ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΙ

Transcript

1 ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΙ Εργαστήριο Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Λάμπρου Μαρία, M.Sc., Ph.D. Βιοχημικός & Βιοτεχνολόγος

2 Σκοπός της καλλιέργειας ούρων Σκοπός: Να βρεθεί ο µικροοργανισµός που προκάλεσε τη λοίµωξη στο ουροποιητικό σύστηµα. Ταυτοποίηση μικροοργανισμού Μελέτη της ευαισθησίας σε διάφορα αντιβιοτικά Συνεπώς: Επιλογή καταλληλότερου σκευάσματος Παρακολούθηση της πορείας της νόσου και της θεραπευτικής αγωγής

3 Νόσοι όπου ζητείται η καλλιέργεια Πυελονεφρίτιδα ούρων Λοίμωξη των ουροφόρων οδών Μετεγχειριτικές λοιμώξεις στο ουροποιητικό Συγγενείς ανωμαλίες νεφρού και ουροφόρων οδών Εγκυμοσύνη Διαβήτης Ειδικές φλεγμονές (φυματίωση, μυκητίαση, σύφιλη, σπειροχαιτίαση κ.α.)

4 Συλλογή δείγματος Ούρα μέσου ρεύματος Επιμελής καθαρισμός των έξω γεννητικών οργάνων Πρώτα πρωινά ούρα από το μέσο ρεύμα Χρήση αποστειρωμένου φιαλιδίου Δείγμα ούρων των ml Δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε νεογνά, βρέφη και νήπια και ασθενείς

5 Συλλογή δείγματος Ούρα με καθετηριασμό της κύστης Καλός καθαρισμός των έξω γεννητικών οργάνων Απορρίπτονται τα πρώτα ml ούρων Εφαρμόζεται μόνο σε ασθενείς κλινήρεις, αναπήρους κ.α. Περιορισμός: Συχνές επιμολύνσεις

6 Συλλογή δείγματος Ούρα με υπερηβική παρακέντηση της κύστης Αντισηψία του δέρματος Παρακέντιση της ουροδόχου κύστης Καλύτερος τρόπος λήψης κατάλληλου δείγματος Πιο αξιόπιστο και αντιπροσωπευτικό δείγμα για αναζήτηση αναερόβιων Μέθοδος εκλογής για νεογνά, παιδιά και έγκυες γυναίκες

7 Μεταφορά δείγματος Τα ούρα πρέπει να καλλιεργούνται αμέσως μετά την συλλογή τους Αντιθέτως, διατηρούνται για 24h σε θερμοκρασία 4 ο C Αν παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου για >24h τότε απορρίπτεται Ακατάλληλα για μικροβιολογική εξέταση τα ούρα 24h ή από δοχείο νυκτός

8 Μακροσκοπική εξέταση ούρων Θολερότητα των ούρων πυουρία Ιριδισμός βακτηριουρία Γκριζωπή θολερότητα αιματουρία Κυανοπράσινο χρώμα λοίμωξη απο ψευδομονάδα

9 Μικροσκοπική εξέταση ούρων Αφυγοκέντρητα και καλά αναδευμένα ούρα για τον προσδιορισμό πυουρίας Σε κυτταρομετρική πλάκα Neubauer Πυοσφαίρια: 8-10/μl ούρων Τοποθέτηση σταγόνας αφυγοκέντρητων ούρων για τον προσδιορισμό πυουρίας Σε αντικειμενοφόρο πλάκα Πυοσφαίρια: 30 (x400) ή 1-2 (x1000)

10 Μικροσκοπική εξέταση ούρων Σημαντική η μικροσκοπική εξέταση ιζήματος ούρων καθώς η παρουσία και ο αριθμός λευκών και ερυθρών αιμοσφαιρίων είναι ένας παράγοντας, μαζί με την ουροκαλλιέργεια, που θα βοηθήσει στον προσδιορισμό του είδους της ουρολοίμωξης.

11 Μικροσκοπική εξέταση ούρων Χρώση Gram: 10μl αναδευμένων και αφυγοκέντρητων ούρων σε αντικειμενοφόρο πλάκα Στεγνώνουν χωρίς να απλωθούν Χρωματίζονται Απολύτως αναγκαία: Οταν θα χορηγηθεί εμπειρικά αντιμικροβιακή θεραπεία Εκτίμηση τυχόν επιμόλυνσης των ούρων Οταν υπάρχει κλινική συμπτωματολογία και πυουρία, ενώ η καλλιέργεια είναι στείρα

12 Μικροσκοπική εξέταση ούρων

13 Καλλιέργεια ούρων Ημιποσοτική καλλιέργεια: Με κρίκο γνωστής διαμέτρου, 0,01 ή 0,001 ml, μεταφέρουμε μια σταγόνα από τα ούρα στο θρεπτικό υλικό, βουτώντας τον κρίκο κάθετα και προσέχοντας να μην ακουμπήσει στα τοιχώματα του δοχείου. Απλώνουμε την σταγόνα με τον κρίκο και ακολουθεί επώαση. Ανάλογα με τον κρίκο που χρησιμοποιήθηκε, κάθε αποικία που αναπτύσσεται αντιστοιχεί σε 1000 ή 100 CFU/ml ούρων.

14 Καλλιέργεια ούρων Ποσοτική ουροκαλλιέργεια: Ανάμειξη 1 ml ούρων με 4 ml φυσιολογικού ορού 0,01 ml μείγματος ενοφθαλμί- ζεται σε θρεπτικό υλικό Επίστρωση με κρίκο ή γυάλινη ράβδο Επώαση Θρεπτικά υλικά: MacConkey, Κοινό θρεοπτικό άγαρ, Αιματούχο άγαρ και Sabouraud dextrose

15 Αποτέλεσμα καλλιέργειας

16 Ανάγνωση αποτελέσματος Υπολογισμός των CFU/ml ούρων Ταυτοποίηση βακτηρίων Αξιολόγηση αποτελέσματος Αντιβιόγραμμα

17 Αξιολόγηση καλλιεργειών Η αξιολόγηση της ουροκαλλιέργειας γίνεται βάσει των εξής παραγόντων: 1. Αριθμός μικροβίων, και μικτή ή απλή καλλιέργεια 2. Ιστορικό ασθενούς 3. Οικολογία και παθογένεια του μικροβίου που αναπτύχθηκε

18 Μικρόβια που απομονώνονται σε ουροκαλλιέργεια Πάσχουσα περιοχή (νεφροί, κύστη, ουρητήρας) Από περίνεο, ουροσυλλέκτη, καθετήρα Από το στόμιο της ουρήθρας Escherichia coli Klebsiella aerogenes Micrococci Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris Corynobacteria Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus epidermidis Streptococcus faecalis Staphylococcus aureus Citrobacter Salmonela Streptococcus faecium Staphylococcus epidermidis Candida albicans

19 Ανάγνωση καλλιέργειας Ελεγχος αριθμού και μακροσκοπικής εικόνας των αποικιών Ελεγχος για παρουσία μεταβολών στα θρεπτικά υλικά Ελεγχος μικροσκοπικής εικόνας των βακτηρίων, με νωπά και χρωματισμένα κατά Gram παρασκευάσματα

20 Ανάγνωση καλλιέργειας Η καλλιέργεια των ούρων διαφέρει από τις άλλες καλλιέργειες στο ότι μας ενδιαφέρει, εκτός από το είδος του βακτηρίου, και ο αριθμός των βακτηρίων που περιέχονται σε 1ml ούρων

21 Υπολογισμός των CFU/ml ούρων Ποσοτική καλλιέργεια: Ογκος ούρων που καλλιεργήσαμε είναι 0,002ml (δηλ. 0,01 από 1:5 αραίωση, 0,01/5=0,002) Αριθμός αποικιών ανά ml (CFU/ml) θα είναι: ο αριθμός των καταμετρηθέντων αποικιών/0,002 ή ο αριθμός αποικιών x 500 (αραίωση) Παράδειγμα: εάν έχουμε 200 αποικίες: 200:0,002= ή 200x500= βακτήρια/ml ούρων

22 Υπολογισμός των CFU/ml ούρων Ημιποσοτική καλλιέργεια: Ογκος ούρων που καλλιεργήσαμε είναι 0,01 ή 0,001ml Αριθμός αποικιών ανά ml (CFU/ml) θα είναι: ο αριθμός των καταμετρηθέντων αποικιών/0,01 ή 0,001, ή αριθμός αποικιών x 100 ή 1000 αντίστοιχα (δηλ. το αποτέλεσμα της διαίρεσης του 1ml με το 0,01 ή 0,001 αντίστοιχα)

23 Υπολογισμός των CFU/ml ούρων Παραδείγματα: 1. Αν χρησιμοποιήσαμε πιπέτα του 0,01 και μετρήσαμε 200 αποικίες: 200:0,01= ή 200x100= βακτήρια ανά ml ούρων 2. Αν χρησιμοποιήσαμε πιπέτα του 0,001 και μετρήσαμε 100 αποικίες: 100:0,001= ή 100x1000= βακτήρια ανά ml ούρων

24 Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Ανάπτυξη μικροβίου ενός είδους CFU/ml Χαρακτηρισμός Διάγνωση και άνω (10 5 ) Θετική Ουρολοίμωξη ( ) Θετική ( ) Αρνητική Σε παιδιά ουρολοίμωξη Σε ενήλικες υποχώρηση λοίμωξης ή επιμόλυνση Επιμόλυνση ή υποχώρηση λοίμωξης και κάτω (10 3 ) Αρνητική Επιμόλυνση πάντα Κανένα μικρόβιο Στείρα Απουσία μικροβίων

25 Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Εάν αναπτυχθούν δύο είδη μικροβίων και το ένα είναι σε μεγάλο αριθμό (πάνω από ), ενώ το δεύτερο μερικές αποικίες αξιολογείτε το πρώτο και αγνοείτε το δεύτερο Εάν και τα δύο μικρόβια είναι σε μεγάλο αριθμό ( και άνω), μετριούνται ξεχωριστά και αξιολογούνται και τα δύο Εάν και τα δύο μικρόβια είναι σε μικρό αριθμό (κάτω των ή μέχρι ) σε περίπτωση παιδιού θα χαρακτηριστεί ως αρνητικό Εαν αναπτυχθούν τρία είδη μικροβίων ακατάλληλο και επανάληψη

26 Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Επανάληψη ουροκαλλιέργειας: Ακατάλληλο δείγμα Αναπτύχθηκαν περισσότερα από 2 είδη μικροβίων Αναπτύχθηκαν 2 είδη μικροβίων που οικολογικά ανήκουν στο περιβάλλον Ασθενής υπό φαρμακευτική αγωγή (χρήση αντιβιοτικών) Οχι επανάληψη ουροκαλλιέργειας: Στείρα καλλιέργεια Ανάπτυξη 1 μικροβίου και σε αριθμό > /ml ούρων Ανάπτυξη 1-2 αποικιών, δηλαδή αριθμός κάτω των 1000/ml

27 Ψευδή Αποτελέσματα Ψευδώς αρνητική ουροκαλλιέργεια: Χρήση αντιβιοτικών Τοπική χρήση αντισηπτικών Υπερενυδάτωση Απόφραξη περιφερικότερα του σημείου της λοίμωξης Σφάλμα του εργαστηρίου (κακή τεχνική, κακή αξιολόγηση) Ψευδώς θετική ουροκαλλιέργεια: Παραμονή των ούρων σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Κακή προετοιμασία του ασθενούς κακή λήψη δείγματος Υπερεκτίμηση του αποτελέσματος

28 Ταυτοποίηση βακτηρίων Τα πιο συνηθισμένα βακτήρια που προκαλούν ουρολοιμώξεις είναι αυτά της χλωρίδας του εντέρου. Η αναγνώρισή τους θα γίνει κυρίως από τη μορφολογία των αποικιών και τις μεταβολές στο Mac Conkey άγαρ, καθώς και με τις βιοχημικές δοκιμασίες: E. coli: Αποικίες κόκκινες, ινδόλη, MR (++) Klebsiella: Αποικίες κόκκινες, βλεννώδεις, ινδόλη, MR (- - ), ουρία (+) Proteus: Αποικίες άχρωμες με ερπυσμό στο αιματούχο άγαρ, διάσπαση ουρίας (+), PPA (+)

29 Ταυτοποίηση βακτηρίων Pseudomonas aeruginosa: Παραγωγή χαρακτηριστικής χρωστικής και οσμή όμοια με γιασεμί, οξειδάση (+) Enterococcus: Αποικίες κόκκινες, πολύ μικρές, Esculin (+), καταλάση (- ) Staphylococcus: Δεν αναπτύσσονται στο Mac Conkey άγαρ, σε αιματούχο άγαρ λευκωπές κυκλικές αποικίες, καταλάση (+)

30 E. coli Blood agar MacConkey agar

31 Proteus mirabilis Blood agar MacConkey agar

32 Staph. aureus Blood agar

33 Βιοχημικές Δοκιμασίες Δοκιμασία καταλάσης: Καταλάση, ένζυμο που διασπά το υπεροξείδιο του υδρογόνου σε νερό και οξυγόνο. Χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό Σταφυλόκοκκων (θετικοί) από Στρεπτόκοκκους (αρνητικοί). Μέθοδος: Σταγόνα οξυζενέ σε αντικειμενοφόρο πλάκα Ανάμειξη αποικίας. Εκλυση φυσαλίδων αερίου οξυγόνου= θετικό αποτέλεσμα

34 Βιοχημικές Δοκιμασίες Δοκιμασία παραγωγής κοαγκουλάσης (πηκτάσης) Κοαγκουλάση, ένζυμο που προκαλεί πήξη του πλάσματος. Αποτελεί κριτήριο χαρακτηρισμού Σταφυλόκοκκου ως S. aureus. Η δοκιμασία γίνεται μόνο εάν το στέλεχος είναι Gram θετικός κόκκος και παράγει καταλάση

35 Βιοχημικές Δοκιμασίες Δοκιμασία οξειδάσης: Οξειδάση, ένζυμο που παράγουν κυρίως οι Ψευδομονάδες και Ναϊσσέριες. Αντιδραστήριο: διάλυμα παραφαινυλο- διαμίνης 1% (άχρωμο). Η δοκιμασία της οξειδάσης γίνεται για το διαχωρισμό των εντεροβακτηριακών από τις ψευδομονάδες

36 Βιοχημικές Δοκιμασίες Από τα εντεροβακτηριακά, άλλα διασπούν τη λακτόζη και άλλα όχι. Η διάσπαση της λακτόζης έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή όξινων προϊόντων, τα οποία μεταβάλουν το ph του διαφοροποιητικού υλικού (MacConkey) και ο δείκτης αλλάζει χρώμα. Τα λακτόζη + εντεροβακτηριακά δίνουν ροδόχροες αποικίες, ενώ οι αποικίες των λακτόζη - εντεροβακτηριακών είναι άχρωμες