Το κύτταρο και ο κυτταρικός μεταβολισμός

Department of Chemical Το κύτταρο και ο κυτταρικός μεταβολισμός Αναπλ. Καθηγητής Δημοσθένης Σαρηγιάννης 1

Department of Chemical Κυτταρική αναπνοή Λαμβάνει χώρα σε τρία στάδια Γλυκόλυση, ένα μόριο γλυκόζης διασπάται σε δυο μόρια πυροσταφυλικού οξέος Ο κύκλος του κιτρικού οξέος, ολοκληρώνει τη διάσπαση της γλυκόζης Η οξειδωτική φωσφορυλίωση, παράγει την κύρια ποσότητα ATP 2

Γλυκόλυση Department of Chemical Λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα απουσία οξυγόνου. Η γλυκόζη διασπάται αρχικά σε δυο μόρια τριοζών, και στη συνέχεια σε δυο μόρια πυροσταφυλικού οξέος, προσφέροντας 2 ATP Στην περίπτωση ύπαρξης οξυγόνου, το πυροσταφυλικό εισέρχεται στον κύκλο του κιτρικού οξέος. Αν όχι μετατρέπεται σε αιθυλική αλκοόλη και διοξείδιο του άνθρακα ή γαλακτικό οξύ. 3

Department of Chemical 4

Department of Chemical Κύκλος του κιτρικού οξέος Το πυροσταφυλικό οξύ, που είχε παραχθεί από τη γλυκόλυση, μετατρέπεται σε ακετυλο-συνένζυμο Α και με τη μορφή αυτή εισέρχεται στον κύκλο του κιτρικού οξέος. Ο κύκλος είναι μια αλληλουχία αντιδράσεων στην οποία τελικό προϊόν είναι αντιδρών του αρχικού σταδίου. Ο κύκλος προσφέρει ενέργεια μέσω της παραγωγής NADH και FADH 2, που μπορούν να μετατραπούν σε ATP. Αν και απαραίτητος, ο κύκλος του κιτρικού οξέος, ο ρυθμός του ελέγχεται για να επιτευχθεί η σταθερότητα στο εσωτερικό του κυττάρου και οι συγκεντρώσεις προϊόντων δεν είναι μεγαλύτερες από τις ανάγκες. Ο έλεγχος επιτυγχάνεται μέσω των σταδίων της αναστολής, διέγερσης και των συγκεντρώσεων των ενζύμων αφυδρογονάση του πυροσταφυλικού, συνθετάση του κιτρικού, αφυδρογονάση του ισοκιτρικού και α-κετογλουταρική αφυδρογονάση. 5

Department of Chemical 6

Department of Chemical Οξειδωτική Φωσφορυλίωση Κατά την οξειδωτική φωσφορυλίωση (oxidative phosphorylation), τα ηλεκτρόνια του NAD και του FADH2 μεταφέρονται στο Ο 2 και η ενέργεια που απελευθερώνεται από τη διαδικασία αυτή χρησιμοποιείται για τη σύνθεση του ATP από ADP. Η μεταφορά ηλεκτρονίων από το NADH στο O 2 απελευθερώνει μεγάλα ποσά ελεύθερης ενέργειας: ΔG = 52,5 kcal/mol για κάθε ζεύγος ηλεκτρονίων που μεταφέρεται. Η διαδικασία λαμβάνει χώρα βαθμιαία μέσω της μεταφοράς των ηλεκτρονίων από μια σειρά φορέων, οι οποίοι συνιστούν την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων (electron transport chain). Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται πλήρης αξιοποίηση της ελεύθερης ενέργειας Ηλεκτρόνια από το NADH και το FADH2 μεταφέρονται στο Ο2 μέσω μιας σειράς μεταφορέων που είναι οργανωμένοι σε τέσσερα ενεργειακά σύμπλοκα στη μιτοχονδριακή μεμβράνη. Η ελεύθερη ενέργεια που παράγεται από τις αντιδράσεις μεταφοράς ηλεκτρονίων στα σύμπλοκα Ι, ΙΙI και IV χρησιμοποιείται για τη σύνθεση του ATP. 7

Department of Chemical Αλυσίδα μεταφοράς ενέργειας 8

Department of Chemical 9

Department of Chemical Αναερόβια αναπνοή Ορισμένα βακτήρια, μύκητες και μερικά φύκη χρησιμοποιούν άλλη διαδικασία απελευθέρωσης ενέργειας στο κύτταρο, τη ζύμωση. Η διαδικασία αυτή δεν έχει ως τελικό δέκτη ηλεκτρονίων το οξυγόνο αλλά κάποια οργανική ουσία. Το οξυγόνο επομένως, δεν είναι απαραίτητο και γι αυτό η διαδικασία γίνεται αναερόβια. Οι ζυμώσεις δηλαδή είναι αναερόβιες βιοχημικές οδοί που δεν περιλαμβάνουν σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων. Η συνολική ποσότητα της ΑΤΡ που παράγεται κατά τις ζυμώσεις είναι αποτέλεσμα της φωσφορυλίωσης υποστρωματικού επιπέδου κατά τη γλυκόλυση (συνολικό κέρδος 2 μόρια ΑΤΡ ανά μόριο γλυκόζης), τελικό προϊόν της οποίας είναι το πυροσταφυλικό οξύ. Αυτό όμως δεν μπορεί να συμβεί αν δεν υπάρχει στο κύτταρο ικανοποιητική ποσότητα NAD +. Αν ολόκληρη η διαθέσιμη ποσότητα NAD + αναχθεί σε NADH, τότε η γλυκόλυση σταματά. Στις ζυμώσεις για να επιλυθεί το πρόβλημα, τα μόρια NADH δίνουν τα υδρογόνα τους σε οργανικά μόρια, αφού δεν υπάρχει οξυγόνο και έτσι ξαναδημιουργείται το NAD + για να συνεχιστεί η γλυκόλυση. Οι ζυμώσεις διακρίνονται σε διάφορα είδη ανάλογα με το τελικό προϊόν που παράγεται (συνήθως αιθανόλη και γαλακτικό οξύ). Τα τελικά αυτά προϊόντα είναι τοξικά για τα κύτταρα και αποβάλλονται ως απόβλητα ή μεταποιούνται. 10

Department of Chemical Αναερόβια αναπνοή 11

Department of Chemical Οι τρεις οξειδωτικοί οδοί του πυροσταφυλικού 12

Department of Chemical φωτοσύνθεση Η παραγωγή ενέργειας από την οξείδωση υδατανθράκων και λιπιδίων στηρίζεται στη διάσπαση ήδη συντεθειμένων οργανικών ενώσεων. Η ενέργεια που απαιτείται για τη σύνθεση αυτών των ενώσεων προέρχεται ουσιαστικά από το ηλιακό φως, το οποίο συλλέγεται και χρησιμοποιείται από φυτά και φωτοσυνθετικά βακτήρια για να πραγματοποιηθεί η σύνθεση των υδατανθράκων. Μετατρέποντας την ενέργεια του ηλιακού φωτός σε χρησιμοποιήσιμη μορφή χημικής ενέργειας, η φωτοσύνθεση αποτελεί πρακτικά την πηγή όλης της μεταβολικής ενέργειας στα βιολογικά συστήματα. 13

Department of Chemical Πρωτογενείς και δευτερογενείς μεταβολικές οδοί και οι διασυνδέσεις τους με κεντρικά καταβολικά μονοπάτια μέσω κοινών μεταβολιτών σε φυτά, βακτήρια και μύκητες 14

Department of Chemical 15

Department of Chemical Μοντέλα κυτταρικών αντιδράσεων Αναπλ. Καθηγητής Δημοσθένης Σαρηγιάννης 16

Department of Chemical ΣΚΟΠΟΣ Η μεταβολική μηχανική αποσκοπεί στην κατασκευή μαθηματικών μοντέλων για να περιγράψει και να προσομοιώσει τις μεταβολικές οδούς τις οποίες χρησιμοποιούν οι έμβιοι οργανισμοί. Η κατανόηση βοηθά στην ερμηνεία της συμπεριφοράς Μπορεί να προβλέψει τη συμπεριφορά Μπορεί να επιτρέψει τη χειραγώγησή της 17

Department of Chemical Αρχική διάκριση εννοιών Υπόστρωμα (substrate) Η ένωση που μεταβολίζεται ή απευθείας ενσωματώνεται στο κύτταρο, είναι ενώσεις οι οποίες που χρησιμοποιούνται από το κύτταρο ως πήγες άνθρακα, αζώτου και ενέργειας (γλυκόζη, αμμωνία, Ο 2 ) Μεταβολικό προϊόν (metabolic product) ενώσεις που παράγονται στο κύτταρο και εκκρίνονται στον εξωκυτταρικό χώρο. Σε αυτά εντάσσονται τα προϊόντα του πρωτογενούς και δευτερογενούς μεταβολισμού, ετερόλογες πρωτεΐνες. Συστατικά βιομάζας (biomass constituents) είναι οι δεξαμενές μακρομορίων ή μεμονωμένα μακρολογία (πρωτεΐνες, υδατάνθρακες, νουκλεϊκά οξέα, λιπίδια) τα οποία εντοπίζονται στο εσωτερικό του κυττάρου. Ενδοκυτταρικοί μεταβολίτες (intracellular metabolites) όλες οι λοιπές ενώσεις του κυττάρου όπου περιλαμβάνονται τα ενδιάμεσα προϊόντα των μεταβολικών οδών και οι δομικές μονάδες για την μακρομοριακή σύνθεση (αμινοξέα) 18

Department of Chemical Κατασκευή στοιχειομετρικών μοντέλων Συμβολισμός στοιχειομετρικών συντελεστών Υποστρώματα (α), μεταβολικά προϊόντα (β), συστατικά βιομάζας (γ), ενδοκυτταρικά συστατικά (g) Ένα σύστημα όπου Ν υποστρώματα μετατρέπονται σε Μ μεταβολικά προϊόντα και Q συστατικά βιομάζας μέσω J αντιδράσεων και K ενδοκυτταρικοί μεταβολίτες συμμετέχουν ως ενδιάμεσα του μεταβολικού μονοπατιού. Οι στοιχειομετρικοί συντελεστές φέρουν δείκτη αποτελούμενο από δυο νούμερα τα οποία αντιστοιχούν στον αριθμό της αντίδρασης και στο συστατικό. Ο στοιχειομετρικός συντελεστής α ji αντιστοιχεί στο στοιχειομετρικό συντελεστή του i υποστρώματος στην j αντίδραση. Τα υποστρώματα μιας αντίδρασης συμβολίζονται ως S i, τα μεταβολικά προϊόντα ως P i και τα συστατικά της βιομάζας ως X macro,i. Τα Κ ενδιάμεσα του μεταβολικού δρόμου συμβολίζονται ως Χ met,i 19

Department of Chemical Κατασκευή στοιχειομετρικών μοντέλων Με βάση του παραπάνω συμβολισμούς η στοιχειομετρία της j κυτταρικής αντίδρασης δίνεται από τον τύπο Σε κάθε μεταβολικό μοντέλο θα αναπτύσσεται μια εξίσωση όπως η παραπάνω για κάθε μια από τις J κυτταρικές αντιδράσεις. Για λογούς ευκολίας έκφρασης, γράφεται και ως ΑS + BP + ΓX macro +GΧ Met =0 Όπου Α,Β,Γ και G αντιστοιχούν σε στοιχειομετρικούς πίνακες οι οποίοι περιέχουν τους στοιχειομετρικούς συντελεστές των J αντιδράσεων για τα υποστρώματα, τα μεταβολικά προϊόντα, τους ενδιάμεσους μεταβολίτες και τα συστατικά της βιομάζας 20

Department of Chemical Στους πίνακες οι Στοιχειομετρικοί πίνακες Γραμμές αντιστοιχούν στις αντιδράσεις Στήλες στους μεταβολίτες Κατ' επέκταση το στοιχείο στη γραμμή j και στήλη i του πίνακα Α αντιστοιχεί στον στοιχειομετρικό συντελεστή του i υποστρώματα στην j αντίδραση. Οι τιμές που μπορεί να λάβουν οι συντελεστές αυτοί μπορεί να είναι θετικές, αρνητικές ή μηδέν 21

Department of Chemical Παράδειγμα, Ε. coli σε μικτή ζύμωση οξέων Εξελίσσεται σύμφωνα με το σχήμα Κατά το μεταβολισμό του ο μικροοργανισμός παράγει 7 προϊόντα με το ηλεκτρικό να παράγεται από το φωσφοενολοπυροσταφυλικό (PEP) και τα υπόλοιπα από το πυροσταφυλικό 22

Department of Chemical Ε. coli σε μικτή ζύμωση οξέων Στις κυτταρικές αντιδράσεις εμφανίζονται ζεύγη συμπαραγόντων ιδιαίτερης σημασίας όπως τα ζεύγη ATP/ADP, NAD/NADH, NADP/NADPH για στα δυο συστατικά των ζευγών αυτών οι στοιχειομετρικοί συντελεστές θα έχουν ποσοτικά την ίδια τιμή αλλά με αντίθετο πρόσημο (+1. -1). Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση των συμπαραγόντων κάθε ζεύγους βρίσκεται σε στενή σχέση μεταξύ τους και είναι σταθερή σε κάθε αντίδραση που λαμβάνουν μέρος. οι αντιδράσεις που σχηματίζονται είναι οι ακόλουθες: 23

Department of Chemical Ε. coli σε μικτή ζύμωση οξέων Οι αντιδράσεις μπορούν να ομογενοποιηθούν σύμφωνα με τη γενική εξίσωση, με τη γλυκόζη ως υπόστρωμα, το ηλεκτρικό, γαλακτικό, οξικό, αιθανόλη, διοξείδιο του άνθρακα και υδρογόνο ως προϊόντα του μεταβολισμού και το PEP, πυροσταφυλικό, ακετυλο-coa, ΑΤΡ, και ΝΑDH ως ενδιάμεσα προϊόντα. 24

Department of Chemical Ε. coli σε μικτή ζύμωση οξέων Η εξίσωση παρέχει εύχρηστη σύνοψη των αντιδράσεων του μοντέλου Από την τέταρτη στήλη της αντίδρασης G φαίνεται ότι το ATP παράγεται μόνο σε δυο αντιδράσεις (μετατροπή του PEP σε πυροσταφυλικό και μετατροπή του ακετυλο-coa σε οξικό). Αυτές οι δυο ροές μπορούν να προσδιοριστούν, και δύναται η εξαγωγή πληροφοριών για την συνολική ταχύτητα σύνθεσης του ATP Καθότι το αναγωγικό ισοζύγιο πρέπει να κλείσει με τη μετατροπή της γλυκόζης στους μεταβολίτες της, φαίνεται από τον πίνακα ότι η κατανάλωση της γλυκόζης μπορεί να συσχετισθεί με το σχηματισμό του ηλεκτρικού, γαλακτικού και της αιθανόλης, έτσι μπορεί να υπολογιστεί ότι η κατανάλωση του NADH για 100 mol γλυκόζης είναι : 2 x 10.7 (ηλεκτρικό)+ 79.5 (γαλακτικό)+ 2 x 49.8 (αιθανόλη) =200.5 25

Department of Chemical Ταχύτητα αντιδράσεων Η ταχύτητα μιας αντίδρασης ορίζεται ως την ταχύτητα προς τη δεξιά πλευρά της αντίδρασης V η οποία καθορίζει ότι ένα συστατικό με στοιχειοθετικό συντελεστή β σχηματίζεται με ταχύτητα βv. Ως μονάδα μέτρησης της ταχύτητας ορίζεται το mol h -1, ή mol L -1 h -1 Στις κυτταρικές αντιδράσεις συχνά χρησιμοποιείται η βιομάζα ως σημείο αναφοράς για να οριστεί η ειδική ταχύτητα, με μονάδες μέτρησης το mol (gdw h) -1. Στη γενικότερη μορφή η ειδική ταχύτητα κατανάλωσης του i υποστρώματος είναι το άθροισμα της κατανάλωσης του σε όλες της J αντιδράσεις: Με την ταχύτητα παραγωγής του i μεταβολικού προϊόντος να δίνεται από τη σχέση: 26

Department of Chemical Ταχύτητα αντιδράσεων Στην περίπτωση που ένα μεταβολικό προϊόν σχηματίζεται μόνο σε μια αντίδραση, τότε η ταχύτητα σχηματισμού ή κατανάλωσης του είναι μια έμμεση μέτρηση της ταχύτητας της αντίδρασης. Οι ταχύτητες σχηματισμού των συστατικών της βιομάζας και των ενδοκυτταρικών μεταβολιτών μπορούν να υπολογιστούν με τις σχέσεις. 27

Department of Chemical Ταχύτητα αντιδράσεων Ο προσδιορισμός των ταχυτήτων δεν είναι εξίσου εύκολος όπως στην περίπτωση της κατανάλωσης των υποστρωμάτων ή της παραγωγής των προϊόντων. Ο προσδιορισμός τους βασίζεται στη μέτρηση των ενδοκυτταρικών συστατικών Όπου Α Τ, Β Τ, Γ Τ, G T είναι οι πίνακες που προέκυψαν, r s το άνυσμα της ειδικής ταχύτητας που περιέχει τις Ν ειδικές ταχύτητες πρόσληψης του υποστρώματος, r p το άνυσμα της ειδικής ταχύτητας που περιέχει τις Μ ειδικές ταχύτητες σχηματισμού προϊόντος. Οι πίνακες έχουν ως στήλες στοιχειομετρικούς συντελεστές του συνόλου των ροών, και ως γραμμές τις εξισώσει των ισοζυγίων μάζας για του μεταβολίτες. 28

Department of Chemical Παράδειγμα Στο μεταβολικό δίκτυο του παρακάτω σχήματος εμφανίζονται τρεις διαφορετικές ροές. Οι ροές εισόδου μεταβολικών στο εσωτερικό του κυττάρου Οι ενδοκυτταρικές ροές που σχετίζονται με την εξέλιξη του μεταβολικού δικτύου στο εσωτερικό του κυττάρου Οι ροές εξόδου προϊόντων εκτός του κυττάρου 29

Department of Chemical Παράδειγμα Η παραπάνω γραφική παράσταση μπορεί να αναπαρασταθεί στη μορφή πίνακα Μxn όπου Μ ο αριθμός των ενδοκυτταρικών μεταβολιτών και n ο αριθμός των αντιδράσεων 30

Department of Chemical Παράδειγμα R1-R9: οι αντιδράσεις του μεταβολικού δικτύου, με την ειδική ταχύτητα r σχηματισμού των μεταβολιτών στη σταθερή κατάσταση να δίνεται από τους τύπους 31

Department of Chemical Παράδειγμα Σύμφωνα με την εξίσωση r = Γ Τ v μπορεί να γραφεί ότι: Και 32

Department of Chemical Μοντέλα ανάπτυξης Ανάπτυξη που περιορίζεται από το υπόστρωμα Μοντέλο Monod Η αύξηση της βιομάζας εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών στο μέσο ανάπτυξης, όταν ένα θρεπτικό συστατικό καταστεί περιοριστικό τότε ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μg μεταβάλλεται όπως στο σχήμα. Στη συγκεκριμένη περίπτωση γίνεται παραδοχή ότι το υπόστρωμα S επηρεάζει το ρυθμό ανάπτυξης ενώ οποιαδήποτε άλλη αλλαγή στη συγκέντρωση των θρεπτικών δεν έχει επίδραση. Το συγκεκριμένο μοντέλο είναι παρόμοιο με των Michaelis-Menten και περιγράφεται από την εξίσωση Όπου μ max o μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης, K s η σταθερά Monod, και S η συγκέντρωση του περιοριστή 33

Εναλλακτικές εξισώσεις Department of Chemical Η εξίσωση Monod είναι ημιεμπειρική και η υπόθεση στην οποία είναι δομημένη δεν ισχύει σε πραγματικά συστήματα. Η Monod μπορεί να περιγράψει την ανάπτυξη που καθορίζεται από το υπόστρωμα μόνο όταν είναι αργή και η πυκνότητα του κυτταρικού πληθυσμού χαμηλή. H ανάγκη περιγραφής των συστημάτων ώθησε στην ανάπτυξη των παρακάτω εξισώσεων Όλες μπορούν να περιγραφούν από μια διαφορική εξίσωση Όπου V=μg/μmax, S είναι η συγκέντρωση του υποστρώματος, και K, α και β διαφορετικές σταθερές 34

Department of Chemical Αναστολείς Ανταγωνιστική αναστολή. Όταν αυξάνει η τιμή του Κ Μ και μένει αμετάβλητη η τιμή του V max. Μη ανταγωνιστική. Όταν μειώνεται η τιμή V max, αλλά μένει αμετάβλητη η τιμή του Κ Μ Ασυναγώνιστη αναστολή. Όταν μειώνεται η τιμή Κm και η τιμή V max. 35

Department of Chemical Μοντέλα με αναστολείς ανάπτυξης Σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος ή προϊόντων και παρουσία ανασταλτικών ουσιών στο θρεπτικό υλικό, παρατηρείται αναστολή της ανάπτυξης και ο ρυθμός ανάπτυξης εξαρτάται από τη συγκέντρωση του αναστολέα I. Το μοντέλο μικροβιακής και ενζυμικής αναστολής είναι ανάλογο, με τις κινητικές σταθερές να έχουν μικρή σημασία. Τα κινητικά δεδομένα στις περιπτώσεις αυτές προκύπτουν από προσαρμογή πειραματικών δεδομένων. Αναστολή από το υπόστρωμα. Υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος είναι δυνατό να οδηγήσουν σε αναστολή του ρυθμού μικροβιακής ανάπτυξης. Μπορεί να πάρει τη μορφή της πλήρους μη συναγωνιστικής Και της πλήρους συναγωνιστικής Κ ι η σταθερά αναστολής από το υπόστρωμα 36

Department of Chemical Μοντέλα αναστολής από το προϊόν Αναστολή από το προϊόν: υψηλές συγκεντρώσεις προϊόντων P είναι δυνατό να οδηγήσει σε αναστολή της μικροβιακής ανάπτυξης. Μπορεί και αυτή να πάρει τη μορφή της: πλήρως συναγωνιστικής πλήρως μη συναγωνιστική H EtOH από τη ζύμωση γλυκόζης αποτελεί ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα μη συναγωνιστική αναστολή από το προϊόν με την EtOH να είναι ο αναστολέας σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του 5% 37

Department of Chemical Αναστολή από τοξικές ουσίες Μπορεί να πάρει τρεις μορφές Πλήρως συναγωνιστική Πλήρως μη συναγωνιστική Ασυναγώνιστη αναστολή 38

Department of Chemical Thank you for your kind attention www.enve-lab.eu A connectivity perspective to environmental health 39