Review article Aνασκόπηση

Transcript

1 : : Review article Aνασκόπηση Canine coronavirus: not an innocuous virus Ntafis V. 1, Papanastassopoulou M. 2, Xylouri E. 1 1 Department of Anatomy and Physiology of Farm Animals, Faculty of Animal Science and Aquaculture, Agricultural University of Athens, Iera Odos 75, Athens, Greece. 2 Laboratory of Microbiology and Infectious Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece. Κοροναϊός του σκύλου: ένας όχι αθώος ιός Ντάφης Β. 1, Παπαναστασοπούλου Μ. 2, Ξυλούρη Ε. 1 1 Εργαστήριο Ανατομίας και Φυσιολογίας Αγροτικών Ζώων, Τμήμα Επιστήμης Ζωικής Παραγωγής και Υδατοκαλλιεργειών, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά οδός 75, Αθήνα. 2 Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων, Κτηνιατρική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Θεσσαλονίκη. ABSTRACT. Canine coronavirus (CCoV) is a significant aetiologic agent of acute diarrhoea in dogs, specially in puppies. An important characteristic of coronaviruses is their high genetic variability, due to increased mutation frequency and sporadic recombination events. Due to this genetic variability, CCoV is classified in two distinct types, type I and II. CCoV type I strains share increased genetic similarity with Feline coronavirus strains, while CCoV type II consists of the typical reference CCoVs. Moreover, type II strains are classified into one of two subtypes, which include the classical strains (CCoV-IIa) and the new strains (CCoV-IIb), which emerged as a result of recombination among CCoV and Porcine transmissible gastroenteritis virus. Typical disease signs of CCoV infection are anorexia, depression, lethargy, as well as vomiting and diarrhoea. Mortality rate is low, especially in adult dogs with no infection signs. Most dogs recover within 7-10 days. Mixed infections with other viruses, bacteria or parasites may lead to more severe clinical disease. Currently, CCoV appears to have spread worldwide and has been related to mild, acute diarrhoea. However, during the last years, novel CCoV strains associated with outbreaks of lethal gastroenteritis have been detected in Australia and Europe. Genome analysis revealed that these strains shared low similarity with prototype reference strains of CCoV, suggesting that atypical, divergent strains may be related to more severe clinical signs. In addition, over the past decade, strains with an ability to trespass the intestinal tract, leading to lethal systemic infection, have also been isolated. These strains have attracted scientific interest, with research focusing on experimental infections, identification of genetic markers and prophylaxis. Pantropic CCoV strains have been detected across Europe, suggesting that the new, highly pathogenic biotype is circulating among canine population. The high genetic variability of CCoV, the severe mixed infections Correspondence: V. Ntafis, Department of Anatomy and Physiology of Farm Animals, Faculty of Animal Science and Aquaculture, Agricultural University of Athens, Iera Odos 75, , Athens, Greece. Ε-mail: vasilisntafis@hotmail.com Αλληλογραφία: Β. Ντάφης, Εργαστήριο Ανατομίας και Φυσιολογίας Αγροτικών Ζώων, Τμήμα Επιστήμης Ζωικής Παραγωγής και Υδατοκαλλιεργειών, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά οδός 75, , Αθήνα. vasilisntafis@hotmail.com Date of initial submission: 25 October 2012 Date of revised submission: 28 February 2013 Date of acceptance: 29 February 2013 Ημερομηνία αρχικής υποβολής: 25 Οκτωβρίου 2012 Ημερομηνία αναθ. υποβολής: 28 Φεβρουαρίου 2013 Ημερομηνία αποδοχής: 29 Φεβρουαρίου 2013

2 58 Ntafis V., Papanastassopoulou M.,XYLOURI E. and the antigenic differences among CCoV types and subtypes raise questions regarding the protective efficacy of the currently commercially available vaccines. Keywords: coronavirus, diarrhoea, dog, vaccine ΠΕΡΙΛΗΨΗ. Ο Κοροναϊός του σκύλου αποτελεί σημαντικό αιτιολογικό παράγοντα οξείας διάρροιας σε σκύλους, ιδιαίτερα σε κουτάβια. Κύριο χαρακτηριστικό του εν λόγω ιού, όπως και όλων των μελών της οικογένειας των κοροναϊών, είναι η έντονη γενετική ποικιλότητα, λόγω της συχνής εμφάνισης μεταλλάξεων και γενετικών ανασυνδυασμών. Αναφέρονται δύο τύποι Κοροναϊού του σκύλου, ο τύπος Ι και ο τύπος ΙΙ. Ο τύπος Ι περιλαμβάνει στελέχη, τα οποία εμφανίζουν μεγάλη γενετική ομοιότητα με στελέχη του Κοροναϊού της γάτας, ενώ στον τύπο ΙΙ ταξινομούνται τα κλασικά στελέχη του ιού. Επιπλέον, τα στελέχη που ανήκουν στον τύπο ΙΙ διακρίνονται σε δύο υποτύπους, τον IIa, στον οποίο κατατάσσονται τα κλασικά στελέχη, και τον ΙΙb, στον οποίο ανήκουν στελέχη που αναδύθηκαν μετά από ανασυνδυασμό του Κοροναϊού του σκύλου με τον Ιό της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας των χοίρων. Η λοίμωξη από Κοροναϊό του σκύλου συνήθως εκδηλώνεται με ανορεξία, κατάπτωση, λήθαργο και γαστρεντερικά συμπτώματα, όπως έμετο, ειδικά τις πρώτες δύο ημέρες, και διάρροια. Το ποσοστό θνητότητας είναι χαμηλό, ιδιαίτερα σε ενήλικες σκύλους, οι οποίοι συνήθως δεν εμφανίζουν συμπτώματα. Τα περισσότερα ζώα συνήθως αναρρώνουν μετά από 7-10 ημέρες. Η συνύπαρξη μολύνσεων από άλλους ιούς, βακτήρια ή παράσιτα μπορεί να οδηγήσει σε εκδήλωση πιο βαριάς κλινικής εικόνας. Σήμερα, έχει επιβεβαιωθεί η παγκόσμια εξάπλωση του Κοροναϊού του σκύλου και η συσχέτισή του με κρούσματα συνήθως ήπιας, οξείας διάρροιας. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια έχουν ανιχνευτεί, στην Αυστραλία και την Ευρώπη, στελέχη, τα οποία σχετίστηκαν με την πρόκληση κρουσμάτων επιζωοτικής θανατηφόρου γαστρεντερίτιδας. Η ανάλυση του γονιδιώματος αυτών των στελεχών ανέδειξε χαμηλό ποσοστό ομοιότητας με τα στελέχη αναφοράς, οδηγώντας στο συμπέρασμα πώς παραλλαγμένα στελέχη Κοροναϊού του σκύλου φαίνεται να σχετίζονται με εκδήλωση έντονων κλινικών συμπτωμάτων. Επιπλέον, σε αντίθεση με τη θεωρία που υποστήριζε ότι η λοίμωξη από Κοροναϊό του σκύλου περιοριζόταν στο πεπτικό σύστημα, την τελευταία δεκαετία απομονώθηκαν στελέχη ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, με δυνατότητα να διαπερνούν τον εντερικό φραγμό, προκαλώντας συστηματική λοίμωξη στα ζώα, με συνήθως θανατηφόρα κατάληξη. Τα στελέχη αυτά προσέλκυσαν γρήγορα το ενδιαφέρον, με την έρευνα να εστιάζεται στην πρόκληση πειραματικών μολύνσεων, στην ανίχνευση γενετικών δεικτών διαφοροποίησής τους από τα κοινά στελέχη, καθώς και στην ανεύρεση μέσων προφύλαξης έναντι αυτών. Η ανίχνευση στελεχών που διαπερνούν τον εντερικό φραγμό σε πολλές περιοχές της Ευρώπης (περιλαμβανομένης της Ελλάδας) υποδηλώνει την κυκλοφορία νέων βιοτύπων του ιού. Η έντονη γενετική ποικιλότητα των στελεχών, η ύπαρξη σύμμικτων μολύνσεων και η έλλειψη απόλυτα διασταυρούμενων αντιδράσεων μεταξύ των τύπων και των υποτύπων του ιού εγείρουν ερωτηματικά σχετικά με την αποτελεσματικότητα των υπαρχόντων εμβολίων. Λέξεις ευρετηρίασης: διάρροια, εμβόλια, κοροναϊός, σκύλος ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κοροναϊός του σκύλου (Canine coronavirus, O CCoV) αποτελεί ένα σημαντικό αιτιολογικό παράγοντα οξείας διάρροιας στους σκύλους, ιδιαίτερα σε κουτάβια. Η πρώτη αναφορά λοίμωξης από τον ιό έγινε το 1974 (Binn et al. 1974), λίγα χρόνια αργότερα δε, την άνοιξη και το καλοκαίρι του 1978, σημειώθηκαν στις ΗΠΑ σημαντικές εξάρσεις της νόσου, από τις οποίες απομονώθηκε ο ιός (Carmichael and Binn 1981). Σήμερα, έχει επιβεβαιωθεί η παγκόσμια εξάπλωση του ιού και η συσχέτισή του με κρούσματα συνήθως οξείας διάρροιας ήπιας μορφής. Την τελευταία δεκαετία ωστόσο, αυξάνονται οι αναφορές παραλλαγμένων στελεχών που χαρακτηρίζονται από υψηλή λοιμογόνο δύναμη και συνδέονται με την πρόκληση συστηματικής νόσου. Αυτή η εξέλιξη έρχεται σε αντίθεση με την ως τώρα πεποίθηση ότι ο CCoV είναι ιός που προκαλεί αποκλειστικά ήπιας μορφής διάρροια. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Ο Κοροναϊός του σκύλου ανήκει στην τάξη Nidovirales και στην οικογένεια Coronaviridae. Η πρόσφατα αναθεωρημένη ταξινόμηση της τάξης χωρίζει την οικογένεια Coronaviridae σε δύο υποοικογένειες: Coronavirinae (η οποία περιλαμβάνει 4 γένη, τα Alphacoronavirus, Betacoronavirus,

3 Ντάφης Β., Παπαναστασοπούλου Μ., Ξυλούρη Ε. 59 Gammacoronavirus και Deltacoronavirus) και Torovirinae. O CCoV κατατάσσεται στο γένος Alphacoronavirus και στο είδος Alphacoronavirus-1, μαζί με τον Κοροναϊό της γάτας (Feline coronavirus), τον Ιό της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας των χοίρων (Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV) και τον Αναπνευστικό κοροναϊό του χοίρου (Porcine respiratory coronavirus, PRCoV), με τους οποίους εμφανίζει στενή γενετική συγγένεια (Carstens 2010, Adams and Carstens 2012). Ο CCoV δεν πρέπει να συγχέεται με τον Αναπνευστικό κοροναϊό του σκύλου (Canine respiratory coronavirus), η δομή και η αντιγονικότητα του οποίου είναι διαφορετικές από τον CCoV, ανήκει δε στο είδος Betacoronavirus 1 του γένους Betacoronavirus (Ntafis and Xylouri 2012a). ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ - ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ - ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Τα ιικά σωματίδια του CCoV είναι σφαιρικά έως ελλειψοειδή, με μέγεθος nm (Takeuchi et al. 1976) και τυπική μορφολογία κοροναϊών στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, από την οποία και προέρχεται η ονομασία τους. Η ονομασία των κοροναϊών προέρχεται από την παρουσία σε αυτούς στεφάνης, ωσάν ηλιακή κορώνα, η οποία χαρακτηρίζει την τυπική μορφολογία των ιών αυτών κατά την παρατήρηση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (de Groot et al. 2011). Το νουκλεοκαψίδιο του ιού έχει ελικοειδή συμμετρία και απαρτίζεται από το γονιδιακό RNA και τη φωσφοπρωτεΐνη Ν. Εξωτερικά, περιβάλλεται από το λιποπρωτεϊνικό περίβλημα, στο σχηματισμό του οποίου συμμετέχουν οι γλυκοπρωτεΐνες, S, M και Ε (Lai and Holmes 2001, Balasuriya and Stott 2004). Η γλυκοπρωτεΐνη S σχηματίζει τα πεπλομερή, η γλυκοπρωτεΐνη Μ είναι διαμεμβρανική, ενώ η γλυκοπρωτεΐνη Ε υπάρχει σε μικρές ποσότητες (Masters 2006). Η γλυκοπρωτεΐνη S είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση του ιού με τους υποδοχείς του κυττάρου και τη συγχώνευση του ιικού περιβλήματος με την κυτταροπλασματική μεμβράνη. Η σημασία της γλυκοπρωτεΐνης S για την επιβίωση του ιού, διαφαίνεται από το γεγονός ότι η αδρανοποίησή της από αντισώματα (εξουδετερωτικά αντισώματα) του ξενιστή προκαλεί εξουδετέρωση του ιού, ενώ μεταλλάξεις του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη οδηγούν στη δημιουργία στελεχών του ιού ικανών να διαφύγουν από τους μηχανισμούς της ανοσίας. Η γλυκοπρωτεΐνη Μ υποκινεί τη συγκρότηση των ιικών σωματιδίων (σε συνεργασία με την πρωτεΐνη Ε), ενώ η παρουσία της στον ξενιστή προκαλεί την παραγωγή ιντερφερόνης-α και αντισωμάτων (Enjuanes et al. 2000, Lai and Holmes 2001, Balasuriya and Stott 2004, Masters 2006). Ο CCoV φέρει ευθύγραμμο, θετικής πολικότητας, μονόκλωνο RNA, το οποίο περιέχει συνολικά 10 γονίδια. Τα γονίδια της πολυμεράσης (pol) και των τεσσάρων δομικών πρωτεϊνών είναι οργανωμένα στη σειρά 5 -pol-s-e-m-n-3. Το γονίδιο pol καταλαμβάνει τα δύο τρίτα του γονιδιώματος και κωδικοποιεί μία RNA-εξαρτημένη RNA πολυμεράση. Μεταξύ των γονιδίων που προαναφέρθηκαν, παρεμβάλλονται γονίδια που κωδικοποιούν τις μη δομικές πρωτεΐνες, οι λειτουργίες των οποίων δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. Η έκφρασή τους φαίνεται ότι έχει αρνητική επίδραση στην προσαρμογή των ιών in vitro. Ωστόσο, η απώλειά τους έχει συνδεθεί με απώλεια της λοιμογόνου δύναμης αυτών (Lai and Holmes 2001, Woods 2001, de Haan et al. 2002, Ortego et al. 2003, Lissenberg et al. 2005). ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ - ΕΞΕΛΙΞΗ Φαίνεται ότι οι παράγοντες που οδηγούν σε εμφάνιση μεγάλης γενετικής ποικιλότητας στους κοροναϊούς είναι τρεις: (α) η έλλειψη πιστότητας και διόρθωσης που χαρακτηρίζει την RNA-εξαρτημένη RNA πολυμεράση και οδηγεί σε συχνή εμφάνιση μεταλλάξεων, (β) οι γενετικοί ανασυνδυασμοί που παρατηρούνται κυρίως εξαιτίας του τρόπου πολλαπλασιασμού των κοροναϊών και (γ) το εξαιρετικά μεγάλο γονιδίωμά τους (Woo et al. 2009). Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί ο τύπου Ι και ο τύπου ΙΙ CCoV. Στον τύπο ΙΙ κατατάσσονται τα κλασικά στελέχη, ενώ στον τύπο Ι ταξινομούνται στελέχη τα οποία εμφανίζουν μεγάλη γενετική ομοιότητα με στελέχη του Κοροναϊού της γάτας (Lorusso et al. 2008). Αιτία για την έρευνα στη γενετική ποικιλότητα του CCoV αποτέλεσαν σημειακές μεταλλάξεις στο γονίδιο Μ ορισμένων στελεχών και αντικαταστάσεις αμινοξέων, με αποτέλεσμα οι αλληλουχίες που προέκυψαν να ομοιάζουν με εκείνες του Κοροναϊού της γάτας (Pratelli et al. 2001a, 2002). Οι συγκεκριμένες παρατηρήσεις οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι υπάρχουν δύο γενότυποι CCoV, ο τύπος Ι και ο τύπος II, που συνθέτουν στενά συγγενικές ομάδες. Ο CCoV τύπος Ι, ο οποίος αναγνωρίστηκε επίσημα προσφάτως, αρχικά θεωρήθηκε ότι εξελίχθηκε παράλληλα με τον τύπο ΙΙ και ότι δεν έχει προκύψει από ανασυνδυασμό

4 60 Ntafis V., Papanastassopoulou M.,XYLOURI E. μεταξύ του τύπου Ι του FCoV και του τύπου II του CCoV. Μάλιστα θεωρήθηκε πιθανό, τόσο ο FCoV όσο και ο CCoV τύπου Ι να προέκυψαν από έναν κοινό προγονικό κοροναϊό, μέσω δε ανασυνδυασμών να εξελίχθηκαν παράλληλα (Pratelli et al. 2003a, 2003b, 2004b). Πλέον, υποστηρίζεται ότι ο τύπου Ι CCoV προϋπήρχε του τύπου ΙΙ (Lorusso et al., 2008). Οι δύο τύποι έχουν διαφορετικά γενετικά και βιολογικά χαρακτηριστικά. Η διαφορά αυτή γίνεται ιδιαίτερα αντιληπτή στο γονίδιο S, όπου η ομοιότητα φτάνει μόλις σε 61%, γεγονός που αντανακλά το αντιγονικό επίπεδο. Σε αρκετά γονίδια μάλιστα, ο τύπου Ι CCoV εμφανίζει μεγαλύτερη ομοιότητα με τον Κοροναϊό της γάτας, παρά με τα κλασικά στελέχη CCoV. Επιπλέον, στον τύπου Ι CCoV, αμέσως μετά το γονίδιο S, υπάρχει ένα επιπλέον ORF (ORF3), που κωδικοποιεί μία γλυκοπρωτεΐνη (gp3). Ωστόσο, η αδυναμία απομόνωσης του τύπου Ι CCoV σε κυτταροκαλλιέργειες δυσχεραίνει την έρευνα στην παθογένεια και στα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά αυτού (Pratelli et al. 2004b, 2006, Lorusso et al. 2008). Στη δεκαετία του 1970, απομονώθηκε στις ΗΠΑ το στέλεχος UCD-1, το οποίο είχε την ικανότητα να πολλαπλασιάζεται εύκολα σε κύτταρα χοίρου, σε αντίθεση με τα περισσότερα στελέχη CCoV (Wesley 1999). Το γεγονός αυτό οδήγησε τον Wesley (1999) στην παρατήρηση ότι το συγκεκριμένο στέλεχος παρουσίαζε ομοιότητα στο 5 -άκρο του γονιδίου S με εκείνο του Ιού της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας. Το 2009, επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη στελεχών CCoV, στα οποία το αμινοτελικό άκρο της S πρωτεΐνης προέρχεται από ανασυνδυασμό κλασικών στελεχών CCoV με Ιό της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των στελεχών αυτών είναι η ανίχνευσή τους σε εντερικό περιεχόμενο και σε όργανα νεκρών από γαστρεντερίτιδα σκύλων, στους οποίους όμως ανιχνεύθηκε παράλληλα σύμμικτη λοίμωξη από Παρβοϊό του σκύλου τύπου 2. Εντούτοις, κατά την πειραματική μόλυνση σκύλων, παρατηρήθηκε η κλασική συμπτωματολογία από CCoV, ενώ ο ιός ανιχνεύθηκε στα κόπρανα, όχι όμως και στο αίμα (Decaro et al., 2009, Ntafis et al., 2011a). Τα νέα αυτά στελέχη ταξινομούνται σήμερα ως υπότυπος CCoV-IIb, ενώ τα κλασικά στελέχη του Κοροναϊού του σκύλου κατατάσσονται στον υπότυπο CCoV-IIa (Decaro et al. 2010) (Εικ. 1). Επιπλέον, ανασυνδυασμοί μεταξύ των δύο τύπων CCoV έχουν αναφερθεί στην Ευρώπη και την Αμερική (Escutenaire et al. 2007, Regan et al. 2012), μέσω δε αυτών αναδύονται συνεχώς νέα στελέχη, με νέα χαρακτηριστικά, καθιστώντας την ταξινόμηση του CCoV υπό διαρκή αξιολόγηση και αναθεώρηση. Για την πρόκληση των ανασυνδυασμών, είναι απαραίτητη η παρουσία σύμμικτης μόλυνσης. Πειραματικές μελέτες προς αυτή την κατεύθυνση έχουν επιβεβαιώσει τη μόλυνση γατών με CCoV, ενώ δεν μπορεί να αποκλειστεί και το ενδεχόμενο μόλυνσης σκύλων από Κοροναϊό της γάτας (McArdle et al. 1992, Barlough et al. 1994). Επιπλέον, έχει επιτευχθεί πειραματική μόλυνση χοιριδίων με στελέχη του CCoV (Woods et al. 1981, Woods and Wesley 1992), ενώ σε πειραματικές μολύνσεις κουταβιών με Ιό της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας βρέθηκε ότι ενδεχομένως οι σκύλοι παίζουν ρόλο στην επιδημιολογία της νόσου στους χοίρους (Larson et al. 1979). ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ Ο ιός εισέρχεται στον οργανισμό κυρίως από το στόμα, σπανιότερα δε μέσω της αναπνευστικής οδού. Στο γαστρεντερικό σωλήνα, διέρχεται από το στόμαχο, δεδομένου ότι είναι ανθεκτικός σε συνθήκες όξινου ph, και φθάνει στο λεπτό έντερο. Η παρεντερική χορήγηση του ιού δεν συνοδεύεται από μόλυνση του εντέρου (Binn et al. 1974, Appel 1987). Ο πολλαπλασιασμός του ιού ξεκινάει από το δωδεκαδάκτυλο και επεκτείνεται σε όλο το λεπτό έντερο, προκαλώντας μείωση του αριθμού των κυττάρων και ατροφία των λαχνών. Το παχύ έντερο μάλλον δεν προσβάλλεται (Binn et al. 1974, Keenan et al. 1976, Takeuchi et al. 1976, Appel et al. 1979, Carmichael and Binn 1981). Ο ιός προσβάλλει τα κύτταρα των εντερικών λαχνών που βρίσκονται στα αρχικά δύο-τρίτα του λεπτού εντέρου. Τα κύτταρα των κρυπτών δεν μολύνονται, αλλά εκδηλώνουν αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού. Ο ιός πολλαπλασιάζεται και απελευθερώνεται στον εντερικό αυλό, μπορεί δε να ανιχνευθεί στα κόπρανα εντός τουλάχιστον 48 ωρών μετά τη μόλυνση. Φαίνεται ότι ο ιός μολύνει επίσης κύτταρα με ευρεία διασπορά, όπως τα μακροφάγα, καθώς και άλλους ιστούς (π.χ., μεσεντέρια λεμφογάγγλια, ήπαρ, σπλήνας) (Binn et al. 1974, Keenan et al. 1976, Takeuchi et al. 1976, Carmichael and Binn 1981, Appel 1987, Enjuanes et al. 2000). Η διάρροια αποτελεί το επακόλουθο της κακής απορρόφησης και της έλλειψης πεπτικών ενζύμων, καθώς, σε κουτάβια, έχει παρατηρηθεί μείωση της δραστηριότητας των εντερικών ενζύμων (Keenan et al. 1976, Takeuchi et al. 1976). Τελικά, η παραγωγή

5 Ντάφης Β., Παπαναστασοπούλου Μ., Ξυλούρη Ε. 61 αντισωμάτων (IgA) περιορίζει την εξάπλωση του ιού και οδηγεί σε προοδευτική αποκατάσταση των λαχνών του λεπτού εντέρου, μειώνοντας σταδιακά και την απέκκριση του ιού (Keenan et al. 1976, Appel 1987). ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Οι δομικές πρωτεΐνες S, M και Ν διεγείρουν την πρόκληση ισχυρής χυμικής ανοσίας (Enjuanes et al. 2000, Elia et al. 2002). Αυξημένος τίτλος εξουδετερωτικών αντισωμάτων ανιχνεύεται από τη 14η έως την 60ή ημέρα μετά τη μόλυνση. Με τη μέθοδο ELISA, αντισώματα ανιχνεύονται έως και 3 μήνες μετά τη μόλυνση (Pratelli et al. 2002). Η μητρικής προέλευσης ανοσία διαρκεί 4-5 εβδομάδες, όμως ο τίτλος των αντισωμάτων στα νεογέννητα είναι, συνήθως, χαμηλός. Τα αντισώματα είναι δυνατόν να προστατεύουν από φυσική μόλυνση στο διάστημα αυτό, αν και έχουν διαγνωστεί κλινικές λοιμώξεις λόγω προσβολής από Κοροναϊό του σκύλου και σε κουτάβια ηλικίας μικρότερης των 6 εβδομάδων με μητρικής προέλευσης αντισώματα (Appel 1987). Ο παρεντερικός ενοφθαλμισμός του ιού οδηγεί σε αύξηση του τίτλου των αντισωμάτων, αλλά δεν φαίνεται ότι προστατεύει τα ζώα από πιθανή μελλοντική μόλυνση, ούτε αποτρέπει την απέκκριση του ιού. Ενδεχομένως λοιπόν, η φυσική ενεργητική ανοσία μπορεί να αποδοθεί στην τοπική παραγωγή ανοσοσφαιρίνης Α στο έντερο (Appel 1987, Decaro et al. 2004b). ΚΛΙΝΙΚΑ ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΑ - ΠΑΘΟΛΟΓΟΑΝΑΤΟΜΙΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ Η λοίμωξη από Κοροναϊό του σκύλου συνήθως εκδηλώνεται με ανορεξία, κατάπτωση, λήθαργο και γαστρεντερικά συμπτώματα, όπως έμετο, ειδικά τις πρώτες δύο ημέρες, και διάρροια, ενδεχομένως αιμορραγική. Τα κόπρανα είναι μαλακά, πολτώδη ή υδαρή, με κίτρινο έως πράσινο χρωματισμό, συνήθως δε αναδύουν χαρακτηριστικά αποκρουστική οσμή. Η διάρροια εκδηλώνεται 1-7 ημέρες μετά από την έκθεση στον ιό, διαρκεί συνήθως επί 1-2 εβδομάδες, αν και έχουν επίσης αναφερθεί περιστατικά με μακροχρόνια διάρροια. Η διάρροια συνοδεύεται πάντα από αφυδάτωση. Το ποσοστό θνητότητας είναι συνήθως χαμηλό, ιδιαίτερα σε ενήλικες σκύλους. Περιστασιακά, οι σκύλοι μπορεί να εμφανίσουν πυρετό. Tα ενήλικα ζώα συνήθως δεν εμφανίζουν συμπτώματα. Τα περισσότερα ζώα συνήθως αναρρώνουν μετά από περίοδο 7-10 ημερών (Keenan et al. 1976, Carmichael and Binn 1981, Appel 1987, Balasuriya and Stott 2004). Προκαταρκτικές μελέτες αναφέρουν ότι λοιμώξεις οφειλόμενες σε στελέχη τύπου Ι, τύπου ΙΙ και υποτύπου IIb εκδηλώνονται με παρόμοια συμπτωματολογία (Decaro et al. 2005, 2009). Συνήθεις μακροσκοπικές αλλοιώσεις αποτελούν η διάταση των εντερικών ελίκων και το πολτώδες έως υδαρές εντερικό περιεχόμενο με κίτρινο ή πράσινο χρωματισμό. Το εντερικό τοίχωμα εμφανίζεται οιδηματικό, συμφορημένο έως αιμορραγικό. Τα μεσεντέρια λεμφογάγγλια εμφανίζονται συνήθως Εικ. 1. Φυλογενετική ανάλυση του Κοροναϊού του σκύλου (CCoV), του Κοροναϊού της γάτας (FCoV) και του Ιού της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας του χοίρου (TGEV) βασισμένη στα αμινοξέα της πρωτεΐνης S. Στο δέντρο διαπιστώνονται τρεις κύριοι εξελικτικοί κλάδοι: ο πρώτος σχηματίζεται από τον τύπο Ι του Κοροναϊού του σκύλου και τον τύπο Ι του Κοροναϊού της γάτας, ο δεύτερος από τον υποτύπο IIb του Κοροναϊού του σκύλου και τον Ιό της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας του χοίρου και ο τρίτος από τον υποτύπο IIa του Κοροναϊού του σκύλου και τον τύπο ΙΙ του Κοροναϊού της γάτας (του οποίου το γονίδιο S προέρχεται από ανασυνδυασμό με τον CCoV- IIa). Στο δέντρο χρησιμοποιείται ως εξωτερική ομάδα ο Αναπνευστικός κοροναϊός του σκύλου (CRCoV).

6 62 Ntafis V., Papanastassopoulou M.,XYLOURI E. διογκωμένα και οιδηματικά (Appel et al. 1979). Η ιστολογική εικόνα στο λεπτό έντερο χαρακτηρίζεται από βράχυνση, άμβλυνση και συγχώνευση των λαχνών, καθώς και βάθυνση των κρυπτών. Τα κύτταρα των λαχνών εμφανίζονται κενοτοπιώδη και χαρακτηρίζονται από καταστροφή της ψυκτροειδούς παρυφής τους. Στο ύψος του βασικού υμένα παρατηρείται αυξημένη κυτταροβρίθεια, με κυρίαρχη παρουσία λεμφοκύτταρων, μακροφάγων και πολυμορφοπύρηνων (Keenan et al. 1976, Takeuchi et al. 1976, Appel 1987, McCaw and Hoskins 2006). ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ Γεωγραφική κατανομή Ο ιός έχει παγκόσμια εξάπλωση και έχει ανιχνευθεί ή απομονωθεί στην Ευρώπη, τις ΗΠΑ, την Ασία και την Αυστραλία (Carmichael and Binn 1981, Appel 1987, Bandai et al. 1999, Naylor et al. 2001b). Σύμφωνα με έρευνα που διενεργήθηκε σε σκύλους με γαστρεντερίτιδα από 14 χώρες της Ευρώπης, ο Κοροναϊός του σκύλου ανιχνεύθηκε σε 42% των ζώων. Σε 19% των θετικών δειγμάτων ανιχνεύθηκε ο τύπος Ι του ιού, σε 44% ο τύπος ΙΙ, ενώ σε 37% ανιχνεύθηκαν και οι δύο τύποι αυτού, καταδεικνύοντας τη μεγάλη συχνότητα των σύμμικτων μολύνσεων. Επιπλέον, 20% των στελεχών του τύπου ΙΙ αναγνωρίσθηκε ως υποτύπος IIb (Decaro et al. 2010). Η πρώτη αναφορά του ιού στην Ελλάδα έγινε το 2010 και αφορούσε σε έξαρση περιστατικών οξείας διάρροιας σε κυνοκομείο των Τρικάλων (Ntafis et al. 2010a). Στη συνέχεια, διαπιστώθηκε, με χρήση μοριακών τεχνικών, η παρουσία του ιού σε σκύλους με οξεία διάρροια (56%), καθώς και η παρουσία των δύο τύπων και υποτύπων σε δείγματα από διάφορες περιοχές της Ελλάδας, υποδηλώνοντας την ευρεία διασπορά του ιού στη χώρα (Ntafis et al. 2010b). Το ποσοστό αυτό είναι υψηλότερο από εκείνα που καταγράφηκαν σε άλλες χώρες, όπως η Ιταλία, η Τουρκία, η Αγγλία, η Ιαπωνία και η Πορτογαλία, αλλά χαμηλότερο από το αντίστοιχο της Ουγγαρίας (78%) (Bandai et al. 1999, Yesilbag et al. 2004, Decaro et al. 2010). Επιπλέον, το ποσοστό είναι υψηλότερο από εκείνο του Παρβοϊού του σκύλου τύπου 2 που διαπιστώθηκε σε σκύλους την ίδια περίοδο στην Ελλάδα, υποδηλώνοντας ότι, ενδεχομένως, ο Κοροναϊός του σκύλου εμπλέκεται συχνότερα σε κρούσματα οξείας διάρροιας στη χώρα (Ntafis et al. 2010c). Διασπορά και μετάδοση Ο Κοροναϊός του σκύλου μεταδίδεται κυρίως μέσω της πεπτικής και της αναπνευστικής οδού (επαφή με κόπρανα) (Enjuanes et al. 2000). Ο ιός αποβάλλεται με τα κόπρανα επί 6 έως 9 ημέρες μετά από τη μόλυνση, αν και υπάρχουν αναφορές όπου αποβαλλόταν και για περίοδο μεγαλύτερη από 5 μήνες (Keenan et al. 1976, Pratelli et al. 2001a, 2002). Το νόσημα χαρακτηρίζεται από μεγάλη μεταδοτικότητα και το ποσοστό οροθετικών ζώων είναι σημαντικά υψηλότερο σε κυνοκομεία (σε περιπτώσεις πυκνών πληθυσμών) σε σύγκριση με εκείνο των οικόσιτων σκύλων (Rimmelzwaan et al. 1991, Naylor et al. 2001b). Οι υψηλές θερμοκρασίες αδρανοποιούν τον ιό, ενώ όσο χαμηλότερη είναι η θερμοκρασία, τόσο μεγαλύτερο το χρονικό διάστημα για το οποίο ο ιός διατηρεί την λοιμογόνο δύναμή του. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το νόσημα να εμφανίζει εποχικότητα, με συχνότερη εκδήλωση κατά τη χειμερινή περίοδο (Carmichael and Binn 1981, Tennant et al. 1994). Όλες οι φυλές και οι ηλικίες των σκύλων μπορούν να προσβληθούν, ωστόσο τα νεαρά ζώα (6-12 εβδομάδων) είναι πιο ευπαθή (Appel 1987, Carmichael and Binn 1981). Εκτός από σκύλους, ο ιός μολύνει και άλλα μέλη της οικογένειας Canidae, όπως κογιότ, λύκους και αλεπούδες (Davidson et al. 1992, Zarnke et al. 2001), ενώ πρόσφατα, ανιχνεύτηκε σε πάντα (οικογένεια Ursidae), στα οποία συσχετίστηκε με την εμφάνιση θανατηφόρου νόσου (Gao et al. 2009). Σύμμικτες λοιμώξεις Η σύμμικτη λοίμωξη με άλλους ιούς, βακτήρια ή παράσιτα μπορεί να οδηγήσει σε εκδήλωση πιο σοβαρής κλινικής εικόνας (McCaw and Hoskins 2006). Σε σκύλους, έχουν αναφερθεί σύμμικτες λοιμώξεις από Κοροναϊό του σκύλου και Παρβοϊό του σκύλου τύπου 2, από Κοροναϊό του σκύλου και Αδενοϊό του σκύλου τύπου 1, καθώς και από Κοροναϊό του σκύλου και Νοροϊό του σκύλου (Pratelli et al. 2001b, Ntafis et al. 2010d, 2011b). Σε έρευνα στην Ελλάδα, διαπιστώθηκε η μεγάλη συχνότητα σύμμικτων λοιμώξεων από Κοροναϊό του σκύλου και Παρβοϊό του σκύλου τύπου 2 (28% των σκύλων με οξεία διάρροια) (Ntafis et al. 2011b). Συχνές είναι και οι μολύνσεις από περισσότερα του ενός στελέχη του ιού, διαφορετικών τύπων ή υποτύπων (Decaro et al. 2010). Έχει διαπιστωθεί ότι τέτοιου είδους προσβολές μπορεί να είναι συχνότερες

7 Ντάφης Β., Παπαναστασοπούλου Μ., Ξυλούρη Ε. 63 από ότι εκείνες με ένα στέλεχος (Pratelli et al. 2004a), ο ρόλος τους ωστόσο δεν έχει πλήρως αποσαφηνισθεί. Προκαταρκτική μελέτη υποδεικνύει ότι οι σύμμικτες λοιμώξεις με τύπου Ι και τύπου ΙΙ Κοροναϊό του σκύλου σχετίζονται με βαρύτερα κλινικά συμπτώματα, σε σχέση με εκείνες που οφείλονται σε προσβολή μόνον από έναν από τους δύο τύπους (Decaro et al. 2005). ΔΙΑΓΝΩΣΗ Η κλινική διάγνωση του νοσήματος βασίζεται, κατά κύριο λόγο, στη διαπίστωση οξείας, ενδεχομένως αιμορραγικής, διάρροιας. Ωστόσο, η κλινική εικόνα δεν μπορεί να οδηγήσει σε ασφαλή διάγνωση, καθώς ανάλογα ευρήματα παρατηρούνται και σε άλλα νοσήματα πού εκδηλώνονται με εντερίτιδα. Συνακόλουθα, είναι απαραίτητη η εργαστηριακή διάγνωση (McCaw and Hoskins 2006). Από τη δεκαετία του 1970 χρησιμοποιήθηκαν η ανίχνευση του ιού με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, η απομόνωση αυτού σε κυτταροκαλλιέργειες και η ανίχνευση των αντιγόνων του με ανοσοφθορισμό (Binn et al. 1974, Keenan et al. 1976, Roseto et al. 1980). Αργότερα, προστέθηκε στους τρόπους διάγνωσης η ELISA (Rimmelzwaan et al. 1991), η οποία είναι σε θέση να διαφοροποιήσει τα αντισώματα που παράγονται μετά την έκθεση στον τύπο Ι και ΙΙ (IIa ή IIb) του ιού (Pratelli et al. 2004b, Elia et al. 2010). Ο Κοροναϊός του σκύλου πολλαπλασιάζεται σε κυτταρικές σειρές προέλευσης σκύλου και γάτας, αν και η απομόνωσή του θεωρείται δύσκολη, εξαιτίας της ιδιάζουσας φύσης του και των δυσκολιών που προκύπτουν, λόγω του μολυσμένου παθολογικού υλικού (κόπρανα) (Tennant et al. 1994). Το κυτταροπαθογόνο αποτέλεσμα (Εικ. 2α) δεν είναι πάντα εμφανές (Εικ. 2β), οπότε η απομόνωση του ιού πρέπει να επιβεβαιώνεται με εξουδετέρωση ή ανοσοφθορισμό (Εικ. 3) (Appel et al. 1979, Appel et al. 1987, Pratelli 2006). Για την ανίχνευση του Κοροναϊού του σκύλου Εικ. 2. (α) Συνεχής κυτταρική σειρά Α72 με κύτταρα μη μολυσμένα (μεγέθυνση 100 ). (β) Συνεχής κυτταρική σειρά Α72 με έκδηλο κυτταροπαθογόνο αποτέλεσμα από Κοροναϊό του σκύλου (μεγέθυνση 100 ).

8 64 Ntafis V., Papanastassopoulou M.,XYLOURI E. στην κλινική πράξη έχουν αναπτυχθεί διάφορες ανοσοχρωματογραφικές μέθοδοι, χωρίς ωστόσο να διαφοροποιούν τα στελέχη του CCoV. Η εφαρμογή μοριακών διαγνωστικών τεχνικών έχει συμβάλει σημαντικά στην αποτελεσματική διάγνωση της λοίμωξης. Η αντίστροφης μεταγραφής - αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (RT-PCR) για την ανίχνευση του RNA του ιού διαθέτει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα (Bandai et al. 1999, Pratelli et al. 2000), ενώ με χρήση κατάλληλων εκκινητών είναι σε θέση να διαφοροποιούνται οι τύποι και οι υπότυποι αυτού (Pratelli et al. 2004a, Decaro et al. 2010). Πρόσφατα, η ανάπτυξη τεχνικών RT-PCR πραγματικού χρόνου επέτρεψε την ταχύτερη και ακριβέστερη διάγνωση της λοίμωξης, ενώ παράλληλα κατέστη δυνατός και ο ποσοτικός προσδιορισμός του ιικού RNA στο δείγμα (Decaro et al. 2004a). Τροποποιήσεις της μεθόδου επιτρέπουν τον ποσοτικό προσδιορισμό και των τύπων Ι και ΙΙ του ιού (Decaro et al. 2005). ΠΡΟΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΣ Τα πρώτα εμβόλια για την αντιμετώπιση της λοίμωξης κυκλοφόρησαν στη δεκαετία του 1980 και έκτοτε έχουν παρασκευαστεί διάφορα είδη εμβολίων. Ωστόσο, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της αναφοράς του American Animal Hospital Association (AAHA), δεν συνιστάται ο εμβολιασμός των σκύλων έναντι του ιού (Paul et al. 2006). Μελέτες σχετικά με την αποτελεσματικότητα ενός αδρανοποιημένου εμβολίου (DURAMUNE PC, Zoetis) έναντι του Κοροναϊού του σκύλου έδειξαν ότι δεν ήταν δυνατή η αποτροπή της απέκκρισης του ιού μετά από φυσική μόλυνση των ζώων, παρά μόνον η μείωση της διάρκειάς της. Ωστόσο, τα εμβολιασμένα ζώα δεν εκδήλωσαν κλινικά συμπτώματα (Pratelli et al. 2003c). Αντίστοιχα δεδομένα για εμβόλιο μεωμένης λοιμογόνου δύναμης, χορηγούμενο από τη στοματορινική οδό, ανέφεραν πρόληψη της εκδήλωσης των κλινικών συμπτωμάτων της νόσου και της αποβολής του ιού μετά από φυσική μόλυνση (Pratelli et al. 2004c), ενώ ένα αδρανοποιημένο εμβόλιο βασισμένο σε ανασυνδυασμένα στελέχη του ιού (CCoV-IIb), προλαμβάνει την εκδήλωση κλινικών συμπτωμάτων της νόσου, όχι όμως την απέκκριση του ιού (Decaro et al. 2011). Τα δύο παραπάνω εμβόλια παρασκευάστηκαν στα πλαίσια ερευνητικών μελετών (Pratelli et al. 2004c, Decaro et al. 2011). Στο προτεινόμενο εμβολιακό πρωτόκολλο περιλαμβάνονται δύο εμβολιασμοί, με διαφορά 3 έως 4 εβδομάδων, ακολουθούμενοι από ετήσια αναμνηστική δόση (McCaw and Hoskins 2006). Σημειώνεται ωστόσο ότι δεν είναι εξακριβωμένο αν τα εμβόλια που κυκλοφορούν προστατεύουν έναντι του τύπου I και του υποτύπου IIb του ιού, καθώς προκαταρκτικές μελέτες έδειξαν ότι οι κατηγορίες αυτές δεν εμφανίζουν απόλυτα διασταυρούμενες αντιδράσεις με τον υποτύπου IIa του ιού, ο οποίος χρησιμοποιείται για την παρασκευή των εμβολίων που έχουν άδεια κυκλοφορίας (Pratelli et al. 2004b, Decaro et al. 2009). Τέλος, πρέπει να επισημανθεί το ενδεχόμενο ανασυνδυασμών μεταξύ άγριων και εμβολιακών στελεχών ελαττωμένης λοιμογόνου δύναμης, που μπορεί να οδηγήσουν στη δημιουργία νέων στελεχών, όπως έχει ήδη διαπιστωθεί στους κοροναϊούς των πτηνών (Jia et al. 1995). Σε χώρους όπως τα κυνοκομεία και τα καταφύγια σκύλων, πρέπει να εφαρμόζονται αυστηρές συνθήκες υγιεινής και συχνές απολυμάνσεις, με στόχο τη μείωση του ιικού φορτίου στο περιβάλλον. Διάφορες απολυμαντικές ουσίες έχουν ελεγχθεί για την αποτελεσματικότητά τους έναντι του ιού (Pratelli 2007) και το υποχλωριώδες νάτριο, η αιθανόλη, η ισοπροπανόλη και το χλωριούχο βενζαλκόνιο φαίνεται ότι είναι αποτελεσματικά (Wolff et al. 2005). Σε κάθε περίπτωση, πρέπει να λαμβάνεται πάντοτε υπόψη η πιθανότητα άμεσης μετάδοσης μεταξύ των ζώων και η ύπαρξη ζώων που αποβάλουν τον ιό για μεγάλο χρονικό διάστημα, γεγονότα Εικ. 3. Αποτελέσματα εφαρμογής έμμεσου ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση Κοροναϊού του σκύλου στη συνεχή κυτταρική σειρά Α72 (μεγέθυνση 100 ). Στο κυτταρόπλασμα των μολυσμένων κυττάρων διακρίνεται ειδικός φθορισμός στις περιοχές που συγκεντρώνονται τα ιικά σωματίδια.

9 Ντάφης Β., Παπαναστασοπούλου Μ., Ξυλούρη Ε. 65 που δυσχεραίνουν την πρόληψη της μόλυνσης στα κυνοκομεία (Appel 1987, Pratelli et al. 2001a, Pratelli et al. 2002). ΠΑΡΑΛΛΑΓΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ ΚΑΙ ΣΤΕΛΕΧΗ ΠΟΥ ΔΙΑΠΕΡΝΟΥΝ ΤΟΝ ΕΝΤΕΡΙΚΟ ΦΡΑΓΜΟ Τα τελευταία χρόνια αυξάνονται συνεχώς οι αναφορές σε νέα στελέχη Κοροναϊού του σκύλου αυξημένης λοιμογόνου δύναμης. Τα στελέχη αυτά παρουσιάζουν γενετική απόκλιση από τα συνήθη και συσχετίζονται με την εκδήλωση βαρειάς νόσου του γαστρεντερικού συστήματος. Ως παράδειγμα αναφέρεται το στέλεχος UWSMN-1, που απομονώθηκε στην Αυστραλία από περιστατικά θανατηφόρου γαστρεντερίτιδας σε εκτροφή σκύλων (Naylor et al. 2001a, 2002), και το στέλεχος BGF10, που απομονώθηκε από ανάλογα περιστατικά στη Μεγάλη Βρετανία (Sanchez-Morgado et al. 2004). Στελέχη με αυξημένη λοιμογόνο δύναμη έχουν επίσης αναφερθεί σε δύο περιπτώσεις γαστρεντερίτιδας στις ΗΠΑ από Κοροναϊό του σκύλου με θανατηφόρο κατάληξη, όπου διαπιστώθηκαν αλλοιώσεις και σε άλλα, πλην του εντέρου, όργανα (Evermann et al. 2005). Από τα πρώτα χρόνια μελέτης του ιού δημιουργήθηκαν υπόνοιες ότι υπάρχουν στελέχη που διαπερνούσαν τον εντερικό φραγμό και εντοπίζονταν σε ιστούς πέραν του εντερικού επιθηλίου (Keenan et al. 1976). Η επιβεβαίωση έγινε το 1991, σε πειραματική μόλυνση κουταβιών ηλικίας 10 εβδομάδων, στα οποία ο ιός, εκτός από το εντερικό περιεχόμενο, απομονώθηκε και από τα μεσεντέρια λεμφογάγγλια, τους πνεύμονες, το σπλήνα και τις αμυγδαλές (Tennant et al. 1991). Το 2005, σε κατάστημα πώλησης ζώων στην Ιταλία, παρατηρήθηκαν θανατηφόρα κρούσματα συστηματικής νόσου σε επτά κουτάβια, με χαρακτηριστικά αιμορραγική διάρροια, λήθαργο, έμετο, λευκοπενία, νευρολογικά συμπτώματα και πυρετό. Σε όλα τα περιστατικά, ανιχνεύθηκε στο έντερο και σε άλλα όργανα των προσβεβλημένων ζώων το στέλεχος CB/05 τύπου ΙΙ Κοροναϊού του σκύλου. Από τα κουτάβια δεν απομονώθηκε οποιοσδήποτε άλλος παθογόνος μικροοργανισμός, αποκλείοντας έτσι το ενδεχόμενο σύμμικτης λοίμωξης (Buonavoglia et al. 2006). Κατά τη μοριακή ανάλυση του στελέχους, διαπιστώθηκε μια πλαισιοτροπική μετάλλαξη απάλειψης 38 νουκλεοτιδίων στο ORF 3b, η οποία ενδεχομένως να ήταν υπεύθυνη για τη μεταβολή του τροπισμού του στελέχους (Decaro et al. 2007). Η συστηματική νόσος που προκάλεσε το στέλεχος CB/05 επιβεβαιώθηκε πειραματικά, αλλά ο ιός ανιχνεύτηκε στο αίμα μόνον ενός πειραματόζωου και σε πολύ μικρή ποσότητα (Decaro et al. 2008). Ιδιαίτερο εύρημα αποτέλεσε η λεμφοπενία, που παρατηρήθηκε στις πειραματικές μολύνσεις με το στέλεχος CB/05, η οποία αφορούσε κυρίως στα Τ λεμφοκύτταρα, καθώς δεν αποτελεί σύνηθες εύρημα των λοιμώξεων από Κοροναϊό του σκύλου (Marinaro et al. 2010). Παρόμοιες με τις παραπάνω μεταλλάξεις στον Κοροναϊό της γάτας οδηγούν σε αλλαγή τροπισμού του, με αποτέλεσμα την εκδήλωση λοιμώδους περιτονίτιδας (Vennema et al. 1998). Σε αυτές τις περιπτώσεις, παρατηρείται επίσης πολύ μικρή ποσότητα του ιού στο αίμα των προσβεβλημένων ζώων (de Groot-Mijnes et al. 2005). Τα παθολογοανατομικά ευρήματα στα ζώα με πειραματική μόλυνση ήταν ανάλογα με εκείνα στα κρούσματα φυσικής συστηματικής νόσου στην Ιταλία (Buonavoglia et al. 2006), δηλαδή αιμορραγική εντερίτιδα, οροαιμορραγικό υγρό στην περιτοναϊκή κοιλότητα, αιμορραγικά έμφρακτα στη φλοιώδη μοίρα των νεφρών, πετέχιες στα λεμφογάγγλια και συμφορημένο ήπαρ με κίτρινοκαφέ χρωματισμό (Buonavoglia et al. 2006, Decaro et al. 2008). Παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν σε μία ακόμα ανάλογη περίπτωση, όπου παράλληλα ο ιός ανιχνεύτηκε με ανοσοϊστοχημεία σε μακροφάγα/ ιστιοκύτταρα του πνεύμονα, σε κύτταρα του Kupffer και περιαγγειακά μονοπύρηνα στο ήπαρ (Zappuli et al. 2008). Φαίνεται, λοιπόν, ότι τέτοιου είδους στελέχη ενδεχομένως προκαλούν συστηματική λοίμωξη με μηχανισμό παθογένειας ανάλογο της λοιμώδους περιτονίτιδας στις γάτες (Kipar et al. 2005, Rottier et al. 2005). Αντίστοιχες θανατηφόρες λοιμώξεις από στελέχη που διαπερνούν τον εντερικό φραγμό έχουν επιβεβαιωθεί στο Βέλγιο και στη Γαλλία, υποδηλώνοντας για πρώτη φορά ότι το παραπάνω στέλεχος δεν αποτελεί τυχαία εξαίρεση στον κανόνα (Zicola et al. 2012). Στην Ελλάδα, η ύπαρξη στελεχών με παντροπισμό επιβεβαιώθηκε το 2012 με την ανίχνευση του στελέχους ΝΑ/09 σε σκύλο με θανατηφόρα αιμορραγική γαστρεντερίτιδα (Ntafis et al. 2012b). Η παρουσία τέτοιων στελεχών έχει επίσης αναφερθεί και σε άλλες χώρες της Ευρώπης (Decaro et al. 2013). Αξίζει να αναφερθεί ότι οι λοιμώξεις από κοινά στελέχη Κοροναϊού του σκύλου, μάλλον δεν αφήνουν

10 66 Ntafis V., Papanastassopoulou M.,XYLOURI E. ικανοποιητική προστατευτική ανοσία έναντι του στελέχους CB/05. Σε πειραματική μόλυνση με το στέλεχος CB/05 ο ιός προκάλεσε νόσο στα ζώα και αποβολή του ιού, παρά την υψηλού επιπέδου χυμική ανοσία των κουταβιών (λόγω πρότερης φυσικής προσβολής τους από άλλο στέλεχος του ιού). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Κύριο χαρακτηριστικό των κοροναϊών αποτελεί η έντονη γενετική ποικιλότητα, η οποία αποδίδεται σε μεταλλάξεις και ανασυνδυασμούς. Αποτέλεσμα αυτής είναι η συνεχής εξέλιξη των ιών με την ανάδυση νέων υποτύπων και στελεχών, την αλλαγή τροπισμού των ιών, καθώς και την υπερπήδηση του φραγμού του ζωικού είδους. Η έντονη παραλλακτικότητα των στελεχών, οι σύμμικτες με έντονη συμπτωματολογία λοιμώξεις, καθώς και η έλλειψη απόλυτα διασταυρούμενων αντιδράσεων μεταξύ των τύπων και των υποτύπων του Κοροναϊού του σκύλου εγείρουν την ανάγκη μελετών για τεκμηρίωση της αποτελεσματικότητας των διαθέσιμων εμβολίων έναντι όλων των τύπων και των υποτύπων του ιού. Τα αδρανοποιημένα εμβόλια που εφαρμόζονται για την πρόληψη της λοίμωξης από Κοροναϊό του σκύλου φαίνεται να μην παρεμποδίζουν την αποβολή του ιού μετά από φυσική λοίμωξη, οπότε δεν διακόπτεται ο κύκλος μετάδοσης του ιού σε χώρους ομαδικής διαβίωσης των ζώων. Αντίθετα, τα ελαττωμένης λοιμογόνου δύναμης εμβόλια είναι πιο αποτελεσματικά στην αποτροπή της απέκκρισης του ιού, αλλά ενέχουν τον κίνδυνο ανάδυσης νέων ανασυνδυασμένων στελεχών του ιού. CONFLICT OF INTEREST The authors declare that they have no conflict of interest. REFERENCES Adams MJ, Carstens EB (2012) Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses. Arch Virol 157: Appel MJ (1987) Canine coronavirus. In: (ed.: Appel MJ) Virus infections of carnivores. Elsevier Science Publishers, The Netherlands, pp Appel MJG, Cooper BJ, Greisen H, Scott F, Carmichael LE (1979) Canine viral enteritis. I. Status report on corona- and parvo-like viral enteritides. Cornell Vet 69: Bandai C, Ishiguro S, Masuya N, Hohdatsu T, Mochizuki M (1999) Canine Coronavirus Infections in Japan: Virological and Epidemiological Aspects. J Vet Med Sci 61(7): Barlough JE, Stoddart CA, Soresso GP, Jocabson RH, Scott FW (1994) Experimental inoculation of cats with canine coronavirus and subsequent challenge with feline infectious peritonitis virus. Lab Anim Sci 34: Balasuriya UB R, Stott JL (2004) Coronaviridae and Arteriviridae. In: (eds.: Hirsch DC, MacLachlan NJ, Walker RL) Veterinary microbiology, 2 nd edn. Blackwell Publishing, Ames, IA, pp Binn, LN., Lazar, EC., Keenan, KP., Huxsoll, DL., Marchwicki, RH., Strano, AJ., Recovery and characterization of a coronavirus from military dogs with diarrhea. Proceedings of the 78th Annual Meeting of the U.S. Animal Health Association (Roanoke, Virginia), pp Buonavoglia C, Decaro N, Martella V, Elia G, Campolo M, Desario C, Castagnaro M, Tempesta M (2006) Canine coronavirus highly pathogenic for dogs. Emerg Infect Dis 12: Carmichael LE, Binn LN (1981) New enteric viruses in the dog. Adv Vet Sci Comp Med 25:1-37. Carstens EB (2010) Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses. Arch Virol 155: Davidson WR, Appel MJ, Doster GL, Baker OE, Brown JF (1992) Diseases and parasites of red foxes, gray foxes, and coyotes from commercial sources selling to fox-chasing enclosures. J Wildlife Dis 28: de Groot RJ, Baker SC, Baric R, Enjuanes L, Gorbalenya AE, Holmes KV, Perlman S, Poon L, Rottier PJM, Talbot PJ, Woo PCY, Ziebuhr J (2011) Family Coronaviridae. In: (eds: King, AMQ, Lefkowitz E, Adams MJ, Carstens, EB) Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier, Oxford, pp de Groot-Mijnes JD, van Dun JM, van der Most RG, de Groot RJ (2005) Natural history of a recurrent feline coronavirus infection and the role of cellular immunity in survival and disease. J Virol 79: de Haan CAM, Masters PS, Shen X, Weiss S, Rottier PJM (2002) The group-specific murine coronavirus genes are not essential, but their deletion, be reverse genetics, is attenuating in the natural host. Virology 296: Decaro N, Campolo M, Lorusso A, Desario C, Mari V, Colaianni ML, Elia G, Martella V, Buonavoglia C (2008) Experimental infection of dogs with a novel strain of canine coronavirus causing systemic disease and lymphopenia. Vet Microbiol 128: Decaro N, Cordonnier N, Demeter Z, Egberink H, Elia G, Grellet A, Le Poder S, Mari V, Martella V, Ntafis V, von Reitzenstein M, Rottier PJ, Rusvai M, Shields S, Xylouri E, Xu Z, Buonavoglia C (2013) European surveillance for pantropic canine coronavirus. J Clin Microbiol 51: Decaro N, Mari V, Campolo M, Lorusso A, Camero M., Elia G, Martella V, Cordioli P, Enjuanes L, Buonavoglia C (2009) Recombinant canine coronavirus related to transmissible gastroenteritis virus of swine are circulating in dogs. J Virol 83(3): Decaro N, Mari V, Elia G, Addie DD, Camero M, Lucente MS, Martella V, Buonavoglia C (2010) Recombinant canine coronaviruses in

11 Ντάφης Β., Παπαναστασοπούλου Μ., Ξυλούρη Ε. 67 dogs, Europe. Emerg Infect Dis 16: Decaro N, Mari V, Sciarretta R, Colae V, Losurdo M, Catella C, Elia G, Martella V, Del Giudice G, Buonavoglia C (2011) Immunogenicity and protective efficacy in dogs of an MF59 TM - adjuvanted vaccine against recombinant canine/porcine coronavirus. Vaccine 29: Decaro N, Martella V, Elia G, Campolo M, Desario C, Cirone F, Tempesta M, Buonavoglia C (2007) Molecular characterization of the virulent canine coronavirus CB/05 strain. Virus Res 125: Decaro N, Martella V, Ricci D, Elia G, Desario C, Campolo M, Cavaliere N, Trani LD, Tempesta M, Buonavoglia C (2005) Genotype-specific fluorogenic RT-PCR assays for the detection and the quantitation of canine coronavirus type I and type II RNA in faecal samples of dogs. J Virol Methods 130: Decaro N, Pratelli A, Campolo M, Elia G, Martella V, Tempesta M, Buonavoglia C (2004a) Quantitation of canine coronavirus RNA in the faeces of dogs by TaqMan RT-PCR. J Virol Methods 119: Decaro N, Pratelli A, Tinelli A, Martella V, Camero M, Buonavoglia D, Tempesta M, Caroli AM, Buonavoglia C (2004b) Fecal Immunoglobulin A Antibodies in Dogs Infected or Vaccinated with Canine Coronavirus. Clin Diagn Lab Immun 11: Elia G, Decaro N, Martella V, Lorusso E, Mari V, Lucente MS, Cordioli C, Buonavoglia C (2010) An ELISA based on recombinant spike protein S for the detection of antibodies to transmissible gastroenteritis virus of swine-like canine coronavirus. J Virol Methods 163: Elia G, Decaro N, Tinelli A, Martella V, Pratelli A, Buonavoglia C (2002) Evaluation of antibody response to canine coronavirus infection in dogs by western blotting analysis. New Microbiol 25: Enjuanes L, Brian D, Cavanagh D, Holmes K, Lai MMC, Laude H, Masters P, Rottier PJM, Siddell SG, Spaan WJM, Taguchi F, Talbot P (2000) Coronaviridae. In: (eds.: van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR, Wickner RB) Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Academic Press, New York, pp Escutenaire S, Isaksson M, Renstrom LH, Klingeborn B, Buonavoglia C, Berg M, Belak S, Thoren P (2007) Characterization of divergent and atypical canine coronaviruses from Sweden. Arch Virol 152: Evermann JF, Abbott JR, Han S (2005) Canine coronavirus-associated puppy mortality without evidence of concurrent canine parvovirus infection. J Vet Diagn Invest 17: Gao FS, Hu GX, Xia X, Gao YW, Bai YD, Zou XH (2009) Isolation and identification of a canine coronavirus strain from giant pandas (Ailuropoda melanoleuca). J Vet Sci 10: Jia W, Karaka K, Parrish CR, Naqi SA (1995) A novel variant of avian bronchitis virus resulting from recombination among 3 different strains. Arch Virol 140: Keenan KP, Jervis HR, Marchwicki RH, Binn LN (1976) Intestinal infection of neonatal dogs with canine coronavirus 1 71: studies by virologic, histologic, histochemical and immunofluorescent techniques. Am J Vet Res 37: Kipar A, May H, Menger S, Weber M, Leukert W, Reinacher M (2005) Morphologic features and development of granulomatous vasculitis in feline infectious peritonitis. Veterinary Pathol 42: Lai MMC, Holmes KV (2001) Coronaviridae: the viruses and their replication. In: (eds.: Knipe DM, Howley PM) Fields Virology, 4 th edn. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, pp Larson DJ, Morehouse LG, Solorzano RF, Kinden DA (1979) Transmissible gastroenteritis in neonatal dogs: Experimental intestinal infection with transmissible gastroenteritis virus. Am J Vet Res 40: Lissenberg A, Vrolijk MM, van Vliet AL, Langereis MA, de Groot- Mijnes JD, Rottier PJ, de Groot RJ (2005) Luxury at a cost? Recombinant mouse hepatitis viruses expressing the accessory hemaglutinin esterase protein display reduced fitness in vitro. J Virol 79: Lorusso A, Decaro N, Schellen P, Rottier PJ, Buonavoglia C, Haijema BJ, de Groot RJ (2008) Gain, Preservation and Loss of a Group 1a Coronavirus Accessory Glycoprotein. J Virol 82: Marinaro M, Mari V, Bellacicco AL, Tarsitano E, Elia G, Losurdo M, Rezza G, Buonavoglia C, Decaro N (2010) Long-lasting depletion of circulating CD4? T lymphocytes and acute monocytosis after pantropic canine coronavirus infection in dogs. Virus Res 152: Masters PS (2006) The molecular biology of coronaviruses. Adv Virus Res 66: McArdle F, Bennet M, Gaskell RM, Tennant B, Kelly DF, Gaskell CJ (1992) Induction and enhancement of feline infectious peritonitis by canine coronavirus. Am J Vet Res 53: McCaw DL, Hoskins JD (2006) Canine Viral Enteritis. In: (ed.: Greene CE) Infectious Diseases of the dog and cat, 3 rd edn.. Saunders Elsevier, Missouri, pp Naylor MJ, Harrison GA, Monckton RP, McOrist S, Lehrbach PR, Deane EM (2001a) Identification of canine coronavirus strains from faeces by S gene nested PCR and molecular characterization of a new Australian isolate. J Clin Microbiol 39: Naylor MJ, Monckton RP, Lehrbach PR, Deane EM (2001b) Canine coronavirus in Australian dogs. Aust Vet J 79: Naylor MJ, Walia CS, McOrist S, Lehrbach PR, Deane EM, Harrison GA (2002) Molecular Characterization confirms the presence of a divergent strain of canine coronavirus (UWSMN-1) in Australia. J Clin Microbiol 40: Ntafis V, Mari V, Danika S, Fragkiadaki E, Buonavoglia C (2010a) An outbreak of canine coronavirus in a Greek kennel. J Vet Diagn Invest 22: Ntafis V, Mari V, Decaro N, Papanastassopoulou M, Papaioannou N, Mpatziou R, Buonavoglia C, Xylouri E (2011a) Isolation, tissue distribution and molecular characterization of two recombinant canine coronavirus strains. Vet Microbiol 151: Ntafis, V., Mari, V., Mpatziou, R., Thomas, A., Decaro, N., Buonavoglia, C., Xylouri, E., 2010b. Detection and molecular characterization of canine coronavirus in puppies with acute diarrhea in Greece. Proceedings of the 9 th Congress of the Hellenic Veterinary Medical Society on Companion Animals Practice (Athens, Greece), pp Ntafis, V., Papanastassopoulou, M., Kanellos, T., Pardali, D., Xylouri, E., 2011b. Canine coronavirus. Epizootiological survey and mixed, with canine parvovirus type 2, infections in Greece. Proceedings of the 2 nd Veterinary Forum on Companion Animals (Thessaloniki, Greece), pp Ntafis, V., Xylouri, E., 2012a. Canine respiratory coronavirus: A novel coronavirus. Proceedings of the 3 rd Veterinary Forum on Companion Animals (Athens. Greece), pp Ntafis V, Xylouri E, Kalli I, Desario C, Mari V, Decaro N, Buonavoglia C (2010c) Characterization of canine parvovirus 2 variants circulating in Greece. J Vet Diagn Invest 22: Ntafis V, Xylouri E, Mari V, Papanastassopoulou M, Papaioannou

12 68 Ntafis V., Papanastassopoulou M.,XYLOURI E. N, Thomas A, Buonavoglia C., Decaro N (2012b) Molecular characterization of a canine coronavirus NA/09 strain detected in a dog s organs. Arch Virol 157: Ntafis V, Xylouri E, Radogna A, Buonavoglia C, Martella V (2010d) An outbreak of canine norovirus infection in young dogs. J Clin Microbiol 48: Ortego J, Sola I, Almazan F, Ceriani JE, Riquelme C, Balasch M, Plana J, Enjuanes L (2003) Transmissible gastroenteritis coronavirus gene 7 is not essential but influences in vivo virus replication and virulence. Virology 308: Paul MA, Carmichael LE, Childers H, Cotter S, Davidson A, Ford R, Hurley KF, Roth JA, Schultz RD, Thacker E, Welborn L (2006) American Animal Hospital Association Canine Vaccine Guidelines, Revised. VaccineGuidelines06Revised.pdf. Pratelli A (2006) Genetic evolution of canine coronavirus and recent advances in prophylaxis. Vet Res 37: Pratelli A (2007) Action of disinfectants on canine coronavirus replication in vitro. Zoonoses Public Hlth 54: Pratelli A, Buonavoglia D, Martella V, Tempesta M, Lavazza A, Buonavoglia C (2000) Diagnosis of canine coronavirus infection using nested-pcr. J Vet Diagn Invest 84: Pratelli A, Decaro N, Tinelli A, Martella V, Elia G, Tempesta M, Cirone F, Buonavoglia C (2004a) Two genotypes of canine coronavirus simultaneously detected in the fecal samples of dogs with diarrhea. J Clin Microbiol. 42: Pratelli A, Elia G, Decaro N, Tola S, Tinelli A, Martella V, Rocca S, Tempesta M, Buonavoglia C (2004b) Cloning and expression of two fragments of the S gene of canine coronavirus type I. J Virol Methods, 117: Pratelli A, Elia G, Martella V, Tinelli A, Decaro N, Marsilio F, Buonavoglia D, Tempesta M, Buonavoglia C (2002) M gene evolution of canine coronavirus in naturally infected dogs. Vet Rec 151: Pratelli A, Martella V, Decaro N, Tinelli A, Camero M, Cirone F, Elia G, Cavalli A, Corrente M, Greco G, Buonavoglia D, Gentile M, Tempesta M, Buonavoglia C (2003a) Genetic diversity of a canine coronavirus detected in pups with diarrhea in Italy. J Virol Methods 110:9-17. Pratelli A, Martella V, Elia G, Decaro N, Aliberti A, Buonavoglia D, Tempesta M, Buonavoglia C (2001a) Variation of the sequence in the gene encoding for transmembrane protein M of canine coronavirus (CCV). Mol Cell Probe 15: Pratelli A, Martella V, Elia G, Tempesta M, Guarda F, Cappucchio MT, Carmichael LE, Buonavoglia C (2001b) Severe enteric disease in an animal shelter associated with dual infections by canine adenovirus type 1 and canine coronavirus. J Vet Med B 48: Pratelli A, Martella V, Pistello M, Elia G, Decaro N, Buonavoglia D, Camero M, Tempesta M, Buonavoglia C (2003b) Identification of coronaviruses in dogs that segregate separately from the canine coronavirus genotype. J Virol Methods 107: Pratelli A, Tinelli A, Decaro N, Cirone F, Elia G, Roperto S, Tempesta M, Buonavoglia C (2003c) Efficacy of an inactivated canine coronavirus vaccine in pups. New Microbiol 26: Pratelli A, Tinelli A, Decaro N, Martella V, Camero M, Tempesta M, Martini M, Carmichael LE, Buonavoglia C (2004c) Safety and efficacy of a modified-live canine coronavirus vaccine in dogs. Vet Microbiol 99: Regan AD, Millet JK, Tse LPV, Chillag Z, Rinaldi VD, Licitra BN, Dubovi EJ, Town CD, Whittaker GR (2012) Characterization of a recombinant canine coronavirus with a distinct receptorbinding (S1) domain. Virology 430(2): Rimmelzwaan GF, Groen J, Egberink H, Borst GHA, UytdeHaag FGCM, Osterhaus ADME (1991) The use of enzyme-linked immunosorbent assay systems for serology and antigen detection in parvovirus, coronavirus and rotavirus infections in dogs in The Netherlands. Vet Microbiol 26: Roseto A, Lema F, Cavalieri F, Dianoux L, Sitbon M, Ferchal F, Lasneret J, Peries J (1980) Electron Microscopy Detection and Characterization of Viral Particles in Dog Stools. Arch Virol 66: Rottier PJM, Nakamura K, Schellen P, Volders H, Haijema BJ (2005) Acquisition of macrophage tropism during the pathogenesis of feline infectious peritonitis is determined by mutations in the feline coronavirus spike protein. J Virol 79: Sanchez-Morgado J M, Poynter S, Morris TH (2004) Molecular characterization of a virulent canine coronavirus BGF strain. Virus Res 104: Takeuchi A, Binn LN, Jervis HR, Keenan KP, Hildebrandt PK, Valas RB, Bland FF (1976) Electron microscope study of experimental enteric infection in neonatal dogs with a canine coronavirus. Lab Invest 34: Tennant BJ, Gaskell RM, Gaskell CJ (1994) Studies on the survival of canine coronavirus under different environmental conditions. Vet Microbiol 42: Tennant BJ, Gaskell RM, Kelly DF, Carter SD (1991) Canine coronavirus infection in the dog following oronasal inoculation. Res Vet Sci, 51: Vennema H, Poland A, Foley J, Pedersen NC (1998) Feline Infectious Peritonitis Viruses Arise by Mutation from Endemic Enteric Coronaviruses. Virology 243: Wesley RD (1999) The S gene of canine coronavirus, strain UCD-1, is more closely related to the S gene of transmissible gastroenteritis virus than to that of feline infectious peritonitis virus. Virus Research 61: Wolff MH, Sattar SA, Adegbunrin O, Tetro J (2005) Environmental survival and microbicide inactivation of coronaviruses. In: (eds.: Schmidt A, Wolff MH, Weber O) Coronaviruses with special emphasis on first insights concerning SARS. Birkhäuser Verlag, Basel, pp Woo PCY, Lau SKP, Huang Y, Yuen KY (2009) Coronavirus diversity, phylogeny and interspecies jumping. Exp Biol M 234: Woods R (2001) Efficacy of a transmissible gastroenteritis coronavirus with an altered ORF-3 gene. Can J Vet Res 65: Woods RD, Cheville NF, Gallagher JE (1981) Lesions in the small intestine of newborn pigs inoculated with porcine, feline, and canine coronaviruses. Am J Vet Res 42: Woods RD, Wesley RD (1992) Seroconversion of pigs in contact with dogs exposed to canine coronavirus. Can J Vet Res 56: Yesilbag K, Yilmaz Z, Torun S, Pratelli A (2004) Canine coronavirus in Turkish dog population. J Vet Med 51: Zappulli V, Caliari D, Cavicchioli L, Tinelli A, Castagnaro M (2008) Systemic fatal type II coronavirus infection in a dog: Pathological findings and immunocytochemistry. Res Vet Sci 84: Zarnke RL, Evermann J, Ver Hoef JM, McNay ME, Boertje RD, Gardner CL, Adams LG, Dale BW, Burch J (2001) Serologic survey for canine coronavirus in wolves from Alaska. J Wildlife Dis 37: Zicola A, Jolly S, Mathijs E, Ziant D, Decaro N, Mari V, Thiry E (2012) Fatal outbreaks in dogs associated with pantropic canine coronavirus in France and Belgium. J Small Anim Pract 53: