ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΧΑΡΟΚΟΠΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΤΜ. ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΙΑΙΤΟΛΟΓΙΑΣ - ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Μαντώ Κυριακού Επίκουρη Καθηγήτρια Μικροβιολογίας ΑΘΗΝΑ 2009

2 Α ΜΕΡΟΣ 1

3 Προκαρυωτικοί µικροοργανισµοί Φυλογενετικές σχέσεις µεταξύ των προκαρυωτικών οργανισµών Οι προκαρυωτικοί οργανισµοί χωρίζονται σε 12 µεγάλες ταξινοµικές οµάδες. Τα γένη που τοποθετούνται σε κάθε οµάδα, όπως φαίνεται και στο σχήµα που ακολουθεί, συνήθως παρουσιάζουν οµοιότητες στα µορφολογικά και βιοχηµικά τους χαρακτηριστικά. Τα ταξινοµικά µέσα που χρησιµοποιούσαµε µέχρι πρόσφατα στηρίζονταν αποκλειστικά σε µορφολογικά και βιοχηµικά χαρακτηριστικά. Τα τελευταία όµως χρόνια µε τις εξελίξεις στη Μοριακή Βιολογία και στη Γενετική, προστέθηκαν καινούργια µέσα, όπως το ποσοστό των βάσεων GC στο DNA του µικροοργανισµού και ο έλεγχος του βαθµού οµοιότητας της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του ριβοσωµικού RNA (rrna). Το τελευταίο µάλιστα θεωρείται και το πιο σύγχρονο µέσο στην Ταξινοµική. Πράσινα θειοβακτήρια Πράσινα µηθειϊκά βακτήρια Πρωτεοβακτήρια Σύµ φωνα µε το σχήµα, η πιο παλαιά οµάδα από τις 12 είναι η οµάδα του Aquifexπεριλαµβάνει Hydrogenobacter, η οποία περιλαµβάνει υπερθερµόφιλους, χηµιολιθότροφους µικροοργανισµούς. Το Aquifex αναπτύσσεται στους 95 o C και θεωρείται ο πιο κοντινός συγγενής του κοινού προγόνου των βακτηρίων. Η επόµενη οµάδα είναι η οµάδα του Thermogota, η οποία επίσης µικροοργανισµούς υπερθερµόφιλους αλλά χηµειοοργανότροφους (αναερόβια ζύµωση). 2

4 Η οµάδα των πράσινων µη-θειϊκών βακτηρίων περιλαµβάνει φωτοσυνθέτοντα και µη φωτοσυνθέτοντα βακτήρια τα οποία είναι θερµόφιλα. Στις επόµενες οµάδες βακτηρίων φαίνεται ότι χάνεται ως υποχρεωτική ιδιότητα ο υπερθερµόφιλος χαρακτήρας, ο οποίος πιθανά να αντανακλά και την προσαρµογή αυτών των εξαιρετικά παλαιών µικροοργανισµών στις συνθήκες που ίσχυαν στη γη την εποχή εκείνη. Στην οµάδα του Deinococcus περιλαµβάνεται το ανθεκτικό στην ακτινοβολία γένος του Deinococcus. Ακολουθεί η οµάδα των σπειροχαιτών η οποία περιλαµβάνει µικροοργανισµούς µε µοναδικά µορφολογικά χαρακτηριστικά και τρόπο κίνησης και τα φωτοσυνθετικά πράσινα θειοβακτήρια. Η οµάδα του Bacteroides περιλαµβάνει βακτήρια υποχρεωτικά αναερόβια όπως το Bacteroides, µέχρι υποχρεωτικά αερόβια όπως το Sporocytophaga. Η οµάδα του Planctomyces-Pirella περιλαµβάνει µικροοργανισµούς οι οποίοι αναπαράγονται µε εκβλάστηση και δεν έχουν πεπτιδογλυκάνη στα κυτταρικά τους τοιχώµατα. Προτιµούν το υγρό περιβάλλον για την ανάπτυξή τους. Τα χλαµύδια είναι υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα, πολλά από τα οποία προκαλούν ασθένειες στον άνθρωπο και στα άλλα ζώα. Οι επόµενες τρεις ταξινοµικές οµάδες είναι οι µεγαλύτερες από άποψη αριθµού γενών και ειδών και τα περισσότερα από τα βακτήρια που απαντώνται εκεί ήταν γνωστά από τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τους πολύ πριν καταταχθούν στις οµάδες αυτές. Η οµάδα των Gram + βακτηρίων περιλαµβάνει κόκκους και βακίλλους και χωρίζονται σε δύο υπο-οµάδες: την υπο-οµάδα µικρής αναλογίας βάσεων GC (αναλογία βάσεων < 50%) και την υπο-οµάδα υψηλής αναλογίας βάσεων GC (αναλογία βάσεων > 50%). Τα κυανοβακτήρια είναι φωτοσυνθετικά βακτήρια τα οποία φυλογενετικά βρίσκονται κοντά στα Gram +. Η τελευταία και πιο µεγάλη σε αριθµό βακτηριακών γενών, είναι η οµάδα των πρωτεοβακτηρίων. Η οµάδα αυτή χωρίζεται σε 5 υποοµάδες: α, β, γ, δ και ε. Κάποια από τα βακτήρια αυτά είναι φωτοσυνθετικά και φαίνεται ότι ο κοινός πρόγονος της οµάδας αυτής ήταν φωτοσυνθετικός µικροοργανισµός. Υπάρχει όµως µεγάλη βιοσυνθετική ποικιλία, η οποία πιθανόν να προέρχεται από τις εναλλακτικές οδούς που αναπτύχθηκαν από τους µικροοργανισµούς για να αποικίσουν νέους οικολογικούς θώκους. 3

5 Πρωτεοβακτήρια - Σπειράµατα Τοποθετούνται στις α, β, γ, ε υποοµάδες των πρωτεοβακτηρίων. Περισσότερα στοιχεία στο βιβλίο: BROCK Βιολογία των µικροοργανισµών Τόµος Ι. σελ. 445 Σηµαντικά γένη & σελ. 448 Campylobacter και Helicobacter. Ψευδοµονάδες Τοποθετούνται στις α και γ υποοµάδες των πορφυρών βακτηρίων. Είναι Gram βάκιλλοι οι οποίοι µοιάζουν πολύ µε τα εντεροβακτήρια. Τα βιοχηµικά χαρακτηριστικά που τα ξεχωρίζουν από τα εντεροβακτήρια είναι: 1) η δοκιµή της οξειδάσης : οι ψευδοµονάδες είναι θετικές στην οξειδάση και 2) κατανάλωση σακχάρων: οι ψευδοµονάδες δεν ζυµώνουν τα σάκχαρα δηλ. δεν παράγουν αέριο, αλλά τα οξειδώνουν. Τα µορφολογικό χαρακτηριστικό που τις διαφοροποιεί από τα εντεροβακτήρια είναι ότι οι ψευδοµονάδες συνήθως έχουν πολικό µαστίγιο, ενώ τα εντεροβακτήρια είναι περίτριχα. Λίγα είδη ψευδοµονάδων είναι παθογόνα του ανθρώπου πχ. Το Pseudomonas aeruginosa το οποίο προκαλεί µολύνσεις στο ουροποιητικό και στο αναπνευστικό σύστηµα του ανθρώπου. Επίσης, επιµολύνσεις από το ίδιο είδος προκαλούνται σε ανθρώπους που έχουν υποστεί εκτεταµένα εγκαύµατα ή άλλου τύπου σοβαρές βλάβες στην επιδερµίδα τους. Το είδος αυτό προσβάλλει κυρίως ασθενείς µε µειωµένη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήµατος. Ο µικροοργανισµός αυτός µάλιστα παρουσιάζει ανθεκτικότητα σε πολλά από τα ευρέως φάσµατος αντιβιοτικά, γεγονός που κάνει την αντιµετώπισή του εξαιρετικά δύσκολη. Συχνά, η ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά οφείλεται στο πλασµίδιο R, το οποίο φέρει γονίδια που κωδικοποιούν για τη σύνθεση ενζύµων τα οποία διασπούν (αποτοξικοποίηση) διάφορα αντιβιοτικά. Στελέχη ανθεκτικά στα αντιβιοτικά απαντώνται συχνά στο νοσοκοµειακό περιβάλλον και προσβάλλουν ασθενείς που δέχονται θεραπεία για άλλες ασθένειες. Για τις περιπτώσεις αυτές χρησιµοποιείται ένα αντιβιοτικό που σπάνια χρησιµοποιείται σε θεραπείες λόγω της τοξικότητάς του, η πολυµυξίνη και το οποίο είναι δραστικό απέναντι στα στελέχη αυτά. - Βακτήρια οξικού οξέος Τοποθετούνται στην α υποοµάδα των πορφυρών βακτηρίων. Στην οµάδα αυτή περιλαµβάνονται βάκιλλοι αερόβιοι, Gram-αρνητικοί, που παρουσιάζουν αυτόνοµη κίνηση και βέβαια εµφανίζουν ατελή οξείδωση των αλκοολών η οποία οδηγεί στη συσσώρευση οργανικών οξέων ως τελικά προϊόντα. Όταν το υπόστρωµα είναι 4

6 αιθανόλη τότε παράγεται οξικό οξύ. Όπως είναι λογικό τα βακτήρια αυτά παρουσιάζουν µεγάλη ανθεκτικότητα στις όξινες συνθήκες, µε αποτέλεσµα τα περισσότερα στελέχη να αναπτύσσονται σε ph <5. Στην οµάδα αυτή εµφανίζονται τόσο περίτριχα στελέχη όσο και στελέχη µε πολικά µαστίγια. Τα τελευταία µοιάζουν αρκετά µε τις ψευδοµονάδες, διαφέρουν όµως από αυτές ως προς την ανθεκτικότητα τους στις όξινες συνθήκες και στην ανικανότητά τους να παρουσιάζουν τέλεια οξείδωση των αλκοολών. Χαρακτηριστικός εκπρόσωπος αυτού του τύπου είναι το γένος Gluconobacter. Αντίθετα το γένος Acetobacter περιλαµβάνει περίτριχα στελέχη τα οποία επιπλέον µπορούν και µεταβολίζουν το οξικό οξύ που παράγουν σε CO 2. Τα βακτήρια της οµάδας αυτής απαντώνται σε αλκοολικούς χυµούς όπως το µηλόκρασο (cider) ή το κρασί. Για την εµπορική παραγωγή του ξιδιού µάλιστα χρησιµοποιούνται στελέχη από την οµάδα αυτή. Οι µικροοργανισµοί αυτοί εκτός από τα αλκοολούχα υποστρώµατα οξειδώνουν ατελώς και σάκχαρα π.χ. η γλυκόζη µεταβολίζεται σε γλουκονικό οξύ, η γαλακτόζη σε γαλακτονικό οξύ, η αραβινόζη σε αραβονικό οξύ κ.λ.π. Αυτή η ιδιότητά τους χρησιµοποιείται για την παραγωγή του ασκορβικού οξέος (βιταµίνη C), µε βιοτεχνολογική µέθοδο. Το ασκορβικό οξύ παρασκευάζεται από τη σορβόζη η οποία όµως πολύ δύσκολα συντίθεται χηµικά. Για τον λόγο αυτό χρησιµοποιούνται καλλιέργειες βακτηριακών στελεχών της οµάδας του οξικού οξέος, τα οποία µετατρέπουν τη σορβιτόλη (ένα κοινό σάκχαρο) σε σορβόζη µε µία διαδικασία που ονοµάζεται βιοµετατροπή, και η οποία έχει πολύ µικρότερο οικονοµικό κόστος. Μία άλλη πολύ ενδιαφέρουσα ιδιότητα µερικών βακτηριακών στελεχών της οµάδας αυτής είναι η σύνθεση κυτταρίνης. Η βακτηριακή αυτή κυτταρίνη δεν διαφέρει πολύ από τη φυτική κυτταρίνη, δεν αποτελεί όµως µέρος του κυτταρικού τοιχώµατος όπως συµβαίνει στα φυτά αλλά δηµιουργεί ένα επιπλέον περίβληµα στο βακτηριακό κύτταρο. Σε καλλιέργειες µάλιστα όπου δεν αναδεύονται δηµιουργούν στην επιφάνεια ένα είδος µεµβράνης το οποίο φαίνεται ότι εξυπηρετεί στην παραµονή των κυττάρων στην επιφάνεια και στην προµήθεια οξυγόνου των βακτηριακών κυττάρων µε αυτό τον τρόπο. - Vibrios ( ονάκια) Τοποθετούνται στην γ υποοµάδα των πορφυρών βακτηρίων. Εχουν τη µορφή κεκαµένων ραβδίων ή µοιάζουν µε κόµµα. Απαντώνται σε υδάτινα περιβάλλοντα. Το γένος Vibrio περιλαµβάνει ένα πολύ σηµαντικό παθογόνο του ανθρώπου το Vibrio cholerae, το παθογόνο αίτιο της ασιατικής χολέρας. 5

7 - Εντερικά βακτήρια Τα βακτήρια της οµάδας αυτής αποτελούν µία σχετικά οµοιογενή φυλογενετικά ενότητα. Είναι Gram αρνητικοί βάκιλλοι οι οποίοι δεν σχηµατίζουν σπόρια, δεν παρουσιάζουν αυτόνοµη κίνηση ή εάν κινούνται, τότε έχουν περίτριχα µαστίγια. Είναι προαιρετικά αερόβια και ζυµώνουν τα σάκχαρα σε διάφορα προϊόντα. Τα εντεροβακτήρια είναι αρνητικά στη δοκιµή της οξειδάσης. Ένα από τα πιο σηµαντικά ταξινοµικά χαρακτηριστικά για την οµάδα αυτή είναι ο τύπος και η αναλογία των προϊόντων της αναερόβιας ζύµωσης της γλυκόζης. ύο είναι οι πιο σηµαντικές οδοί: η ζύµωση των µικτών οξέων και η ζύµωση της 2,3 βουτανεδιόλης. Στη ζύµωση των µικτών οξέων παράγονται 3 οξέα σε σηµαντικές ποσότητες: οξικό, γαλακτικό και ηλεκτρικό (succinate). Επίσης παράγονται CO 2 και H 2 σε µικρότερες ποσότητες και καθόλου βουτανεδιόλη. Αντίθετα στη ζύµωση της 2,3-βουτανεδιόλης τα κύρια προϊόντα είναι η βουτανεδιόλη, το CO 2 και H 2. 6

8 Η συστηµατική κατάταξη των στελεχών των εντεροβακτηρίων που αποµονώνονται από διάφορα περιβάλλοντα παρουσιάζει δυσκολίες λόγω του µεγάλου αριθµού των στελεχών που συχνά παρουσιάζουν εξαιρέσεις στις βιοχηµικές συνήθειές τους. Για τον λόγο αυτό τα αποτελέσµατα ενός µεγάλου αριθµού βιοχηµικών δοκιµών που γίνονται αναλύονται µε τη βοήθεια υπολογιστή. Ένας µικρός πρακτικός οδηγός για τη κατάταξη ενός στελέχους σε γένη που ανήκουν στα εντεροβακτήρια είναι ο ακόλουθος. 7

9 ιαγνωστικές δοκιµές 1. MR +, VP (ζύµωση µικτών οξέων) MR -, VP + (ζύµωση βουτανεδιόλης) 2. Ουρεάση + Ουρεάση - 3. H 2 S (TS) + H 2 S (TS) - 4. KCN + KCN - 5. Ινδόλιο +, Κιτρικά Ινδόλιο -, Κιτρικά + 6. Παραγωγή αερίου από γλυκόζη Μη παραγωγή αερίου από γλυκόζη 7. Όχι αυτόνοµη κίνηση, Ορνιθίνη Αυτόνοµη κίνηση, Ορνιθίνη + 8. Ζελατίνη +, DNAάση + Ζελατίνη -, DNAάση - Αριθµός 2 7 Proteus Citrobacter 5 Edwardsiella Salmonella Escherichia Shigella Klebsiella 8 Serratia (κόκκινη χρωστική) Enterobacter Γένος Shigella Τα βακτηριακά στελέχη του γένους αυτού βρίσκονται φυλογενετικά πολύ κοντά στα Escherichia, τόσο που µπορεί να παρατηρηθεί και γενετικός ανασυνδυασµός µεταξύ τους, όπως επίσης προσβάλλονται και από τους ίδιους φάγους. Τα στελέχη του γένους αυτού είναι κατά κανόνα παθογόνα του ανθρώπου κα δηµιουργούν πολύ σοβαρές δυσεντερίες. Το Shigella dysenteriae µεταδίδεται µέσω των τροφών και του νερού και εποικίζει τα επιθηλιακά κύτταρα του γαστρεντερικού σωλήνα. Αφού αναπτυχθεί παράγει µία ενδοτοξίνη και µία νευροτοξίνη. Γένος Salmonella Τα γένη Salmonella και Escherichia επίσης θεωρούνται ότι βρίσκονται κοντά φυλογενετικά. Τα είδη του Salmonella είναι παθογόνα του ανθρώπου και των ζώων. Οι πιο γνωστές ασθένειες που προκαλούν στον άνθρωπο είναι ο τυφοειδής πυρετός και γαστρεντερίτιδα. Τα στελέχη του χαρακτηρίζονται ανοσολογικά από 3 κατηγορίες επιφανειακών αντιγόνων: τα αντιγόνα του κυτταρικού τοιχώµατος (Ο αντιγόνα), τα αντιγόνα του µαστιγίου (Η αντιγόνα) και τα Vi αντιγόνα που βρίσκονται στην εξωτερική στοιβάδα του λιποπολυσακχαριδίου. Τα Ο αντιγόνα είναι σύνθετα πολυσακχαρίδια τα οποία αποτελούν µέρος της δοµής της ενδοτοξίνης αυτών των οργανισµών. Στο γένος περιλαµβάνονται τουλάχιστον 1000 διακριτοί τύποι µε αντιγονικές ιδιαιτερότητες στο Ο αντιγόνο. Επιπλέον παρουσιάζονται αντιγονικές ιδιαιτερότητες και ως προς το Η αντιγόνο. εν έχει όµως µέχρι στιγµής συσχετιστεί ο διαφορετικός τύπος του αντιγόνου και των συµπτωµάτων 8

10 που προκαλεί. Αντίθετα ο αντιγονικός τύπος χρησιµεύει στην κατάταξη ενός στελέχους που σχετίζεται µε µία επιδηµία. Γένος Proteus Τα κύρια χαρακτηριστικά του γένους είναι η µεγάλη κινητικότητα που παρουσιάζουν τα κύτταρα και η παραγωγή του ενζύµου ουρεάση. Τα στελέχη που ανήκουν εδώ δεν φαίνεται να παρουσιάζουν µεγάλη φυλογενετική συγγένεια µε το Escherichia coli παρότι ανήκουν στην ίδια κατηγορία αυτών που χαρακτηρίζονται από τη ζύµωση των µικτών οξέων. Συνήθως αποµονώνεται σε µολύνσεις του ουροποιητικού συστήµατος και πιο σπάνια του εντερικού. Λόγω µάλιστα της ιδιότητάς του να διασπά την ουρία αναφέρεται σε λοιµώξεις των νεφρών. Γένος Yersinia. Το γένος αυτό αποτελείται από τρία είδη:το Yersinia pestis, το οποίο προκαλεί τη βουβωνική πανώλη, µία από τις αρχαιότερες και πιο θανατηφόρες ασθένειες, το Y.pseudoturbeculosis, το οποίο προκαλεί στα ζώα µία ασθένεια τύπου φυµατίωσης των λεµφαδένων και το Y. enterocolitica το οποίο προκαλεί στα ζώα και στον άνθρωπο λοιµώξεις του γαστρεντερικού και πιο σπάνια συστηµατικές λοιµώξεις. Από τα είδη αυτά το πρώτο είναι γνωστό για τις φοβερές επιδηµίες πανώλης που έχουν σπείρει τον θάνατο σε εκατοµµύρια ανθρώπους. Η επιδηµία της βουβωνικής πανώλης τον 14 ο αιώνα στην Ευρώπη την στέρησε από το ¼ του πληθυσµού της. Τα τελευταία χρόνια το είδος Y. enterocolitica αναγνωρίστηκε ως µικροοργανισµός που µεταδίδεται µέσω του πόσιµου νερού και µέσω των τροφίµων. Με τις σύγχρονες µεθόδους ταυτοποίησης και αποµόνωσης µάλιστα, φάνηκε ότι η συχνότητα εµφάνισής του αυξάνεται. Γένη που ακολουθούν τη µεταβολική οδό της ζύµωσης της βουτανεδιόλης Οι µικροοργανισµοί αυτοί φαίνεται να παρουσιάζουν µεγαλύτερη οµοιογένεια από τα εντεροβακτήρια που ακολουθούν την µεταβολική οδό της ζύµωσης των µικτών οξέων. Το πιο γνωστό γένος που ανήκει στην κατηγορία αυτή είναι το Klebsiella. Ιδιαίτερα το είδος K.pneumoniae είναι αυτό που προκαλεί την πνευµονία στον άνθρωπο. Γενικά πάντως τα στελέχη του γένους αυτού απαντώνται στο έδαφος και στο νερό. Το γένος Serratia ανήκει επίσης στην ίδια κατηγορία και χαρακτηρίζεται από την εµφάνιση χρωστικών κόκκινων που έχουν πυρολικό δακτύλιο. Απαντάται στο έδαφος και στο νερό αλλά και στον εντερικό σωλήνα των ζώων. Συχνά αποµονώνεται από αλλοιωµένα κρέατα. 9

11 - Ρικέτσιες Οι ρικέτσιες είναι βακτήρια Gram-αρνητικά, κόκκοι ή βάκιλλοι (µήκος 1-2 µm, πλάτος µm) και είναι υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα, τα οποία δεν µπορούν να καλλιεργηθούν εκτός των κυττάρων ξενιστών. Προκαλούν πολύ σοβαρές ασθένειες όπως ο τυφοειδής πυρετός, ο εξανθηµατικός τυφοειδής πυρετός και ο πυρετός Q. Το κύτταρό τους διαθέτει κυτοπλασµατική µεµβράνη και κυτταρικό τοίχωµα που περιέχει µουραµικό και διαµινοπιµελικό οξύ. ιαθέτουν τόσο DNA, όσο και RNA και διαιρούνται µε διχοτόµηση. Για την αναπαραγωγή τους είναι απαραίτητο να είναι µεταβολικά ενεργό το κύτταρο ξενιστής και πολλαπλασιάζονται στο κυτταρόπλασµα, στη συνέχεια διαρυγνύεται το κύτταρο και ελευθερώνει τα παράσιτα στο περιβάλλοντα χώρο. Η πιο γνωστή ρικέτσια είναι το αίτιο του πυρετού Q, το Coxiella burnetti. Μεταφέρονται από το ένα άτοµο στο άλλο πιθανότατα µέσω αρθροπόδων τα οποία µεταφέρουν ποσότητες αίµατος που περιέχουν τον µικροοργανισµό. Ειδικά το Coxiella burnetti µεταφέρεται στο αναπνευστικό σύστηµα και µε την εισπνοή. Θεωρείται µάλιστα και το πιο ανθεκτικό διότι σχηµατίζει µία µορφή ενδοσπορίου. Οι ρικέτσιες φυλογενετικά θεωρούνται πιο συγγενείς µε τα πορφυρά βακτήρια, σύµφωνα µε τις πιο σύγχρονες µεθόδους σύγκρισης του βαθµού οµοιότητας των βάσεων του 16S RNA. - Gram + Βακτήρια Τα βακτήρια αυτά αποτελούν φυλογενετικά µία σχετικά οµοιογενή οµάδα, εάν εξαιρεθεί το γένος Deinococcus. Χωρίζονται σε δύο µεγάλες υποοµάδες µετά από µελέτη της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του ριβοσωµικού DNA: Α) η πρώτη οµάδα περιλαµβάνει το γένος Clostridium και συγγενή γένη που σχηµατίζουν ενδοσπόριο, τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος, όπως και την µεγάλη πλειοψηφία των Gram + κόκκων. Τα βακτήρια της υποοµάδας αυτής παρουσιάζουν στο γενετικό τους υλικό µικρή αναλογία σε περιεκτικότητα βάσεων GC. Β) η δεύτερη υποοµάδα περιλαµβάνει τους ακτινοµύκητες και το γένος Propionibacterium. Στην υποοµάδα αυτή παρατηρείται µεγάλη αναλογία σε περιεκτικότητα βάσεων GC. Gram + κόκκοι Γένη Staphylococcus και Micrococcus Είναι αερόβια βακτήρια και διαθέτουν το ένζυµο καταλάση, γεγονός που τα διαφοροποιεί από το γένος Streptococcus και από άλλους Gram + κόκκους. Είναι ανθεκτικά στη ξηρασία και στην υψηλή αλατότητα. Για τον λόγο αυτό τα εκλεκτικά 10

12 θρεπτικά υλικά που χρησιµοποιούνται για την αποµόνωσή τους από το περιβάλλον περιέχουν υψηλή συγκέντρωση αλάτων (7.5% NaCl). Συχνά οι µικροοργανισµοί αυτοί σχηµατίζουν χρωστικές οι οποίες βοηθούν επιπλέον στην αποµόνωσή τους. Τα δύο αυτά γένη µπορούν εύκολα να διαχωριστούν µε κριτήριο τις µεταβολικές τους διαφορές: τα βακτήρια του γένους Micrococcus είναι υποχρεωτικά αερόβια και παράγουν οξύ από τη γλυκόζη µόνο αερόβια, ενώ τα βακτήρια που ανήκουν στο γένος Staphylococcus είναι προαιρετικά αναερόβια και παράγουν οξύ τόσο αερόβια όσο και αναερόβια. Επίσης η αναλογία των βάσεων GC στο µόριο του DNA είναι µικρή για το Micrococcus sp., ενώ για το Staphylococcus sp. είναι σχετικά υψηλή. Οι σταφυλόκοκκοι είναι κοινά παράσιτα των ανθρώπων και των ζώων και συχνά προκαλούν σοβαρές λοιµώξεις. Στους ανθρώπους απαντώνται το S. epidermidis και το S. aureus. Το S. aureus παράγει εξωτοξίνες (τοξίνες που παράγει ο µικροοργανισµός όσο αυξάνεται και τις ελευθερώνει εξωκυτταρικά). Οι τοξίνες αυτές µπορεί να κινηθούν από το σηµείο της µόλυνσης σε διαφορετικά σηµεία του σώµατος και να προκαλέσουν διάφορα συµπτώµατα. Οι τοξίνες αυτές σχετίζονται µε την παθογένεια του µικροοργανισµού στον άνθρωπο. Μία από τις πλέον σηµαντικές είναι το ένζυµο αγλουτινάση (coagulase), το οποίο προκαλεί πήξιµο των πρωτεϊνών του πλάσµατος. Το ένζυµο αυτό συνδέεται µε την παθογένεια του S. aureus. Φαίνεται ότι προκαλεί την µετατροπή του ινωδογόνου σε ινώδες γύρω από το σηµείο της µόλυνσης και µε αυτό τον τρόπο δηµιουργείται ένα προστατευτικό φράγµα ως προς τα µακροφάγα του αίµατος. Συνήθως τα είδη του S. epidermidis δεν διαθέτουν την τοξίνη αυτή. Οι πιο γνωστές τοξίνες ή παράγοντες παθογένειας του S. aureus είναι οι παρακάτω: Τοξίνη Συµπτωµατολογία α τοξίνη αιµόλυση Τοξίνη συνδρόµου τοξικού σοκ Συστηµατικό σοκ Τοξίνες Α και Β Ξεφλούδισµα του δέρµατος, σοκ Λευκοσιδίνη Καταστρέφει τα λευκά αιµοσφαίρια β τοξίνη αιµόλυση γ- τοξίνη Καταστρέφει κύτταρα δ-τοξίνη Αιµόλυση, καταστρέφει τα λευκά αιµοσφαίρια Εντεροτοξίνες Α, Β, C, D και E ιάρροια, σοκ Αγλουτινάση (coagulase) Μετατροπή του ινοδογόνου σε ινώδες (πήξιµο του αίµατος) Μεταξύ των τοξινών που παράγουν στελέχη του S. aureus ανιχνεύονται τέσσερις τουλάχιστον διαφορετικές αιµολυσίνες. Έχουν µάλιστα αποµονωθεί παθογόνα στελέχη που παράγουν πάνω από µία αιµολυσίνη. 11

13 Πιστεύεται επίσης ότι οι χρωστικές που παράγει το S. aureus (καροτενοειδή) παίρνουν µέρος στον µηχανισµό καταστροφής των φαγοκυττάρων, δεσµεύοντας τις ρίζες οξυγόνου που παράγουν τα κύτταρα αυτά για την καταστροφή των παθογόνων µικροοργανισµών. Η λευκοσιδίνη επίσης καταστρέφει τα φαγοκύτταρα µε αποτέλεσµα τη µειωµένη δράση του ανοσοποιητικού. Κάποια στελέχη του S. aureus θεωρούνται ως υπεύθυνοι παθογόνοι παράγοντες για το σύνδροµο του τοξικού σοκ. Το σύνδροµο αυτό είναι µία σοβαρή σταφυλοκοκκική µόλυνση που χαρακτηρίζεται από υψηλό πυρετό, εξάνθηµα, εµετούς, διάρροια και σπάνια µέχρι και θάνατο. Το σύνδροµο αυτό σχετίζεται µε την χρήση ταµπόν κατά την έµµηνο ρύση, αλλά και µε µολύνσεις µετά από χειρουργικές επεµβάσεις. Το σύνδροµο αυτό προκαλείται από τη συγκεκριµένη τοξίνη η οποία θεωρείται ένα υπερ-αντιγόνο. Από το 1981, η εµφάνιση του συνδρόµου αυτού έχει µειωθεί σηµαντικά λόγω της αλλαγής των απορροφητικών υλικών που χρησιµοποιούνται στα ταµπόν, αλλά και της σωστής χρήσης, λόγω ενηµέρωσης του κοινού. Πολλοί υγιείς άνθρωποι είναι φορείς του S. aureus. Αρκετά βρέφη µολύνονται κατά την διάρκεια της πρώτης εβδοµάδας της ζωής τους από τη µητέρα τους ή από κάποιο άλλο άτοµο του συγγενικού τους περιβάλλοντος. Στις περισσότερες όµως από αυτές τις περιπτώσεις δεν δηµιουργείται ιδιαίτερο πρόβληµα. Αντίθετα, γίνεται επικίνδυνο για άτοµα που έχουν µειωµένη άµυνα (ανοσοκαταστολή) λόγω ορµονικών διαταραχών ή λόγω άλλων ασθενειών ή λόγω της χορήγησης στεροειδών ή αντιφλεγµονωδών φαρµάκων ή παρουσιάζουν εκτεταµένες πληγές στην επιφάνεια του δέρµατος. Επίσης οι επιδηµικές µορφές που εµφανίζονται σε νοσοκοµεία είναι πιο επικίνδυνες διότι προκαλούνται από στελέχη ανθεκτικά σε αντιβιοτικά. Οι ασθενείς που βρίσκονται ήδη σε νοσοκοµείο και συχνά βρίσκονται σε κατάσταση ανοσοκαταστολής, µολύνονται από το νοσοκοµειακό προσωπικό το οποίο µπορεί να είναι φορέας αντίστοιχων στελεχών. Τα ανθεκτικά στελέχη στα αντιβιοτικά (πενικιλλίνη) είναι αναµενόµενο να εµφανίζονται πιο συχνά στο νοσοκοµειακό χώρο λόγω φυσικής επιλογής. Γένος Streptococcus Στο γένος αυτό ανήκουν βακτηριακά στελέχη που τα κύτταρά τους (κόκκοι) σχηµατίζουν αλυσίδες. Περιλαµβάνει µία µεγάλη ποικιλία ειδών που απαντώνται σε πολλούς και διαφορετικούς βιότοπους και κάποια από αυτά τα είδη είναι πολύ σηµαντικά για τον άνθρωπο. 12

14 Φωτογραφία από Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο βακτηρίων του γένους Streptococcus. Παράγουν γαλακτικό οξύ όταν µεταβολίζουν σάκχαρα και για τον λόγο αυτό ανήκουν στην οµάδα των βακτηρίων του γαλακτικού οξέος και έχουν µεγάλη οικονοµική σηµασία για την παραγωγή προϊόντων όπως το ξυνόγαλα και άλλα προϊόντα ζύµωσης. Για τον διαχωρισµό των µη παθογόνων στρεπτοκόκκων από τα είδη που σχετίζονται µε παθογένεια στον άνθρωπο και τα ζώα, το γένος αυτό χωρίστηκε σε τρία είδη: Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus. Στο γένος Lactococcus ανήκουν όλοι οι στρεπτόκοκκοι που σχετίζονται µε τα γαλακτοκοµικά προϊόντα και γενικά µε τις ζυµώσεις. Στο γένος Enterococcus περιλαµβάνονται όλοι οι στρεπτόκοκκοι κοπρανώδους προέλευσης. Οι υπόλοιποι στρεπτόκοκοι που ανήκουν στο γένος Streptococcus χωρίζονται σε δύο υποοµάδες µε γνώµονα τα χαρακτηριστικά που αναφέρονται στον επόµενο Πίνακα. Οµάδα Αντιγονική Αντιπροσωπευτικά Τύπος Βιότοπος οµάδα είδη αιµόλυσης Πυογενείς A, B, C, F, G S. pyogenes Β Αναπνευστική οδός, συστηµατική παρουσία Μολυσµατικοί - S. mutans Πρασινωπό Στόµα, έντερο ή καφετί χρώµα 13

15 Ο τύπος της αιµόλυσης που προκαλούν είναι πολύ σηµαντικό κριτήριο για τον διαχωρισµό αυτό. Οι αποικίες που δηµιουργούν γύρω τους µία µεγάλη ζώνη διαυγή όταν αναπτύσσονται σε θρεπτικό υλικό µε βάση το αίµα, προκαλούν αιµόλυση τύπου- β. Τα στελέχη αυτά εκκρίνουν στρεπτολυσίνη Ο ή S. Αντίθετα όταν γύρω από την αποικία σχηµατίζεται ένα καφετί ή πρασινωπό χρώµα στο ίδιο θρεπτικό υλικό (blood agar), τότε δεν πρόκειται για πραγµατική αιµόλυση, αλλά αποχρωµατισµό που οφείλεται σε απώλεια ιόντων καλίου από τα ερυθροκύτταρα. Αυτός είναι ο α -τύπος αιµόλυσης, που παρουσιάζουν αρκετοί λακτόκοκκοι και εντερόκοκκοι. Οι στρεπτόκοκκοι, εντερόκοκκοι και λακτόκοκκοι χωρίζονται σε οµάδες ανάλογα µε την ανοσολογική τους αντίδραση που οφείλεται σε αντιγόνα υδατανθρακικής σύστασης. Αυτές οι οµάδες (οµάδες Lancefield) συµβολίζονται µε τα γράµµατα Α έως Ο. Κάποια από τα είδη αυτά είναι παθογόνα και του ανθρώπου και τα πιο σηµαντικά είναι τα S. pyogenes και S. pneumoniae. Τα είδη αυτά αποµονώνονται από την άνω αναπνευστική οδό υγιών ενηλίκων όπου απαντώνται σε µικρό αριθµό. Το S. pyogenes προκαλεί την στρεπτοκοκκική φαρυγγίτιδα. Τα στελέχη που προκαλούν αυτό τον τύπο φαρυγγίτιδας προκαλούν β-αιµόλυση. Επίσης άλλα στελέχη του ίδιου είδους προκαλούν ωτίτιδες, µαστίτιδα σε θηλαστικά καθώς και µολύνσεις της επιδερµίδας αν και οι περισσότερες οφείλονται στο Staphylococcus aureus. Περίπου οι µισές από τις εµφανιζόµενες φαρυγγίτιδες προκαλούνται από κάποιο στέλεχος του S. pyogenes, ενώ οι υπόλοιπες είναι ιογενούς προελεύσεως. Είναι πολύ σηµαντικό να χαρακτηριστεί ο παθογόνος παράγοντας διότι εάν είναι βακτηριακός, τότε µόνο µπορεί να αντιµετωπιστεί µε χορήγηση αντιβιοτικών. Επίσης κάποιες στρεπτοκοκκικές φαρυγγίτιδες µπορεί να οδηγήσουν σε πιο σοβαρά σύνδροµα όπως η οστρακιά, ο ρευµατοειδής πυρετός και η σπειραµατονεφρίτιδα. Το S. pneumoniae προκαλεί µολύνσεις στους πνεύµονες που συχνά αναπτύσσονται ως δευτερογενείς µολύνσεις από άλλες αναπνευστικές διαταραχές. Χαρακτηριστικό του είδους αυτού είναι ο σχηµατισµός ελύτρου γύρω από τα κύτταρα και η εµφάνιση των κυττάρων σε ζεύγη ή σε µικρές αλυσίδες. Είναι γνωστό ότι το έλυτρο βοηθά στην ανθεκτικότητα των βακτηριακών κυττάρων στο µηχανισµό της φαγοκύττωσης και παίζει σηµαντικό ρόλο στην παθογένεια του στελέχους. Οι πνευµονίες που προέρχονται από στρεπτόκοκκους είναι πολύ σοβαρές και στο 30% των περιπτώσεων που δεν ακολουθείται φαρµακευτική αγωγή, οδηγούνται στον θάνατο. Η πενικιλλίνη είναι το αντιβιοτικό που συστήνεται και σε περιπτώσεις ανθεκτικότητας στην πενικιλλίνη, χορηγείται ερυθροµυκίνη. 14

16 Οξυγαλακτικά βακτήρια Τα οξυγαλακτικά βακτήρια είναι Gram +, συνήθως δεν διαθέτουν αυτόνοµη κίνηση, δεν σχηµατίζουν ενδοσπόρια και παράγουν γαλακτικό οξύ κατά την ζύµωση των σακχάρων ως κύριο ή µοναδικό προϊόν. Τα κυριότερα γένη που ανήκουν στην οµάδα αυτή είναι τα: Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Bifidobacterium, Carnobacterium. Φωτογραφία από Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο βακτηρίων του γένους Lactobacillus sp. Τα βακτήρια αυτά δεν έχουν πορφυρίνες και κυτοχρώµατα και βέβαια δεν κάνουν φωσφορυλίωση µε µεταφορά ηλεκτρονίων. Παράγουν ενέργεια µόνο µε φωσφορυλίωση υποστρώµατος. Τα βακτήρια αυτά αναπτύσσονται και αναερόβια χωρίς όµως και να είναι τα περισσότερα ευαίσθητα στην παρουσία οξυγόνου και αναπτύσσονται τόσο παρουσία όσο και απουσία οξυγόνου (αναερόβια αεροανθεκτικά). Μερικά στελέχη µάλιστα προσλαµβάνουν οξυγόνο µέσω φλαβοπρωτεϊνών οξειδασών και παράγουν H 2 O 2 (τοξικό προϊόν για τα κύτταρα). Είναι γνωστό ότι τα περισσότερα είδη των βακτηρίων του γαλακτικού οξέος δεν διαθέτουν το ένζυµο 15

17 καταλάση. ιασπούν το H 2 O 2 µε τη βοήθεια εναλλακτικών ενζύµων, των υπεροξειδασών. Τα βακτήρια αυτά δεν συνθέτουν επίσης το ένζυµο οξειδάση. Τα οξυγαλακτικά βακτήρια παίρνουν την ενέργεια που χρειάζονται µέσω του µεταβολισµού των σακχάρων και συγγενών µορίων και έτσι περιορίζονται σε βιότοπους που υπάρχουν υδατάνθρακες. Έχουν συνήθως πολύ περιορισµένη βιοσυνθετική δυνατότητα και παρουσιάζουν πολλές θρεπτικές απαιτήσεις όταν καλλιεργούνται στο εργαστήριο, σε αµινοξέα, βιταµίνες, πουρίνες και πυριµιδίνες, γεγονός που πρέπει να αποτελεί προσαρµογή στα πλούσια σε θρεπτικά στοιχεία περιβάλλοντα που αναπτύσσονται. Οι φυσικοί τους βιότοποι είναι: 1) το γάλα και στα µέρη όπου το γάλα παράγεται και επεξεργάζεται (Lactobacillus brevis, L. bulgaricus, L. helveticus, L.casei, L. fermentum, Lactococcus lactis, L. diacetilactis) 2) φυτικοί ιστοί (Lactobacillus plantarum, L. delbrueckii, L. fermentum, Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis) 3) Εντερικός σωλήνας και βλεννογόνοι ανθρώπου και ζώων (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp., Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae). Τα οξυγαλακτικά βακτήρια διαθέτουν αρκετά συστήµατα µεταφοράς, έτσι ώστε να µπορούν να συσσωρεύουν θρεπτικά συστατικά από το περιβάλλον. Αυτά τα συστήµατα µεταφοράς απαντώνται στη κυτοπλασµατική µεµβράνη. Ένζυµα όπως οι ATPάσες µεταφέρουν εξωκυτταρικά τα Η+ µέσω της υδρόλυσης του µορίου του ATP. Με το τρόπο αυτό διατηρείται η συγκέντρωση των Η+ σε υψηλά επίπεδα ενδοκυτταρικά. ιαφορετικά η συνεχιζόµενη παραγωγή οξέος θα οδηγούσε στη µείωση του ph και ενδοκυτταρικά, εκτός από εξωκυτταρικά. Στον επόµενο πίνακα φαίνονται αντιπροσωπευτικά τρόφιµα τα οποία είναι προϊόντα ζύµωσης βακτηρίων του γαλακτικού οξέος. 16

18 Τρόφιµο Γάλα και γαλακτοκοµικά προϊόντα Σκληρά τυριά, χωρίς τρύπες Τυρί cottage και τυριά χωρίς ή µε ελάχιστες τρύπες (Edam) Βούτυρο, τυριά µε τρύπες (Gouda) Τυριά ελβετικού τύπου Γιαούρτι Ξυνόγαλα Κεφίρ Αλλα γαλακτοκοµικά προϊόντα Βακτήρια Lactococcus lactis ssp. cremoris sbs. lactis Lactococcus lactis ssp. cremoris sbs. Lactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris Lactococcus lactis ssp. cremoris, sbs. lactis, sbs. diacetylactis Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris Lactobacillus delbruekii spp. bulgaricus Lactobacillus helveticus Streptococcus salivarius spp. thermophilus, Lactobacillus delbruekii ssp. bulgaricus, Lactococcus lactis ssp. diacetylactis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens Lactobacillus brevis, Lb. buchneri, Lb. casei, Lb. fermentum, Lb. plantarum, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Lactococcus lactis Κρέατα Ηµι-συντηρηµένα Lactobacillus viridescens (αλλοίωση), Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gelindum, Carnobacterium divergens, C. piscicola (maltaromicus) Ζυµωµένα κρέατα Pediococcus acidilacti, P. pentosaceus (εµβολιάζεται σε ξερά λουκάνικα), Lactobacillus sakei, Lb. curvatus, Lb. farciminis (δεν εµβολιάζεται) Ψάρια µαριναρισµένα Lactobacillus alimentarius, Carnobacterium piscicola Ζυµωµένα λαχανικά (γενικά) Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lb. sakei, Lb. buchneri, Lb. fermentum Αγγούρια τουρσί Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus bavaricus, Lb. brevis, Lb. sakei, Lb. plantarum Ελιές Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus pentosus Σάλτσα σόγιας Tetragenococcus (Pediococcus) halophilus Κρασί Oenococcus oeni 17

19 Οµοζυµωτικά Ετεροζυµωτικά οξυγαλακτικά βακτήρια Τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος χωρίζονται σε δύο υποοµάδες ανάλογα µε τη φύση των προϊόντων που παράγονται κατά τη ζύµωση των σακχάρων: - οµοζυµωτικά βακτήρια - ετεροζυµωτικά βακτήρια Τα οµοζυµωτικά παράγουν ως µοναδικό προϊόν το γαλακτικό οξύ, ενώ τα ετεροζυµωτικά παράγουν εκτός από γαλακτικό οξύ και άλλα προϊόντα όπως η αιθανόλη, το CO 2 κ.α. Οι πιο γνωστές µεταβολικές οδοί στους µικροοργανισµούς είναι η γλυκόλυση και η βιοχηµική οδός των φωσφορο-πεντοζών, χωρίς βέβαια να αποκλείονται και εναλλακτικές µεταβολικές οδοί που προκύπτουν από αυτές. Τα οµοζυµωτικά βακτήρια χρησιµοποιούν κυρίως τη γλυκόλυση για την παραγωγή γαλακτικού οξέος ως τελικού προϊόντος. Τα ετεροζυµωτικά ακολουθούν άλλες µεταβολικές οδούς, όπως αυτή των φωσφορο-πεντοζών ως εναλλακτική για τα πρώτα στάδια της γλυκόλυσης. Οµοζυµωτική ζύµωση της γλυκόζης: C 6 H 12 O 6 2 CH 3 -CHOH-COOH Εναλλακτικοί µηχανισµοί της ετεροζυµωτικής ζύµωσης της γλυκόζης: C 6 H 12 O 6 CH 3 -CHOH-COOH + CH 3 COOH + CO 2 + 2H C 6 H 12 O 6 CH 3 -CHOH-COOH + CH 3 CH 2 OH + CO 2 C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2 C 6 H 12 O 6 CH 3 -CHOH-COOH + CH 3 COOH + HCOOH + 3H Στον επόµενο πίνακα φαίνεται η διαφοροποίηση ως προς τα προϊόντα της ζύµωσης των σακχάρων των κυριότερων γενών των βακτηρίων του γαλακτικού οξέος. Γένος Σχήµα κυττάρων Ζυµωτικός τύπος Streptococcus Κόκκοι σε αλυσίδες Οµοζυµωτικά Leuconostoc >> Ετεροζυµωτικά Pediococcus Κόκκοι σε τετράδες Οµοζυµωτικά Lactobacillus Βάκιλλοι συνήθως σε - Οµοζυµωτικά αλυσίδες - Ετεροζυµωτικά Enterococcus Κόκκοι σε αλυσίδες Οµοζυµωτικά Lactococcus >> >> 18

20 Οι βιοχηµικές οδοί των δύο ζυµωτικών τύπων σακχάρων που απαντώνται στα οξυγαλακτικά βακτήρια είναι οι ακόλουθοι: Η διαφοροποίηση στα προιόντα αυτών των δύο βιοχηµικών οδών οφείλεται στην παρουσία ή στην απουσία του ενζύµου αλδολάση, ενός από τα ένζυµα κλειδιά της γλυκόλυσης. Οι ετεροζυµωτικοί µικροοργανισµοί δεν διαθέτουν την αλδολάση και κατά συνέπεια δεν µπορούν να διασπάσουν τη διφωσφορική φρουκτόζη. Αντίθετα οξειδώνουν την 6-φωσφορική-γλυκόζη σε 6-φωσφορογλουκονικό οξύ και στη συνέχεια αυτό το ενδιάµεσο προιόν το µετατρέπουν σε φωσφορική γλυκεριναλδεύδη και ακετυλ-φωσφορικό µε τη βοήθεια του ενζύµου φωσφοκετολάση. Οι ετεροζυµωτικοί µικροοργανισµοί µετατρέπουν τη φωσφορική γλυκεριναλδεύδη σε γαλακτικό οξύ, µε την παραγωγή τελικά 1mol ATP. 19

21 Το ακετυλφωσφορικό δέχεται ηλεκτρόνια από το NADH που προέκυψε από την παραγωγή φωσφοροπεντοζών και µετατρέπεται σε αιθανόλη χωρίς την παραγωγή ATP. Φαίνεται λοιπόν ότι οι ετεροζυµωτικοί µικροοργανισµοί παράγουν 1mol ATP λιγότερο κατά την διάσπαση της γλυκόζης, από τους οµοζυµωτικούς. Η διαφορά αυτή δικαιολογεί το γεγονός ότι οι οµοζυµωτικοί µικροοργανισµοί παράγουν την διπλάσια ποσότητα βιοµάζας για την ίδια ποσότητα γλυκόζης. Ένας απλός τρόπος διαφοροποίησης των ετεροζυµωτικών µικροοργανισµών είναι η παραγωγή CO 2 στις εργαστηριακές καλλιέργειες (τα οµοζυµωτικά βακτήρια δεν παράγουν). Τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος έχουν τη δυνατότητα να µεταβολίζουν τη γαλακτόζη, ιδιότητα που δεν διαθέτουν τα περισσότερα βακτήρια που απαντώνται στα τρόφιµα. Αυτή η ιδιότητα µπορεί να θεωρηθεί ως προσαρµογή στον εντερικό σωλήνα των θηλαστικών, αφού το συγκεκριµένο σάκχαρο παράγεται µόνο από τα θηλαστικά και εκκρίνεται στο γάλα. Οι κύριες µεταβολικές οδοί της γαλακτόζης οδηγούν στην παραγωγή γαλακτικού οξέος ή γαλακτικού και αιθανόλης. Υπάρχουν όµως πολλές εναλλακτικές οδοί οι οποίες έχουν ως τελικά προϊόντα ενώσεις που προσδίδουν χαρακτηριστικά αρώµατα. Επίσης αυτές οι εναλλακτικές µεταβολικές οδοί προσδίδουν περισσότερα ενέργεια (ATP), η οποία χρησιµοποιείται για πιο γρήγορη αύξηση και παραγωγή βιοµάζας. Το οµοζυµωτικό είδος Lactococcus lactis (spp. diacetylactis), και κάποια από τα ετεροζυµωτικά είδη του γένους Leuconostoc, όπως π.χ. το Leuconostoc mesenteroides (sps. cremoris), µεταβολίζουν το κιτρικό οξύ. Το κιτρικό δεν χρησιµοποιείται ως πηγή ενέργειας, αλλά µεταβολίζεται παράλληλα µε την ζύµωση της γαλακτόζης. Κατά τον µεταβολισµό του κιτρικού παράγεται επιπλέον πυροσταφυλικό οξύ, από αυτό που απαιτείται για την οξείδωση του NADH, το οποίο µπορεί να µεταβολιστεί περαιτέρω σε τελικά προϊόντα όπως το οξικό οξύ, CO 2, ακετοίνη και διακετύλιο. Το διακετύλιο προσδίδει το χαρακτηριστικό άρωµα του βουτύρου. Τα βακτήρια εκείνα που δεν διαθέτουν το τελικό ένζυµο (αφυδρογονάση της αιθανόλης) για την µετατροπή της ακεταλδεύδης σε αιθανόλη, συσσωρεύουν ως τελικό προϊόν την ακεταλδεύδη. Τα πιο γνωστά είδη είναι το Lactococcus lactis spp. lactis, biovar. acetylactis, το Streptococcus thermophilus και το Lactococcus delbruekii spp. bulgaricus. Η ακεταλδεύδη προσδίδει το χαρακτηριστικό άρωµα του γιαουρτιού. 20

22 Gram + βακτήρια που σχηµατίζουν ενδοσπόριο Τα πιο γνωστά γένη βακτηρίων που σχηµατίζουν ενδοσπόριο είναι το γένος Bacillus και το γένος Clostridium. Στο γένος Bacillus περιλαµβάνονται κυρίως είδη υποχρεωτικά αερόβια. Εµφανίζουν οικονοµικό ενδιαφέρον, διότι κάποια προκαλούν αλλοιώσεις στα τρόφιµα και µερικά είναι παθογόνα του ανθρώπου. Αντίθετα τα στελέχη που περιλαµβάνονται στο γένος Clostridium είναι υποχρεωτικά αναερόβια και επίσης µεταξύ αυτών εντοπίζονται κάποια πολύ σοβαρά παθογόνα του ανθρώπου και των ζώων. Τα κύτταρα και στα δύο αυτά γένη είναι βάκιλλοι οι οποίοι παρουσιάζουν αυτόνοµη κίνηση και διαθέτουν περίτριχα µαστίγια. Ένα από τα πιο σηµαντικά χαρακτηριστικά (ταξινοµικό κριτήριο) είναι το σχήµα και η θέση του ενδοσπορίου µέσα στο κύτταρο. Κατά κανόνα σε κάθε βακτηριακό κύτταρο παράγεται ένα µόνο ενδοσπόριο, διότι ο σκοπός της δηµιουργίας του είναι η επιβίωση και όχι η αναπαραγωγή (εξαίρεση αποτελεί το Anaerobacter polyendosporous, το οποίο παράγει 5 ενδοσπόρια σε κάθε κύτταρο). Τα είδη του Bacillus παράγουν το ένζυµο καταλάση και τη δισµουτάση του υπεροξειδίου σε αντίθεση µε τα είδη του γένους Clostridium που δεν διαθέτουν το ένζυµο καταλάση και παράγουν σε ελάχιστες ποσότητες το δεύτερο ένζυµο. Για τον λόγο αυτό είναι και υποχρεωτικά αναερόβια επειδή δεν έχουν τα κατάλληλα ένζυµα για να διασπούν τα τοξικά παράγωγα του O 2, όπως το H 2 O 2 και το O - 2. Τα βακτήρια που ταξινοµούνται στο γένος Bacillus παρουσιάζουν φυλογενετική ανοµοιογένεια, αλλά ανιχνεύονται στους ίδιους οικολογικούς θώκους που είναι κυρίως το έδαφος. Ακόµη και τα είδη που είναι παθογόνα του ανθρώπου και των ζώων, είναι σαπρόφυτα του εδάφους και µολύνουν τους ξενιστές µόνο τυχαία. Εξ άλλου η ιδιότητα της δηµιουργίας ενδοσπορίου σχετίζεται µε τις συχνά αντίξοες συνθήκες θερµοκρασίας και θρεπτικών συστατικών που επικρατούν στο έδαφος. Η αποµόνωση σποριογόνων στελεχών του γένους Bacillus από το περιβάλλον µπορεί να γίνει σχετικά εύκολα. Το δείγµα από το οποίο θα γίνει η αποµόνωση (χώµα, τρόφιµα) εκτίθεται στους 80 o C για 10min και ενώ τα περισσότερα βακτηριακά κύτταρα καταστρέφονται, τα ενδοσπόρια επιβιώνουν. Στη συνέχεια γίνεται εµβολιασµός (γραµµική διασπορά) τρυβλίων Petri µε θρεπτικό υλικό και αερόβια επώαση. Οι αποικίες που θα εµφανιστούν ανήκουν σχεδόν αποκλειστικά στο γένος Bacillus. Τα στελέχη του γένους αυτού διασπούν τα σάκχαρα, οργανικά οξέα, αλκοόλες και συνήθως χρησιµοποιούν αµµωνιακά ιόντα ως πηγή αζώτου. Σχετικά λίγα στελέχη παρουσιάζουν απαιτήσεις σε βιταµίνες ή άλλους αυξητικούς παράγοντες. 21

23 Επίσης πολύ συχνά παράγουν εξωκυτταρικά υδρολυτικά ένζυµα τα οποία διασπούν πολυσακχαρίδια, νουκλεικά οξέα, λιπίδια. Πολλά στελέχη του γένους αυτού παράγουν αντιβιοτικά όπως το bacitracin, polymyxin, tyrocidin, gramicidin και circulin. Στις πιο πολλές περιπτώσεις στα στελέχη που παράγουν αντιβιοτικά, η παραγωγή του αντιβιοτικού συνδέεται µε την σποριογένεση. Το αντιβιοτικό παράγεται στη φάση στασιµότητας και στη συνέχεια ακολουθεί η σποριογένεση. Από τα πιο γνωστά παθογόνα είδη του γένους Bacillus είναι το Bacillus anthracis το παθογόνο αίτιο της ασθένειας του άνθρακα και στελέχη του Bacillus cereus τα οποία προκαλούν τροφική δηλητηρίαση, λόγω της εξωτοξίνης που παράγουν. Συνήθως βρίσκονται στο ρύζι και σε άλλες αµυλούχες τροφές. Τα κλοστρίδια δεν διαθέτουν κυτοχρώµατα και τον µηχανισµό της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, αλλά παράγουν ATP µόνο µε φωσφορυλίωση υποστρώµατος, χαρακτηριστικό τω αναερόβιων µικροοργανισµών. Πολλά κλοστρίδια ζυµώνουν τα σάκχαρα, και παράγουν ως κύριο τελικό προιόν το βουτυρικό οξύ. Επίσης κάποια παράγουν ακετόνη και βουτανόλη. Για αρκετά χρόνια η βιοµηχανική παραγωγή ακετόνης βουτανόλης στηρίζονταν στη ζύµωση από στελέχη του γένους Clostridium sp. Σήµερα όµως η παραγωγή αυτή γίνεται κυρίως χηµικά από τα παράγωγα του πετρελαίου. Κάποια στελέχη του Clostridium που παράγουν ακετόνη βουτανόλη, κάνουν και αζωτοδέσµευση. Το πιο γνωστό είναι το Clostridium pasteurianum το οποίο ευθύνεται για το µεγαλύτερο τµήµα της αναερόβιας αζωτοδέσµευσης στο έδαφος. Επίσης µία άλλη οµάδα κλοστριδίων παράγει οξέα και αλκοόλες, διασπώντας τη κυτταρίνη αναερόβια. Υπάρχει µεγάλο οικονοµικό ενδιαφέρον γιατί η παραγωγή της αιθανόλης από κυτταρίνη (φτηνή και άφθονη στη φύση), θα µπορούσε να βοηθήσει στη λύση του ενεργειακού προβλήµατος. Άλλα είδη του γένους αυτού ζυµώνουν αµινοξέα τα οποία βρίσκονται είτε µεµονωµένα, είτε σε ζεύγη, όπως η αλανίνη, κυστείνη, γλουταµινικό οξύ κ.α. Τα κύρια προιόντα αυτής της ζύµωσης είναι το οξικό οξύ, βουτυρικό, CO 2 και H 2. Πολλά από τα προιόντα της ζύµωσης των αµινοξέων είναι συστατικά µε έντονες οσµές και βέβαια η χαρακτηριστική οσµή της σήψης οφείλεται σε ενώσεις όπως το ισοβουτυρικό οξύ, το ισοβαλερικό, το καπροικό, το H 2 S, το µεθυλ-µερκαπτάνιο (από τα αµινοξέα µε θειούχες βάσεις), κανταβερίνη (από τη λυσίνη), πουτρεσκίνη (από την ορνιθίνη) και αµµωνία. Τα κλοστρίδια ανιχνεύονται κυρίως στο έδαφος, σε ανοξικούς θύλακες που δηµιουργούνται από τη κατανάλωση του οξυγόνου από προαιρετικά αερόβιους µικροοργανισµούς. Επίσης πολλά είδη βρίσκονται στο παχύ έντερο των θηλαστικών. 22

24 Κάποια από αυτά είναι παθογόνα του ανθρώπου κα τω ζώων. Χαρακτηριστικά είναι το Clostridium tetani που προκαλεί τέτανο, το Clostridium perfringens που προκαλεί γάγγραινα και το Clostridium botulinum, το παθολογικό αίτιο του βοτουλινισµού, µίας πολύ σοβαρής τροφογενούς ασθένειας. Όλα αυτά παράγουν τοξίνες διαφόρων ειδών. Η τοξίνη που παράγει το Clostridium botulinum θεωρείται η πιο ισχυρή τοξίνη που έχει αποµονωθεί. Οµάδα Gram + βακτηρίων µε υψηλή αναλογία βάσεων GC στο µόριο του DNA - Ακτινοµύκητες (Mycobacterium sp., Streptomyces sp., Noccardia sp.) - Κορυνοειδή (Corynebacterium sp., Brevobacterium sp., Arthrobacter sp.) - Βακτήρια του προπιονικού οξέος (Propionibacterium sp.) Βακτήρια του προπιονικού οξέος Κυριότερος εκπρόσωπος είναι το γένος Propionibacterium, το οποίο για πρώτη φορά αποµονώθηκε από το ελβετικό τυρί Emmental, από τη ζύµωση του οποίου παράγεται CO 2 το οποίο δηµιουργεί και τις χαρακτηριστικές τρύπες. Επίσης, η παραγωγή κατά τη ζύµωση του προπιονικού οξέος είναι κυρίως υπεύθυνη για το χαρακτηριστικό άρωµα του τυριού αυτού. Τα βακτήρια της οµάδας αυτής είναι Gram +, πλειοµορφικά, δεν σχηµατίζουν ενδοσπόριο, δεν παρουσιάζουν αυτόνοµη κίνηση και είναι αυστηρά αναερόβια. Ζυµώνουν το γαλακτικό οξύ, υδατάνθρακες, πολύ-υδροξυαλκοόλες και παράγουν προπιονικό οξύ, ηλεκτρικό οξύ και CO 2. Αυξάνονται σχετικά αργά και έχουν σύνθετες θρεπτικές απαιτήσεις. Τα βακτήρια αυτά ζυµώνουν το γαλακτικό οξύ (αναερόβια) σε προπιονικό οξύ. Το γαλακτικό οξύ είναι προιόν της ζύµωσης άλλων βακτηρίων (βακτήρια του γαλακτικού οξέος). Κάνουν δηλαδή µία «δευτερογενή ζύµωση». Στη βιοµηχανία παραγωγής του ελβετικού τυριού, η αρχική καλλιέργεια (το εµβόλιο) είναι ένας µικτός πληθυσµός οµοζυµωτικών στρεπτοκόκκων και λακτοβακίλλων µαζί µε βακτήρια του προπιονικού οξέος. Σε πρώτη φάση γίνεται η ζύµωση της γαλακτόζης σε γαλακτικό οξύ και δηµιουργείται το τυρόγαλα από τα οµοζυµωτικά βακτήρια. Στη συνέχεια µετά από την ξήρανση του τυρογάλακτος, αυξάνονται γρήγορα τα βακτήρια του προπιονικού οξέος και φθάνουν σε πληθυσµούς των /gr, όταν το τυρί φθάσει σε ηλικία 2 µηνών. Οι τρύπες του τυριού αυτού δηµιουργούνται από την απελευθέρωση CO 2 το οποίο διαχέεται µέσω του τυρογάλακτος και συγκεντρώνεται σε πιο αδύνατα σηµεία. 23

25 Είσοδος παθογόνων µικροοργανισµών στον ξενιστή Τα στάδια της παθογένεσης δηλαδή τα στάδια της εξέλιξης µίας παθογόνου κατάστασης που οφείλεται σε µικροοργανισµό είναι: 1. Είσοδος του παθογόνου µικροοργανισµού στον ξενιστή 2. Αποικισµός των ιστών του ξενιστή από το µικροοργανισµό 3. Χρήση διαφόρων στρατηγικών από το µικροοργανισµό που οδηγούν στην εµφάνιση µολυσµατικότητας. Είσοδος του παθογόνου µικροοργανισµού στον ξενιστή Ένας παθογόνος µικροοργανισµός για να µπορέσει να εισχωρήσει στους ιστούς του ξενιστή και να πολλαπλασιαστεί, χρειάζεται να περάσει από το δέρµα ή τους βλεννογόνους ή το εντερικό επιθήλιο, δηλαδή επιφάνειες οι οποίες συνήθως εµποδίζουν την είσοδο των µικροοργανισµών στους υπόλοιπους ιστούς. Η διέλευση γίνεται µέσα από πληγές ή αµυχές του δέρµατος. Οι περισσότερες µικροβιακές µολύνσεις ξεκινούν στους βλεννογόνους της αναπνευστικής, εντερικής ή ουρογεννητικής οδού. Τα βακτήρια και οι ιοί προκαλούν µόλυνση αφού προσκολληθούν στα επιθηλιακά κύτταρα. Η προσκόλληση αυτή παρουσιάζει αφενός εξειδίκευση ιστού, αφετέρου εξειδίκευση ξενιστή. Στην πρώτη περίπτωση ένας παθογόνος µικροοργανισµός προσκολλάται σε συγκεκριµένα επιθηλιακά κύτταρα. Για παράδειγµα το βακτήριο Neisseria gonorrhea (παθογόνο αίτιο της γονόρροιας), προσκολλάται πολύ πιο επιτυχηµένα στο ουρογεννητικό επιθήλιο. Στη δεύτερη περίπτωση ένας παθογόνος µικροοργανισµός ο οποίος προσκολλάται σε κάποια επιθηλιακά κύτταρα του ανθρώπου δεν προσκολλάται µε την ίδια επιτυχία στα αντίστοιχα κύτταρα ενός άλλου ζώου. Αρκετά παθογόνα βακτηριακά στελέχη διαθέτουν στην επιφάνειά τους ειδικά µακροµόρια τα οποία συνδέονται µε αντίστοιχους συµπληρωµατικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων του ξενιστή. Συχνά τα µακροµόρια αυτά είναι πολυσακχαρίδια και σχηµατίζουν ένα κολλώδες περίβληµα το έλυτρο. Το έλυτρο είναι σηµαντικό όχι µόνο για την προσκόλληση των βακτηριακών κυττάρων στα κύτταρα του ξενιστή, αλλά και για την σύνδεση µεταξύ των βακτηριακών κυττάρων. 24

26 Φωτογραφία από ηλεκτρονικό µικροσκόπιο α) Κύτταρα του Vibrio cholerae (χωρίς έλυτρο), σε προσπάθεια προσκόλλησης σε επιθηλιακό ιστό β) Κύτταρα του Escherichia coli (ελυτροφόρα) σε αντίστοιχη προσπάθεια Ένα άλλο µορφολογικό χαρακτηριστικό που βοηθάει στην προσκόλληση των παθογόνων βακτηρίων στα κύτταρα του ξενιστή, είναι η παρουσία των ινιδίων. Από τα πιο εκτενώς µελετηµένα είναι τα ινίδια τύπου Ι που ανιχνεύονται στα εντεροβακτήρια (Escherichia sp., Klebsiella sp., Salmonella sp., Shigella sp.).τα ινίδια αυτά έχουν µήκος 0.2-1µm και πλάτος 7nm και κατανέµονται οµοιόµορφα σε όλη την επιφάνεια του κυττάρου. Τα περισσότερα στελέχη του E.coli δεν είναι παθογόνα, αλλά αποτελούν µέλη της φυσικής χλωρίδας του παχέος εντέρου όπου συχνά εγκαθιστούν µακροχρόνιες συµβιωτικές σχέσεις µε τον ξενιστή. Μερικά όµως αποικίζουν το λεπτό έντερο και προκαλούν διάρροιες (εντεροπαθογόνα). Τα στελέχη αυτά διαθέτουν ειδικά ινίδια πρωτεινικής φύσεως τα οποία ευθύνονται για την εξειδικευµένη αυτή προσκόλληση στο βλεννογόνο του εντέρου. Ονοµάζονται µάλιστα αντιγόνα αποικισµού (colonization factors antigens). Το πιο σοβαρό παθογόνο µεταξύ αυτών είναι το στέλεχος Ο157:Η7 το οποίο προκαλεί αιµορραγική κολίτιδα. Μετά από την προσκόλληση των κυττάρων του παθογόνου µικροοργανισµού στα επιθηλιακά κύτταρα του ξενιστή, το επόµενο βήµα είναι η είσοδος µέσω του επιθηλίου στο εσωτερικό του οργανισµού. Στα σηµεία εισόδου µπορεί να υπάρχουν πληγές ή µικρές αµυχές. Επίσης είναι δυνατόν να διευκολύνεται η αύξηση του παθογόνου µικροοργανισµού στο βλεννογόνο, λόγω της απουσίας της φυσικής χλωρίδας µετά από επίδραση κάποιου αντιµικροβιακού παράγοντα π.χ. αντιβιοτική ουσία. 25

27 Είναι δυνατόν επίσης η αύξηση του µικροοργανισµού να έχει συντελεστεί σε αποµακρυσµένο σηµείο του ξενιστή και να έχει µεταφερθεί µέσω της λέµφου ή του αίµατος. Αποικισµός των ιστών του ξενιστή και αύξηση του µικροοργανισµού Ο αποικισµός του ξενιστή από το µικροοργανισµό συντελείται αφού ο µικροοργανισµός έχει προσδεθεί σε ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια του ιστού και έχει ξεπεράσει την µη-ειδική και την ειδική άµυνα του ξενιστή. Στις περισσότερες περιπτώσεις δεν αρκεί η αρχική ποσότητα του παθογόνου µικροοργανισµού, αλλά απαιτείται η αύξησή του πάνω στον ιστό. Αυτό σηµαίνει ότι πρέπει να υπάρχουν τα κατάλληλα θρεπτικά συστατικά και οι ευνοϊκές περιβαλλοντικές συνθήκες (θ,ph). Το θρεπτικό περιβάλλον του ξενιστή δηµιουργεί την εντύπωση ότι περιέχει πλήθος θρεπτικών συστατικών. Στην πραγµατικότητα όµως τα διαλυµένα θρεπτικά συστατικά που µπορεί να εκµεταλλευτεί ο µικροοργανισµός όπως σάκχαρα, αµινοξέα κ.α. µπορεί να µη βρίσκονται σε αφθονία και τότε είναι αναγκασµένος να διασπάσει πολύπλοκες ενώσεις όπως το γλυκογόνο. Επίσης δεν είναι πάντοτε διαθέσιµοι οι αυξητικοί παράγοντες που χρειάζεται για την ανάπτυξή του σε όλους τους ιστούς (π.χ. βιταµίνες). Παράδειγµα αποτελεί το παθογόνο βακτήριο Brucella abortus, το οποίο αυξάνεται στον πλακούντα των βοοειδών και προκαλεί αποβολή του εµβρύου. Η ανάπτυξή του στον πλακούντα ευνοείται από την ύπαρξη της ερυθριτόλης, η οποία αποτελεί αυξητικό παράγοντα για το βακτήριο αυτό. Αντίστοιχα τα ίδια ισχύουν και µε την παρουσία ιχνοστοιχείων για την αύξηση του µικροοργανισµού όπως π.χ. ο σίδηρος. Στους ζωικούς ιστούς οι πρωτείνες τρανσφερίνη (transferrin) και λακτοφερίνη (lactoferrin) συνδέονται µε ιόντα σιδήρου και τα µεταφέρουν στα κύτταρα. Οι πρωτείνες αυτές προσδένονται τόσο ισχυρά µε τα ιόντα σιδήρου που οι µικροοργανισµοί δεν µπορούν να προµηθευτούν σίδηρο. Εάν όµως για κάποιο λόγο µεταφερθεί σε ένα ζώο διαλυτό άλας του σιδήρου τότε αυξάνεται απότοµα η αύξηση των παθογόνων µικροοργανισµών. Υπάρχουν όµως κάποια εντεροπαθογόνα στελέχη του Escherichia coli τα οποία διαθέτουν χηλικούς παράγοντες του σιδήρου. Οι παράγοντες αυτοί ονοµάζονται σιδηροφόρα και δεσµεύουν σίδηρο από το περιβάλλον. Μερικοί µάλιστα εµφανίζουν τόσο ισχυρή δράση, ώστε µπορούν να αποµακρύνουν ακόµα και τα ιόντα σιδήρου που είναι συνδεδεµένα µε την τρανσφερίνη. Η σύνθεση αυτών των παραγόντων κωδικοποιείται από γονίδια που βρίσκονται στο πλασµίδιο colv. Μετά από την αρχική είσοδο του µικροοργανισµού στον ξενιστή, ο παθογόνος µικροοργανισµός είτε παραµένει εντοπισµένος στο σηµείο της µόλυνσης και 26

28 αυξάνεται δηµιουργώντας µία τοπική φλεγµονή, οίδηµα, ή τα χαρακτηριστικά αποστήµατα που εµφανίζει το Staphylococcus aureus. Υπάρχει όµως και η περίπτωση όπου οι µικροοργανισµοί περνούν µέσα από τα αιµοφόρα αγγεία και µέσω του αίµατος µεταφέρονται σε όλα τα σηµεία του σώµατος και ιδιαίτερα στο συκώτι και στον σπλήνα. Αντίστοιχα το ίδιο µπορεί να συµβεί και µέσω της λέµφου. Το γεγονός αυτό προκαλεί συστηµατική µόλυνση, ο µικροοργανισµός ανιχνεύεται σε πολύ µεγάλους αριθµούς στους ιστούς και στο αίµα. Οι καταστάσεις όµως αυτές είναι πολύ σπάνιες. Παράγοντες µολυσµατικότητας Αρκετοί παθογόνοι µικροοργανισµοί εκκρίνουν εξωκυτταρικά διάφορες πρωτείνες οι οποίες διευκολύνουν την εξάπλωση των µικροοργανισµών και την εµφάνιση των συµπτωµάτων της νόσου. Ένα τέτοιο παράδειγµα είναι το ένζυµο υαλουρονιδάση το οποίο διασπά το υαλουρονικό οξύ, ένα πολυσακχαρίδιο που λειτουργεί µεταξύ των ιστών ως συνδετικό και σταθεροποιητικό όπως δηλαδή το τσιµέντο στα οικοδοµικά υλικά. Το ένζυµο αυτό εκκρίνεται από διάφορα στελέχη των στρεπτοκόκκων, σταφυλοκόκκων, πνευµονιοκόκκων και κάποια κλοστρίδια. Η παραγωγή ενός τέτοιου ενζύµου βοηθά στην διασπορά του παθογόνου µικροοργανισµού στο σώµα του ξενιστή. Οι στρεπτόκοκκοι και οι σταφυλόκοκκοι είναι από τους µικροοργανισµούς που παράγουν µια πολύ µεγάλη ποικιλία από πρωτεάσες, νουκλεάσες, λιπάσες, ένζυµα δηλαδή τα οποία διασπούν πρωτείνες, νουκλεικά οξέα, λιπίδια. Τα στελέχη του γένους Clostridium που προκαλούν γάγγραινα εκκρίνουν τη κολαγενάση (ή κ-τοξίνη), ένα ένζυµο που διασπά το δίκτυο του κολλαγόνου το οποίο συγκρατεί τους ιστούς. Με τον τρόπο αυτό διασπείρονται στο σώµα του ξενιστή. Στο σηµείο που γίνεται η µόλυνση από ένα παθογόνο µικροοργανισµό, συνήθως ο ξενιστής δηµιουργεί ένα ινώδες δίκτυο, το οποίο εµποδίζει την εξάπλωση του µικροοργανισµού. Υπάρχουν όµως µικροοργανισµοί όπως το Streptococcus pyogenes, οι οποίοι παράγουν ένζυµα τα οποία διασπούν αυτό το δίκτυο (στρεπτοκινάση). Έχουµε ήδη αναφέρει την περίπτωση του Staphylococcus aureus όπου εκεί συµβαίνει το αντίθετο, δηλαδή ο µικροοργανισµός παράγει ένα ένζυµο την αγλουτινάση (coagulase) το οποίο επάγει τη δηµιουργία ινώδους δικτύου. Στην περίπτωση αυτή, το δίκτυο συγκρατεί εντοπισµένο τον παθογόνο µικροοργανισµό αλλά συγχρόνως τον προφυλάσσει και από την δράση των µακροφάγων του αίµατος. Επίσης πολλοί παθογόνοι µικροοργανισµοί εκκρίνουν πρωτείνες οι οποίες προσβάλλουν τη κυτοπλασµατική µεµβράνη των κυττάρων του ξενιστή και 27

29 προκαλούν κυτταρικό θάνατο. Η δράση αυτών τω τοξινών εντοπίζεται εύκολα στα κύτταρα του αίµατος (ερυθροκύτταρα) και για τον λόγο αυτό ονοµάζονται αιµολυσίνες. (Εργαστηριακή δοκιµή σε τρυβλία µε θρετπικό υλικό blood agar). Οι τοξίνες αυτές δρούν και σε άλλα κύτταρα, εκτός από τα ερυθροκύτταρα. Κάποιες από τις αιµολυσίνες είναι ένζυµα που προσβάλλουν τα φωσφολιπίδια της κυτοπλασµατικής µεµβράνης. Η ανίχνευση αυτών των ενζύµων γίνεται µε την δοκιµή της λεκιθίνης. ηλαδή χρησιµοποιείται ως υπόστρωµα το φωσφολιπίδιο λεκιθίνη και ελέγχεται κατά πόσο διασπάται από τον µικροοργανισµό. Για τον λόγο αυτό τα ένζυµα αυτά ονοµάζονται λεκιθινάσες ή φωσφολιπάσες. Είναι γνωστό ότι η δοµή της κυτοπλασµατικής µεµβράνης µοιάζει πολύ στα προκαρυωτικά και στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Τα ένζυµα αυτά συνεπώς θα προσβάλλουν και τα βακτηριακά κύτταρα, καταστρέφοντας τις κυτοπλασµατικές τους µεµβράνες. Υπάρχουν όµως αιµολυσίνες, όπως η στρεπτολυσίνη Ο (παράγεται από στρεπτοκόκκους), η οποία επιδρά στις στερόλες της κυτταρικής µεµβράνης του ξενιστή. Οι λευκοσιδίνες είναι ένζυµα τα οποία προκαλούν τη λύση των λευκών αιµοσφαιρίων εξειδικευµένα, και έτσι µειώνουν την άµυνα του ξενιστή. Τοξίνες - Εξωτοξίνες Τα συµπτώµατα µίας ασθένειας σπάνια οφείλονται απλά στην παρουσία µεγάλου αριθµού µικροβιακών κυττάρων. Υπάρχει πάντα η περίπτωση απόφραξης αιµοφόρων αγγείων ή της διόδου του αέρα στους πνεύµονες από µεγάλες ποσότητες µικροοργανισµών, αλλά σπάνια εντοπίζονται τέτοια φαινόµενα. Αντίθετα οι παθογόνοι µικροοργανισµοί παράγουν πιο συχνά τοξίνες οι οποίες ευθύνονται και για τα συµπτώµατα στον ξενιστή. Οι τοξίνες που εκκρίνονται εξωκυτταρικά από τον µικροοργανισµό, ονοµάζονται εξωτοξίνες. Οι ενώσεις αυτές µπορούν να µετακινηθούν από το σηµείο της µόλυνσης σε πολύ διαφορετικά µέρη του σώµατος και δηµιουργούν βλάβες µακριά από το σηµείο που εντοπίζεται η αύξηση του παθογόνου µικροοργανισµού. Από τις πιο καλά µελετηµένες τοξίνες είναι η τοξίνη της διφθερίτιδας, η οποία παράγεται από το Corynebacterium diphtheriae, το παθογόνο αίτιο της διφθερίτιδας. Η δραστικότητα της τοξίνης αυτής διαφέρει στα διάφορα είδη ζώων π.χ. τα ποντίκια είναι ανθεκτικά, ενώ ο άνθρωπος, το κουνέλι, το ινδικό χοιρίδιο, τα πτηνά είναι ευαίσθητα. Η τοξίνη είναι αρκετά ισχυρή, δηλαδή ένα γραµµοµόριο τοξίνης είναι αρκετό να θανατώσει ένα κύτταρο. Η τοξίνη αυτή προσδένεται µη αντιστρεπτά µε το κύτταρο, και σε λίγες ώρες το κύτταρο αδυνατεί να κάνει οποιαδήποτε µορφής 28