ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΜΗΤΕΡΑΣ-ΠΑΙΔΙΟΥ Γ ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ:ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΑΣΣΑΝΟΣ «Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ m-rna ΙΩΝ ΥΨΗΛΟΥ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΣΤΟΝ ΠΛΗΘΥΣΜΙΑΚΟ ΕΛΕΓΧΟ ΓΥΝΑΙΚΩΝ ΓΙΑ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΣΤΑΜΑΤΙΑΣ ΔΙΑΜΑΝΤΟΠΟΥΛΟΥ, ΙΑΤΡΟΥ Αθήνα 2012 Αθήνα

2 2

3 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΜΗΤΕΡΑΣ-ΠΑΙΔΙΟΥ Γ ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ:ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΑΣΣΑΝΟΣ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ m-rna ΙΩΝ ΥΨΗΛΟΥ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΣΤΟΝ ΠΛΗΘΥΣΜΙΑΚΟ ΕΛΕΓΧΟ ΓΥΝΑΙΚΩΝ ΓΙΑ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ ΣΤΑΜΑΤΙΑ Μ. ΔΙΑΜΑΝΤΟΠΟΥΛΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΕΒΛΗΘΗ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Ε.Κ.Π.Α. ΑΘΗΝΑ

4 4

5 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ-ΜΕΛΕΤΙΟΣ ΔΗΜΟΠΟΥΛΟΣ ΑΝΑΠΛ. ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΥΣΤΡΑΤΙΟΣ ΠΑΤΣΟΥΡΗΣ ΑΘΗΝΑ

6 6

7 Γ ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Δ. ΚΑΣΣΑΝΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Π. ΚΑΡΑΚΙΤΣΟΣ Β ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΠΑΝΑΓΙΩΤΙΔΗΣ 7

8 8

9 Πρόοδος ορισμού και εκπόνησης της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής: Αρχική αίτηση: 27/01/2006 Ορισμός τριμελούς επιτροπής:10/4/2006 Ορισμός θέματος: 6/10/2006 Κατάθεση Α προόδου: 9/4/2008 Κατάθεση Β προόδου: 29/4/2009 Χορήγηση παράτασης ενός έτους: 19/12/2011 Αλλαγή μέλους Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής:23/3/2012 Κατάθεση Γ προόδου: 20/6/2012 Ορισμός επταμελούς επιτροπής: 9/10/2012 Παρουσίαση ενώπιον Εξεταστικής Επιτροπής: 13/11/2012 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΣΑΛΑΜΑΛΕΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (επιβλέπον μέλος ΔΕΠ) 2. ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΑΣΣΑΝΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 3. ΠΕΤΡΟΣ ΚΑΡΑΚΙΤΣΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΣΑΛΑΜΑΛΕΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 2. ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΑΣΣΑΝΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 3. ΠΕΤΡΟΣ ΚΑΡΑΚΙΤΣΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 4. ΙΩΑΝΝΗΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΙΔΗΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 5. ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ ΧΡΕΛΙΑΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 6. ΠΕΡΙΚΛΗΣ ΦΟΥΚΑΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 7. ΠΕΡΙΚΛΗΣ ΠΑΝΑΓΟΠΟΥΛΟΣ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ 9

10 10

11 ΒΑΘΜΟΣ: ΑΡΙΣΤΑ 11

12 12

13 13

14 14

15 Β Ι Ο Γ Ρ Α Φ Ι Κ Ο Σ Η Μ Ε Ι Ω Μ Α ΣΤΑΜΑΤΙΑ ΔΙΑΜΑΝΤΟΠΟΥΛΟΥ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ : Σταματία Διαμαντοπούλου του Μιχαήλ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΓΕΝΝΗΣΗΣ : 06/05/1979 ΔΙΕΥΘΥΝΣΗ : Καλαβρύτων 45, Δάσος Χαϊδαρίου, T.K , Αθήνα ΤΗΛΕΦΩΝΑ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑΣ : e mail : Matoula_Diam@yahoo.com ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ : Έγγαμη με δύο παιδιά ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗ : 2005 : Αποφοίτηση από την Ιατρική Σχολή Ε.Κ.Π.Α. Βαθμός «ΛΙΑΝ ΚΑΛΩΣ» ( 8,09) 1999 : Εισαγωγή με πανελλήνιες εξετάσεις στην Ιατρική Σχολή του Α.Π.Θ : Εισαγωγή στη Νοσηλευτική Σχολή Α.Τ.Ε.Ι. Αθηνών 1997 : Αποφοίτηση από το Γενικό Λύκειο «Μεν. Ξάνθου» με βαθμό 19 9/11. ΔΙΑΚΡΙΣΕΙΣ : Υποτροφία Ιδρύματος Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.) 2004 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΕΣ ΣΠΟΥΔΕΣ : 1. Υποψήφια Διδάκτωρ Ιατρικής Σχολής Ε.Κ.Π.Α. 15

16 Θέμα : «Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ m-rna ΙΩΝ ΥΨΗΛΟΥ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΣΤΟΝ ΠΛΗΘΥΣΜΙΑΚΟ ΕΛΕΓΧΟ ΓΥΝΑΙΚΩΝ ΓΙΑ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΜΗΤΡΑΣ» 2. Φοιτήτρια του Π.Μ.Σ. Ιατρικής Σχολής Ε.Κ.Π.Α. «ΠΑΘΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΚΥΗΣΗΣ» ΞΕΝΕΣ ΓΛΩΣΣΕΣ : Αγγλικά (Proficiency) Γαλλικά (DELF 1-6) ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗ : 18/01/ σήμερα ειδικευόμενη ιατρός Μαιευτικής Γυναικολογικής Κλινικής Γ.Ν.Νικαίας «ΑΓ. ΠΑΝΤΕΛΕΗΜΩΝ» 22/10/ /01/2012 ειδικευόμενη Ιατρός Γυναικολογικής Κλινικής Γ.Ν.Α. «ΛΑΪΚΟ» 19/05/ /04/2010 ειδικευόμενη ιατρός Χειρουργικής Κλινικής του Γ.Ν.Δ.Α. «Η Αγία Βαρβάρα» 09/ /2007 : Επιστημονική συνεργάτις της Γ Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών Π.Γ.Ν. «ΑΤΤΙΚΟΝ» 10/ σήμερα : Επιστημονική συνεργάτις Εργαστηρίου Διαγνωστικής Κυτταρολογίας Πανεπιστημίου Αθηνών Π.Γ.Ν. «ΑΤΤΙΚΟΝ» ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ : Πληροφορική στην υγεία (Οργάνωση Ιατρείου και Ιατρικού Φακέλου). Πρόγραμμα 15 ωρών ΛΑΕΚ ΟΑΕΔ. 26/11/ /12/2009, Γ.Ν.Δ.Α. Αγία Βαρβάρα, Αθήνα Νοσοκομειακές Λοιμώξεις. Expert Level. Πρόγραμμα 10 ωρών. ΛΑΕΚ ΟΑΕΔ. 14 Απριλίου 2011, Γ.Ν.Α. Λαϊκό, Αθήνα 16

17 ΔΙΔΑΚΤΙΚΟ ΕΡΓΟ : Εκπαιδεύτρια Ιατρός στη Δευτεροβάθμια Εκπαίδευση Πειραιώς για θέματα Σεξουαλικής Διαπαιδαγώγησης και Οικογενειακού Προγραμματισμού. Εκπ. Έτος ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΕΡΓΟ : Δημοσιεύσεις σε Ξένα και Ελληνικά περιοδικά: 1. Διαμαντοπούλου Σ., Μεταβολές γονιδίων στην καρκινογένεση του ενδομητρίου. Θέματα Μαιευτικής Γυναικολογίας, Τόμος Κ, τα-4, Διαμαντοπούλου Σ., Καρανικολόπουλος Π., Κασσάνος Δ., Οστεοπόρωση σχετιζόμενη με την κύηση. Ελληνικό Περιοδικό Γυναικολογίας και Μαιευτικής, Τόμος 7, Τεύχος 2, σελ , Diamantopoulou S., Sikiotis K., Panajiotides J., Kassanos D., Serous cystadenoma with massive ovarian edema. A case report and review of the literature. Clin. Exp. Obst.&Gyn. Vol. XXXVI, no. 1, p , Διαμαντοπούλου Σ., Πολύζου Η., Καπογιαννάτος Γ., Περράκης Ε. Επιθετικό αγγειομύξωμα. Παρουσίαση περιστατικού και ανασκόπηση της βιβλιογραφίας. Ελληνικό Περιοδικό Γυναικολογίας και Μαιευτικής, Τόμος 10, Τεύχος 3, σελ , Diamantopoulou S., Spathis A., Chranioti A., Anninos D., Stamataki M., Chrelias C., Pappas A., Panajiotides J., Karakitsos P. Liquid based cytology and HPV DNA testing in a greek population Compared to colposcopy and histology. Clin. Exp. Obst. &Gyn. Vol. Ahead of print,

18 Εργασίες σε Διεθνή και Ελληνικά Συνέδρια: 1. Διαμαντοπούλου Σ., Μεταβολές γονιδίων στην καρκινογένεση του ενδομητρίου. 3 ο Ετήσιο Συμπόσιο Γ Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής Ιατρικής Σχολής Ε.Κ.Π.Α. 23 Σεπτεμβρίου 2006, Αθήνα 2. Spathis A., Chranioti A., Alepaki M., Diamantopoulou S., Georgoulakis J., Tsiodras S., Kassanos D., Karakitsos P. Flow cytometry in rapid screening for E6/E7 mrna detection. HPV IN HUMAN PATHOLOGY, 1-3 May 2008, Prague 3. Βελιμέζης Γ., Γεωργίου Ι., Καπογιαννάτος Γ., Κορωνάκης Δ., Σταμούλης Δ., Τζαμαρίας Σ., Διαμαντοπούλου Σ., Πατρικάκος Β., Περράκης Ε. Τι μπορεί να κρύβει μια βουβωνική διόγκωση; Η εμπειρία μας. 4 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κήλης, Νοεμβρίου 2009, Αθήνα 4. Βελιμέζης Γ., Καπογιαννάτος Γ., Γεωργίου Ι., Κορωνάκης Δ., Διαμαντοπούλου Σ., Περράκης Ε. Έκτοπος ιστός ενδομητρίου στη βουβωνική χώρα. 4 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κήλης, Νοεμβρίου 2009, Αθήνα 5. Βελιμέζης Γ., Γεωργίου Ι., Καπογιαννάτος Γ., Κορωνάκης Δ., Ντούλας Γ., Διαμαντοπούλου Σ., Τζαμαρίας Σ., Πατρικάκος Β., Περράκης Ε. Ευμεγέθεις οσχεοβουβωνοκήλες: προβλήματα και λύσεις. 4 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κήλης, Νοεμβρίου 2009, Αθήνα 6. Διαμαντοπούλου Σ., Χρανιώτη Α., Σταματάκη Μ., Άνοινος Δ., Παππάς Α., Παναγιωτίδης Ι., Μάργαρη Ν., Κασσάνος Δ. Αξιολόγηση του ThinPrep Pap Test και CLART II Test στη διερεύνηση γυναικών που προσέρχονται στο Ιατρείο Πρόληψης Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου. 6 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Παθολογίας Τραχήλου και Κολποσκόπησης. 4-6 Νοεμβρίου 2010, Ιωάννινα 7. Αθανασιάδη Ε., Πουλιάκης Α., Παππάς Α., Διαμαντοπούλου Σ., Σταθοπούλου Β., Κασσάνος Δ., Καρακίτσος Π. Διερεύνηση παραγόντων (ανεξάρτητων οικονομικού κόστους) μη συμμόρφωσης των νέων ελληνίδων σε προγράμματα εμβολιασμού έναντι του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. 6 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Παθολογίας Τραχήλου και Κολποσκόπησης. 4-6 Νοεμβρίου 2010, Ιωάννινα 8. Παπανικολάου Α., Διαμαντοπούλου Σ., Φέξη Δ., Κολυβίρας-Τζιβανιώτης Π., Λαγκαδάς Α., Γιαννακόπουλος Κ. Ρήξη κολπικού κολοβώματος και εκσπλάχνωση 4 χρόνια μετά από κολπική υστερεκτομή. 12 ο Πανελλήνιο Συνέδριο στη Μαιευτική και Γυναικολογία, Μαΐου 2012, Θεσσαλονίκη 18

19 9. Diamantopoulou S., Spathis A., Chranioti A., Chrelias C., Panajiotides J., Karakitsos P. Post diagnosis approach of ASCUS cases on a large population sample from Athens. British Gynaecological Cancer Society. Annual meeting. 5-6 July 2012, London. 10. Chasiotis I., Diamantopoulou S., Kallinteri C., Kakkos L. A rare case of borderline ovarian carcinoma. British Gynaecological Cancer Society. Annual meeting. 5-6 July 2012, London. 11. Diamantopoulou S., Spathis A., Chranioti A., Meristoudis C., Chrelias C., Panayiotides J., Karakitsos P. Alternative tests on ASCUS cases on a large population sample from Athens. International Course in Colposcopy and Cervical Pathology November 2012, Ioannina Διακλικινές Συνεργασίες : Διαμαντοπούλου Σ., Αρβανίτης Γ., Φέξη Δ., Αγγελάκη Χ. HPV στον τράχηλο της μήτρας και στο στοματοφάρυγγα. Επιδημιολογική εκτίμηση και συσχετισμός. Γυναικολογική Κλινική & Ω.Ρ.Λ. Κλινική Γ.Ν.Α. Λαϊκό, 10 Δεκεμβρίου 2011, Αθήνα Αρβανίτης Γ., Διαμαντοπούλου Σ., Σταυράκης Ι. Καρκίνος του στοματοφάρυγγα και η επίδραση του HPV. Ερευνητική Πρόταση Ιατρική Σχολή Ε.Κ.Π.Α. ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΣΥΝΕΔΡΙΩΝ ΣΕΜΙΝΑΡΙΩΝ : ο Πανελλήνιο Συνέδριο χειρουργικής & Διεθνές Χειρουργικό Φόρουμ Νοεμβρίου 2002, Αθήνα 2. 9 ο Επιστημονικό Συνέδριο Φοιτητών Ιατρικής Ελλάδας Μαΐου 2003, Αθήνα ο Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο Μαΐου 2003, Αθήνα 4. 6 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Πλαστικής Επανορθωτικής και Αισθητικής Χειρουργικής. 1-5 Οκτωβρίου 2003, Αθήνα ο Επιστημονικό Συνέδριο Φοιτητών Ιατρικής Ελλάδας Μαΐου 2004, Θεσσαλονίκη 19

20 6. Μετεκπαιδευτικά Μαθήματα Συνεχιζόμενης Ιατρικής Εκπαίδευσης στη Μαιευτική και Γυναικολογία. Ενδομήτρια Υποξία. 1 Μαρτίου 2005, Αλεξάνδρα, Αθήνα 7. Εκπαιδευτικό Σεμινάριο Καρδιοτοκογραφίας. 8-9 Οκτωβρίου 2005, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα 8. 2 ο Ετήσιο Συμπόσιο Γ Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής Ιατρικής Σχολής Ε.Κ.Π.Α. Σύγχρονα Κλινικά και Ερευνητικά Θέματα Μαιευτικής & Γυναικολογίας. 5 Νοεμβρίου 2005, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα 9. Επιστημονική Ημερίδα: Οι ενδοκρινοπάθειες της εγκύου και οι επιπτώσεις τους στο νεογνό. 10 Δεκεμβρίου 2005, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα ο Πανελλήνιο Συνέδριο Υπέρηχων στη Μαιευτική & Γυναικολογία Φεβρουαρίου 2006, Αθήνα 11. Ουρογυναικολογία & Λαπαροσκοπικές τεχνικές αποκατάστασης του πυελικού εδάφους Φεβρουαρίου 2006, Ιασώ, Αθήνα ο Ενδοσκοπικό Σεμινάριο Μαρτίου 2006, Ιασώ, Αθήνα 13. Σεμινάρια Ειδικευομένων Ιατρών Μαιευτικών και Γυναικολογικών Κλινικών Γ ΔΥΠΕ. Εκπαιδευτικό σεμινάριο καρδιοτοκογραφίας. 19 Μαΐου 2006, Νίκαια ο Πανελλήνιο Συνέδριο Μαιευτικής και Γυναικολογίας Μαΐου 2006, Πάτρα ο Ευρωπαϊκό Σεμινάριο Παθολογίας Τραχήλου & Κολποσκόπησης Ιουνίου 2006, Αθήνα ο Ετήσιο Συμπόσιο Γ Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής Ιατρικής Σχολής Ε.Κ.Π.Α. Παρουσίαση Ερευνητικών Προγραμμάτων. 23 Σεπτεμβρίου 2006, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα ο Σεμινάριο Μητρικού Θηλασμού. 13 Οκτωβρίου 2006, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα 18. Μετεκπαιδευτική Επιστημονική Διημερίδα & Σεμινάριο. Εξελίξεις στη μελέτη του καρκίνου του μαστού Οκτωβρίου 2006, Αθήνα η Επιστημονική Ημερίδα. Λοιμώξεις κατά την κύηση και οι επιπτώσεις τους στο νεογνό. Η πορεία του μητρικού θηλασμού στην Ελλάδα. 15 Δεκεμβρίου ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα 20. Ενδοσκοπικό Σεμινάριο στη Γυναικολογία, 23 Φεβρουαρίου 2008, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα 21. Ενδοσκοπικό Σεμινάριο στη Γυναικολογία, Εκπαιδευτικό Πρόγραμμα Hands-on, 24 Φεβρουαρίου 2008, Πειραματικό Χειρουργείο ELPEN, Αθήνα 20

21 22. Επιμορφωτικό Σεμινάριο : Νεότερες Εξελίξεις στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. 21 Μαΐου 2008, Γ.Ν.Δ.Α., Αθήνα 23. Σεμινάριο Ρομποτικής Χειρουργικής στη Γυναικολογία Σεπτεμβρίου 2008, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα ο Πανελλήνιο Συνέδριο Μαιευτικής & Γυναικολογίας Μαΐου 2009, Αθήνα th Athens Colposcopy Training Course June 2009, Athens th Athens Colposcopy Training Course. Hands-on Course June 2009, Athens 27. Εκπαιδευτικό Σεμινάριο: Σύγχρονα θέματα Κυτταρολογίας : Πρόληψη καρκίνου Τραχήλου της Μήτρας και Μαστού Ιουνίου 2009, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα η Εκπαιδευτική Ημερίδα στην Απεικονιστική Προσέγγιση των Παθήσεων του Μαστού. Από την απεικόνιση στη διάγνωση. 26 Σεπτεμβρίου 2009, Αθήνα η Εκπαιδευτική Ημερίδα στην Απεικονιστική Προσέγγιση των Παθήσεων του Μαστού. Από την απεικόνιση στη διάγνωση. Hands-on Σεμινάριο. 26 Σεπτεμβρίου 2009, Αθήνα ο Ετήσιο Συμπόσιο Γ Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής Ιατρικής Σχολής Ε.Κ.Π.Α Ενδοκρινολογικά Θέματα στη Μαιευτική και Γυναικολογία. 14 Νοεμβρίου 2009, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα ο Πανελλήνιο Συνέδριο κήλης Νοεμβρίου 2009, Αθήνα ο Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο 4-8 Μαΐου 2010, Αθήνα 33. Συμπόσιο Ελληνικής Ογκολογίας Ορμόνες και καρκίνος του μαστού. 7-8 Μαΐου 2010, Αθήνα rd International Meeting Laparoscopic Complications: Prevention and if things go wrong what next? May 2010, Athens η Ετήσια Ειδική Σύνοδος Ελληνικής Μαιευτικής & Γυναικολογικής Εταιρίας. 4-5 Ιουνίου 2010, ΑΤΤΙΚΟΝ, Αθήνα th Athens Colposcopy training Course June 2010, Athens nd Seminar of Diagnostic Cytology October 2010, ATTIKON, Athens 38. Συμμετοχή στην πρακτική Άσκηση. 6 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Παθολογίας Τραχήλου & Κολποσκόπησης. 4-6 Νοεμβρίου 2010, Ιωάννινα ο Πανελλήνιο Συνέδριο Παθολογίας Τραχήλου & Κολποσκόπησης. 4-6 Νοεμβρίου 2010, Ιωάννινα 21

22 40. 3 ο Σεμινάριο γυναικολογικής Ογκολογίας. Διατήρηση Γονιμότητας σε γυναίκες με γυναικολογικό καρκίνο Φεβρουαρίου 2011, Αθήνα 41. Διημερίδα: Γυναικολογικές Παθήσεις: Πρόληψη, Αντιμετώπιση, Ιδιαιτερότητες. 1-2 Απριλίου 2011, Λαϊκό, Γουδή, Αθήνα ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Κυτταρολογίας «Μεσογειακές Ημέρες» Μαΐου 2011, Αθήνα ο Πανελλήνιο Συνέδριο Περιγεννητικής Ιατρικής Οκτωβρίου 2011, Αθήνα 44. International Course in Colposcopy and Cervical Pathology November 2011, Ioannina rd Maria Delivoria- Papadopoulos Perinatal Symposium. Intrauterine growth restriction Fetal programming. 10 March 2012, Aretaieion, Athens th European Congress On Menopause and Andropause, March 2012, Athens, Greece 47. Προσυνεδριακή Εκδήλωση Εκπαίδευσης στην Παθολογία Τραχήλου και Κολποσκόπηση. 12 ο Πανελλήνιο Συνέδριο στη Μαιευτική & Γυναικολογία. 17 Μαΐου 2012, Θεσσαλονίκη ο Πανελλήνιο Συνέδριο στη Μαιευτική & Γυναικολογία Μαΐου 2012, Θεσσαλονίκη 49. Συνέδριο: Εθνικές Κατευθυντήριες Οδηγίες (guidelines) Στη Χειρουργική Ογκολογία του Μαστού Μαΐου 2012, Αθήνα ο Ευρωπαϊκό Σεμινάριο Κολποσκόπησης & Παθολογίας Τραχήλου Ιουνίου 2012, Αθήνα 51. British Gynaecological Cancer Society Annual Scientific Meeting. 5-6 July 2012, London st Annual Congress ESGE, September 2012, Paris ο Σεμινάριο Ειδικευομένων Ιατρών Μαιευτικής Γυναικολογίας Β Υ.Π.Ε. Πειραιώς & Αιγαίου. Οικογενειακός Προγραμματισμός. 5 Οκτωβρίου 2012, Νίκαια 22

23 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ: Θέλω να ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιάς μου τον κ. Εμμανουήλ Σαλαμαλέκη, Καθηγητή μου, ο οποίος, από τα φοιτητικά μου ακόμα χρόνια, μου έδειξε με τον όμορφο, ήρεμο, διδακτικό και καθοδηγητικό του τρόπο την ομορφιά της Γυναικολογίας και της Μαιευτικής. Τον ευχαριστώ γιατί ήταν πάντα δάσκαλος και συμπαραστάτης στην προσπάθεια και μου έδωσε την ευκαιρία με τη Διδακτορική Διατριβή να κάνω ένα μεγάλο όνειρό μου πραγματικότητα. Βαδίζει πάντα στο δρόμο της αρετής και μου δίδαξε την ηρεμία, την ευγένεια και την προσπάθεια για το καλύτερο. Έμπνευση στην προσπάθεια, καθοδηγητής και δάσκαλος μου, ο κ. Πέτρος Καρακίτσος, ανέχθηκε τόσα πολλά από μένα, άγχη, αγωνίες, λάθη, παραλήψεις, καθυστερήσεις, γκρίνια. Μου έδειξε το δρόμο της έρευνας, τον τρόπο σκέψης, το όραμα. Πάντα παρών σε κάθε προσπάθεια, μικρή ή μεγάλη, ο τελευταίος που αποχωρεί από το Εργαστήριο, και αφού ασχοληθεί με τον κάθε έναν συνεργάτη προσωπικά, αφιερώνοντας χρόνο και προσπάθεια να βοηθήσει σα δάσκαλος, σα συνεργάτης, σαν επιστήμονας, σαν φίλος, σαν πατέρας. Δεν υπάρχουν κατάλληλα λόγια ευγνωμοσύνης. Ευχαριστώ τον κ. Δημήτριο Κασσάνο, γιατί, από φοιτήτρια μου δημιουργούσε επιστημονικές ανησυχίες και ενίσχυε διαρκώς την προσπάθεια μου να ερευνήσω, να σκεφτώ και να λειτουργήσω επιστημονικά. Μου δίδαξε την ομορφιά του αγώνα συνδυάζοντας με απαράμιλλο τρόπο την αυστηρότητα με το χιούμορ. Ο κ. Κωνσταντίνος Συκιώτης, δεύτερος πατέρας και δάσκαλος. Με την αδάμαστη ενεργητικότητα, τη φλόγα και το πάθος για τη Γυναικολογική Ογκολογία, τη Γυναικολογία, τη Μαιευτική, την επιστήμη και τη ζωή. Ο πρώτος Πανεπιστημιακός μου δάσκαλος που μου χάρισε επιστημονικό βιβλίο από την προσωπική του βιβλιοθήκη, που με καθοδήγησε στην έννοια της παθολογίας του τραχήλου, που με δίδαξε να έχω πάντα ανοιχτά τα βιβλία μου στα βασικά, στην Ανατομία, τη Φυσιολογία, την Ιστολογία. Τον ευχαριστώ γιατί μου έμαθε πως στην Ιατρική ένα ποσοστό δεν είναι απλώς ένα νούμερο. Είναι ένας άνθρωπος, μία γυναίκα εν προκειμένω, κόρη, σύζυγος, αδελφή, 23

24 24

25 μητέρα, που αξίζει κάθε προσπάθεια να είναι υγιής. Τα μαθήματά του δεν τα ξεχνώ ποτέ. Ευχαριστώ τον κο. Ιωάννη Παναγιωτίδη γιατί μου δίδαξε τη συνέπεια, τη λογική, τη μελέτη, την αρετή και τον τίμιο αγώνα. Μου δίδαξε την ομορφιά της επιστημονικής γλώσσας και την ιστορία της επιστήμης μας. Με ενθάρρυνε και μου έδειξε την ευρύτητα της επιστημονικής γνώσης. Με βοήθησε να θέσω τα προσωπικά και επιστημονικά μου όρια αξιοπρέπειας, ανοχής και αντοχής. Ευχαριστώ την κα. Νίκη Μάργαρη, γιατί η αρχή είναι το ήμισυ του παντός. Ευχαριστώ τον κο. Χρήστο Μεριστούδη γιατί μου έδειξε πόσο όμορφη είναι η επιστήμη της Κυτταρολογίας και ανέχτηκε τόσα πολλά ως φίλος. Ευχαριστώ την κα. Έλενα Αθανασιάδη, γιατί μου συμπαραστάθηκε σαν φίλη πάνω από όλα. Τον κο. Άρη Σπάθη γιατί πάντα ήταν εκεί, συμπαραστάτης και πάντα έτοιμος να μου εξηγήσει τα αυτονόητα. Την κα. Μαρία Αλεπάκη, για το υπέροχο έργο της. Την κα. Αικατερίνη Χρανιώτη γιατί μου άνοιξε την πόρτα σε ένα υπέροχο κόσμο. Ευχαριστώ όλους τους συνεργάτες του Εργαστηρίου Διαγνωστικής Κυτταρολογίας για τη συμπαράσταση και τη βοήθεια. Δεν υπάρχουν λόγια που να μπορούν να εκφράσουν τις ευχαριστίες και τη βαθύτατη ευγνωμοσύνη μου στην οικογένεια μου, στα παιδιά μου που κατά τη διάρκεια της κύησης τους συνέλεγα το δείγμα της έρευνας, που με στερήθηκαν και τα στερήθηκα και που μου έμαθαν και τους έμαθα πως τίποτα δεν κατακτάται χωρίς προσπάθεια, χωρίς κόπο και θυσίες. Στο σύζυγό μου, δίπλα μου κάθε στιγμή αληθινό και επί της ουσίας συμπαραστάτη σε κάθε όνειρο, σε κάθε αγώνα από τις Πανελλήνιες εξετάσεις ακόμα. Στους υπέροχους γονείς μου, που βίωναν κάθε άγχος, χαρά, απογοήτευση, προσπάθεια σα δικό τους, σα δικό τους αγώνα. Ευχαριστώ. 25

26 26

27 Στην Αλίκη και στο Νικόλα Στο Μάνο Στην Αλίκη και στο Μιχάλη 27

28 28

29 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑ ANATOMΙΑ ΑΓΓΕΙΑ ΚΑΙ ΝΕΥΡΑ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ ΠΛΑΚΩΔΗΣ-ΚΥΛΙΝΔΡΙΚΗ ΣΥΜΒΟΛΗ ΚΑΙ ΖΩΝΗ ΜΕΤΑΠΤΩΣΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ HPV ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑ BETHESDA 2001 (TBS)[131, 133] ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ [3, 137] ΕΝΔΟΕΠΙΘΗΛΙΑΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ ΜΙΚΡΟΔΙΗΘΗΤΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΠΛΑΚΩΔΟΥΣ ΕΠΙΘΗΛΙΟΥ ΠΛΑΚΩΔΕΣ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΑΔΕΝΟΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΡΑΧΗΛΟΥ in situ ΑΔΕΝΟΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΚΟΛΠΟΣΚΟΠΗΣΗ ΠΛΗΘΥΣΜΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ HPV mrna ΣΤΙΣ ΕΝΔΟΕΠΙΘΗΛΙΑΚΕΣ ΝΕΟΠΛΑΣΙΕΣ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Δείγμα πληθυσμού ThinPrep Pap-Test ΚΟΛΠΟΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΟΨΙΕΣ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΜΗΤΡΑΣ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΕΡΕΥΝΑΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ ΕΡΕΥΝΑΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

30 30

31 1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 31

32 32

33 1.1. ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑ Κατά την ανάπτυξη του ουρογεννητικού συστήματος, στο πρώιμο και αδιαφοροποίητο ακόμα στάδιο, τα έμβρυα και των δύο φύλων έχουν πανομοιότυπες καταβολές. Οι γονάδες έχουν το δυναμικό να εξελιχθούν σε όρχεις ή ωοθήκες. Στην περίπτωση κατά την οποία τα έμβρυα προορίζονται να γίνουν θήλεα, τα στοιχεία του άρρενος εξαφανίζονται. Αρχικά σχηματίζεται η αμάρα, ένας διατεταμένος θάλαμος, από το ουραίο άκρο του οπισθίου εντέρου. Το ενδόδερμά της βρίσκεται σε επαφή με το σωματικό εξώδερμα και μαζί σχηματίζουν τη μεμβράνη της αμάρας. Από την αμάρα εκτείνεται και η αλλαντοΐδα ως τον ομφάλιο λώρο. Η προβολή της διάμεσου μεσοδέρματος του γαστριδίου εντός του ενδοεμβρυικού κοιλώματος, από το ραχιαίο του τοίχωμα οδηγεί στο σχηματισμό της ουρογεννητικής ακρολοφίας. Αυτή στη συνέχεια εξελίσσεται σε δύο ακρολοφίες, την νεφρογόνο επί τα εκτός και τη γεννητική επί τα εντός. Προς τη γεννητική ακρολοφία και διαμέσου του ραχιαίου μεσεντερίου, ξεκινά η μετανάστευση των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων από το ενδόδερμα του οπισθίου εντέρου. Εκεί, τα κύτταρα περιβάλλονται από επιθηλιακές χορδές. Παράλληλα στη νεφρογόνο ακρολοφία, σχηματίζονται ο μεσονεφρικός (πόρος του Wolff), ως συμπύκνωση του μεσοδέρματος, και ο παρανεφρικός πόρος (πόρος του Müller) ως εγκόλπωση του σπλαχνικού περιτοναίου. Κατά την πέμπτη εβδομάδα διαιρείται η αμάρα. Σε στεφανιαίο επίπεδο το ούρο-ορθικό διάφραγμα, μεταξύ της αλλαντοΐδας και του οπισθίου εντέρου, τη διαχωρίζει οπίσθια σε ορθό και πρόσθια σε ουρογεννητικό κόλπο. Έτσι διαιρείται και η μεμβράνη της αμάρας σε ουρογεννητική και πρωκτική μεμβράνη. Από τη, μεν, ανώτερη μοίρα του ουρογεννητικού κόλπου σχηματίζεται η ατρακτοειδής ουροδόχος κύστη. Από τη, δε, κατώτερη πυελική/γεννητική μοίρα, η οποία αποτελεί και τον ιδίως ουρογεννητικό κόλπο, σχηματίζεται η ουρήθρα και οι συνοδοί αδένες και ιστοί. Στη σωματοπλευρά του γαστριδίου προβάλλει ως διόγκωση και το γεννητικό φύμα. Μεταξύ γεννητικού φύματος και γεννητικής μοίρας του ουρογεννητικού κόλπου παρατηρείται, στο στάδιο αυτό, στενή τοπογραφική συσχέτιση, με το γεννητικό φύμα να βρίσκεται υψηλότερα από το ουραίο άκρο του ουρογεννητικού κόλπου. Ενώ ο μετανεφρικός πόρος (ουρητήρας) εκβάλλει στην αναπτυσσόμενη ουροδόχο κύστη, ο 33

34 παραμεσονεφρικός πόρος μετακινείται στον ουρογεννητικό κόλπο σε πιο ουραία θέση, συμπορευόμενοι όμως με τους μεσονεφρικούς. Οι παραμεσονεφρικοί πόροι συνενώνονται στο κατώτερο τμήμα τους κατά τη μέση γραμμή, καταλήγοντας στο κατώτερο τμήμα του ουρογεννητικού κόλπου. Από αυτούς θα αναπτυχθούν τα εσωτερικά γεννητικά όργανα στα θήλεα. Κατά την όγδοη εβδομάδα, και το αδιαφοροποίητο ακόμα στάδιο, η ανάπτυξη του θήλεος είναι προκαθορισμένη. Λόγω της έλλειψης αντί-μυλλέρειας ορμόνης και τεστοστερόνης (και οι δύο παρούσες στα άρρενα), οι μεσονεφρικοί πόροι του Wolff υποστρέφουν. Από τους παραμένοντες παραμεσονεφρικούς πόρους του Müller θα προκύψουν οι ωαγωγοί, η μήτρα και η ανώτερη μοίρα του κόλπου. Οι υπόλοιπες δομές: ουροδόχος κύστη, ουρήθρα, μείζονες αδένες του προδρόμου του κολεού, περιουρηθρικοί αδένες, πρόδρομος και κατώτερη μοίρα του κόλπου, προκύπτουν από τον ουρογεννητικό κόλπο. Η εξωτερική γεννητική μοίρα του ουρογεννητικού κόλπου οριοθετείται από τα πλάγια από τις ουρογεννητικές πτυχές. Πλαγιότερα αυτών αναπτύσσονται οι χειλεοοσχεΐκές πτυχές της σωματοπλευράς. Ενώ από το γεννητικό φύμα θα προκύψει η κλειτορίδα, από τις μεν ουρογεννητικές πτυχές προκύπτουν τα μικρά χείλη και από τις δε χειλεοσχεΐκές τα μεγάλα χείλη του αιδοίου[1] ANATOMΙΑ Στον ανατομικό χώρο μεταξύ ουροδόχου κύστης και ορθού και εντός του πλατέως συνδέσμου, βρίσκεται η μήτρα. Πρόκειται για ένα μυώδες όργανο κοίλο, απιοειδούς σχήματος, με μήκος περί τα 6-8 cm και βάρος gr. Η μήτρα αποτελείται από τον πυθμένας, το σώμα και τον τράχηλο. Μεταξύ σώματος και τραχήλου υπάρχει ο ισθμός. Στο κατώτερο μέρος του ο τράχηλος εισέρχεται εντός του κόλπου. Έτσι διακρίνεται ανατομικά στο υπερκολπικό και στο ενδοκολπικό τμήμα του τραχήλου. Το περιτόναιο, ενώ καλύπτει εξολοκλήρου τον πυθμένα και το σώμα της μήτρας, στην περιοχή του τραχήλου καλύπτει, οπίσθια μεν, μόνο το υπερκολπικό τμήμα του, πρόσθια, δε, ανακάμπτει πάνω από την ουροδόχο κύστη και έτσι η πρόσθια επιφάνεια του τραχήλου παραμένει ακάλυπτη. Έτσι σχηματίζεται η κυστεομητρική πτυχή και το κυστεομητρικό κόλπωμα. Πλαγίως του 34

35 σώματος της μήτρας και με οριζόντια κατεύθυνση, το περιτόναιο σχηματίζει μια τετράπλευρη πτυχή, τον πλατύ σύνδεσμο. Από το οπίσθιο πέταλο του πλατέως συνδέσμου αναρτάται η ωοθήκη με μία πτυχή, το μεσοωοθήκιο. Ο πλατύς σύνδεσμος διαιρείται έτσι στο μεσοωοθήκιο άνωθεν και στο μεσοσαλπίγγιο κάτωθεν της πτυχής. Ανάμεσα στα δύο πέταλα του πλατέως συνδέσμου σχηματίζεται το παραμήτριο, ένας ανατομικός χώρος που πληρείται από συνδετικό ιστό. Η κοιλότητα της μήτρας είναι σχισμοειδής με μήκος 5-7cm. Σε εγκάρσια διατομή έχει σχήμα τριγωνικό με τη βάση του τριγώνου προς τα επάνω. Από τον πυθμένα και προς τα κάτω διακρίνονται τα κέρατα της μήτρας, στα οποία καταλήγουν τα στόμια των ωαγωγών, το σώμα της μήτρας, ο ισθμός, το έσω τραχηλικό στόμιο, η ενδοτραχηλική κοιλότητα και το έξω τραχηλικό στόμιο. Το τμήμα του τραχήλου το οποίο προβάλλει στον κόλπο λέγεται εξωτράχηλος (ενδοκολεΐκό ή ενδοκολπικό). Η επιφάνειά του είναι κυρτή και αποστρογγυλωμένη. Το εξωτερικό στόμιο έχει σχήμα κυκλικό ή σχισμοειδές. Η διατήρηση της θέσης της μήτρας γίνεται με το περιτόναιο και τους συνδέσμους της. Σε όρθια θέση της γυναίκας, όταν η κοιλότητα της μήτρας φέρεται σχεδόν οριζόντια προς τα εμπρός και το σώμα σχηματίζει ως προς τον τράχηλο γωνία , τότε πρόκειται για πρόσθια κλίση και κάμψη της μήτρας. Όταν το σώμα κάμπτεται προς τα οπίσθια του τραχήλου, πρόκειται για οπίσθια κάμψη της μήτρας. Οι στρογγύλοι σύνδεσμοι εκφύονται εκατέρωθεν του πυθμένα άμφω και μπροστά από τις σάλπιγγες. Ακολουθούν πορεία μέσω των πετάλων του πλατέως συνδέσμου, και δια του βουβωνικού πόρου καταφύονται στο δέρμα των μεγάλων χειλέων του αιδοίου. Οι ευθυμητρικοί ή ιερομητρικοί σύνδεσμοι εκφύονται μεταξύ 3 ου και 4 ου ιερού σπονδύλου εκατέρωθεν και ακολουθώντας λοξή πορεία, καταφύονται στην οπίσθια επιφάνεια της μήτρας, ισοϋψώς προς τον ισθμό, σχηματίζοντας το μητριαίο όγκωμα. Η ανέγερση του περιτοναίου την οποία προκαλούν δημιουργεί μία πτυχή, η οποία διαιρεί το ευθυμήτριο κόλπωμα σε δύο μοίρες: την άνω και την κάτω ή οπίσθιο χώρο του Douglas[2-3]. 35

36 ΑΓΓΕΙΑ ΚΑΙ ΝΕΥΡΑ Η αγγείωση της μήτρας προέρχεται από τη μητριαία αρτηρία, η οποία είναι κλάδος της έσω λαγονίου. Μετά την είσοδό της εντός του πλατέως συνδέσμου από το κάτω χείλος του και παράλληλα προς τα πλάγια χείλη της μήτρας, διακλαδίζεται στο ύψος του ιδίου συνδέσμου της ωοθήκης και δίνει κλάδους τελικούς αλλά και αναστομωτικούς με την ωοθηκική και την κολπική αρτηρία. Σχηματίζεται πυκνό φλεβικό δίκτυο το οποίο πορεύεται παράλληλα προς τους κλάδους της μητριαίας αρτηρίας, καταλήγοντας στην έσω λαγόνιο και κατά ένα μέρος και στην έσω σπερματική φλέβα. Εντός του παραμητρίου πορεύονται τα λεμφαγγεία της μήτρας, τα οποία καταλήγουν στα αντίστοιχα λεμφογάγγλια παράλληλα προς το ηλιακό πλέγμα. Τα λεμφογάγγλια στα οποία παροχετεύονται τα λεμφαγγεία της μήτρας είναι αυτά του παραμητρίου, τα λαγόνια, τα υπογαστρικά, τα οσφυϊκά και τα παρά-αορτικά. Η νεύρωση της μήτρας γίνεται από κλάδους του 4 ου ιερού νεύρου και του μητροκολεΐκού πλέγματος. Μεγαλύτερο από τα νευρικά γάγγλια είναι το γάγγλιο του Frankenhauser[2] ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ Ο πυθμένας και το σώμα και της μήτρας έχουν παχιά τοιχώματα αποτελούμενα από δέσμες λείου μυϊκού ιστού (μυομήτριο), οι οποίες διατάσσονται σε τρεις ασαφώς καθοριζόμενες στιβάδες. Το μυομήτριο επενδύεται εσωτερικά από το ενδομήτριο. Πρόκειται για χαμηλό κυβοειδές επιθήλιο, στηριζόμενο σε αραιό στρώμα ατρακτοειδών κυττάρων. Λίγοι υποτυπώδεις σωληνοειδείς αδένες σχηματίζονται από την κατάδυση του επιθηλίου στο εσωτερικό του στρώματος. Το ενδομήτριο μεταβάλλεται στο ύψος του έσω τραχηλικού στομίου, το οποίο αποτελεί και το σημείο εσωτερικής συμβολής τραχήλου και σώματος της μήτρας. Ο τράχηλος αποτελείται από επιθήλιο και στρώμα με λείες μυϊκές ίνες και κολλαγονώδη ιστό. Το επιθήλιο του ενδοτραχήλου είναι μονόστιβο κυλινδρικό, βλέννο-εκκριτικό. Το επιθήλιο αυτό παρουσιάζει βαθιές εγκολπώσεις, οι οποίες σχηματίζουν τυφλούς σωληνώδεις σχηματισμούς. Ανάμεσα στα βλέννο-εκκριτικά 36

37 κυλινδρικά κύτταρα, υπάρχουν και λίγα κροσσωτά κυλινδρικά για τη μεταφορά της βλέννης. Ο εξωτράχηλος καλύπτεται από πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο μη κερατινοποιημένο. Σημαντικό χαρακτηριστικό, και για την κολποσκόπηση, είναι η παρουσία γλυκογόνου κατά την αναπαραγωγική ηλικία στο φυσιολογικό επιθήλιο. Τα δύο διαφορετικά επιθήλια εξωτραχήλου και ενδοτραχήλου συναντώνται στην πλακώδη- κυλινδρική συμβολή[3] ΠΛΑΚΩΔΗΣ-ΚΥΛΙΝΔΡΙΚΗ ΣΥΜΒΟΛΗ ΚΑΙ ΖΩΝΗ ΜΕΤΑΠΤΩΣΗΣ Τόσο ο εντοπισμός, όσο και η μεταβολή της θέσης και των χαρακτηριστικών της συμβολής των δύο επιθηλίων και της ζώνης μετάπτωσης υπόκεινται σε ορμονικές επιδράσεις. Κατά τη γέννηση, η πλακώδης- κυλινδρική συμβολή, λόγω επίδρασης των ορμονών της μητέρας στο έμβρυο, βρίσκεται στο έξω τραχηλικό στόμιο. Στην εφηβεία, το κυλινδρικό επιθήλιο επεκτείνεται στον εξωτράχηλο, σχηματίζοντας εκτρόπιο. Παράλληλα, το ph αρχίζει σταδιακά να μεταβάλλεται από αλκαλικό σε όξινο, λόγω διάσπασης του γλυκογόνου από τη φυσιολογική χλωρίδα του κόλπου. Η μεταβολή αυτή του ph δημιουργεί ένα «εχθρικό» περιβάλλον για το κυλινδρικό επιθήλιο. Έτσι προκαλείται κατά την αναπαραγωγική ηλικία μεταπλασία του κυλινδρικού επιθηλίου του εκτροπίου σε πλακώδες. Στη θέση της αρχικής συμβολής, αρχίζει έτσι η δημιουργία της ζώνης μετάπτωσης του ενός στο άλλο επιθήλιο. Η πλακώδης μεταπλασία μπορεί να οδηγήσει στην απόφραξη του αυλού των αδενίων του κυλινδρικού επιθηλίου, με αποτέλεσμα να συσσωρεύεται μικρή ποσότητα βλέννης, η οποία χωρίς δυνατότητα εξόδου, προκαλεί κυστικές διογκώσεις, τα θηλάκια Naboth. Κατά την εμμηνόπαυση η ζώνη μετάπτωσης μετατοπίζεται στον ενδοτράχηλο. Η πλακώδης μεταπλασία είναι διαδικασία μη αναστρέψιμη. Η εξέλιξή της από άωρη σε ώριμη, και τα διαφορετικά χαρακτηριστικά τους, παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την κολποσκόπηση. 37

38 Η σημασία της ζώνης μετάπτωσης είναι ότι αποτελεί το σημείο εμφάνισης και εξέλιξης των ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων, οι οποίες αν δεν εντοπιστούν και αντιμετωπιστούν, ενδέχεται να εξελιχθούν σε διηθητικό καρκίνο[3] ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, το κύτταρο αναπαράγεται διεκπεραιώνοντας μία ιεραρχική ακολουθία γεγονότων, κατά την οποία διπλασιάζεται το περιεχόμενο του, και κατόπιν διαιρείται στα δύο. Πρόκειται για κύκλο διπλασιασμού και διαίρεσης. Ο κυτταρικός κύκλος αποτελείται από τις φάσεις: Go (κυτταρικής ανάπαυσης), G1 (ανάπτυξη του κυττάρου σε μέγεθος), S (αναδιπλασιασμός του DNA), G2 (αναδιπλασιασμός δομών και οργανιλίων, έκφραση πρωτεϊνών) και M (Μίτωση). Το στάδιο της Μίτωσης έχει επιμέρους στάδια την πρόφαση, τη μετάφαση, την ανάφαση και την τελόφαση. Εναλλακτικά το κύτταρο μπορεί να ακολουθήσει την οδό του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, που ονομάζεται απόπτωση. Κατά τη διάρκεια των φάσεων του κυτταρικού κύκλου, μοναδικά και συγκεκριμένα γεγονότα λαμβάνουν χώρα με συγκεκριμένη αλληλουχία και χρονική διαδοχή. Το κύτταρο διαθέτει συστήματα ελέγχου (checkpoints), τα οποία ενεργοποιούν και απενεργοποιούν πρωτεΐνες που συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο τον κατάλληλο χρόνο, συντονίζοντας διεργασίες που οδηγούν στην τελική διαίρεση των κυττάρων. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται : Ενεργοποίηση ενζύμων, που ελέγχουν τη διαδικασία της ακολουθίας των φάσεων Έλεγχος της ολοκλήρωση της προηγούμενης φάσης πριν την έναρξη επόμενης Συνεκτίμηση συνθηκών περιβάλλοντος μηνυμάτων Έλεγχος της επιλογής μεταξύ στατικότητας (Go), επανενεργοποίησης, πολλαπλασιασμού ή απόπτωσης του κυττάρου Ανατροφοδότηση από μηνύματα του ίδιου του κυττάρου (π.χ. ολοκλήρωση προηγούμενης φάσης, κατάλληλο μέγεθος κ.τ.λ.) 38

39 Στα σημεία ελέγχου πυροδοτούνται μοριακά «φρένα», ούτως ώστε να μην ξεκινά το επόμενο στάδιο πριν την ολοκλήρωση του προηγούμενου, αποτελώντας, ουσιαστικά, σημαντικούς σταθμούς μοριακής ρύθμισης. Οι βασικοί ρυθμιστές των σημείων ελέγχου είναι μια ομάδα ετεροδιμερών πρωτεϊνικών κινασών (κυκλίνο-εξαρτώμενες κινάσες cdks), οι οποίες αποτελούνται από μία ρυθμιστική (κυκλίνη) και μία καταλυτική υπομονάδα (κινάση). Οι κινάσες αυτές ρυθμίζουν τη δράση αρκετών πρωτεϊνών, που επιδρούν στον αναδιπλασιασμό του DNA και στη μίτωση, φωσφορυλιώνοντάς τις σε συγκεκριμένες ρυθμιστικές τους περιοχές. Έτσι προκαλούν την ενεργοποίηση ή την αναστολή της δράσης τους, συντονίζοντας τη λειτουργία τους. Η μετάβαση από τη μία φάση του κυτταρικού κύκλου στην άλλη, ελέγχεται από τα σύμπλοκα κυκλίνο-εξαρτώμενων κινασών G1, S-phase και μίτωσης. Επιπλέον, μεγάλες, και με πολλές υπομονάδες, ουβικουϊτινικές λιγάσες ( SCF και APC) επάγουν την πολύ-ουβικουϊτινοποίηση σημαντικών ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, σηματοδοτώντας έτσι τον κατακερματισμό τους από το πρωτεάσωμα του κυττάρου. Στους ανώτερους οργανισμούς, ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου επιτυγχάνεται κυρίως μέσω της ρύθμισης της σύνθεσης και της ενεργότητας των G1-κυκλίνη-CDK-συμπλόκων [4]. Αυτό επιτυγχάνεται με τη δράση ειδικών ανασταλτικών πρωτεΐνών των Cd κινασών (Cdk inhibitor proteins), οι οποίες αναστέλλουν τη συναρμολόγηση, και τελικά τη δράση, ενός ή περισσοτέρων συμπλόκων κυκλίνης- Cd κινάσης (π.χ. p21)[5]. Πρωτεΐνη p53 [5] Το ΤΡ53 αποτελεί ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη 53 του όγκου, γνωστή ως p53. Η πρωτεΐνη αυτή βρίσκεται στον πυρήνα κάθε κυττάρου και μπορεί να συνδεθεί άμεσα με το DNA. Σε περίπτωση κατά την οποία προκληθεί βλάβη του DNA, διακόπτεται ο κυτταρικός κύκλος στη φάση G1. Αρχικά αυξάνεται η συγκέντρωση της ρυθμιστικής πρωτεΐνης p53, η οποία διεγείρει τη μεταγραφή του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη p21. Αυτή, με τη σειρά της, προσδένεται στα σύμπλοκα κυκλίνης-cd κινάσης της φάσης S του κυτταρικού κύκλου, τα οποία προωθούν το κύτταρο στη φάση S και αναστέλλει τη δράση τους. Η διακοπή του κύκλου προσφέρει στο κύτταρο τη δυνατότητα να επιδιορθώσει τις βλάβες του DNA πριν το αντιγράψει. 39

40 Βλάβη ή απουσία της p53 οδηγεί σε απρόσκοπτη αντιγραφή του DNA, που, όταν συνοδεύεται από υψηλή συχνότητα μεταλλάξεων, έχει συνέπεια να παράγονται κύτταρα με προδιάθεση να γίνουν καρκινικά. Πρωτεΐνη Rb [5] Το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη του Ρετινοβλαστώματος (Rb) είναι ογκοκατασταλτικό. Η πρωτεΐνη Rb αφθονεί στον πυρήνα όλων των κυττάρων. Προσδένεται σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες του κυττάρου, οι οποίες ρυθμίζουν τη μεταγραφή γονιδίων απαραίτητων για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (π.χ. E2F). Η αδρανοποίηση της πρωτεΐνης Rb επιτυγχάνεται είτε με τη δημιουργία συμπλόκων, όπως με την πρωτεΐνη Ε7 του ιού HPV, είτε μέσω φωσφορυλίωσης από ενεργοποιημένα σύμπλοκα G1 κυκλινών- Cd κινασών, τροποποιώντας έτσι τη διαμόρφωσή της. Η απενεργοποιημένη Rb απελευθερώνει τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες των γονιδίων, οι οποίες μπορούν, πλέον, να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή των γονιδίων- στόχων τους, επάγοντας έτσι τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό HPV Οι πρώτες υποψίες περί της μολυσματικής φύσης των ανθρωπίνων θηλωμάτων είχαν τεθεί αιώνες πριν, συγχέονταν, όμως, με άλλες σεξουαλικά μεταδιδόμενες νόσους, όπως η σύφιλη και η γονόρροια. Το 1907, τα πειράματα επί της μετάδοσης των μυρμηκιών από άτομο σε άτομο μετά από ενοφθαλμισμό με εκχύλισμα από ακυτταρικό ιστό πάσχοντος, οδήγησαν στην εδραίωση της θεωρίας περί ιογενούς αιτιολογίας της νόσου [6]. Το 1970 ο ιολόγος Harald zur Hausen (Νόμπελ Φυσιολογίας της Ιατρικής, 2008), χρησιμοποιώντας την τεχνική του υβριδισμού, άρχισε τη μελέτη του ιού HPV και τη διερεύνηση της πιθανής συσχέτισής του με τα επιθηλιακά καρκινώματα. Το 1977 ανακοινώθηκε η ύπαρξη τεσσάρων διαφορετικών τύπων του ιού και εκφράστηκε η πεποίθηση ότι ο ιός παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [7-11]. Κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1980, η έρευνα για τον HPV εντατικοποιήθηκε. Το 1980, ο Shah χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοϋπεροξυδάσης, απέδειξε παρουσία του ιού στο 50% των δυσπλασιών του 40

41 τραχήλου της μήτρας [12]. Ακολούθησε η απομόνωση τεσσάρων νέων τύπων ιού, των 6 και 11, από θηλώματα του γεννητικού συστήματος και των 16 και 18 από βιοψίες καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [13-16]. Η μελέτη επί του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας έδωσε στοιχεία για την ύπαρξη και άλλων παραγόντων, οι οποίοι ενέχονται στην καρκινογένεση, όπως η παρουσία και άλλων ιών [17], η ενεργοποίηση ογκογονιδίων (c-myc, c- Ha-ras) ή η απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων [18-19]. Οι επιδημιολογικές μελέτες που ξεκίνησαν τη δεκαετία του 1980, ενοχοποίησαν τελικά τον ιό HPV ως την κυριότερη αιτία για τη δημιουργία προκαρκινικών και καρκινικών αλλοιώσεων στον τράχηλο της μήτρας [3, 20-22]. Ο ιός των ανθρωπίνων θηλωμάτων ανήκει στην οικογένεια Papovaviridae. Ανάμεσα στους τύπους του HPV παρατηρείται αξιοσημείωτη ετερογένεια. Μέχρι σήμερα, έχει αναλυθεί και προσδιοριστεί η αλληλουχία του DNA 85 διαφορετικών γονοτύπων του ιού, ενώ περισσότεροι από 120 νέοι υποψήφιοι έχουν μερικώς χαρακτηριστεί [23]. Οι περισσότεροι από του νέους τύπους HPV έχουν ταυτοποιηθεί με τη χρήση ευαίσθητων μοριακών τεχνικών, όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Οι HPV γονότυποι διαφέρουν ως προς την ικανότητά τους να προκαλούν ογκογόνο μετασχηματισμό. Βάσει αυτού του κριτηρίου, διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: 1. Τύποι «χαμηλού κινδύνου» (low risk): π.χ. 6, 11, 42, 43, 44, 54, 61, 62, 71, 72, 81, 83, 84, 89, οι οποίοι ανιχνεύονται σε εξωφυτικά οξυτενή κονδυλώματα, σε επίπεδα κονδυλώματα και σε χαμηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις του πλακώδους επιθηλίου του τραχήλου της μήτρας. 2. Τύποι «υψηλού κινδύνου» (high risk): π.χ. 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82, 85, οι οποίοι ανιχνεύονται σε υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις του πλακώδους επιθηλίου του τραχήλου της μήτρας ή σε διηθητικούς καρκίνους[24]. Δομή και γενωμική οργάνωση Ο HPV είναι ένας ιός, μικρός σε μέγεθος με διάμετρο nm. Πρόκειται για DNA ιό με ομοιοπολικώς κλειστό, κυκλικό, δίκλωνο DNA το οποίο περιβάλλεται από κυβοειδές εικοσαεδρικό πρωτεϊνικό καψίδιο, που σχηματίζεται 41

42 από 72 καψομερίδια. Τα καψομερίδια διατάσσονται ως 12 πενταμερή και 60 εξαμερή σύνολα διατεταγμένα σε μία Τ=7 συμμετρία. Ο ιός στερείται περιβλήματος και είναι ανθεκτικός τόσο σε υψηλές, όσο και σε χαμηλές θερμοκρασίες, καθώς και σε λιποδιαλυτικές ουσίες (αιθέρας, χλωροφόρμιο) [25-26]. Η επιφάνεια του ιικού σωματιδίου φέρει αντιγονικές ομάδες, χαρακτηριστικές του κάθε τύπου. Στο εσωτερικό του ιού υπάρχουν αντιγονικές ομάδες χαρακτηριστικές του γένους. Το γονιδίωμα του ιού έχει μέγεθος ζεύγη βάσεων (bp), μοριακό βάρος 5,2х10 6 Daltons και λόγο γουανίνης/κυτοσίνης (G/C) περίπου 42%. Το DNA είναι συνδεδεμένο με ιστόνες κυτταρικής προέλευσης, παίρνοντας τη μορφή μικρού χρωμοσώματος. Οι γονιδιακές περιοχές που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (open reading frames) βρίσκονται στη μία μόνο αλυσίδα του ιικού DNA. Στη συμπληρωματική αλυσίδα περιλαμβάνονται περιοχές, οι οποίες είτε δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες, είτε κωδικοποιούν βραχέα τμήματα. Το γονιδίωμα του ιού διαιρείται λειτουργικά σε τρεις περιοχές: 1. Πρώιμη περιοχή (early-e), η οποία περιλαμβάνει 8 γονίδια, τα Ε1 έως Ε8. Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τα γονίδια αυτά εκφράζονται αμέσως μετά την είσοδο του ιού στο κύτταρο και είναι απαραίτητες για την αντιγραφή του DNA του ιού και την εξαλλαγή του κυττάρου. 2. Όψιμη περιοχή (late-l), η οποία περιλαμβάνει 2 γονίδια, τα L1 και L2. Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τα γονίδια αυτά εκφράζονται στα τελικά στάδια του κύκλου του ιού και είναι δομικές. 3. Μη κωδική ρυθμιστική περιοχή, η οποία ονομάζεται ανοδικός ρυθμιστής ανάγνωσης (upstream reading regulator) και ρυθμίζει τη μεταγραφή και την έναρξη αντιγραφής του DNA. 42

43 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΟΥ HPV ΓΟΝΙΔΙΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ Ε1 Αντιγραφή του DNA, διατήρηση επισώματος, μεταγραφική καταστολή Ε2 Αντιγραφή του DNA (με το Ε1), έλεγχος μεταγραφής Ε3 Άγνωστη (έχει βρεθεί μόνο στον ιό BPV 1) Ε4 Καθορισμός τροπισμού των διαφόρων HPV τύπων ως προς κύτταρα/ιστούς, αλληλεπίδραση με κυτταροκερατίνες, ωρίμανση ιών Ε5 Μετασχηματική ικανότητα (πρώιμα στάδια εξαλλαγής), αλληλεπίδραση με EGF και την 16Κ της ATPάσης Ε6 και Ε7 Μετασχηματική ικανότητα (κύριες πρωτεΐνες), δημιουργία συμπλόκων με τις κυτταρικές πρωτεΐνες p53 και PRB αντίστοιχα, εξαλλαγή κυττάρων, διατήρηση κακοήθους φαινότυπου, έλεγχος μεταγραφής Ε8 Άγνωστη L1 Κύρια πρωτεΐνη του καψιδίου των ώριμων ιικών σωματιδίων L2 Μικρή πρωτεΐνη του καψιδίου, σταθεροποίηση της δομής του καψιδίου [3] Μολυσματικός κύκλος του HPV και ογκογένεση Οι γονότυποι του HPV παρουσιάζουν εξειδικευμένο τροπισμό, προσβάλλοντας επιθήλια ορισμένων περιοχών του σώματος, όπως το κατώτερο γεννητικό σύστημα, η ουρήθρα, το τραχειοβρογχικό δέντρο, η ρινική και οι παραρρινικές κοιλότητες, η στοματική κοιλότητα, ο οισοφάγος και ο λάρρυγγας. Η διαδικασία της αντιγραφής του ιού εξαρτάται πλήρως από τους μηχανισμούς διαφοροποίησης του κυττάρου-ξενιστή. Η αντιγραφή και η μετάφραση του DNA του HPV επιτελείται σε κύτταρα υψηλού βαθμού διαφοροποίησης. Υπάρχουν βάσιμες ενδείξεις ότι και οι ίδιοι οι ιοί είναι σε θέση να τροποποιούν την επιθηλιακή διαφοροποίηση [27]. Αρχικά, προσβάλλεται το πλακώδες επιθήλιο του δέρματος και των βλεννογόνων. Συχνότερα προσβάλλεται ο οπίσθιος κολπικός θόλος και η ζώνη μετάλασης του τραχήλου. Η είσοδος και η εγκατάσταση του ιού γίνεται διαμέσου μικροταυματισμών του επιθηλίου. Οι παράγοντες του κυττάρου που διαμεσολαβούν για την είσοδο του ιού, δεν έχουν πλήρως καθοριστεί. Θεωρείται πιθανό ο HPV να προσκολλάται σε ειδικούς επιφανειακούς κυτταρικούς υποδοχείς, όπως η α6-ιντεγκρίνη, με την οποία συνδέεεται ο HPV 6. Για τους γονότυπους 16 και 33 έχει αποδειχθεί πως προσκολλώνται στο κύτταρο μέσω 43

44 της μίας κυτταρικής επιφανειακής πρωτεΐνης, της θειικής ηπαράνης, η οποία αντιδρά με το καρβοξυτελικό άκρο της L1 πρωτεΐνης και μέσω ενός δεύτερου υποδοχέα η πρωτεογλυκανικού σταθεροποιητή [28-32]. Μετά τη διείσδυση του ιού στο κύτταρο, ακολουθεί απέκδυσή του με λύση του καψιδίου στο κυτταρόπλασμα. Το γονιδίωμα διεισδύει μέσω της πυρηνικής μεμβράνης και καταλήγει στον πυρήνα του κυττάρου. Στο επίπεδο της βασικής στιβάδας, η ιική αναπαραγωγή είναι μη παραγωγική και ο ιός εδραιώνεται ως επίσωμα, με τη μορφή πλασμιδίου. Χρησιμοποιώντας το μηχανισμό της αντιγραφής του DNA του κυττάρου-ξενιστή, ο ιός συνθέτει το δικό του DNA. Αυτό το επιτυγχάνει εκφράζοντας τα πρώιμα του γονίδια, τα οποία ρυθμίζουν τη σύνθεση του ιικού DNA. Καθώς η βασική στιβάδα των επιθηλιακών κυττάρων διαφοροποιείται, μετακινείται ουσιαστικά και ο ιός προς τις επιφανειακές στιβάδες του επιθηλίου. Στα διαφοροποιημένα πλέον κερατινοκύτταρα, γίνεται ο πολλαπλασιασμός του γενετικού υλικού σε πολλά αντίγραφα, εκφράζονται τα όψιμα γονίδια του ιού που κωδικοποιούν τις δομικές πρωτεΐνες, συντίθενται τα καψομερίδια και τελικά συγκροτούνται τα ιικά σωματίδια. Στα περισσότερα καρκινώματα του τραχήλου της μήτρας, το DNA του HPV ενσωματώνεται στο γένωμα του ξενιστή. Η ενσωμάτωση προκαλεί απώλεια της έκφρασης του Ε2 γονιδίου του ιού. Το γονίδιο αυτό λειτουργεί σαν καταστολέας της έκφρασης των Ε6 και Ε7 γονιδίων. Η απώλειά του οδηγεί σε υπερέκφραση των Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών, οι οποίες έχουν ισχυρή ικανότητα μετασχηματισμού του κυττάρου. Προκαλούν αθανατοποίηση κυττάρων in vitro και επάγουν τη δημιουργία όγκων στο δέρμα διαγονιδιακών ζώων [33], και το αποτέλεσμα της δράσης τους είναι η απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και η αναστολή της απόπτωσης. Η Ε6 ογκοπρωτεΐνη προσδένεται στην p53 και επάγει την ταχεία αποικοδόμησή της. Η πρωτεΐνη p53 λειτουργεί σαν μεταγραφικός ενεργοποιητής γονιδίων απαραίτητων για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την καταστολή ανάπτυξης όγκων. Η δέσμευσή της από την Ε6 πρωτεΐνη ιών χαμηλού κινδύνου έχει σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία ασθενούς συμπλόκου, και η p53 δεν αποικοδομείται. Όταν, όμως, δεσμεύεται από την Ε6 ιών υψηλού κινδύνου, το ισχυρό σύμπλοκο που σχηματίζεται επάγει την αποικοδόμηση της p53 μέσω ενός πρωτεολυτικού συστήματος, που εξαρτάται από την ουβικουϊτίνη. 44

45 Η Ε7 ογκοπρωτεΐνη δημιουργεί σύμπλοκα με πρωτεΐνες της οικογένειας του ρετινοβλαστώματος. Η πρόσδεσή της στις πρωτεΐνες p107, p130 και Rb, οδηγεί στην απελευθέρωση των μεταγραφικών παραγόντων Ε2F, οι οποίοι ενεργοποιούν τα κυτταρικά γονίδια που σχετίζονται με την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Η Ε7, επιπλέον, σχηματίζει σύμπλοκα με την κυκλίνη Α, η οποία ενεργοποιεί τις cdk2 και cdc2 κατά τις φάσεις S και G2/M, αντίστοιχα, και με την κυκλίνη Ε, η οποία ενεργοποιεί τη cdk2 κατά τη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Η δημιουργία αυτών των συμπλόκων μεταβάλλει τη λειτουργία των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (cdks) ως προς τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, επάγοντας έτσι τον κυτταρικό υπερπολλαπλασιασμό. Επομένως, η μη ελεγχόμενη έκφραση των Ε6 και Ε7 ιικών ογκογονιδίων προκαλεί χρωμοσωμική αστάθεια και αποτελεί ουσιαστικά τη σφραγίδα της καρκινογένεσης. Αν και η ενσωμάτωση του ιικού γενώματος στο γένωμα του ξενιστή έχει παρατηρηθεί σε μεγάλες σειρές καρκινικών κυττάρων και σε υψηλόβαθμες ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις, παρολαυτά αποτελεί σπανιότερο φαινόμενο σε πρώιμες βλάβες προκαλούμενες από HPV[34-40]. Με βάση αυτή την παρατήρηση, διατυπώθηκε η υπόθεση ότι η ενσωμάτωση του ιικού γενώματος αποτελεί το γεγονός-κλειδί στη διαδικασία της καρκινογένεσης και μπορεί να πυροδοτήσει την χρωμοσωμική αστάθεια. Στη βιβλιογραφία αναφέρονται, μεταξύ άλλων, τρεις σημαντικοί μηχανισμοί, οι οποίοι, ενδέχεται, τελικά, να εξηγούν αυτή τη θεωρία. Πρώτον, η διάρρηξη του ιικού Ε2 γονιδίου στα κύτταρα με ενσωματωμένο το γενωμικό υλικό του HPV, μπορεί να απελευθερώσει τον ιικό «προωθητή» (promoter) που ελέγχει την έκφραση των Ε6 και Ε7 ογκογονιδίων. Η υπόθεση αυτή υποστηρίζεται από πειράματα που κατέδειξαν ότι η εισαγωγή ανέπαφων Ε2 γονιδίων σε σειρές καρκινικών κυττάρων (HeLa) είχε σαν αποτέλεσμα την καταστολή της ανάπτυξης των όγκων λόγω καταστολής της έκφρασης των Ε6 και Ε7 γονιδίων. Δεύτερον οι cis- δρώσες κυτταρικές αλληλουχίες μπορεί να επηρεάσουν τη δράση του promoter ο οποίος ελέγχει - όπως αναφέρθηκε - τη μεταγραφή των ιικών Ε6/Ε7 γονιδίων. Εναλλακτικά, η επίδραση άλλων κυτταρικών ακολουθιών μπορεί να σταθεροποιήσει τα ιικά Ε6 και Ε7 αντίγραφα από τα ήδη ενσωματωμένα του ιικού γενώματος[41], ενισχύοντας, έτσι, τα επίπεδα έκφρασής τους και το ογκογόνο δυναμικό τους[42-43]. Τρίτον, τα ενσωματωμένα ιικά γονίδια μπορούν, δυνητικά, 45

46 να ενεργοποιήσουν κυτταρικά ογκογονίδια ή να απενεργοποιήσουν ογκοκατασταλτικά γονίδια του κυττάρου ως «ένθετη μεταλλαγή» (insertional mutagenesis)[38, 44-45]. Ερευνητικά δεδομένα επί των γονιδιακών τόπων, όπου συνήθως επισυμβαίνει ενσωμάτωση (integration loci) σε περιπτώσεις προκαρκινικών αλλοιώσεων και σε καρκίνους, έχουν δείξει τη συσσώρευση τέτοιων σημείων ενσωμάτωσης σε εύθραυστες χρωμοσωμικές περιοχές με ενεργή αντιγραφική δραστηριότητα[38-39]. Παρολαυτά η θεωρία της «ένθετης μεταλλαγής» ως απαραίτητος μηχανισμός της καρκινογένεσης δεν έχει ακόμα αποδειχθεί[35, 37, 46]. Αν και η ενσωμάτωση του ιικού γενώματος σε αυτό του ξενιστού συμβάλλει καθοριστικά στη διαδικασία της νεοπλασματικής εξαλλαγής, παρολαυτά η απουσία ενσωματωμένου ιικού υλικού σε ορισμένους καρκίνους, υποδηλώνει πως δεν είναι πάντα προαπαιτούμενο για την κακοήθη εξαλλαγή. Με βάση τη βιβλιογραφία, διατυπώνεται η θεωρία ότι η ενσωμάτωση του γενώματος των ιών HPV υψηλού κινδύνου (HR-HPV), ως επί το πλείστον αντικατοπτρίζει το επίπεδο της χρωμοσωμικής αστάθειας[47] και το ότι αν η ενσωμάτωση αποτελεί το βασικό καθοριστή που οδηγεί στην απρόσκοπτη έκφραση των ιικών γονιδίων και στη μετατροπή των λοιμώξεων σε καρκινογένεση, ένα ποσοστό των όγκων πρέπει να φτάσει στο στάδιο αυτό μέσω διαφορετικών μονοπατιών (pathways). Εναλλακτικά, προτείνεται ότι η ενσωμάτωση είναι μάλλον, μία συνέπεια της χρωμοσωμικής αστάθειας, που προκαλείται από τη μη ελεγχόμενη έκφραση των Ε6/Ε7, και όχι η αιτία της[48]. Με βάση αυτό το σενάριο, η μη ελεγχόμενη έκφραση στα προσβεβλημένα κύτταρα από ιούς HPV υψηλού κινδύνου πρέπει προκαλείται με ανεξάρτητους μηχανισμούς. Επιπλέον, η συγκριτική μελέτη των χρονικών σημείων της ιικής ενσωμάτωσης και της εξάπλωσης των κυτταρικών κλώνων, έδειξε ότι η ανευπλοϊδία προηγείται της εξάπλωσης των κυτταρικών κλώνων που περιέχουν ενσωματωμένο ιικό γονιδίωμα[49]. Παρά τις θεωρίες αυτές, φαίνεται πως ο εντοπισμός της ύπαρξης αντιγράφων των Ε6/Ε7 αποτελεί πιο ακριβή μέθοδο ενδεικτική της εξέλιξης προς κακοήθεια, συγκριτικά με την ανίχνευση του HPV DNA. Αυτό αποδίδεται, πρώτον, στο ότι οι διαθέσιμες τεχνικές ανίχνευσης του HPV DNA έχουν επικεντρωθεί στην ανίχνευση της L1 δομικής περιοχής του ιού. Η πρωτεΐνη όμως αυτή εκφράζεται αργά στον κύκλο ζωής του ιού στα υψηλής διαφοροποίησης παραβασικά 46

47 (suprabasal) κύτταρα, και δε σχετίζεται με το μηχανισμό ογκογένεσης. Έτσι, οι διαθέσιμες τεχνικές ανίχνευσης του HPV DNA δεν ανιχνεύουν τη δραστηριότητα των ογκοπρωτεϊνών του HPV, που επί της ουσίας, αποτελεί το μοναδικό μέτρο της εξέλιξης των νεοπλασματικών αλλαγών στο κύτταρο. Σε περίπτωση, δε, απώλειας της L1 περιοχής εξαιτίας της ενσωμάτωσης του ιικού γενώματος σε αυτό του ξενιστού, οι τεχνικές αυτές λανθασμένα θα καθορίσουν το δείγμα σαν αρνητικό, παρά το γεγονός ότι μπορεί να υπάρχει επιθετική δραστηριότητα, που μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικές αλλαγές προκαλούμενες από τις ογκοπρωτεΐνες Ε6/Ε7. Επιπλέον, το μοτίβο της γονιδιακής έκφρασης του HPV μεταβάλλεται στα διαφορετικά επίπεδα του επιθηλίου και διαφέρει ανάλογα με τη βαρύτητα της αλλοίωσης. Έτσι μελετώντας το μοντέλο της γονιδιακής έκφρασης, είναι πιθανό να εκτιμηθεί η βαρύτητα της υποκείμενης αλλοίωσης και το αποτέλεσμα της λοίμωξης. Τα δεδομένα αυτά οδήγησαν στην ανάπτυξη νέων, σύγχρονων μεθόδων μοριακής διερεύνησης για την τυποποίηση και την ανίχνευση του mrna των Ε6/Ε7 ογκοπρωτεινών, όπως η NASBA για τους πέντε συνηθέστερους καρκινογόνων τύπων του HPV, των 16, 18, 31, 33 και 45 και η κυτταρομετρία ροής. Βιολογία της λοίμωξης από ιό HPV Η μόλυνση από HPV δε συνεπάγεται απαραίτητα και εκδήλωση νόσου, καθώς, σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί να παραμείνει σε λανθάνουσα μορφή. Η εξέλιξη ή όχι της λοίμωξης εξαρτάται από τη σχέση της ιογόνου δράσης και της ανοσολογικής απάντησης του ξενιστή στην προσβολή. Ο χρόνος επώασης του ιού κυμαίνεται από 6 εβδομάδες έως και 8 μήνες. Όταν ο ιός βρίσκεται σε επισωματική μορφή (λανθάνουσα φάση), το χρονικό διάστημα ανάμεσα στη μόλυνση και στην πιθανή κλινική εκδήλωση της νόσου ανέρχεται μέχρι και στα 10 έτη. Στην περίπτωση που η λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος εκπέσει τοπικά, αναπτύσσεται λοίμωξη παραγωγικού τύπου. Εάν το ιικό DNA δεν έχει ενσωματωθεί ακόμα στο γενετικό υλικό του ξενιστή, κατά τη διαδικασία της διαφοροποίησης των βασικών κυττάρων του επιθηλίου, τα αντίγραφα του επισωματικού ιού αυξάνονται, προκαλώντας την εμφάνιση κυρίως καλοήθων 47

48 αλλοιώσεων [50]. Εάν έχει ενσωματωθεί όμως το γενετικό υλικό του ιού σε αυτό του ξενιστή, η εξέλιξη της βλάβης εξαρτάται από τον τύπο του ιού (υψηλού ή χαμηλού κινδύνου) και από τη συνέργεια, ενδεχομένως, και άλλων παραγόντων όπως το κάπνισμα, η εξωγενής χορήγηση ορμονών ή η χρήση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων κ.ά [3, 51-52]. Φυσική Ιστορία HPV λοίμωξης Η ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου της μήτρας προκύπτει ως ακολουθία τεσσάρων βημάτων: προσβολή από τον ιό HPV, επιμονή της λοίμωξης, εξέλιξη ενός κλώνου κυττάρων- με εμμένουσα λοίμωξη από HPV - προς προκαρκινική αλλοίωση και, τελικά, διήθηση. Στο μοντέλο αυτό μπορεί να συμβούν και βήματα υποστροφής, με κάθαρση της λοίμωξης ή, σπανιότερα, με υποχώρηση των προκαρκινικών αλλοιώσεων. Εξαιτίας της κοινής τους οδού μετάδοσης, μέσω επαφής, συχνά διαφορετικοί τύποι του HPV μεταδίδονται μαζί, με αποτέλεσμα να εμφανίζεται σε ποσοστό της τάξης του 20-30% συλλοίμωξη από διαφορετικούς τύπους ιού στις προσβεβλημένες γυναίκες του γενικού πληθυσμού. Στις περισσότερες προοπτικές μελέτες γυναικών με αρνητική κυτταρολογική διάγνωση του επιχρίσματος του τεστ Παπανικολάου και θετικό HPV DNA test, κατά την εισαγωγή στον πληθυσμό της μελέτης, ο αθροιστικός κίνδυνος (cumulative risk) εμφάνισης χαμηλού βαθμού αλλοιώσεων στο τεστ Παπ φτάνει στο μέγιστο ποσοστό (25-50%) κατά τον πρώτο και δεύτερο χρόνο της μελέτης. Στη συνέχεια, ο κίνδυνος μειώνεται, καταλήγοντας σε ένα σταθερό βασικό επίπεδο (<5% των επιχρισμάτων) περίπου στα τέσσερα χρόνια της μελέτης[53-54]. Ο ελάχιστος αυτός αθροιστικός κίνδυνος, όμως, συνεχίζει να υφίσταται και για μεγαλύτερο διάστημα παρατήρησης ( 15 χρόνια), υποδηλώνοντας ότι ορισμένες γυναίκες διατηρούν επίμονη μόλυνση[55-56]. Οι περισσότερες λοιμώξεις από HPV είναι παροδικές και αντιμετωπίζονται από το ανοσοποιητικό σύστημα (μέσω κυτταρικής ανοσίας) εντός διαστήματος 1-2 ετών από την πρώτο-μόλυνση[57]. Μεταξύ των διαφορετικών τύπων του ιού, αυτοί που προκαλούν τις πιο επίμονες μολύνσεις, φαίνεται ότι είναι και οι πιο συχνοί[58]. Ορίζοντας ένα χρονικό διάστημα μελέτης, παρατηρείται ότι όσο αυξάνεται η χρονική διάρκεια παραμονής της μόλυνσης από ένα, έστω, 48

49 συγκεκριμένο τύπο HPV, τόσο μειώνεται η πιθανότητα κάθαρσής του και, αντίστροφα, αυξάνεται ο κίνδυνος εμφάνισης προκαρκινικών αλλοιώσεων[59]. Παρολαυτά, ο μέσος χρόνος παραμονής και ορισμένων μη- καρκινογόνων τύπων (π.χ. HPV 61) μπορεί να είναι εξαιρετικά μεγάλος [58]. Οι παράγοντες που αυξάνουν τον κίνδυνο παραμονής μίας λοίμωξης ή πρόκλησης προκαρκινικών αλλοιώσεις, δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Ως ισχυρότερος παράγοντας θεωρείται ο τύπος του ιού[55, 58]. Ο HPV 16 θεωρείται εξαιρετικά καρκινογόνος, με τον απόλυτο κίνδυνο ανάπτυξης προκαρκινικών αλλοιώσεων να προσεγγίζει το 40% μετά από 3-5 χρόνια εμμένουσας μόλυνσης [56, 58, 60]. Ο συνολικός κίνδυνος ανάπτυξης προκαρκινικών αλλοιώσεων στην περίπτωση μόλυνσης από πολλαπλούς τύπους ιού είναι αυξημένος συγκριτικά με τον κίνδυνο από μονήρη μόλυνση με καθένα έναν τύπο ξεχωριστά. Δεν είναι όμως ξεκαθαρισμένο εάν ο συνολικός κίνδυνος αποτελεί άθροισμα των επιμέρους κινδύνων κάθε τύπου ξεχωριστά[61]. Οι επικρατούσες λοιμώξεις (prevalent infections) που ανιχνεύονται κατά τον πληθυσμιακό έλεγχο, τείνουν να επιμένουν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στις γηραιότερες, έναντι των νεότερων γυναικών. Αυτό το φαινόμενο μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι ενδεχομένως πρόκειται για λοιμώξεις ήδη μακράς διαρκείας[62]. Από μελέτες πληθυσμιακού ελέγχου, φαίνεται ότι το μέσο χρονικό διάστημα στο οποίο αποκαθαίρεται η μόλυνση είναι 6-18 μήνες[59]. Γενικά, δεν υφίσταται καθορισμός του χρονικού διαστήματος, μετά την παρέλευση του οποίου, η λοίμωξη να γίνεται κλινικά σημαντική. Σε μελέτες στις οποίες έχουν τεθεί τα χρονικά όρια για τον έλεγχο ανάπτυξης αλλοιώσεων στα δύο και πλέον χρόνια, υποδηλώνεται ότι οι εμμένουσες μολύνσεις θέτουν σε μεγαλύτερο κίνδυνο τις ασθενείς[63]. Ένα μικρό ποσοστό, της τάξης του 10%, λοιμώξεων με υψηλού κινδύνου ιούς, που επιμένουν για αρκετά χρόνια, αυξάνουν σημαντικά τον απόλυτο κίνδυνο εμφάνισης προκαρκινικών αλλοιώσεων[58]. Μελέτες κοορτής με στοιχεία μέχρι και 10 ετών παρακολούθησης, δείχνουν ότι μετά την κάθαρση, μπορεί να επανεμφανιστεί σποραδικά ο ίδιος τύπος ιού[64]. Δεν είναι ακόμα σαφές εάν οι λοιμώξεις δεν ανιχνεύονται επειδή όντως έχει επέλθει πλήρης κάθαρση του ιού, ή εάν παραμένει ο ιός σε λανθάνουσα φάση στα βασικά κύτταρα του επιθηλίου και πολλαπλασιάζεται μεν, αλλά σε πολύ χαμηλά επίπεδα, χωρίς πλήρη έκφραση των ιϊκών πρωτεϊνών και για το λόγο αυτό, πιθανών, δεν ανιχνεύεται από τις μοριακές τεχνικές που βασίζονται στο 49

50 DNA. Η παρουσία αυξημένου αριθμού HPV λοιμώξεων σε οροθετικούς ασθενείς υποστηρίζει τη θεωρία της παραμονής του ιού σε λανθάνουσα φάση[65]. Σε ορισμένους πληθυσμούς, η παρουσία HPV εμφανίζει δικόρυφη κατανομή στις ηλικιακές ομάδες του πληθυσμού, με τη δεύτερη να αφορά σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να οφείλεται, είτε, σε επαν-ενεργοποίηση από τη λανθάνουσα φάση λόγω γήρανσης του συστήματος κυτταρικής ανοσίας που επιτηρεί τη λοίμωξη, είτε στην απόκτηση νέων ερωτικών συντρόφων των γυναικών ή των συντρόφων τους, είτε σε επίδραση του φαινομένου κοορτής (cohort effects). Στοιχεία εκ των ιδίων μελετών δείχνουν ότι παρά την πιθανή ενεργοποίηση από τη λανθάνουσα μορφή, οι γυναίκες μεγαλύτερης ηλικίας με μακρά περίοδο χωρίς στοιχεία κυτταρολογικής ατυπίας στο τεστ Παπ, έχουν πολύ μικρό κίνδυνο να αναπτύξουν καρκίνο του τραχήλου της μήτρας[66]. Στις περιπτώσεις γυναικών με ιστολογικά επιβεβαιωμένες CIN, ουσιαστικά ενέχεται μικρότερος κίνδυνος εξέλιξης σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας από αυτές μόνη ένδειξη την κυτταρολογική διάγνωση LSIL του τεστ Παπ[67]. Στην ιστολογική διάγνωση CIN 1 μπορούν να ενσωματωθούν και οι περιπτώσεις κακής ή ελλιπούς λήψης βιοψίας κολποσκοπικά κατευθυνόμενης. Θεωρείται ότι η συγκεκριμένη διάγνωση δεν μπορεί εύκολα να αναπαραχθεί, ακόμα και σε μεγάλα ιστοτεμάχια[68]. Σε περιπτώσεις λοίμωξης με οποιονδήποτε τύπο υψηλού κινδύνου HPV, στις περιπτώσεις CIN 1 δε φαίνεται να ελοχεύει μεγαλύτερος κίνδυνος εξέλιξης σε CIN 3 συγκριτικά με τις περιπτώσεις με αρνητική βιοψία[67]. Σε πρόσφατα δημοσιευμένη μελέτη ανασκόπησης της βιβλιογραφίας, αναφέρεται πως, σε μέσο χρονικό διάστημα παρακολούθησης του πληθυσμού 21,9 μηνών, ο αθροιστικός κίνδυνος ανάπτυξης CIN 1 αλλοίωσης ήταν 14,6%[69]. Ο ετήσιος κίνδυνο εξέλιξης προς CIN 1 υπολογίστηκε στο 8,3%, ενώ, ο αντίστοιχος ετήσιος κίνδυνος εξέλιξης μίας λοίμωξης ειδικά από τα στελέχη 16/18 προς CIN 1 εκτιμάται στο 9,4%[70]. Αρχής γενομένης χρονικά από την πρώτο-μόλυνση από τον HPV, και υπολογίζοντας τον ετήσιο κίνδυνο εξέλιξης σε CIN 2 και CIN3, αυτός εκτιμάται από 4,8% έως 6,7% και από 1,7% έως 5,3%, αντίστοιχα[69-70]. Όταν η λοίμωξη προέρχεται από HPV 16/18, ο ετήσιος κίνδυνος εξέλιξης υπολογίζεται σε 5,8% για CIN 2 και 3,5% για CIN 3[70-71]. 50

51 Στοιχεία από δύο μελέτες ως προς την ετήσια εξέλιξη των CIN 1 προς CIN 2, ανεξαρτήτως HPV τύπου, αναφέρουν ότι ο μέσος κίνδυνος υπολογίζεται περίπου στο 7%[72-73]. Στα πλαίσια ανασκόπησης της βιβλιογραφίας από τις Η.Π.Α. για τις περιπτώσεις CIN 2-3, έγινε εμφανές ότι στο 59% των δειγμάτων ελέγχου ανιχνεύθηκε HPV 16/18. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι οι περιπτώσεις CIN 1 στις οποίες ανιχνεύονται οι συγκεκριμένοι τύποι, είναι πιο πιθανό να εξελιχθούν σε CIN 2, από τις αντίστοιχες βλάβες με προσβολή από άλλους τύπους[74-78]. Δύο μελέτες, που δημοσιεύτηκαν στη διεθνή βιβλιογραφία, υπολόγισαν τον ετήσιο κίνδυνο εξέλιξης του CIN 2 σε CIN 3 σε ~ 8% και 20% αντίστοιχα. Η συναξιολόγηση των αποτελεσμάτων των συγκεκριμένων μελετών, καθόρισε τον ετήσιο κίνδυνο εξέλιξης στο τελικό 14%[69]. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης των γυναικών ήταν στη μία μελέτη 3,75 και στην άλλη 2,0 χρόνια. Το ποσοστό εξέλιξης σε CIN 3 κατά τη συνολική χρονική διάρκεια των μελετών ήταν ~ 23% και 33% αντίστοιχα[73, 79]. Οι μελέτες επί της εξέλιξης μίας υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης σε καρκίνο in situ ή μικροδιηθητικό καρκίνο, έχουν σοβαρούς περιορισμούς, λόγω των ηθικών θεμάτων, που εγείρονται ως προς την κλινική επιλογή παρακολούθησης ή αντιμέτωπισης αυτών των περιστατικών. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται πως ο ετήσιος κίνδυνος υπολογίζεται από 47%[80], έως 38%[73]. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων των δημοσιευμένων μελετών υπολογίζει το συνολικό κίνδυνο στο 43%[69]. Αξιοποιώντας τα στοιχεία του συνολικού διαστήματος παρακολούθησης, των 21 μηνών μίας μελέτης και των 45 μηνών άλλης, το ετήσιο ποσοστό εξέλιξης σε καρκίνο in situ σταθμίζεται στο 38% και 40%, αντίστοιχα. Για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (Stage I κατά FIGO), τα στοιχεία είναι περιορισμένα. Χρησιμοποιώντας βαθμονόμηση (calibration) των πληθυσμιακών δεδομένων, ορισμένοι ερευνητές έχουν υπολογίσει εξαιρετικά χαμηλά ποσοστά της ετήσιας εξέλιξης από το CIN 2/3 προς τον διηθητικό καρκίνο. Για παράδειγμα, οι Goldie και συν. αναφέρουν μεγάλο εύρος του εκτιμώμενου κινδύνου από το ελάχιστο 0,2% έως και το μέγιστο 4% σε γυναίκες 65 ετών και άνω[81]. Άλλοι συγγραφείς αναφέρουν τις πιθανότητες εξέλιξης σε ετήσιο επίπεδο μεταξύ 3% και 5%, χωρίς να κάνουν διάκριση ανάλογα με την ηλικία[82-84]. Τα χαμηλά ολικά ετήσια ποσοστά του κινδύνου εξέλιξης, 51

52 αποδίδονται στην επίδραση της παρέλευσης του χρόνου. Το ηλικιακό φάσμα στο οποίο παρατηρείται η μέγιστη επίπτωση της μόλυνσης από HPV διαφέρει από αυτό της μέγιστης επίπτωσης του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κατά δύο με τρεις δεκαετίες, κατά μέσο όρο[69]. Το χρονικό διάστημα μεταξύ πρώτο-λοίμωξης και εμφάνισης μικροσκοπικά ορατής προκαρκινικής αλλοίωσης, μπορεί να είναι μικρότερο του αναμενόμενου, ακόμα και εντός πενταετίας[85]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, αναφέρεται ακόμα και δύο χρόνια μετά την έναρξη της σεξουαλικής ζωής[86-88]. Η κλινική σημασία (όπως ο κίνδυνος εμφάνισης διηθητικής νόσου) σε αυτές τις «πρώιμες» περιπτώσεις δεν έχει, ακόμα, καθοριστεί σαφώς. Η μέση ηλικία εμφάνισης προκαρκινικών αλλοιώσεων κυμαίνεται μεταξύ 25 και 35 ετών και εξαρτάται, αφενός, από τη μέση ηλικία έναρξης της σεξουαλικής ζωής και, αφετέρου, από τη συχνότητα εφαρμογής των διαγνωστικών μεθόδων του πληθυσμιακού ελέγχου. Όσον αφορά την ηλικία της πρώτης σεξουαλικής επαφής, γενικά θεωρείται ότι ταυτίζεται με την ηλικία έκθεσης στον HPV, εκτός των περιπτώσεων σεξουαλικής κακοποίησης σε νεαρή ηλικία. Στους πληθυσμούς, που υποβάλλονται σε τυχαίο, μη οργανωμένο πρόγραμμα πληθυσμικού ελέγχου, ο μεγαλύτερος κίνδυνος εμφάνισης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας παρουσιάζεται νωρίτερα σε σχέση με τους υπολοίπους καρκίνους των ενηλίκων, αγγίζοντας το υψηλότερο επίπεδο επίπτωσης, και διατηρώντας το, στην ηλικιακή ομάδα 35 έως 55 ετών[89]. Δεδομένου ότι σε απόλυτο αριθμό οι προκαρκινικές αλλοιώσεις είναι περισσότερες από τους καρκίνους, φαίνεται ότι τελικά μία μειοψηφία τελικά εξελίσσεται. Η αύξηση της πιθανότητας και ο ακριβής χρόνος κατά τον οποίο ο κίνδυνος διήθησης γίνεται μέγιστος, εάν οι προκαρκινικές αλλοιώσεις δεν αντιμετωπιστούν, δε δύναται να υπολογιστεί σε μελέτες κοορτής, λόγω των ηθικών θεμάτων που εγείρονται[90]. Από ορισμένες μελέτες προκύπτουν εκτιμήσεις του κινδύνου διήθησης από 20 έως 30% για χρονικά διαστήματα μελέτης 5 και 10 έτη αντίστοιχα [91-92]. Ο κίνδυνος ανάπτυξης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας οφείλεται αφενός στην επίδραση της λοίμωξης από HPV και αφετέρου στην έλλειψη αποτελεσματικού προγράμματος πληθυσμιακού ελέγχου. Άλλοι παράγοντες θεωρούνται ελάσσονος σημασίας συγκριτικά με την παρουσία ενός ή περισσότερων καρκινογόνων τύπων του ιού. Το κάπνισμα[93], η πολυτοκία[94] και η μακροχρόνια λήψη αντισυλληπτικών[95] διπλασιάζουν ή τριπλασιάζουν τον 52

53 κίνδυνο εμφάνισης προκαρκινικών αλλοιώσεων και καρκίνου στις γυναίκες, που είναι ήδη προσβεβλημμένες από τύπους HPV υψηλού κινδύνου. Ο ρόλος της επίδρασης χρόνιας φλεγμονής ιδιαίτερα από Χλαμύδια του Τραχώματος (Clamydia Trachomatis), δεν έχει επιβεβαιωθεί[96]. Επιπλέον, δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία ως προς το ρόλο που πιθανών παίζουν τα μικροστοιχεία και οι παράγοντες διατροφής, παρά μόνο ως προς την προστατευτική δράση που πιθανών ασκούν στην πρόληψη των προκαρκινικών αλλοιώσεων τα υψηλά επίπεδα φυλλικού οξέος[97]. Μεταξύ των ήδη προσβεβλημένων γυναικών από HPV, το χαμηλό κοινωνικό-οικονομικό επίπεδο θεωρείται παράγοντας κινδύνου, ακόμα και αν ληφθεί υπόψη η επαρκής παροχή υπηρεσιών υγείας[98]. Σε ορισμένες μελέτες, έχει γίνει εμφανής μία πρώιμη συσχέτιση μεταξύ της χρήσης προφυλακτικού και της μείωσης του χρονικού διαστήματος παραμονής της λοίμωξης ή ακόμα και της εξέλιξης προς προκαρκινικές αλλοιώσεις[99-100]. Στις οροθετικές (HIV) ασθενείς η λοίμωξη με HPV παρουσιάζει μεγαλύτερη επίπτωση, επιμονή και μικρότερη πιθανότητα κάθαρσης. Παράλληλα, παρουσιάζουν συχνότερα πολλαπλές μολύνσεις. Παρολαυτά, πιθανότητα εμφάνισης διηθητικής νόσου δε φαίνεται να αυξάνεται για αυτές τις ασθενείς[101]. Όσον αφορά την εμφάνιση διηθητικής νόσου, πέραν της ηλικίας, δεν υπάρχουν γνωστοί παράγοντες κινδύνου. Ορισμένοι τύποι HPV όπως ο 16, 18 και 45 παρουσιάζονται ποσοστιαία συχνότερα σε διηθητικούς καρκίνους, έναντι των προκαρκινικών αλλοιώσεων από άλλους τύπους[102]. Θεωρείται πως η ενσωμάτωση του γενετικού υλικού του ιού σε αυτό του ξενιστή συνδέεται με την εμφάνιση διηθητικών μορφών της νόσου[103]. Η συνεχής μεταγραφή των ογκογονιδίων του HPV είναι απαραίτητη για να διατηρηθεί η ογκογένεση[37]. Η φυσική ιστορία της λοίμωξης από HPV δεν έχει ακόμα αποσαφηνιστεί. Οι μελέτες που αφορούν το πεδίο αυτό, έχουν ορισμένους σοβαρούς περιορισμούς[104]. δεν υπάρχει αξιόπιστο ζωικό μοντέλο και in vitro πειραματικά συστήματα για τη μελέτη της φυσικής ιστορίας. Στις περισσότερες μελέτες, οι γυναίκες που συμμετέχουν έχουν ήδη εκτεθεί στον ιό πριν την είσοδο στη μελέτη, οι συμμετέχουσες, δε, παρακολουθούνται σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα ( από μήνες έως χρόνια). 53

54 Τα, ενδεχομένως, μακρά αυτά χρονικά διαστήματα μεταξύ των ελέγχων, δεν επιτρέπουν το συνεχή έλεγχο της λοίμωξης και των μεταβολών που προκαλεί στον τράχηλο. Συνήθως, δεν διαχωρίζεται η έννοια της επίπτωσης και του επιπολασμού της λοίμωξης. Υπάρχουν περιορισμοί στη λήψη των επιχρισμάτων και στην τεχνολογία ανίχνευσης του ιού καθώς και ελλείψεις σε αναπαραγώγιμους βιοδείκτες, στοιχεία που καθιστούν δύσκολο τον προσδιορισμό πρώτο-μόλυνσης, επαναλοίμωξης ή αναζωπύρωσης προηγούμενης λοίμωξης. Συχνά είναι δύσκολο να καθοριστεί ο ακριβής τύπος HPV που προκαλεί αλλοίωση, όταν πρόκειται για περιπτώσεις πολλαπλών μολύνσεων. Η παρουσία πολλαπλών τύπων μπορεί να επηρεάσει την παραμονή της λοίμωξης και τη φυσική ιστορία της νόσου. Δεν είναι δυνατό να καθοριστεί ο ακριβής τύπος που ευθύνεται για την αρχική εμφάνιση της αλλοίωσης, καθώς και η απάντηση του ανοσοποιητικού απέναντι σε κάθε τύπο ξεχωριστά ή στο σύνολό τους, στοιχεία σημαντικά για την ανάπτυξη αποτελεσματικών εμβολίων. Οι μελέτες επί γυναικών που δεν έχουν έλθει σε επαφή με τον ιό, επικεντρώνονται σε νεαρές ηλικίες, και επομένως τα αποτελέσματα να μην μπορούν γενικευθούν με ασφάλεια και σε μεγαλύτερες ηλικίες. Στη λοίμωξη επιδρούν και ορισμένοι συμπαράγοντες. Κάποιοι από αυτούς, ίσως, σχετίζονται περισσότερο με την εξέλιξη της αλλοίωσης, έναντι της λοίμωξης από HPV, ενώ άλλοι μπορεί να σχετίζονται με τη δημιουργία ευνοϊκού για τον ιό μικροπεριβάλλοντος στα κύτταρα της βασικής στιβάδας. Επιδημιολογία HPV λοίμωξης Οι περισσότερες γυναίκες παγκοσμίως θα μολυνθούν από τον HPV κάποια στιγμή στη ζωή τους[105]. Τα στοιχεία που αφορούν στην επιδημιολογία της λοίμωξης από τον ιό και η κατανομή των τύπων του, προέρχονται, κυρίως, από μετά-ανάλυση μελετών από την παγκόσμια βιβλιογραφία, που έγινε για λογαριασμό του Παγκοσμίου Οργανισμού Υγείας (Π.Ο.Υ.- W.H.O.) το 2010 και από μελέτες της IARC. Η μελέτη της IARC έχει δύο μεθοδολογικά πλεονεκτήματα: 54

55 1. χρησιμοποιήθηκε προτυπωμένο πρωτόκολλο για τη λήψη και τη συλλογή πληροφοριών ως προς τους παράγοντες κινδύνου 2. η ανίχνευση HPV DNA έγινε με μία μόνο τεχνική (GP5+/6+ PCR) από κεντρικά και μόνο εργαστήρια. Η συνολική επίπτωση του HPV, προτυπωμένη ανάλογα με την ηλικία, υπολογίστηκε στο 10,5% (95% CI: 9,9%- 11%) από τη μελέτη της IARC[106]. Μεταξύ γυναικών με φυσιολογικό κυτταρολογικό επίχρισμα τραχήλου της μήτρας, από τα δεδομένα του Π.Ο.Υ. φαίνεται ότι σε παγκόσμιο επίπεδο η συνολική επίπτωση του HPV είναι 11,4% (95% CI: 11,3%- 11,5%). Ψηλότερα ποσοστά παρουσιάζονται μεταξύ των γυναικών από την Καραϊβική με 35,4% (95% CI: 29%- 42.2%) και ακολουθούν οι γυναίκες της Ανατολικής Αφρικής με 33,6% (95% CI: 30,2%- 37,1%). Χαμηλότερα ποσοστά έχει η Δυτική Ασία με 2,2% (95% CI: 1,5%- 3,1%) και η Δυτική Ευρώπη με 7,3% (95% CI: 7,1%- 7,5%). Στις γυναίκες αυτές ο πιο συχνός τύπος είναι ο 16 (2,7%), είτε πρόκειται για αναπτυγμένες, είτε για αναπτυσσόμενες περιοχές του πλανήτη. Η κατανομή μεταβάλλεται στη συνέχεια, αφού δεύτερος κατατάσσεται ο 31 σε παγκόσμιο επίπεδο (1,1%) και στις αναπτυγμένες χώρες (1,3%), ενώ στις αναπτυσσόμενες υπερέχει ο 18 (1,4%). Σε φυσιολογικές γυναίκες ακολουθούν σε παγκοσμίως στην κατάταξη οι 18 (1,1%), 52 (1,0%), 51 (0,8%), 58 (0,7%), 56 (0,6%), 39 (0,6%), 45 (0,6%) και 33 (0,5%). Οι διαφορές που παρατηρούνται ως προς τις σχετικές συχνότητες εμφάνισης των διαφορετικών τύπων του HPV, μπορεί να οφείλονται στην αλληλεπίδραση σύνθετων γεωγραφικών και βιολογικών παραγόντων, όπως η σχέση μεταξύ των τύπων του ιού και των ανοσιακών παραγόντων του ξενιστή (π.χ. πολυμορφισμοί HLA)[107]. Παρολαυτά, αν και η συχνότητα εμφάνισης του 16 σε σχέση με άλλους τύπους, παρουσιάζει μεγαλύτερη διαφοροποίηση ανάλογα με τη γεωγραφική περιοχή του πλανήτη (υψηλότερη στη Ευρώπη και χαμηλότερη στην Αφρική), ο τύπος αυτός, ειδικά, φαίνεται να επηρεάζεται λιγότερο από την κατάσταση του ανοσιακού συστήματος[108]. Με βάση τα στοιχεία των μελετών της IARC (2005), μεταξύ γυναικών με φυσιολογικό κυτταρολογικό επίχρισμα, οι θετικές περιπτώσεις στις δοκιμασίες ανίχνευσης του HPV DNA (10,5% προτυπωμένο με την ηλικία), είχαν σε ποσοστό 6,6% μονήρη λοίμωξη. Για λοιμώξεις από πολλαπλούς τύπους, 0,9% είχε 55

56 προσβληθεί από τρεις και πλέον τύπους και το διπλάσιο, σχεδόν, ποσοστό από δύο (1,7%)[106]. Στην κυτταρολογική κατηγορία ASCUS, η διάγνωση, αφενός, δεν είναι τυποποιημένη και, αφετέρου, με δεδομένη την απόκλιση στη διάγνωση μεταξύ του ιδίου ή διαφορετικών κυτταρολόγων, η θετική εξέταση ανίχνευσης HPV παρουσιάζει μεγάλη διακύμανση, όπως φαίνεται στη βιβλιογραφία[109]. Επιπλέον, η παρουσία του ιού μεταβάλλεται ανάλογα με την ηλικία. Στη μελέτη ALTS, στην οποία ελέχθησαν 27 τύποι του ιού με PGMY09/11 ιχνηθέτες, 61% των εξετασθέντων δειγμάτων ήταν θετικά στον HPV, και ενώ ήταν 78% στις ηλικίες 18-24, το ποσοστό έπεφτε στο 32% στις άνω των 35 ετών. Η συχνότητα εμφάνισης του HPV 16 ήταν, στην ίδια μελέτη, 24% και για τον HPV 18 8% στις ASCUS περιπτώσεις. Το ποσοστό της HPV 16/18 συλλοίμωξης παρουσιάζει, και αυτό, γραμμική μείωση με την πρόοδο της ηλικίας και κυμαίνεται στο 35% στις γυναίκες ετών και 19% στις άνω των 35[60]. Άλλες μελέτες, χρησιμοποιώντας την ίδια τεχνική ανίχνευσης του ιού, παρουσιάζουν τα ποσοστά θετικότητας στο 42% και 59%, ( 5% και 15% με πολλαπλού τύπου λοιμώξεις) και τη συχνότητα των HPV 16 στο 22% και15%, και HPV 18 στο 4% και 10%, στις αντίστοιχες ηλικιακές ομάδες [61, 110]. Στις περιπτώσεις με χαμηλού βαθμού επιθηλιακές αλλοιώσεις (LSIL), η παγκόσμια επίπτωση του HPV (οποιουδήποτε τύπου) είναι, 71,1%. Συνολικά, τα ποσοστά θετικότητας στις δοκιμασίες HPV DNA κυμαίνονται από 67,1% έως 68,3% για την Ευρώπη, την Κεντρική και Νότια Αμερική και την Ασία. Ιδιαίτερα αυξημένο ήταν στη Βόρια Αμερική (80,2%) και χαμηλό στην Αφρική (59,1%)[111]. Τα στοιχεία του Π.Ο.Υ. για το 2010, διακρίνουν τις περιοχές σε αναπτυγμένες και αναπτυσσόμενες και υπολογίζουν την κατανομή των 10 συχνότερων τύπων του ιού μεταξύ των LSIL βλαβών. Παγκοσμίως ο 16 είναι ο συχνότερος (18,5%) ακολουθούμενος από τον 51 (7,5% παγκόσμια και 9,1% στις αναπτυγμένες χώρες). Στις αναπτυσσόμενες χώρες δεύτερος συχνότερος είναι ο 58 (7,7%). Την τρίτη θέση καταλαμβάνει ο 31 (7,3% παγκόσμια και 7,9% στις αναπτυγμένες χώρες) και ο 18 (6,7%) στις αναπτυσσόμενες. Οι αναλογίες πιθανοτήτων (odds ratio, OR) των λοιμώξεων από HPV 16 και HPV 18 μεταξύ των θετικών LSIL περιστατικών, σε παλαιότερη μελέτη[111], συγκρίθηκαν κατά περιοχές χρησιμοποιώντας σαν αναφορά την Ευρώπη, λόγω του μεγέθους του δείγματος, που προερχόταν από αυτή την 56

57 ήπειρο. Οι γυναίκες με HPV θετική LSIL αλλοίωση, στην Αφρική ήταν στατιστικώς σημαντικά λιγότερο πιθανό να έχουν προσβληθεί από HPV 16 ( OR, 0,49, 95% FCI) σε σχέση με τις Ευρωπαίες ( OR, 1,00, 95% FCI). Οι αντίστοιχες περιπτώσεις στη Βόρεια Αμερική και στην Κεντρική και Νότια Αμερική παρουσίασαν τιμές αναλόγων πιθανοτήτων μεταξύ αυτών Ευρώπης και Αφρικής. Όμως, οι βορειοαμερικανίδες ήταν σημαντικά πιο πιθανό να έχουν προσβληθεί από HPV 18 ( OR, 1,61, 95% FCI), σε σχέση με τις Ευρωπαίες ( OR, 1,00, 95% FCI). ή τις κέντρο-νοτιοαμερικανίδες ( OR, 0,69, 95% FCI). Από την ίδια μελέτη, φαίνεται ότι μετά από συγκερασμό των στοιχείων και αξιολόγηση πολλών παραμέτρων, οι αναλογίες πιθανοτήτων για τις HPV θετικές LSIL περιπτώσεις για τη λοίμωξη από HPV 16 και HPV 18 ήταν υψηλότερες για όσες επιβεβαιώθηκαν και ιστολογικά, έναντι αυτών στις οποίες υπήρχε μόνο κυτταρολογική διάγνωση. Πολυκεντρικές μελέτες επί της φυσικής ιστορίας της λοίμωξης από HPV, καταδεικνύουν τη συμβολή της παρουσίας του ιού σε υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις, που ανέρχεται σε ποσοστό 85%[112]. Πρέπει να αναφερθεί ότι, συχνά, οι υπολογισμοί στις μελέτες της επίπτωσης των διαφόρων τύπων του ιού, δεν διαχωρίζουν τις μονήρεις από τις πολλαπλές λοιμώξεις. Αυτό σημαίνει, ότι στις πολλαπλών τύπων λοιμώξεις, μετράται ο κάθε τύπος, πιθανών, εις διπλούν, όταν αθροίζονται τα περιστατικά, και ότι μερικοί τύποι (π.χ. 6, 11) τείνουν να εμφανίζονται μόνο σε πολλαπλών τύπων λοιμώξεις[112]. Η εκτίμηση της ποσοστιαίας αναλογίας κάθε τύπου του ιού επί των θετικών δειγμάτων, επηρεάζεται, επιπλέον, σε μικρότερο βαθμό όμως, και από την ευαισθησία των τεχνικών ανάλυσης[105]. Αυτό οφείλει να λαμβάνεται υπόψη στη διαδικασία εκτίμησης των παραλλαγών ως προς τη γεωγραφική κατανομή και, τελικά, στον υπολογισμό των πραγματικών διαφορών σε παγκόσμιο επίπεδο. Η οργάνωση πινάκων αξιολόγησης του Π.Ο.Υ. έδειξε πως δεν υπάρχουν ουσιαστικές διαφορές στην ανίχνευση του DNA του ιού για τους τύπους 16, 18, 33 και 45 μεταξύ των διαφορετικών τεχνικών και των διαφορετικών εργαστηρίων. Αντίθετα, για τους τύπους 31, 35, 52 και 6 υπάρχουν διαφορές ως προς την ευαισθησία και την ειδικότητα, οι οποίες πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όταν αξιολογούνται τα στοιχεία διαφορετικών εργαστηρίων. Ως προς την κατάταξη των διαφορετικών τύπων HPV σε HSIL αλλοιώσεις και στις πέντε ηπείρους, με βάση τα στοιχεία του Π.Ο.Υ. του 2010, ο 16 ανιχνεύεται σε ποσοστό 44,1% επί του συνόλου των δειγμάτων. Στη δεύτερη 57

58 θέση βρίσκεται ο 31 (9,4% παγκόσμια και 10,2% στις αναπτυγμένες χώρες), αλλά στις αναπτυσσόμενες χώρες είναι ο 58 (13,5%). Μεγαλύτερες διακυμάνσεις ως προς την κατανομή παρατηρούνται από τις θέσεις αυτές και κάτω, αφού παγκοσμίως ακολουθούν οι 58, 33, 52 και 18, στις αναπτυγμένες χώρες οι 33, 52, 18 και 58 αντίστοιχα και στις αναπτυσσόμενες οι 33, 52, 18 και 58 αντίστοιχα. Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας αποτελεί τον τρίτο σε συχνότητα καρκίνο μεταξύ των γυναικών παγκοσμίως και τον δεύτερο για τις ηλικίες από 15 έως 44 ετών. Το προτυπωμένο με βάση την ηλικία ποσοστό εμφάνισής του είναι 15,2 και ο σχετικός κίνδυνος 1,6. Η συνολική επίπτωση του ιού σε περιπτώσεις διηθητικού καρκίνου, οποιουδήποτε ιστολογικού τύπου, υπολογίζεται στο 87,2% (95% CI 86,7-87,8)[ ]. Θεωρητικά, θα έπρεπε, το 99,7% των καρκίνων του τραχήλου της μήτρας, να είναι θετικοί, όπως υπολογίζεται από τις πιο ευαίσθητες δοκιμασίες ανίχνευσης του HPV[114]. Οι αποκλίσεις από αυτές τις εκτιμήσεις εξηγούνται, γενικά, από τις διαφορές στην ποιότητα των υλικών που εξετάστηκαν, και από το είδος των δοκιμασιών, που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της παρουσίας του ιού. Τα παγκόσμια δεδομένα του Π.Ο.Υ. με την κατανομή των 10 συχνότερων τύπων του ιού επί των καρκίνων του τραχήλου της μήτρας, βασισμένα σε μετάαναλύσεις, δείχνουν ότι ο 16 και ο 18 είναι οι συνηθέστεροι τύποι σε όλες τις ηπείρους (54,4% και 16,5% αντίστοιχα). Επιπροσθέτως, οι τύποι 33, 45 και 31 κατατάσσονται από την τέταρτη έως την έκτη θέση γενικά και από την τρίτη ως την πέμπτη θέση στις ανεπτυγμένες χώρες. Στις αναπτυσσόμενες χώρες, παρατηρείται αυξημένη συχνότητα των 58 και 52, οι οποίοι παρεμβάλλονται στην κατάταξη στην τρίτη και έκτη θέση αντίστοιχα. Μελέτη του 2007[102], αναφέρει πως συνολικά σε παγκόσμιο επίπεδο, 70% των περιπτώσεων διηθητικού καρκίνου σχετιζόταν με λοίμωξη, είτε από τον HPV 16 (55%), είτε από τον HPV 18 (15%). Οι 6 επόμενοι σε συχνότητα τύποι (31, 33, 35, 45, 52 και 58) ευθύνονταν για το επιπλέον 18% των περιπτώσεων. Στην ανάλυση των τύπων του καρκίνου, φαίνεται ότι στον καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων συμπίπτει γενικά η συχνότητα εμφάνισης των τύπων του ιού με τη γενική κατάταξη, με την προσθήκη του 51 σε παγκόσμιο επίπεδο και των 56 και 68 επιπλέον στις αναπτυγμένες χώρες. Στην περίπτωση, όμως των Αδενοκαρκινωμάτων, στην κατάταξη των 10 συχνότερων τύπων του HPV, παρατηρούνται ορισμένες διαφοροποιήσεις από το γενικό μοντέλο. Πρώτος είναι 58

59 ο 18 (38,7%), ακολουθεί ο 16 (35,3%), ο 45 (5,2%) και στη συνέχεια, με φθίνουσα συχνότητα, οι 33, 31, 58, 52, 59, 51 και 35. Από παλαιότερη μελέτη, που αναφέρει τη συνολική επίπτωση του ιού στο 92,5%, το 92,2% των θετικών δειγμάτων είχαν μονήρη και το 7,8% πολλαπλού τύπου λοίμωξη από δύο και πλέον τύπους του ιού[115]. Με βάση τα δεδομένα αυτά, και τα στοιχεία πολυκεντρικών ερευνών[102, ], εάν αγνοηθεί προσωρινά η πιθανή επίδραση της διασταυρούμενης προστασίας από τα εμβόλια κατά του ιού που ήδη κυκλοφορούν, η επόμενη γενιά εμβολίων, που στοχεύουν στην κάλυψη περισσότερων από το 90% των ογκογόνων τύπων παγκοσμίως, θα πρέπει να περιλαμβάνουν στους τύπους 16, 18, 58, 33, 45, 31, 52, 35, 39 και επιπλέον τον 59 που ενδημεί στις αναπτυσσόμενες, και τον 73, με ποσοστό 0,8% στις αναπτυγμένες χώρες[105, 115]. Γενικά, ο HPV 16 είναι ο συχνότερος τύπος ανεξαρτήτως διάγνωσης. Ο HPV 18 είναι ο δεύτερος συχνότερος τύπος σε όλο το φάσμα των αλλοιώσεων του τραχήλου και κυριαρχεί στο Αδενοκαρκίνωμα[119]. Ο HPV 45, μία σπάνια, σχετικά, λοίμωξη σε γυναίκες με φυσιολογικό κυτταρολογικό επίχρισμα, παρουσιάζει συχνότητα εμφάνισης 2,8% σε HSIL αλλοιώσεις και η συχνότητα του σχεδόν διπλασιάζεται (4,4%) στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Σε αντίθεση με παλαιότερα δεδομένα[105], που αναφέρουν τον HPV 58 σαν συχνό τύπο σε φυσιολογικές γυναίκες και σε HSIL, αλλά τον κατατάσσουν σε χαμηλή θέση στον καρκίνο, με τα νεότερα στοιχεία παρατηρείται, πλέον, σημαντική αύξηση της συχνότητας εμφάνισής του. Έτσι, για τους καρκίνους, γενικά, αποτελεί τον τρίτο σε συχνότητα τύπο παγκοσμίως, και διατηρεί για τα πλακώδη καρκινώματα την ίδια θέση, ενώ φαίνεται να είναι λιγότερο συχνός στα Αδενοκαρκινώματα. Αυτού του είδους οι καρκίνοι αποτελούν περίπου το 16% όλων των καρκίνων του τραχήλου, όπως υπολογίζεται από το φάσμα των συχνοτήτων που προέρχεται από τα αρχεία καταγραφής καρκίνων. Παρολαυτά, στις αναπτυγμένες χώρες, με εφαρμοσμένα προγράμματα πληθυσμιακού ελέγχου, παρατηρούνται τάσεις αύξησης της επίπτωσης και της σχετικής συχνότητας εμφάνισης των Αδενοκαρκινωμάτων έως και το 20% των καταγεγραμμένων καρκίνων του τραχήλου. Οι αυξητικές τάσεις αυτές μπορεί να οφείλονται, αφενός στη χαμηλή αποδοτικότητα (efficacy) των προγραμμάτων πληθυσμικού ελέγχου, που βασίζονται στην κυτταρολογία, να διαγνώσουν τις προκαρκινικές βλάβες, και 59

60 αφετέρου στην πραγματική αύξηση του ποσοστού έκθεσης των νεώτερων γενεών, ως αποτέλεσμα των αλλαγών στη σεξουαλική συμπεριφορά[105]. Οι τύποι HPV16 και HPV18 υπό- αντιπροσωπεύονται στις φυσιολογικές γυναίκες (3,8%) συγκριτικά με τη συμβολή τους σε περιπτώσεις αλλοιώσεων του τραχήλου της μήτρας. Ο 16 ή/και ο 18 συμβάλλουν σε ποσοστό 24,3% στις LSIL αλλοιώσεις. Επιπλέον αφορούν σε περισσότερο από 50% των λοιμώξεων που ανιχνεύονται σε HSIL βλάβες, στο 70% των λοιμώξεων σε περιπτώσεις διηθητικών καρκινωμάτων και στο 81,5% των λοιμώξεων που ανιχνεύονται στα Αδενοκαρκινώματα[113, 119]. Οι παρατηρήσεις συμφωνούν με τα στοιχεία προοπτικών μελετών, που υποστηρίζουν πως οι συγκεκριμένοι τύποι έχουν πλεονέκτημα ως προς την επιμονή της λοίμωξης και την εξέλιξη προς αλλοιώσεις του τραχήλου, συγκριτικά με άλλους υψηλού κινδύνου τύπους του ιού[56]. Από στοιχεία μετά- αναλύσεων επί των κυτταρολογικών και ιστολογικών αλλοιώσεων σε Ευρωπαίες, φαίνεται ότι αυξάνεται η συχνότητα ανίχνευσης του HPV 16, όσο αυξάνεται και η βαρύτητα της βλάβης. Δεν ισχύει όμως το ίδιο και για τον HPV 18. Επί κυτταρολογικά διαγνωσμένων και ιστολογικά επιβεβαιωμένων αλλοιώσεων LSIL, CIN 1 και HSIL, CIN 2/3, και καρκίνο του πλακώδους επιθηλίου, ο μεν 16 ήταν παρών στο 18,8%, 23,7%, 45,7%, 55,4% και 64,5% αντίστοιχα, ενώ ο 18 στο 14,5%, 5,7%, 6%, 6% και 11% αντίστοιχα[120]. Αν και ανιχνεύεται σπανιότερα, ο HPV45 μπορεί και αυτός να έχει «βιολογικό πλεονέκτημα», δεδομένου ότι κατατάσσεται μόλις στην 9 η θέση μεταξύ HPV θετικών γυναικών με φυσιολογικό επίχρισμα (0,6%), αλλά αναγνωρίζεται μεταξύ των πέντε συχνότερων τύπων σε περιπτώσεις διηθητικών καρκίνων. Η επίπτωση του HPV είναι αρκετά υψηλή (έως 30%) μεταξύ νεαρών γυναικών με εξαίρεση την Ασία[118]. Υπάρχουν στοιχεία που αποδίδουν το φαινόμενο στην αλλαγή της σεξουαλικής συμπεριφοράς, με πρωιμότερη έναρξη της σεξουαλικής ζωής στις ηλικιακές ομάδες κάτω των 25 ετών, έναντι αυτής των γυναικών από 45 και άνω[ ]. Στις ενδιάμεσες ηλικιακές ομάδες παρατηρείται ύφεση και αυξάνεται ξανά στις κατηγορίες και ετών. Η δεύτερη αυτή αύξηση δεν παρατηρείται τόσο έντονα στους ασιατικούς πληθυσμούς. Δεν είναι ακόμα σαφώς καθορισμένο, κατά πόσο αυτή η αύξηση οφείλεται σε αντίστοιχη αύξηση της επίπτωσης τύπων χαμηλού κινδύνου, όπως προτείνουν ορισμένοι συγγραφείς[118, ]. Οι έρευνες επί αυτού του φαινομένου, υποστηρίζουν ότι 1) οι αλλαγές στη σεξουαλική συμπεριφορά των 60

61 μεσηλίκων γυναικών, ή των συντρόφων τους 2) η επανενεργοποίηση λανθανουσών λοιμώξεων λόγω γήρανσης του ανοσοποιητικού συστήματος και 3) αθροιστικά φαινόμενα, που μεταφράζονται ως συνεχιζόμενη έκθεση καθόλη τη διάρκεια της ζωής σε μεγαλύτερης ηλικίας γυναίκες, μπορεί να ευθύνονται για τη δεύτερη αυξητική αιχμή της επίπτωσης[105, ]. Ορισμένοι συγγραφείς υποστηρίζουν πως ο ρόλος της παραμονής του ιού είναι ισχυρότερος από αυτών της απόκτησης νέων λοιμώξεων στις γυναίκες από 45 ετών και άνω[62]. Όμως, το γεγονός ότι η δεύτερη κορυφή της κατανομής παρατηρείται με διαφορά 10 ετών μεταξύ γυναικών των Η.Π.Α. (35-44 ετών) και της Ευρώπης (45-54 ετών), συνηγορεί υπέρ της επίδρασης συμπεριφορικών παραγόντων, παρά των βιολογικών φαινομένων, που σχετίζονται με την εμμηνόπαυση και την πρόοδο της ηλικίας[105]. Γενικά, ως προς τις διαφορές που παρατηρούνται στις συχνότητες εμφάνισης των τύπων του ιού ανά ηλικιακές ομάδες, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι υπάρχει η τάση να χρησιμοποιούνται στο πλαίσιο των μελετών ομάδες ελέγχου με μεγαλύτερης ηλικίας γυναίκες προσπαθώντας, όσο το δυνατόν, να αντιστοιχηθούν οι ηλικίες με τις ομάδες του δείγματος. Επιπλέον, η ισχυρή επίδραση της ηλικίας επί της συχνότητας εμφάνισης του ιού, μπορεί να επηρεάσει ακόμα και τις εκτιμήσεις επί της επίπτωσης ανά γεωγραφική περιοχή. Παρά τις προσπάθειες να προτυπωθούν τα αποτελέσματα των μετά- αναλύσεων με βάση την ηλικία, αυτό δεν ήταν πάντα εφικτό [118]. Παρά τη δεδομένη ύπαρξη αιτιολογικής σχέσης μεταξύ της λοίμωξης από HPV και της εμφάνισης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, η συσχέτιση της επίπτωσης με γεωγραφικά στοιχεία περιλαμβάνει ορισμένους ακόμα περιορισμούς. Πρώτον, προκύπτουν θέματα που αφορούν στην ποιότητα των στοιχείων που συλλέγονται. Υπάρχουν, γενικά, δυσκολίες ως προς τη διασφάλιση αντιπροσωπευτικού δείγματος, ειδικά σε χώρες με ελάχιστους οικονομικούς πόρους, προκειμένου να υπολογιστεί η επίπτωση του HPV. Επιπλέον, πιθανά λάθη μέτρησης οφείλονται και στη δυσκολία διάκρισης μεταξύ εμμένουσας ή παροδικής λοίμωξης[59]. Αν και η λοίμωξη αποτελεί τον πρωταρχικό παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση καρκίνου, έχουν ενοχοποιηθεί και αρκετοί άλλοι συμπαράγοντες, όπως η σεξουαλική συμπεριφορά, η χρήση αντισυλληπτικών και το κάπνισμα[93-94, 127]. Οι συστηματικές διαφορές αυτών των συμπαραγόντων μεταξύ των πληθυσμών, αποτελούν συγχυτικούς παράγοντες στην αξιολόγηση 61

62 των γεωγραφικών κατανομών. Σε πληθυσμιακό επίπεδο, ο σημαντικότερος συγχυτικός παράγοντας είναι ο τύπος του προγράμματος ελέγχου (screening). Θεωρητικά, ο αποτελεσματικός έλεγχος μειώνει την επίπτωση του καρκίνου, και ανιχνεύει περιστατικά με προκαρκινικές αλλοιώσεις, στις οποίες, αφού αντιμετωπιστούν αποτελεσματικά, εξαφανίζεται η λοίμωξη από τον HPV. Παρολαυτά, σε μελέτη που έγινε ανάλυση της ευαισθησίας, συγκρίνοντας και τις γυναίκες που δεν είχαν πρόσβαση στα συστήματα υγείας, δεν παρατηρήθηκαν τελικά διαφορές στη επίπτωση του ιού[123] ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΑ Αντικείμενο της κυτταρολογίας αποτελεί η μελέτη των φυσιολογικών και των παθολογικών χαρακτήρων των ανθρωπίνων κυττάρων είτε ως προϊόντα αυτόματης αποφολίδωσης, είτε μετά από απόσπαση με τεχνητά μέσα από τους ιστούς (π.χ. ψήκτρα, παρακέντηση δια λεπτής βελόνης κ.ά.). Η κυτταρολογική διάγνωση της κακοήθειας βασίζεται σε μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται κυρίως στον πυρήνα του κυττάρου, χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα κριτήρια. Απαραίτητα στοιχεία για τη διάγνωση θεωρούνται, βέβαια τόσο η επάρκεια και η αντιπροσωπευτικότητα του δείγματος, όσο και η γνώση του ιστορικού του ασθενούς και η παράθεση των σχετικών κλινικών πληροφοριών. Βοηθητική, σε κάποιες περιπτώσεις θεωρείται και η χρήση νεώτερων διαγνωστικών τεχνικών όπως η ανοσοκυτταροχημεία, η κυτταρομετρία ροής και οι τεχνικές της μοριακής βιολογίας[3]. Σκοπός της κυτταρολογίας είναι η έγκαιρη και έγκυρη διάγνωση της πάθησης του ασθενούς, καλοήθους ή κακοήθους, από υλικό το οποίο έχει ληφθεί με μη παρεμβατικό τρόπο [128]. Η κυτταρολογική εξέταση του τραχήλου περιλαμβάνει τη συλλογή αποφολιδωμένων κυττάρων από τον τράχηλο της μήτρας και τη μικροσκοπική αξιολόγησή τους, μετά από κατάλληλη επεξεργασία. Οι πρωτοποριακές εργασίες των Παπανικολάου και Babȩs αποτέλεσαν τη βάση για την εφαρμογή τεχνικών αποφολιδωτικής κυτταρολογίας για την αναγνώριση γυναικών με καρκίνο της μήτρας, η συνεργασία, δε, του μεγάλου Έλληνα με τον Trot οδήγησε στην ανάπτυξη τεχνικής για τη λήψη κυττάρων από τον οπίσθιο κολπικό θόλο. Η 62

63 ολοκληρωμένη μορφή λήψης του κολποτραχηλικού επιχρίσματος, διεθνώς γνωστού ως test Παπανικολάου, οφείλεται στους Παπανικολάου και Ayre [ ]. Λήψη και προετοιμασία υλικού συμβατικού επιχρίσματος Τις πλέον αποδεκτές τεχνικές λήψης δείγματος αποτελούν: Α. ο συνδυασμός εφαρμογής σπάτουλας του Ayre για τη λήψη δείγματος από τον εξωτράχηλο και ψήκτρας για τη λήψη δείγματος από τον ενδοτράχηλο Β. η εφαρμογή ψήκτρας τύπου Broom για ταυτόχρονη λήψη δείγματος από τον ενδοτράχηλο και τον εξωτράχηλο. Η διαγνωστική ακρίβεια κατά τη διαδικασία της κυτταρολογικής εξέτασης επηρεάζεται σημαντικά από την τεχνική επεξεργασίας κάθε υλικού. Στην περίπτωση της επίστρωσης του ληφθέντος υλικού σε αντικειμενοφόρους πλάκες, είναι απαραίτητη η δημιουργία μονοεπίπεδης στρώσης κυττάρων, προκειμένου η μικροσκόπηση να είναι ευκρινής. Η επίστρωση του υλικού επιτυγχάνεται με τη χρήση δεύτερης αντικειμενοφόρου πλάκας η οποία σύρεται πάνω στην πρώτη που φέρει το υλικό. Το υλικό μονιμοποιείται με ισοπροπανόλη ή αιθανόλη πριν την εφαρμογή της χρώσης Παπανικολάου. Αυτή συνδυάζει τη χρώση του πυρήνα με αιματοξυλίνη και την αντίχρωση του κυτταροπλάσματος με Orange G και ΕΑ50. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται κατά τη μικροσκόπηση η ευκρινής απεικόνιση τόσο της κατανομής της χρωματίνης και του πυρηνίου, όσο και η διάκριση του κυτταροπλάσματος σε βασεόφιλο, ηωσινόφιλο ή κερατινοποιούμενο. Ανεξαρτήτως μεθόδου λήψης συμβατικού επιχρίσματος, μόνο 20% των κυττάρων του δείγματος παραμένουν στην αντικειμενοφόρο πλάκα, ενώ το ποσοστό ανεβαίνει στο 95% των κυττάρων που τελικά εναιωρούνται στο υλικό κυτταρολογίας υγρής φάσης. Κυτταρολογία υγρής φάσης (Liquid Based Cytology, LBC) Πρόκειται για σύγχρονη τεχνική συλλογής, μονιμοποίησης και αυτόματης επίστρωσης κυττάρων για την παρασκευή πλακιδίων προς μικροσκόπηση. Αναπτύχθηκε ως τεχνική προκειμένου να βελτιωθούν οι σημαντικότερες αιτίες που περιορίζουν τη διαγνωστική ακρίβεια του συμβατικού test Παπανικολάου. Δεδομένης της ολοένα αυξανόμενης χρήσης μηχανημάτων αυτοματοποιημένης 63

64 σάρωσης, τα οποία απαιτούν επιχρίσματα με μικρού βαθμού κυτταρική αλληλοεπικάλυψη, η εφαρμογή της τεχνικής αυτής κερδίζει διαρκώς έδαφος. Η ThinPrep είναι τεχνική αυτού του είδους αναγνωρισμένη από τον Οργανισμό Φαρμάκων και Τροφίμων των Η.Π.Α. (FDA). Με την τεχνική αυτή επιτρέπεται η μεταφορά του συνόλου των κυττάρων σε ένα υγρό μέσο συντήρησης. Τα κύτταρα, εντός του υλικού αυτού μπορούν να διατηρηθούν για αρκετές εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα επιχρίσματα τα οποία παρασκευάζονται, περιέχουν αντιπροσωπευτική αναλογία κυττάρων που ελήφθησαν από τον τράχηλο, με καθαρό υπόστρωμα. Σημαντικό στοιχείο αποτελεί η λεπτομερέστερη διάκριση του πυρήνα, με εμφανέστερη κατανομή της χρωματίνης, του πυρηνίου και της πυρηνικής μεμβράνης. Λόγω της μεγαλύτερης ευκρίνειας και της μείωσης του αριθμού των εξεταζομένων πλακιδίων που απαιτούνται ανά περιστατικό, ο συνολικός διαγνωστικός χρόνος του εργαστηρίου, τελικά μειώνεται κατά 40%. Μετά την παρασκευή ενός αντιπροσωπευτικού επιχρίσματος για τη διάγνωση του τεστ, εάν απαιτείται, από το κυτταρικό δείγμα που παραμένει στο φιαλίδιο, υπάρχει η δυνατότητα να παρασκευαστούν επιπλέον επιχρίσματα (έως και 10 ανά φιαλίδιο), να εγκλειστούν τα κύτταρα σε κύβους παραφίνης, ή να εφαρμοστούν διαγνωστικές δοκιμασίες μοριακής κυτταρολογίας (HPV testing, ανίχνευση χλαμυδίων, γονόρροιας κ.ά.). Τα γενικά κυτταρολογικά χαρακτηριστικά της κυτταρολογίας υγρής φάσης συγκριτικά με τη συμβατική, παρατίθενται στον πίνακα που ακολουθεί. 64

65 Χαρακτηριστικά ThinPrep Συμβατικό επίχρισμα Κυτταρική μονιμοποίηση Άριστη Artifacts Όχι Συχνά Κυτταρική κατανομή Ομοιόμορφη σε μονοστιβάδα Ανομοιόμορφη Κυτταρικότητα Επαρκής Επαρκής Κυτταρικό μέγεθος/σχήμα Μικρότερο, αποστρογγυλεμένο Μεγαλύτερο, με σχήμα ανάλογο της επίστρωσης Αρχιτεκτονική Διατηρείται Διατηρείται Κύτταρα του ενδοτραχήλου Σε αθροίσεις Σε αθροίσεις και μεμονωμένα Υπόστρωμα καθαρό Ναι Όχι Ερυθρά αιμοσφαίρια Μειωμένα Παρόντα σε αριθμό που συχνά δυσχεραίνουν τη διάγνωση Λευκά αιμοσφαίρια Μειωμένα Παρόντα σε αριθμό που συχνά δυσχεραίνουν τη διάγνωση Νέκρωση Σε αθροίσεις Διάχυτη Βλέννη Μειωμένη σε αθροίσεις Άφθονη και διάχυτη Αξιολόγηση επιχρίσματος Εύκολο μετά από ειδική Σχετικά δύσκολη εκπαίδευση Συμπληρωματικές τεχνικές Ναι Συνήθως όχι Στην κυτταρολογική έκθεση γίνεται προσπάθεια αποτύπωσης της κατάστασης του τραχήλου της υπό διερεύνηση γυναίκας με τη χρήση συστημάτων ταξινόμησης. Η πρώτη προσπάθεια ταξινόμησης έγινε από τον ίδιο τον Παπανικολάου το 1940 και αναθεωρήθηκε από τον ίδιο το [129]. Η ταξινόμηση του Μονάχου αποτελεί εξελιγμένη μορφή της κυτταρολογικής απάντησης σε πέντε κατηγορίες [130]. ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ ΚΑΤΑ Γ. ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΑΟΥ Κατηγορία Ι Κατηγορία ΙΙ Κατηγορία ΙΙΙ Κατηγορία IV Κατηγορία V Απουσία κυτταρικών στοιχείων ενδεικτικών φλεγμονής, προκαρκινωματώδους αλλοίωσης ή καρκινώματος. Παρουσία κυττάρων με χαρακτήρες φλεγμονώδους αλλοίωσης. Παρουσία κυττάρων που εγείρουν την υπόνοια κακοήθειας χωρίς να είναι δυνατή η διάγνωση υπέρ αυτής. Παρουσία κυττάρων που εγείρουν έντονα την υπόνοια κακοήθειας. Κυτταρολογική εικόνα συμβατή με κακοήθεια. 65

66 Το 1997, η Βρετανική Εταιρία Κλινικής Κυτταρολογίας πρότεινε ένα νέο σύστημα ταξινόμησης των κυτταρολογικών επιχρισμάτων που αντιστοιχούν σε προνεοπλασματικές και νεοπλασματικές αλλοιώσεις του τραχήλου της μήτρας πέντε κατηγοριών: Οριακές αλλοιώσεις Ελαφρά δυσκαρύωση Μέτρια δυσκαρύωση Σοβαρού βαθμού δυσκαρύωση Σοβαρού βαθμού δυσκαρύωση ενδεικτική διηθητικού καρκινώματος. Η εισαγωγή από τον Richart του όρου «ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση του τραχήλου» (CIN) [132], οδήγησε στην πιο πρόσφατη εξέλιξη του συστήματος απόδοσης της κυτταρολογικής διάγνωσης του CIN, δηλαδή στο σύστημα ονοματολογίας κατά Bethesda. Το αρχικό σύστημα του 1988 τροποποιήθηκε δύο φορές, το 1991 και το ΣΥΣΤΗΜΑ BETHESDA 2001 (TBS)[131, 133] Το σύστημα αυτό ταξινόμησης περιλαμβάνει τμήματα τα οποία αφορούν: τον τύπο του δείγματος: συμβατικό επίχρισμα ή κυτταρολογία υγρής φάσης την επάρκεια του δείγματος: ο καθορισμός της καταλληλότητας ενός δείγματος καθορίζεται από την κυτταρική σύνθεση του επιχρίσματος και την καταλληλότητα της παρασκευαστικής διαδικασίας. Εκτός της περίπτωσης του «ικανοποιητικού δείγματος», αιτιολογείται το «ανεπαρκές δείγμα» με στόχο τη συνεχόμενη βελτίωση της ποιότητας των επιχρισμάτων. Ακατάλληλο είναι το δείγμα όταν η αντικιμενοφόρος πλάκα είναι σπασμένη, όταν δεν ταυτοποιείται η ασθενής, όταν το 75% των επιθηλιακών κυττάρων καλύπτονται από πολυμορφοπύρηνα, ερυθρά αιμοσφαίρια ή βλέννη και όταν το επίχρισμα είναι πτωχής κυτταρικότητας. Τη γενική κατηγοριοποίηση: διακρίνοντας τα κυτταρολογικά επιχρίσματα σε «αρνητικά για ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση ή κακοήθεια» και σε αυτά με παρουσία επιθηλιακών κυττάρων με αλλοιώσεις «ενδεικτικές ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης ή καρκινώματος», προσφέρεται μία 66

67 ουσιαστική αποσαφήνιση του συμπεράσματος της κυτταρολογικής έκθεσης. Την αυτοματοποιημένη αναθεώρηση: Τις βοηθητικές εξετάσεις: όπως η μοριακή διερεύνηση της HPV λοίμωξης και την αυτοματοποιημένη σάρωση του επιχρίσματος Την ερμηνεία, τα αποτελέσματα και τα σχόλια: ως προς το σχολιασμό, πρόκειται για προαιρετικά στοιχεία, υπό την προϋπόθεση της συναίνεσης των θεραπόντων ιατρών Α. επιχρίσματα «αρνητικά για ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση ή κακοήθεια» Στην κατηγορία αυτή ταξινομούνται τόσο τα επιχρίσματα χωρίς αλλοιώσεις ενδεικτικές ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης ή καρκίνου, καθώς και οι περιπτώσεις ατροφικού επιθηλίου, αλλοιώσεων οφειλόμενων σε φλεγμονώδη αντίδραση ανεξαρτήτως αιτιολογίας και οι αλλοιώσεις μετά από ακτινοβολία. Β. επιχρίσματα με παρουσία επιθηλιακών κυττάρων με αλλοιώσεις «ενδεικτικές ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης ή καρκινώματος» Β1a. Άτυπα πλακώδη κύτταρα απροσδιόριστης σημασίας (ASCUS) Επιχειρείται η περιγραφή κυτταρολογικών χαρακτηριστικών που υποδηλώνουν, χωρίς να αποδεικνύουν, διάγνωση ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης του πλακώδους επιθηλίου. Στο επίχρισμα μπορεί να ανιχνεύονται κύτταρα του πλακώδους επιθηλίου με ευμεγέθεις μεν υπερχρωματικούς πυρήνες, αλλά ομοιογενή κατανομή της χρωματίνης και σχέση πυρήνα προς κυτταρόπλασμα < ⅓. 67

68 Β1β. Άτυπα πλακώδη κύτταρα στα οποία δεν μπορεί να αποκλειστεί υψηλόβαθμη αλλο ίωση(asc-h) Στην κατηγορία αυτή μπορεί να ενταχθούν επιχρίσματα με κύτταρα του πλακώδους επιθηλίου με ανισομεγέθεις βαθυχρωματικούς πυρήνες, αλλά ασάφεια κυτταροπλασματικών ορίων. Πρέπει να τονιστεί πως μολονότι η κατηγορία ASC γενικά έχει πολύ χαμηλή διαγνωστική αναπαραγωγιμότητα τόσο μεταξύ διαφορετικών, όσο και από τον ίδιο κυτταρολόγο, εντούτοις εντάχθηκε στο σύστημα Bethesda προκειμένου να μειωθεί ο αριθμός των ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων της εξέτασης. Β2. Χαμηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακή αλλοίωσ η του πλακώδους επιθηλίου (LSIL) Τα κλασσικά κυτταρολογικά κριτήρια αφορούν την παρουσία κυττάρων με ευρεία ανώμαλη περιπυρηνική άλω (κοιλοκύτταρα), την παρουσία υπερκεράτωσης, παρακεράτωσης, δυσκεράτωσης και την παρουσία κυττάρων της επιπολής και της διάμεσης στιβάδας με δυσκαρυωτικούς πυρήνες. Η σχέση πυρήνα με κυτταρόπλασμα είναι τουλάχιστον ⅓. Τα κύτταρα διατάσσονται μεμονωμένα ή σε αθροίσεις διατηρώντας όμως τα κυτταροπλασματικά τους όρια. Β3. Υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση του πλακώδους επι θηλίου (HSIL) Τα κυτταρολογικά κριτήρια για την κατηγορία αυτή περιλαμβάνουν την παρουσία μικρών κυττάρων της διάμεσης στιβάδας με χαρακτήρες πλακώδους μετάπλασης και έντονη δυσκαρύωση. Ανάλογα με τη βαρύτητα της αλλοίωσης, η σχέση πυρήνα προς κυτταρόπλασμα κυμαίνεται από ⅔ έως ¾. Τα κύτταρα διατάσσονται είτε μεμονωμένα, είτε σε σφιχτούς συγκυτιακούς σωρούς. 68

69 Β4. Με χαρακτήρες ύποπτους διήθησης Στο TBS δεν γίνεται διάκριση μεταξύ κερατινοποιημένου και μη καρκινώματος του πλακώδους επιθηλίου. Στα επιχρίσματα αναγνωρίζονται κύτταρα που διατάσσονται μεμονωμένα, σε χαλαρούς σωρούς ή συγκυτιακές αθροίσεις. Τα κύτταρα χαρακτηρίζονται από έντονα ανισομεγέθεις, υπερχρωματικούς πυρήνες, αδροκοκκώδη και ανώμαλα κατανεμημένη χρωματίνη και ευδιάκριτα πυρήνια. Στην περίπτωση κερατινοποιημένου καρκινώματος, αν και αναγνωρίζονται κύτταρα ποικίλου μεγέθους και σχήματος, χαρακτηριστικά είναι αυτά με μορφή «γυρίνου», με πυρήνες ανωμάλου σχήματος. Η παρουσία νέκρωσης συνοδεύεται από έντονα βαθυχρωματικούς πυρήνες. Στο μη κερατινοποιημένο καρκίνωμα παρατηρείται χαρακτηριστικά «βρώμικο υπόστρωμα» που αντιστοιχεί σε θέσεις οροϊνώδους υλικού αναμεμιγμένου με ινώδη στοιχεία, κυτταροπλασματικά και πυρηνικά ράκη και ενεργά κύτταρα του καρκινώματος. Β5. Άτυπα αδενικά κύτταρα (AGC) Η κατηγορία αυτή περιλαμβάνει τα επιχρίσματα με κύτταρα που διατάσσονται σε συμπαγείς αθροίσεις με μικρού βαθμού πυρηνική αλληλοεπικάλυψη. Οι πυρήνες συνήθως παρουσιάζουν σχετικά ομοιόμορφη κοκκιώδη κατανομή χρωματίνης και σπάνια ξεφεύγουν από τα όρια των κυτταρικών αθροίσεων. Β6. Άτυπα αδενικά κύτταρα η παρουσία των οποίων συνηγορεί υπέρ νεοπλασίας Στην κατηγορία αυτή περιγράφονται κύτταρα του αδενικού επιθηλίου που διατάσσονται σε συμπαγείς τρισδιάστατους σωρούς. Οι πυρήνες παρουσιάζουν σχετικά ανώμαλα κατανεμημένη αδροκοκκώδη χρωματίνη, ευδιάκριτα χρωμόκεντρα ή και υποσημαινόμενα πυρήνια. Στην περιφέρεια αυτών των ομάδων οι πυρήνες, συνήθως, δίνουν την εντύπωση φτερού. 69

70 Β7. Αδενοκαρκίνωμα in situ(ais) Στα επιχρίσματα αυτά αναγνωρίζονται άφθονα άτυπα αδενικά κύτταρα. Διατάσσονται σε πυκνούς τρισδιάστατους σωρούς αυξημένης κυτταρικότητας και στην περιφέρεια αναγνωρίζονται πυρήνες με σαφή σχηματισμό «φτερού». Επίσης αναγνωρίζονται άτυπα κύτταρα σε ροζετοειδείς σχηματισμούς και σε πασσαλοειδή διάταξη, δίνοντας την εικόνα ψευδοπολύστιβου επιθηλίου. Οι πυρήνες, με ποικιλία μεγέθους και σχήματος, παρουσιάζουν αδροκοκκκώδη κατανομή της χρωματίνης, χρωμόκεντρα και ευδιάκριτα πυρήνια. Β8. Αδενοκαρκίνωμα Τα κύτταρα στα επιχρίσματα αυτής της κατηγορίας διατάσσονται μεμονωμένα ή σε τρισδιάστατες αθροίσεις. Τα κύτταρα είναι αδενικού τύπου με έντονη διαταραχή της σχέσης πυρήνα προς κυτταρόπλασμα. Στον πυρήνα παρατηρείται αδροκοκκώδης ανώμαλη κατανομή της χρωματίνης και ευδιάκριτα πυρήνια. Σπάνια, αναγνωρίζονται στο υπόστρωμα και θέσεις νεκροβίωσης ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΑ Δεδομένου ότι η παρουσία και η αναγνώριση απλώς, ακόμα και ενός υψηλού κινδύνου ογκογόνου τύπου HPV, αποτελεί ένδειξη και όχι απόδειξη της βιολογικής συμπεριφοράς της ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης, έχει προταθεί από πολλούς ερευνητές η μελέτη και άλλων παραμέτρων, οι οποίες πιθανών σχετίζονται με την καρκινογένεση στον τράχηλο της μήτρας. Επιπλέον, η ανάγκη διατήρησης δειγμάτων για μεγάλες χρονικές περιόδους, προκειμένου να είναι εφικτή τόσο η ανίχνευση και η τυποποίηση του HPV, όσο και η μοριακή διερεύνηση της αιτιοπαθογένειας των προκαρκινικών αλλοιώσεων και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, συνέβαλλε καθοριστικά στην ανάπτυξη της κυτταρολογίας υγρής φάσης. Η ανάπτυξη της τεχνικής αυτής αποτέλεσε σημαντικό παράγοντα για την εφαρμογή μοριακών τεχνικών, απαραίτητων για τις μελέτες αυτές. Η σταθερότητα τόσο του DNA[134], όσο και του RNA [ ] θεωρείται ικανοποιητική στα 70

71 υλικά συλλογής, μεταφοράς και αποθήκευσης της κυτταρολογίας υγρής φάσης. Δεδομένου δε ότι τα κύτταρα διατηρούνται σαν εναιώρημα στο υγρό μέσο, είναι δυνατό να εφαρμοστεί και ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Στα πλαίσια της μοριακής κυτταρολογίας έχουν αναπτυχθεί πολύτιμες τεχνικές και μέθοδοι ανίχνευσης, τυποποίησης και μελέτης χαρακτηριστικών του HPV, οι οποίες αδρά κατηγοριοποιούνται ως εξής: 1. Τεχνικές βασιζόμενες στον υβριδισμό (π.χ. υβριδισμός και ανίχνευση ενδοκυττάριου mrna με κυτταρομετρία ροής) 2. Τεχνικές βασιζόμενες στην ενίσχυση νουκλεϊκών οξέων (π.χ. αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), ενίσχυση νουκλεϊκών οξέων βασισμένη στην αλληλουχία (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)) 3. Τεχνικές βασιζόμενες σε συνδυασμό των ανωτέρω (π.χ. HPV DNA μικροσυστοιχίες) 1.7. ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ [3, 137] Η Παθολογική Ανατομική αποτελεί τη γέφυρα μεταξύ κλινικής πράξης και βασικής επιστήμης. Για την πραγματοποίηση της διάγνωσης και την καθοδήγηση της θεραπείας, ο Παθολογοανατόμος προσδιορίζει τις αλλοιώσεις των ιστών και των κυττάρων μάκρο- και μικροσκοπικά, παράλληλα όμως, προσπαθεί να ανιχνεύσει το αίτιο της νόσου (αιτιολογία), τους μηχανισμούς ανάπτυξής της (παθογένεια) και τον τρόπο εξέλιξης των μορφολογικών αλλοιώσεων. Στην προσπάθεια αυτή χρησιμοποιούνται και σύγχρονες τεχνικές μοριακής βιολογίας και ανοσοιστοχημείας ΕΝΔΟΕΠΙΘΗΛΙΑΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ Ήδη από το 1994 χρησιμοποιείται ο όρος «τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία», CIN (cervical intraepithelial neoplasia), για να περιγράψει το φάσμα των διαταραχών από την ήπια δυσπλασία έως τη σοβαρή δυσπλασία και το καρκίνωμα in situ του πλακώδους επιθηλίου. Οι αλλοιώσεις ταξινομούνται σε CIN 71

72 1, 2 και 3 αν και υπάρχει πλέον η τάση να αναφέρονται σαν χαμηλού βαθμού (LSIL - CIN1) και υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις (HSIL - CIN 2 και 3). Οι παθολογικές αλλοιώσεις δεν εξελίσσονται γραμμικά, αλλά συνθέτουν ένα συνεχές φάσμα μίας ευρύτερης παθολογικής οντότητας. Η εγγενής δυσκολία να διακριθεί η αμιγής HPV λοίμωξη από τις CIN1 αλλοιώσεις στο επίπεδο, μη κονδυλωματώδες επιθήλιο, δημιουργεί προβλήματα ταξινόμησης αυτού του είδους των βλαβών. Οι ιστολογικοί χαρακτήρες που συνεκτιμώνται είναι: Α. η διαφοροποίηση των κυττάρων: στο φυσιολογικό ιστό τα κύτταρα διαφοροποιούνται και ωριμάζουν προς την επιφάνεια, γεγονός που οδηγεί σε φυσιολογική στιβάδωση. Στις ενδοεπιθηλιακές νεοπλασίες παρατηρείται απώλεια στιβάδωσης του επιθηλίου και αδιαφοροποίητα, άωρα κύτταρα. Το ποσοστό του επιθηλίου το οποίο καταλαμβάνεται από τα κύτταρα αυτά, καθοδηγεί και τη διαβάθμιση της δυσπλασίας. Β. η παρουσία ανωμαλιών του πυρήνα: όπως αύξηση του μεγέθους του, συνεπώς και αύξηση της σχέσης πυρήνα/ κυτταροπλάσματος, ανωμαλίες στο σχήμα, πυρηνικός βαθυχρωματισμός και πύκνωση της χρωματίνης. Γ. η αναγνώριση μιτωτικής δραστηριότητας: στο φυσιολογικό επιθήλιο οι μιτώσεις που παρατηρούνται είναι λίγες σε αριθμό και περιορίζονται στα παραβασικά κύτταρα. Στις ενδοεπιθηλιακές νεοπλασίες καταλαμβάνουν το 1/3, τα 2/3 και τα 3/3 του πάχους του επιθηλίου αντίστοιχα στις CIN1, 2 και 3. Τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία 1 (CIN1) Ωρίμανση παρατηρείται στα ανώτερα 2/3 του πάχους του επιθηλίου, και τα επιφανειακά κύτταρα παρουσιάζουν ποικίλη, αλλά συνήθως ήπια ατυπία, ή κοιλοκυττάρωση. Παρατηρούνται ήπιες ατυπίες του πυρήνα και μικρή μιτωτική δραστηριότητα στο κατώτερο επίπεδο του επιθηλίου. Σπάνια παρατηρούνται ανώμαλες μορφές κυττάρων. Τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία 2 (CIN2) Ωρίμανση παρατηρείται στο άνω μισό του πάχους του επιθηλίου με καταφανή πυρηνική ατυπία τόσο στις ανώτερες, όσο και στις κατώτερες στιβάδες. Η μιτωτική δραστηριότητα περιορίζεται στα κατώτερα 2/3 του επιθηλίου. Μπορεί να παρατηρηθούν ορισμένες ανώμαλες μορφές κυττάρων. 72

73 Τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία 3 (CIN3) Η ωρίμανση (συμπεριλαμβανομένης της κερατινοποίησης της επιπολής στιβάδας) μπορεί είτε να εκλείπει τελείως, είτε να περιορίζεται στο επιπολής 1/3 του επιθηλίου. Πυρηνική ατυπία παρατηρείται στο μεγαλύτερο μέρος ή σε όλο το πάχος του επιθηλίου. Υπάρχουν πολυάριθμες μιτώσεις σε όλα τα επίπεδα του επιθηλίου, αρκετές από τις οποίες είναι ανώμαλες ΜΙΚΡΟΔΙΗΘΗΤΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΠΛΑΚΩΔΟΥΣ ΕΠΙΘΗΛΙΟΥ Πρόκειται για καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου με μικροδιήθηση του στρώματος, η έκταση της οποίας δεν μπορεί σαφώς να καθοριστεί, μεν, μικρότερης από 1 χιλ. σε βάθος, δε, και με μικρή πιθανότητα τοπικής λεμφαδενικής μετάστασης. Η οριστική διάγνωση μικροδιηθητικού καρκινώματος μπορεί να γίνει μόνο σε παρασκεύασμα κωνοειδούς εκτομής του τραχήλου, με χειρουργικά όρια εκτομής ελεύθερα νόσου ή μετά από τον έλεγχο ολόκληρου του τραχήλου κατόπιν τραχηλεκτομής ή ολικής υστερεκτομής. Σε περίπτωση υψηλόβαθμης ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας, υπάρχουν ορισμένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά που αυξάνουν την πιθανότητα ύπαρξης μικροδιηθητικής νόσου όπως: α. ύπαρξη εκτεταμένου CIN3 β. εκτεταμένη νόσος με βαθιά επέκταση στις κρύπτες του ενδοτραχήλου γ. ενδοαυλική παρουσία νεκρωτικού υλικού και ενδοεπιθηλιακή πλακώδης ωρίμανση. Στο μικροδιηθητικό καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου παρουσιάζεται συνήθως οίδημα του στρώματος και στρωματική δεσμοπλαστική και λεμφοκυτταρική αντίδραση. 73

74 ΠΛΑΚΩΔΕΣ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ Μακροσκοπικά το διηθητικό πλακώδες καρκίνωμα του τραχήλου μπορεί να είναι εξωφυτικό, με θηλωματώδη ή πολυποειδή μορφή, ή μπορεί να είναι κυρίως ενδοφυτικό το οποίο διηθεί τις γειτονικές δομές χωρίς μεγάλη επιφανειακή ανάπτυξη. Τα περισσότερα καρκινώματα διηθούν με τη μορφή δικτύου αναστομούμενων ταινιών με την παρεμβολή στρώματος και εμφανίζονται σαν ανώμαλες νησίδες αποστρογγυλομένες, γωνιώδεις ή με αιχμές. Συχνά, ειδικά σε μικρούς όγκους, στην επιφάνεια ή στα όρια του όγκου μπορεί να συνυπάρχει CIN. Το στρώμα του τραχήλου, που διαχωρίζει τις νησίδες, διηθείται από ποικιλία κυττάρων, κυρίως λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα. Μπορεί, σε ορισμένες περιπτώσεις να παρατηρηθεί έντονη ηωσινοφιλική αντίδραση του στρώματος ή αντίδραση τύπου ξένου σώματος με γιγαντοκύτταρα. Τα πλακώδη καρκινώματα του τραχήλου της μήτρας διακρίνονται σε: Κερατινοποιούμενα Οι όγκοι αυτοί περιέχουν «μαργαριτοειδή σωμάτια κερατίνης», που σχηματίζονται από δακτυλίους πλακωδών κυττάρων με κεντρικές φωλιές κερατίνης. Κατά το Rubin [138], πρόκειται για φωλιές κερατινοποιημένων κυττάρων που είναι οργανωμένα σε συγκεντρικούς στροβιλοειδείς σχηματισμούς, στο κέντρο των οποίων διακρίνεται κερατίνη. Οι πυρήνες των κυττάρων είναι συνήθως μεγάλοι και υπερχρωματικοί με αδρό δίκτυο χρωματίνης. Οι μιτώσεις είναι λίγες και παρατηρούνται, κυρίως, στα λιγότερο διαφοροποιημένα κύτταρα στην περιφέρεια του όγκου. Υπάρχει, επίσης, νεκρωτικό υπόλειμμα. Μη κερατινοποιούμενα Οι όγκοι αυτοί αποτελούνται από πολυγωνικά πλακώδη κύτταρα με κερατινοποίηση μεμονωμένων κυττάρων και διακυτταρικές γέφυρες, αλλά χωρίς σχηματισμό «μαργαριτοειδών σωματίων κερατίνης». Ο κυτταρικός και πυρηνικός πλειομορφισμός είναι ιδιαίτερα εμφανής και εμφανίζονται αρκετές μιτώσεις. Οι πυρήνες είναι σχετικά μεγάλοι με άνισα κατανεμημένη, αδροκοκκώδη χρωματίνη και μπορεί να περιέχουν ανώμαλα πυρήνια. 74

75 Βασικοκυτταροειδές (basaloid) Το καρκίνωμα αυτό αποτελείται από φωλιές ανώριμων πλακωδών κυττάρων τύπου βασικής στιβάδας με λίγο κυτταρόπλασμα. Στο κέντρο των σχηματισμών αυτών μπορεί να υπάρχουν λίγα στοιχεία κερατινοποίησης. Ακροχορδονώδες (verrucous) Πρόκειται για υψηλής διαφοροποίησης όγκο με υπερκερατωσική ακροχορδονώδη επιφάνεια, ο οποίος εισβάλλει στο υποκείμενο στρώμα με τη μορφή βολβοειδών προεξοχών. Τα κύτταρα του όγκου έχουν άφθονο κυτταρόπλασμα και ελάχιστη πυρηνική ατυπία. Θηλωματώδες (warty) μόλυνσης. Ο όγκος έχει θηλωματώδη επιφάνεια και κυτταρικά χαρακτηριστικά HPV Θηλώδες (papillary) Πρόκειται για όγκο με λεπτές ή διευρυσμένες θηλές συνδετικού ιστού του στρώματος, οι οποίες καλύπτονται από επιθήλιο, και παρουσιάζει χαρακτηριστικά CIN. Καρκίνωμα τύπου λεμφοεπιθηλιώματος (lymphoepithelioma-like) Πρόκειται για όγκο που αποτελείται από νησίδες με ασαφή όρια που περιέχουν αδιαφοροποίητα κύτταρα και υπόβαθρο έντονα διηθημένο από λεμφοκύτταρα. Τα κύτταρα του όγκου έχουν ομοιόμορφους κυστικούς πυρήνες με εξεσημασμένα πυρήνια και μέτρια ποσότητα ελαφρά ηωσινοφιλικού κυτταροπλάσματος. Τα όρια των κυττάρων δεν είναι ευδιάκριτα προσδίδοντας, συχνά, τη μορφή συγκυτίων στους σχηματισμούς. 75

76 Μεταβατικού τύπου πλακώδες καρκίνωμα (squamotransitional carcinoma) Οι όγκοι αυτοί παρουσιάζουν θηλώδη αρχιτεκτονική με ινo-αγγειακά (fibrovascular) πυρηνικά κέντρα επικαλυπτόμενα από άτυπο επιθήλιο που ομοιάζει με CIN ΑΔΕΝΟΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΡΑΧΗΛΟΥ in situ Πρόκειται για βλάβη στην οποία τα αδένια βρίσκονται, μεν, στη φυσιολογική τους θέση, έχει όμως αντικατασταθεί το επιθήλιο τους, μερικώς ή πλήρως, από κύτταρα με κακοήθεις χαρακτήρες. Το όριο της βλάβης διατηρείται, χαρακτηριστικά, αδρό. Τα κύτταρα είναι συνήθως ομαλά διατεταγμένα με τον μακρύ άξονα τους κάθετο στη βασική μεμβράνη. Οι επιμηκυσμένοι, πλειομορφικοί και υπερχρωματικοί πυρήνες διατάσσονται κοντά στη βάση. Το νεοπλαστικό επιθήλιο συνήθως βρίσκεται εντός των κρυπτών. Αν και υπάρχει έντονος ερεθισμός του στρώματος, δεν παρατηρείται δεσμοπλαστική αντίδραση ΑΔΕΝΟΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΡΑΧΗΛΟΥ Πρόκειται για καρκινώματα με αδενική διαφοροποίηση. Περίπου οι μισοί όγκοι αυτού του τύπου παρουσιάζονται ως εξωφυτικές, πολυποειδείς ή θηλώδεις μάζες. Οι υπόλοιποι είναι οζώδεις με διάχυτη διόγκωση ή εξέλκωση του τραχήλου. Διακρίνεται σε: Βλεννώδες αδενοκαρκίνωμα Το 70% περίπου των αδενοκαρκινωμάτων είναι ενδοτραχηλικού τύπου, με τα κύτταρα του όγκου να ομοιάζουν με αυτά του ενδοτραχήλου. Στις περισσότερες περιπτώσεις οι όγκοι είναι από μέτρια έως καλά διαφοροποιημένοι. Τα αδενικά στοιχεία διατάσσονται σε ένα σύνθετο μοτίβο. Τα κύτταρα είναι τυπικά διατεταγμένα με τους πυρήνες κοντά στη βάση με άφθονο, ωχρό, κοκκώδες κυτταρόπλασμα. Υπάρχει σημαντική πυρηνική ατυπία, με ποικιλία στο μέγεθος 76

77 του πυρήνα, αδρή χρωματίνη που σχηματίζει μάζες και εξεσημασμένα πυρήνια. Συνήθως παρατηρούνται αρκετές μιτώσεις. Στις περιπτώσεις κακώς διαφοροποιημένων όγκων, τα κύτταρα περιέχουν λιγότερο κυτταρόπλασμα, αλλά συνεχίζουν να σχηματίζουν ευδιάκριτες αδενικές δομές. Ενδομητριοειδές αδενοκαρκίνωμα Οι όγκοι αυτοί αποτελούν το 30% των αδενοκαρκινωμάτων του τραχήλου της μήτρας και έχουν τα ιστολογικά χαρακτηριστικά των ομωνύμων όγκων του ενδομητρίου, με σπανιότερα όμως τα επιθηλιακά στοιχεία. Άλλες σπανιότερες μορφές Περιλαμβάνονται στην κατηγορία αυτή το διαυγοκυτταρικό, το ορώδες και το μεσονεφρικό καρκίνωμα ΚΟΛΠΟΣΚΟΠΗΣΗ Η κολποσκόπηση είναι μία διαγνωστική τεχνική που επιτρέπει την εξέταση, υπό φωτισμό και μεγέθυνση, του τραχήλου της μήτρας, του κόλπου και του αιδοίου. Γίνεται με τη χρήση κολποσκοπίου, το οποίο μεγεθύνοντας την εικόνα 6х έως 40х, επιτρέπει στον κολποσκόπο να διακρίνει οπτικά τις φυσιολογικές από τις παθολογικές περιοχές και να πάρει κατευθυνόμενες βιοψίες για περαιτέρω ιστολογική εξέταση. Η εξέταση εφαρμόστηκε αρχικά το 1925 από τον Γερμανό Hans Hinselmann. Η κολποσκόπηση χρησιμοποιείται για τρεις σκοπούς: 1. Εκτίμηση γυναικών με παθολογικό τεστ Παπανικολάου. 2. Εκτίμηση γυναικών με κλινικά ύποπτο τράχηλο. 3. Σαν βασικό εργαλείο πληθυσμιακού ελέγχου στα πλαίσια της γυναικολογικής εξέτασης. Αυτό αφορά αρκετές χώρες της Ευρώπης και της Λατινικής Αμερικής, με χαμηλή όμως ειδικότητα της εξέτασης, αν και υψηλή ευαισθησία για τον εντοπισμό προκαρκινικών αλλοιώσεων. 77

78 Στην περίπτωση γυναικών με παθολογικό επίχρισμα τραχήλου της μήτρας, σκοποί της κολποσκόπησης είναι: 1. Ο καθορισμός της ακριβούς γεωγραφικής/ανατομικής εντόπισης της ζώνης μετάπτωσης. 2. Η επιβεβαίωση ή αναίρεση της κυτταρολογικής υποψίας ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης. 3. Η αναγνώριση ή ο αποκλεισμός διηθητικού καρκίνου. 4. Η αναγνώριση ή ο αποκλεισμός αδενικής βλάβης. 5. Η διευκόλυνση της θεραπείας και η παρακολούθηση της εξέλιξης ή της οπισθοχώρησης της ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης. Η κολποσκοπική εξέταση πρέπει να μην περιορίζεται στον τράχηλο της μήτρας, αλλά να επεκτείνεται και στον κόλπο. Αυτό γίνεται κατά την αφαίρεση του κολποδιαστολέα με αργές κινήσεις, προκειμένου να επισκοπηθούν και τα κολπικά τοιχώματα. Σκόπιμη είναι και η επισκόπηση του αιδοίου. Με βάση τις Ευρωπαϊκές Οδηγίες για την αντιμετώπιση της Παθολογικής Κυτταρολογίας του Τραχήλου της Μήτρας του 2008, συμπερασματικά : 1. Η κολποσκόπηση επιτρέπει την αναγνώριση, τον εντοπισμό και την απεικόνιση των προκαρκινικών αλλοιώσεων του τραχήλου, του κόλπου και του αιδοίου και κατευθύνει για τη θέση λήψης της βιοψίας. 2. Σε ορισμένες χώρες η κολποσκόπηση χρησιμοποιείται σαν εργαλείο πληθυσμιακού ελέγχου. Εξαιτίας της χαμηλής της ειδικότητας δεν πρέπει να χρησιμοποιείται με αυτό το σκοπό, αλλά να διατηρείται σε εφεδρεία για τις γυναίκες με παθολογικό επίχρισμα τραχήλου. 3. Η κολποσκόπηση οφείλει να προηγείται κάθε αντιμετώπισης CIN αλλοίωσης. 4. Η κολποσκόπηση πρέπει να διενεργείται μόνο από εκπαιδευμένους και έμπειρους κολποσκόπους. 5. Οι κολποσκόποι οφείλουν να αναφέρουν τη διάγνωσή τους προκειμένου να επιβεβαιώσουν ότι το αποτέλεσμα της εκτίμησής τους και της κολποσκοπικά κατευθυνόμενης θεραπείας που προσέφεραν είναι σε συμφωνία με τα διεθνώς αποδεκτά πρότυπα. 6. Τα ευρήματα της κολποσκόπησης πρέπει να καταγράφονται στον προσωπικό φάκελο της ασθενούς[3]. 78

79 1.9. ΠΛΗΘΥΣΜΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Τα πρώτα προγράμματα πληθυσμιακού ελέγχου για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας εφαρμόστηκαν στη Νορβηγία το 1959 (Ostfold county) και στη Σκωτία ένα χρόνο αργότερα (Grampian region). Έκτοτε, σε όλες της ευρωπαϊκές, τουλάχιστον, χώρες έχουν εφαρμοστεί προγράμματα κάθε τύπου (οργανωμένο, ευκαιριακό, πιλοτικό κ.ά.). Μελέτες, διεθνώς, δείχνουν πως η εφαρμογή καλά οργανωμένων προγραμμάτων πληθυσμιακού ελέγχου βασισμένων στην κυτταρολογική διάγνωση του τεστ Παπανικολάου, μπορεί να επιφέρουν μείωση έως και 80% στους δείκτες επίπτωσης και θνησιμότητας[ ]. Στην πλειονότητα, όμως, των ευρωπαϊκών χωρών, οι πτωτικές τάσεις των δεικτών, που αφορούν στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, προτυπωμένες με βάση την ηλικία, είναι μικρότερες και κυμαίνονται από 40 έως 70%[ ]. Τα στοιχεία των ευρωπαϊκών χωρών δείχνουν ότι η ελλιπής εφαρμογή, ή σε κάποιες περιπτώσεις, και η απόλυτη έλλειψη προγραμμάτων πληθυσμιακού ελέγχου, έχουν σαν αποτέλεσμα να μην παρατηρείται η επιθυμητή μείωση των επιδημιολογικών δεικτών και, σε ορισμένες περιπτώσεις, να παρατηρείται ακόμα και αύξηση. Με δεδομένο δε, ότι στις περισσότερες χώρες δεν υπάρχουν ούτε επαρκή ιστορικά στοιχεία, αλλά ούτε και στοιχεία διασφάλισης ποιότητας ως προς την εφαρμογή των προγραμμάτων πληθυσμιακού ελέγχου, η εκτίμηση της επίδρασής των προγραμμάτων αυτών τελικά, σε πρακτικό επίπεδο, στη διαμόρφωση των επιδημιολογικών τάσεων του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, μετατρέπεται σε δύσκολη υπόθεση. Η ευρωπαϊκή ένωση, με πρόσφατες οδηγίες που έχει εκδώσει, προτείνει να εφαρμόζονται οργανωμένα προγράμματα πληθυσμιακού ελέγχου (populationbased) με απαραίτητη διασφάλιση ποιότητας σε όλα τα επίπεδα του προγράμματος. Σύμφωνα με τις διεθνείς συστάσεις, ο πληθυσμιακός έλεγχος με τεστ Παπανικολάου για τις περιπτώσεις γυναικών με φυσιολογικά επιχρίσματα κάθε 3 με 5 χρόνια είναι αποδεκτός, και δε χρειάζεται να μειωθεί το μεσοδιάστημα ελέγχου[99, 140]. Δεδομένου ότι η χρονική διάρκεια της προκαρκινικής φάσης είναι αρκετά μεγάλη, κατά μέσο όρο χρόνια στις περιπτώσεις που, τελικά, θα εξελιχθεί σε καρκίνο, τα εναλλακτικά προτεινόμενα μεσοδιαστήματα μεταξύ 79

80 των ελέγχων, δε φαίνεται να διαφοροποιούν την αποτελεσματικότητα των προγραμμάτων[ ]. Υπάρχουν, μάλιστα, στοιχεία ότι στις χώρες όπου εφαρμόζεται το 5ετές μεσοδιάστημα των ελέγχων, μειώθηκε σημαντικά το ποσοστό του καρκίνου, ενώ αντίστροφα, αυξήθηκε σημαντικά ο απόλυτος αριθμός των γυναικών που υποβλήθηκαν σε τεστ Παπανικολάου. Με βάση τις Ευρωπαϊκές κατευθυντήριες οδηγίες για την εξασφάλιση ποιότητας στον πληθυσμιακό έλεγχο για καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, η προτεινόμενη ηλικία έναρξης των ελέγχων κυμαίνεται μεταξύ 20 και 30 ετών και οι έλεγχοι λήγουν στα έτη, με μεσοδιαστήματα των 3-5 χρόνων, όπως έχει ήδη αναφερθεί[99]. Η εφαρμογή των συστάσεων αυτών έχει σαν αποτέλεσμα το σημαντικό περιορισμό των πρακτικά μη απαραίτητων εξετάσεων, και τελικά τη βελτίωση της ισορροπίας μεταξύ βλάβης και ωφέλειας, την ελάττωση της δαπάνης σε ανθρώπινους και οικονομικούς πόρους και τη βελτίωση της σχέσης κόστουςωφέλειας των προγραμμάτων προσυμπτωματικού πληθυσμιακού ελέγχου. Στις χώρες με ευκαιριακό έλεγχο και χωρίς οργανωμένα προγράμματα, η ετήσια κάλυψη του πληθυσμού αναφέρεται μεταξύ 30% και 50% υποδηλώνοντας ανισοκατανομή και κατάχρηση των υπηρεσιών υγείας[20, 22, ]. Το ποσοστό των γυναικών οι οποίες οφείλουν να εξεταστούν, αλλά δεν έχουν υποβληθεί ποτέ σε έλεγχο υπολογίζεται, ενδεικτικά, σε 24% στην Αυστρία ( γυναίκες ηλικιών 20 έως 69 ετών που δεν έχουν υποβληθεί ποτέ σε τεστ Παπανικολάου στη ζωή τους), 18-30% στη Μάλτα (στις ομάδες ετών και ετών αντιστοίχως) και σε 33% στο Βέλγιο (γυναίκες από τον πληθυσμόστόχο οι οποίες δεν είχαν υποβληθεί σε τεστ Παπανικολάου τα τελευταία 5 χρόνια). Τα μοντέλα κάλυψης του πληθυσμού είναι, στις καλύτερες των περιπτώσεων, παρόμοια και, κυρίως, χειρότερα σε χώρες χωρίς οργανωμένα προγράμματα πληθυσμιακού ελέγχου. Τα μειονεκτήματα του πληθυσμιακού ελέγχου είναι σημαντικά και περιλαμβάνουν την ψυχολογική φόρτιση των γυναικών που διαγιγνώσκονται με παθολογικό τεστ Παπανικολάου ή υποβάλλονται σε θεραπεία για την αντιμετώπιση προκαρκινικών αλλοιώσεων. Επιπλέον, αναφέρονται επιπλοκές και αυξημένος κίνδυνος για πρόκληση πρόωρου τοκετού μεταξύ των γυναικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία για προκαρκινικές αλλοιώσεις[151]. Σημαντικό πρόβλημα είναι και οι περιπτώσεις καθυστερημένης διερεύνησης ή θεραπείας γυναικών με ψευδώς αρνητικά τεστ Παπανικολάου ή γυναικών που δεν 80

81 συμμορφώνονται στις συστάσεις για περαιτέρω έλεγχο ή θεραπεία[141, ]. Τόσο η ποιότητα ζωής, όσο και τα μειονεκτήματα των προγραμμάτων πληθυσμιακού ελέγχου που αναφέρθηκαν οφείλουν να λαμβάνονται σοβαρά υπόψη και να διερευνώνται σχολαστικά κατά το σχεδιασμό πολιτικών ελέγχου. Με την εισαγωγή νέων μεθόδων ελέγχου των γυναικών, όπως οι τεχνικές ανίχνευσης του HPV, η ανάγκη για το σχεδιασμό και την οργάνωση προγραμμάτων πληθυσμιακού ελέγχου αυξάνονται σημαντικά σε σχέση με αυτά που περιελάμβαναν αποκλειστικά την κυτταρολογική εξέταση του τεστ Παπανικολάου[99, 154]. Με βάση μια πρόσφατα δημοσιευμένη μετά-ανάλυση[155], όσον αφορά τις συμπληρωματικές μεθόδους προσυμπτωματικού ελέγχου, η ευαισθησία του HC2 για την ανίχνευση του HPV DNA υπολογίζεται ότι κυμαίνεται από 0,86 έως 1,00 (95% CI ), η ειδικότητα από 0,28 έως 0,86 (95% CI), η θετική προγνωστική αξία από 0,28 έως 0,82 και η αρνητική προγνωστική αξία από 0,67 έως 1,00 (αναλογικά). Προκειμένου για άλλες μοριακές μεθόδους (real-time PCR, Linear Array, Roche Diagnostics, Amplicor, Roche Diagnostics), τα αντίστοιχα στατιστικά δεδομένα είναι: ευαισθησία από 0,70 έως 0,96, ειδικότητα 0,39 έως 0,92, θετική προγνωστική αξία 0,30 έως 0,91 και αρνητική προγνωστική αξία από 0,56 έως 0,97. Όσον αφορά, όμως, την εφαρμογή μοριακών μεθόδων ανίχνευσης του mrna των Ε6/Ε7 του ιού αντίστοιχων με αυτή που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, η ευαισθησία υπολογίζεται σε 0,41 έως 0,86 (95% CI ), η ειδικότητα σε 0,66 έως 0,97 (95% CI), η θετική προγνωστική αξία σε 0,50 έως 0,94 και η αρνητική προγνωστική αξία σε 0,48 έως 0,99 (αναλογικά). Η Ελλάδα αποτελεί μια ακόμα περίπτωση χώρας χωρίς οργανωμένο, εθνικό σύστημα πληθυσμιακού ελέγχου για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Στη χώρα μας, η προτυπωμένη με βάση την ηλικία αναλογία επίπτωσης της νόσου στο γενικό πληθυσμό υπολογίζεται σε 7,7/ και η θνητότητα σε 2,5/ [156]. Δεδομένης όμως της ιδιαίτερης γεωγραφίας της χώρας, με περιοχές από όπου η πρόσβαση σε μονάδες παροχής υγείας είναι δύσκολη, θεωρείται πως η εφαρμογή ενός προγράμματος που είναι οικονομικά αποδοτικό θα έπρεπε να βασίζεται στο τεστ Παπανικολάου σε συνδυασμό είτε με τυποποίηση του HPV, είτε με ανίχνευση της έκφρασης του mrna των E6/E7 του HPV, ή στο συνδυασμό των μεθόδων αυτών συμπληρωματικά, ανάλογα με τα μεσοδιαστήματα ελέγχου που θα επιλεγούν[156]. 81

82 ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ HPV mrna ΣΤΙΣ ΕΝΔΟΕΠΙΘΗΛΙΑΚΕΣ ΝΕΟΠΛΑΣΙΕΣ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ Με βάση τα επιδημιολογικά δεδομένα, μέχρι στιγμής, 15 υπότυποι του HPV έχουν χαρακτηριστεί σαν υψηλού κινδύνου (hr-hpv) και 12 υπότυποι σαν χαμηλού κινδύνου (lr-hpv) για την ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Μεταξύ των πρώτων, οι τύποι 16 και 18 αθροιστικά ευθύνονται για το 70% των καρκίνων αυτού του είδους [157]. Η ανίχνευση των λοιμώξεων που τείνουν να εμμένουν αποτελεί, πλέον, τον πρωταρχικό στόχο των μεθόδων εντοπισμού του HPV DNA, δεδομένου ότι οι λοιμώξεις που δεν υποχωρούν είναι πιθανό να οδηγήσουν στην ανάπτυξη αλλαγών των χαρακτήρων των κυττάρων, σε προκαρκινικές αλλοιώσεις ή ακόμα και σε καρκίνωμα. Η εφαρμογή μίας τεχνικής που θα μπορούσε με αξιοπιστία να ξεχωρίσει τις παροδικές από τις εμμένουσες λοιμώξεις, θα πρόσφερε σημαντικά στοιχεία ως προς την αποτελεσματική ανίχνευση των γυναικών, που βρίσκονται σε μεγαλύτερο κίνδυνο για την ανάπτυξη, πιθανών, καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Τα προγράμματα πληθυσμιακού ελέγχου, τα οποία βασίζονται αποκλειστικά στην κυτταρολογική εξέταση με τεστ Παπανικολάου, μπορεί να αποτρέψουν ακόμα και το 80% των καρκινωμάτων στις αναπτυγμένες χώρες. Είναι γνωστό, βέβαια, πως υπάρχουν και περιστατικά ψευδώς αρνητικά εξαιτίας τόσο του τρόπου λήψης του επιχρίσματος, όσο και εξαιτίας της σχετικά χαμηλής ευαισθησίας της εξέτασης[158]. Η χαμηλή ευαισθησία έχει σαν αποτέλεσμα, οι γυναίκες να υποβάλλονται σε επαναλαμβανόμενα τεστ Παπανικολάου σε τακτά χρονικά διαστήματα, προκειμένου να βελτιωθεί η αρνητική προγνωστική αξία της εξέτασης. Τα τελευταία χρόνια, η εισαγωγή ειδικών εξετάσεων εντοπισμού του HPV σε επίπεδο διαλογής, χρησιμεύει στη βελτίωση της ακρίβειας της διάγνωσης και στον εντοπισμό των εμμενουσών λοιμώξεων. Οι εξετάσεις που στοχεύουν, είτε στον εντοπισμό του DNA, είτε του RNA του HPV, ουσιαστικά, ανιχνεύουν την ύπαρξη του ιού. Οι δοκιμασίες που βασίζονται στον εντοπισμό του DNA, ανιχνεύουν την παρουσία του ιικού γενώματος, ενώ αυτές που έχουν σαν στόχο το RNA, εντοπίζουν, μέσω του mrna, την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την καρκινογένεση στον 82

83 τράχηλο της μήτρας, ειδικά των Ε6 και Ε7. Προηγούμενες μελέτες στη βιβλιογραφία, που αφορούσαν σε δοκιμασίες ανίχνευσης του mrna των Ε6/Ε7 του HPV ανέφεραν μεγαλύτερη ειδικότητα ως προς τον εντοπισμό υψηλόβαθμων ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων, από αυτή των δοκιμασιών του βασίζονταν στην ανίχνευση του DNA του ιού, αν και με χαμηλότερη ειδικότητα[159]. Ο συνδυασμός αυτών των παραμέτρων, βέβαια, έχει σαν αποτέλεσμα υψηλή θετική προγνωστική αξία των εξετάσεων και τελικά λιγότερες περιπτώσεις ψευδώς θετικών, με αποτέλεσμα τελικά την ελάττωση των περιπτώσεων υπέρ-θεραπείας. Σε μία μετά-ανάλυση, που δημοσιεύτηκε στη διεθνή βιβλιογραφία, η οποία συνέκρινε μελέτες που χρησιμοποίησαν δύο διαφορετικές μεθόδους εντοπισμού του mrna του ιού (APTIMA HPV, Gen-Probe και NucliSENS EasyQ, biomérieux) και τέσσερις διαφορετικές για το DNA (Hybrid Capture 2, Digene/Qiagen, PCR, Linear Array, Roche Diagnostics, Ampilicor, Roche Diagnostics) φαίνεται ότι και οι δύο δοκιμασίες για το mrna είχαν λιγότερες ψευδώς θετικές περιπτώσεις από αυτές του DNA, και τελικά υψηλότερη ειδικότητα. Ειδικά, η πρώτη μέθοδος (NucliSENS EasyQ, biomérieux) είχε σημαντικά υψηλότερη ειδικότητα, αν και χαμηλότερη ευαισθησία, ενώ η δεύτερη (APTIMA HPV, Gen-Probe) είχε αποτελέσματα ανάλογα των εξετάσεων του DNA. Είναι πιθανό η μειωμένη ευαισθησία και η αυξημένη ειδικότητα της μεθόδου NucliSENS EasyQ (biomérieux) να οφείλεται στο μικρότερο αριθμό των υποτύπων του ιού που εξετάζονται ( 5 έναντι των 14 τύπων υψηλού κινδύνου του ιού). Με βάση την ίδια μελέτη [155], η χρήση των τεχνικών προσδιορισμού του mrna του ιού, φαίνεται να έχει μεγαλύτερη σημασία σε επίπεδο δευτερογενούς πληθυσμιακού ελέγχου (διαλογή περιστατικών). Σε αυτό το επίπεδο, η υψηλή ειδικότητα μίας μεθόδου είναι σημαντικότερη προκειμένου να καθοριστεί ο κίνδυνος παρουσίας της νόσου με τη μέγιστη δυνατή πιθανότητα, διατηρώντας, φυσικά, και ένα επαρκές επίπεδο ευαισθησίας, έτσι ώστε να μην απωλεσθούν και περιπτώσεις γυναικών οι οποίες πάσχουν από τη νόσο. Μία μέθοδος που εφαρμόζεται στη διαλογή και έχει υψηλή ειδικότητα, στην ουσία μειώνει τον αριθμό των γυναικών, που, δυνητικά, θα υποβληθούν σε περιττές κωνοειδείς εκτομές, ή σε υπερθεραπεία, γενικότερα. 83

84 84

85 2. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 85

86 86

87 2.1. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Δείγμα πληθυσμού Στην παρούσα μελέτη εντάχθηκαν 3000 γυναίκες με μέση ηλικία τα 34,3 ± 11,9 έτη στο ηλικιακό φάσμα μεταξύ 18 και 65 ετών. Η διάρκεια της μελέτης ήταν τρία χρόνια ( ). Το δείγμα αφορούσε κυρίως γυναίκες, οι οποίες προσήλθαν στα Εξωτερικά Ιατρεία της Γ Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών στο «ΑΤΤΙΚΟΝ» Νοσοκομείο. Η συμμετοχή ήταν εθελοντική με προφορική συναίνεση κατόπιν πληροφόρησης για τους σκοπούς και τα οφέλη της μελέτης και για την πλήρη διατήρηση της ανωνυμίας των συμμετεχόντων. Η χρηματοδότηση του προγράμματος έγινε εξολοκλήρου από κονδύλια για έρευνα του Υπουργείου Ανάπτυξης, Project AKAKOS (code ATT.95). Οι γυναίκες που συμμετείχαν στη μελέτη προέρχονταν, ως επί το πλείστον, από τη γεωγραφική περιοχή της Δυτικής Αθήνας, αποτελώντας περίπου αριθμητικά το 0,1% του πληθυσμού της πρωτεύουσας γυναικών σε αναπαραγωγική και μετεμμηνοπαυσιακή ηλικία. Ως κριτήρια απόρριψης από την παρούσα μελέτη ορίστηκαν ο τοκετός κατά τη διάρκεια του τελευταίου ημερολογιακού έτους από την εισαγωγή στη μελέτη και η ελλιπής προσέλευση και συνεργασία για επανεξέταση και επανέλεγχο οποτεδήποτε κληθούν. Τελικά εξαιρέθηκαν του αρχικού δείγματος 471 γυναίκες. Η επεξεργασία του επιχρίσματος του τραχήλου της μήτρας, που ελήφθη από τις γυναίκες του πληθυσμού έρευνας, η προετοιμασία του πλακιδίου και η διάγνωσή του καθώς και η εφαρμογή και ανάλυση των μοριακών τεχνικών έγινε στο Εργαστήριο Διαγνωστικής Κυτταρολογίας του Πανεπιστημίου Αθηνών στο «ΑΤΤΙΚΟΝ» Νοσοκομείο. Η επεξεργασία και διάγνωση των πλακιδίων από τα βιοπτικά υλικά που ελήφθησαν από των τράχηλο των γυναικών με τη μέθοδο της κολποσκοπικά κατευθυνόμενης βιοψίας, έγινε στο Β Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημίου Αθηνών στο «ΑΤΤΙΚΟΝ» Νοσοκομείο. 87

88 Η λήψη του επιχρίσματος από τον τράχηλο της μήτρας και η κολποσκόπηση των γυναικών που συμμετείχαν στον πληθυσμό της έρευνας έγινε στο Ιατρείο Παθολογίας Τραχήλου της Γ Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών στο «ΑΤΤΙΚΟΝ» Νοσοκομείο ThinPrep Pap-Test Συλλογή του δείγματος Η συλλογή του δείγματος πραγματοποιήθηκε, ως επί τω πλείστον, με τη χρήση συσκευής τύπου Broom, και σε ορισμένες περιπτώσεις με ξύλινη σπάτουλα του Ayre σε συνδυασμό με ενδοτραχηλική ψύκτρα. Στην πρώτη περίπτωση, η συσκευή τοποθετήθηκε στο έξω τραχηλικό στόμιο και περιστράφηκε επί της περιφέρειας του τραχηλικού στομίου 5 φορές επί 360. Στην περίπτωση της κλασσικής συσκευής, η σπάτουλα τοποθετήθηκε με τη μακρύτερη κεφαλή εντός του έξω τραχηλικού στομίου και περιστράφηκε κατά 360, και ακολούθησε η εισαγωγή της ψήκτρας εντός του ενδοτραχήλου και η περιστροφή της κατά 180. Σε κάθε περίπτωση, ακολούθησε έκπλυση της συσκευής λήψης στο μονιμοποιητικό υλικό του φιαλιδίου. Για το σύστημα ThinPrep TP2000, το συντηρητικό υλικό μονιμοποίησης και μεταφοράς των κυττάρων του τραχηλικού δείγματος στο φιαλίδιο συλλογής PreservCyt είναι το Cytolyt, το οποίο βασίζεται στη μεθανόλη και περιέχει επίσης βλεννολυτικούς και αιμολυτικούς παράγοντες. Για τη συσκευή Broom, η συσκευή εμβυθίστηκε στο φιαλίδιο πιεστικά ώστε να ανοίξουν οι ίνες επί του πυθμένα και περιστάφηκε με αντίθετη φορά από τη φορά λήψης. Στη συνέχεια επιστρώθηκε και οποίο υλικό παρέμεινε στη συσκευή επί των τοιχωμάτων του φιαλιδίου. Ακολούθησε το κλείσιμο του πώματος και επιπλέον ελαφρά ανάδευση του φιαλιδίου με μέριμνα να φτάσει το υγρό έως το πώμα και να παρασύρει κάθε κύτταρο. Η σπάτουλα και η ψήκτρα εμβυθίστηκαν στο υλικό του φιαλιδίου διαδοχικά και περιεστράφησαν κυκλικά. Μετά το κλείσιμο του πώματος, το φιαλίδιο αναδεύτηκε ελαφρά. Τα φιαλίδια μεταφέρθηκαν στο Εργαστήριο Διαγνωστικής Κυτταρολογίας για περαιτέρω επεξεργασία. 88

89 Επεξεργασία του δείγματος Το φιαλίδιο μεταφέρθηκε σε αναδευτήρα και ακολούθησε φυγοκέντρηση. Η διαδικασία επαναλήφθηκε δύο (2) φορές. Από το ίζημα των κυττάρων ελήφθη ικανή ποσότητα κυττάρων για την εξαγωγή DNA, RNA και πρωτεϊνών. Το υλικό μεταφέρθηκε σε συντηρητικό υγρό PreservCyt (Cytyc, Η.Π.Α.), το οποίο βασίζεται στη μεθανόλη και χρησιμοποιεί μια απλή διαδικασία προετοιμασίας του υλικού με ελεγχόμενη μεταφορά μέσω μεμβράνης, χωρίς άλλα απαιτούμενα στάδια προετοιμασίας. Το φιαλίδιο PreservCyt μεταφέρθηκε σε κατάλληλο επεξεργαστή (TP2000, Cytyc, Η.Π.Α.), στον οποίο πραγματοποιήθηκε αυτοματοποιημένη επίστρωση πλακιδίου ThinPrep. Με τη βοήθεια ειδικού λογισμικού του επεξεργαστή επιτυγχάνεται η ρύθμιση της διέλευσης των κυττάρων μέσω φίλτρου και η επίστρωση των κυττάρων του δείγματος σε λεπτή, μονοεπίπεδη στιβάδα, στην ειδική αντικειμενοφόρο πλάκα. Χρώση πλακιδίων κατά Παπανικολάου Στα πλακίδια που παρασκευάστηκαν με την ThinPrep τεχνική, ακολούθησε χρώση κατά Παπανικολάου για να τεθεί η κυτταρολογική διάγνωση. Τα στάδια που ακολουθήθηκαν ήταν: 1. ενυδάτωση των πλακιδίων για 10 δευτερόλεπτα 10 φορές σε αιθανόλη 80, 70, 60 με απεσταγμένο νερό (dh 2 O) 2. χρώση με αιματοξυλίνη Harris (Merck, Γερμανία) για 5 λεπτά 3. έκλπυση με τρεχούμενο νερό βρύσης για 5 λεπτά 4. έκλπυση με 10 εμβαπτίσεις σε απεσταγμένο νερό dh 2 O 5. διαφοροποίηση με 0,25% v/v αραιωμένου HCl 37,5% με 3 εμβαπτίσεις των 10 δευτερολέπτων 6. έκλπυση με 10 εμβαπτίσεις σε απεσταγμένο νερό dh 2 O 7. αφυδάτωση των πλακιδίων με 10 εμβαπτίσεις των 10 δευτερολέπτων σε αιθανόλη 50, 70, 80 και χρώση με Orange G (Merck, Γερμανία) για 5 λεπτά 9. Έκλπυση με 95 αιθανόλη εις διπλούν 10. χρώση με ΕΑ50 (Merck, Γερμανία) για 5 λεπτά 89

90 11. αφυδάτωση των πλακιδίων με 10 εμβαπτίσεις των 10 δευτερολέπτων σε αιθανόλη 50, 70, 80, 96, 100, μίγμα 100% αιθανόλης με ξυλόλη σε αναλογία 1:1 v/v και ξυλόλης εις διπλούν. Η κάλυψη των πλακιδίων έγινε με οργανικό μέσο DPX (1-3-διαίθυλ-8- φαίνυλοξανθίνη) (BHD, Ην. Βασίλειο). Κυτταρολογική Διάγνωση Η κυτταρολογική διάγνωση ετέθη από έμπειρο κυτταρολόγο στα πλακίδια που εχρώσθησαν κατά Παπανικολάου. Ακολουθήθηκαν οι αρχές του Συστήματος TBS2001, επί της καταλληλότητας του δείγματος, της επάρκειάς του και τελικά γενική κατηγοριοποίηση και ερμηνεία του επιχρίσματος και αναφορά του τελικού αποτελέσματος ΚΟΛΠΟΣΚΟΠΗΣΗ Η κολποσκόπηση αποτελεί μία σύγχρονη διαγνωστική μέθοδο, η οποία επιτρέπει τον έλεγχο του επιθηλίου του τραχήλου της μήτρας και την εκτίμηση των μεταβολών, που υποδηλώνουν προδιηθητική ή διηθητική νόσο. Όπως επισημαίνεται από τον καθηγητή Διακομανώλη: «Ο ρόλος της κολποσκόπησης είναι ο ανατομικός καθορισμός της επιθηλιακής βλάβης και η αρχική εκτίμηση της σοβαρότητας αυτής»[3]. Βάσει πρωτοκόλλου έρευνας, παραπέμφηκαν για κολποσκόπηση όλες οι γυναίκες με παθολογικό τεστ Παπανικολάου, HPV DNA testing θετικό για την παρουσία ιών υψηλού κινδύνου, θετικό NASBA ή θετικό FLOW CYTOMETRY. Η ορολογία που χρησιμοποιήθηκε κατά την περιγραφή, αξιολόγηση και διάγνωση της κολποσκοπικής εικόνας είναι αυτή που προτάθηκε από την επιτροπή της Διεθνούς Ομοσπονδίας Παθολογίας Τραχήλου και Κολποσκόπησης (International Federation for Cervical Pathology and Colposcopy IFCPC) υπό την προεδρία του Patric Walker το 2002 [160]. Η αξιολόγηση των κολποσκοπικών ευρημάτων έγινε με το σύστημα του Reid (Reid Colposcopic Index, RCI) [ ], το οποίο αποτελεί το πιο διαδεδομένο 90

91 και ευρύτερα αποδεκτό σύστημα αξιολόγησης των κολποσκοπικών ευρημάτων, ενώ παράλληλα χρησιμοποιήθηκε και το σύστημα Coppelson [163]. Μετά τον καθορισμό και τη χαρτογράφηση της πιθανής αλλοίωσης, ο κολποσκόπος έκρινε σε ποιες περιπτώσεις ήταν απαραίτητη η λήψη βιοψίας και έλαβε τουλάχιστον τρία ιστοτεμάχια (3) με λαβίδες τύπου Tishler [164]. Σε καμία περίπτωση δεν ακολουθήθηκε η άμεση θεραπευτική προσέγγιση, χωρίς να προηγηθεί η ιστολογική επιβεβαίωση της παρουσίας αλλοίωσης από το βιοπτικό υλικό ΒΙΟΨΙΕΣ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΜΗΤΡΑΣ Στις περιπτώσεις στις οποίες βάσει πρωτοκόλλου (όπως ήδη αναφέρθηκε) κρίθηκε απαραίτητο, ελήφθησαν κολποσκοπικά κατευθυνόμενες βιοψίες (punch biopsies). Το υλικό που ελήφθη από τις λαβίδες βιοψίας τοποθετήθηκε σε φιαλίδια και χρησιμοποιήθηκε φορμόλη ως μονιμοποιητικό μέσο. Μεταφέρθηκε στο Β Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημίου Αθηνών ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ HPV DNA μικροσυστοιχίες (CLART Human Papillomavirus 2 kit, GENOMICA, Spain) Πρόκειται για μία από τις πλέον σύγχρονες μεθόδους μοριακής ανίχνευσης και τυποποίησης του HPV [3]. Πρόκειται για τεχνική που προσφέρει τη γρήγορη ανίχνευση και την ταυτόχρονη τυποποίηση μονών και πολλαπλών μολύνσεων έως και 35 HPV γονοτύπων (HPV 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 και 89) από ένα ευρύ φάσμα κλινικών παρασκευασμάτων (βαμβακοφόρο στυλεό, δείγματα κυτταρολογίας υγρής φάσης ThinPrep, ιστοτεμάχια από νωπούς ιστούς ή κύβους παραφίνης). Στηρίζεται στην ανάπτυξη ενός συστήματος ανίχνευσης HPV ολιγονουκλεοτιδίων, το οποίο βασίζεται σε μία υψηλής 91

92 ευαισθησίας και ειδικότητας PCR και στη τεχνολογία των μικροσυστοιχιών μικρής πυκνότητας. Η τεχνική περιλαμβάνει την παράταξη σε σειρά εκατοντάδων μικροφρεατίων που το καθένα περιέχει picomoles (10-12 moles) από διαφορετικά DNA ολιγονουκλεοτίδια που καλούνται ιχνηθέτες, και χρησιμεύουν για τον υβριδισμό με cdna (στόχο) από το δείγμα. Η ανίχνευση του υβριδισμού βασίζεται στην παραγωγή ενός αδιάλυτου φθορίζοντος προϊόντος που σχηματίζεται όταν το τμήμα του DNA-στόχου δεσμεύεται από τον κατάλληλο ιχνηθέτη που βρίσκεται στο μικρο-φρεάτιο. Συγκεκριμένα για την τεχνική CLART GENOMICA, Spain που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη, αρχικά το δείγμα κυτταρολογίας υγρής φάσης ThinPrep υπεβλήθη σε PCR για πολλαπλασιασμό του πιθανώς υπάρχοντος DNA του/των ιών HPV. Η πλάκα των μικροσυστοιχειών, μεγέθους 3х3, περιλαμβάνει 120 cdna μικροφρεάτια «ακινητοποιημένα» σε ένα πλακίδιο επενδεδυμένο με πολυμερές, που μπορούν να υβριδιστούν με ειδικές DNA αλληλουχίες από το δείγμα. Το πολλαπλασιασμένο DNA μαρκάρεται με βιοτίνη και τοποθετείται στο σωληνάριο των συστοιχιών. Τα επισημασμένα, πλέον, προϊόντα αναγνωρίζουν τους αντίστοιχους ιχνηθέτες του πλακιδίου κατά τον υβριδισμό και καθηλώνονται. Το δείγμα επωάζεται με στρεπταβιδίνηπεροξυδάση, που δεσμεύεται από το δείγμα μέσω μίας αντίδρασης μεταξύ της στρεπταβιδίνης και της βιοτίνης με την οποία έχει μαρκαριστεί το δείγμα. Με την παρουσία ο-διανισιδίνης, η περοξυδάση επάγει τη δημιουργία ενός αδιάλυτου προϊόντος το οποίο καθιζάνει στα αντίστοιχα φρεάτια όπου έγινε ο υβριδισμός. Το σήμα που παράγεται τελικά, αποδίδεται στην εικόνα που παράγεται στο μηχάνημα σαν σκούρες κηλίδες. Καθεμία αντιστοιχεί σε διαφορετικό τύπο του ιού. ΜΕΘΟΔΟΣ Προπαρασκευαστικές διαδικασίες Προετοιμασία ρυθμιστικών διαλυμάτων όπως περιγράφονται από τον κατασκευαστή και φύλαξη με βάση τις οδηγίες. Εξαγωγή του HPV DNA (extraction of HPV DNA) 1. Προετοιμασία του δείγματος 92

93 Ανάδευση του δείγματος (αναστροφή του φιαλιδίου λίγες φορές) και αφαίρεση 1 ml σε φιαλίδιο μικροφυγοκέντρου χωρητικότητας 1,5 ml. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 10 λεπτά στις rpm και αφαίρεση του υπερκείμενου υγρού με μικροπιπέτα. Επαναδιάλυση του παραμένοντος υλικού με 1 ml αποστειρωμένου νερού. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 10 λεπτά στις rpm και αφαίρεση του υπερκείμενου υγρού με μικροπιπέτα. Επαναδιάλυση του παραμένοντος υλικού με 180 μl του ήδη παρασκευασμένου διαλύματος, το οποίο από τις οδηγίες του κατασκευαστή, ορίζεται ως Τ1. Μεταφορά σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου χωρητικότητας 1,5 ml. 2. Προσθήκη 25 μl διαλύματος πρωτεΐνάσης Κ και εγκλεισμός των δειγμάτων στους 56 C για 1 με 3 ώρες σε υδατόλουτρο, μέχρι την πλήρη λύση του δείγματος. Η διαδικασία ανάδευσης των δειγμάτων (vortex) κάθε 15 λεπτά επιταχύνει τη διαδικασία της λύσης. 3. Μετά τη λύση, προσθήκη 200 μl διαλύματος, που χαρακτηρίζεται από τον κατασκευαστή σαν Β3, σε κάθε δείγμα. Ανάμιξη των δειγμάτων με μηχανική ανάδευση (vortex) και εγκλεισμός των δειγμάτων στους 70 C για 10 λεπτά. 4. Προσθήκη 210 μl διαλύματος 96% αιθανόλης σε κάθε δείγμα και μηχανική ανάδευση. 5. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 1 λεπτό στις rpm. 6. Προσθήκη 500 μl διαλύματος BW και φυγοκέντρηση στις rpm για 1 λεπτό. Απόρριψη του διηθημένου διαλύματος και του φιαλιδίου συλλογής των 2 ml. 7. Προσθήκη 600 μl διαλύματος Β5 και φυγοκέντρηση στις rpm για 1 λεπτό. Απόρριψη του διηθημένου διαλύματος. 8. Φυγοκέντρηση εκ νέου στις rpm για εξάλειψη τυχόν παραμένοντος διαλύματος Β5. 9. Τοποθέτηση του υλικού σε καινούριο φιαλίδιο μικροφυγοκέντρου χωρητικότητας 1,5 ml. Εγκλεισμός του δείγματος με 100 μl προθερμασμένου στους 70 C διαλύματος ΒΕ για 1 λεπτό και στη συνέχεια φυγοκέντρηση στις rpm για 1 λεπτό. 10. Αφαίρεση 5 μl από το φιαλίδιο της μικροφυγοκέντρου για την αντίδραση της ενίσχυσης και διατήρηση του υπολοίπου στους 20 C. 93

94 Αντίδραση ενίσχυσης (Amplification reaction) 1. Ξεπάγωμα ενός φιαλιδίου αντίδρασης για κάθε δείγμα και διατήρηση τους σε πάγο. Οι θερμοκρασίες του ξεπαγώματος δεν ξεπερνούν τους 37 C. 2. Φυγοκέντρηση των φιαλιδίων της αντίδρασης στη μικροφυγόκεντρο, ώστε το υγρό να συγκεντρωθεί στον πυθμένα του φιαλιδίου. 3. Προσθήκη 5 μl από το εξαχθέν DNA σε κάθε φιαλίδιο αντίδρασης και ανάδευση αρκετές φορές με τη βοήθεια της μικροπιπέτας. 4. Προγραμματισμός του thermocycler όπως παρατίθεται: Για φιαλίδια χωρητικότητας 0,2 ml 1 κύκλος 95 C για 9 λεπτά 45 κύκλοι 94 C για 0,5 λεπτό 55 C για 1 λεπτό 72 C για 1.5 λεπτό 1 κύκλος 72 C για 8 λεπτά 20 C (διατηρήσιμο) μέχρι τη συλλογή των φιαλιδίων (προαιρετικό) 5. Έναρξη του προγράμματος και τοποθέτηση των φιαλιδίων της αντίδρασης όταν η θερμοκρασία είναι πάνω από 90 C. Αυτό μειώνει την πιθανότητα μη ειδικών ενισχύσεων λόγω υβριδισμού σε χαμηλότερες θερμοκρασίες από τις προβλεπόμενες για την αντίδραση. Γενικά η διαδικασία της αντίδρασης διαρκεί περίπου 4 ώρες. Οπτικοποίηση αποτελεσμάτων (visualization of amplified products) 1. Ενεργοποίηση του ΑΤ σαρωτή. 2. Πριν την εκκίνηση του προγράμματος λύσης των δεσμών και μετουσίωσης (denaturing), έκπλυση του μηχανήματος με καθαριστικό διάλυμα 10% (με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή). Τοποθέτηση των φιαλιδίων ξεχωριστά εντός του μηχανήματος. 3. Το διάλυμα υβριδισμού πρέπει να βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου. 94

95 4. Διασφάλιση ότι τα θερμικά μίγματα βρίσκονται στην κατάλληλη θερμοκρασία πριν την εισαγωγή των φιαλιδίων συστοιχιών. 5. Σήμανση των φιαλιδίων με κωδικό για εντοπισμό λαθών κατά τη διαδικασία. Διαδικασίες οπτικοποίησης 1. Μετουσίωση (denaturation): χρήση του thermocycler για μετουσίωση των προϊόντων της PCR. Τοποθέτηση των φιαλιδίων στο μηχάνημα και εμβάπτιση στους 95 C για 10 λεπτά. Ρύθμιση του μηχανήματος στα 15 λεπτά, ούτως ώστε μετά τη μετουσίωση τα προϊόντα να παραμείνουν σε αυτή τη θερμοκρασία. Αφαίρεση των φιαλιδίων και άμεση τοποθέτησή τους σε πάγο. 2. Πρό-πλυση των φιαλιδίων της αντίδρασης (array tubes AT): τοποθέτηση 300 μl διαλύματος TL, όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή, σε κάθε ΑΤ και ανάδευση 4 με 5 φορές. Αφαίρεση του διαλύματος με μικροπιπέτα και επαρκές στέγνωμα των φιαλιδίων και των καπακιών τους. 3. Υβριδοποίηση : προσθήκη 100 μl διαλύματος SH, όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή, χωρίς να σχηματιστεί αφρός. Προσθήκη 5 μl από τα μετουσιώμενα ενισχυμένα προϊόντα και δημιουργία εναιωρήματος. Τοποθέτηση στο μηχάνημα, το οποίο έχει ρυθμιστεί στους 55 C και στις 550 rpm. Στη συνέχεια αφαίρεση των φιαλιδίων από το μηχάνημα και αφαίρεση του διαλύματος SH με μικροπιπέτα. Ρύθμιση της θερμοκρασίας στους 30 C και προετοιμασία για το 5 ο βήμα. 4. Πλύση : προσθήκη 300 μl διαλύματος TL σε κάθε ΑΤ και ανάδευση 5 με 10 φορές. Αφαίρεση του διαλύματος με τη βοήθεια μικροπιπέτας, αλλάζοντας τις άκρες (tips) της πιπέτας σε κάθε δείγμα. 5. Δέσμευση μη ειδικών θέσεων και προσθήκη υποστρώματος (Blocking and addition of conjugate): τοποθέτηση κάθε φιαλιδίου αντίδρασης με 100 μl αραιού διαλύματος CJ στους 30 C και στις 550 rpm. Προετοιμασία αραιού διαλύματος CJ 15 λεπτά πριν την υβριδοποίηση και τοποθέτηση του σε πάγο μέχρι τη χρήση. Ανάδευση με vortex του διαλύματος CJ πριν τη χρήση. Στη συνέχεια ακολουθεί γρήγορη εξαίρεση του διαλύματος από το 95

96 ΑΤ χρησιμοποιώντας πιπέτα. Ελάττωση της θερμοκρασίας στους 25 C για το επόμενο στάδιο. 6. Διπλές πλύσεις : προσθήκη γρήγορα 300 μl αραιού διαλύματος TL σε κάθε ΑΤ και ανάδευση των φιαλιδίων 5 με 10 φορές και στη συνέχεια αφαίρεση του διαλύματος με πιπέτα. Απαραίτητο στοιχείο είναι η αποφυγή δημιουργίας ιζήματος στο διάλυμα. 7. Εργασία σε ομάδες των 12 ΑΤ. Αφαίρεση του διαλύματος TL και προσθήκη 100 μl διαλύματος RE στο ΑΤ για 10 λεπτά στους 25 C στο μηχάνημα χωρίς περιδιύνηση. 8. Προγραμματισμός σε batch analysis στο μηχάνημα ανάγνωσης: ανάγνωση 24 δειγμάτων και ανάλυση των αποτελεσμάτων σε δεύτερο χρόνο. Υβριδισμός και ανίχνευση ενδοκυττάριου mrna με κυτταρομετρία ροής Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μία πολυπαραμετρική και ποσοτική τεχνική ανάλυσης των ιδιοτήτων κάθε κυττάρου χωριστά, τα οποία βρίσκονται αιωρούμενα σε υγρό μέσο και έχουν συνεχή ροή μέσω ενός θαλάμου (flow chamber). Χρησιμοποιεί δέσμη πολωμένου φωτός υψηλής ενέργειας (laser), προκειμένου να διεγείρει μόρια είτε που βρίσκονται στην επιφάνεια ή στο εσωτερικό των κυττάρων, είτε έχουν χορηγηθεί εξωγενώς (φθορίζοντες ιχνιθέτες). Τα κύτταρα διέρχονται στο θάλαμο ροής και διαπερνούν τη δέσμη του laser ως μονά στοιχεία, με βάση την αρχή της υδροδυναμικής εστίασης, με τη βοήθεια ενός ταχύτερα κινούμενου υγρού θήκης. Η επαφή των κυττάρων με τη δέσμη του φωτός, τροποποιεί τελικά τις ιδιότητες του. Μετά τη διέλευση από αλλεπάλληλα φίλτρα, καταλήγει σε φωτοπολλαπλασιαστές, κατάλληλους να ανιχνεύουν την ένταση του φωτός. Ακολουθεί η μετάφραση σε ηλεκτρικό ρεύμα και η ανάλυση του σήματος από λογισμικό. Έτσι δίδονται πληροφορίες για διαφορετικές παραμέτρους όπως η σκέδαση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας στα κύτταρα και η παραγόμενη φθορίζουσα ακτινοβολία. Όσον αφορά τη μεταβολή της σκέδασης του φωτός κατά τη συνάντηση με το κύτταρο, αναλύεται η πρόσθια σκέδαση (FSC, Front Scatter) η οποία 96

97 σχετίζεται με το μέγεθος του σωματιδίου και η πλάγια σκέδαση (SSC, Side Scatter) με την πολυπλοκότητα του κυττάρου, όπως καθορίζεται, κυρίως, από την κοκκίωση του κυτταροπλάσματος. Ως προς την ανίχνευση φθορίζοντος σήματος, η κυτταρομετρία ροής μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος ανίχνευσης φθοριζουσών χημικών ουσιών. Οι κυτταρομετρητές ροής χρησιμοποιούν φίλτρα συγκεκριμένου μήκους κύματος, για το διαχωρισμό του παραγόμενου φθορισμού και ο κάθε ένας ανιχνεύεται σε διαφορετικό πολλαπλασιαστή. Ειδικότερα, η κυτταρομετρία ροής μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος ανίχνευσης της υπερέκφρασης του mrna των γονιδίων Ε6 και Ε7 του HPV κατόπιν ενσωμάτωσης του ιού στο γενωμικό DNA. Βασίζεται στον υβριδισμό ενός FAM-σημασμένου μίγματος HPV ιχνηθετών σε κύτταρα εξωτραχήλου προερχόμενα από εναιώρημα σε φιαλίδιο κυτταρολογίας υγρής φάσης (ThinPrep ), τα οποία έχουν μονιμοποιηθεί και έχουν καταστεί διαπερατά με τη βοήθεια ρυθμιστικού διαλύματος (HPV OncoTectTM, Invirion Diagnostics, LLC, Oak Brook, IL). Τα δείγματα αναλύονται σε κυτταρόμετρο ροής Partec CyFlow SL που διαθέτει ως πηγή φωτός 488nm argon laser και φωτοπολλαπλασιαστή με απορρόφηση στα 520 nm. Ο συνδυασμός πρόσθιας και πλάγιας σκέδασης χρησιμοποιείται για επιλογή (gating) κυττάρων του εξωτραχήλου. Το αποτέλεσμα εκφράζεται ως ποσοστό φθοριζόντων κυττάρων που υπερεκφράζουν mrna των ογκοπρωτεινών Ε6 και Ε7. Θετικό ορίστηκε το αποτέλεσμα όταν το ποσοστό υπερέβαινε το 1,5%. Προκειμένου να οριστεί το ποσοστό που θα αποτελούσε τον ουδό θετικότητας, η παρασκευάστρια εταιρία παρείχε δύο σειρές πληθυσμού κυττάρων σαν θετικό έλεγχο και σαν αρνητικό έλεγχο. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν και 150 δείγματα κυτταρολογικά διαγνωσμένων περιστατικών σαν αρνητικά για ύπαρξη κακοήθειας. ΑΡΧΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η εξέταση HPV OncoTect E6,E7 mrna αποτελείται από έξι βήματα: 1. Ορθή συλλογή και αποθήκευση του δείγματος 97

98 2. Μονιμοποίηση και αύξηση διαπερατότητας του κυττάρου 3. Πλύσεις πριν την υβριδοποίηση 4. Υβριδοποίηση 5. Πλύσεις μετά την υβριδοποίηση 6. Λήψη και ανάλυση δεδομένων Μετά από οποιαδήποτε διαδικασία χειρισμού των κυττάρων και πριν την υβριδοποίηση (π.χ. σήμανση επιφανειακών αντιγόνων), τα κύτταρα μονιμοποιούνται και η διαπερατότητα τους αυξάνεται με μία αντίδραση ενός σταδίου, πλένονται δύο φορές, ως προετοιμασία για την υβριδοποίηση, υβριδοποιούνται με ένα κοκτέιλ ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών, πλένονται για να απομακρυνθεί όσος ανιχνευτής δεν ενώθηκε και οι αναντιστοιχίες, και τελικά αναλύονται με κυτταρομετρία ροής. ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Τα δείγματα αποθηκεύονται στους 2-8 C, όσον το δυνατόν συντομότερα μετά τη συλλογή και μέχρι να προετοιμαστούν για ανάλυση. Έκθεση των δειγμάτων σε υψηλές θερμοκρασίες (μεγαλύτερες των C) έχει ανεπιθύμητα αποτελέσματα στην ποιότητα του δείγματος και τα δείγματα αυτά πρέπει να απορρίπτονται. Η ηλικία του δείγματος μπορεί να επηρεάζει την ποιότητα των αποτελεσμάτων. Με βάση τις οδηγίες της παρασκευάστριας εταιρίας, υπό βέλτιστες συνθήκες, τα δείγματα πρέπει να προετοιμάζονται και να αναλύονται μέσα σε δύο εβδομάδες από τη συλλογή τους. Τρεις εβδομάδες θεωρείται ο μέγιστος χρόνος ανάμεσα στη συλλογή του δείγματος και την προετοιμασία του για ανάλυση. ΜΕΘΟΔΟΣ Μονιμοποίηση των κυττάρων 98

99 1. Μεταφορά 1 ml (περίπου 1х 10 6 κύτταρα) από κάθε κυτταρολογικό τραχηλικό δείγμα σε υγρή μορφή, σε ξεχωριστούς σωλήνες του 1,5 ml από πολυπροπυλένιο τύπου Eppendorf. Φυγοκέντρηση στα 1000 х g επί 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αναρρόφηση υπερκείμενου, με προσοχή ώστε να μη διαταραχτούν τα συσσωματώματα των κυττάρων. 2. Πλύσιμο των κυττάρων σε 1 ml PBS ph 7,4 και φυγοκέντρηση σε 1000 х g επί 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αναρρόφηση του υπερκείμενου, με προσοχή ώστε να μη διαταραχτούν τα συσσωματώματα των κυττάρων. 3. Προσθήκη 300 ul αντιδραστηρίου incellfp σε κάθε σωλήνα δείγματος, ήπια περιδίνηση των κυττάρων για αποφυγή σχηματισμού θρόμβων. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου επί 1 ώρα. Υβριδοποίηση Προετοιμασία υδατόλουτρου στους 43 C ± 1 C. Τοποθέτηση αντιδραστηρίων 6 και 7 κατά τα πρωτόκολλα της παρασκευάστριας εταιρίας και αναμονή περίπου μισή ώρα προκειμένου να προθερμανθούν στους 43 C πριν την τοποθέτηση των δειγμάτων. 1. Πλύση των κυττάρων σε 1 ml αντιδραστηρίου 2 κατά τα πρωτόκολλα της παρασκευάστριας εταιρίας και ήπια περιδίνηση των κυττάρων. Φυγοκέντρηση σε 1000 х g επί 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, με πλήρη πέδηση. Αναρρόφηση του υπερκείμενου, με προσέχοντας να μη διαταραχτεί το συσσωμάτωμα των κυττάρων. 2. Ήπια περιδίνηση των κυττάρων στο υπόλοιπο υγρό. 3. Προσθήκη 1 ml αντιδραστηρίου 2 κατά τα πρωτόκολλα της παρασκευάστριας εταιρίας και ήπια περιδίνηση των κυττάρων. Φυγοκέντρηση σε 1000 х g επί 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, με πλήρη πέδηση. Αναρρόφηση του υπερκείμενου, με προσέχοντας να μη διαταραχτεί το συσσωμάτωμα των κυττάρων. Αφαίρεση όσον το δυνατόν περισσότερου υπολειπόμενου όγκου χωρίς διαταραχή των συσσωματωμάτων. 99

100 4. Ήπια περιδίνηση των κυττάρων στο υπόλοιπο υγρό. 5. Προετοιμασία κοκτέιλ υβριδοποίησης αναμιγνύοντας 100 μl αντιδραστηρίου 4 με 3 μl αντιδραστηρίου 5 κατά τα πρωτόκολλα της παρασκευάστριας εταιρίας ανά δείγμα σε σωλήνα πολυπροπυλενίου 15ml. Προσθήκη 103 μl του μίγματος σε κάθε σωλήνα δείγματος. Ήπια περιδίνηση των κυττάρων. 6. Επώαση σε προθερμασμένο υδατόλουτρο θερμοκρασίας 43 C ± 1 C επί 30 λεπτά. Επιμελείς πλύσεις των κυττάρων 1. Προσθήκη 1 ml προθερμασμένου αντιδραστηρίου 6 σε κάθε σωλήνα δείγματος. Ήπια περιδίνηση των κυττάρων. 2. Φυγοκέντρηση σε 1000 х g επί 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, με πλήρη πέδηση. Αναρρόφηση του υπερκείμενου, με προσέχοντας να μη διαταραχτεί το συσσωμάτωμα των κυττάρων. Ήπια περιδίνηση των κυττάρων στο υπόλοιπο υγρό. 3. Προσθήκη 1 ml προθερμασμένου αντιδραστηρίου 7 σε κάθε σωλήνα δείγματος. Ήπια περιδίνηση των κυττάρων. 4. Επώαση σε υδατόλουτρο 43 C επί 15 λεπτά. 5. Φυγοκέντρηση σε 1000 х g επί 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, με πλήρη πέδηση. Αναρρόφηση του υπερκείμενου, με προσέχοντας να μη διαταραχτεί το συσσωμάτωμα των κυττάρων. Ήπια περιδίνηση των κυττάρων στο υπόλοιπο υγρό. 6. Αιώρηση εκ νέου των κυττάρων σε μl 1 х PBS, ph 7,4. Περιδίνηση. 7. Έτοιμα δείγματα για ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. 100

101 Ανάλυση των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής 1. Αξιολόγηση της λειτουργίας του οργάνου, σύμφωνα με τις διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου του εργαστηρίου. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Το αποτέλεσμα εκφράζεται ως το ποσοστό των τραχηλικών κυττάρων στην πύλη ανάλυσης που υπερεκφράζουν mrna για ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7. Εάν το ποσοστό αυτό υπερβαίνει το κλινικό σημείο αποκοπής (cut-off), το αποτέλεσμα της εξέτασης HPV OncoTect Ε6, Ε7 mrna αναφέρεται ως θετικό. Εάν το αποτέλεσμα είναι μικρότερο από το κλινικό σημείο αποκοπής (cut-off), το αποτέλεσμα της εξέτασης αναφέρεται ως αρνητικό. Τα παρακάτω αποτελούν απαιτήσεις για αναφορά έγκυρου αποτελέσματος: συμβάντα καθορίζονται ως στόχος για λήψη δεδομένων συμβάντα πρέπει να είναι εξωτραχηλικά δείγματα (δηλ. στην πύλη ανάλυσης) - Ο διορθωμένος πληθυσμός πρέπει να διαθέτει κατάλληλη εμφάνιση - Έστω ότι το αποτέλεσμα του δείγματος είναι έγκυρο: Τα θετικά αποτελέσματα προσδιορίζονται διαβάζοντας μία τιμή αποκοπής 1,5% των κυττάρων ή μία τιμή αποκοπής που προσδιορίζεται λαμβάνοντας το μέσο όρο 20 κυτταρολογικώς φυσιολογικών δειγμάτων συν 2 τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο ως σημείο αποκοπής. Αρνητικά αποτελέσματα είναι λιγότερα κύτταρα από 1,5%. 101

102 Ενίσχυση νουκλεικών οξέων βασισμένη στην αλληλουχία (Nucleic Acid Sequence- Based Amplification) Η τεχνική ανίχνευσης PCR με γενικούς εκκινητές στοχεύει σε περιοχές του ιικού γενώματος του HPV, όπως αυτή που κωδικοποιεί την κύρια καψιδιακή πρωτείνη L1 του ιού. Η πρωτείνη αυτή όμως, αφενός δεν εμπλέκεται στο μηχανισμό ογκογένεσης και αφετέρου εκφράζεται αργά στον κύκλο ζωής του ιού και όταν ο ιός φτάσει στα υψηλής διαφοροποίησης παραβασικά κύτταρα. Με τη μέθοδο αυτή δεν είναι δυνατό να ελεγχθεί η έκφραση και τελικά η λειτουργία των ογκοπρωτεινών του HPV, η οποία, τελικά, αποτελεί και το μέτρο εξέλιξης των καρκινικών αλλαγών στο κύτταρο. Σε περίπτωση απώλειας της L1 περιοχής λόγω ενσωμάτωσης του ιικού γενώματος σε αυτό του ξενιστή, οι τεχνικές που χρησιμοποιούν DNA, μπορεί ψευδώς να διαγνώσουν το δείγμα ως αρνητικό, παρά την ύπαρξη επιθετικής δραστηριότητας των ογκοπρωτεινών Ε6/Ε7. Τα δεδομένα αυτά οδήγησαν στην ανάπτυξη μίας νέας, σύγχρονης μεθόδου μοριακής διερεύνησης. Η τεχνική αναπτύχθηκε από τον J. Compton το Χρησιμοποιούνται μοριακοί ιχνηθέτες για την τυποποίηση και την ανίχνευση του mrna των Ε6/Ε7 ογκοπρωτεινών πέντε καρκινογόνων τύπων του HPV, των 16, 18, 31, 33 και 45. Αν και ο τρόπος λειτουργίας της είναι παρόμοιος με αυτόν της PCR, παρολαυτά έχει ορισμένες σημαντικές διαφορές: Α. αντί για DNA ή cdna ως αρχικό εκμαγείο για επιλεκτική ενίσχυση μπορεί να χρησιμοποιηθεί RNA. Β. η όλη αντίδραση πραγματοποιείται σε σταθερή θερμοκρασία χωρίς εναλλαγές. Γ. επειδή όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε τρία κλειστά σωληνάρια, και ανιχνεύεται mrna, πρακτικά δεν υφίσταται κίνδυνος επιμόλυνσης του δείγματος. Η τεχνική λειτουργεί ως εξής στους 41 C : 1. Σε κατάλληλο σωληνάριο, που περιέχει τα απαραίτητα ένζυμα της αντίδρασης, προστίθεται το RNA, που αποτελεί το εκμαγείο, στο μίγμα της αντίδρασης, και ξεκινά η αντίδραση με τον πρώτο εκκινητή να προσδένεται στο συμπληρωματικό του σημείο στο 3 ακρο της μήτρας. 2. Η αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει την αντίθετη και συμπληρωματική αλυσίδα του DNA 3. H δράση της RNAάσης Η προκαλεί την καταστροφή μόνο του RNA στα υβρίδια RNA- DNA, και όχι του μονόκλωνου RNA 102

103 4. Ο δεύτερος εκκινητής προσκολλάται στο 5 άκρο της DNA αλυσίδας 5. Η Τ7 RNA πολυμεράση παράγει μία συμπληρωματική RNA αλυσίδα, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ξανά κυκλικά, ξεκινώντας ξανά, από βήμα 1. Η διάγνωση γίνεται σε πραγματικό χρόνο. Τα νέα προιόντα του ποσοτικού πολλαπλασιασμού του RNA ανιχνεύονται με τη βοήθεια μοριακών ιχνηθετών (beacons). Οι ιχνηθέτες αυτοί είναι μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια με συμπληρωματικά άκρα που σχηματίζουν βρόχο και φθορίζουν μετά τον υβριδισμό με το στόχο τους. Το ένα άκρο του βρόχου συνδέεται με μία φθορίζουσα χρωστική και το άλλο με ένα δεύτερο μόριο που απορροφά το φθορισμό της χρωστικής (quencher). Σε κατάσταση ηρεμίας, το σήμα φθορισμού «δεσμεύεται» από τον quencher και απελευθερώνεται ως θερμότητα. Κατά τον υβριδισμό, το τμήμα με τη φθορίζουσα χρωστική και αυτό με τον quencher απομακρύνονται και εκπέμπεται φθορίζον σήμα. Το σήμα, τελικά, ανιχνεύεται από κατάλληλο μηχάνημα και επεξεργάζεται από ειδικό λογισμικό ηλεκτρονικού υπολογιστή. Ο εκπεμπόμενος φθορισμός σε συνάρτηση με το χρόνο αποδίδεται ως καμπύλη. Στην περίπτωση που το σήμα ξεπερνά καθορισμένο ουδό, το δείγμα χαρακτηρίζεται ως «θετικό» (ποιοτική ανίχνευση). Για τον ποιοτικό έλεγχο της μεθόδου χρησιμοποιείται και ένας δείκτης για το ανθρώπινο U1A housekeeping γονίδιο. Το RNA μπορεί ποσοτικά να πολλαπλασιαστεί με τη χρήση και άλλων τεχνικών όπως η RT-PCR, κατά τη οποία συντίθεται αρχικά η συμπληρωματική αλυσίδα DNA και χρησιμοποιείται αυτή στη τελικά ως εκμαγείο. Η NASBA, όμως, έχει σαν κύριο πλεονέκτημα πως λειτουργεί υπό ισοθερμικές συνθήκες και παρέχει γρηγορότερα αποτελέσματα από την PCR. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το Nucli-SENS EasyQ HPV v 1.0 kit (Biomerieux) για τον ποσοτικό προσδιορισμό των Ε6/Ε7 mrna των HPV 16, 18, 31, 33 και 45. ΜΕΘΟΔΟΣ Προεπεξεργασία δειγμάτων 1. Ανάμιξη των δειγμάτων τραχήλου σε διάλυμα PreservCyt/Thinprep. 103

104 2. Μεταφορά 5 ml από τον όγκο του δείγματος σε νέο σωληνάριο 10 ml, και φύλαξη του δείγματος που απομένει ως και 6 εβδομάδες σε θερμοκρασία 2-8 C ή έως και ένα μήνα σε θερμοκρασία <-20 C. 3. Φυγοκέντρηση του δείγματος τραχήλου σε διάλυμα PreservCyt/Thinprep για 12 λεπτά σε 1125g (2500 rpm). 4. Αφαίρεση του υπερκείμενου έως ότου απομείνει 1 ml δείγματος PreservCyt/Thinprep. 5. Επαναιώρηση των κυττάρων δείγματος στο 1 ml δείγματος PreservCyt/Thinprep που απομένει. 6. Φυγοκέντρηση του σωληναρίου NucliSENS Lysis Buffer για 10 δευτερόλεπτα στα 1500g. 7. Μεταφορά των κυττάρων μετά την επαναιώρηση στα σωληνάρια NucliSENS Lysis Buffer (2 ml/ σωληνάριο) και κλείσιμο των σωληναρίων αμέσως. 8. Ανακίνηση των σωληναρίων NucliSENS Lysis Buffer σε αναδευτήρα τύπου vortex. 9. Τα σωληνάρια δείγματος παραμένουν σε ηρεμία για τουλάχιστον 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Προχωρούμε στη διαδικασία εκχύλισης ή φύλαξη των δειγμάτων. Μαγνητική εκχύλιση NucliSENS minimag Πρόμιγμα 1. Προετοιμασία προμίγματος Προσθήκη 550 μl αραιωτικού προμίγματος σε ένα κενό σωληνάριο Προσθήκη 550 μl διαλύματος σωματιδίων πυριτίου στο αραιωτικό προμίγματος Πρόσδεση Για κάθε δείγμα: 2. Φυγοκέντρηση του προεπεξεργασμένου δείγματος για 10 δευτερόλεπτα σε 1500g, ώστε το διάλυμα να συγκεντρωθεί στον πυθμένα. Ανακίνηση του διαλύματος προμίγματος σε αναδευτήρα τύπου vortex. 104

105 3. Άνοιγμα του σωληναρίου πυθμιστικού διαλύματος λύσης (Lysis buffer) και προσθήκη 100 μl διαλύματος προμίγματος. 4. Κλείσιμο του σωληναρίου και ανάδευση προσεκτικά και για σύντομο διάστημα. 5. Αφήνουμε το διάλυμα σε ηρεμία, ώστε να αποκτήσει θερμοκρασία δωματίου, για 10 λεπτά, χωρίς ανάμιξη. Πλύση 6. Φυγοκέντρηση του σωληναρίου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης για 2 λεπτά σε 1500g 7. Αφαίρεση του υπερκείμενου από το σωληνάριο 8. Προσθήκη 400 μl ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης 1 (wash buffer 1) 9. Μεταφορά σε σωληνάριο χωρητικότητας 1,5 ml χωρίς έντονη ανακίνηση ( με απενεργοποιημένο το μαγνήτη) 10. Πλύση για 30 δευτερόλεπτα με το STEP 1 του NucliSENS minimag ( με ενεργοποιημένο το μαγνήτη) 11. Αφαίρεση όλου του υγρού ( με ενεργοποιημένο το μαγνήτη) 12. Προσθήκη 400 μl ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης 1 (wash buffer 1) ( με απενεργοποιημένο το μαγνήτη και επάληψη των βημάτων 10 και Προσθήκη 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης 2 ( με απενεργοποιημένο το μαγνήτη) και επανάληψη των βημάτων 10 και Επανάληψη του προηγούμενου βήματος. 15. Προσθήκη 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης 3 ( με απενεργοποιημένο το μαγνήτη). Πλύση για 15 δευτερόλεπτα με το STEP 1 του NucliSENS minimag ( με ενεργοποιημένο το μαγνήτη) 16. Αφαίρεση όλου του υγρού Έκλουση 17. Προσθήκη 55 μl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης και αφαίρεση των σωληναρίων από το minimag. 18. Κλείσιμο του σωληναρίου χωρίς να φυγοκεντρηθεί. 19. Επώαση για 5 λεπτά στους 60 C στο θερμικό αναδευτήρα ( ταχύτητα 1400 rpm) 20. Τοποθέτηση των σωληναρίων στο μαγνητικό στατώ 105

106 21. Μεταφορά του εκχυλίσματος νουκλεϊκών οξέων που δεν περιέχει σωματίδια πυριτίου σε νέο σωληνάριο 1,5 ml 22. Συνέχιση με τη διαδικασία ενίσχυσης ή φύλαξη του προϊόντος έκλουσης σύμφωνα με τις προδιαγραφές. Ενίσχυση και ανίχνευση 1. Προετοιμασία για νέα εκτέλεση του λογισμικού Director 2. Προσθήκη 170 μl αραιωτικού ενζύμων στα 3 λυοφιλοποιημένα ένζυμα. Ηρεμία για λεπτά, ελαφρά ανάδευση του σωληναρίου των ενζύμων με ήπιες κινήσεις και φυγοκέντρηση για 15 δευτερόλεπτα σε g. χρησιμοποιούνται εντός μίας ώρας. Προετοιμασία διαλύματος εκκινητών- ανιχνευτών- αντιδραστηρίου 3. Προσθήκη 240 μl αραιωτικού σφαιριδίων αντιδραστηρίου σε 3 λυοφιλοποιημένα σφαιρίδια αντιδραστηρίου και ανάδευση σε vortex, έως ότου το διάλυμα να γίνει διαυγές. 4. Προσθήκη 80 μl αυτού το διαλύματος σε κάθε ένα από τα τρία κενά σωληνάρια ( μωβ, μπλε, κόκκινο) 5. Προσθήκη 16 μl KCl σε 14 μl νερού NASBA και στη συνέχεια προσθήκη μίγματος εκκινητών- ανιχνευτών U1A/HPV 16 στο μωβ σωληνάριο. Προσθήκη 10 μl μίγματος εκκινητών- ανιχνευτών HPV 18/ 31 στο μπλε σωληνάριο Προσθήκη 10 μl μίγματος εκκινητών- ανιχνευτών HPV 33/ 45 στο κόκκινο σωληνάριο Ανάδευση των σωληναρίων σε vortex, για ανάμιξη των αντιδραστηρίων και χρήση εντός 30 λεπτών. Εκχυλίσματα και μάρτυρες 6. Προσθήκη 5 μl εκκχυλισμένου δείγματος σε κάθε σωληνάριο. Κάθε δείγμα προστίθεται σε 3 ξεχωριστά σωληνάρια, σύμφωνα με τη διάταξη της πλάκας. 106

107 7. Προσθήκη 5 μl υλικού αρνητικού μάρτυρα (νερό NASBA) στα προβλεπόμενα από τον κατασκευαστή πηγάδια. 8. Πραγματοποίηση ανασύσταση του θετικού μάρτυρα accu σε 200 μl νερού NASBA. Προσθήκη 195 μl νερού NASBA σε ένα σωληνάριο 1,5 ml. μεταφορά 5 μl διαλύματος θετικού μάρτυρα στο σωληνάριο, ανακίνηση σε αναδευτήρα vortex και εκτέλεση σύντομης φυγοκέντρησης, ώστε το διάλυμα να συγκεντρωθεί στον πυθμένα. Προσθήκη 5 μl υλικού θετικού μάρτυρα για το ζεύγος U1A/ HPV 16, HPV 18/ 31 και HPV 33/ 45 στα αντίστοιχα πηγάδια που προβλέπονται από τον κατασκευαστή. Προσθήκη διαλύματος εκκινητών- ανιχνευτών- αντιδραστηρίου. 9. Προσθήκη 10 μl διαλύματος εκκινητών- ανιχνευτών- αντιδραστηρίου στον πυθμένα κά8ε αντίστοιχου σωληναρίου (που περιέχει προϊόν έκλουσης ή μάρτυρα), χρησιμοποιώντας νέο ρύγχος για κάθε δείγμα. 10. Τοποθέτηση του δίσκου σωληναρίου με τις ταινίες χωρίς πώματα, στη συσκευή επώασης NucliSENS EasyQ. Κάλυψη με διάφανο κάλυμα και έναρξη του προγράμματος επώασης (2 λεπτά στους 65 C, 2 λεπτά στους 41 C). 11. Κατά τη διάρκεια της επώασης, τοποθέτηση των πωμάτων των σωληναρίων ανάποδα στη βάση ταινιών και προσθήκη 5 μl διαλύματος ενζύμου σε όλα τα πώματα σωληναρίων. 12. Μετά το δεύτερο βήμα επώασης (2 λεπτά στους 41 C) ακολουθεί κλείσιμο των ταινιών 8 σωληναρίων με τη χρήση του βοηθήματος πωματισμού. Επισήμανση κάθε ταινίας. 13. Φυγοκέντρηση δύο ταινιών 8 σωληναρίων για 2 δευτερόλεπτα στη μικροφυγόκεντρο ταινιών. 14. Ανάμιξη του περιεχομένου των ταινιών ανακινώντας τις ταινίες με vortex 3 φορές για 1 δευτερόλεπτο. 15. Φυγοκεντρήστε τις ταινίες 8 σωληναρίων για 2 δευτερόλεπτα στη μικροφυγόκεντρο ταινίων. 16. Επιστροφή των ταινιών 8 σωληναρίων στη συσκευή επώασης NucliSENS EasyQ ώστε να διατηρηθεί η θερμοκρασία στους 41 C. 17. Μεταφορά του δίσκου σωληναρίων στον προθερμασμένο αναλυτή εντός 8 λεπτών. 107

108 Εγκυρότητα της ανάλυσης 1. Επαλήθευση των αποτελεσμάτων μαρτύρων ΑΝΑΛΥΣΗΣ για το ζεύγος U1A Επαλήθευση των αποτελεσμάτων μαρτύρων ΑΝΑΛΥΣΗΣ για το ζεύγος Επαλήθευση των αποτελεσμάτων μαρτύρων ΑΝΑΛΥΣΗΣ για το ζεύγος Εάν κάποιος από τους μάρτυρες ανάλυσης είναι άκυρος, η ανάλυση θεωρείται άκυρη. Απαιτείται επανάληψη της εξέτασης. Διακοπή της ανάλυσης και μετάβαση στο βήμα (13). Εγκυρότητα των αποτελεσμάτων 5. Ανάυση των αποτελεσμάτων που αναφέρονται για κάθε στόχο ανά δείγμα 6. Εάν ανιχνευτεί ο εσωτερικός μάρτυρας δείγματος U1A (θετικός), το δείγμα είναι έγκυρο 7. Εάν δεν ανιχνευτεί ο εσωτερικός μάρτυρας δείγματος (αρνητικός), αλλά ανιχνευτούν ένας ή περισσότεροι στόχοι HPV (θετικός), το δείγμα θεωρείται έγκυρο. 8. Εάν δεν ανιχνευτεί εσωτερικός μάρτυρας δείγματος U1A (αρνητικός) και στόχοι HPV (αρνητικοί), το δείγμα είναι άκυρο. Απαιτείται επανάληψη της εξέτασης του δείγματος. 9. Εάν μία από τις 3 διπλές αντιδράσεις του δείγματος είναι άκυρη, το δείγμα είναι άκυρο. Απαιτείται επανάληψη της εξέτασης του δείγματος. Τελικά αποτελέσματα Καθορισμός του ποιοτικού αποτελέσματος HPV ανά δείγμα εφαρμόζοντας το παρακάτω διάγραμμα: 10. Εάν ανιχνευτεί ο εσωτερικός μάρτυρας δείγματος U1A (θετικός), αλλά δεν ανιχνευτεί ο στόχος HPV (αρνητικός), τότε το αποτέλεσμα είναι αρνητικό για όλους τους στόχους HPV που υποβάλλονται σε εξέταση για το δείγμα. 11. Εάν ανιχνευτεί ο εσωτερικός μάρτυρας U1A (θετικός), καθώς και ένας ή περισσότεροι στόχοι HPV (θετικός), τότε το αποτέλεσμα για τους στόχους 108

109 HPV που ανιχνεύονται είναι θετικό και για όλους τους υπόλοιπους στόχους που υποβάλλονται σε εξέταση αρνητικό. 12. Εάν δεν ανιχνευτεί εσωτερικός μάρτυρας δείγματος U1A (αρνητικός), αλλά ανιχνευτούν ένας ή περισσότεροι στόχοι HPV (θετικός), τότε το αποτέλεσμα για το στόχο HPV που ανιχνεύεται είναι θετικό και για όλους τους υπόλοιπους στόχους αρνητικό. Ωστόσο, λόγω της μη ανίχνευσης του μάρτυρα δείγματος, δεν μπορεί να αποκλειστεί το ενδεχόμενο ύπαρξης HPV στόχων στο δείγμα, οι οποίοι δεν έχουν ανιχνευτεί. 13. Συγκέντρωση των τελικών αποτελεσμάτων, σημείωση των παρατηρήσεων και διαχείριση των δειγμάτων που πρέπει να υποβληθούν σε εκ νέου εξέταση ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η συλλογή και η αποθήκευση των αποτελεσμάτων έγινε στο Εργαστήριο Διαγνωστικής Κυτταρολογίας σε βάση δεδομένων Microsoft Access 2007, (Microsoft, Η.Π.Α.). Έγινε κωδικοποίηση των συμμετεχόντων στη μελέτη, ούτως ώστε να διαφυλάσσεται πλήρως η ανωνυμία. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με το πρόγραμμα SPSS

110 110

111 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 111

112 112

113 3.1. ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΕΡΕΥΝΑΣ Στη μελέτη επιχειρήθηκε ο συσχετισμός της παρουσίας υποτύπων του ιού HPV, σε όλων των σταδίων αλλοιώσεις του επιθηλίου του τραχήλου της μήτρας, με τα επίπεδα mrna των ανοικτών αναγνωστικών πλαισίων Ε6,Ε7 των ογκογόνων τύπων του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων, αποσκοπώντας στην διερεύνηση της μορφής στην οποία βρίσκονται οι αντίστοιχοι υπότυποι, επισωματική ή ενσωματωμένη και ο πιθανός ρόλος της αναγνώρισής τους στο σχεδιασμό συγχρόνων προγραμμάτων πληθυσμιακού ελέγχου. Το υλικό της μελέτης αποτελέσαν τα Pap-test 2530 γυναικών που έχουν ενταχθεί στο ερευνητικό έργο με τίτλο «Αυτοματοποιημένη Κυτταρολογική Ανίχνευση Κακοήθειας και η Οικονομοτεχνική Σημασία της» (ΑΚΑΚΟΣ) στα πλαίσια του προγράμματος ΠΕΠ Aττικής , μέτρο 1.2. Ειδικότερα από το υλικό του φιαλιδίου συλλογής του ThinPrep Pap-test ελήφθησαν 10ml υγρού προκειμένου να εκτελεσθούν οι επόμενες τεχνικές μοριακής κυτταρολογίας. α) Για την ανίχνευση και τυποποίηση του ΗPV: Απομόνωση DNA από αρχικό υλικό κυτταρολογίας υγρής φάσης, πολλαπλασιασμός τμήματος των υπό διερεύνηση γονιδίων του ιού με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και ανίχνευση με τεχνική DNA μικροσυστοιχιών. β) Για την ενσωμάτωση του HPV στο γονιδίωμα του ξενιστή: Απομόνωση mrna από αρχικό υλικό κυτταρολογίας υγρής φάσης, πολλαπλασιασμός τμήματος των ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης Ε6 και Ε7 του ιού και ποσοτικοποίηση τους με τεχνική αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου και αξιολόγηση με τεχνική NASBA και κυτταρομετρίας ροής. Βάσει πρωτοκόλλου, οι συμμετέχουσες αρχικά υποβλήθηκαν σε κυτταρολογική εξέταση με τεστ Παπανικολάου. Η λήψη του επιχρίσματος γινόταν υπό άμεση επισκόπηση του τραχήλου με τη χρήση κολποσκοπίου σε κάθε περίπτωση και σημειωνόταν η παρουσία ορατής παθολογίας στον τράχηλο της συμμετέχουσας ως κλινική πληροφορία. Με την ολοκλήρωση των εξετάσεων, οι γυναίκες εάν είχαν: 1. Στοιχεία παθολογίας τραχήλου από την πρώτη επισκόπηση κατά τη λήψη του επιχρίσματος: παραπομπή για κολποσκόπηση 2. Τεστ Παπανικολάου ASCUS+ : παραπομπή για κολποσκόπηση 113

114 3. DNA typing με ARRAYS θετικό για ιούς υψηλού κινδύνου: παραπομπή για κολποσκόπηση 4. NASBA θετικό: παραπομπή για κολποσκόπηση 5. FLOW CYTOMETRY θετικό: παραπομπή για κολποσκόπηση Στην κολποσκοπική εξέταση ελήφθησαν κολποσκοπικά κατευθυνόμενες βιοψίες εάν: 1. Υπήρχε ορατή αλλοίωση 2. Τυχαίες βιοψίες επί διάγνωσης ASCUS+ ακόμα και χωρίς ορατή αλλοίωση 3. Επί θετικού αποτελέσματος οποιασδήποτε από τις μοριακές τεχνικές. Ως κλινικές αρνητικά ορίστηκαν οι περιπτώσεις με φυσιολογικό τεστ Παπανικολάου και αρνητικές μοριακές τεχνικές. Η παρούσα έρευνα σχεδιάστηκε ως πραγματικού τύπου μελέτη κοορτής και τα αποτελέσματα της μοριακής διερεύνησης συσχετίσθηκαν με τα αποτελέσματα της κυτταρολογικής διάγνωσης, της ιστολογικής εξέτασης και τα στοιχεία του ατομικού αναμνηστικού των γυναικών. Αναμενόμενα οφέλη: Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης πιθανόν να οδηγήσουν 1. σε καλύτερη κατανόηση των σχετιζόμενων με τον HPV μηχανισμών καρκινογένεσης στον τράχηλο της μήτρας. 2. στη δημιουργία επιδημιολογικού χάρτη της HPV λοίμωξης 3. στη δημιουργία μοντέλου πρόβλεψης επιτυχίας του εμβολιασμού έναντι HPV Τα αναμενόμενα οφέλη 1. σχετίζονται με την ορθολογικότερη αντιμετώπιση των γυναικών με HPV μόλυνση, επειδή οι μέθοδοι διερεύνησης που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας, σε συνδυασμό με τις ήδη υπάρχουσες τεχνικές, μπορούν να οδηγήσουν σε ουσιαστικότερο δευτερογενή προληπτικό έλεγχο (διαλογή περιστατικών) και ορθολογικότερη θεραπευτική αντιμετώπιση των αλλοιώσεων του τραχήλου της μήτρας 2. Σε αξιόπιστο σχεδιασμό πρωτογενούς πρόληψης που θα βασίζεται σε πραγματικά επιδημιολογικά δεδομένα στον Ελληνικό χώρο. 114

115 3.2. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ ΕΡΕΥΝΑΣ Το υλικό της μελέτης αποτελέσαν τα Pap-test 2530 γυναικών που έχουν ενταχθεί στο ερευνητικό έργο με τίτλο «Αυτοματοποιημένη Κυτταρολογική Ανίχνευση Κακοήθειας και η Οικονομοτεχνική Σημασία της» (ΑΚΑΚΟΣ) στα πλαίσια του προγράμματος ΠΕΠ Aττικής , μέτρο 1.2. Ο πληθυσμός της έρευνας αποτελείτο από γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας ετών, προερχόμενες από τη Δυτική Αθήνα, καλύπτοντας ουσιαστικά το 0,1% του γυναικείου πληθυσμού της πρωτεύουσας. Από τη μελέτη εξαιρέθηκαν γυναίκες έγκυες, λεχωΐδες ή γυναίκες με τοκετό προ διαστήματος μικρότερο του έτους, περιπτώσεις γυναικών με γνωστό ιστορικό αλλοιώσεων του τραχήλου της μήτρας και περιπτώσεις υπό θεραπεία. Ο πληθυσμός έρευνας συστάθηκε από γυναίκες που δεν υποβάλλονταν σε τακτικό έλεγχο με τεστ Παπανικολάου, και παράλληλα με την έρευνα, έγινε και προσπάθεια ευαισθητοποίησης και ένταξης σε τακτικό έλεγχο, που δυστυχώς, μετά το πέρας της μελέτης, για κάποιο διάστημα, θα βασίζεται αποκλειστικά στην ιδία κινητοποίηση των γυναικών. Οι συμμετέχουσες έδωσαν προφορική συγκατάθεση συμμετοχής στη μελέτη, κατόπιν ενημέρωσης τους και διασφάλισης της ανωνυμίας τους. Δεν εφαρμόστηκαν άλλου τύπου κριτήρια ένταξης ή αποκλεισμού από τη μελέτη, σημειώθηκαν όμως τα δημογραφικά στοιχεία, τα οποία αφορούσαν και την προέλευση, εθνικότητα, βιοτικό επίπεδο, μορφωτικό επίπεδο και σεξουαλικές συνήθειες, προκειμένου να μελετηθούν στο μέλλον για εξαγωγή επιστημονικών συμπερασμάτων. Βάσει πρωτοκόλλου, οι συμμετέχουσες αρχικά υποβλήθηκαν σε κυτταρολογική εξέταση με τεστ Παπανικολάου. Η λήψη του επιχρίσματος γινόταν υπό άμεση επισκόπηση του τραχήλου με τη χρήση κολποσκοπίου σε κάθε περίπτωση και σημειωνόταν η παρουσία πιθανής ορατής παθολογίας στον τράχηλο της συμμετέχουσας ως κλινική πληροφορία. Οι βιοψίες τραχήλου μήτρας υποσημαίνονταν ξεχωριστά, σε κάθε περίπτωση κατά την οποία κρίθηκε απαραίτητη η λήψη τους, και οι συμμετέχουσες ενημερώνονταν για τα αποτελέσματα των εξετάσεων γραπτώς. 115

116 3.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κατά τη διεξαγωγή της έρευνας, εξετάστηκαν 2530 επιχρίσματα τραχήλου μήτρας με χρώση κατά Παπανικολάου με τη μέθοδο της κυτταρολογίας υγρής φάσης. Το σύνολο των δειγμάτων υποβλήθηκαν στις μοριακές τεχνικές της μελέτης (έλεγχος DNA και RNA). Στα πλαίσια της περιγραφής των αποτελεσμάτων παρατηρήθηκε ότι στο δεδομένο υπό εξέταση πληθυσμό, το 52,2% των επιχρισμάτων ήταν παθολογικά (ASCUS + κυτταρολογικές αλλοιώσεις). Επί συνόλου κυτταρολογικών διαγνώσεων, 26% αφορούσε σε LSIL περιπτώσεις και μόλις 18,6% σε ASCUS. Χαρακτηριστικό του πληθυσμού, ο οποίος δεν υποβάλλεται σε τακτικές εξετάσεις είναι το αθροιστικό 1,1% των καρκινωμάτων πλακώδους και αδενικού επιθηλίου, καθιστώντας τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας μείζον πρόβλημα στη δεδομένη περιοχή. Στη συγκριτική μελέτη και ανάλυση των αποτελεσμάτων του τεστ Παπανικολάου και της ιστολογικής διάγνωσης από τις κατευθυνόμενες βιοψίες που ελήφθησαν προέκυψαν ενδιαφέροντα στοιχεία. Το 48% των βιοπτικών δειγμάτων ήταν αρνητικά και το 45% με ήπιες αλλοιώσεις. Γενικά, το 7,3% ήταν CIN 2+ και υπήρξε συνάφεια ως προς το ποσοστό της διάγνωσης καρκινωμάτων. Δεδομένου ότι η τάση πλέον στην ιστολογική διάγνωση είναι η χρήση του LSIL και HSIL αντικαθιστώντας την κατάταξη CIN, παρατηρείται ότι το αθροιστικό ποσοστό CIN 2 και CIN 3 (6,2%) δε διαφέρει από το 6% της κυτταρολογικής διάγνωσης HSIL (6%). Η μέθοδος DNA που ανιχνεύει τη L1 πρωτεΐνη του ιού, η οποία χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, εντόπισε μεταξύ των δειγμάτων 53,2% θετικά ως προς την παρουσία τουλάχιστον ενός από τους 35 τύπους του HPV που εξετάζονται με τη συγκεκριμένη τεχνική, υψηλού ή χαμηλού κινδύνου. Έτσι καθορίστηκε η επίπτωση του ιού, στο δεδομένο δείγμα πληθυσμού. Ειδικότερα για τους υψηλού κινδύνου τύπους του ιού, ανιχνεύτηκαν σε ποσοστό 47,2% του πληθυσμού, είτε ως μονήρεις, είτε ως μολύνσεις από πολλούς τύπους ταυτοχρόνως. Η παρουσία αποκλειστικά τύπων χαμηλού κινδύνου HPV, αφορούσε το 6% του ελεγχόμενου πληθυσμού, διαφέροντας σημαντικά από το ποσοστό προσβολής από τύπους υψηλού κινδύνου. Μεταξύ των 35 τύπων που 116

117 ανιχνεύονται με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε στο υπό εξέταση δείγμα υπεροχή των τύπων 16, 18, 51 και 53, με φθίνουσα σειρά, και του 89, ο οποίος κατατάσσεται στους τύπους χαμηλού κινδύνου για την ανάπτυξη κακοήθειας. Αναφορικά με τη σύγκριση των δειγμάτων που υποβλήθηκαν σε τυποποίηση του DNA HPV και με την τελική ιστολογική διάγνωση του βιοπτικού υλικού, σε επίπεδο αρνητικής ιστολογικής διάγνωσης τα θετικά και τα αρνητικά δείγματα ήταν περίπου ισομοιρασμένα (45,8% και 54,2% αντίστοιχα). Το ποσοστό θετικότητας αυξάνεται με τη βαρύτητα της αλλοίωσης και για CIN 2 αλλοιώσεις είναι 90,1%, για CIN 3 91,6%, αλλά για τα καρκινώματα 88,9%. Η εφαρμογή των μεθόδων ανίχνευσης του RNA του HPV έδειξε ότι, σε επίπεδο NASBA, το 16,3% των δειγμάτων ανιχνεύτηκαν θετικά για την ενεργοποίηση τουλάχιστον ενός εκ των πέντε τύπων, τους οποίους εντοπίζει η μέθοδος. Παρατηρήθηκε, υπεροχή της ενεργοποίησης του τύπου 16 ακολουθούμενο από τον τύπο 31, και των μονήρων έναντι των πολλαπλών τύπου λοιμώξεων. Επιπλέον, συγκρίνοντας τα περιστατικά με την τελική ιστολογική διάγνωση, φαίνεται ότι μεταξύ των αρνητικών περιστατικών, η συντριπτική πλειοψηφία ήταν αρνητικά και στη μέθοδο NASBA (92,2%), γεγονός που παρατηρήθηκε και στις ήπιες αλλοιώσεις CIN 1. Τα θετικά αποτελέσματα αυξάνονταν αναλογικά με τη βαρύτητα της αλλοίωσης μέχρι το επίπεδο του CIN 3 και παρατηρήθηκε μία πτώση στα καρκινώματα (66,7%). Στη σχέση θετικών προς αρνητικά δείγματα φαίνεται ότι για CIN 2 η σχέση είναι 2:1, για CIN 3 είναι 5:1 και για τα καρκινώματα 3:1. Ως προς το FLOW CYTOMETRY, θετικό για την παρουσία HPV χαρακτηρίστηκε το 23,3% των δειγμάτων. Συγκριτικά με την ιστολογική διάγνωση των δειγμάτων, τα οποία είχαν ήδη υποβληθεί στη μοριακή τεχνική της κυτταρομετρίας ροής, και για τα οποία η διάγνωση ήταν αρνητική, το 83,1% ήταν αρνητικά και στη μοριακή μέθοδο. Το υψηλό ποσοστό αρνητικών δειγμάτων αφορούσε και την περίπτωση των ήπιων ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων (74,2%), ενώ, αντίστροφα, η θετικότητα αυξανόταν αναλογικά με τη βαρύτητα της αλλοίωσης μέχρι του επιπέδου του CIN 3 (75%), ακολουθούμενο από μία ήπια πτώση του ποσοστού στα καρκινώματα (66,7%). Γενικά, το υψηλότερο ποσοστό παρατηρήθηκε συνολικά στις CIN 3+ αλλοιώσεις 72,9%. 117

118 Επί του συνόλου των δειγμάτων, από τα οποία χρησιμοποιήθηκε σαν τελική συγκριτική διαγνωστική μέθοδος η ιστολογική διάγνωση της βιοψίας, είτε κρίθηκαν σαν κλινικά αρνητικά, το 53,7% διαγνώστηκε τελικά με κάποιας μορφής παθολογία, από ήπια μέχρι σοβαρή. Η συντριπτική πλειοψηφία αφορούσε μεν χαμηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις CIN 1, παρολαυτά το αξιοσημείωτο ήταν πως το ποσοστό των ιστολογικά επιβεβαιωμένο ποσοστό των καρκινωμάτων πλακώδους και αδενικού επιθηλίου ανήλθε στο 1.1%. Ειδικότερα οι βλάβες CIN 2 + αφορούσαν το 7,2% των δειγμάτων, ενώ CIN 3+ το 4,2%. Κατά τη μελέτη των αποτελεσμάτων, σημαντικά στοιχεία εξήχθησαν όσον αφορά τις περιπτώσεις κατά τις οποίες υπήρχε διαφωνία μεταξύ των μεθόδων που εφαρμόστηκαν. Συγκεκριμένα, μεταξύ των αρνητικών κυτταρολογικών διαγνώσεων για ύπαρξη αλλοιώσεων ή κακοήθεια, υποκρύπτονταν τρεις περιπτώσεις CIN 2 και τέσσερεις περιπτώσεις CIN 3. Σε μια περίπτωση CIN 2 και σε μια CIN 3, όλες οι μοριακές μέθοδοι ήταν αρνητικές σε επίπεδο τόσο DNA, όσο και RNA και τελικά ελήφθησαν βιοψίες κατά τη διάρκεια της κολποσκόπησης, λόγω υπόνοιας του κολποσκόπου, χωρίς να μπορεί να καθορίσει συγκεκριμένες περιοχές με ορατές βλάβες. Σε μία ακόμα περίπτωση CIN 2 με φυσιολογικό τεστ Παπανικολάου και θετική τυποποίηση του ιού, οι μεθοδοι ανίχνευσης του RNA ήταν αρνητικές. Μεταξύ των περιπτώσεων ASCUS κυτταρολογικής διάγνωσης του επιχρίσματος, δύο περιπτώσεις που ταυτοποιήθηκαν ως CIN 3 είχαν όλες τις μοριακές μεθόδους αρνητικές. Αντίθετα, σε δύο περιπτώσεις CIN 3 και μία αδενοκαρκινώματος, οι μοριακές μέθοδοι, στο σύνολό τους, ήταν θετικές. Σε επίπεδο LSIL κυτταρολογικής διάγνωσης, υποκρύπτονταν τέσσερεις περιπτώσεων CIN 3, εκ των οποίων η μία με DNA τυποποίηση θετική για την ύπαρξη υψηλού κινδύνου στελέχους ιού και αρνητικές τις υπόλοιπες μοριακές τεχνικές. Αξιοσημείωτη, δε, είναι και η παρουσία ενός αδενοκαρκινώματος, στο οποίο μόνο η μέθοδος NASBA ήταν αρνητική. Στις ASC-H κυτταρολογικές διαγνώσεις, υποκρύπτονταν ένα περιστατικό CIN 2 με αρνητικές όλες τις μοριακές μεθόδους και ένα ακόμα περιστατικό καρκινώματος εκ πλακωδών κυττάρων με μόνο την κυτταρομετρία ροής θετική και τις υπόλοιπες μοριακές τεχνικές αρνητικές. Ως προς τις περιπτώσεις HSIL κυτταρολογικών διαγνώσεων, παρουσιάστηκαν μεταξύ των περιστατικών του δείγματος και δύο, στα οποία μεν 118

119 οι μοριακές τεχνικές ήταν στο σύνολό τους αρνητικές, παρολαυτά η ιστολογική εξέταση των βιοψιών αποκάλυψε CIN 2. Γενικά, τα τρία περιστατικά CIN 3, τα οποία ταυτοποιήθηκαν ιστολογικά, αν και είχαν αρνητική DNA τυποποίηση, είχαν θετικές μοριακές τεχνικές ανίχνευσης mrna, και στη ουσία δεν διέφυγε περίπτωση CIN 3 και πλέον αλλόιωσης. Αξιοσημείωτη, επιπλέον, είναι η περίπτωση με ανίχνευση ιού χαμηλού κινδύνου και αρνητική τόσο τη NASBA όσο και την κυτταρομετρία ροής, στην οποία διαγνώστηκε ιστολογικά CIN 2 αλλοίωση. Στο σύνολο των HSIL κυτταρολογικών διαγνώσεων διεγνώσθησαν ιστολογικά εφτά περιπτώσεις καρκινωμάτων εκ πλακωδών κυττάρων. Το σημαντικό είναι ότι στις δύο εξ αυτών των περιπτώσεων οι μοριακές τεχνικές ανίχνευσης mrna, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη ήταν αρνητικές, και μόνο η DNA τυποποίηση ιού υψηλού κινδύνου ήταν θετική. Μεταξύ των υπολοίπων περιπτώσεων, η κυτταρομετρία ροής δεν προσέφερε διαγνωστική βοήθεια στις τέσσερεις από αυτές. Μεταξύ των 25 καρκινωμάτων που εντοπίστηκαν κατά την εξέταση του τεστ Παπανικολάου, τα 9 ήταν αρνητικά ιστολογικά, ενώ αντίστροφα, εντοπίστηκαν επιπλέον 11 που υπκρύπτονταν σε άλλου τύπου κυτταρολογικές διαγνώσεις. Το σύνολο των περιστατικών αυτών επανεξετάστηκε από το Εργαστήριο Διαγνωστικής Κυτταρολογίας και από το Β Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημίου Αθηνών σε συνεργασία και επαναξιολογήθηκαν οι μοριακές τεχνικές που εφαρμόστηκαν στα δείγματα. Μία περίπτωση καρκινώματος εκ πλακωδών κυττάρων εντοπίστηκε στον πληθυσμό έρευνας, η οποία πέραν της κυτταρολογικής, δε διέθετε καμία άλλη ένδειξη σε μοριακό επίπεδο, από τις τεχνικές της μελέτης. Σε μία ακόμα περίπτωση το ενδιαφέρον εστιάστηκε στην παρουσία ιού χαμηλού κινδύνου και αρνητικής NASBA, με θετική την κυτταρομετρία ροής. Αν και η κυτταρολογική και η ιστολογική διάγνωση συνέπιπταν σε μία περίπτωση αδενοκαρκινώματος με θετική την παρουσία DNA ιού υψηλού κινδύνου και θετική την κυτταρομετρία ροής, παρολαυτά η NASBA ήταν αρνητική ως τεχνική ελέγχου ενεργοποίησης έστω ενός εκ των πέντε συχνότερων ιών υψηλού κινδύνου που μελετά. Η στατιστική ανάλυση επί των αποτελεσμάτων και η σύγκριση μεταξύ κυτταρολογικής διάγνωσης των επιχρισμάτων του τραχήλου και του βιοπτικού υλικού, με δεδομένο ότι το τεστ Παπανικολάου αποτελεί ως επί το πλείστον 119

120 παγκόσμια τη μοναδική εξέταση πληθυσμιακού ελέγχου αποτέλεσε σημαντικό στοιχείο της παρούσας έρευνας. Ο στατιστικός συσχετισμός μεταξύ της κυτταρολογικής διάγνωσης ASCUS + και της ιστολογικής CIN 2 έδειξε ότι τόσο η ευαισθησία της μεθόδου (τεστ Παπ) είναι πολύ μεγάλη, της τάξης του 0,962 όσο και η αρνητική προγνωστική αξία (0,994). Η ειδικότητα (0,514) όμως και η θετική προγνωστική αξία είναι αρκετά μικρές (0,135). Η συνολική ακρίβεια της μεθόδου υπολογίζεται στο 0,547 και ο σχετικός κίνδυνος να υποκρύπτεται αλλοίωση CIN 2 και πλέον είναι 23,02. Η αναφορά του συγκεκριμένου ουδού (ASCUS + ) αποτελεί σημαντικό ζήτημα αφενός λόγω του ότι υποδηλώνει το σύνολο των παθολογικών κυτταρολογικών διαγνώσεων και, αφετέρου, γιατί αποτελεί μία εκ των παραμέτρων αξιολόγησης ενός Εργαστηρίου Διαγνωστικής Κυτταρολογίας. Η μεταβολή του ουδού σε LSIL + και επιπλέον σε HSIL +, αυξάνει σημαντικά την ειδικότητα μειώνοντας την ευαισθησία της μεθόδου, αλλά χωρίς σημαντική μεταβολή της αρνητικής προγνωστικής αξίας. Η συνολική ακρίβεια της μεθόδου αυξάνεται σημαντικά και ο σχετικός κίνδυνος μειώνεται μεν για το LSIL + (13,77), αυξάνεται δε σημαντικά για το HSIL + (30,24). Η τυποποίηση του HPV DNA έδειξε πως με ουδό το CIN 2 + η ευαισθησία και η αρνητική προγνωστική αξία της μεθόδου είναι πολύ υψηλές (0,901 και 0,985 αντίστοιχα), αλλά η ειδικότητα και η θετική προγνωστική αξία ήταν χαμηλές (0,499 και 0,074 αντίστοιχα). Η συνολική ακρίβεια της μεθόδου ήταν 0,528 και ο σχετικός κίνδυνος ύπαρξης CIN 2 + επί θετικού αποτελέσματος κυμαίνεται σε χαμηλά επίπεδα (8,07). Η τοποθέτηση του ουδού στο CIN 3 + βελτιώνει την ευαισθησία εις βάρος της ειδικότητας, αλλά όχι σημαντικά και το ίδιο παρατηρείται και για τις υπόλοιπες στατιστικές παραμέτρους. Ως προς την τεχνική NASBA με την οποία ανιχνεύεται η ενεργότητα της HPV λοίμωξης, η ευαισθησία μεν της μεθόδου είναι μικρότερη από τις προηγούμενες τεχνικές και για τους δύο ουδούς CIN 2+ και CIN 3+, (0,731 και 0,794 αντίστοιχα), αλλά τόσο η ειδικότητα, όσο και οι αρνητική αλλά και η θετική προγνωστική αξία είναι σε πολύ υψηλά επίπεδα. Η συνολική ακρίβεια της μεθόδου είναι εξαιρετικά υψηλή (0,871 και 0,863 για τους αντίστοιχους ουδούς) και ο σχετικός κίνδυνος, μικρότερος μεν από του τεστ Παπ, αλλά παρολαυτά σε υψηλά επίπεδα (13,97 και 19,89 για CIN 2 + και CIN 3+ αντίστοιχα). Η τεχνική της κυτταρομετρίας ροής παρουσίασε ήπια ευαισθησία ως διαγνωστική μέθοδος με ουδό το CIN 2 + (0,648), σημαντικά καλύτερη όμως με 120

121 ουδό το CIN 3 + (0,729). Η ειδικότητα, δε της μεθόδου ήταν αξιοσημείωτη (0,799 και 0,789 αντίστοιχα). Αν και η θετική προγνωστική αξία της μεθόδου ήταν σχετικά χαμηλή (0,203 και 0,134 αντίστοιχα), παρολαυτά η αρνητική προγνωστική αξία κυμάνθηκε σε ικανοποιητικά επίπεδα (0,967 και 0,985 αντίστοιχα). Η συνολική ακρίβεια της μεθόδου ήταν καλή (0,788 και 0,786 αντίστοιχα) με χαμηλό, όμως σχετικό κίνδυνο να υποκρύπτεται νόσος CIN 2 + (6,06), αλλά υψηλότερο για νόσο CIN 3 + (8,85). Αναλύοντας τις στατικές παραμέτρους της καμπύλης ROC, που χρησιμοποιήθηκε για τη συγκριτική ανάλυση των εξετάσεων και των διαγνωστικών μεθόδων του συγκεκριμένου πρωτοκόλλου, η «περιοχή υπό την καμπύλη» (area under curve) αντιπροσωπεύει την πιθανότητα ένα τυχαία επιλεγμένο δείγμα να χαρακτηριστεί σωστά ως παθολογικό ή θετικό, αναλόγως της εξέτασης, από ένα τυχαία επιλεγμένο δείγμα, το οποίο θα χαρακτηριστεί φυσιολογικό ή αρνητικό. Εκφράζει, δηλαδή, σε επίπεδο διαγνωστικής μεθόδου, το επίπεδο ορθής διάγνωσης του παθολογικού. Στόχος για κάθε προτεινόμενη διαγνωστική μέθοδο και εξέταση είναι η περιοχή υπό την καμπύλη να απομακρύνεται κατά το δυνατό περισσότερο από το 0,5 και να βρίσκεται, όσο το δυνατόν, πλησιέστερα στο ιδανικό 1,0. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων των εξετάσεων έδειξε ότι ορίζοντας σαν ουδό σύγκρισης την ιστολογική διάγνωση CIN 2+, και τα όρια εμπιστοσύνης στο 95%, η NASBA ως μέθοδος υπερείχε κάθε άλλης διαγνωστικής μεθόδου (0,807), ακολουθούμενη από την κυτταρολογική διάγνωση του τεστ Παπανικολάου (0,737), την κυτταρομετρία ροής (0,724) και τέλος την τυποποίηση του HPV (0,722), με φθίνουσα, βέβαια, σειρά. 121

122 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ N ARRAYS Τεστ Παπ ARRAYS ARRAYS ΑΡΝΗΤΙΚΑ- ΘΕΤΙΚΑ HIGH RISK- LOW RISK Έγκυρα δείγματα Απώλειες Πίνακας 1: Αριθμός δειγμάτων τεστ Παπ και τυποποίησης HPV DNA με microarrays NASBA NASBA ΑΡΝΗΤΙΚΑ- ΘΕΤΙΚΑ NASBA ΑΝΑ ΤΥΠΟ N Έγκυρα δείγματα Απώλειες Πίνακας 2: Αριθμός δειγμάτων NASBA N Έγκυρα δείγματα FLOW Flow result for CYTOMETRY processing GOLD STANDARD Απώλειες Πίνακας 3: Αριθμός δειγμάτων κυτταρομετρίας ροής 122

123 Τεστ Παπανικολάου Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent Αρνητικά Παθολογικά Σύνολο Απώλειες 3.1 Γενικό σύνολο Πίνακας 4: Αριθμός δειγμάτων τεστ Παπ ως αρνητικών παθολογικών διαγνώσεων γενικά Τεστ Παπανικολάου Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent WNL ASCUS LGSIL ASC-H HG-SIL SCC AGUS ADENOCARC Σύνολο Απώλειες 3.1 Γενικό σύνολο Πίνακας 5: κυτταρολογικές διαγνώσεις τεστ Παπ και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 123

124 HPV DNA Arrays Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent Αρνητικά Θετικά Σύνολο Απώλειες 2.1 Γενικό σύνολο Πίνακας 5: θετικά (ανεξαρτήτως τύπου) και αρνητικά δείγματα τυποποίησης του HPV DNA και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας HPV DNA Arrays Cumulative Frequency Percent Valid Percent Percent Αρνητικά Χαμηλού κινδύνου Υψηλού κινδύνου Total Απώλειες 2.1 Γενικό σύνολο Πίνακας 6: θετικά (χαμηλού και υψηλού κινδύνου) και αρνητικά δείγματα τυποποίησης του HPV DNA και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 124

125 NASBA Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent Αρνητικά Θετικό (για κάθε τύπο) Σύνολο Απώλειες 2.1 Γενικό σύνολο Πίνακας 7: θετικά (ανεξαρτήτως τύπου) και αρνητικά δείγματα NASBA και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας Κυτταρομετρία ροής Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent Αρνητικά Θετικά Σύνολο Απώλειες 2.1 Γενικό σύνολο Πίνακας 8: θετικά και αρνητικά δείγματα κυτταρομετρίας ροής και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας Ιστολογική Διάγνωση Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent ΑΡΝΗΤΙΚΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΑ Σύνολο Απώλειες Γενικό σύνολο Πίνακας 9: ιστολογικώς θετικά (ανεξαρτήτως διάγνωσης) και αρνητικά δείγματα βιοπτικού υλικού και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 125

126 Ιστολογική Διάγνωση Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent Ανεπαρκή Αρνητικά CIN 1 / LGSIL CIN CIN3 / HGSIL SCC ADENO-CA Σύνολο Απώλειες 7.3 Γενικό σύνολο Πίνακας 10: ιστολογικές διαγνώσεις βιοπτικού υλικού από κολποσκοπικά κατευθυνόμενες βιοψίες από τον τράχηλο της μήτρας και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας Ιστολογική διάγνωση CIN 2+ Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent < CIN CIN Σύνολο Απώλειες 7.3 Γενικό σύνολο Πίνακας 11: ιστολογικές διαγνώσεις CIN 2 + και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 126

127 Iστολογική διάγνωση CIN 3+ Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent < CIN CIN Σύνολο Απώλειες 7.3 Γενικό σύνολο Πίνακας 12: ιστολογικές διαγνώσεις CIN 3 + και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 127

128 CYTOLOGY ARRAYS NEG ARRAYS LOW ARRAYS HIGH NASBA NEG NASBA 16 NASBA 18 NASBA 31 NASBA 33 NASBA 45 FLOW POS GOLD STANDARD FLOW NEG CIN 2 CIN 3 SCC ADENOCA TOTAL NILM ASCUS LGSIL ASC-H HGSIL SCC ADENOCA TOTAL Πίνακας 13: Ανάλυση περιπτώσεων με διαφωνίες ως προς τις διαγνωστικές μεθόδους 128

129 Ποσοστό ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ Τεστ Παπανικολάου Αρνητικά Παθολογικά Σχήμα 1: τεστ Παπανικολάου αρνητικά και παθολογικά ανεξαρτήτως κυτταρολογικής διάγνωσης και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 129

130 Ποσοστό Τεστ Παπανικολάου Σχήμα 2: τεστ Παπανικολάου ανά κυτταρολογική διάγνωση και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 130

131 Ποσοστό MICROARRAYS Θετικά Αρνητικά Σχήμα 3: Αποτελέσματα τυποποίησης δειγμάτων HPV DNA: αρνητικά και παθολογικά ανεξαρτήτως τύπου του ιού και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 131

132 Ποσοστό MICROARRAYS Σχήμα 4: Αποτελέσματα τυποποίησης δειγμάτων HPV DNA: αρνητικά και παθολογικά υψηλού και χαμηλού κινδύνου τύποι του ιού και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας Αρνητικά Χαμηλού Υψηλού Κινδύνου ιοί Κινδύνου ιοί 132

133 Ποσοστό MICROARRAYS Σχήμα 5: Αποτελέσματα τυποποίησης δειγμάτων HPV DNA ανά τύπους του ιού και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 133

134 Ποσοστό NASBA Αρνητικά Θετικό για κάθε τύπο Σχήμα 6: Αποτελέσματα NASBA: αρνητικά και παθολογικά ανεξαρτήτως τύπου του ιού και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 134

135 Ποσοστό NASBA αρνητικα Σχήμα 7: Αποτελέσματα NASBA: αρνητικά και παθολογικά ανά τύπο του ιού και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 135

136 Ποσοστό NASBA Σχήμα 8: Αποτελέσματα NASBA: αρνητικά και παθολογικά ανά τύπους του ιού (και συλλοιμώξεις) και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 136

137 Ποσοστό FLOW CYTOMETRY Αρνητικά Θετικά Σχήμα 9: Αποτελέσματα κυτταρομετρίας ροής: αρνητικά και παθολογικά και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 137

138 Ποσοσστό ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ Αρνητικά Παθολογικά Σχήμα 10: Ιστολογικές διαγνώσεις: αρνητικά και παθολογικά (ανεξαρτήτως διάγνωσης) και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 138

139 Ποσοστό ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ Ανεπαρκή Αρνητικά CIN 1 / LGSIL CIN 2 CIN 3 / HGSIL SCC ADENO CA Σχήμα 11: Ιστολογικές διαγνώσεις και ποσοστιαία κατανομή στον πληθυσμό της έρευνας 139

140 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η σύγκριση των μοριακών μεθόδων στατιστικά έγινε χρησιμοποιώντας σαν ουδό την ιστολογική διάγνωση CIN 2+ και στη συνέχεια CIN 3+. ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΑ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΡΝΗΤΙΚΑ CIN 1 CIN 2 CIN 3 Ca Total % ΑΡΝΗΤΙΚΑ % ASCUS % LGSIL % ASCH % HSIL % Ca % ΣΥΝΟΛΟ % % 60,1% 32,6% 3,0% 3,2% 1,1% 100,0% CIN1+ CIN2+ CIN3+ Ca ,9% 7,3% 4,3% 1,1% Πίνακας 14: Ανάλυση κυτταρολογικών διαγνώσεων του τεστ Παπανικολάου σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΑ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ 95,00% ASCUS+/CIN2 LSIL+/CIN2 HSIL+ / CIN2 PV 0,073 0,073 0,073 Sensitivity 0,962 0,874 0,698 Specificity 0,514 0,708 0,978 P PV 0,135 0,191 0,718 N PV 0,994 0,986 0,976 OA 0,547 0,720 0,958 Odds Ratio 26,446 16, ,509 Relative Risk 23,02 13,77 30,24 Πίνακας 15: Στατιστικές παράμετροι ανάλυσης κυτταρολογικών διαγνώσεων του τεστ Παπανικολάου σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση 140

141 ARRAYS ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΡΝΗΤΙΚΑ CIN 1 CIN 2 CIN 3 Ca Σύνολο ARRAYS ,04% ARRAYS ,96% Σύνολο ,00% % 60% 33% 3% 3% 1% 100% ARRAYS+ 45,8% 58,2% 88,0% 92,5% 88,9% 53,0% ARRAYS- 54,2% 41,8% 12,0% 7,5% 11,1% 47,0% CIN2+ CIN3+ Ca ,1% 91,6% 88,9% Πίνακας 16: Ανάλυση αποτελεσμάτων τυποποίησης HPV DNA σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση ARRAYS ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ 95,00% CIN2+ CIN3+ PV 0,073 0,032 Standard Dev 0,252 0,351 Confidence +/- 0,010 0,014 Sensitivity 0,901 0,916 Specificity 0,499 0,487 P PV 0,124 0,074 N PV 0,985 0,992 OA 0,528 0,505 Relative Risk 8,07 9,64 Πίνακας 17: Στατιστικές παράμετροι ανάλυσης τυποποίησης HPV DNA σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση 141

142 NASBA - ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΡΝΗΤΙΚΑ CIN 1 CIN 2 CIN 3 Ca Σύνολο NASBA ,27% NASBA ,73% Σύνολο ,00% % 60% 33% 3% 3% 1% 100% NASBA+ 7,8% 19,2% 64,0% 83,8% 66,7% 16,3% NASBA- 92,2% 80,8% 36,0% 16,3% 33,3% 83,7% CIN2+ CIN3+ Ca ,1% 79,4% 66,7% Πίνακας 18: Ανάλυση αποτελεσμάτων NASBA σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση NASBA ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ 95,00% CIN2+ CIN3+ PV 0,073 0,032 Standard Dev 0,179 0,247 Confidence +/- 0,007 0,010 Sensitivity 0,731 0,794 Specificity 0,882 0,866 P PV 0,328 0,209 N PV 0,977 0,989 OA 0,871 0,863 Relative Risk 13,97 19,89 Πίνακας 19: Στατιστικές παράμετροι ανάλυσης NASBA σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση 142

143 FLOW ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΡΝΗΤΙΚΑ CIN 1 CIN 2 CIN 3 Ca Σύνολο FLOW ,32% FLOW ,68% Σύνολο ,00% % 60% 33% 3% 3% 1% 100% FLOW+ 16,9% 25,8% 53,3% 75,0% 66,7% 23,3% FLOW- 83,1% 74,2% 46,7% 25,0% 33,3% 76,7% CIN2+ CIN3+ Ca ,8% 72,9% 66,7% Πίνακας 20: Ανάλυση αποτελεσμάτων κυτταρομετρίας ροής σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση FLOW - ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ 95,00% CIN2+ CIN3+ PV 0,073 0,032 Standard Dev 0,164 0,223 Confidence +/- 0,006 0,009 Sensitivity 0,648 0,729 Specificity 0,799 0,789 P PV 0,203 0,134 N PV 0,967 0,985 OA 0,788 0,786 Relative Risk 6,06 8,85 Πίνακας 21: Στατιστικές παράμετροι ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση 143

144 CIN % PV Ευαισθησία Ειδικότητα Θ ΠΑ Α ΠΑ OA Σχετικός Κίνδυνος Τεστ Παπ 0,073 0,962 0,514 0,135 0,994 0,547 23,02 ASCUS + ARRAYS 0,073 0,901 0, ,985 0,528 8,07 NASBA 0,073 0,731 0,882 0,328 0,977 0,871 13,97 FLOW 0,073 0,648 0,799 0,203 0,967 0,788 6,06 Πίνακας 22: Στατιστικές παράμετροι ανάλυσης όλων των διαγνωστικών μεθόδων σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση CIN 2 + (Θ ΠΑ: θετική προγνωστική αξία, Α ΠΑ: αρνητική προγνωστική αξία, ΟΑ: Συνολική αξιοπιστία) CIN % PV Ευαισθησία Ειδικότητα Θ ΠΑ Α ΠΑ OA Σχετικός Κίνδυνος ARRAYS 0,032 0,916 0, ,992 0,505 9,64 NASBA 0,032 0,794 0,866 0,209 0,989 0,863 19,89 FLOW 0,032 0,729 0,789 0,134 0,985 0,786 8,85 Πίνακας 23: Στατιστικές παράμετροι ανάλυσης όλων των διαγνωστικών μεθόδων σε σχέση με την ιστολογική διάγνωση CIN 3 + (Θ ΠΑ: θετική προγνωστική αξία, Α ΠΑ: αρνητική προγνωστική αξία, ΟΑ: Συνολική αξιοπιστία) 144

145 Tεστ Παπανικολάου με CIN 2+ Area Under the Curve Asymptotic 95% Confidence Interval Area Std. Error Asymptotic Sig. Lower Bound Upper Bound Σχήμα 12: Καμπύλη ROC κυτταρολογικής διάγνωσης του τεστ Παπανικολάου με ιστολογική διάγνωση CIN

146 Σύγκριση τεστ Παπανικολάου με CIN 3 + Area Under the Curve Asymptotic 95% Confidence Interval Area Std. Error Asymptotic Sig. Lower Bound Upper Bound Σχήμα 13: Καμπύλη ROC κυτταρολογικής διάγνωσης του τεστ Παπανικολάου με ιστολογική διάγνωση CIN

147 ARRAYS χαμηλού / υψηλού κινδύνου με CIN 2 + Area Under the Curve Asymptotic 95% Confidence Interval Area Std. Error Asymptotic Sig. Lower Bound Upper Bound Σχήμα 14: Καμπύλη ROC τυποποίησης HPV DNA (γενική κατανομή σε τύπους υψηλού και χαμηλού κινδύνου) με ιστολογική διάγνωση CIN

148 ARRAYS χαμηλού / υψηλού κινδύνου με CIN 3 + Area Under the Curve Asymptotic 95% Confidence Interval Area Std. Error Asymptotic Sig. Lower Bound Upper Bound Σχήμα 15: Καμπύλη ROC τυποποίησης HPV DNA (γενική κατανομή σε τύπους υψηλού και χαμηλού κινδύνου) με ιστολογική διάγνωση CIN

149 NASBA με CIN 2+ Area Under the Curve Asymptotic 95% Confidence Interval Area Std. Error Asymptotic Sig. Lower Bound Upper Bound Σχήμα 16: Καμπύλη ROC NASBA (γενική κατανομή σε θετικά και αρνητικά) με ιστολογική διάγνωση CIN

150 NASBA Θετικά / Αρνητικά με CIN 3+ Area Under the Curve Asymptotic 95% Confidence Interval Area Std. Error Asymptotic Sig. Lower Bound Upper Bound Σχήμα 17: Καμπύλη ROC NASBA (γενική κατανομή σε θετικά και αρνητικά) με ιστολογική διάγνωση CIN

151 FLOW CYTOMETRY με CIN 2 + Area Under the Curve Asymptotic 95% Confidence Interval Area Std. Error Asymptotic Sig. Lower Bound Upper Bound Σχήμα 18: Καμπύλη ROC κυτταρομετρίας ροής με ιστολογική διάγνωση CIN

152 FLOW CYTOMETRY με CIN 3 + Area Under the Curve Asymptotic 95% Confidence Interval Area Std. Error Asymptotic Sig. Lower Bound Upper Bound Σχήμα 19: Καμπύλη ROC κυτταρομετρίας ροής με ιστολογική διάγνωση CIN

153 Τεστ Παπανικολάου και μοριακές μέθοδοι με CIN 2 + Τεστ Παπ Flow cytometry NASBA Micro arrays Reference line Area Under the Curve Asymptotic 95% Confidence Interval Area Std. Error Asymptotic Sig. Lower Bound Upper Bound Τεστ Παπανικολάου Flow cytometry NASBA θετικό / αρνητικό NASBA ανά τύπο ARRAYS χαμηλού / υψηλού κινδύνου Σχήμα 20: Καμπύλη ROC όλων των διαγνωστικών μεθόδων με ιστολογική διάγνωση CIN