جداسازي پکتینلیاز از آسپرژیلوس نایژر و اثر آن در بهبود فرایند تخمیر در تولید چاي سیاه

و 2 234 5 Iranian Food Science and Technology Research Journal Vol. 7, No. 4, 2012, p. 305-313 نشریه پژوهشهاي علوم و صنایع غذایی ایران جلد 7 شماره 4 زمستان 1390 ص 305-313. جداسازي پکتینلیاز از آسپرژیلوس نایژر و اثر آن در بهبود فرایند تخمیر در تولید چاي سیاه 5 4 3 2 *1 سیده مهسا دادپور - مرتضی خمیري - حمیدرضاصادقیپور - شیوا روفیگري حقیقت - مهران اعلمی تاریخ دریافت: 89/12/11 تاریخ پذیرش: 90/7/25 چکیده تخمیر یکی از فرایندهاي مهم در تولید چاي سیاه میباشد که در این مرحله با قرار گرفتن سوبسترا در معرض آنزیم واکنش اکسیداسیون اتفاق افتاده و ترکیبات تعیین کننده خصوصیات کیفی چاي تولید میشوند. یکی از عوامل افزاینده این ترکیبات افزایش میزان تماس بین آنزیم و سوبسترا است که با افزودن آنزیمهاي تخریب کننده دیواره سلولی برگ میسر میگردد. پکتیناز یکی از مهمترین این آنزیمها است و آسپرژیلوس از مهمترین منابع میکروبی در تولید این آنزیم میباشد. در این تحقیق آنزیم پکتینلیاز از Aspergillus niger جداسازي گردید و به کمک روش جداسازي سه فازي از طریق افزودن t -بوتانول به عصاره خام حاوي آنزیم در حضور آمونیوم سولفات خالصسازي شد. بازده بدست آمده براي آنزیم پکتینلیاز حاصل از 52 Aspergillus niger درصد و مرتبه خلوص نهایی آنزیم 16/65 بهدست آمد. به منظور تعیین اثر آنزیم بر خصوصیات کیفی چاي آنزیم خام و خالص در مرحله تخمیر چاي جهت بهبود پارامترهاي کیفی چاي به آن اسپري گردید. وزن مولکولی آنزیم خالص ph اپتیمم و دماي اپتیمم آنزیم به ترتیب 8 12KDa و 50 C مشاهده شد. از بین تیمارهاي مورد بررسی اثر عصاره خام آنزیمی روي پارامترهاي کیفی چاي بیشتر از آنزیم خالص مشاهده شد. واژههاي کلیدي: آنزیم پکتینلیاز Aspergillus niger جداسازي سه فازي چاي سیاه 54321 مقدمه میکروارگانیسمها در طبیعت داراي انرژي پتانسیل عظیمی هستند. آنها گروه بسیار زیادي از آنزیمها را تولید مینمایند که سالها است بصورت تجاري مورد استفاده قرار میگیرند( Dayanand Patil, 2003 &). یکی از پر اهمیتترین آنزیمها پکتیناز میباشد که از منابع مختلفی بدست میآید پکتیناز میکروبی %25 از کل آنزیمهاي تولیدي در دنیا را تشکیل میدهد و میتوان گفت که تقریبا بیشتر پکتینازهاي تجاري تهیه شده از منابع قارچی به دست میآیند.(Kapoor et al., 2001) 1 -دانش آموخته کارشناسی ارشد گروه علوم و صنایع غذایی دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی گرگان -*) نویسنده مسي ول: (Email: Mahsa.dadpour@gmail.com 5- به ترتیب دانشیار و استادیار گروه علوم و صنایع غذایی دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی گرگان 3- استادیار گروه زیست شناسی دانشگاه گلستان گرگان 4- مربی پژوهش مر کز تحقیقات چاي کشور لاهیجان یکی از روشهاي جداسازي آنزیم از منابع قارچی محیط تلقیح مایع حاوي پکتین میباشد. این روش شامل تلقیح سوسپانسیون اسپور قارچ مورد نظر در محیط مایع و گرمخانه گذاري آن تا زمان تولید حداکثر میزان آنزیم خام میباشد (2001 al.,.(kapoor et از روشهاي کاربردي براي خالص سازي آنزیمها روش میباشد که در سالهاي اخیر بسیار مورد توجه جداسازي سه فازي 6 قرار گرفته است (1997 Lovrein,.(Dennison & جداسازي سه فازي به عنوان مرحله تغلیظ کننده نیز معرفی شده است این روش همراه با خالص سازي آنزیمها در افزایش فعالیت کاتالیتیکی آنها نیز نقش دارد al.,2007).(saxena et در این روش عصاره خام حاوي آنزیم در حضور سولفات آمونیوم با t -بوتانول مخلوط میگردد. در این حالت آنزیم به صورت یک محلول در حد فاصل بین فاز آبی پایین و فاز t -بوتانول در بالا ظاهر میشود. فاکتورهاي موثر در جداسازي بخش پروتي ینی مورد نظر از فاز میانی غلظت آمونیوم سولفات حجم t -بوتانول و دما میباشد (2001 Gupta,.(Sharma & این روش 6- Three Phase Partitioning(TPP)

306 نشریه پژوهشهاي علوم و صنایع غذایی ایران جلد 7 شماره 4 زمستان 1390 براي خالص سازي پروتي ین در هر دو مقیاس کم و زیاد با صرف زمان یکسان کارایی دارد 1997) Lovrein,.(Dennison & آنزیمهاي پکتینولیتیک میکروبی پتانسیل عظیمی براي استفاده در صنعت دارند. یکی از کاربردهاي مورد توجه این آنزیم در صنعت چاي است. چاي گیاهی اقتصادي و به عنوان یکی از مهمترین نوشیدنیها در ایران و سایر کشورها محسوب میشود. چاي سیاه متداولترین فرم مورد استفاده توسط بشر بوده و این نوع چاي فرم تخمیر شده کامل برگ گیاه چاي است. فرایند تخمیر چاي فرایندي شیمیایی بوده و طی مرحله پلاس و مالش آنزیم و سوبسترا در معرض هم قرار گرفته و فرایند تخمیر صورت میگیرد. یک فرایند 1 تخمیر ایدهآل منجر به ایجاد یک تعادل مناسب بین تي افلاوین و 2 تي اروبیگین میگردد( 2002 al.,.(angayarkanni et سرعت تخمیر بستگی به میزان تماس بین آنزیم و سوبستراي مربوطه دارد که هر دو در بافت برگ چاي حضور دارند اما آنزیمهاي پلیفنولاکسیداز درون سلولهاي اپیدرمی و آوندي قرار دارند در حالی که سوبستراي کاتکین درون سلولهاي احاطه کننده آوندي وجود دارد 2002) al.,.(murugesan et لول کردن برگ چاي از طریق غلتاندن سبب میشود تا سلولها دچار تخریب جزي ی گردد درنتیجه فرایند اکسیداسیون در مرحله تخمیر به صورت ناقص صورت میگیرد اما افزودن آنزیم به طور مصنوعی دیواره سلولی برگهاي چاي را بیشتر شکسته منجر به تخریب کامل سلولهاي برگ چاي میگردد. بنابراین کاربرد این آنزیمها سبب بهبود تخمیر توسط واکنشگرها میشود. گزارش شده است که آنزیم پکتیناز فاکتور اصلی در تخریب بافتهاي گیاهی میباشد 2002) al.,.( Angayarkanni et تحقیق صورت گرفته شامل جداسازي و خالص سازي آنزیم 3 پکتینلیاز از آسپرژیلوس نایژر توسط روش جداسازي سه فازي بررسی خصوصیات آنزیمی حاصل از این روش و کاربرد آنزیم در مرحله تخمیر چاي جهت بهبود خواص کیفی چاي میباشد. تهیه عصاره خام حاوي آنزیم آنزیم پکتین لیاز در محیط تلقیح مایع حاوي پکتین 1 گرم L- آسپارژین 0/2 گرم سولفات منیزیم 7 آبه 0/05 گرم و فسفات دي هیدروژن پتاسیم 0/3 گرم در 100 میلیلیتر آب دوبار تقطیر با 4/5 ph= تولید گردید. 5 میلیلیتر سوسپانسیون اسپور(دانسیته اسپور 10 6 5 اسپور در هر میلیلیتر) از محیط اسلنت آگار بطور کاملا استریل در 100 میلیلیتر محیط مایع در فلاسک 500 میلیلیتر تلقیح گردید. فلاسکها در شیکر- انکوباتور در دماي 25 C تحت شرایط ثابت گرمخانه گذاري شدند. در روز چهارم ) حداکثر تولید آنزیم براساس پیش آزمونهاي انجام شده در تحقیق حاضر) کشت برداشته شد و سانتریفوژ ) g 10000 20 دقیقه (4 C گردید. سوپرناتانت حاصل به عنوان عصاره خام حاوي آنزیم براي مرحله خالص سازي نگهداري شد 2007) al.,.(yadav et بررسی میزان رشد میکروارگانیسم براي بررسی میزان رشد میکروارگانیسم در حین پروسه تولید آنزیم از روش اسپکتروفتومتري و میزان جذب نور محیط در طول موج 760nm استفاده شد. خالص سازي به روش جداسازي سه فازي در این مرحله نمک آمونیوم سولفات به نسبت %30 (وزنی- حجمی) به عصاره خام حاوي آنزیم در دماي 25 C افزوده شد و تا حل شدن کامل نمک مخلوط گردید سپس t -بوتانول به نسبت 1:1 به مخلوط قبل اضافه گردید. مخلوط حاصل بعد از یک ساعت گرمخانه گذاري درC 25 سانتریفوژ( g 10 2000 دقیقه) شد و فاز میانی به عنوان فاز حاوي آنزیم خالص شده جدا گردید( Pike& (Ramalingam & Mulimani, 2004 -Dennison, 1989 مواد و روشها مواد و میکروارگانیسمها شکل 1 - خالص سازي آنزیم به روش جداسازي سه فازي. 1.فاز آلی بالایی( t -بوتانول) 2.آنزیم خالص شده 3. فاز مایع پایینی تعیین وزن مولکولی قارچهاي Aspergillus niger بصورت آمپول لیوفیلیزه از مرکز کلکسیون میکروبی ایران خریداري شد. فعال سازي قارچها روي 4 محیط پوتیتو دکستروز آگار (PDA) بصورت اسلنت آگار و نگهداري در 30 C صورت گرفت. 1- Theaflavin 2- Thearubigin 3 - Aspergillus niger 4- Potato Dexterose Agar

307 جداسازي پکتین لیاز از Aspergillus niger و اثر آن در بهبود... خلوص و وزن مولکولی آنزیم توسط روش SDS-PAGE%12 1 تعیین گردید. رنگ آمیزي ژل توسط کوماسی بریلیانت بلو 250-R جهت ظاهر شدن باندها صورت گرفت( 1970.(Laemmli, اندازه گیري میزان پروتي ین مقدار پروتي ین محلول توسط روش برادفورد و استفاده از بووین سرم آلبومین به عنوان پروتي ین استاندارد تعیین گردید( Bradford,.(1976 سنجش فعالیت آنزیمی فعالیت آنزیمی پکتین لیاز از طریق اندازهگیري افزایش جذب در طول موج 235 نانومتر در اثر تشکیل محصول غیر اشباع توسط اسپکتروفتومتر S2000 UV/VIS مدل WPA سنجیده شد. محلول آنزیمی( 0/2 میلیلیتر) به مخلوط واکنش حاوي 0/8 میلیلیتر پکتین مرکبات( %1w/v ) و 0/2 میلیلیتر بافر فسفات سدیم 100 میلیمولار( 8 ph: ( در دماي 37 C افزوده شد. دانسیته نوري در زمان صفر و بعد از 20 دقیقه اندازه گیري شد. فعالیت آنزیم با احتساب ضریب خاموشی محصول غیراشباع 1- cm 5500M 1- بر حسب تولید میکرومولار محصول غیراشباع در هر دقیقه تعیین گردید( Yadav et.(al., 2007 بررسی خصوصیات آنزیمی آزمایشهاي انجام شده روي آنزیم شامل تعیین دماي بهینه پایداري حرارتی ph بهینه و پایداري آنزیم به ph بود ) et Yadav.(al., 2007 فراوري چاي فرآوري در مرکز تحقیقاتی کارخانه کاشف روي برگ سبز چاي نوع هیبرید بومی منطقه فشالم(ایستگاه تحقیقاتی فشالم) واقع در 100 کیلومتري جاده رشت- فومن در 7- متري از سطح آزاد دریا و عرض جغرافیایی 25 37 و طول جغرافیایی 25 49 در برداشت تابستانه انجام شد. نوع برگهایی که براي بررسی و آزمایش انتخاب شدند یک جوانه و دو برگ انتهایی از ساقههاي نورسته گیاه چاي بود که پس از چیدن بهترتیب خشک شده خرد گردید و در معرض دو منبع آنزیمی خام و خالص شده نسبی از نمونه قارچ آسپرژیلوس نایژر قرار گرفتند. اندازهگیري پارامترهاي کیفی چاي در این مرحله پارامترهاي تي افلاوین تي اروبیگین رنگ کل شفافیت 1992) Barouah,.(Mahanta & کافي ین( 1989 (Lakin, روي چاي سیاه تولید شده اندازهگیري شد. تجزیه و تحلیل آماري تجزیه وتحلیل آماري بر اساس طرح کاملا تصادفی با 6 تیمار در 3 تکرار و با استفاده از نرم افزار SAS انجام پذیرفت مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون LSD و تجزیه و تحلیل دادهها و رسم نمودارها با استفاده از نرم افزار EXCEL انجام شد. نتایج و بحث رشد میکروارگانیسم در پروسه تولید آنزیم بررسی رشد آسپرژیلوس نایژر در زمان تولید آنزیم پکتین لیاز در محیط تلقیح نشان داد که حداکثر رشد در طول دوره 6 روزه تلقیح در نمونه قارچی مربوط به روز چهارم میباشد. نتایج نشان داد که با شروع فرایند تولید آنزیم میزان کدورت محیط نیز افزایش یافته و همزمان با تولیدات پروتي ینی و آنزیمی در محیط رشد میکروارگانیسم نیز وجود داشت و این افزایش کدورت تا پایان دوره تولید آنزیم بصورت صعودي ادامه داشت. بیشترین کدورت در زمان حداکثر تولید آنزیم یعنی در چهارمین روز تلقیح مشاهده گردید. با توجه به شکل 2 و 3 میتوان اظهار داشت که آسپرژیلوس نایژر در دوره 6 روز تلقیح در محیط مایع حاوي پکتین قادر به تولید آنزیم پکتین لیاز میباشد و بیشترین فعالیت آنزیمی در روز چهارم تلقیح در زمان حداکثر رشد مشاهده گردید. فاوول و اودونفا( 2003 ) اثر فاکتورهاي مختلف بر تولید آنزیمهاي پکتینی از Aspergillus niger را بررسی نمودند و بیان کردند که بر اساس سن کشت در میزان تولید آنزیمها اختلافهایی وجود دارد و بیشترین میزان تولید آنزیم در چهارمین روز کشت صورت میگیرد. حداکثر تولید آنزیم هاي پکتیکی در کپک هاي مختلف از 1 تا 6 روز متغیر می باشد( al, Ghildyal et. (1981 شکل 2 - منحنی رشد Aspergillus niger در دوره تلقیح 1- Coomassie brilliant blue R-250

308 نشریه پژوهشهاي علوم و صنایع غذایی ایران جلد 7 شماره 4 زمستان 1390 دست میدهند. دماي غیر فعال شدن آنزیم تقریبا همیشه به دناتوره شدن ساختار پروتي ینی آنزیم نسبت داده شده است( &Webb, Dixon 1979). مقاومت آنزیمی پکتینلیاز حاصل از Aspergillus niger به دماهاي مختلف در شکل 5 نشان داده شده است. شکل 3 - فعالیت آنزیمی پکتات لیاز حاصل از Aspergillus niger در دوره تلقیح دماي 25 C بررسی فعالیت آنزیمی پکتینلیاز در دماهاي مختلف فعالیت آنزیمهاي مفید چه به صورت درونزا و چه به صورت افزوده شده نیاز به تعیین دماي بهینه واکنش دارد. این دماي بهینه برآیندي از افزاش شدت واکنش و حداقل غیر فعال شدن آنزیم را نشان میدهد. فعالیت آنزیمی پکتینلیاز حاصل از در دماهاي مختلف در شکل( 4 ) نشان داده شده است. شکل 5 - افت فعالیت آنزیمی پکتینلیاز حاصل از Aspergillus niger در دماهاي مختلف. براساس شکل 5 میتوان بیان نمود که آنزیم حاصل از آسپرژیلوس نایژر کمترین افت فعالیت آنزیمی را در دماي 50 C نشان داد که میزان افت %2/024 بدست آمد. در دماهاي پایینتر از 50 C فعالیت آنزیمی با شیب کمتري کاهش یافت یعنی آنزیم مورد نظر مقاومت خود را در دماهاي پایینتر از 50 C به میزان بیشتري حفظ نمود اما در دماهاي بالاتر از 40 C افت شدیدي در فعالیت آنزیمی مشاهده شد و در دماهاي بالاي 70 C فعالیت آنزیمی مشاهده نشد و آنزیم غیر فعال شد. شکل 4 - فعالیت آنزیمی پکتینلیاز حاصل از Aspergillus niger در دماهاي مختلف نتایج بدست آمده نشان داد که قرار دادن آنزیم پکتین لیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر به مدت 20 دقیقه در دماهاي مختلف سبب حفظ بیشترین فعالیت آنزیمی در دماي 50 C گردید و در دماهاي بالاتر 50 C فعالیت آنزیمی بطور مشخصی کاهش یافت. نتایج بدست آمده از مطالعات پیشین دماي بهینه آنزیم پکتینلیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر را در دامنه 40-60 C تایید نمودند( & Fawole Ramanujam et al., -Yadav et al., 2007- Odunfa, 2003.(Rasheedha et al., 2010-2008 بررسی مقاومت آنزیمی پکتینلیاز در دماهاي مختلف آنزیمها در دماهاي مختلف فعالیت آنزیمی متفاوتی از خود نشان میدهند. در دماهاي بالا آنزیمها ناپایدار بوده و فعالیت خود را از بررسی فعالیت آنزیمی پکتینلیاز در ph هاي مختلف فعالیت آنزیم به نحو قابل توجهی از ph تاثیر میپذیرد. این امر به این علت است که اتصال سوبسترا و کاتالیزور غالبا به توزیع بار هم بر روي سوبسترا و هم مولکول آنزیم بستگی دارد. توزیع بار روي پروتي ینها توسط حالت زنجیرههاي قابل یونیزه در اسیدهاي آمینه تشکیل دهنده آنها تعیین میشود که این امرخود به ph بستگی دارد و میتواند مستقیما بر اتصال سوبسترا و خاصیت کاتالیزوري تاثیر بگذارند. روشن است که حالت یونیزاسیون زنجیرههاي جانبی اسیدآمینه در خارج از جایگاه فعال آنزیم نیز میتواند اثر قابل توجهی بر فعالیت آن داشته باشد. برخی آنزیمها فعالیت خود را در گستره وسیعی از ph داراي بهترین فعالیت به عنوان ph بهینه میباشند و این ph بهینه بین آنزیمهاي مختلف متفاوت است(شهیدي وحسینی نژاد 1389). فعالیت آنزیمی پکتینلیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر در ph هاي مختلف در شکل 6 نشان داده شده است.

309 جداسازي پکتین لیاز از Aspergillus niger و اثر آن در بهبود... فعالیت آنزیمی پکتینلیاز حاصل از Aspergillus niger در ph هاي مختلف شکل 7 - مقاومت آنزیمی پکتینلیاز حاصل از Aspergillus niger در ph هاي مختلف شکل 6- همانطور که در شکل نشان داده شده است در آنزیم حاصل از آسپرژیلوس نایژر ph اپتیمم 8 بوده و در ph بالاتر و پایین تر از 8 فعالیت آنزیمی بطور مشخصی کاهش یافت. کاهش فعالیت آنزیمی در ph بالاتر از 8 (قلیایی) نسبت به phهاي پایین تر از 8 محسوستر بود. وقتی ph از میزان اپتیمم فاصله پیدا کند خواص عملکردي و کارآمد آنزیم تغییر مییابد و این امر را میتوان به کاهش اشباعیت آنزیم با سوبسترا به علت کاهش وابستگی و یا اثر ph روي مقاومت آنزیم نسبت داد( 1979 Webb.,.(Dixon and نتایج بدست آمده از مطالعات پیشین ph بهینه آنزیم پکتینلیاز از آسپرژیلوس نایژر را در رنج 6-8 تایید نمودند (2005 --Hamdy,.(Rasheedha et al., 2010 Yadav et al., 2007 بررسی مقاوت آنزیمی پکتینلیاز در ph هاي مختلف نتایج بدست آمده نشان داد که آنزیم پکتینلیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر درpH=8 بعد از 24 ساعت %48/99 فعالیت آنزیمی خود را حفظ نمود. بیشترین مقاومت این آنزیم در دامنه ph=4-10 مشاهده گردید. در آنزیم حاصل از آسپرژیلوس نایژر افت فعالیت آنزیمی در ph پایینتر از 8 (ناحیه اسیدي) و ph بالاتر از 8 (ناحیه قلیایی) مشاهده شد. این امر میتواند به این صورت نتیجهگیري شود که ناحیه اسیدي منجر به تخریب و ویرانی ساختار سه گانه آنزیم میگردد و در طرف قلیایی کاهش اشباعیت آنزیم از سوبسترا منجر به افت فعالیت آنزیمی میشود 2005).(Hamdy, خالص سازي آنزیم پکتینلیاز به روش جداسازي سه فازي نتایج خالص سازي آنزیم پکتینلیاز توسط روش جداازي سه فازي در جدول( 1 ) نشان داده شده است. همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است آنزیم خام حاصل از آسپرژیلوس نایژر در چهارمین روز کشت داراي فعالیت آنزیمی 3/37 واحد در هر میلیلیتر و میزان پروتي ین 0/19 میلیگرم در هر میلیلیتر بود. بازده فعالیت در هر نمونه آنزیمی خام %100 بدست آمد. ph علاوه بر کم کردن فعالیت کاتالیتیکی بر پایداري آنزیم نیز اثر مشخصی به جاي میگذارد. بدین سبب آنزیمها نهتنها از نظر امکان فعالیت بلکه از نظر پایداري یک گستره محدود ph دارند. نتایج مقاومت آنزیمی پکینلیاز حاصل از Aspergillus niger در ph هاي مختلف در شکل 7 نشان داده شده است. نمونه جدول 1 - خالص سازي آنزیم پکتین لیاز از فعالیت آنزیمی ( * U/ml) پروتي ین (mg/ml) Aspergillus niger به روش جداسازي سه فازي اکتیویته کل (U) پروتي ین کل (mg) اکتیویته ویژه بازده (%) 100 52 مرتبه خلوص 1 16/65 (U/mg) Aspergillus niger آنزیم خام آنزیم خالص 17/79±5/09 296/3±75/14 190±5/29 0/06±0/017 337/3±25/15 177/94±0/14 0/19±0/052 /006±0/001 0 3/37±0/25 1/779±0/014 * هر واحد U برابرست با فعالیت آنزیمی صورت گرفته براي تشکیل 1 میکرومولار محصول غیر اشباع در هر دقیقه.

310 نشریه پژوهشهاي علوم و صنایع غذایی ایران جلد 7 شماره 4 زمستان 1390 نتایج حاصل از خالص سازي آنزیم پکتینلیاز از آسپرژیلوس نایژر نشان داد که فعالیت آنزیمی تا میزان 17/79 واحد در هر میلیلیتر افزایش یافت. مقدار پروتي ین آنزیم خالص نیز به مقدار 0/006 رسید. بازده فعالیت در آنزیم حاصل %52 گردید و مرتبه خلوص آنها به ترتیب 16/65 بار بدست آمد. نتایج خالص سازي آنزیم پکتیناز توسط روش جداسازي سه فازي توسط شارما و گوپتا (2001) بازده خالص سازي را %76 و مرتبه خلوص نهایی را 10 برابر بیان نمودند. وزن مولکولی نتایج SDS-PAGE مشخص نمود که وزن مولکولی آنزیم پکتینلیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر معادل 12 کیلودالتون میباشد (شکل 8 ). شکل 8 - تعیین وزن مولکولی آنزیم پکتینلیاز حاصل از SDS-PAGE توسط روش Aspergillus niger نتایج حاصل از آزمونهاي کیفی چاي فراوري شده اثر آنزیم بر میزان تي افلاوین مقدار تي افلاوین تولید شده درجه شفافیت چاي را تعیین میکند. رنگ چاي دم کرده که معمولا بین قرمز تا قهوهاي تغییر میکند به علت حضور تي افلاوین است. میزان تي افلاوین در چاي فرآوري شده در شکل (9) نشان داده شده است. شکل 9 - اثر آنزیم بر میزان تي افلاوین نتایج اثر عصاره خام آنزیمی و آنزیم خالص پکتینلیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر روي فاکتور تي افلاوین نشان داد که آنزیم مورد بررسی قادر به افزایش درصد تي افلاوین است. از بین تیمارهاي صورت گرفته آنزیم خالص حاصل از آسپرژیلوس نایژر بیشترین اثر را روي مقدار تي افلاوین به میزان % 0/2976 از خود نشان داد. عصاره خالص آنزیم حاصل از آسپرژیلوس نایژر و پکتیناز تجاري به ترتیب سبب افزایش مقدار تي افلاوین به میزان %15/07 و %14/43 شدند اما اثر آنزیم خام حاصل از آسپرژیلوس نایژر اثر افزایشی بر میزان تي افلاوین نداشت. چون میزان فعالیت ویژه در نمونه آنزیمی خالص بیشتر از آنزیم خام است دیواره سلولی بیشتر تخریب شده درنتیجه قرار گرفتن سوبستراهاي کاتکینی چاي در برابر آنزیم پلیفنول اکسیداز بیشتر میشود که این امر اثر بیشتر آنزیم خالص نسبت به خام را روي این فاکتور تایید میکند. سریري و همکاران (2006) اثر آنزیم سلولاز را در مرحله تخمیر برگ چاي روي فاکتورهاي کیفی آن مورد بررسی قرار دادند نتایج آنها نیز اثر بیشتر آنزیم خالص را نسیت به خام روي چاي تایید نمود. اثر آنزیم بر میزان تي اروبیگین نتایج اثر عصاره خام آنزیمی و آنزیم خالص پکتین لیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر روي فاکتور تي اروبیگین در شکل 10 نشان داده است. از بین تیمارهاي صورت گرفته تنها آنزیم پکتیناز تجاري (%12/5851) اثر افزایشی روي مقدار تي اروبیگین از خود نشان داد. اما آنزیم خام و خالص حاصل از آسپرژیلوس نایژر اثر افزایشی بر میزان تي اروبیگین نداشت. چون بین دو فاکتور تي افلاوین و تي اروبیگین همبستگی وجود دارد و پیشسازهاي پلیفنولی براي تولید این دو ماده مشترك است (2004 al., (Obanda et اثر کم تیمارهاي انجام شده روي فاکتور

311 جداسازي پکتین لیاز از Aspergillus niger و اثر آن در بهبود... تي اروبیگین را میتوان تنها به شرایط زمان و دماي مرحله تخمیر نسبت داد زیرا میزان تبدیل تي افلاوین به تي اروبیگین تحت تاثیر دما و طول مدت تخمیر نیز میباشد (2004 al.,.(obanda et چاي نقش دارند (2001 Obanda,.(Owuor & از آنجا که تیمارهاي مورد آزمون اثري روي افزایش تي اروبیگین نداشت میتوان دلیل کاهش درصد رنگ کل را نیز توجیه نمود. اثر آنزیم بر شفافیت نتایج اثر عصاره خام آنزیمی و آنزیم خالص پکتین لیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر روي فاکتور شفافیت نشان داد که آنزیم داراي اثر افزایشی بر میزان شفافیت میباشد (شکل 12 ). شکل 10 - اثر آنزیم بر میزان تي اروبیگین اثر آنزیم بر میزان رنگ کل نتایج اثر عصاره خام آنزیمی و آنزیم خالص پکتینلیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر روي فاکتور رنگ کل در شکل 11 نشان داده شده است. شکل 12 - اثر آنزیم بر شفافیت شکل 11 - اثر آنزیم بر میزان رنگ کل رنگ کل فاکتوري است که مقدار آن تحت تاثیر دو فاکتور تي افلاوین و تي اروبیگین میباشد. معمولا حدود %30 از رنگ کل نهایی به تي افلاوین و بقیه به تي اروبیگین نسبت داده میشود( Obanda et &Reeves, 1986.(al., 2004- Owuor درنتیجه عدم افزایش درصد رنگ کل در اثر تیمارهاي انجام شده را میتوان به مقدار تي اروبگین نسبت داد. عوامل دیگري که باعث افزایش این صفت میشوند تنها محصولات اکسیداسیون نیستند بلکه پیگمانهاي رنگی دیگري مانند کاروتنوي ید تي وفیلین و تي وفورباید نیز در ایجاد رنگ نوشابه چاي تاثیر دارند. دو ترکیب آخر حاصل تجزیه کلروفیل در مرحله خشک میباشند که در ایجاد رنگ سیاه و قهوهاي در نوشابه از بین تیمارهاي صورت گرفته آنزیم خالص حاصل از آسپرژیلوس نایژر بیشترین اثر را روي درصد شفافیت به میزان %11/02 از خود نشان داد. آنزیم خالص حاصل از آسپرژیلوس نایژر و پکتیناز تجاري به ترتیب سبب افزایش مقدار تي افلاوین به میزان %24/62 و %22/39 شدند. اما اثر آنزیم خام حاصل از آسپرژیلوس نایژر اثر افزایشی بر میزان شفافیت نداشت. فاکتور شفافیت نیز تحت تاثیر تي افلاوین میباشد. هرچه میزان تي افلاوین در چاي استحصالی بیشتر باشد شفافیت چاي نهایی نیز افزایش مییابد( al, Obanda et.( 2004- Owuor & Reeves, 1986 اثر آنزیم بر نسبت تي افلاوین به تي اروبیگین یک فرآیند تخمیر ایدهآل منجر به ایجاد یک تعادل مناسب بین تي افلاوین و تي اروبیگین میگردد 2002) al.,.( Angayarkanni et نسبت بین تي افلاوین و تي اروبیگین اثر مستقیم روي رنگ چاي دارد. نتایج اثر عصاره خام آنزیمی و آنزیم خالص پکتین لیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر بر نسبت تي افلاوین به تي اروبیگین در شکل 13 نشان داده شده است.

312 نشریه پژوهشهاي علوم و صنایع غذایی ایران جلد 7 شماره 4 زمستان 1390 همکاران( 2000 ) مورگسان و همکاران( 2002 ) و وانگ و همکاران (2005) مطابقت داشت. شکل 13 - اثر آنزیم بر نسبت تي افلاوین به تي اروبیگین. با توجه به شکل 13 مشخص گردید که آنزیم خالص حاصل از آسپرژیلوس نایژر بیشترین اثر را روي نسبت تي افلاوین به تي اروبیگین (%0/0256 ( داشت. آنزیم خالص حاصل از آسپرژیلوس نایژر و پکتیناز تجاري به ترتیب سبب افزایش نسبت تي افلاوین به تي اروبگین به میزان %22/77 و %12/44 شدند. اما اثر آنزیم خام حاصل از از آسپرژیلوس نایژر اثر افزایشی بر این فاکتور نداشت. چون میزان فعالیت ویژه در نمونه آنزیمی خالص بیشتر از آنزیم خام است دیواره سلولی بیشتر تخریب شده درنتیجه قرار گرفتن سوبستراهاي کاتکینی چاي در برابر آنزیم پلیفنول اکسیداز بیشتر میشود که این امر اثر بیشتر آنزیم خالص نسبت به خام را روي این فاکتور تایید میکند. اثر آنزیم بر میزان کافي ین مکانیسم تغییر میزان کافي ین در فرایند چاي سیاه توسط تیمارهاي انجام شده مورد بررسی قرار گرفتند نتایج در شکل 14 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که تخمیر چاي توسط عصاره خام آنزیمی آنزیم خالص پکتینلیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر میتواند میزان کافي ین چاي را افزایش دهد. از بین تیمارهاي انجام شده عصاره خام آنزیمی آسپرژیلوس نایژر با مقدار کافي ین %4/627 بیشترین اثر را روي چاي از خود نشان داد. اثر عصاره خام آنزیمی و آنزیم خالص روي چاي به ترتیب سبب افزایش کافي ین چاي به میزان %11/4 و %4/6 شدند. نتایج بدست آمده در این پژوهش با نتایج آنگایارکانی شکل 14 - اثر آنزیم بر میزان کافي ین. نتیجه گیري در این بررسی استفاده از روش جداسازي سه فازي در خالص سازي آنزیم پکتینلیاز حاصل از آسپرژیلوس نایژر میزان خلوص 16/652 و بازده فعالیت %52 را نشان داد. این متد تنها نیازمند یک ساعت زمان جهت خالص سازي بوده بنابراین فرایندي کارامد و اقتصادي محسوب می گردد و داراي پتانسیل بالایی براي خالص سازي آنزیم ها در مقیاس صنعتی میباشد. همچنین اثر آنزیم خالص حاصل از آسپرژیلوس نایژر نسبت به عصاره خام آنزیمی روي افزایش درصد فاکتورهاي تي افلاوین شفافیت و نسبت تي افلاوین به تي اروبیگین بیشتر بوده اما تیمارهاي آنزیمی اثر افزایشی روي فاکتورهاي تي اروبیگین و رنگ کل از خود نشان ندادند اما اثر عصاره خام آنزیمی نسبت به آنزیم خالص روي فاکتور کافي ین بیشتر بود. قدردانی بدینوسیله از مدیریت محترم وقت مرکز تحقیقات چاي کشور که انجام این پروژه بدون حمایت و همکاري ایشان مقدور نبود قدردانی میگردد. منابع شهیدي. ف. و حسینی نژاد. م. 1389. در ترجمه آنزیم ها در صنایع غذایی. توکر. ج.ا. اف. و. و وود. ژ (مو لف). انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد. ص 15-41 Angayarkanni, J., Palaniswami, M., Murugesan, S. & Swaminathan, k., 2002, Improvement of tea leaves fermentation with Aspergillus spp. pectinase. Journal of Bioscience and Bioengineering, 94(4), 299-303 Bradford, M.M., 1976, A Rapid & Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing

313 جداسازي پکتین لیاز از Aspergillus niger و اثر آن در بهبود... the Principle of Dye Binding. Analytical Biochemistry, 72, 248 254 Dayanand, A. & Patil S. R., 2003, In: Detection of potential fungal isolates for the production of pectinase from deseeded dried sunflower head Dennison, C. & Lovrein, R., 1997, Three phase partitioning : concentration and purification of protein. Protein Expr purify, 11,149-16 Dixon, M., and Webb, E.C. (1979). Enzyme kinetics, In: Enzymes, 3rd edition, Academic press, New york, Publishers. Logman group, p. 47 Ghildyal, N.P., Ramakrishna, S.V., Nirmala, P., Devi, B.K. & Lowsane Asthana, H.A., 1981, "Large scale production of pectolytic enzyme by solid state fermentation". Journal of Food Science and Technology, 18, 243-251 Hamdy, H.S., 2005, Purification and characterization of the pectin lyase produced by Rhizopus oryzae grown on orange peels. Annals of microbiology. 55(3), 205-211 Kapoor, M., Beg, QK., Bhushan, B., Singh, K., Dadhich, KS & Hoondal, GS., 2001, Application of an alkaline and thermostable polygalacturonase from Bacillus sp. MG-cp-2 in degumming of ramie (Boehmeria nivea) and sunn hemp (Crotalaria juncea) bast fibers. Process Biochemistry. 36, 803 807 Kashyab, D.R., Vohra, P.K., Chopr, S. & Tewari, R, 2001, Applications of pectinases in commercial secor:a review. Bioresour Technoogyl. 77, 215-227 Laemmli, U.K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227, 680-685 Lakin, A., 1989. Food Analysis, Practical Handout. Reading University, UK. Mahanta, P., & Barouah, S., 1992, Changes in pigments and phenolics and their relationship with black tea quality. Journal of Science and Food Agricalture, 59,21-26 Murugesan, G. S., Angayarkanni, J. & Swaminathan, K., 2002. Effect of Tea fungal enzymes on the quality of black tea. Food Chemistry, 79, 411-17 Obanda, M., Owuner, P.O., Oka, R.M. & Kavoi, M.M., 2004, Change in thearubigin fractions and theaflavin levels due to variation in processing conditions and their influence on black tea liquor brightness and total color. Food Chemistry, 85:163-173 Owuor, P. O. & Obanda, M., 2001, Comparative responses in plain black tea quality parameters of different tea clones to fermentation temperature and duration. Food chemictry, 72,319-327 Owuor, P. O. & S. G. Reeves., 1986, Optimising fermentation time in black tea manufacture. Food Chemistry, 21(3), 195-203 Pike, R.N. & Dennison, C., 1989, Protein fractionation by three phase partitioning (TPP) in aqueous/t-butanol mixtures. Biotechnology of Bioengineer, 33,221 228 Ramalingam, G. & Mulimani, V.H., 2004, purification and characterization of guar galactomannann degrading α- galactosidase from Aspergillus oryzae DR-5. Journal of Microbial Biotechnology, 11,863-867 Ramanujam, P.K., N, S., andf Subramanian, P. 2008. Production of pectin lyase by solid state fermentation of sugarcane bagasse using Aspegillus niger. Research Article. 30-33 Rasheedha, A., Kalpana Devi, M., Gnanaprabhal, G.R., Pradeep, B.V. & Palaniswamy, M., 2010, Production and characterization of pectinase enzyme from penicillum chrysogenum. Indian Journal of Science and Thechnology, 3, 377-381 Sariri, R., Najafi, A., and Araste, A. 2006. The effect of Cellulase extracted from symbiotic tea fungies on the quality of Iranian tea. Enz. Microbial Technol, 39(20), 308-310 Saxena, L., Lyer, B.K. & Ananthanaraan, L., 2007. Three-phase partitioning as a novel method for purification of ragi bifunctional amylase/protease inhibitor. Process biochemistry, 42,491-495 Sharma, A. & Gupta MN., 2001, purification of pectinases by three-phase partitioning. Biotechnology Letters, 23, 1625-1627 Wang, X.G., Hu, S.X., Wan, X.C. & Pan, C.Y., 2005, Effect of microbial fermentation on caffeine content of tea leaves. Journal of Agriculture Food Chemistry, 53, 7238-7242 Yadav, S., Yadav, P. K., Yadav, D. & Yadav, K. D. S., 2007, Purification and characterization of an alkaline pectin lyase from Aspergillus flavus. Process Biochemistry, 43(5), 547-552.