ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ

Transcript

1 ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Η επιστήμη που ασχολείται με τη βιολογία των μικροοργανισμών, τις νόσους που προκαλούν την διάγνωση των νόσων, την πρόληψη αυτών και τη συμβολή στην διαμόρφωση της θεραπείας των νόσων.

2 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΙΟΙ ΠΑΡΑΣΙΤΑ ΜΥΚΗΤΕΣ (PRIONS)

3 4- Malaria 7- Tuberculosis 9- Hepatitis B 6- HIV/AIDS 3- Food poisoning 5- Strep throat 2- Influenza 8- Lyme disease 1- Giardiasis

4 ΑΞΙΩΜΑΤΑ ΤΟΥ KOCH (1882) Το αίτιο της λοίμωξης πρέπει να είναι παρόν σε κάθε περίπτωση της νόσου Ο μικροοργανισμός να απομονωθεί από την εστία της λοίμωξης και να αναπτυχθεί in vitro για μερικές γενεές Ο μικροοργανισμός ενιέμενος σε πειραματόζωο πρέπει να προκαλεί την ίδια λοίμωξη Ο ίδιος μικροοργανισμός πρέπει να απομονωθεί από το πειραματόζωο

5 Μικροβιολογικές τεχνικές Επίπεδα Πληροφορίας Γενετική Πληροφορία Ανοσολογική Πληροφορία Βιοχημική Πληροφορία Μικροσκοπική Πληροφορία Μακροσκοπική Πληροφορία Αξία Πληροφορίας

6 Μικροσκόπηση

7 Είδη μικροσκοπίων Σύνθετο ή κοινό Ηλεκτρονικό Αντιθέτου φάσεως Πολωτικό Σκοτεινού πεδίου Φθορισμού Στερεοσκοπικό 1675 Leenwenhoek : ανακάλυψε τους μικροοργανισμούς

8 Σύνθετο ή κοινό μικροσκόπιο Το πιο πολύ χρησιμοποιούμενο Αντικειμενικοί & προσοφθάλμιοι φακοί: 10χ 2500χ Διακριτική ικανότητα αντιστρόφως ανάλογη μήκους κύματος ακτινοβολίας

9 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Τα ηλεκτρόνια ως ακτινοβολία μικρού μήκους κύματος Μεγέθυνση: χ χ Όχι ζώντες οργανισμοί Εικόνα πάντα ασπρόμαυρη

10 Μικροσκόπιο αντιθέτου φάσεως Ζωντανό υλικό Χωρίς χρώση & επεξεργασία Διαφορετικοί δείκτες διάθλασης This Phase Contrast image of blood containing colonies of yeast markers have proven antibody positive for Candida Albicans

11 In this picture, monolayers were permeablized and stained with antisera to Leishmania amastigotes followed by FITCconjugated anti-igg. Amastigotes appear green. Macrophages were counterstained with Propridium iodide. Nuclei appear red. Μικροσκόπιο φθορισμού Αποκάλυψη ουσιών που φθορίζουν Αυτο-φθορισμός Ετερο-φθορισμός

12 Μέθοδοι άμεσης εξέτασης Νωπό παρασκεύασμα Ούρα Κόπρανα Κολπικό έκκριμα

13 Μέθοδοι άμεσης εξέτασης Νωπό παρασκεύασμα Ούρα Πλεονεκτήματα Κόπρανα Γρήγορη Κολπικό έκκριμα Ειδική Μειονεκτήματα Μικρή διαχωριστική εικανότητα Εμπειρία

14 Μέθοδοι άμεσης εξέτασης Νωπό παρασκεύασμα με ΚΟΗ Βιολογικό υλικό ύποπτο για μύκητες Δέρμα Νύχια Τρίχες Υγρά αναρρόφησης

15 Μέθοδοι άμεσης εξέτασης Νωπό παρασκεύασμα με ΚΟΗ Βιολογικό Πλεονεκτήματα υλικό ύποπτο για μύκητες Δέρμα Γρήγορη Νύχια Ειδική Τρίχες Μειονεκτήματα Υγρά αναρρόφησης Μικρή διαχωριστική ικανότητα Εμπειρία

16 Χρώσεις μικροβίων Απλές ή γενικές: Σινική μελάνη Χρώση ιωδίου (Lugol) Kυανό μεθυλενίου Σύνθετες γενικές χρώσεις: χρώση Gram οξεάντοχη χρώση Ειδικές χρώσεις :σπόρων, ελύτρων, βλεφαρίδων, ρικετσιών, σπειροχαιτών, Χρώσεις με φθοριοχρώματα

17

18 ΒΕΝΖΟΛΙΟ (ΒΕΝΖΕΝΕ) PhH ή ΦH Το βασικό στοιχείο της χημικής δομής των χρωστικών. ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Ένας υγρός υδρογονάνθρακας C 6 H 6 παράγωγο της λιθανθρακόπισσας. Απορροφά ηλεκτομαγνητική ενέργεια μη ορατή (200nm). Άχρωμος ουσία.

19 ΧΡΩΜΟΦΟΡΕΣ ΟΜΑΔΕΣ (Chromophores) Χημική ομάδα που δίνει συγκεκριμένο χρώμα σε μια ένωση. Η ένταση του χρώματος μιας χρωστικής εξαρτάται από τις χρωμοφόρες ομάδες που περιέχει. Η σύζευξη δύο ή περισσότερων χρωμοφόρων ομάδων προκαλεί μετατόπιση της απορρόφησης της χρωστικής σε μικρότερα ή μεγαλύτερα μήκη κύματος. - ΥΠΟΧΡΩΜΙΚΗ/ΜΠΛΕ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ(hypochronic/blue shift) - ΒΑΘΥΧΡΩΜΙΚΗ/ΕΡΥΘΡΗ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ(bathochromic/red shift)

20 ΟΙ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΧΡΩΜΟΦΟΡΕΣ ΟΜΑΔΕΣ

21

22 ΑΥΞΟΧΡΟΜΕΣ ΟΜΑΔΕΣ (auxochromes) Είναι μιά ομάδα ατόμων, ιόντων, που μπορούν να είναι δέκτες ή δότες ηλεκρονίων ή και τα δύο (έχουν μη δεσμικά ηλεκτρόνια σθένους). Μεταδίδουν την ιδιότητα του ηλεκτρολυτικού διαχωρισμού, τον διαχωρισμό του μορίου της χρωστικής στα συστατικά της ή σε άτομα, δημιουργώντας δεσμούς αλάτων με τα βακτήρια, ενισχύοντας την αντίδραση ενός δείγματος με την χρωστική. Δεν δίνουν χρώμα στην χρωστική αλλά επηρρεάζουν την έντασή της. Ενισχύουν τη δράση του χρωμοφόρου στο να απορροφήσει την ηλεκτρομαγνητική ενέργεια.

23 ΟΙ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΑΥΞΟΧΡΩΜΕΣ ΟΜΑΔΕΣ

24 ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ ΒΕΝΖΟΛΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΣΤΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΩΝ ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ Βενζολικές ενώσεις: aπό δύο ή περισσότερους βενζολικούς δακτυλίους συνδεδεμένους με ισχυρούς χημικούς δεσμούς (chromophores, auxocromes) Τολουόλη C 7 H 8 αντικατάσταση Η + με CH 3 _ Φαινόλη C 6 C 5 OH - αντικατάσταση H + με OH - Ανιλίνη C 6 H 5 NH 2 (ελαιώδες υγρό) τις περισσότερες χρωστικές στην Μικροβιολογία αντικατάσταση Η + με ΝΗ 2 _ ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ ΑΝΙΛΙΝΗΣ

25 ΧΗΜΙΚΗ ΔΟΜΗ ΧΡΩΣΤΙΚΗΣ

26 ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ Φυσικές Τεχνικές: είναι άλατα υπό μορφή σκόνης ή κρυστάλλων ΒΑΣΙΚΕΣ: Αποτελούνται από θετικό ιόν (cationic auxochrome), Όχι σύμφωνα με την αντίδρασή τους στο ph Xρησιμοποιούνται περισσότερο από τις όξινες Κυανούν του μεθυλενίου, κρυσταλλικό ιώδες, πράσινο του μαλαχίτη, σαφρανίνη ΧΡΩΜΑΤΙΝΗ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΑ ΟΞΙΝΕΣ: Αποτελούνται από αρνητικό ιόν (anionic auxochrome) Ηωσίνη, όξινη φουξίνη, νιγροσίνη ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ

27 ΓΙΑΤΙ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΜΕ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΟ ΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ? To έγχρωμο θετικό ιόν σε μια βασική χρωστική έλκεται από τα αρνητικά φορτία του βακτηριακού κυττάρου. Οι όξινες δεν προσελκύονται από τους περισσότερους τύπους βακτηρίων, επειδή τα αρνητικά ιόντα της χρωστικής απωθούν την αρνητικά φορτισμένη βακτηριακή επιφάνεια.

28 Απλές Διαφορικές Ειδικές

29 ΑΠΛΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ SIMPLE STAIN Είναι υδατικά ή αλκοολικά διαλύματα μιας μόνο βασικής χρωστικής. Συνήθως μπλε του μεθυλενίου, βασική φουξίνη, κρυσταλλικό ιώδες. Μορφολογία των βακτηρίων (σχήμα, διάταξη). Στο μονιμοποιημένο δείγμα για ΟΡΙΣΜΕΝΟ χρονικό διάστημα ξέπλυμα στέγνωμα παρατήρηση

30 SIMPLE STAIN

31 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗΣ Η μονιμοποίηση των μικροοργανισμών σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Σκοτώνει τα μικρόβια. Συντηρεί τα διάφορα μέρη των μικροβίων ( παγώνουν ). Heat fixing (θέρμανση σε φλόγα) Chemical fixing (με εφαρμογή διαλύματος μεθυλικής αλκοόλης για 1 min, διατήρηση έμορφων στοιχείων, καθαρό υπόστρωμα)

32 ΔΙΑΦΟΡΙΚΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ Αντιδρούν διαφορετικά στα διάφορα είδη μικροβίων. Χρησιμοποιούνται για τον διαχωρισμό διαφορετικών ειδών μικροβίων. Gram χρώση, acid-fast stain.

33 Κύρια χρωστική GRAM ΧΡΩΣΗ primary stain Σταθεροποιητής mordant Αποχρωματισμός decolorization Βασική αντίθεσης χρωστική counterstain positive negative

34 Hans Christian Joachim Gram Danish Bacteriologist Η Gram χρώση είναι πολύ σημαντική. Αναπτύχθηκε το 1884 από το Δανό βακτηριολόγο. Μία από τις πιο χρήσιμες χρώσεις της Μικροβιολογίας επειδή ταξινομεί τα βακτήρια σε δύο μεγάλες κατηγορίες. Gram (+), Gram (-). Aνακάλυψε ότι το κρυσταλλικό ιώδες χρωματίζει κάποια βακτήρια ενώ άλλα όχι μετά τον αποχρωματισμό. Gram (+) θετικά αυτά που διατηρούν το χρώμα, Gram (-) αρνητικά αυτά που όχι.

35

36 ΧΡΩΣΗ ΚΥΑΝΟΥ ΤΟΥ ΜΕΘΥΛΕΝΙΟΥ Χρωστικό διάλυμα A. Μητρικό διάλυμα Μπλε του μεθυλενίου Αιθυλική αλκοόλη 95 ο Β. Διάλυμα εργασίας Υδατικό διάλυμα 1% ΚΟΗ dh2o Μητρικό διάλυμα 1g 100ml 1ml 99ml 30ml

37 Τεχνική χρώσης Κυανού του Μεθυλενίου 1. Επίστρωση του παρασκευάσματος με κρίκο πάνω σε καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα. 2. Στέγνωμα στον αέρα για λίγα λεπτά. 3. Μονιμοποίηση σε φλόγα. 4. Μεταφορά στη σχάρα της λεκάνης χρώσης. 5. Προσθήκη διαλύματος εργασίας (να καλύψει ΟΛΗ την επιφάνεια της πλάκας). Παραμονή 1 min. 6. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης. Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο νερό. 7. Τοποθέτηση πλάκας σε κατακόρυφη θέση να στεγνώσει. 8. Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό. Όλα τα βακτήρια μπλε Αν σπορογόνα, μικροβιακό σώμα μπλε, σπόρος σαν κενός χώρος

38 R. Koch, 1877

39 Αρχή της μεθόδου Η ουσία πρέπει να είναι χρωμογόνος Η ουσία πρέπει να διασπάται σε ιόντα(+) και (-) Cationic dye Acid dye

40

41 ΧΡΩΣΗ GRAM Χρωστικά διαλύματα Κρυσταλλικό ιώδες (μπλε χρωστική) Διάλυμα Lugol (στυπτικό = σταθεροποίηση της χρωστικής στη μικροβιακή μεμβράνη) Μείγμα οινόπνευμα - ακετόνη (αποχρωματιστικός διαλύτης) Σαφρανίνη (κόκκινη χρωστική) Hans Christian Gram, 1884

42 Τι χρησιμοποιούμε σε μια χρώση Gram?

43 Gram (-) Gram (+)

44 Χρώση Gram

45

46 Εξήγηση χρώσης Gram Θεωρία της οξειδωτικής δράσης του ιωδίου: ιώδιο ελαττώνει το ισοηλεκτρικό σημείο, μη δράση οινοπνεύματος Gram (+) Θεωρία διαπερατότητας κυτταρικού τοιχώματος Θεωρία ριβονουκλεονικού μαγνησίου: ριβονουκλεονικό Mg σε μεγάλο πολυμερισμό, ένωση με ιώδιο, ενώσεις μεγάλης μοριακής δομής

47 Gram (+)

48 Gram (-)

49 ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΣ Ο ΤΡΟΠΟΣ ΠΟΥ ΣΤΡΩΝΟΥΜΕ ΕΝΑ ΠΛΑΚΑΚΙ ΛΑΘΟΣ ΣΩΣΤΟ

50 Τεχνική χρώσης Gram 1. Επίστρωση του παρασκευάσματος με κρίκο πάνω σε καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα. 2. Στέγνωμα στον αέρα για λίγα λεπτά. 3. Μονιμοποίηση σε φλόγα. 4. Μεταφορά στη σχάρα της λεκάνης χρώσης. 5. Προσθήκη διαλύματος κρυσταλικού ιώδους (να καλύψει ΟΛΗ την επιφάνεια της πλάκας). Παραμονή 1 min. 6. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης. Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο νερό. 7. Προσθήκη διαλύματος Lugol. Παραμονή 1 min. 8. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύση. 9. Προσθήκη αποχρωματιστικού διαλύτη σε διαδοχικές φάσεις, ενώ ενδιάμεσα ξέπλυμα με νερό βρύσης (μέχρι μακροσκοπικού αποχρωματισμού). 10. Προσθήκη διαλύματος σαφρανίνης. Παραμονή 10 sec. 11. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύση. Στέγνωμα. 12. Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό.

51 BHMA 1: Το μονιμοποιημένο δείγμα καλύπτεται από μια βασική ιώδη χρωστική συνήθως ΚΡΥΣΤΑΛΛΙΚΟ ΙΩΔΕΣ ΚΥΡΙΑ ΧΡΩΣΤΙΚΗ Βάφει όλα τα κύτταρα.

52 BHMA 2: Ξέπλυμα με νερό

53 BHMA 3: Το δείγμα καλύπτεται με ΙΩΔΙΟΥΧΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΤΗΣ

54 BHMA 4: Ξέπλυμα με νερό

55 ΒΗΜΑ 5 ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΣ με ΑΛΚΟΟΛΗ ή διάλυμα ΑΛΚΟΟΛΗΣ-ΑΚΕΤΟΝΗΣ αποχρωματίζει ορισμένα κύτταρα

56 BHMA 6 : Ξέπλυμα με νερό

57 ΒΗΜΑ 7 ΣΑΦΡΑΝΙΝΗ για 15 sec ΒΑΣΙΚΗ ΚΟΚΚΙΝΗ ΧΡΩΣΤΙΚΗ

58 ΒΗΜΑ 8 ξέπλυμα-στέγνωμα

59 Gram Staining Procedure

60 Staphylococcus & Streptococcus pneumoniae

61 Clostridium perfringens

62 Candida albicans

63 Escherichia coli

64 Neisseria gonorrhoeae

65 ΧΡΩΣΗ Ziehl-Neelsen Χρωστικά διαλύματα Φαινικούχος φουξίνη (κόκκινη χρωστική) Αποχρωματιστικό διάλυμα Πυκνό HCl 3ml Αιθυλική αλκοόλη 97ml Μπλε του μεθυλενίου κατά Loeffler (μπλε χρωστική)

66 Εξήγηση χρώσης Ziehl-Neelsen Ύπαρξη του μυκολικού οξέος στο τοίχωμα των μυκοβακτηριδίων Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται από το 1882, όταν την εισήγαγε ο Ziehl και την τροποποίησε το 1883 ο Neelsen. Τα μυκοβακτηρίδια χρωματίζονται κόκκινα, ενώ τα άλλα βακτήρια χρωματίζονται μπλε.

67 Mycobacteria Gram(+) Gram(-)

68 Εξήγηση χρώσης Ziehl-Neelsen Κηρός D (Wax D) στη σύνθεση του τοιχώματος των μυκοβακτηριδίων Πολύπλοκο μόριο και ανήκει χημικώς στα πεπτιδογλυκολιπίδια. Αποτελείται από πολυσακχαριδική αλυσίδα που είναι ενωμένη με εστερικό δεσμό με το μυκολικό οξύ και με αμιδικό δεσμό, μέσω της γαλακτοζαμίνης με πεπτιδική αλυσίδα που αποτελείται από 3 αμινοξέα D και L αλανίνη, D-γλουταμινικό οξύ και α και ε-διαμινοαμιλικό οξύ.

69 Εξήγηση χρώσης Ziehl-Neelsen Κανονικοί κηροί εστέρες μακρών λιπαρών οξέων με λιπαρές αλκοόλες) Ιδιαίτεροι λιποπολυσακχαρίτες σε ορισμένα είδη, όπως ο Cord factor (μυκοσίδιο-mycoside) ή σχοινοειδής παράγων στο Μ. tuberculosis, που αποτελείται από τρεαλόζη ενωμένη με δύο μόρια μυκολικού οξέος

70 Τρεαλόζη

71 Ο βασικός ρόλος του μυκολικού οξέος στην οξεάντοχη χρώση Ziehl-Neelsen H ειδική διάταξη, δίκην σχοινιού (ropelike), του πεπτιδογλυκολιπιδίου (κηρός D) έχει ως αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη παροχή μονάδων μυκολικού οξέος για να αντιδράσουν με τη φουξίνη. Tα κορυνοβακτηρίδια και οι ακτινομύκητες, που έχουν στο τοίχωμά τους διάφορα μυκολικά οξέα, χωρίς όμως την ειδική αυτή διαμόρφωση του πεπτιδογλυκολιπιδίου, δε βάφονται.

72 Ο βασικός ρόλος του μυκολικού οξέος στην οξεάντοχη χρώση Ziehl-Neelsen μυκοβακτηρίδια, τα οποία έχουν υποστεί κατεργασία με αλκοολούχο ΚΟΗ, που απομακρύνει τα λιποειδή, ή έχουν εκτεθεί στη δράση της ισονιαζίδης, που αναστέλλει τη σύνθεση του μυκολικού οξέος, δεν βάφονται με τη χρώση Ziehl-Neelsen. Η ιδιότητα της οξεαντοχής-αλκο ολαντοχής. χάνεται, μερικά ή ολικά, για ορισμένα είδη σε κάποια στάδια ανάπτυξής τους. Στα ταχέως αναπτυσσόμενα δυνατόν να είναι οξεάντοχα, μόνο το 10% των μικροβιακών κυττάρων.

73 Τεχνική χρώσης Ziehl-Neelsen 1. Επίστρωση του παρασκευάσματος με κρίκο πάνω σε καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα. 2. Στέγνωμα στον αέρα για λίγα λεπτά. Μονιμοποίηση. 3. Μεταφορά στη σχάρα της λεκάνης χρώσης. 4. Προσθήκη διαλύματος πυκνής φαινικούχου φουξίνης (να καλύψει ΟΛΗ την επιφάνεια της πλάκας). 5. Κάτω επιφάνεια θερμαίνεται πάνω από φλόγα μέχρι να εμφανιστούν ατμοί (χωρίς να στεγνώσει η χρωστική) 6. Παραμονή 5 min. 7. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης. Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο νερό. 8. Προσθήκη αποχρωματιστικού διαλύτη σε διαδοχικές φάσεις, ενώ ενδιάμεσα ξέπλυμα με νερό βρύσης (μέχρι μακροσκοπικού αποχρωματισμού). 9. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης 10. Προσθήκη μπλε μεθυλενίου. Παραμονή 1 min. 11. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης. Στέγνωμα. 12. Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό.

74 ΒΗΜΑ 1: Μονιμοποίηση

75 ΒΗΜΑ 2: Προσθήκη διαλύματος πυκνής φαινικούχου φουξίνης. ΠΡΟΣΟΧΗ: κάλυψη ΟΛΗ της επιφάνειας της πλάκας.

76 ΒΗΜΑ 3: Με τη χρήση λύχνου Bunsen θέρμανση κάτω επιφάνειας μέχρι να εμφανιστούν ατμοί (χωρίς να στεγνώσει η χρωστική) Παραμονή 5 min. ΠΡΟΣΟΧΗ: χρησιμοποίηση πολύ φλόγας μπορεί να σπάσει το πλακάκι.

77 ΒΗΜΑ 4: Ξέπλυμα με νερό Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο νερό.

78 ΒΗΜΑ 5: Προσθήκη αποχρωματιστικού διαλύτη (3% οξινισμένο οινόπνευμα) σε διαδοχικές φάσεις για 5 min, ενώ ενδιάμεσα ξέπλυμα με νερό βρύσης ΠΡΟΣΟΧΗ: μέχρι μακροσκοπικού αποχρωματισμού

79 Over decolorized Under decolorized

80 ΒΗΜΑ 6: Ξέπλυμα με νερό Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο νερό.

81 ΒΗΜΑ 7: Προσθήκη μπλε μεθυλενίου. Παραμονή 1 min.

82 ΒΗΜΑ 8: Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης. Στέγνωμα.

83 ΒΗΜΑ 9: Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό. Εξέταση τουλάχιστον 100 οπτικών πεδίων. Σάρωση του παρασκευάσματος σε σχήμα μαιάνδρου

84 ΒΗΜΑ 9: Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό. A F B

85 Αρνητικό αποτέλεσμα μικροσκόπησης Απάντηση: «Κατά την μικροσκοπική εξέταση δεν παρατηρήθηκαν οξεάντοχα βακτηρίδια». Θετικό αποτέλεσμα μικροσκόπησης Απάντηση ανάλογα με τον αριθμό των οξεάντοχων που παρατηρήθηκαν ανά οπτικό πεδίο (ο.π.) (όπως στον παρακάτω πίνακα)

86 Αποτέλεσμα Number of AFB seen None Report No AFB observed 1-2 / 300 fields +/-* 1-9 / 100 fields / 10 fields / field 3+ >9 / field 4+

87 Ειδικότητα - Ευαισθησία Η οξεάντοχη χρώση είναι μη ειδική Τα βραδέως αναπτυσσόμενα μυκοβακτηρίδια είναι σταθερά οξεάντοχα Άλλοι μικροοργανισμοί που δυνατόν να είναι οξεάντοχοι: Nocardia Rhodococcus Legionella micdadi Κύστεις Cryptosporidium spp Κύστεις Cyclospora spp Σπόροι μικροβίων Κοκκία λίπους μερικών μικροβίων Ποσοστό ευαισθησίας 22-80% Αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει φυματίωση Για να είναι (+) το παρασκεύασμα πρέπει να υπάρχουν βάκιλλοι / ml πτυέλου

88 Οξεάντοχα Mycobacterium spp Mycobacterium leprae Nocardia spp Gordonia spp Tsukamurella spp Legionella micdadei Rhodococcus spp Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora Spores B. subtilis Nocardia spp

89 M. tuberculosis M. kansasii M. avium

90 Artifacts Ψευδώς θετικά Πρόσμιξη τροφών Επιμολύνσεις Λάθη στις τεχνικές εμπλουτισμού και χρώσεων Σαπροφυτικά ΑFB Χρήση νερού επιμολυσμένου με ΝΤΜ (συνήθως M. gordonae) Φακοί-κεδρέλαιο

91 Ψευδώς αρνητικά Ακατάλληλο κλινικό δείγμα ανεπαρκής ποσότητα ακατάλληλο δοχείο συνθήκες και χρόνος φύλαξης Μικροσκοπική εξέταση μικρός αριθμός μυκοβακτηριδίων ανεπαρκής χρόνος έλλειψη εμπειρίας Λάθη στον εμπλουτισμό, στις χρώσεις και χρωστικές Τα ταχέως αναπτυσσόμενα μπορεί να φαίνονται οξεάντοχα σε ποσοστό <10% σε πρόσφατο καλλιέργημα και να μη βάφονται με φθορίζουσα χρωστική

92 Παραλλαγές τροποποιήσεις Ζ-Ν Για ανθρώπους που δεν ξεχωρίζουν το κόκκινο χρώμα, μπορεί να γίνει η χρώση με κρυσταλλικό ιώδες και ο μεταχρωματισμός με πικρικό οξύ (μυκοβακτηρίδια μπλε, σε περιβάλλον κίτρινο) Χωρίς την υποβοήθηση της θερμότητας (ψυχρές χρώσεις) Kinyoun, Φθοριοχρώματα Auramine Ο και Rhodamine, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό.

93 Auramine O - Rhodamine 1938 ο Hageman ιδιότητα ορισμένων ουσιών να προσροφούν τις υπεριώδεις ακτίνες και να εκπέμπουν ακτινοβολία μεγαλύτερου κύματος, ορατού με το μάτι. και οι δύο χρωστικές (φαινικούχος φουξίνη και φθοριόχρωμα) συνδέονται με το μυκολικό οξύ του τοιχώματος του μυκοβακτηριδίου.

94 Fluorescent - Auramine Rhodamine

95 Auramine O - Rhodamine το M. fortuitum δεν χρωματίζεται πάντα με auramine μη βιώσιμοι βακίλλοι, με διαφορές στα αποτελέσματα. όσα παρασκευάσματα βρεθούν θετικά με auramine, επανελέγχονται και με τη χρώση της φουξίνης, για να επιβεβαιώσουν το αποτέλεσμα και να φυλάξουν το παρασκεύασμα στο αρχείο.

96 Αποτέλεσμα Φαινικούχος φουξίνη Auramine-Ο Απάντηση 1000Χ 250Χ 450Χ 1-2 / 300 ο.π. 1-2 / 30 ο.π. 1-2 / 70 ο.π. Αμφίβολο, επανάληψη 1-9 / 100 ο.π. 1-9 / 10 ο.π / 50 ο.π / 10 ο.π. 1-9 / 1 ο.π / 10 ο.π / 1 ο.π / 1 ο.π / 1 ο.π. 3 + > 9 / 1 ο.π. > 90 / 1 ο.π. > 36 / 1 ο.π. 4 +