"Φυσιολογικοί, τεχνολογικοί και προβιοτικοί χαρακτήρες ζυµών που αποµονώθηκαν από κόπρανα βρεφών και παραδοσιακό τυρί Φέτα"

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣ/ΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ "Φυσιολογικοί, τεχνολογικοί και προβιοτικοί χαρακτήρες ζυµών που αποµονώθηκαν από κόπρανα βρεφών και παραδοσιακό τυρί Φέτα" Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΕΥ ΟΞΙΟΣ Ι. ΨΩΜΑΣ Γεωπόνος-Επιστήµονας Τροφίµων ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2004

2 Πρόλογος Η παρούσα εργασία πραγµατοποιήθηκε στο µεγαλύτερο µέρος της στο εργαστήριο Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίµων του Τµήµατος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. Τα µέρη της εργασίας που αφορούσαν την αφοµοίωση της χοληστερόλης και τη διερεύνηση της αντιµικροβιακής δράσης πραγµατοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Υγιεινής Τροφίµων του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. Επιπρόσθετα η ταυτοποίηση των στελεχών µε µεθόδους Μοριακής Βιολογίας πραγµατοποιήθηκε στο Istituto per la Qualita e le Tecnologie Agroalimentari, Veneto Agricoltura, Thiene, Italy. Θεωρώ πρωταρχικό καθήκον να εκφράσω τις θερµότερες και ειλικρινείς ευχαριστίες µου στους καθηγητές και δασκάλους µου κ. κ. Νίκο Τζανετάκη και Ευανθία Λιτοπούλου-Τζανετάκη, για την επίβλεψη, την α- µέριστη συµπαράσταση τους, τις συµβουλές και την εποικοδοµητική κριτική τους καθ όλη τη διάρκεια της µελέτης αυτής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερµά τον οµότιµο καθηγητή του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. και της Κτηνιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Davis, California, USA κ. Κωνσταντίνο Γενηγιώργη για τις συµβουλές του, την καθοδήγηση του καθώς και την ευγενική παραχώρηση του Εργαστηρίου Υγιεινής Τροφίµων του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. για τη διεξαγωγή µέρους της παρούσας διατριβής. Ευχαριστώ τον επίκουρο καθηγητή του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. κ. ηµήτριο Φλετούρη όχι µόνο για την καθοδήγησή του στον πειραµατισµό που αφορούσε την αφοµοίωση της χοληστερόλης αλλά και για τη συµπαράστασή του σε όλη τη διάρκεια της διατριβής. Ευχαριστώ πολύ τα µέλη της εξεταστικής επιτροπής κ.κ. Καλογρίδου-Βασιλειάδου έσποινα, Κοτζεκίδου-Ρουκά Παρθένα, καθηγήτριες του Τµήµατος Γεωπονίας του Α.Π.Θ., τους κ.κ. Κοΐδη Παύλο, καθηγητή του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. και τον κ. Σούλτο Νικόλαο, επίκουρο 2

3 καθηγητή του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. για τις υποδείξεις και τις διορθώσεις τους. Θερµές ευχαριστίες επίσης εκφράζω στην Dr. A. Lombardi για τη δυνατότητα που µου προσέφερε να εκπονήσω τµήµα της διατριβής στο Istituto per la Qualita e le Tecnologie Agroalimentari, Veneto Agricoltura, Thiene, Italy και στον φίλο µου Dr. Christian Andrighetto, για την καθοδήγηση και τη βοήθεια του στη διεξαγωγή της ταυτοποίησης των στελεχών µε τις µεθόδους της Μοριακής Βιολογίας. Επίσης ευχαριστώ την κ. Χαριτωνίδου Ευγενία, µέλος του εργαστηρίου Yγιεινής και Mικροβιολογίας τροφίµων για τη βοήθειά της. Πολλές ευχαριστίες οφείλω στον φίλο µου Κώστα Γιαννακού, µέλος Ε.Τ.Ε.Π. του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. για την πολύτιµη βοήθειά του στην παρουσίαση του κειµένου της διατριβής. Τέλος ευχαριστώ όλους όσους µε βοήθησαν µε κάθε τρόπο στην ολοκλήρωση αυτής της διατριβής. 3

4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι ζύµες συνιστούν µια οµάδα µικροοργανισµών ιδιαίτερα σηµαντική για τη Βιοµηχανία των τροφίµων. Είναι µονοκύτταροι µύκητες, και διακρίνονται, εδώ και πολλά χρόνια, για τις ζυµωτικές τους ικανότητες. Χρησιµοποιούνται για την παραγωγή αιθανόλης και διοξειδίου του άνθρακα (µπύρα, κρασί, προϊόντα απόσταξης και ψω- µί). Σήµερα εξετάζεται η δυνατότητα αξιοποίησης των ζυµών για την παραγωγή τροφίµων µε βελτιωµένη θρεπτική αξία και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά καθώς επίσης και µε ευεργετικές επιδράσεις για την υγεία του ανθρώπου. Τα τελευταία χρόνια οι ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία του ανθρώπου ενός τροφίµου στο οποίο έχουν προστεθεί ζωντανοί µικροοργανισµοί αποτελούν αντικείµενο επισταµένης έρευνας. Οι συγκεκριµένοι µικροοργανισµοί σύµφωνα µε τους οργανισµούς FAO-WHO χαρακτηρίζονται ως προβιοτικά και ορίζονται ως "ζωντανοί µικροοργανισµοί οι οποίοι όταν χορηγούνται σε κατάλληλες ποσότητες βελτιώνουν την υγεία του ξενιστή". Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η αποµόνωση στελεχών ζυµών από κόπρανα βρεφών και η µελέτη στελεχών από παραδοσιακό τυρί Φέτα και ο έ- λεγχος στη συνέχεια των πιθανών προβιοτικών ιδιοτήτων τους ώστε να καταστεί δυνατή η πιθανή προσθήκη τους σε ζυµωµένο γαλακτοκοµικό προϊόν. Αποµονώθηκαν πέντε στελέχη ζυµών ως Saccharomyces cerevisiae, δεκατέσσερα στελέχη ως Candida albicans, δύο στελέχη ως Kluyveromyces marxianus, δύο ως Kluyveromyces lactis, ένα ως Debaryomyces hansenii, δύο ως Pichia farinosa, δύο ως Torulapora delbrueckii, δύο ως Isaathenkia orientalis και δύο ως Candida parapsilosis. Τα στελέχη ταυτοποιήθηκαν µε τη χρήση φαινοτυπικών µεθόδων καθώς επίσης και µε µεθόδους της µοριακής Βιολογίας ό- πως η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης τυχαία µεγενθυµένου πολυµορφικού DNA (RAPD-PCR), και η ανάλυση µε ένζυµα περιορισµού του µιτοχονδριακού DNA (mt-dna restriction analysis). Μεταξύ των µεθόδων διαπιστώθηκε συµφωνία στα αποτελέσµατα της ταυτοποίησης µε εξαίρεση τη µέθοδο της 4

5 ανάλυσης µε ένζυµα περιορισµού του µιτοχονδριακού DNA (mt-dna restriction analysis) µε την οποία δεν ταυτοποιήθηκε το σύνολο των στελεχών σε επίπεδο είδους αλλά ήταν ιδιαίτερα αποτελεσµατική για την ταυτοποίηση σε επίπεδο στελέχους των ζυµών του είδους Saccharomyces cerevisiae. Για την επιλογή των στελεχών εξετάστηκε η δυνατότητα ανάπτυξης τους σε θερµοκρασίες 25, 37 και 42 ο C, η ικανότητα ανάπτυξης τους σε διαφορετικές τιµές ph (1,0, 2,0, 3,0 και 5,0) και χολικών αλάτων (0,1 έως 1%) καθώς και η πιθανή αντιµικροβιακή τους δράση σε παθογόνους µικροοργανισµούς των ειδών Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus και Yersinia enterocolitica. εκαεννέα στελέχη ζυµών που επιλέχθηκαν µετά από την ολοκλήρωση των προκαταρτικών δοκιµών εξετάστηκαν στη συνέχεια για τις προβιοτικές, τεχνολογικές και βιοτεχνολογικές τους ιδιότητες. Πιο συγκεκριµένα, εξετάστηκαν η αντοχή των στελεχών σε ανθρώπινο γαστρικό υγρό και σε συγκεντρώσεις χολικών αλάτων 0,1, 0,3 και 0,5%, η αντιµικροβιακή τους δράση, η δυνατότητα αφοµοίωσης της χοληστερόλης και τα ενζυµικά χαρακτηριστικά των στελεχών. Μετά από τις παραπάνω δοκιµές διαπιστώθηκε ότι τρία στελέχη εκτός της αντοχής τους σε ανθρώπινο γαστρικό υγρό και σε χολικά άλατα εµφάνιζαν αντιµικροβιακή δράση και αφοµοίωναν το µεγαλύτερο ποσοστό χοληστερόλης του θρεπτικού υποστρώµατος. Τα δύο στελέχη είχαν αποµονωθεί από κόπρανα βρεφών και το ένα άνηκε στο είδος Saccharomyces cerevisiae (KK1) ενώ το άλλο στο είδος Ιssatchenkia orientalis (KK5Y.1). To τρίτο στέλεχος προερχόταν από παραδοσιακό τυρί Φέτα και άνηκε στο είδος Saccharomyces cerevisiae (832). Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης καθιστούν πιθανή τη χρησιµοποίηση των παραπάνω τριών στελεχών ζυµών ως προβιοτικών είτε ως καλλιέργεια εκκίνησης είτε ως συγκαλλιέργεια ή δευτερεύουσα καλλιέργεια σε ένα ζυ- µωµένο γαλακτοκοµικό προϊόν. 5

6 SUMMARY Yeasts constitute a group of microorganisms of great importance to the food industry. Yeasts are unicellular fungi and they are classified according to their fermentation properties. They are used for ethanol and carbon dioxide production (beer, wine, distillation products and bread). Nowadays the potential use of yeasts for the production of foods with enhanched nutritional and organoleptic characteristics along with beneficial health effects is under research. Furthermore the beneficial effects of a food in which live microorganisms are added, are under investigation. These microorganisms according to FAO-WHO are characterized as "probiotics" and are described as "live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host". The aim of the present study was to isolate yeast strains from the infant feces and the traditional Greek cheese Feta and to evaluate them for their possible probiotics characteristics so as to use them as dietary adjuncts. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Debaryomyces hansenii, Pichia farinosa, Torulaspora delbrueckii, Isaatchenkia orientalis and Candida parapsilosis were isolated and identified with phenotypic methods coupled with molecular biology methods namely randomly amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) and mitochondrial DNA restriction analysis (mt-dna restriction analysis). There was good agreement with the results of all methods with the exception of the mt-dna restriction analysis method in which not all of the strains were identified down to the species level. Nevertheless this method 6

7 was quite successful in the identification at the species level of Saccharomyces cerevisiae. For the selection of the strains, the ability of the yeasts to grow at various temperatures 25 o C, 37 o C and 42 o C ph, values (1,0, 2,0, 3,0 and 5,0) and bile acid concentrations (0,1 up to 1,0%) were examined. Futhermore the antimicrobial activity of the yeast strains against the pathogens Salmonella typhimurium var Copenhagen, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus NCTC 6571, Yersinia enterocolitica 0:9/4360 and Candida albicans was tested. Nineteen yeast strains selected after the completion of the preliminary tests were additionally examined for their probiotic, technological and biotechnological properties: In vitro survival in gastric juice, bile tolerance (0,1, 0,3 and 0,5% bile), cholesterol assimilation from culture media and enzymatic activity, were all examined. It was quite evident from the results that three strains besides their tolerance to human gastric juice and bile acids, exhibited antimicrobial activity and assimilated cholesterol (> 83,4%) from the culture media. Two of these strains were isolated from infant feces (Saccharomyces cerevisiae KK1 and Isaatchenkia orientalis KK5.Y.1) and one from traditional Greek cheese Feta (Saccharomyces cerevisiae). The results of the present study suggest the potential use of these three yeast strains as probiotics either as starter cultures or co-cultures in a fermented dairy products. 7

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 2 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 4 SUMMARY 6 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Οικοσύστηµα ζυµών τροφίµων Ζύµες-µορφολογία κυττάρου Ζύµες και τρόφιµα Μέθοδοι αρίθµησης και ταυτοποίησης ζυµών Αρίθµηση ζυµών Ταυτοποίηση µε φαινοτυπικές και βιοχηµικές µεθόδους Ταυτοποίηση µε το σύστηµα ταυτοποίησης ID 32C _ Ταυτοποίηση µε µεθόδους µοριακής βιολογίας Ζύµες και προβιοτικά Προβιοτικοί µικροοργανισµοί Κριτήρια επιλογής προβιοτικών στελεχών Θετικές επιδράσεις στην υγεία του ξενιστή Εφαρµογές των ζυµών ως προβιοτικά Αλληλεπιδράσεις ζυµών-βακτηρίων Αλληλεπιδράσεις ζυµών-βακτηρίων Αλληλεπιδράσεις ζυµών-βακτηρίων στο νωπό και στο παστεριωµένο γάλα Αλληλεπιδράσεις ζυµών-βακτηρίων σε ζυµωµένα προϊόντα γάλακτος Acidophilus-yeast milk Κεφίρ Θεραπευτικές ιδιότητες κεφίρ Κουµίς Θεραπευτικές ιδιότητες κουµίς 80 8

9 3. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Αποµόνωση και επιλογή στελεχών είγµατα Στελέχη Αποµόνωση στελεχών οκιµές επιλογής στελεχών Ανάπτυξη σε διαφορετικές θερµοκρασίες Ζύµωση µαλτόζης Ανάπτυξη σε διαφορετικές τιµές ph 86 Ανάπτυξη σε διαφορετικές συγκεκτρώσεις χολικών αλάτων _ Έλεγχος αντιµικροβιακής δράσης Ταυτοποίηση στελεχών Στελέχη Ταυτοποίηση στελεχών µε φαινοτυπικά κριτήρια και µεθόδους Σύστηµα ταυτοποίησης ID 32C Ζύµωση γλυκόζης Έλεγχος παραγωγής χλαµυδοσπορίων Έλεγχος σπορογονίας Ταυτοποίηση στελεχών µε την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (RAPD-PCR) και την ανάλυση περιορισµού του µιτοχονδριακού DNA (mt-dna restriction analysis) Μέθοδος RAPD-PCR Μέθοδος ανάλυσης περιορισµού του µιτοχονδριακού DNA Προβιοτικές και τεχνολογικές ιδιότητες επιλεγµένων στελεχών Στελέχη Αντοχή των ζυµών σε ανθρώπινο γαστρικό υγρό Αντοχή των ζυµών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις χολικών αλάτων 99 9

10 4.3.4 ιερεύνηση του χρόνου παραγωγής των αντιµικροβιακών ουσιών των ζυµών Αφοµοίωση της χοληστερόλης από τις ζύµες Ενζυµικά χαρακτηριστικά των ζυµών ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αποµόνωση και επιλογή στελεχών Αποµόνωση στελεχών οκιµές επιλογής στελεχών Ανάπτυξη σε διαφορετικές θερµοκρασίες Ζύµωση της µαλτόζης Ανάπτυξη σε διαφορετικές τιµές ph Ανάπτυξη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις 113 χολικών αλάτων Έλεγχος αντιµικροβιακής δράσης Ταυτοποίηση στελεχών Ταυτοποίηση µε φαινοτυπικά κριτήρια ή µεθόδους Σύστηµα ταυτοποίησης ID 32C Ζύµωση γλυκόζης Έλεγχος σχηµατισµού χλαµυδοσπορίων Έλεγχος σπορογονίας Ταυτοποίηση στελεχών µε την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (RAPD-PCR) και την ανάλυση περιορισµού του µιτοχονδριακού DNA (mt- DNA restriction analysis) Μέθοδος RAPD-PCR Μέθοδος ανάλυσης περιορισµού mt-dna Προβιοτικές και τεχνολογικές ιδιότητες επιλεγµένων στελεχών Αντοχή των ζυµών σε ανθρώπινο γαστρικό υγρό Αντοχή των ζυµών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις χολικών αλάτων ιερεύνηση του χρόνου παραγωγής των αντιµικροβιακών ουσιών των ζυµών Αφοµοίωση της χοληστερόλης από τις ζύµες Ενζυµικά χαρακτηριστικά των ζυµών

11 6. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Αποµόνωση και επιλογή στελεχών Ταυτοποίηση στελεχών Προβιοτικές και τεχνολογικές ιδιότητες επιλεγµένων στελεχών ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο άνθρωπος σήµερα ζει κάτω από δύσκολες συνθήκες και η διατροφή του βασίζεται στο έτοιµο φαγητό. Aνθυγιεινές δίαιτες πλούσιες σε λίπος, αλκοόλ και χηµικές ουσίες καθώς και πλήθος επεξεργασµένων τροφίµων που κυκλοφορούν στην αγορά σε συνδυασµό και µε τον σύγχρονο τρόπο ζωής, επηρεάζουν αρνητικά την ισορροπία ανάµεσα στους ωφέλι- µους και µη µικροοργανισµούς του γαστρεντερικού σωλήνα (Shih, 2003). Επιπλέον, οι ηλικιωµένοι άνθρωποι εµφανίζουν µειωµένη ανοσία στο επιθήλιο του εντέρου και καθίστανται έτσι ευάλωτοι στις λοιµώξεις. Οι τελευταίες ενώ παλαιότερα εκδηλώνονταν µε ήπια συµπτώµατα και αντιµετωπίζονταν εύκολα µε τη χορήγηση αντιβιοτικών ουσιών τώρα εµφανίζονται ως απειλητικές για την υγεία του ανθρώπου (λοίµωξη από Clostridium difficile, λοιµώξεις από Staphylococcus aureus ή εντεροκόκκους). Παρατηρείται, επίσης έξαρση τροφοδηλητηριάσεων από µικροοργανισµούς ιδιαίτερα επικίνδυνους όπως Campylobacter spp. και Escherichia coli. Επιπλέον, η ιδιαίτερα αυξανόµενη ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικές ουσίες δηµιουργεί σοβαρότατο πρόβληµα στην αντιµετώπιση λοιµώξεων που αντιµετωπίζονταν µε ευκολία. Για την αντιµετώπιση των παραπάνω προβληµάτων η χρησιµοποίηση προβιοτικών καλλιεργειών έδωσε ενθαρρυντικά αποτελέσµατα. Η θεωρία των "προβιοτικών" αναπτύχθηκε στις αρχές του 20 ου αιώνα µε το Ρώσο επιστήµονα βραβευµένο µε το βραβείο Nobel, Ellie Metchnikoff να δηλώνει "ότι η µακρά και µε υγεία ζωή των Βουλγάρων χωρικών οφείλεται στην κατανάλωση ζυµωµένων γαλακτοκοµικών προϊόντων", πιστεύοντας ότι η κατανάλωση ζυµωτικών βακίλλων επηρέαζε θετικά την µικροχλωρίδα του εντέρου περιορίζοντας τις τοξικές δραστηριότητες των µικροοργανισµών. Σύµφωνα µε τον Fuller, (1989) προβιοτικά είναι "ζωντανά µικροβιακά συµπληρώµατα (στην διατροφή) που επιδρούν θετικά 12

13 στον ξενιστή βελτιώνοντας την ισορροπία της µικροχλωρίδας του γαστρεντερικού σωλήνα". Ο συσχετισµός των προβιοτικών µε τα ζυµωµένα γαλακτοκοµικά προϊόντα χρονολογείται από τις συγκεκριµένες πρώιµες χρονικά παρατηρήσεις. Η έρευνα όµως τα τελευταία χρόνια έχει επεκταθεί και σε µικροοργανισµούς που προέρχονται από το γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου. Εκατοντάδες είδη µικροβίων ζουν "συµβιωτικά" µε τον άνθρωπο στο δέρ- µα, στη στοµατική κοιλότητα, στο γαστρεντερικό σωλήνα και στο ούρογεννητικό σύστηµα. Ο συνολικός πληθυσµός των µικροοργανισµών σε όλα τα µέρη του ανθρώπινου σώµατος είναι περίπου κύτταρα. Συνήθως τα προβιοτικά προσθέτονται σε γιαούρτι και άλλα ζυµω- µένα τρόφιµα αλλά τελευταία έχουν προστεθεί σε ποτά, σε κοµµάτια φρούτων (Maguina και συν, 2002), καθώς και σε σοκολάτες µε υψηλό βαθµό επιβίωσης (Siuta-Cruce και Goulet, 2001). Επιπλέον, προβιοτικά στελέχη διατίθενται µε τη µορφή φαρµακευτικών σκευασµάτων (κάψουλες, τα- µπλέτες) όπου διατηρούνται σε λυοφιλιωµένη µορφή. Στα τρόφιµα στα οποία προσθέτονται προβιοτικά περιλαµβάνονται το γιαούρτι, η οξινισµένη κρέµα γάλακτος, το ξινόγαλα, η σκόνη γάλακτος, διάφορα είδη τυριών καθώς και επιδόρπια. Εκτός των γαλακτοκοµικών προϊόντων εξετάζεται και η δυνατότητα προσθήκης προβιοτικών µικροοργανισµών σε ζυµωµένα λαχανικά και ζυµωµένα προϊόντα κρέατος (Shih, 2003). Τα γαλακτοκοµικά προϊόντα που περιέχουν προβιοτικά είναι ιδιαίτερα δηµοφιλή στην Ιαπωνία (53 διαφορετικά προϊόντα κυκλοφορούν στην αγορά) ενώ στην Ευρώπη, αν και κυκλοφορούν ευρέως η χρήση τους περιορίζεται στο γιαούρτι (Shah, 2001). Τα προβιοτικά στελέχη που συνήθως χρησιµοποιούνται είναι του γένους Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L. fermentum, L. rhamnosus), του γένους Bifidobacterium καθώς και µικροοργανισµοί άλλων γενών (Bacillus, Escherichia). Οι µικροοργανισµοί αυτοί πρέπει να βρίσκονται σε 13

14 πληθυσµούς µεγαλύτερους από 10 6 ζωντανά κύτταρα/g προϊόντος κατά την ηµεροµηνία λήξης (Lourens-Hattingh και Viljoen, 2001 Shah, 2001 Klaenhammer, 2001 Kurman και Rasic, 1991). Σηµαντικό πρόβληµα αποτελεί η χαµηλή επιβίωση των προβιοτικών γαλακτικών βακτηρίων στα τρόφιµα ειδικά στα ζυµωµένα γαλακτοκο- µικά προϊόντα. Σε ορισµένες περιπτώσεις ενεργές καλλιέργειες πεθαίνουν πριν ακόµα ο καταναλωτής ωφεληθεί από οποιαδήποτε ευεργετική επίδραση (κατά την διάρκεια της παραγωγής, της συντήρησης ή της µεταφοράς του τελικού προϊόντος). Οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι στο περιβάλλον. Ο πληθυσµός των προβιοτικών γαλακτικών βακτηρίων µειώνεται δραστικά εξαιτίας της οξύτητας του τροφίµου, της µετά-οξίνισης, του Ο 2 του τροφίµου, του Ο 2 που εισέρχεται από τη συσκευασία, της θερµοκρασίας και των αντιµικροβιακών ουσιών που παράγονται από τις καλλιέργειες εκκίνησης (Shah, 2001 Siuta-Cruce, 2001). To συγκεκριµένο πρόβληµα θα µπορούσε να αντιµετωπιστεί µε την προσθήκη στις καλλιέργειες εκκίνησης στελεχών ζυµών. Οι ζύµες έχοντας την ικανότητα χρησιµοποίησης των οργανικών οξέων αυξάνουν την τιµή του ph του τροφίµου βελτιώνοντας την επιβίωση του προβιοτικού µικροοργανισµού. Επιπλέον, επιλεγµένα στελέχη ζυµών θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν ως αυτόνοµες προβιοτικές καλλιέργειες. Μέχρι σήµερα η ενεργός χρήση των ζυµών, ως διαιτητικά πρόσθετα για τον άνθρωπο, είναι ιδιαίτερα περιορισµένη αν και αποτελούν σηµαντικό µέρος της µικροχλωρίδας αρκετών γαλακτοκοµικών προϊόντων. Οι ζύµες, έχοντας την ικανότητα να επιβιώνουν σε γαλακτοκοµικά προϊόντα και να µεταβολίζουν συστατικά του γάλακτος, θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν όχι µόνο ως προβιοτικοί µικροοργανισµοί αλλά ακόµη και ως καλλιέργειες εκκίνησης (Jakobsen και Narvhus, 1996 Ferreira και Viljoen, 2003). 14

15 2 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1 Το οικοσύστηµα των ζυµών που απαντώνται στα τροφί- µα Zύµες-µορφολογία κυττάρου Οι ζύµες ανήκουν στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, είναι µύκητες µε βλαστική µορφή που αναπαράγονται κύρια µε εκβλάστηση (budding) ή σχάση (fission) και παράγουν µεµονωµένα κύτταρα (Kurtzman και Fell, 2000). εν φωτοσυνθέτουν και αποτελούν µια ετερογενή οµάδα µικροοργανισµών που δεν σχετίζονται σε µεγάλο βαθµό µεταξύ τους (Pitt και Hocking, 2000). Σήµερα είναι αναγνωρισµένα 678 διαφορετικά είδη ζυµών (Barnett και συν., 2000) Το κύτταρο των ζυµών είναι τυπικό ευκαρυωτικό και µοιάζει µε το κύτταρο των ανωτέρων φυτών. ιαφέρει ως προς την σύσταση της κύριας ουσίας του κυτταρικού τοιχώµατος, η οποία στις ζύµες είναι η γλυκάνη ενώ στα ανώτερα φυτά είναι η κυτταρίνη. Επίσης διαφέρει ως προς το ότι τα ριβοσωµάτια των ζυµών βρίσκονται διασκορπισµένα στο κυτταρόπλασµα ενώ στα ανώτερα φυτά είναι προσαρτηµένα στο ενδοπλασµικό δίκτυο (Walker, 1998). Το κυτταρικό τοίχωµα των ζυµών είναι σύνθετο, έχει πάχος nm και αποτελείται κύρια από τους πολυσακχαρίτες, µαννάνη, γλυκάνη και σε µικρό ποσοστό από χιτίνη και επιπλέον, από ποσότητες πρωτεϊνών, λιπιδίων, και φωσφόρου σε ανόργανη µορφή. Η ακριβής αναλογία των συστατικών του κυτταρικού τοιχώµατος ποικίλλει ανάλογα µε το στέλεχος της ζύµης, την ηλικία του κυττάρου και τις συνθήκες ανάπτυξης (Walker, 1998). Το κύτταρο των ζυµών διαφέρει σε µεγάλο βαθµό από ένα τυπικό προκαρυωτικό κύτταρο (βακτηρίου), στο οποίο δεν υπάρχουν µιτοχόνδρια και η πυρηνική ουσία δεν περιβάλλεται από µεµβράνη. 15

16 Η κυτταρική µεµβράνη των ζυµών δεν είναι ιδιαίτερα διαπερατή σε ιόντα. Όµως, το κύτταρο των ζυµών διαθέτει ένα αποτελεσµατικό σύστηµα µεταφοράς των σηµαντικών για τη φυσιολογία τους ιόντων όπως είναι τα κατιόντα καλίου (Κ + ), µαγνησίου (Mg ++ ) και το φωσφορικό ανιόν (PO ). Το ιόν Κ + εισέρχεται στο κύτταρο µε την ανταλλαγή Κ + -Η +, ενώ το κατιόν υδρογόνου προέρχεται από µεταβολική δράση της κυτταρικής µεµβράνης. Η µικρή διαπερατότητα των ζυµών ταυτόχρονα µε την υψηλή ικανότητα µεταφοράς ιόντων oφείλεται πιθανόν σε προσαρµογή τους στο υγρό περιβάλλον (Walker, 1998). Oι ζύµες είναι µονοκύτταροι µύκητες που έχουν ένα απλό πυρήνα και αναπαράγονται είτε αγενώς µε εκβλάστηση και σχάση ή εγγενώς µε παραγωγή σπορίων. Κάθε θυγατρικό κύτταρο που προέρχεται από την εκβλάστηση εξελίσσεται σε ένα νέο κύτταρο ζύµης (Prescott και συν., 2002). Στα σηµεία των εκβλαστήσεων µετά την απόσπαση των θυγατρικών κυττάρων µένουν χαρακτηριστικές σφαιρικές ουλές. Η κυτταροπλασµατική µεµβράνη αποτελείται από εξαγωνικά τεµαχίδια που διασχίζονται από νηµάτια. Μέσα στο κυτταρόπλασµα υπάρχουν µιτοχόνδρια, ενδοπλασµικό δίκτυο και αποθέσεις από λίπη και γλυκογόνο. Στο κέντρο υπάρχει ένα µεγάλο χυµοτόπιο που περιβάλλεται από µεµβράνη και περιέχει δεσµίδες και κοκκία που σχηµατίζουν πλέγµα. Ο πυρήνας περιβάλλεται από διπλή µεµβράνη που είναι διάτρητη (Walker, 1998). Οι ζύµες διαφοροποιούνται από τα βακτήρια από το µεγαλύτερο µέγεθός τους, από το σφαιρικό, κυλινδρικό ή ελλειπτικό σχήµα του κυττάρου τους καθώς και από την παρουσία εσωτερικών κυτταρικών δοµών (Madigan και συν., 2000). Ένα τυπικό κύτταρο ζύµης έχει διάµετρο 5 έως 8 µm ορισµένα, όµως, είδη έχουν ακόµη µεγαλύτερο µέγεθος που µπορεί να φθάσει τα µm (Jay, 2000 Walker, 1998). Οι ζύµες έχουν πολλές και σηµαντικές εφαρµογές στην βιοµηχανία των τροφίµων και κατ επέκταση ωφελίµων για τον άνθρωπο προιόντων 16

17 (Kurtzman και Fell, 1998). Ορισµένες από τις χρήσεις των ζυµών παρουσιάζονται στον πίνακα Πίνακας Χρήσεις των ζυµών στα τρόφιµα, ποτά και σε ζυµώσεις. Εφαρµογή Ζύµωση µπύρας ιόγκωση ψωµιού Παραγωγή κρασιού Γαλακτωµατοποίηση Παραγωγή αιθανόλης Παραγωγή πρωτεΐνης Ζύµωση λακτόζης και γάλακτος Παραγωγή µαννιτόλης Παραγωγή D- αραβιτόλης Παραγωγή ξυλιτόλης Ζύµωση D- ξυλόζης Ζύµη Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces exiguuus Saccharomyces rosei Saccharomyces cerevisiae Candida lipolytica Saccharomyces cerevisiae Candida utilis Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Candida pseudotropicalis Torulopsis mannitofaciens Candida diddensiae Torulopsis candida Candida sheatae, Pichia stipitis Pichia segobiensis Οι ζύµες αναπτύσσονται καλά σε θερµά, υγρά και όξινα περιβάλλοντα µε υψηλή συγκέντρωση σακχάρων. Όσον αφορά το ph οι ζύµες αναπτύσσονται πολύ καλά σε τιµές ph 4,5-6,5 ενώ όλα σχεδόν τα είδη µπορούν να αναπτυχθούν σε περισσότερο αλκαλικά ή όξινα περιβάλλοντα (σε ph 3 ή ph 8 αντίστοιχα). Σχετικά µε τις απαιτήσεις των ζυµών σε οξυγόνο οι περισσότερες είναι αερόβιες. Το οξυγόνο είναι απαραίτητο σαν τελικός δέκτης ηλεκτρο- 17

18 νίων στην αερόβια ανάπτυξη. Επιπλέον είναι απαραίτητος παράγοντας α- νάπτυξης για τη σύνθεση των λιπαρών οξέων της κυτταρικής µεµβράνης καθώς και για τη βιοσύνθεση των στερολών (κύρια εργοστερόλη και ζυµοστερόλη, λανοστερόλη), οι οποίες είναι απαραίτητες για τη διατήρηση της διαπερατότητας της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης των ζυµών (Walker, 1998). H ιδιότητα των ζυµών να αναπαράγονται µε εκβλάστηση επιτρέπει στις ζύµες να αυξάνονται γρήγορα σε ένα υγρό περιβάλλον το οποίο ευνοεί τη διασπορά των µονοκύτταρων µικροοργανισµών. Επιπρόσθετα ένας µεγάλος αριθµός ζυµών αναπτύσσεται εύκολα κάτω από αυστηρά αναερόβιες συνθήκες, κάτι το οποίο επίσης ευνοεί την γρήγορη ανάπτυξη τους σε ένα υγρό περιβάλλον (Pitt και Hocking, 2000). Aντίθετα, η αναπαραγωγή των ζυµών µε απλά κύτταρα δεν ευνοεί την ανάπτυξη ή και την διείσδυση σε επιφάνειες στερεών, όπου αναπτύσσονται εύκολα οι µύκητες. Επιπλέον, οι ζύµες σαν ευκαρυωτικοί µικροοργανισµοί αναπτύσσονται πιο αργά από τα βακτήρια και συνεπώς δεν ανταγωνίζονται τα βακτήρια σε περιβάλλοντα όπου ευνοείται η ανάπτυξη των βακτηρίων σε τιµές ph κοντά στο 7 ή σε σχετικά υψηλές θερµοκρασίες (Pitt και Hocking, 2000) Zύµες και τρόφιµα Οι ζύµες αποτελούν ένα σηµαντικό τµήµα της µικροχλωρίδας των τροφίµων γιατί αφενός προκαλούν αλλοιώσεις στα τρόφιµα και αφετέρου γιατί είναι υπεύθυνες για ένα πλήθος ζυµώσεων που καταλήγουν στην παραγωγή ιδιαίτερα σηµαντικών τροφίµων (ψωµί, κρασί, cider, µπύρα, γαλακτοκοµικά προϊόντα). Η ζύµωση που προκαλείται είναι µια αναερόβια µεταβολική διεργασία, µε την οποία τα στελέχη των ζυµών διασπούν τα σάκχαρα αρχικά σε διοξείδιο του άνθρακα και αιθυλική αλκοόλη, µε ταυτόχρονη απελευθέρω- 18

19 ση ενέργειας που χρησιµοποιείται από τα στελέχη για την σύνθεση κυτταρικού υλικού. Οι αντιδράσεις ζύµωσης είναι ενζυµικά κατευθυνόµενες α- ντιδράσεις οξειδο-αναγωγής κατά τις οποίες η γλυκόζη µέσω του κύκλου Embden-Meyerhof-Parnas αποδοµείται σε δύο µόρια πυρουβικού οξέος, τα οποία αποκαρβοξυλιώνονται σε δύο µόρια διοξειδίου του άνθρακα και ένα µόριο ακεταλδεύδης το οποίο ανάγεται σε αιθανόλη (Peppler, 1977). Στην αντίδραση ζύµωσης το µεγαλύτερο ποσοστό (95%) της γλυκόζης µετατρέπεται σε αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα. Παράγονται επίσης και υποπροϊόντα της ζύµωσης όπως γλυκερόλη σε ποσοστό 3%, η- λεκτρικό οξύ σε ποσοστό 1%, καθώς και ουσίες που συνεισφέρουν στην ανάπτυξη του αρώµατος και της γεύσης σε ποσοστό 1% (Suomalainen, 1971). Τα κυριότερα υποπροϊόντα της ζύµωσης εκτός από την αιθανόλη και το διοξείδιο του άνθρακα, είναι το διακετύλιο, το γαλακτικό και το οξικό οξύ. Όταν η ζύµωση πραγµατοποιείται σε όξινο ph τότε η παραγόµενη ποσότητα αιθανόλης και διοξειδίου του άνθρακα είναι µεγάλη ενώ αντίθετα όταν η ζύµωση πραγµατοποιείται σε αλκαλικό ph τότε παράγεται µειω- µένη ποσότητα αιθανόλης και διοξειδίου του άνθρακα και αυξηµένη ποσότητα υποπροϊόντων (Peppler, 1977 Neish and Blackwood, 1951). Εκτός από τα κύρια υποπροϊόντα που αναφέρθηκαν (αιθανόλη, διοξείδιο του άνθρακα, γλυκερόλη, ηλεκτρικό οξύ) κατά την διεργασία της ζύµωσης παράγεται ένας µεγάλος αριθµός διαφορετικών ουσιών, που αποτελούν προϊόντα µεταβολισµού των σακχάρων, όπως αναφέρονται στον πίνακα

20 Πίνακας Ουσίες που παράγονται κατά την ζύµωση σακχάρων από ζύµες ΚΥΡΙΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ Αιθανόλη ιοξείδιο του άνθρακα Γλυκερόλη Ηλεκτρικό οξύ Γαλακτικό οξύ Οξικό οξύ ΕΥΤΕΡΕΥΟΝΤΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ Φορµικό οξύ Ακετοΐνη Μίγµα ανωτέρων αλκοολών (1-προπανόλη 2 µεθύλ-1-βουτανόλη, ισοβουτανόλη, 3-µεθύλβουτανόλη) Αµινοξέα Νουκλεϊκά οξέα Ένζυµα Συνένζυµα Βιταµίνες του συµπλέγµατος Β Μερκαπτάνες Σουλφίδια Είναι σηµαντικό να τονιστεί ότι οι ζύµες δεν αποτελούν αιτία δηλητηριάσεων από τρόφιµα. Ωστόσο, ορισµένα άτοµα εµφανίζουν υπερευαισθησία του ανοσοποιητικού συστήµατος σε στελέχη ζυµών που χρησιµοποιούνται στην αρτοποιία και στη ζαχαροπλαστική. Ορισµένα στελέχη ζυµών είναι παθογόνα για τον άνθρωπο (Hazen και Howell, 2003). Παράγοντες που προδιαθέτουν για τη λοίµωξη από ζύ- µες είναι φυσικοί παράγοντες όπως δυσλειτουργία ενδοκρινών αδένων, νεοπλασίες, νοσήµατα οφειλόµενα σε µικροοργανισµούς (λοιµώδη νοσήµατα), διατροφικοί παράγοντες, όπως διατροφή µε πλούσιες σε σάκχαρα τροφές και έλλειψη σιδήρου και βιταµινών, µηχανικοί παράγοντες, όπως ε- γκαύµατα και προσθετικά δοντιών, νοσοκοµειακοί παράγοντες όπως θεραπεία µε αντιβιοτικά, χειρουργικές επεµβάσεις και καθετήρες, καθώς και µόλυνση από ιούς, όπως από τον ιό HIV-AIDS. Τα άτοµα που βρίσκονται σε ανοσοκαταστολή καθώς και οι ασθενείς που πάσχουν από AIDS είναι 20

21 ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε λοιµώξεις από ζύµες (Walker, 1998 Kurtzman και Fell, 2000). Οι ζύµες δεν προκαλούν το πλήθος των αλλοιώσεων, που προκαλούνται από τα βακτήρια, γιατί ο πληθυσµός τους σε ένα τρόφιµο είναι συνήθως µικρότερος από αυτό των βακτηρίων και αναπτύσσονται πιο αργά από ότι τα βακτήρια. Επιπλέον, η ανάπτυξη τους περιορίζεται από τα µεταβολικά προϊόντα ανάπτυξης των βακτηρίων. Οι αλλοιώσεις, που προκαλούν οι ζύµες στα τρόφιµα, έχουν διαφορετικές µορφές όπως θόλωµα σε υγρά προϊόντα όπως το κρασί, σχηµατισµό υµενίου σε άλµες και στο κρασί, ανάπτυξη αερίου σε γαλακτοκοµικά προϊόντα, σε ζυµωµένα λαχανικά και στο κρασί, ανάπτυξη δυσάρεστων αρωµάτων και αλλαγή χρώµατος (τόσο λόγω αποχρωµατισµού από τις ζύ- µες όσο και λόγω σχηµατισµού χρωστικών από στελέχη ζυµών). Είδη ζυ- µών που παράγουν χρωστικές παρουσιάζονται στον πίνακα (Walker, 1998). Στα γαλακτοκοµικά προϊόντα έχει αποµονωθεί ένα µεγάλο πλήθος διαφορετικών ειδών ζυµών. Συγκεκριµένες µελέτες αναφέρουν, ότι τα γαλακτοκοµικά προϊόντα αποτελούν ένα ιδιαίτερο οικοσύστηµα όπου, παρότι εµφανίζονται και αναπτύσσονται διαφορετικά είδη ζυµών, δύο είδη κυριαρχούν, ο Debaryomyces hansenii και ο Kluyveromyces marxianus καθώς και τα ανάµορφα τους είδη, Candida famata και Candida kefyr (Fleet, 1990). Ζύµες έχουν αποµονωθεί τόσο από απαστερίωτο όσο και από παστεριωµένο γάλα σε µικρούς πληθυσµούς της τάξης του 10 3 έως 10 4 κύτταρα/ml γάλακτος (Fleet, 1990). Συνήθως δεν δηµιουργούν πρόβληµα αλλοίωσης στο παστεριωµένο γάλα γιατί τα ψυχρότροφα βακτήρια που επικρατούν δεν επιτρέπουν την ανάπτυξη των ζυµών (Cousin, 1982 Viljoen, 2001). 21

22 Πίνακας Είδη ζυµών που παράγουν χρωστικές Χρωστική που παράγεται Kρεµώδης Λευκή Μαύρη Ροζ Κόκκινη Πορτοκαλί Κίτρινη Είδος ζυµών Πλήθος στελεχών Saccharomyces cerevisiae Geotrichum spp. Phaecoccomyces spp. Phaecoccomyces spp. Αureobasidium pullulans Phaffia spp. Oosporidium spp. Rhodotorula spp. Saccharomyces cerevisiae Rhodosporidium spp. Cryptococcus laurentii Bullera spp. Αλλοιώσεις εξαιτίας των ζυµών παρουσιάζονται σε γάλα στο οποίο η προσθήκη αντιβιοτικών έχει περιορίσει την ανάπτυξη των βακτηρίων. Επίσης, η παρουσία των ζυµών ως δευτερογενής χλωρίδα µετά από αλλοίωση του γάλακτος από βακτήρια προκαλεί σηµαντικές αλλοιώσεις. Τα κυριότερα είδη ζυµών που αποµονώθηκαν από γάλα παρουσιάζονται στον πίνακα Η ανάπτυξη ζυµών δεν έχει ιδιαίτερη σηµασία για την αλλοίωση της κρέµας γάλακτος στην οποία δεν έχουν προστεθεί επιπλέον συστατικά. Αντίθετα η ανάπτυξη ζυµών έχει ως αποτέλεσµα την αλλοίωση κρέµας γάλακτος στην οποία έχει προστεθεί ζάχαρη ή φρούτα και σε κρέµα γάλακτος, η οποία έχει υποστεί οξίνιση. Τα κυριότερα είδη ζυµών που αποµονώθηκαν από κρέµα γάλακτος παρουσιάζονται στον πίνακα Στο βούτυρο έχουν αποµονωθεί στελέχη ζυµών µε λιπολυτικές ιδιότητες κυρίως του είδους Rhodotorula αλλά σε µικρούς πληθυσµούς. Τα δύο είδη που κύρια αποµονώθηκαν σε βούτυρο είναι η Rhodotorula glutinis και η Rhodotorula rubra (Fleet και Mian, 1987). 22

23 Οι ζύµες δεν συµµετέχουν στην παρασκευή του γιαουρτιού, η οποία πραγµατοποιείται µε την χρήση καλλιέργειας γαλακτικών βακτηρίων, αλλά η παρουσία τους στο τελικό προϊών αποτελεί µια σηµαντική αιτία αλλοίωσης. Όταν κατά την διάρκεια της παρασκευής του γιαουρτιού τηρούνται οι κατάλληλες συνθήκες υγιεινής τότε ο αριθµός των ζυµών στο τελικό προϊών δεν υπερβαίνει τα 10 κύτταρα/g γιαουρτιού. Ο συγκεκριµένος πληθυσµός ζυµών δεν προκαλεί προβλήµατα κατά την διάρκεια της συντήρησης. Αντίθετα όταν δεν τηρούνται οι κατάλληλες συνθήκες υγιεινής κατά την διάρκεια της παρασκευής του γιαουρτιού και ο αριθµός των ζυµών στο τελικό προϊόν υπερβαίνει τα 100 κύτταρα/g γιαουρτιού τότε παρατηρείται αλλοίωση του τελικού προϊόντος η οποία αποκτά έντονα χαρακτηριστικά όταν ο αριθµός των ζυµών προσεγγίσει τα επίπεδα του κύτταρα/g γιαουρτιού (Green και Ιbe, 1987 Fleet και Mian, 1987). 23

24 Πίνακας Είδη ζυµών που αποµονώθηκαν από γάλα και προϊόντα του Είδη ζυµών Προϊόν Βιβλιογραφική αναφορά Candida curvata απαστερίωτο γάλα Engel, 1986 Candida diffluens γιαούρτι κρέµα γάλακτος Fleet & Mian, 1987 Candida famata γιαούρτι κρέµα γάλακτος παστεριωµένο γάλα Suriyarachchi & Fleet, 1981; Fleet & Mian, 1987 Candida intermedia γιαούρτι Tillbury και συν., 1974 Candida krusei γιαούρτι Green & Ibe, 1987 Candida lusitaniae γιαούρτι Green & Ibe, 1987 Candida pelliculosa γιαούρτι Tillbury και συν., 1974 Candida pseudotropicalis γιαούρτι Van Uden & Carmo Sousa, 1957 Candida stellata γιαούρτι Fleet & Mian, 1987 Cryptococcus flavus παστεριωµένο γάλα Fleet & Mian, 1987 Cryptococcus laurentii κρέµα γάλακτος Fleet & Mian, 1987 Hansenula anomala γιαούρτι Green & Ibe, 1987 Kluyveromyces marxianus παστεριωµένο γάλα Fleet & Mian, 1987 Kluyveromyces bulgaricus γιαούρτι Dubois και συν., 1980 Kluyveromyces fragilis γιαούρτι Green & Ibe, 1987 Kluyveromyces marxianus γιαούρτι Fleet & Mian, 1987 Rhodotorula απαστερίωτο γάλα βούτυρο Walker & Ayres, 1970 Rhodotorula glutinis βούτυρο κρέµα γάλακτος Fleet & Mian, 1987 Rhodotorula rubra βούτυρο Fleet & Mian, 1987 Saccharomyces cerevisiae γιαούρτι Fleet & Mian, 1987 Torulopsis γιαούρτι Soulides, 1956 Torulopsis candida γιαούρτι Tillbury και συν., 1974 Torulopsis versatilis γιαούρτι Tillbury και συν.,

25 Η αλλοίωση εκδηλώνεται αρχικά µε έντονο φούσκωµα στον περιέκτη λόγω παραγωγής αερίου από την ζύµωση που προκαλείται. Σε ορισµένες περιπτώσεις ο περιέκτης καταστρέφεται λόγω υψηλής πίεσης από το αέριο που έχει σχηµατισθεί. Το γιαούρτι το οποίο έχει αλλοιωθεί από την ανάπτυξη ζυµών αποκτά δυσάρεστη γεύση "ζύµωσης" και η υφή του είναι αφρώδης λόγω της παραγωγής αερίου. Η κυριότερη πηγή επιµόλυνσης του γιαουρτιού µε ζύµες είναι η προσθήκη στο έτοιµο προϊόν επιµολυσµένων συστατικών µε υψηλό φορτίο ζυµών όπως φρούτα, µαρµελάδα και πολτός φρούτων, ξηροί καρποί, µέλι. Μία άλλη πηγή επιµόλυνσης του γιαουρτιού µε ζύµες είναι τα µηχανικά µέρη της γραµµής παραγωγής του γιαουρτιού όπως οι µηχανές γεµίσµατος των περιεκτών και οι αναµικτήρες (Fleet και Mian, 1987). Επιπρόσθετα οι κακές συνθήκες συντήρησης ευνοούν την ανάπτυξη των ζυµών. Τα κυριότερα είδη ζυµών που αποµονώθηκαν από γιαούρτι παρουσιάζονται στον πίνακα Τα είδη που απαντώνται περισσότερο στο γιαούρτι είναι ο Kluyveromyces marxianus και η Candida famata. Σύµφωνα µε τους Green και Ibe (1987), αλλοίωση γιαουρτιού προκλήθηκε από ζύµες των ειδών Candida lusitaniae, Candida krusei, Kluyveromyces fragilis, Candida rugosa, Saccharomyces cerevisiae. Εκτός των αλλοιώσεων που προκαλούν οι συγκεκριµένες ζύµες είναι και παθογόνες για τον άνθρωπο. Η Candida lusitaniae έχει την ικανότητα να αναπτύσσεται σε χαµηλές θερµοκρασίες όπου και ανταγωνίζεται από πλεονεκτική θέση τα βακτήρια. Ο Kluyveromyces fragilis έχει την ικανότητα να αναπτύσσεται στην θερµοκρασία ζύµωσης µε αποτέλεσµα τη µεγάλη αύξηση του πληθυσµού και την αλλοίωση του γιαουρτιού. Η 25

26 Candida rugosa παράγει το ένζυµο λιπάση και έχει έντονες λιπολυτικές ιδιότητες στο βούτυρο, στη µαργαρίνη και στα τυριά (Peppler, 1977). Στελέχη ζυµών αποµονώνονται συχνά από δείγµατα διαφορετικών τυριών. Το τυρί αποτελεί ένα ιδιαίτερα ευνοϊκό οικοσύστηµα για την ανάπτυξη των ζυµών γιατί έχει χαµηλό ph, σχετικά χαµηλό ποσοστό υγρασίας και αυξηµένη συγκέντρωση αλατιού. Επιπλέον, διατηρείται για µεγάλο χρονικό διάστηµα σε συνθήκες ψύξης. Σε αντίθεση µε το γιαούρτι η εµφάνιση ζυµών σε ένα τυρί δεν ση- µαίνει ότι σε κάθε περίπτωση θα προκληθεί αλλοίωση του τυριού από τις ζύµες. Η επίδραση που έχουν οι ζύµες διαφέρει από το ένα είδος τυριού στο άλλο. Σε συγκεκριµένα είδη τυριών οι ζύµες προκαλούν αλλοιώσεις όπως φούσκωµα, ενώ σε άλλα είδη η επίδραση των ζυµών είναι ευνοϊκή γιατί συµβάλλει στην ανάπτυξη γεύσης και αρώµατος κατά την διάρκεια την ωρίµασης του τυριού. Ζύµες αποµονώνονται τόσο από µαλακά όσο και από ηµίσκληρα και σκληρά τυριά και σε πληθυσµούς κύτταρα/g τυριού, ενώ στο τυρί Φέτα σε πληθυσµούς της τάξεως των 10 3 κύτταρα/g τυριού (Kobuger, 1971 Banks & Board 1987 Tzanetakis και συν., 1987). Τα κυριότερα είδη ζυµών που αποµονώθηκαν από δείγµατα τυριών παρουσιάζονται στον πίνακα Η αλλοίωση του τυριού από την δράση ζυµών εκδηλώνεται µε την ανάπτυξη γεύσης "φρούτου", µε τη πικρότητα, µε την ανάπτυξη οσµής "ζύµωσης", µε τη διόγκωση λόγω παραγωγής αερίου καθώς και µε την χαλάρωση της δοµής του τυριού. Σύµφωνα µε τούς Romano και συν, (1989) στελέχη του είδους Candida καθώς και στελέχη του είδους Kluyveromyces marxianus που προέρχονταν από τον ορό του γάλακτος προκαλούσαν αλλοίωση του τυριού Παρµεζάνα µε την παραγωγή αερίου. 26

27 Πίνακας Είδη ζυµών που αποµονώθηκαν από δείγµατα τυριών Είδη ζυµών Τύπος τυριού Βιβλιογραφική αναφορά Debaryomyces hansenii Candida lipolytica Pichia membranaefaciens Μπλε τυριά Camembert Φέτα Brie Boer & Kuik, 1987; Nakase και συν., 1977; Nooitgedagt & Hartog, 1988 Μπλε τυριά Camembert Nakase και συν., 1977 Φέτα Tzanetakis και συν Pichia fermentans Φέτα Tzanetakis και συν Candida famata Kluyveromyces marxianus Candida diffluens Μπλε τυριά Camembert Fleet & Mian, 1987 Μπλε τυριά Fleet & Mian, 1987; Boer Camembert & Kuik, 1987; Nooitgedagt Brie & Hartog, 1988 Μπλε τυριά Camembert Fleet & Mian, 1987 Saccharomyces cerevisiae Yarrowia lipolytica Candida spp. Μπλε τυριά Camembert Φέτα Μπλε τυριά Camembert Φέτα Μπλε τυριά Camembert Brie Boer & Kuik, 1987 Boer & Kuik, 1987; Nooitgedagt & Hartog, 1988 Boer & Kuik, 1987; Nooitgedagt & Hartog, 1988 Οι ζύµες αποτελούν την κύρια αιτία αλλοίωσης ηµί-µαλακών τυριών που δεν υφίστανται ωρίµανση, όπως τα τυριά τύπου cottage (Engel, 1986 Engel 1987). Οι ζύµες αναπτύσσονται κατά τη διάρκεια της συντήρησης των τυριών στο ψυγείο και όταν ο αριθµός τους προσεγγίσει τα επίπεδα κύτταρα/g τυριού εµφανίζονται τα συµπτώµατα της αλλοίωσης των συγκε- 27

28 κριµένων τυριών πού είναι δυσάρεστη οσµή, δυσάρεστη γεύση, παραγωγή αερίου, ανάπτυξη χαρακτηριστικών αποικιών ζυµών στην επιφάνεια των τυριών καθώς και αποχρωµατισµός ή ανάπτυξη ανεπιθύµητων χρωµάτων. Η ανάπτυξη των ζυµών κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας και κατά την ωρίµανση δεν έχει µελετηθεί αρκετά. Εκτιµάται, όµως, ότι οι ζύµες έχουν τόσο άµεση όσο και έµµεση συνεισφορά στην ανάπτυξη της γεύσης και της δοµής των τυριών (Vedamuthu και Washam 1983). Οι ζύµες αποτελούν µέρος της δευτερογενούς χλωρίδας του τυριού και προέρχονται από τυχαία επιµόλυνση των τυριών κατά τη διάρκεια της τυροκόµησης και δεν προστίθενται ως καλλιέργειες εκκίνησης. Συνήθως οι ζύµες που απαντώνται στα τυριά προέρχονται από το γάλα τυροκόµησης. Σε ορισµένες περιπτώσεις µπορεί να προέρχονται από τµήµατα της γραµµής παραγωγής που δεν έχουν καθαριστεί και απολυµανθεί ικανοποιητικά, από επιµολυσµένες καλλιέργειες εκκίνησης γαλακτικών βακτηρίων, από την πυτιά, από το αλάτι τυροκόµησης καθώς και από την προσθήκη καλλιεργειών µυκήτων (Fleet και Mian, 1987). Η δράση των ζυµών είναι σηµαντική στα ηµι-µαλακά τυριά ωρί- µανσης επιφανείας τύπου Limburger ή Trappist. Τα τυριά αυτής της οµάδας έχουν ποσοστό υγρασίας 40-60% και ωριµάζουν στους ο C για χρονικό διάστηµα που κυµαίνεται από 5 µέρες έως και εβδοµάδες. Κατά την διάρκεια της ωρίµανσης στην επιφάνεια του τυριού αναπτύσσεται ένα στρώµα µικροοργανισµών που δίνει το χαρακτηριστικό άρωµα και τη γεύση των τυριών (Olson, 1969 Reps, 1987). Oι µικροοργανισµοί που επικρατούν στο στρώµα αυτό είναι ο Brevibacterium linens, κορυνοβακτήρια και ζύµες. Ο αριθµός των ζυµών είναι αρχικά κύτταρα/g αλλά κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης παρουσιάζει µείωση και σταθεροποιείται στο κύτταρα/g. Τα στελέχη ζυµών που απαντώνται στο επιφανειακό στρώ- µα ανήκουν στα είδη Rhodotorula, Torulopsis και Candida (Marth, 1978). 28

29 Οι ζύµες δρουν στον συγκεκριµένο τύπο τυριού µεταβολίζοντας το γαλακτικό οξύ που έχει σχηµατισθεί στο τυρόπηγµα. Κατά συνέπεια η τιµή του ph αυξάνεται από 5,0 σε περίπου 5,7 και ευνοείται η ανάπτυξη βακτηρίων που ασκούν πρωτεολυτική και λιπολυτική δράση. Επιπρόσθετα, οι ζύµες µε αυτόλυση ή µε αποβολή απελευθερώνουν πλήθος βιταµινών που βοηθούν τη βακτηριακή ανάπτυξη καθώς και πρωτεολυτικά και λιπολυτικά ένζυµα που συντελούν στην ωρίµανση του τυριού. Τα µπλε τυριά ωρίµανσης είναι µαλακά τυριά, που ωριµάζουν µε τη βοήθεια µυκήτων. H ωρίµανση τους είναι µια σύνθετη διαδικασία στην ο- ποία συµµετέχουν εκτός από την κύρια καλλιέργεια εκκίνησης που αποτελείται από γαλακτικά βακτήρια, και η δευτερεύουσα καλλιέργεια εκκίνησης που αποτελείται από µύκητες κύρια του είδους Penicillium roquerforti. Στην ωρίµανση των τυριών αυτού του τύπου συµµετέχουν και στελέχη ζυ- µών είτε αλληλεπιδρώντας µε τους µικροοργανισµούς εκκίνησης είτε µε την παρουσία τους ως κύρια καλλιέργεια εκκίνησης. Σύµφωνα µε τους Barroiler και Schmidt, (1990) οι ζύµες που αναπτύσσονται στα µπλε τυριά, ανήκουν στα είδη Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces rouxii. Ο αριθµός των ζυµών κατά το στάδιο οξίνισης του γάλακτος δεν υπερβαίνει το 10 3 κύτταρα/g, ενώ στο τυρόπηγµα ο αριθµός των ζυµών αυξάνεται σε κύτταρα/g. Πριν από το αλάτισµα επικρατούν τα Saccharomyces spp., Candida spp., Hansenula spp. ενώ µετά από το αλάτισµα επικρατούν αλατοάντοχα στελέχη της Candida spp. τόσο στο εσωτερικό µέρος του τυριού όσο και στην επιφάνεια του. Επιπλέον, στο τυρόπηγµα αναπτύσσονται στελέχη που ζυµώνουν την λακτόζη (όπως Kluyveromyces lactis, Candida sphaerica, Candida lipolytica) τα οποία α- νοίγουν την υφή του τυριού διευκολύνοντας µε αυτό τον τρόπο την ανάπτυξη και την δράση του Penicillium roquerforti. 29

30 Ορισµένα στελέχη ζυµών αφοµοιώνουν το γαλακτικό οξύ µε αποτέλεσµα η τιµή του ph του τυριού να αυξάνεται και έτσι να ευνοείται η α- νάπτυξη των βακτηρίων που συµµετέχουν στην ωρίµαση του τυριού. Προϊόντα µεταβολισµού των ζυµών καθώς και ένζυµα που παράγουν συγκεκριµένα στελέχη, όπως πρωτεάσες και λιπάσες, συντελούν στην ανάπτυξη αρώµατος και γεύσης (Fleet, 1990). Η παρουσία των ζυµών στο παραδοσιακό τυρί Φέτα έχει µελετηθεί τόσο ως παράγοντας αλλοίωσης όσο και για τη συµµετοχή στην ανάπτυξη του χαρακτηριστικού αρώµατος και της γεύσης του συγκεκριµένου τυριού (Tzanetakis και συν, 1996 Fadda και συν, 2001 Westal και Filtenborg, 1998 Kaminarides και Laskos, 1992). Tα είδη ζυµών που αποµονώθηκαν από τυρί Φέτα παρουσιάζονται στον πίνακα

31 Πίνακας Είδη ζυµών που αποµονώθηκαν από τυρί Φέτα Είδη ζυµών Saccharomyces cerevisiae Βιβλιογραφική αναφορά Tzanetakis και συν., 1996 Kaminarides και Laskos, 1992 Candida famata Kaminarides και Laskos, 1992 Torulaspora delbrueckii Pichia membranaefasciens Debaryomyces hansenii Candida sake Kluyveromyces marxianus Kaminarides και Laskos, 1992 Westall και Filtenborg, 1998 Kaminarides και Laskos, 1992 Tzanetakis και συν., 1996 Tzanetakis και συν, 1996 Fadda και συν., 2001 Westall και Filtenborg, 1998 Westall και Filtenborg, 1998 Fadda και συν., 2001 Westall και Filtenborg, 1998 Fadda και συν., 2001 Pichia farinosa Tzanetakis και συν., 1996 Candida intermedia Tzanetakis και συν., 1996 Candida tropicalis Tzanetakis και συν., 1996 Fadda και συν., 2001 Candida versatilis Tzanetakis και συν., 1996 Candida catenulata Tzanetakis και συν., 1996 Saccharomyces kluyveri Tzanetakis και συν., 1996 Kluyveromyces lactis Fadda και συν., 2001 Dekkera anomala Fadda και συν., 2001 Geotrichum candidum Fadda και συν., 2001 Kluyveromyces marxianus Dekkera bruxellensis Fadda και συν., 2001 Westall και Filtenborg, 1998 Fadda και συν., 2001 Tα κύρια είδη που αποµονώθηκαν από την επιφάνεια του τυριού Φέτα σύµφωνα µε τους Tzanetakis και συν., (1996) ήταν ο Saccharomyces 31

32 cerevisiae, ο Debaryomyces hansenii, και η Pichia farinosa. Οι Kaminarides και Laskos (1992) αποµόνωσαν από την άλµη τυριού Φέτα στελέχη των ειδών Saccharomyces cerevisiae, Candida famata, Torulaspora delbrueckii και Pichia membranefasciens. Τα κυριότερα είδη ζυµών που αποµονώθηκαν από λευκό αγελαδινό τυρί άλµης (προέλευσης ανίας), σύµφωνα µε τούς Westall και Filtenborg (1998), ήταν η Torulaspora delbrueckii, ο Debaryomyces hansenii, η Candida sake και ο Kluyveromyces marxianus. Παρατηρείται διακριτή διαφορά στην χλωρίδα των ζυµών του τυριού Φέτα τόσο σε επίπεδο γεωγραφικού τόπου παρασκευής όσο και σε επίπεδο χώρας παρασκευής. Αυτό οφείλεται κύρια στην σύσταση του γάλακτος που χρησιµοποιείται ως πρώτη ύλη για την παρασκευή του τυριού. Στην Ελλάδα για την παρασκευή της Φέτας χρησιµοποιείται αιγοπρόβειο γάλα τόσο παστεριωµένο όσο και απαστερίωτο ενώ στην ανία χρησιµοποιείται αποκλειστικά παστεριωµένο αγελαδινό γάλα (Westall και Filtenborg, 1998) και στην Ιταλία αποκλειστικά παστεριωµένο πρόβειο γάλα (Fadda και συν., 2001). 32

33 2.2. Μέθοδοι αρίθµησης και ταυτοποίησης ζυµών Αρίθµηση ζυµών Οι ζύµες αποµονώνονται από πολλές και διαφορετικές πηγές τόσο από το έδαφος και τα υγρά περιβάλλοντα όσο και από την ατµόσφαιρα και τα τρόφιµα. Σπάνια εµφανίζονται ζύµες χωρίς την ταυτόχρονη παρουσία είτε µυκήτων είτε βακτηρίων. Το ιδανικό θρεπτικό υπόστρωµα για την αποµόνωση των ζυµών από ένα τρόφιµο πρέπει να αναστέλλει εντελώς την ανάπτυξη των βακτηρίων και των µυκήτων, να είναι επαρκές σε θρεπτικά συστατικά ώστε να υποστηρίξει την σχετικά γρήγορη ανάπτυξη των ζυµών και στην περίπτωση αποµόνωσης ζυµών συγκεκριµένου είδους να ευνοεί την ανάπτυξη των ζυµών που απαντώνται στο τρόφιµο που εξετάζεται (Beuchat, 1993). Θρεπτικό υπόστρωµα µε τις συγκεκριµένες ιδιότητες δεν υπάρχει. Η σύνθεση του υποστρώµατος καθορίζεται από το ότι οι ζύµες αναπτύσσονται σε τιµές ph και α w ανασταλτικές για την οµαλή ανάπτυξη των βακτηρίων. Για την αποµόνωση και την αρίθµηση των ζυµών χρησιµοποιείται ένα µεγάλο πλήθος θρεπτικών υποστρωµάτων τα οποία διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, σε αυτά που έχουν υποστεί οξίνιση και σε εκείνα στα ο- ποία έχει προστεθεί ποσότητα µιάς ή και περισσοτέρων αντιβιοτικών ουσιών (Jakobsen και Narvhus, 1996 Beuchat, 1993). Τα σηµαντικότερα υ- ποστρώµατα που χρησιµοποιούνται αναφέρονται στον πίνακα

34 Πίνακας Υποστρώµατα αποµόνωσης και αρίθµησης ζυµών Υποστρώµατα µε όξινο ph Potato dextrose agar (ph 3,5) Wort agar (ph 4,8) Malt extract agar (ph 3,5) Υποστρώµατα µε προσθήκη αντιβιοτικού Oxytetracycline glucose yeast extract (OGY) agar (Mosel και συν., 1970) Rose bengal chlortetracycline ( RBC) agar (Jarvis, 1973) Dichloran rose bengal chloramphenicol (DRBC) agar (King και συν., 1979) Oxytetracycline gentamicin glucose yeast extract (OGGY) agar (Mossel και συν., 1980) Yeast extract glucose chloramphenicol (YGC) agar (Int.Org.Stand, 1987) Tryptone glucose yeast extract choramphenicol agar (Samson και συν., 1992) Τα υποστρώµατα που έχουν υποστεί οξίνιση παρασκευάζονται µε την προσθήκη συγκεκριµένης ποσότητας οξέος (υδροχλωρικό, γαλακτικό, ταρταρικό, ή φωσφορικό) µετά από την αποστείρωση του υποστρώµατος (Beech και Davenport, 1969). Τα οργανικά οξέα, όπως το οξικό οξύ, αποφεύγονται για την οξίνιση των υποστρωµάτων γιατί διίστανται ελαφρά στη τιµή ph 3,5-4,0 και η υψηλή συγκέντρωση του αδιάστατου οξέος έχει ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη συγκεκριµένων ζυµών. Τα κυριότερα υποστρώµατα τα οποία οξινίζονται για την αποµόνωση των ζυµών από ένα τρόφιµο είναι το Potato Dextrose Agar (ph 3,5), το Wort Agar (ph 4,8) καθώς και το Malt Extract Agar (ph 3,5). Το πλεονέ- 34

35 κτηµα των συγκεκριµένων υποστρωµάτων είναι ότι η χαµηλή τιµή ph α- ναστέλλει το σχηµατισµό αποικιών από τα περισσότερα βακτήρια. Μειονέκτηµα των συγκεκριµένων υποστρωµάτων και κατ επέκταση των υποστρωµάτων που οξινίζονται είναι το ότι τυχόν τραυµατισµένα κύτταρα ζυµών δεν ανακάµπτουν στις συγκεκριµένες χαµηλές τιµές ph, καθώς και το ότι κύτταρα γαλακτικών βακτηρίων που αναπτύσσονται ε- µπλέκονται τόσο στην ανάπτυξη όσο και στο σχηµατισµό των αποικιών των ζυµών. Επιπρόσθετα, η πιθανή κατακρήµνιση πρωτεϊνών των δειγµάτων των τροφίµων στις συγκεκριµένες χαµηλές τιµές ph δυσχεραίνει την αρίθµηση των ζυµών (Beuchat, 1993). Τα υποστρώµατα που έχουν υποστεί οξίνιση είναι ιδιαίτερα αποτελεσµατικά στην περίπτωση που πρόκειται να αποµονωθούν οξεόφιλες ζύµες, οι οποίες αποτελούν την κύρια µικροχλωρίδα στα τρόφιµα µε χαµηλό ph, όπως τα φρούτα και τα λαχανικά. Τα θρεπτικά υποστρώµατα, στα οποία προσθέτονται αντιβιοτικά, παρασκευάζονται µε την προσθήκη συγκεκριµένων αντιβιοτικών ουσιών (κύρια οξυτετρακυκλίνη, χλωραµφενικόλη, γενταµικίνη και στρεπτοµυκίνη) σε συγκέντρωση 10 έως 100 µg/ml θρεπτικού υποστρώµατος (Beuchat, 1993). Μία αντιβιοτική ουσία είναι αποτελεσµατική για τη χρήση της σε θρεπτικό υπόστρωµα όταν αναστέλλει την ανάπτυξη σε ένα ευρύ φάσµα βακτηρίων, δεν αδρανοποιείται από τα υπόλοιπα συστατικά του υποστρώ- µατος, είναι σταθερή κατά την διάρκεια της επώασης και δεν έχει καµία αρνητική επίδραση στην αναγέννηση των τραυµατισµένων κυττάρων των ζυµών (Fleet, 1990). Σε ορισµένες περιπτώσεις κρίνεται απαραίτητη η προσθήκη πλέον της µίας αντιβιοτικών ουσιών για να ανασταλεί η ανάπτυξη όλων των βακτηρίων που απαντούν σε ένα τρόφιµο. Τα κυριότερα θρεπτικά υποστρώµατα που χρησιµοποιούνται για την αποµόνωση και αρίθµηση ζυµών και τα οποία έχει προστεθεί αντιβιοτική ουσία αναφέρονται στον πίνακα

36 Η επιλογή του κατάλληλου θρεπτικού υποστρώµατος εξαρτάται σε ένα βαθµό από τη φύση του τροφίµου που πρόκειται να εξεταστεί. Τα υποστρώµατα στα οποία έχει προστεθεί χλωραµφενικόλη έχουν το πλεονέκτη- µα ότι το συγκεκριµένο αντιβιοτικό είναι ανθεκτικό στις θερµοκρασίες α- ποστείρωσης και προστίθεται στο θρεπτικό υπόστρωµα πριν από την αποστείρωση. Ένα σηµαντικό µειονέκτηµα των συγκεκριµένων υποστρωµάτων είναι το ότι ευνοούν την ανάπτυξη και των µυκήτων εκτός από αυτή των ζυµών. Η προσθήκη ουσιών όπως το Rose bengal καθώς και το dichloran περιορίζει την ανάπτυξη των αποικιών των µυκήτων που έχουν την τάση να απλώνονται όχι όµως και των µυκήτων που δεν απλώνονται (Jarvis, 1973). Η ανάπτυξη µυκήτων είναι δυνατόν να ανασταλεί µε την προσθήκη στο θρεπτικό υπόστρωµα προπιονικού οξέος (κύρια άλατα του νατρίου και του ασβεστίου), µε την ποσότητα του προστιθέµενου προπιονικού οξέος να εξαρτάται από την τιµή ph του θρεπτικού υποστρώµατος, λόγω του ότι το µυκοστατικό αποτέλεσµα εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αδιάστατης µορφής του οξέος (Beech και Davenport, 1969). Η προσθήκη µυκοστατικών ουσιών σε ορισµένες περιπτώσεις εµπεριέχει τον κίνδυνο να ανασταλεί η ανάπτυξη ορισµένων ζυµών. Όσο αφορά τον τρόπο εµβολιασµού των υποστρωµάτων για την αποµόνωση των ζυµών από ένα τρόφιµο, καλύτερη µέθοδος είναι αυτή της επιφανειακής επίστρωσης. Σύµφωνα µε τον Flannigan, (1973) οι πληθυσµοί των ζυµών που καταγράφηκαν από το ίδιο δείγµα τροφίµου ήταν ση- µαντικά µικρότεροι, όταν ο εµβολιασµός πραγµατοποιήθηκε µε τη µέθοδο της ενσωµάτωσης σε θερµοκρασίες ο C και αισθητά υψηλότεροι όταν ο εµβολιασµός πραγµατοποιήθηκε µε τη µέθοδο της επιφανειακής επίστρωσης. Ένα επιπλέον σηµαντικό µειονέκτηµα της µεθόδου της ενσωµάτωσης είναι το ότι τυχόν θερµοευαίσθητες και τραυµατισµένες ζύµες είναι 36