματα Χ στα θηλυκά άτομα (Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 2003). Τα μέλη ενός ζεύγους (τα οποία ονομάζονται ομόλογα χρωμοσώματα) φέρουν την ίδια γενετική πληροφορία, δηλαδή έχουν τους ίδιους γενετικούς τόπους με την ίδια διάταξη, αν και σε κάθε γενετικό τόπο μπορεί να έχουν είτε πανομοιότυπες είτε ελαφρώς διαφορετικές μορφές, οι οποίες ονομάζονται αλληλόμορφα. Το ένα μέλος κάθε ζεύγους κληρονομείται από τον πατέρα, ενώ το άλλο από τη μητέρα. (Thomson & Thomson, 2001). 2.3 Μελέτη των χρωμοσωμάτων Σε πάρα πολλά φυτικά και ζωικά είδη η άμεση εξέταση του αριθμού και της μορφολογίας των χρωμοσωμάτων τους είναι μια σχετικά εύκολη εργασία στο τεχνικό επίπεδο. Όσον αφορά όμως τη μελέτη των χρωμοσωμάτων του ανθρώπου υπήρχαν για αρκετά χρόνια διάφορες δυσκολίες: 1. Τα χρωμοσώματα είναι πιο κατάλληλα για μελέτη κατά τη διαίρεση του κυττάρου και ειδικότερα στο στάδιο της μετάφασης. Κύτταρα που διαιρούνται ώστε να επιτρέψουν την άμεση μελέτη των χρωμοσωμάτων υπάρχουν μόνο σε μερικούς ιστούς του ανθρώπου, π.χ. μειωτικές διαιρέσεις στους όρχεις (ή στις ωοθήκες των εμβρύων), μιτωτικές διαιρέσεις στο μυελό των οστών, σε μερικά επιθηλιακά κύτταρα καθώς και σε καρκινικά κύτταρα. Όμως, η λήψη και η επεξεργασία αυτού του υλικού δεν είναι πάντοτε εύκολη και δε μπορεί να δώσει απαραίτητες πληροφορίες για πολλά σπουδαία κλινικά προβλήματα. Η δυσκολία αυτή υπερπηδήθηκε με την ανάπτυξη τεχνικών καλλιέργειας διαφορετικών ιστών και κυττάρων in vitro. Έτσι, αυξήθηκε ο αριθμός των ιστών και των τύπων των κυττάρων, από τα οποία θα μπορούσαν να γίνουν χρωμοσωματικά παρασκευάσματα. Η πιθανότητα μάλιστα να βρεθούν κατάλληλα κύτταρα για παρατήρηση αυξήθηκε με σύντομη επίδραση κολχικίνης στην κυτταροκαλλιέργεια. Η κολχικίνη παρεμποδίζει την ολοκλήρωση της κυτταρικής διαίρεσης μέσω της αναστολής του σχηματισμού της μιτωτικής ατράκτου και της καθυστέρησης του

10 σχηματισμού των κεντρομερών. Έτσι, σήμερα είναι δυνατή η παρατήρηση χρωμοσωμάτων σε λεμφοκύτταρα, σε ινοβλάστες από την επιδερμίδα ή άλλους ιστούς και σε κύτταρα από το αμνιακό υγρό εγκύου γυναίκας. Επίσης, μπορούν να παρθούν ζωντανά κύτταρα μερικές ώρες μετά από το θάνατο διαφόρων ατόμων ή φυσικά αποβληθέντων εμβρύων. Σήμερα οι τεχνικές έχουν βελτιωθεί τόσο πολύ ώστε χρωμοσώματα μπορούν να παρατηρηθούν και σε κύτταρα που δε διαιρούνται ή είναι τελείως διαφοροποιημένα, χρησιμοποιώντας την τεχνική του υβριδισμού των κυττάρων. 2. Ο σχετικά μεγάλος αριθμός των χρωμοσωμάτων του ανθρώπου καθιστούσε αρκετά δύσκολη (εξαιτίας της αλληλοεπικάλυψης) την ακριβή παρατήρηση και καταμέτρηση ακόμη και στα καλύτερα παρασκευάσματα μεταφασικών χρωμοσωμάτων. Η επίδραση όμως με υποτονικό διάλυμα, πριν από τη μονιμοποίησή τους, έλυσε και αυτό το τεχνικό πρόβλημα. 3. Σήμερα, γίνεται επίδραση στις κυτταροκαλλιέργειες των λεμφοκυττάρων με φυτοαιμοσυγκολλητίνη. Η λεκτίνη αυτή συγκολλά τα ερυθροκύτταρα και διεγείρει τη μιτωτική διαίρεση των λεμφοκυττάρων (μιτογόνος δράση) (Thomson & Thomson, 2001, Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 2003). 2.3.1 Τεχνικές χρώσης που δε δίνουν ζωνώσεις Τα χρωμοσώματα όταν χρωματίζονται με βασικές χρωστικές που δε δίνουν ζωνώσεις χρωματίζονται ομοιόμορφα. Παρόλα αυτά, διακρίνονται εύκολα αρκετά χαρακτηριστικά τους σημεία. Αυτά είναι οι πρωτογενείς και οι δευτερογενείς περισφίξεις, τα τελομέρη και οι δορυφόροι. Πρωτογενής περίσφιξη ή κεντρομέρος: Η πρωτογενής περίσφιξη ή κεντρομέρος χρησιμεύει για τη συγκράτηση των αδελφών χρωματίδων. Επίσης, παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική διαίρεση, διότι είναι η περιοχή σύνδεσης των ινών της ατράκτου. Το κεντρομέρος αποτελεί σταθερό σημείο του χρωμοσώματος και το διαιρεί σε δύο βραχίονες, τον μικρό βραχίονα p και τον μεγάλο βραχίονα q (Thomson & Thomson, 2001). Το DNA του κεντρομέρους παρουσιάζει μεγάλη επαναληψιμότητα και περιέχει ειδικές αλληλουχίες. Επίσης, το DNA των κεντρομερικών περιοχών είναι ισχυρά συσπειρωμένο. Η συμπύκνωση του DNA στην περιοχή του κεντρομέρους είναι ομοιόμορφη και παρουσιάζει τη μεγαλύτερη συσπείρωση από όλες τις άλλες περιοχές του γενώματος. Σε μερικές χρωμοσωματικές μεταλλάξεις τα χρωμοσώματα ενδέχεται να σπάσουν και να συνδεθούν με άλλα. Με

11 αυτόν τον τρόπο προκύπτουν χρωμοσώματα χωρίς κεντρομέρη (ακεντρικά) ή με δύο κεντρομέρη (δικεντρικά). Αυτές οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες είναι ασταθείς. Στην πρώτη περίπτωση, τα ακεντρικά χρωμοσώματα δε μπορούν να συνδεθούν με τα ινίδια της μιτωτικής ατράκτου και κατά συνέπεια παραμένουν στο κυτταρόπλασμα κατά τη μιτωτική διαίρεση. Στη δεύτερη περίπτωση, τα δικεντρικά χρωμοσώματα, κατά τη μείωση, τείνουν να μετακινηθούν προς αντίθετους πόλους, οπότε προκαλείται το σπάσιμό τους (Τριανταφυλλίδης, 2001). Ανάλογα με τη θέση του κεντρομέρους, το μήκος τους, καθώς και τη σχετική αναλογία των βραχιόνων τους, τα χρωμοσώματα κατατάσσονται σε τέσσερις τύπους: 1. Μετακεντρικά: Στα μετακεντρικά χρωμοσώματα το κεντρομέρος βρίσκεται σχεδόν στη μέση του χρωμοσώματος και οι δύο βραχίονες έχουν περίπου το ίδιο μήκος 2. Υπομετακεντρικά: Στα υπομετακεντρικά χρωμοσώματα το κεντρομέρος βρίσκεται σε έκκεντρη θέση και οι δύο βραχίονες έχουν διαφορετικό μήκος. 3. Ακροκεντρικά: Τα ακροκεντρικά χρωμοσώματα έχουν το κεντρομέρος κοντά στο τελομέρος του χρωμοσώματος. 4. Τελοκεντρικά: Στα τελοκεντρικά χρωμοσώματα το κεντρομέρος βρίσκεται ακριβώς στην άκρη του χρωμοσώματος και στην ουσία αυτά αποτελούνται από έναν μόνο βραχίονα. Τα χρωμοσώματα αυτά δεν υπάρχουν στον άνθρωπο, αν και είναι συνήθη σε άλλα είδη, όπως για παράδειγμα στον ποντικό (Εικόνα 2.3)(Thomson & Thomson, 2001). Δευτερογενής περίσφιξη: Σε μερικά από τα ακροκεντρικά χρωμοσώματα του ανθρώπου, εκτός από το κεντρομέρος, παρατηρείται και μία δεύτερη περίσφιξη, σαν αχρωματική διακοπή, σε διαφορετική θέση από την περίσφιξη του κεντρομέρους, που λέγεται δευτερογενής. Συνήθως η δευτερογενής περίσφιξη βρίσκεται κοντά στο τελομέρος και δίνει στο χρωμόσωμα δορυφόρους. Οι δορυφόροι είναι μικρά χρωμοσωματικά τμήματα που συνδέονται με το υπόλοιπο χρωμόσωμα μέσω πολύ λεπτών μίσχων. Στον άνθρωπο τα χρωμοσώματα που έχουν δορυφόρους είναι τα 13, 14, 15, 21 και 22. Οι μίσχοι αυτών των πέντε ζευγών χρωμοσωμάτων περιέχουν τα γονίδια για τις υπομονάδες 18S και 28S του ριβοσωματικό RNA (rrna) (Thomson & Thomson, 2001,Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 2003).

12 Χρωματίδες Κεντρομέρος Μικρός βραχίονας Μεγάλος βραχίονας Εικόνα 2.3: Κατηγορίες των χρωμοσωμάτων. Α) μετακεντρικά, Β) υπομετακεντρικά, C) ακροκεντρικά. Τελομέρη: Τα τελομέρη είναι εξειδικευμένα σύμπλοκα DNA-πρωτεϊνών, βρίσκονται στα άκρα των χρωμοσωμάτων και αποτελούν απαραίτητο στοιχείο για την επιβίωση και τη σωστή λειτουργία των χρωμοσωμάτων. Προσδίδουν στα χρωμοσώματα σταθερότητα, τα προστατεύουν από την αποδιάταξη και τον ανασυνδυασμό με άλλα χρωμοσώματα και επιτρέπουν τον πλήρη αυτοδιπλασιασμό των άκρων κάθε χρωμοσώματος. Επίσης, παρεμποδίζουν τη συνένωση των χρωμοσωμάτων και τις αντιδράσεις μεταξύ τους ή με άλλες χρωμοσωματικές περιοχές. Τα τελομέρη έχουν την ίδια δομή και παραπλήσια μοριακή οργάνωση σε όλους τους οργανισμούς. Περιέχουν μικρές, διαδοχικά επαναλαμβανόμενες (20-70 φορές) ακολουθίες των 6 νουκλεοτιδίων, που αποτελούνται από πλούσιους σε G ή C κλώνους. Λόγω της νουκλεοτιδικής τους σύστασης, τα τελομέρη δεν έχουν γονίδια (Τριανταφυλλίδης, 2001). Για τη μελέτη των χρωμοσωμάτων στην κυτταρογενετική, συνθέτεται ο καρυότυπος. Καρυότυπος είναι ο χαρακτηριστικός αριθμός και η μορφολογία των χρωμοσωμάτων κάθε είδους. Για τη σύνθεση του καρυότυπου χρησιμεύουν οι εξής παράμετροι: 1. Το σχετικό μήκος: Το μήκος κάθε χρωμοσώματος εκφρασμένο ως ποσοστό του συνολικού μήκους όλων των χρωμοσωμάτων μιας κανονικής απλοειδούς σειράς. 2. Ο βραχιονικός δείκτης: Η αναλογία του μήκους του μεγάλου (q) προς τον κοντό (p) βραχίονα (q/p). 3. Ο κεντρομερικός δείκτης: Η αναλογία του μήκους του κοντού βραχίονα προς το ολικό μήκος του χρωμοσώματος εκφρασμένη επί τοις εκατό.

13 Βάσει αυτών των παραμέτρων, τα χρωμοσώματα αριθμούνται και τοποθετούνται σε εφτά ομάδες (Εικόνα 2.4): Ομάδα Α: χρωμοσώματα 1-3, μετακεντρικά ή υπομετακεντρικά (2 ο ζεύγος), μεγάλα σε μέγεθος. Ομάδα Β: χρωμοσώματα 4-5, υπομετακεντρικά, μεγάλου μεγέθους. Ομάδα C: χρωμοσώματα 6-12 και το χρωμόσωμα Χ, υπομετακεντρικά μεσαίου μεγέθους. Ομάδα D: χρωμοσώματα 13-15, ακροκεντρικά μεσαίου μεγέθους, φέρουν δορυφόρους. Ομάδα E: χρωμοσώματα 16-18, είναι μετακεντρικά (16 ο ζεύγος) ή υπομετακεντρικά (17 ο και 18 ο ζεύγος) και έχουν σχετικά μικρό μέγεθος. Ομάδα F: χρωμοσώματα 19-20, μικρά, μετακεντρικά. Ομάδα G: χρωμοσώματα 21-22 και το χρωμόσωμα Υ, ακροκεντρικά, μικρού μεγέθους. Φέρουν δορυφόρους, εκτός από το Υ. Η παραπάνω κατάταξη και ονοματολογία των χρωμοσωμάτων προτάθηκε το 1960 στο Denver του Colorado από ομάδα κυτταρογενετιστών (Thomson & Thomson, 2001, Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 2003). Εικόνα 2.4: Καρυότυπος άρρενος. Οι ομάδες των χρωμοσωμάτων του ανθρώπου, έτσι όπως αυτά φαίνονται μετά από χρώση με χρωστική που δε δίνει ζωνώσεις (http://www.webbooks.com/mobio/free/images/ch1c3.gif).

14 2.3.2 Τεχνικές χρώσης που δίνουν ζωνώσεις Η ανακάλυψη τεχνικών χρώσης των χρωμοσωμάτων που δίνουν ζωνώσεις κατέστησε δυνατή την εκτενέστερη μελέτη των μεταφασικών χρωμοσωμάτων. Η σημαντική αυτή πρόοδος έγινε το 1968 από τον T. Caperson και τους συνεργάτες του. Αυτοί ανακάλυψαν ότι η φθορίζουσα χρωστική κουϊνακρίνη αλληλεπιδρά με τα χρωμοσώματα πολλών ειδών, με αποτέλεσμα μερικά τμήματά τους να φθορίζουν πολύ έντονα και άλλα αμυδρά και να υπάρχει κατά μήκος διαφοροποίηση των χρωμοσωμάτων σε ζώνες διάφορου πλάτους και έντασης φθορισμού, τις ζώνες Q. Από τότε μέχρι σήμερα αναπτύχθηκαν περισσότερες από 15 τεχνικές χρώσης των χρωμοσωμάτων, που κάθε μία δίνει ιδιαίτερο πρότυπο ζωνώσεων στα μεταφασικά χρωμοσώματα. Το πρότυπο ζωνώσεων που δίνει κάθε χρώση είναι συγκεκριμένο για κάθε χρωμόσωμα ενός είδους. Έτσι, η ανακάλυψη αυτών των τεχνικών επέτρεψε την αξιόπιστη αναγνώριση των μεταφασικών χρωμοσωμάτων και τη διάγνωση δομικών χρωμοσωματικών ανωμαλιών, π.χ. αναστροφές, μετατοπίσεις. Οι τεχνικές χρώσης μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο ομάδες. Σε εκείνες που δίνουν ζωνώσεις κατανεμημένες σε όλο το μήκος του χρωμοσώματος (ζώνες Q, G, R) και σε εκείνες που χρωματίζουν ορισμένες περιοχές του χρωμοσώματος (ζώνες C, NOR). Ζώνες Q: Στην περίπτωση αυτή η χρώση γίνεται με τη χρωστική κουϊνακρίνη. Με ειδικό μικροσκόπιο, κάθε χρωμόσωμα παρουσιάζει χαρακτηριστικές φωτεινές και σκοτεινές ζώνες (ζώνες Q). Οι χρωμοσωματικές περιοχές που είναι πλούσιες σε ΑΤ δεσμεύουν περισσότερη κουϊνακρίνη και έτσι εξηγείται ο διαφορετικός φθορισμός των ζωνών Q (Εικόνα 2.5). Εικόνα 2.5: Καρυότυπος αρσενικού ατόμου. Ζωνώσεις Q με κουϊνακρίνη (http://www.translationalmedicine.com/content/figures/1479-5876-3-21-4.gif).

15 Ζωνώσεις G: Η τεχνική χρώσης G των χρωμοσωμάτων ανακαλύφθηκε το 1971 και αποτελεί την πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδο. Σε αυτήν γίνεται επίδραση με πρωτεολυτικά ένζυμα ή άλλα αντιδραστήρια πάνω σε παρασκευάσματα που στέγνωσαν στον αέρα. Ακολουθεί ξέπλυμα των παρασκευασμάτων και χρώση των χρωμοσωμάτων με χρωστική Giemsa, που δίνει σε κάθε χρωμόσωμα ένα χαρακτηριστικό και επαναλαμβανόμενο πρότυπο ανοιχτόχρωμων και σκουρόχρωμων ζωνών. Χονδρικά, οι ζώνες που αποκαλύπτονται με την τεχνική G αντιστοιχούν με τις ζώνες που αποκαλύπτονται με την τεχνική Q. Οι σκουρόχρωμες περιοχές αντιπροσωπεύουν περιοχές πλούσιες σε ΑΤ που αντιγράφονται αργά και δεν έχουν πολλά γονίδια. Αντίθετα, οι ανοιχτόχρωμες περιοχές αντιπροσωπεύουν περιοχές οι οποίες είναι πλούσιες σε CG, αντιγράφονται νωρίς και είναι πλούσιες σε γονίδια (Shaffer & Tommerup, 2005) (Εικόνα 2.6). Εικόνα 2.6 : Καρυότυπος αρσενικού ατόμου. Στα χρωμοσώματα έγινε επίδραση με θρυψίνη και χρωματίστηκαν με Giemsa (ζώνες G). Ζωνώσεις R: Στην τεχνική αυτή τα χρωμοσώματα υφίστανται θερμική κατεργασία πριν από την χρώση με Giemsa και εμφανίζουν ζώνωση αντίστροφη από

16 αυτή των ζωνών G και Q. Και η τεχνική R χρωματίζει ζώνες που έχουν χαρακτηριστική σύσταση βάσεων. Ζωνώσεις C: Στα χρωμοσωματικά παρασκευάσματα γίνεται πρώτα επίδραση με οξύ, ακολουθεί επίδραση με ουσίες που έχουν αλκαλικό ph και τέλος γίνεται χρώση με χρωστική Giemsa. Η μέθοδος αυτή χρωματίζει επιλεκτικά την περιοχή του κεντρομέρους κάθε χρωμοσώματος, καθώς και όλες τις άλλες περιοχές που περιέχουν συστατική ετεροχρωματίνη. Συγκεκριμένα πρόκειται για τμήματα των χρωμοσωμάτων 1q, 9q και 16q, τα οποία βρίσκονται κοντά στο κεντρομέρος, καθώς και για το τελομέρος του Υq. Συνήθως, το μέγεθος των ζωνών C είναι σταθερό σε όλα τα κύτταρα ενός ανθρώπου, αλλά ποικίλλει από άτομο σε άτομο. Τέτοια πολυμορφικά χαρακτηριστικά είναι χρήσιμα σε διάφορες κλινικές και επιδημιολογικές μελέτες των χρωμοσωματικών ανωμαλιών. Ζώνες NOR: Η χρώση γίνεται με νιτρικό άργυρο και χρωματίζονται οι περιοχές του οργανωτή του πυρηνίσκου όπου γίνεται μεταγραφή rrna (Thomson & Thomson, 2001, Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 2003, Turnpenny & Ellard, 2005). Ζώνωση υψηλής ανάλυσης: Η τεχνική χρώσης G των χρωμοσωμάτων δίνει χρωμοσώματα με υψηλή ανάλυση. Τα χρωμοσώματα εμφανίζουν 400-500 ζώνες στις απλοειδείς σειρές. Κάθε μία από αυτές τις ζώνες αντιπροσωπεύει, περίπου, 6000-8000kb DNA. Η ζώνωση υψηλής ευκρίνειας επιτυγχάνεται με την τεχνική, είτε των ζωνών G είτε των ζωνών R, σε χρωμοσώματα που έχουν παρασκευαστεί σε αρχικό στάδιο της μίτωσης (στην πρόφαση ή στην προμετάφαση), όταν είναι σχετικά αποσυσπειρωμένα. Τα χρωμοσώματα στην πρόφαση και στην προμετάφαση εμφανίζουν 550-850 ζώνες στις απλοειδείς σειρές. Η τεχνική αυτή απαιτεί τη διακοπή της κυτταροδιαίρεσης με έναν παράγοντα όπως η μεθοτρεξάτη ή η θυμιδίνη. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται ο συγχρονισμός των καλλιεργούμενων κυττάρων. Στη συνέχεια αίρεται η αναστολή και γίνεται η συγκομιδή της καλλιέργειας, όταν βρεθεί ικανός αριθμός κυττάρων σε κάποιο προχωρημένο στάδιο πρόφασης, ή σε κάποιο αρχικό στάδιο της μετάφασης (Thomson & Thomson, 2001, Turnpenny & Ellard, 2005). Εύθραυστες περιοχές: Σποραδικά παρατηρούνται σε χαρακτηριστικά σημεία των χρωμοσωμάτων άβαφα χάσματα, γνωστά ως εύθραυστες θέσεις. Πολλές από τις θέσεις αυτές συνιστούν απλώς μία κληρονομήσιμη παραλλαγή. Η μόνη εύθραυστη θέση, που είναι γνωστό ότι έχει κλινική σημασία, βρίσκεται κοντά στο άκρο του μεγάλου βραχίονα του Χ (Xq) και σχετίζεται με μία συνήθη μορφή διανοητικής

17 καθυστέρησης συνδεδεμένης με το Χ. Για να αποδειχθεί η ύπαρξη αυτών των θέσεων, τα κύτταρα πρέπει να καλλιεργηθούν κάτω από ειδικές συνθήκες. Έτσι, η εύθραυστη θέση εμφανίζεται σε κύτταρα που έχουν καλλιεργηθεί υπό συνθήκες έλλειψης θυμιδίνης. Αυτό επιτυγχάνεται, είτε μέσω κάποιου καλλιεργητικού υλικού με μικρή συγκέντρωση θυμιδίνης και φολικού οξέος, είτε με την προσθήκη στο καλλιεργητικό υλικό ενός αναστολέα του ενζύμου συνθετάση της θυμιδίνης. Εκτός από τις ειδικές συνθήκες καλλιέργειας, τα προς ανάλυση κύτταρα χρειάζεται να χρωματισθούν με ομοιόμορφη χρώση, δεδομένου ότι οι εύθραυστες θέσεις δε διακρίνονται εύκολα όταν τα παρασκευάσματα υπόκεινται σε διαδικασία ζώνωσης (Thomson & Thomson, 2001). 2.3.3 Ονοματολογία των χρωμοσωμάτων Tο πρότυπο ζωνώσεων που δίνει κάθε τεχνική είναι συγκεκριμένο για κάθε είδος. Εξετάζοντας λοιπόν τον καρυότυπο ενός ατόμου μπορούν να διαπιστωθούν δομικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες (αναδιατάξεις) από τις αλλαγές στο πρότυπο ζωνώσεων. Για την εύκολη και ακριβή περιγραφή τέτοιων ανωμαλιών δημιουργήθηκε ένα σύστημα ονοματολογίας που χρησιμοποιείται διεθνώς. Αυτό προτάθηκε από ομάδα κυτταρογενετιστών, σε διεθνή συνδιάσκεψη που πραγματοποιήθηκε στο Παρίσι το 1971. Σύμφωνα με το σύστημα ονοματολογίας του Παρισιού, για να περιγραφεί μία χρωμοσωματική ζώνη πρέπει να δηλωθούν με τη σειρά: 1. ο αριθμός του χρωμοσώματος 2. ο χρωμοσωματικός βραχίονας (p ή q) 3. ο αριθμός της περιοχής 4. ο αριθμός της ζώνης μέσα στην περιοχή Για παράδειγμα, συμβολίζεται 1p3.2 η ζώνη που βρίσκεται στο πρώτο χρωμόσωμα, στον μικρό βραχίονα, στην τρίτη περιοχή και είναι η 2 ζώνη. Το σύστημα αυτό βελτιώθηκε αργότερα και το 1977 στη Στοκχόλμη συνήλθε διεθνής επιτροπή κυτταρογενετιστών που πρότεινε το «διεθνές σύστημα ονοματολογίας στην κυτταρογενετική του ανθρώπου» ή αλλιώς ISCN 1978. Το σύστημα αυτό περιέχει σύμβολα και συντμήσεις για την περιγραφή των φυσιολογικών ανθρώπινων χρωμοσωμάτων και των χρωμοσωματικών ανωμαλιών. (Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 2003). Με τη βελτίωση των τεχνικών και την ανάλυση περισσότερων ζωνών, καθώς και με την ανακάλυψη νέων ανωμαλιών και τεχνικών ανάλυσης το σύστημα ονοματολογίας

18 έχει υποστεί πολλές τροποποιήσεις. Σήμερα, χρησιμοποιείται το «διεθνές σύστημα ονοματολογίας στην κυτταρογενετική του ανθρώπου» που δημοσιεύθηκε το 2005 (ISCN, 2005) (Shaffer & Tommerup, 2005) (Πίνακας 2.1). Πίνακας 2.1: Σύμβολα και συντμήσεις που χρησιμοποιούνται για την περιγραφή των χρωμοσωμάτων και των χρωμοσωματικών ανωμαλιών σύμφωνα με το ISCN, 2005. Σύμβολο p q pter qter cen h del der dic dup i ins inv mat pat r t mos rob s Ερμηνεία Μικρός βραχίονας Μεγάλος βραχίονας Κορυφή μικρού βραχίονα Κορυφή μεγάλου βραχίονα Κεντρομέρος Ετερομορφισμός Έλλειμμα Παράγωγο χρωμοσωματικής ανακατάταξης Δικεντρικό χρωμόσωμα Διπλασιασμός Ισοχρωμόσωμα Προσθήκη Αναστροφή Μητρικής προέλευσης Πατρικής προέλευσης Κυκλικό χρωμόσωμα Μετάθεση Μωσαϊκισμός Robertsonian μετάθεση Δορυφόρος ph Χρωμόσωμα Philadelphia +/- Δηλώνει προσθήκη/έλλειψη όταν γράφεται πριν τον αριθμό του χρωμοσώματος και προσθήκη/έλλειψη χρωμοσωματικού τμήματος όταν γράφεται μετά τον αριθμό. / Η διαγώνια γραμμή σημαίνει μωσαϊκισμό

19 2.4 Χρωμοσωματικές ανωμαλίες Οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες αποτελούν μία μεγάλη κατηγορία γενετικών νοσημάτων, που ευθύνονται για μεγάλο ποσοστό των αποτυχημένων κυήσεων, των συγγενών διαμαρτιών και των περιστατικών διανοητικής καθυστέρησης και παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του καρκίνου. Μέχρι σήμερα έχουν καταγραφεί τουλάχιστον 20.000 χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Αν και πολλές από αυτές είναι εξαιρετικά σπάνιες, στο σύνολό τους συμβάλλουν αισθητά στη νοσηρότητα και στη θνησιμότητα. Οι ανωμαλίες αυτές απαντούν στο 0,7%, περίπου των νεογέννητων βρεφών, στο 2% περίπου όλων των κυήσεων, σε γυναίκες άνω των 35 ετών, καθώς και στο 50% όλων των αποβολών που σημειώνονται στο πρώτο τρίμηνο της κύησης (Thomson & Thomson, 2001, Turnpenny & Ellard, 2005). Οι ανωμαλίες των χρωμοσωμάτων είναι είτε αριθμητικού είτε δομικού χαρακτήρα και μπορεί να εμπλέκουν ένα ή περισσότερα αυτοσωματικά χρωμοσώματα, φυλετικά χρωμοσώματα ή και τα δύο (Thomson & Thomson, 2001). 2.4.1. Αριθμητικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες Αν κατά τη μίτωση παρεμποδιστεί η λειτουργία της ατράκτου, τότε ένα ή περισσότερα χρωμοσώματα μπορεί να μη μετακινηθούν σωστά κατά το στάδιο της ανάφασης. Μία τέτοια ανωμαλία (μη αποχωρισμός) θα έχει ως αποτέλεσμα να προκύψουν θυγατρικοί μιτωτικοί πυρήνες, που θα περιέχουν και τα δύο ομόλογα χρωμοσώματα ή κανένα ομόλογο χρωμόσωμα. Παρόμοια, και η καθυστερημένη μετακίνηση ενός χρωμοσώματος καταλήγει, μερικές φορές, σε αποκλεισμό αυτού του χρωμοσώματος από ένα θυγατρικό κύτταρο. Οι ανωμαλίες που έχουν σχέση με τον αριθμό των χρωμοσωμάτων ταξινομούνται σε δύο κυρίως κλάσεις: 1. Ευπλοειδίες: Με τον όρο ευπλοειδίες εννοούμε τις ανωμαλίες στις οποίες παρατηρούνται αλλαγές στον αριθμό των σειρών των χρωμοσωμάτων. Για παράδειγμα n=23 μονοπλοειδές, 2n=46 διπλοειδές, 3n=69 τριπλοειδές και 4n=96 τετραπλοειδές. Άτομα που έχουν περισσότερες από 4 σειρές χρωμοσωμάτων λέγονται πολυπλοειδή. 2. Ανευπλοειδίες: Πρόκειται για προσθήκη ή αφαίρεση χρωμοσωμάτων στις χρωμοσωματικές σειρές. Για παράδειγμα 2n-1 είναι μονοσωμία, 2n+1 είναι

20 τρισωμία, 2n+1+1 είναι διπλή τρισωμία, 2n+2 είναι τετρασωμία και 2n-2 είναι νουλισωμία (έχουν χαθεί δύο ομόλογα χρωμοσώματα). Τα αποτελέσματα που έχει ο μιτωτικός μη-αποχωρισμός πάνω στο φαινότυπο εξαρτώνται από τα χρωμοσώματα που παίρνουν μέρος σε αυτόν, καθώς και από το στάδιο ανάπτυξης κατά το οποίο συνέβη η ανωμαλία. Αν ο μη-αποχωρισμός συμβεί στην πρώτη αυλάκωση του ζυγωτού, τότε το άτομο είναι μωσαϊκό, οι μισοί του ιστοί είναι τρισωμικοί, και οι άλλοι μισοί μονοσωμικοί. Αν συμβεί στη δεύτερη αυλάκωση του ζυγωτού, τότε το ένα τέταρτο των ιστών θα είναι μονοσωμικοί, το ένα τέταρτο τρισωμικοί και το υπόλοιπο ένα δεύτερο θα έχει τον κανονικό καρυότυπο. Τέλος, αν συμβεί αργά στη διάρκεια της ανάπτυξης του ανθρώπου, τότε μόνο τα θυγατρικά κύτταρα που προέρχονται από την ανώμαλη μίτωση είναι ανευπλοειδή. Στην περίπτωση αυτή οι επιπτώσεις στην ανάπτυξη και στον φαινότυπο του ατόμου μπορεί να είναι πολύ μικρές ή και να μην υπάρχουν καθόλου. Αν ο μη-αποχωρισμός συμβεί στην πρώτη μειωτική διαίρεση, από τα τέσσερα τελικά μειωτικά προϊόντα τα δύο θα έχουν ένα επιπλέον χρωμόσωμα, ενώ τα άλλα δύο θα έχουν ένα χρωμόσωμα λιγότερο. Αν συμβεί στη δεύτερη μειωτική διαίρεση, από τα 4 τελικά προϊόντα, δύο θα έχουν κανονικό απλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων, ένα θα έχει ένα παραπάνω χρωμόσωμα, ενώ από το άλλο θα λείπει ένα χρωμόσωμα, Έτσι, με τον μη-αποχωρισμό δημιουργούνται αριθμητικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Τα αποτελέσματα του μειωτικού μη-αποχωρισμού είναι πιο εμφανή από αυτά του μιτωτικού. Το ζυγωτό που προέρχεται από έναν ανώμαλο γαμέτη καθώς και όλα τα κύτταρα του ατόμου που μπορεί να προκύψει από ένα τέτοιο ζυγωτό είναι ανευπλοειδή. Όσον αφορά τα αυτοσώματα, οι περισσότερες περιπτώσεις ανευπλοειδίας στον άνθρωπο είναι θανατογόνες, ειδικά όταν πρόκειται για μεγάλα χρωμοσώματα. Οι τρισωμίες για μικρά χρωμοσώματα προκαλούν χαρακτηριστικές δυσμορφίες, πνευματική καθυστέρηση και μειωμένη βιωσιμότητα. Οι μονοσωμίες είναι κατά κανόνα θανατογόνες. Μία πιθανή εξήγηση γι αυτό είναι ότι σε περίπτωση μονοσωμίας εκφράζονται όλα τα υποτελή θανατογόνα γονίδια. Η μόνη βιώσιμη μονοσωμία είναι το σύνδρομο Turner, με καρυότυπο 45,Χ. Λόγω της απενεργοποίησης του X, οι ανευπλοειδίες των φυλετικών χρωμοσωμάτων είναι πιο συχνές (Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 2003).