ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Έκφραση και ρόλος της aggrecan και perlecan στο πρώιµο έµβρυο ΝΙΚΟΛΙΤΣΑ ΣΟΥΛΙΝΤΖΗ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ, ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ 2009
ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής Ν. Ζάγκρης Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Μέλη Χ. Γεωργίου Kαθηγητής Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Ν. Σταµάτης Επίκουρος καθηγητής Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ν. Ζάγκρης Καθηγητής Γ. ηµητριάδης Καθηγητής Ν. ηµόπουλος Καθηγητής Χ. Γεωργίου Καθηγητής Γ. Στεφάνου Καθηγήτρια Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Γ. Κίλιας Αναπληρωτής καθηγητής Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Ν. Σταµάτης Επίκουρος καθηγητής Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Μεταπτυχιακού ιπλώµατος Ειδίκευσης ( ιδακτορικής ιατριβής) από το Τµήµα Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα Ν. 5343/1392, άρθρο 202. (10pt)
Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει εκπονηθεί στο Εργαστήριο Αναπτυξιακής Βιολογίας του Τοµέα Γενετικής Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Πανεπιστηµίου Πατρών, υπό την επίβλεψη του καθηγητή κ. Νικόλα Ζάγκρη Η έρευνα χρηµατοδοτήθηκε από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταµείο (ΕΚΤ), Επιχειρησιακό Πρόγραµµα Εκπαίδευση και Αρχική Επαγγελµατική Κατάρτιση (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ), και ειδικότερα το Πρόγραµµα ΠΥΘΑΓΟΡΑΣ ΙΙ και από το Πανεπιστήµιο Πατρών (Κ. Καραθεοδωρή Β. 397)
Ευχαριστώ τον καθηγητή κ. Νικόλα Ζάγκρη για την ακούραστη καθοδήγηση και επίβλεψη του κατά την εκπόνηση της παρούσης διατριβής. Επίσης ευχαριστώ την επταµελή επιτροπή. Θα ήθελα να ευχαριστήσω και τους µεταπτυχιακούς φοιτητές του εργαστηρίου για την άψογη συνεργασία. Η παρούσα ιατριβή αφιερώνεται στην οικογένεια µου και στους φίλους µου.
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή Εξωκυττάρια ύλη και ο ρόλος της κατά την ανάπτυξη...2 Βασική Μεµβράνη....... 5 Γλυκοζαµινογλυκάνες..... 7 Πρωτεογλυκάνες....9 Perlecan..... 13 οµή και λειτουργία..14 Μοριακές αλληλεπιδράσεις perlecan 17 1. Συγκρότηση της βασικής µεµβράνης...18 2. Σύνδεση µε την κυτταρική επιφάνεια..21 3. Αλληλεπιδράσεις µε αυξητικούς παράγοντες. 23 Έκφραση και κατανοµή της perlecan..25 Ο ρόλος της perlecan..27 Aggrecan....... 29 οµή και λειτουργία της aggrecan....29 Βιοσύνθεση και ρύθµιση της µεταγραφής της aggrecan 34 Εκφραση της aggrecan κατά την ανάπτυξη... 36 Aggrecan και συγκρότηση της εξωκυττάριας ύλης.. 37 Μεταλλάξεις του γονιδίου της aggrecan....42 Ανάπτυξη του εµβρύου της όρνιθας. 44 1. Πρώιµα στάδια ανάπτυξης του εµβρύου....44 2. Έναρξη οργανογένεσης.45 α. ηµιουργία των σωµιτών.. 45 β. ηµιουργία του νευρικού σωλήνα....46 3. Προσδιορισµός των σταδίων εµβρυϊκής ανάπτυξης στην όρνιθα....47
Σκοπός της διατριβής 49 Υλικά και µέθοδοι... 51 1. Αποµόνωση / Καλλιέργεια εµβρύων...52 2. Μονιµοποίηση εµβρύων...53 3. Μικροτόµηση εµβρύων...55 4. Χρώση µε Alcian Blue...56 5. Ανίχνευση πρωτεϊνών µε αντίσωµατα /Ανοσοφθορισµός...58 6. Καλλιέργεια και ραδιενεργή σήµανση εµβρύων.. 63 7. Ανοσοκατακρήµνιση πρωτεΐνης µε την Protein A-Sepharose...64 8. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακριλαµιδίου (SDS- PAGE Electrophoresis)...68 9. Χρώση πηκτώµατος πολυακρυλαµιδίου...72 10. Φθοριογραφία (autoradiography)...73 11. Εµφάνιση αυτοραδιογραφιών...76 12. Έκθεση εµβρύων σε αντισώµατα έναντι της perlecan ή aggrecan..77 13. Ανίχνευση mrna perlecan και aggrecan µε RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction).....78 13.1 Αποµόνωση εµβρύων...78 13.2 Αποµόνωση RNA...78 13. 3 Μέτρηση οπτικής απορρόφησης αποµονωµένου RNA.79 13. 4 Σύνθεση cdna µε RT-PCR.. 81 14. Ηλεκτροφόρηση προϊόντων RT-PCR σε 5% SDS-PAGE.. 84 15. Αποστειρώσεις..86 15.1 Προφυλάξεις για τα πειράµατα µε RNA. 86 Αποτελέσµατα...88 1. Έκφραση του mrna της perlecan....89 2. Ανίχνευση της perlecan µε ανοσοκατακρήµνιση.....91 3. Χωρο-χρονική ανίχνευση της perlecan στο πρώιµο έµβρυο....93
4. Ο ρόλος της perlecan στην ανάπτυξη του πρώιµου εµβρύου όρνιθας... 99 5. Έκφραση του mrna της aggrecan στο πρώιµο έµβρυο.103 6. Χωρο-χρονική ανίχνευση της aggrecan στο πρώιµο έµβρυο..105 7. Ο ρόλος της aggrecan στο πρώιµο έµβρυο...110 Συζήτηση...115 Περίληψη.132 Abstract...135 Βιβλιογραφία.138
Εισαγωγή Εξωκυττάρια ύλη και ο ρόλος της κατά την ανάπτυξη του εµβρύου. Τα µοριακά γεγονότα που ελέγχουν τη συµπεριφορά των κυττάρων, και κατ επέκταση την ανάπτυξη του εµβρύου, ελέγχονται µε τη σειρά τους από την εξωκυττάρια ύλη που παράγεται από το ίδιο το έµβρυο. Τα µόρια της εξωκυττάριας ύλης εκκρίνονται και συγκροτούν ένα εξαιρετικά οργανωµένο και πολύ-λειτουργικό δίκτυο, σε συνάφεια µε τα κύτταρα που το παρήγαγαν ή/και µε γειτονικούς κυτταρικούς πληθυσµούς (Zagris, 2001. Kleinman et al. 2003). Τα δίκτυα που σχηµατίζουν τα µόρια της εξωκυττάριας ύλης ρυθµίζουν πολλές από τις πιο βασικές λειτουργίες της ανάπτυξης ενός οργανισµού. Πιο συγκεκριµένα, τα δίκτυα αυτά µπορεί να διαχωρίζουν γειτονικές οµάδες κυττάρων εµποδίζοντας τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ τους, ενώ σε άλλες περιπτώσεις χρησιµεύουν σαν υπόστρωµα για τη µετανάστευση και προσκόλληση κυττάρων, ή επάγουν την διαφοροποίηση συγκεκριµένων κυτταρικών τύπων (Adams and Watt, 1993. Lin and Bissell, 1993. Timpl and Brown, 1994. Zagris, 2001. Rauch, 2004. Yurchenco et al., 2004). Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ κυττάρων και εξωκυττάριας ύλης ενεργοποιούν ποικίλα µονοπάτια µεταγωγής σήµατος, τροποποιούν τη ρύθµιση συγκεκριµένων γονιδίων µε αποτέλεσµα τις διαφορετικές αποκρίσεις των κυττάρων, οι οποίες επηρεάζουν τη µετανάστευση και προσκόλληση (Chakravarti et al., 1990. De Simone, 1994. Lee et al. 2000. Zagris, 2001), τον πολλαπλασιασµό (Armstrong and Armstrong, 2003) των κυττάρων και τη µορφογένεση ιστών και οργάνων (Zagris, 2001. Soulintzi and Zagris, 2007). Η εξωκυττάρια ύλη είναι µια δυναµική δοµή που υφίσταται συνεχείς αναδιαµορφώσεις, αποδόµηση των υπαρχόντων συστατικών της από πρωτεολυτικά ένζυµα κυρίως µεταλλοπρωτεάσες (ΜΜΡs), και εκ νέου σύνθεση και απόθεση µορίων (Stamenkovic, 2003). Η εξωκυττάρια ύλη είναι εµφανής ακόµα και από το στάδιο του µοριδίου, αν και µερικά από τα συστατικά της µόρια εµφανίζονται πολύ νωρίτερα στο στάδιο των 2-βλαστοµεριδίων. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η εµφάνιση του δικτύου - 1 -
Εισαγωγή εξωκυττάριας ύλης συµπίπτει χρονικά µε την έναρξη των µορφογενετικών κινήσεων της γαστριδίωσης (Zagris, 2001). Ο µηχανισµός µε τον οποίο επιτυγχάνεται η κυτταρική επικοινωνία προϋποθέτει τη προσκόλληση των ειδικών υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας µε µόρια της εξωκυττάριας ύλης ή/και άλλα µόρια όπως αυξητικοί παραγόντες, κυτοκίνες. Τα εξωκυτταρικά σινιάλα µπορεί να είναι διεργερτικά ή ανασταλτικά και καθορίζουν τη κυτταρική µετανάστευση σε κρίσιµες περιόδους της ανάπτυξης του εµβρύου. Για παράδειγµα, οι λαµινίνες προάγουν την κυτταρική µετανάστευση και την προέκταση των νευριτών (Richard et al., 1996. Takagi et al., 1996). Αντίθετα, πρωτεογλυκάνες όπως οι υαλεκτάνες (aggrecan, versican, neurocan) λειτουργούν ανασταλτικά (Margolis and Margolis, 1993. Landolt et al., 1995). Πιο συγκεκριµένα, η aggrecan αναστέλει τη µετανάστευση των κυττάρων των νευρικών κρηπίδων ενώ, η παρουσία της versican (ισοµορφές V0, V1) κατά µήκος της διαδροµής των εν λόγω κυττάρων κατευθύνει τη µετανάστευση τους (Perris and Perissinotto, 2000). Η κυτταρική µεµβράνη είναι σε συνάφεια µε την εξωκυττάρια ύλη, µέσω πληθώρας υποδοχέων όπως είναι οι ιντεγκρίνες, οι διαµεµβρανικές πρωτεογλυκάνες (syndecan, glypican), η α-δυστρογλυκάνη και οι υποδοχείς του υαλουρονικού οξέος (κυρίως CD44) (Gullberg and Ekblom, 1995. Henry and Campell, 1998. Yurchenco, 2004. Rapraeger, 2006). Η πιο σηµαντική οµάδα αυτών των ειδικών υποδοχέων είναι οι ιντεγκρίνες, µια οικογένεια ετεροδιµερών διαµεµβρανικών γλυκοπρωτεϊνών (Hynes, 1992. 2002. Ruoslahti, 1996. Howe et al., 1998. Tucker, 2004. Zagris et al., 2004). Οι ιντεγκρίνες είναι η κύρια οδός επικοινωνίας που διαθέτουν τα κύτταρα για την προσκόλληση και αλληλεπίδραση µε την εξωκυττάρια ύλη και αλληλεπίδραση µε γειτονικούς κυτταρικούς πληθυσµούς. Η εξωκυτταρική περιοχή (Ν- τελικό άκρο) της ιντεκρίνης αναγνωρίζει συγκεκριµένους επιτόπους του πρωτεϊνικού κορµού (π.χ. το τριπεπτίδιο RGD/ Arg-Gly-Asp) πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ύλης. Η κυτταροπλασµατική περιοχή της ιντεγκρίνης αλληλεπιδρά µε πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού όπως η fibulin, η ταλίνη και η α-ακτινίνη (Argraves et al., 1989. Burridge et al., 1990). Έτσι, οι ιντεγκρίνες έχουν την ικανότητα να δρουν ως σύνδεσµος µεταξύ του κυτταροσκελετού και των εξωκυττάριων µακροµορίων - 2 -
Εισαγωγή (Larouche et al., 2000. Mayernick and Armant, 2002) και να ενεργοποιούν ποικίλα µονοπάτια µεταγωγής µυνηµάτων που µεταβιβάζουν πληροφορίες από το µικρο-περιβάλλον στο εσωτερικό του κυττάρου και αντίστροφα (Zhang et al., 1997. Hughes et al., 1997. Howe et al., 1998). Παρατηρείται λοιπόν µία δοµική και λειτουργική συνέχεια µεταξύ του εσωτερικού του κυττάρου, της κυτταρικής µεµβράνης και των εξωκυττάριων ουσιών (Bosman και Stamenkonvic, 2003). Ο τρόπος οργάνωσης των µορίων της εξωκυττάριας ύλης καθώς και οι εναλλαγές στην ποσοτική και ποιοτική τους σύσταση οδηγεί σε µια µεγάλη ποικιλία µορφών, κάθε µια προσαρµοσµένη στις λειτουργικές απαιτήσεις του εκάστοτε ιστού. Το αποτέλεσµα αντανακλά τις ξεχωριστές φυσικές ιδιότητες των κυττάρων/ιστών που τις παράγουν. Η βασική µεµβράνη είναι τροποποιηµένη µορφή της εξωκυττάριας ύλης (Εικόνα 1). Εικόνα 1: Βασική µεµβράνη είναι τροποπoιηµένη µορφή εξωκυττάριας ύλης. Επιθηλικακά κύτταρα επικάθονται στην βασική µεµβράνη που τα διαχωρίζει από µεσενγχυµατικά κύτταρα. Ηλεκτρονική µικροσκοπία σάρωσης (www.upei.ca/pathclub). - 3 -
Εισαγωγή Βασική Μεµβράνη Η βασική µεµβράνη όπως εµφανίζεται στην Εικόνα 1, µοιάζει µε λεπτό στρώµα κάτω από τον επιθηλιακό ιστό και τον διαχωρίζει από τα υποκείµενα µεσεγχυµατικά κύτταρα. Επιπρόσθετα, απαντάται στον ενδοθήλιο των αιµοφόρων αγγείων, και περιβάλλει µυϊκά, κύτταρα Schwann και λιποκύτταρα. Η πρώτη βασική µεµβράνη που σχηµατίζεται κατά την ανάπτυξη του εµβρύου της όρνιθας ανιχνεύεται στο κοιλιακό µέρος της υποβλάσης, στο στάδιο του βλαστιδίου (Ζagris, 2001). Η βασική µεµβράνη ενδέχεται να περιβάλει εξ ολοκλήρου τα κύτταρα, όπως τα χονδροκύτταρα, ή να έρχεται σε επικοινωνία µόνο µε τη µια επιφάνεια τους όπως στα επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα κύρια δοµικά και λειτουργικά συστατικά που απαρτίζουν τη βασική µεµβράνη είναι κολλαγόνο IV, λαµινίνη, εντακτίνη και perlecan (Chung, 1995. Halfter et al., 2000. Chen and Hansma, 2000. Gersdorff, 2005). Η λαµινίνη και το κολλαγόνο ΙV σχηµατίζουν πολυµερή δίκτυα που ενώνονται και σταθεροποιούνται µέσω της εντακτίνης, προσφέροντας επιφάνειες προσκόλλησης για άλλα µόρια της εξωκυττάριας ύλης, όπως είναι η perlecan (Εικόνα 2). Η σύσταση της βασικής µεµβράνης καθώς και οι αλληλεπιδράσεις της µε τα κύτταρα διαφοροποιούνται ανάλογα µε τον συγκεκριµένο κυτταρικό πληθυσµό και το στάδιο ανάπτυξης. Η βιοσύνθεση των µορίων που απαρτίζουν τη βασική µεµβράνη ρυθµίζεται αναπτυξιακά και τα µόρια κατανέµονται πάντα µε ιστοειδικά συγκεκριµένο πρότυπο (Zagris, 2001). Η λειτουργική ποικιλότητα των βασικών µεµβρανών πηγάζει από την ποικιλότητα των µορίων που την απαρτίζουν, κυρίως από την παρουσία διαφορετικών ισοµορφών κολλαγόνου ΙV και λαµινίνης (Paulsson, 1992. Yurchenco and O Rear, 1994. Timpl and Brown, 1996. Aumailley and Gayraud, 1998. Erickson and Couchman, 2000. Υurchenco et al., 2004). Οι σχέσεις των κυττάρων µε την βασική µεµβράνη καθώς και µε την υπόλοιπη εξωκυττάρια ύλη στις εµβρυϊκές κοιλότητες είναι ζωτικής σηµασίας. Νωρίς στην ανάπτυξη, η βασική µεµβράνη είναι σηµαντική στην επιθηλιοποίηση ιστών, επίσης προσφέρει µηχανική υποστήριξη σε ιστούς και δηµιουργεί φράγµατα - 4 -
Εισαγωγή στη διέλευση µακροµορίων, οριοθετεί τα εµβρυϊκά κύτταρα και τους αναπτυσσόµενους ιστούς. Κατά την ανάπτυξη, η εξωκυττάρια ύλη λειτουργεί σαν υπόστρωµα για την προσκόλληση και την µετανάστευση κυττάρων, επηρεάζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, την πολικότητα και προάγει τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Στον ενήλικα οργανισµό, η σταθερότητα των ιστών, η αναγέννηση και η επoύλωση των πληγών µετά από τραυµατισµό εξαρτώνται από τη βασική µεµβράνη και την υπόλοιπη εξωκυττάρια ύλη (Timpl and Dziadek, 1986. Relan and Schuger, 1999. Erickson and Couchman, 2000. Zagris, 2001. Yurchenco et al., 2004) Εικόνα 2: Αλληλεπιδράσεις µορίων της βασικής µεµβράνης. Α) αλληλεπιδράσεις µεταξύ των συστατικών µορίων βασικής µεµβράνης και επίσης µε υποδοχείς και άλλα µόρια της κυτταρικής επιφάνειας. Β) σχηµατικό µοντέλο όπου απεικονίζεται η συνάφεια µεταξύ των µορίων της βασικής µεµβράνης και των µορίων της κυτταρικής επιφάνειας (Yυrchenco et al., 2004). - 5 -
Εισαγωγή Η αναγκαιότητα των αλληλεπιδράσεων των µακροµορίων της εξωκυττάριας ύλης κατά την ανάπτυξη είναι εµφανής σε παθήσεις σε ένα ευρύ φάσµα οργανισµών (Aszodi et al., 1998. Relan and Schuger, 1999. Erickson and Couchman, 2000). Για παράδειγµα, αρκετές παθήσεις του ανθρώπου, όπως είναι η οστεοαρθρίτιδα, οφείλονται σε εναλλαγές ή απουσία αλληλεπιδράσεων µεταξύ των µορίων της εξωκυττάριας ύλης και κυττάρων. Γλυκοζαµινογλυκάνες και πρωτεογλυκάνες Γλυκοζαµινογλυκάνες Οι γλυκοζαµινογλυκάνες (glycosaminoglycans) είναι µεγάλες γραµµικές αλυσίδες ενός επαναλαµβανόµενου δισακχαρίτη µε ισχυρό αρνητικό φορτίο εξαιτίας της παρουσίας θειϊκών και καρβοξυλικών οµάδων. Ο δισακχαρίτης φέρει πάντα µια εκ των δύο εξοζαµινών Ν-ακετυλογλυκοζαµίνη ή Ν-ακετυλογαλακτοζα- µίνη και ουρονικό οξύ (συνήθως γλυκουρονικό ή ιδουρονικό) ή γαλακτόζη. Υπάρχουν 6 κύριοι τύποι γλυκοζαµινογλυκάνων: θειϊκή χονδροϊτίνη (chondroitin sulfate), θειϊική δερµατάνη (dermatan sulfate), θειϊκή ηπαράνη (heparan sulfate)/ ηπαρίνη, θειϊική κερατάνη (keratan sulfate) και υαλουρονικό οξύ (hyaluronan acid). Όλες οι γλυκοζαµινογλυκάνες εκτός από το υαλουρονικό οξύ υφίστανται θεϊίκωση και είναι πάντα οµοιοπολικά προσδεµένες σε πρωτεϊνικούς κορµούς και σχηµατίζουν της πρωτεογλυκάνες. Η θεϊίκωση των γλυκοζαµινογλυκάνων είναι ουσιώδης γιατί καθορίζει τις σχέσεις µορίων και κυττάρων καθώς συγκεκριµένα πρότυπα θειίκωσης αποτελούν σηµεία πρόσδεσης για ενεργά µόρια της εξωκυττάριας ύλης όπως αυξητικοί παράγοντες και κυτοκίνες (Ayad et al., 1994. Knox et al., 2002). Οι φυσικές ιδιότητες των γλυκοζαµινογλυκάνων και κατά συνέπεια των πρωτεογλυκανών αντικατοπτρίζονται καλύτερα στο χόνδρο από το υαλουρονικό οξύ και την aggrecan. Το υαλουρονικό οξύ, µια ελεύθερη γλυκοζαµινογλυκάνη, µε τεράστιο µοριακό βάρος (10 3 εως 10 4 kda) κατέχει κεντρικό ρόλο στην - 6 -
Εισαγωγή οργάνωση της ύλης του χόνδρου καθώς αποτελεί το σκελετό των µεγαλοµοριακών συµπλεγµάτων (Itano, 2008) (Εικόνα 3). Το υαλουρονικό οξύ και οι αλυσίδες γλυκοζαµινογλυκάνων της aggrecan (αντιπροσωπεύουν το 90% της µάζας της πρωτεινης) έχουν την ικανότητα να αποροφούν νερό και καταλαµβάνουν µεγάλο όγκο σε σχέση µε τη µάζα τους (Jackson et al., 1991). Τα µεγαλοµοριακά συµπλέγµατα που σχηµατίζονται βρίσκονται σε συνάφεια µε το πυκνό δίκτυο που σχηµατίζουν τα ινίδια κολλαγόνου στο χόνδρο. Το αρνητικό φορτίο των γλυκοζαµινογλυκανών προσελκύει κατιόντα Na +2 µε αποτέλεσµα την απορρόφηση νερού (λόγω όσµωσης) και τη διόγκωση του ιστού ώστε να αντιστέκεται στις συµπιεστικές δυνάµεις που ασκούνται στο χόνδρο. Η επέκταση του πλέγµατος της εξωκυττάριας ύλης κατά την ενυδάτωση του υαλουρονικού οξέος επιτρέπει στα κύτταρα όπως, για παράδειγµα, κατά τις µορφογενετικές κινήσεις της γαστριδίωσης, να µεταναστεύσουν σε περιοχές που διαφορετικά θα ήταν απρόσιτες. Παράλληλα, συµβάλλουν στη ρύθµιση της βέλτιστης συγκέντρωσης των απαραίτητων για την οµαλή ανάπτυξη υδατοδιαλυτών ουσιών. Συνεπώς, καταλαµβάνουν και ενυδατώνουν το µεγαλύτερο τµήµα του εξωκυττάριου χώρου, προσδίνοντας µηχανική υποστήριξη, ενυδάτωση και λείανση σε ιστούς όπως για παράδειγµα, ο χόνδρος (Ruosalthi 1988. Hardingham and Fosang, 1992. Bernfield et al., 1999. Perrimon and Bernfield, 2000). Εικόνα 3: Συµπλέγµατα aggrecan και υαλουρονικού οξέος (www.sigmaldrich.com/etc). - 7 -
Εισαγωγή Πολύ σηµαντικές φαίνεται να είναι και άλλες ιδιότητες των γλυκοζαµινογλυκάνων, καθώς το ισχυρό τους φορτίο επιτρέπει µοριακές αλληλεπιδράσεις στην επιφάνεια των κυττάρων µε µόρια της εξωκυττάριας ύλης και αυξητικούς παράγοντες. Αυξητικοί παράγοντες όπως αυτοί της οικογένειας των FGF (Fibroblast Growth Factor), εµφανίζουν µεγάλη συγγένεια για τις γλυκοζαµινογλυκάνες θειικής ηπαράνης/ ηπαρίνης εξαιτίας της µεγαλύτερης πυκνότητας αρνητικού φορτίου που φέρουν. Η δέσµευση αυτή έχει λειτουργικό ρόλο γιατί συµβάλει στην αύξηση της τοπικής συγκέντρωσης τους έτσι ώστε ο αυξητικός παράγοντας να µπορεί να προσδεθεί από τους αντίστοιχους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, οι οποίοι µπορεί να έχουν µικρού βαθµού συγγένεια για τον συγκεκριµένο αυξητικό παράγοντα ενώ παράλληλα, τους παρέχει προστασία από πρωτεολυτική διάσπαση (Ornitz, 2000). Είναι φανερό λοιπόν ότι, ρυθµίζοντας τη δράση των αυξητικών παραγόντων και άλλων µορφογενετικών µορίων εµπλέκονται σε πλήθος βιολογικών διεργασιών όπως ο πολλαπλασιασµός και η διαφοροποίηση κυττάρων (Castellot et al., 1982. 1984. Lin, 2004), και η µορφογένεση ιστών και οργάνων (Walz et al., 1997. Perrimon and Bernfield, 2000. Davies, 2001. Toole, 2001. Zagris 2001. Εsko and Selleck, 2002. Yue et al., 2004). Για παράδειγµα, η ολική απουσία αλυσίδων θειϊκής ηπαράνης δεν επιτρέπει την εµβρυϊκή ανάπτυξη πέρα από τα αρχικά στάδια της γαστριδίωσης (Lin et al., 2000). Πρωτεογλυκάνες Η πρωτεογλυκάνη ανήκει σε µια ειδική τάξη πρωτεϊνών, στην οποία έχουν προσδεθεί οµοιοπολικά µία ή περισσότερες αλυσίδες γλυκοζαµινογλυκάνων (Εικόνα 4). Οι πρωτεογλυκάνες απαντώνται σχεδόν σε όλα τα δίκτυα της εξωκυττάριας ύλης και επιδεικνύουν εξαιρετική ποικιλοµορφία σε µέγεθος, δοµή και λειτουργία (Εικόνα 5). Η µεγάλη ποικιλότητα των πρωτεογλυκανών οφείλεται είτε σε διαφορές στο πρωτεϊνικό κορµό (Bourdon et al., 1985), είτε στη κατηγορία της γλυκοζαµινογλυκάνης που έχει προσδεθεί σε αυτόν καθώς διαφορετικές γλυκοζαµινογλυκάνες µπορεί να είναι προσδεδεµένες στον ίδιο πρωτεϊνικό κορµό (Sugahara et - 8 -
Εισαγωγή al., 1992), είτε σε διαφορές στο µήκος ή στο βαθµό θειϊκωσης του µορίου της γλυκοζαµινογλυκάνης (Roden et al., 1985. Neame et al., 1989. Schwartz, 2000). Επιπρόσθετα, οι πρωτεογλυκάνες φέρουν στο πρωτεϊνικό τους κορµό Ν- και Ο- προσδεµένους ολιγοσακχαρίτες ενισχύοντας έτσι την δοµική τους ποικιλότητα (Esko and Lindahl, 2001). Εικόνα 4 : Απεικόνιση του τετρασακχαρίτη πρόσδεσης (-GlcA-Gal-Gal-Xyl) σε σερίνη του πρωτεϊνικού κορµού και στη συνέχεια πρόσδεση ενός επαναλαµβανόµενου δισακχαρίτη που έχουν ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό µιας πρωτεογλυκάνης (www.glycoforum.gr.jp) Οι ιδιότητες των πρωτεογλυκανών οφείλονται κυρίως στις αλυσίδες γλυκοζαµινογλυκανών που είναι προσδεµένες αλλά και στον πρωτεϊνικό κορµό. Πολλές µελέτες ειδικότερα την τελευταία δεκαετία αποδεικνύουν ότι η δράση των πρωτεογλυκανών δεν περιορίζεται στη µεταφορά και αποθήκευση αυξητικών παραγόντων/ κυτοκινών στους διάφορους ιστούς αλλά ότι οι πρωτεογλυκάνες δρουν ως συν-υποδοχείς αυξητικών παραγόντων και συµµετέχουν στις αλληλεπιδράσεις υποδοχέων και αυξητικών παραγόντων όπου σηµατοδοτείται ένας καταράκτης µοριακών αντιδράσεων στα συστήµατα αναγνώρισης µεταξύ κυττάρων και µε τον εξωκυττάριο χώρο (Larrain et al., 1997. Olsen, 1999. Lin, 2000. Perrimon and Bernfield, 2000. Frevert and Wight, 2006). Οι πρωτεογλυκάνες εµπλέκονται στη συνάθροιση εξωκυττάριων µορίων και µπορούν να επιδεικνύουν προσκολλητική ή απωθητική δράση επηρεάζοντας την εµβρυογένεση (Brennan et al., 1983. Rosenberg et al., 1986. Ruoslahti et al., 1987. Battaglia et al., 1992. Landolt et al., 1995. Ιozzo, 1998. Zagris, 2001. - 9 -
Εισαγωγή Forsberg and Kjellén, 2001. Bishop et al., 2007). Συµµετέχουν στην απόπτωση των κυττάρων, στη φλεγµονή αλλά και αποκατάσταση των πληγών και επηρεάζουν την εισβολή και πολλαπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων (Sanderson, 2001). Αλλαγές στη σύνθεση και κατανοµή είτε των γλυκοζαµινογλυκάνων είτε πρωτεογλυκάνων συνοδεύονται µε σοβαρές παθήσεις σε ένα ευρύ φάσµα οργανισµών. Εικόνα 5: οµή ποικίλων πρωτεογλυκανών µεταξύ των οποίων και οι perlecan και aggrecan (Schwartz and Domowicz, 2004) - 10 -
Εισαγωγή Έχουν ανακαλυφθεί τουλάχιστον 30 πρωτεογλυκάνες που ανιχνεύονται στην εξωκυττάρια ύλη, στην κυτταρική επιφάνεια και στο κυτταρόπλασµα. Οι οικογένειες των πρωτεογλυκανών παρουσιάζονται στο πίνακα 1 Θέση Πρωτεογλυκάνες εξωκυττάριας ύλης (Υαλεκτίνες) Πρωτεογλυκάνες εξωκυττάριας ύλης (Small Leucine Rich Proteoglycans/ SLRP) Συνδυασµένες µε κολλαγόνο Πρωτεογλυκάνες εξωκυττάριας ύλης Βασική µεµβράνη Πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας ιαµεµβρανικές Πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής Μεµβράνης GPI-linked Ενδοκυτταρικές πρωτεογλυκάνες Μέλη Aggrecan, Versican, Neurocan, Brevican decorin, biglycan, lumican, fibromodulin, collagen IX Perlecan, agrin Syndecan -1,-2,-3 και -4 betaglycan, CD44, CSF-1, thrombomdulin Glypican -1,-2,-3,-4,-5-6 serglycin Πίνακας 1: Οικογένειες πρωτεογλυκανών. - 11 -
Εισαγωγή PERLECAN Η perlecan είναι πιθανόν η σηµαντικότερη πρωτεογλυκάνη της βασικής µεµβράνης. Αποµονώθηκε για πρώτη φορά από τον Engelbreth-Holm-Swarm όγκο ποντικού (Ηassell et al., 1980). Ο πρωτεινικός κορµός της perlecan (περίπου 400 kda) φέρει πολλές λειτουργικές περιοχές και το αµινοτελικό του άκρο φέρει 3 αλυσίδες θειικής ηπαράνης (Noonan et al., 1991) (Εικόνες 6, 7). Η perlecan αποτελείται από 5 λειτουργικές περιοχές οι οποίες παρουσιάζουν οµολογία µε πρωτεϊνικά µοτίβα που συµµετέχουν στην µεταφορά και πρόσληψη λιπιδίων όπως ο υποδοχέας των LDL (Low Density Lipoprotein), στην κυτταρική αύξηση όπως η λαµινίνη και το µόριο κυτταρικής προσκόλλησης N-CAM και στην µεταγωγή µυνηµάτων όπως ο επιδερµικός αυξητικός παράγοντας (EGF). Επιπρόσθετα, διαθέτει πολλαπλούς Ν- και Ο- ολιγοσακχαρίτες προσδεµένους στον πρωτεινικό κορµό (Εικόνα 6). Εικόνα 6: οµή της perlecan όπου απεικονίζονται οι δοµικές περιοχές του πρωτεϊνικού κορµού (ΙΙ-V) αλλά και οι αλυσίδες θεϊικής ηπαράνης (περιοχή Ι) (Whitelock et al., 2008). - 12 -
Εισαγωγή οµή και λειτουργία της perlecan Στην perlecan (Εικόνα 6), η περιοχή Ι καταλαµβάνει το αµινοτελικό άκρο του µορίου διαθέτει 3 συνεχόµενες επαναλήψεις (δύο στα πτηνά) του πολύ καλά συντηρηµένου τριπεπτιδίου SGD (ser-gly-asp), που αντιστοιχεί στα πιθανά σηµεία πρόσδεσης γλυκοζαµινογλυκάνων (Noonan et al., 1991. Kokenyesi and Silbert, 1995. Hummel et al., 2004). Επίσης, διαθέτει και ένα στοιχείο SEA (Sperm protein Enterokinase Agrin) το οποίο επιταχύνει τη σύνθεση θειικής ηπαράνης, πολύ κοντά στα σηµεία πρόσδεσης των γλυκοσαµινογλυκανών (Bork and Patthy, 1995). Η περιοχή ΙΙ παρουσιάζει οµολογία µε τον υποδοχέα των λιποπρωτεινών LDL. Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις που υποστηρίζουν ότι η perlecan δύναται να συµµετέχει στο µεταβολισµό των LDL (Iozzo et al., 1994). Η περιοχή ΙΙΙ εµφανίζει οµολογία µε τις ΙVa και IVb δοµές του µικρού βραχίονα της α αλυσίδας της λαµινίνης. Οι 3 σφαιρικές δοµές (LamB µονάδες) συνδέονται µεταξύ τους µε σειρές επαναλήψεων που µοιάζουν µε τον επιδερµικό αυξητικό παράγοντα EGF (LΕ µονάδες). Επιπρόσθετα, στην perlecan στον ποντικό αλλά και σε πιο πρωτόγονους οργανισµούς όπως στο νηµατώδη C. elegans (Rogalski et al., 1993) απαντάται µια ακολουθία RGD (arg-gly-asp) που είναι γνωστό ότι αναγνωρίζεται από ιντεγκρίνες και προάγει την κυτταρική προσκόλληση. Η περιοχή ΙV της perlecan αποτελείται από διαδοχικές επαναλήψεις όµοιες- ανοσοσφαιρίνης (Ig) και εµφανίζει τη µεγαλύτερη ποικιλοµορφία ανάµεσα στα είδη (15 επαναλήψεις στον ποντικό και 22 στον άνθρωπο) (Εικόνα 7). Οι επαναλήψεις αυτές είναι παρόµοιες µε αυτές του µορίου κυτταρικής προσκόλλησης Ν-CΑΜ και βρίσκονται σε αφθονία σε µόρια υποδοχείς ή κυτταρικής προσκόλλησης και εξασφαλίζουν ισχυρή οµοφιλική σύνδεση. Λειτουργικά η περιοχή αυτή δύναται να συµβάλει στην σταθεροποίηση της εξωκυττάριας ύλης είτε µέσω οµοφιλικής σύνδεσης (διµερισµός της perlecan) είτε µέσω ετεροφιλικής σύνδεσης µε άλλα µόρια της εξωκυττάριας ύλης. Στην περιοχή ΙV και συγκεκριµένα στην επανάληψη όµοια Ιg3 (α.α. 1765-1858) - 13 -
Εισαγωγή πρoσδένεται η εντακτίνη µε µεγάλη συγγένεια (Kvansakul et al., 2001) και η σύνδεση αυτή συµβάλλει στον φυσιολογικό σχηµατισµό και λειτουργία της βασικής µεµβράνης. Η περιοχή ΙV κωδικοποιείται από 40 εξόνια και µπορεί να υπόκειται σε εναλλακτικό µάτισµα (Noonan and Hassell, 1993). Εικόνα 7: Σύγκριση των δοµικών στοιχείων του πρωτεϊνικού κορµού της perlecan σε άνθρωπο, ποντικό και νηµατώδη (Rogalski et al., 2001). Η περιοχή V της perlecan στο καρβοξυτελικό άκρο του µορίου είναι οµόλογη µε τη καρβοξυτελική περιοχή της αλυσίδας α της λαµινίνης. Οι 3 σφαιρικές δοµές (LG modules) εναλλάσσονται µε 4 επαναλήψεις δοµών παρόµοιων µε τον επιδερµικό αυξητικό παράγοντα EGF (LΕ modules). Το πρότυπο αυτό απαντάται συχνά σε µόρια που εµπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό. Οι LG δοµές (κυρίως η LG3) διαθέτουν µεγάλη βιολογική δραστηριότητα καθώς διεκπεραιώνουν τις αλληλεπιδράσεις µε πλήθος µορίων. Η LG2 εξασφαλίζει ισχυρότατη σύναψη µε το κολλαγόνο ΧVIII/ endostatin το οποίο συνυπάρχει στη βασική µεµβράνη συµβάλοντας στη διατήρηση της δοµικής ακεραιότητας της βασικής µεµβράνης (Mongiat et al., 2003). Η περιοχή V του µορίου της perlecan περιέχει δύο συντηρηµένες αλληλουχίες των αµινοξέων LRE (1 στον ποντικό), οι οποίες στην s-λαµινίνη αναγνωρίζονται από κινητικούς νευρώνες και πιθανόν να έχει ρόλο στην προέκταση αξόνων. Επιπλέον, περιέχει - 14 -
Εισαγωγή δύο τετραπεπτίδια SGΧG που αποτελούν επιπρόσθετα δυνητικά σηµεία αλληλεπίδρασης µε γλυκοζαµινογλυκάνες άλλων προτεογλυκανών (Tapanadechopone et al., 1999). Σύγκριση των λειτουργικών περιοχών του πρωτεϊνικού κορµού της perlecan στον άνθρωπο, ποντικό και νηµατώδη παρουσιάζεται στην Εικόνα 7. Η perlecan είναι προϊόν ενός µόνο γονιδίου το οποίο βρίσκεται στο χρωµόσωµα 1 στον άνθρωπο (Dodge et al., 1991) και στο χρωµόσωµα 4 στον ποντικό (Chakravarti et al., 1991). Το γονίδιο της perlecan στον άνθρωπο καλύπτει πάνω από 120 kb συνεχούς DNA και κωδικοποιείται από 94 εξόνια (Iozzo and Murdoch, 1996). Και στα ασπόνδυλα έχουν αναγνωριστεί πρωτεΐνες οµόλογες µε την perlecan. Στο νηµατώδες C. elegans, η perlecan κωδικοποιείται από το γονίδιο unc-52 το οποίο βρίσκεται στο χρωµόσωµα ΙΙ και περιλαµβάνει 37 εξόνια (Rogalski et al., 1993. Mullen et al., 1999). Στο έντοµο Drosophila αναγνωρίστηκε το γονίδιο trol (terribly reduced optic lobes) στο χρωµόσωµα Χ ή 1 και µέχρι σήµερα έχουν καταγραφεί 140 trol αλληλόµορφα (Adams et al., 2000. Friedrich et al., 2000. Voigt et al., 2002). Ισοµορφές της perlecan έχουν αναγνωριστει και στον ποντικό και στο νηµατώδες C. elegans. Για παράδειµα, στον Engelbreth-Holm-Swarm όγκο ποντικού βρέθηκαν µόρια της perlecan µε 3 επιπλέον επαναλήψεις όµοιες-ανοσοσφαιρίνης (Ιg) και το µέγεθος των µεταγράφων ήταν µεγαλύτερο γεγονός που αποδίδεται σε εναλλακτικό µάτισµα στην περιοχή ΙV του µορίου (Noonan and Hassell, 1993). Στην ήδη υπάρχουσα πολυπλοκότητα του πρωτεϊνικού κορµού θα πρέπει να προσθέσουµε και τις µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις που αφορούν κυρίως τις αλυσίδες γλυκοζαµινογλυκάνης και που οδηγούν σε διάφορες ισοµορφές του αρχικού µορίου. Η perlecan στα θηλαστικά φέρει κυρίως αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης. Σε µερικές περιπτώσεις µπορεί να φέρει αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης µαζί µε θειϊκής χονδροιτίνης (στο χόνδρο), ή θειϊκής χονδροιτίνης µαζί µε θειϊκής δερµατάνης ή να εκκρίνεται χωρίς γλυκοζαµινογλυκάνες (Isemura et al., 1987. Klein et al., 1988. lozzo 1989. lozzo and Hassell, 1989. Hassell et al., - 15 -
Εισαγωγή 1992. Danielson et al., 1992. Kokenyesi and Silbert, 1995. Couchman et al., 1996. Dolan et al., 1997. Graham et al., 1999). Επιπρόσθετα, οι αλυσίδες γλυκοζαµινογλυκάνης δείχνουν ετερογένεια τόσο στο µέγεθος (30-70 kda) όσο και στο βαθµό θειϊκωσης. Από την βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι η perlecan είναι από τα κύρια µόρια της εξωκυττάριας ύλης και είναι εξαιρετικά διαδεδοµένη σε όλες τις βασικές µεµβράνες ιστών και οργάνων όπως στο νευροεξωδέρµα (Cohen et al., 1994), στο χόνδρο (SundarRaj et al., 1995), στο µυελό των ιστών (Klein et al., 1994), στο δέρµα, στο αυτί, στο στήθος, στην καρδιά, στα αιµοφόρα αγγεία, στο θύµο αδένα, στο πνεύµονα, στα νεφρά (Couchman and Ljubimon, 1989), στο πλακούντα και στο προστάτη (Murdoch et al., 1994. Iozzo, 1994. Xinnong and Couchman, 2001). Ανιχνεύεται επίσης και σε καρκινικές σειρές όπως στα F9 εµβρυϊκά κύτταρα (Chakravarti et al., 1993), σε µελανώµατα (Cohen et al., 1994) και στα καρκινώµατα του στήθους (lozzo and Hassell, 1989. Iozzo, 1994). Μοριακές αλληλεπιδράσεις της perlecan Μια γρήγορη µατιά στην δοµή της perlecan είναι αρκετή για να πείσει ότι εµπλέκεται σε πληθώρα βιολογικών διεργασιών. Μερικές λειτουργίες επιτυγχάνονται µέσω των αλυσίδων θειικής ηπαράνης οι οποίες λειτουργούν σαν µοριακά κόσκινα στις βασικές µεµβράνες (Farquhar, 1982), ενώ για άλλες λειτουργίες όπως η κυτταρική προσκόλληση (Hayashi et al., 1992. Chakravarti et al.,1995), ο µεταβολισµός των LDL, η ανάπτυξη και προέκταση των νευριτών (Yamaguchi, 2001) απαιτείται κυρίως ο πρωτεϊνικός κορµός. Πολλοί αυξητικοί παράγοντες όπως ο FGF (Fibroblast Growth Factor) και ο PDGF (Plateletderived Growth Factor) µπορούν να προσδεθούν όχι µόνο στις αλυσίδες γλυκοζαµινογλυκάνης αλλά και στον πρωτεινικό κορµό (Whitelock et al., 1996. Gohring et al., 1998. Mongiat et al., 2000). Συνεπώς, είναι απαραίτητος ο συνεργισµός αλυσίδων γλυκοζαµινογλυκανών και πρωτεϊνικού κορµού για την εξασφάλιση της δοµικής και λειτουργικής ακεραιότητας του µορίου. - 16 -
Εισαγωγή 1. Συγκρότηση της βασικής µεµβράνης Η ικανότητα της perlecan να διµερίζεται κάτω από ουδέτερες ισοτονικές συνθήκες (Yurchenco et al., 1987) αλλά και οι ετεροφιλικές συνδέσεις που συνάπτει µε άλλα µόρια της εξωκυττάριας ύλης δείχνει ότι συµµετέχει ενεργά στη σταθεροποίηση της εξωκυττάριας ύλης συµπεριλαµβανοµένης και της βασικής µεµβράνης (Εικόνα 8). Βιοχηµικές µελέτες έδειξαν την ικανότητα της perlecan να αλληλεπιδρά µε µόρια της εξωκυττάριας ύλης (Εικόνα 9) όπως η λαµινίνη, η εντακτίνη, η ινονεκτίνη και το κολλαγόνο IV (Laurie et al., 1986. Isemura et al., 1987. Yurchenco et al., 1987. Heremans et al., 1990. Battaglia et al., 1992. Iozzo et al., 1994. Yurchenco et al., 2002). Η perlecan φαίνεται να βρίσκεται σε πολύ στενή σύνδεση µε τα µόρια αυτά αφού για να αποµονωθεί από τον ΕΗS όγκο ποντικού ήταν απαραίτητη η χρήση ισχυρών αποδιατακτικών παραγόντων όπως η υδροχλωρική γουανιδίνη (Yurchenco et al., 1987). Η perlecan µέσω των αλυσίδων θειικής ηπαράνης αλληλεπιδρά µε τη λαµινίνη-1, το κολλαγόνο IV και την ινονεκτίνη ενώ µέσω του πρωτεϊνικού κορµού της αλληλεπιδρά µε την εντακτίνη. Η θέση δέσµευσης της perlecan στη λαµινίνη έχει εντοπιστεί στην E3 περιοχή του καρβοξυτελικού άκρου της α1 αλυσίδας και σε µια κεντρική περιοχή στην τριπλή έλικα του κολλαγόνου ΙV και στην G2 περιοχή της εντακτίνης (Battaglia et al., 1992. Hopf et al., 1999. Kvansakul et al., 2001). Εικόνα 8: Σχηµατική απεικόνιση τυπικής βασικής µεµβράνης (Yurchenco et al., 2002) - 17 -