Μελέτη της σταθερότητας της συγκέντρωσης του φαινανθρενίου σε αντιδραστήρες πειραμάτων μετά τη συνδυαστική χρήση αποστείρωσης και νατραζιδίου.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ ΣΧΟΛΗ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΑΣ Μελέτη της σταθερότητας της συγκέντρωσης του φαινανθρενίου σε αντιδραστήρες πειραμάτων μετά τη συνδυαστική χρήση αποστείρωσης και νατραζιδίου. Συγγραφέας: Τουραπή Χριστιάνα Αρ. Μητρώου: Επιβλέπουσα καθηγήτρια: Χρυσή Καραπαναγιώτη Συνεπιβλέπουσα καθηγήτρια: Αδαμαντία Ευστρατίου

2 Μελέτη της σταθερότητας της συγκέντρωσης του φαινανθρενίου σε αντιδραστήρες πειραμάτων μετά τη συνδυαστική χρήση αποστείρωσης και νατραζιδίου. Περιεχόμενα Περίληψη Εισαγωγή Σκοπός και στόχοι της πτυχιακής Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (PAHs) Γενικά στοιχεία για τους PAHs PAHs στο θαλάσσιο οικοσύστημα Ρόφηση φαινανθρενίου Ρόφηση Ανάγκη για μελέτη της ρόφησης Βιοαποδόμηση PAHs Εισαγωγή Βιοαποδόμηση ροφημένων χημικών στο έδαφος Ανάγκη μελέτης της βιοαποδόμησης Γενικές αρχές των PAHs Προβλήματα που συναντήθηκαν κατά τη μελέτη της κινητικής των PAHs σε πειράματα αντιδραστήρων Υλικά και μέθοδοι Υλικά Φαινανθρένιο Γενικά στοιχεία για το νατραζίδιο (NaN 3 ) Oxoid άγαρ Άγαρ Bacteriological Προετοιμασία αντιδραστήρων με και χωρίς NaN Υγρή φάση των αντιδραστήρων Στερεή φάση των αντιδραστήρων Προετοιμασία των αντιδραστήρων Φθορισμομετρία Μικροβιολογικό μέρος Εξέταση του ιζήματος για μικροοργανισμούς Παρασκευή άγαρ Bacteriological για καλλιέργεια μικροοργανισμών από τους αντιδραστηρές Επίστρωση σε τριβλία με άγαρ Bacteriological Ανάλυση δεδομένων

3 3. Αποτελέσματα Σύγκριση της καμπύλης ρόφησης φαινανθρενίου σε αποστειρωμένους αντιδραστήρες παρουσία νατραζιδίου με την καμπύλη ρόφησης φαινανθρενίου σε αποστειρωμένους αντιδραστήρες απουσία νατραζιδίου Δεδομένα μικροβιολογικών εξετάσεων των αντιδραστήρων Επεξεργασία δεδομένων με μοντέλο Σύγκριση αποτελεσμάτων αδημοσίευτης εργασίας Karapanagioti and Efstratiou που μελετά τη βιοαποδόμηση φαινανθρενίου σε αντιδραστήρες στερεού υγρού παρουσία και μη νατραζιδίου με τα αποτελέσματα της παρούσας πτυχιακής Συμπεράσματα Συμπεράσματα Μελλοντική Εργασία Ευχαριστίες Βιβλιογραφία

4 Περίληψη Η παρούσα πτυχιακή εργασία μελετάει τη ρόφηση πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων, με κύριο αντιπρόσωπο το φαινανθρένιο, και τη βιοαποδόμηση του από μικροοργανισμούς. Ρόφηση ονομάζεται το φαινόμενο κατά το οποίο ιόντα ή μόρια μιας ουσίας που είναι διαλυμένη στο νερό συγκεντρώνονται στην επιφάνεια ή το εσωτερικό των σωματιδίων. Η ρόφηση, είναι μια από τις πιο κρίσιμες διεργασίες που επηρεάζουν την περιβαλλοντική εξέλιξη και μεταφορά των υδρόφοβων οργανικών ρύπων (HOCs) στα υδατικά συστήματα. Επίσης, παρουσιάζουν ένα από τα πιο προκλητικά περιβαλλοντικά προβλήματα στην βιοθεράπευση ρυπασμένων εδαφών και ιζημάτων. Η βιοαποδόμηση θεωρείται η κύρια διαδικασία απορρύπανσης εδαφών από οργανικές ενώσεις, και κυρίως των PAHs λόγω της τοξικότητας τους και της καρκινογενετικής προδιάθεσης τους. Η πτυχιακή εργασία περιλαμβάνει τόσο πειραματικά όσο και βιβλιογραφικά δεδομένα αναφορικά με τη ρόφηση του φαινανθρενίου. Το φαινανθρένιο επιλέγηκε λόγω της ευρείας χρήσης του ως αντιπρόσωπος των PAHs για τη μελέτη της κινητικής της ρόφησης. Το πειραματικό μέρος της πτυχιακής εργασίας διήρκησε 95 μέρες, από 28/10/06 μέχρι 30/1/07 και αποτελείται από σειρά αποστειρωμένων αντιδραστήρων με στερεή και υγρή φάση παρουσία και απουσία νατραζιδίου, και μικροβιολογικό έλεγχο των αντιδραστήρων αυτών. Βρέθηκε ένα εύρος βιβλιογραφικών μελετών για τη ρόφηση του φαινανθρενίου, και παρατίθενται τα σημαντικότερα στοιχεία για τη βέλτιστη ανάλυση και επεξήγηση των αποτελεσμάτων που εξήχθησαν από τα πειραματικά δεδομένα. Επίσης, γίνεται η επεξεργασία των δεδομένων αυτών από μοντέλο που συνδυάζει τη διασωματιδιακή διάχυση, τη μη γραμμική ρόφηση και την 1 ης τάξης βιοαποδόμηση. Από την ανάλυση των πειραματικών δεδομένων από αποστειρωμένους αντιδραστήρες με νατραζίδιο, παρουσιάζεται σταθερότητα της συγκέντρωσης του φαινανθρενίου στο υδατικό διάλυμα των αντιδραστήρων. Η μικροβιολογία των αντιδραστήρων με νατραζίδιο ήταν αρκετά ενδιαφέρουσα. Βρέθηκε πλήθος μικροοργανισμών, από Gram θετικά βακτήρια μέχρι μύκητας, αλλά όχι σε μεγάλη αφθονία. Σε αποστειρωμένους αντιδραστήρες χωρίς νατραζίδιο η συγκέντρωση του φαινανθρενίου μειώνεται με το χρόνο, με αργό όμως σχετικά ρυθμό. Βρέθηκε ένα κυρίαρχο Gram αρνητικό βακτήριο σε μεγάλη αφθονία που βιοαποδομούσε το φαινανθρένιο με χαμηλούς ρυθμούς. Τα συμπεράσματα της πτυχιακής εργασίας από τα αποτελέσματα των πειραματικών δεδομένων, είναι ότι η αποστείρωση σαν συνδυαστική μέθοδος αναστολής της βιοαποδόμησης με την προσθήκη νατραζιδίου, οδηγεί σταθερότητα της συγκέντρωσης του φαινανθρενίου στο υδατικό διάλυμα των αντιδραστήρων μετά τη ρόφηση από το ίζημα. 4

5 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Σκοπός και στόχοι της πτυχιακής Η πτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε για τη λύση των προβλημάτων και ερωτημάτων που παρουσιάστηκαν κατά τη μελέτη της κινητικής της ρόφησης του φαινανθρενίου για την καταλληλότητα ή την επάρκεια του νατραζιδίου ως ανασταλτικό της βιοαποδόμησης. Μελετήθηκε η κινητική της ρόφησης του φαινανθρενίου σε αντιδραστήρες παρουσία και απουσία νατραζιδίου. Ως επιπλέον μέθοδος παρεμπόδισης ανάπτυξης μικροοργανισμών έγινε αποστείρωση των αντιδραστήρων πριν το πείραμα αλλά και κατά τη διάρκεια του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν άσηπτες συνθήκες. Οι στόχοι της πτυχιακής εργασίας είναι: (1) Η επίδειξη εύκολων και πραγματοποιήσιμων μεθόδων μέσω των οποίων (α) περιορίζεται η βιοαποδόμηση του φαινανθρενίου από μικροοργανισμούς και (β) παρατείνεται ο χρόνος ζωής των αντιδραστήρων χωρίς ιδιαίτερες απώλειες μάζας φαινανθρενίου. (2) Η μελέτη της μικροβιολογίας των αντιδραστήρων, των τύπων μικροοργανισμών που αναπτύσσονται στους αντιδραστήρες με φαινανθρένιο (μύκητες, βακτήρια), της μορφολογίας των μικροοργανισμών, της δυναμικής του πληθυσμού των μικροοργανισμών που αποδομούν το φαινανθρένιο, των ρυθμών βιοαποδόμησης του φαινανθρενίου και η συσχέτιση της μείωσης της μάζας του φαινανθρενίου με τον αριθμό των μικροοργανισμών που αναπτύσσονται στους αντιδραστήρες. Τέλος, σκοπός της πτυχιακής εργασίας είναι η διερεύνηση ερωτημάτων που τέθηκαν από προηγούμενες μελέτες (Karapanagioti et al., 1999, αδημοσίευτη εργασία Karapanagiοti and Efstratiou), για την καταλληλότητα του νατραζιδίου ως ανασταλτικό ανάπτυξης μικροοργανισμών που αποδομούν το φαινανθρένιο (Κεφάλαιο 1.8). Στην πτυχιακή εργασία παρατίθενται γενικά στοιχεία για τους πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες, η επίδρασή τους στο θαλάσσιο οικοσύστημα και οι κύριες πηγές τους. Εξετάζεται η ρόφηση του φαινανθρενίου, ενός πολυκυκλικού αρωματικού υδρογονάνθρακα που χρησιμοποιείται ευρέως σε πειράματα ρόφησης, ερευνάται η βιοαποδόμηση του φαινανθρενίου από μικροοργανισμούς και η επίδραση που επιφέρει στην κινητική της ρόφησής του. Τέλος παρατίθενται τα δεδομένα και η ανάλυσή τους από πειράματα ρόφησής του φαινανθρενίου και της βιοαποδόμοσής του, και τα αποτελέσματα. 5

6 1.2 Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (PAHs) ( Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες είναι χημικές ενώσεις που αποτελούνται από αρωματικούς δακτυλίους και δεν περιέχουν ετεροάτομα ούτε κουβαλούν υποκαταστάτες. Σχηματίζονται από την ατελή καύση καυσίμων που περιέχουν άνθρακα όπως είναι το ξύλο, το κάρβουνο, το πετρέλαιο diesel, το λίπος, ή ο καπνός. Μερικοί από αυτούς είναι ύποπτοι για καρκινογενέσεις. Χημεία Οι απλούστεροι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες όπως έχουν καθοριστεί από την IUPAC, είναι το φαινανθρένιο και το ανθρακένιο, ισομερή με τρεις δακτυλίους C 14 H 10. Η πρώτη πολυκυκλική ένωση που ανακαλύφθηκε ήταν το βενζο[α]πυρένιο. Οι PAHs μπορούν να περιέχουν τέσσερα, πέντε, έξι, ή εφτά μέλη δακτυλίων, αλλά συχνότεροι είναι με πέντε ή έξι. Με 6 αρωματικούς δακτυλίους ονομάζονται «μικροί» PAHs και όσοι περιέχουν περισσότερους από έξι ονομάζονται «μεγάλοι» PAHs. Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες με τρεις δακτυλίους όπως είναι το φαινανθρένιο, παρουσιάζουν μικρή διαλυτότητά στο νερό και χαμηλή τάση ατμού. Καθώς το μοριακό βάρος αυξάνεται, η διαλυτότητα τους στο νερό και η τάση ατμού μειώνεται. Λόγω αυτών των ιδιοτήτων, οι PAHs στο περιβάλλον βρίσκονται κυρίως στο έδαφος και στο ίζημα, και οχι στο νερό και στον αέρα. Επίσης, βρίσκονται σε σωματίδια αιωρούμενα στο νερό και στον αέρα. Το φυσικό αργό πετρέλαιο και οι αποθέσεις άνθρακα περιέχουν σημαντικά ποσά PAHs όπως και τα προϊόντα καύσης και καπνού από πυρκαγιές φυσικών αιτίων. Η τοξικότητα των PAHs εξαρτάται πάρα πολύ από τη δομή τους, με ισομερή (PAHs με τον ίδιο τύπο και αριθμό δακτυλίων) να ποικίλουν από μη τοξικά έως εξαιρετικά τοξικά. Έτσι PAHs με υψηλή καρκινογενετική προδιάθεση μπορεί να είναι μικροί ή μεγάλοι (6 και πάνω δακτύλιοι). Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες είναι λιπόφιλοι και έχει καταγραφεί η παρουσία τους ακόμα και σε διάφορα εδώδιμα έλαια από διαφορετικά μέρη του κόσμου. 6

7 Παραδείγματα : Ανθρακένιο Βενζο[α]πυρένιο Χρυσένιο Κορονένιο Φλουορεθένιο Ναφθακένιο Φαινανθρένιο Πυρένιο 7

8 1.3 Γενικά στοιχεία για τους PAHs (Cerniglia, 1992) Η έκθεση σε PAHs αποτελεί σημαντικό ρίσκο για την υγεία των ανθρώπων, κυρίως αυτών που ζουν σε βιομηχανικές περιοχές. Λόγω της μακροχρόνιας έκθεσής τους σε αυτούς και της παρουσίας μεγάλων συγκεντρώσεων σε αυτές τις περιοχές ο κίνδυνος που διατρέχουν είναι μεγαλύτερος. Οι PAHs είναι υδρόφοβες ενώσεις και η παραμονή τους σε διάφορα οικοσυστήματα σχετίζεται με τη χαμηλή διαλυτότητά τους. Επίσης, οι PAHs γρήγορα συσχετίζονται με ιζήματα όπου θάβονται και υπάρχουν σε αυτά έως ότου βιοαποδομηθούν, επαναιωρηθούν, βιοσυσσωρευθούν ή απομακρυνθούν μέσω εκβάθυνσης. Η λιποφιλία τους, η περιβαλλοντική επιμονή τους και η γενοτοξικότητα τους, αυξάνεται όσο αυξάνονται και οι δακτύλιοι βενζολίου σε μια ένωση οδηγώντας σε χρόνιες τοξικότητες και κυρίως καρκινογενέσεις. Οι PAHs εισέρχονται στο περιβάλλον μέσω ποικιλόμορφων πηγών (Πίνακας 1.1), όπως είναι η απευθείας αέρια εξαγωγή, η χρόνια διαρροή βιομηχανικών αποβλήτων ή λυμάτων, οι ατυχηματικές απορρίψεις κατά τη διάρκεια των μεταφορών, η χρήση και η απόθεση πετρελαϊκών παραγώγων, είτε από φυσικές πηγές όπως είναι οι διαρροές πετρελαίου και η επιφανειακή απορροή από δάση και πεδιάδες όπου προηγήθηκαν πυρκαγιές. Συγκεκριμένα, τα βιομηχανικά απόβλητα από την εξαέρωση άνθρακα, την αποτέφρωση αποβλήτων και κάποια παράγωγα πετρελαίου, απελευθερώνουν υψηλές συγκεντρώσεις PAHs στο περιβάλλον. Πιθανές καταλήξεις των PAHs στο περιβάλλον είναι η εξάτμισή τους, η φωτοοξείδωση, η χημική οξείδωση, η βιοσυσσώρευση, η προσρόφηση σε σωματίδια του εδάφους, η διύλιση και η μικροβιακή αποδόμησή τους (Σχήμα 1.1). Οι συγκεντρώσεις των PAHs στο περιβάλλον ποικίλουν, και εξαρτώνται από το επίπεδο της βιομηχανικής ανάπτυξης και της ρύπανσης με πετρελαϊκά προϊόντα σε μια περιοχή. Για παράδειγμα η ρύπανση από PAHs κυμαίνεται από χαμηλές συγκεντρώσεις των 5 ng/g στο έδαφος σε μια μη ανεπτυγμένη περιοχή, μέχρι 1.79 x 10 6 ng/g σε εγκαταστάσεις καθαρισμού πετρελαίου. Επιπλέον οι συγκεντρώσεις των PAHs στα θαλάσσια ιζήματα μπορεί να φτάσουν μέχρι 10 5 ng/g σε αστικές εκβολές (Johnson and Larsen, 1985). Κύρια πηγή πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων είναι και τα κρεόσωτα. Οι PAHs αντιπροσωπεύουν το 85-90% των ενώσεων αυτών. 8

9 Πίνακας 1.1 Κύριες πηγές και μηχανισμοί μεταφοράς των PAHs στο περιβάλλον (Cerniglia, 1992) 1. Φυσικές διαρροές πετρελαίου 2. Απόβλητα εγκαταστάσεων καθαρισμού και φύλαξης πετρελαϊκών αποβλήτων 3. Ατυχηματικές διαρροές από πετρελαιοφόρα και άλλα πλοία 4. Απορροές αστικών αποβλήτων 5. Ατμοσφαιρική ρύπανση από αιωρούμενα σωματίδια 6. Βιομηχανικά πετροχημικά απόβλητα 7. Πίσσα και άλλα απόβλητα από τη διεργασία του άνθρακα 8. Εξατμίσεις αυτοκινήτων 9. Καύση απολιθωμένων καυσίμων (βενζίνη, κηροζίνη, κάρβουνο, πετρέλαιο) 10. Καπνιστά φαγητά, στα κάρβουνα ή τηγανιτά 11. Καπνός τσιγάρων και πούρων 12. Πυρκαγιές δασών και πεδιάδων 13. Αγροτική και αστική λάσπη αποβλήτων (sludge) 14. Απορρίμματα και αποτέφρωση αποβλήτων 15. Εξαέρωση άνθρακα και διαδικασίες ρευστοποίησης 16. Κρεόσωτα και άλλα συντηρητικά ξύλου 17. Εμπορικές δραστηριότητες και δραστηριότητες αναψυχής με πλοία Σχήμα 1.1 Σχηματική απεικόνιση της τύχης των πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων στο περιβάλλον (Cerniglia, 1992). 9

10 1.4 PAHs στο θαλάσσιο οικοσύστημα Οι PAHs όπως αναφέρθηκε είναι υδρόφοβες ενώσεις με χαμηλή διαλυτότητα στο νερό και μεγάλη τάση να δεσμεύονται στο ίζημα αλλά και σε αιωρούμενα σωματίδια μέσω της διαδικασίας της ρόφησης. Ως μεγάλα μόρια και λιπόφιλα, η παραμονή τους στα σωματίδια της υδατικής φάσης είναι μεγάλη και με τον τρόπο αυτό η μεταφορά τους και η διάδοσή τους σε μεγάλες σχετικά αποστάσεις είναι εφικτή. Μεταφέρονται μέσω των ανέμων, των ρευμάτων, και της κυκλοφορίας των υδάτων. Η μελέτη της τύχης, της κατάληξης αλλά και του τρόπου μεταφοράς των PAHs στο θαλάσσιο περιβάλλον στην υδατική φάση ή στο ίζημα, είναι απαραίτητη για την κατανόηση του τρόπου που επηρεάζουν το θαλάσσιο σύστημα, και πως αλληλεπιδρούν με τους οργανισμούς του περιβάλλοντος αυτού. Το θαλάσσιο οικοσύστημα είναι ένας τεράστιος αποδέκτης αποβλήτων και απορροών από τη χέρσο, και η πρώτη ζώνη επιρροής είναι η παράκτια ζώνη. Στην παράκτια ζώνη διεξάγονται οι περισσότερες ανθρώπινες δραστηριότητες από οποιαδήποτε άλλη περιοχή στο θαλάσσιο οικοσύστημα. Η αλιεία, οι υδατοκαλλιέργειες, και οι δραστηριότητες αναψυχής είναι από τις σημαντικότερες δραστηριότητες στην παράκτια ζώνη και η παρουσία των PAHs στο σύστημα αυτό μπορεί να θέσει σε κίνδυνο ακόμα και την ανθρώπινη υγεία. Πηγές PAHs στο θαλάσσιο οικοσύστημα είναι κυρίως απορρίψεις και διαρροές από πετρελαιοφόρα και άλλα πλοία, από βιομηχανικά απόβλητα, από αστικά λύματα, φυσικές θαλάσσιες διαρροές πετρελαίου, καύση απολιθωμένων καυσίμων μέσω της ναυσιπλοΐας και η απορροή αγροτικών χημικών στη θάλασσα, κυρίως μέσω των εκβολών (Ceringlia, 1992). Λόγω της ρόφησης των PAHs στο ίζημα αλλά και στην αιωρούμενη ύλη, οργανισμοί με τροφοληπτικές μεθόδους όπως είναι η αιωρηματοφαγία, διηθηματοφαγία και ιζηματοφαγία, προσλαμβάνουν τις ενώσεις αυτές και μέσω της τροφικής αλυσίδας μεταφέρονται σε οργανισμούς ψήλα στην τροφική αλυσίδα του θαλάσσιου οικοσυστήματος. Η βιοσυσσώρευση των PAHs μπορεί να είναι επικίνδυνη τόσο για το οικοσύστημα όσο και για τον άνθρωπο. Επιπλέον, οι PAHs τριών δακτυλίων όπως είναι το ανθρακένιο και το φαινανθρένιο, λόγω της πτητικότητάς τους και του μικρού μοριακού τους βάρους μπορούν από το υδατικό περιβάλλον να διατεθούν στην ατμόσφαιρα. Αντίστροφα, από την ατμόσφαιρα, λόγω μεγαλύτερης διαλυτότητας από άλλους PAHs στο νερό, μπορούν να εισέλθουν εύκολα στο θαλάσσιο περιβάλλον (αέριων εκπομπών βιομηχανιών, καυσαέρια από εμπορικά και επιβατικά πλοία, και πυρκαγιές παρακείμενων δασών ή πεδιάδων). Για το λόγο αυτό η μελέτη του φαινανθρενίου ως ένας από τους κυριότερους αντιπροσώπους των PAHs στο περιβάλλον, τόσο στο θαλάσσιο όσο και στο χερσαίο, είναι ουσιώδης για την κατανόηση των τρόπων μεταφοράς του και την κατάληξη του στο περιβάλλον. Τέλος, μικροοργανισμοί ικανοί να αποδομούν οργανικά μόρια και ενώσεις π.χ φαινανθρένιο στο θαλάσσιο περιβάλλον, είναι κάποια είδη αλγών και κυανοβακτηρίων, βακτηρίων, και μυκητών (Πίνακες 1.2, 1.3, και 1.4). Η 10

11 διαδικασία της αποδόμησης των PAHs από μικροοργανισμούς θεωρείται από πολλούς επιστήμονες ως το μέλλον για την κάθαρση (εξυγίανση) των ιζημάτων και των υδατικών συστημάτων. 11

12 1.5 Ρόφηση Φαινανθρενίου Ρόφηση (Chiou, 2002) Ρόφηση ονομάζεται το φαινόμενο κατά το οποίο ιόντα ή μόρια μιας ουσίας που είναι διαλυμένη στο νερό συγκεντρώνονται στην επιφάνεια ή το εσωτερικό των σωματιδίων. Ο ρύπος που ροφάται αποκαλείται ροφημένη ουσία και η στερεή φάση πάνω στην οποία συγκεντρώνεται ο ρύπος αποκαλείται ροφητής. Υπάρχουν τρία είδη ρόφησης: φυσική, χημική, και ρόφηση ιον-ανταλλαγής. Η φυσική ρόφηση που είναι και η πιο σημαντική για τους οργανικούς ρύπους παρατηρείται σε ευρύ φάσμα ρύπων και οφείλεται στην επίδραση αδύνατων ελκτικών δυνάμεων ή δυνάμεων van der Walls μεταξύ των μορίων. Τα μόρια που ροφώνται δεν προσαρτώνται σε ένα συγκεκριμένο σημείο επιφάνειας αλλά κινούνται ελεύθερα πάνω σε αυτή (Grathwohl, 1998). Το υλικό που ροφάται μπορεί να εμφανίσει συμπυκνωμένη διάταξη έτσι ώστε να σχηματιστούν μοριακές στρώσεις που επικάθονται η μια πάνω στην άλλη (Σχήμα 1.2). Η φυσική ρόφηση είναι αντιστρέψιμη, μόλις μειωθεί η συγκέντρωση της ροφημένης ουσίας στο υδατικό διάλυμα, τα ροφημένα μόρια εγκαταλείπουν την επιφάνεια πάνω στην οποία έχουν συγκεντρωθεί και επιστρέφουν στην υδατική φάση (εκρόφηση: φαινόμενο αντίθετο της ρόφησης) (Chiou, 2002). Η ρόφηση επιτελείται σε τρία στάδια: α) μακροσκοπική μεταφορά, β) μικροσκοπική μεταφορά, γ) ρόφηση στην εσωτερική επιφάνεια του στερεού ροφητή. Κατά το στάδιο της μακροσκοπικής μεταφοράς η διαλυμένη ουσία μετακινείται μέσα από τον διαλύτη προς τη ζώνη διασύνδεσης στερεού-υγρού μέσω των μηχανισμών της υδροδυναμικής μεταφοράς και της διάχυσης. Στο επόμενο στάδιο της μικροσκοπικής μεταφοράς, η διαλυμένη ουσία διεισδύει μέσα στο πορώδες των στερεών κόκκων με το μηχανισμό της διάχυσης. Το δαιδαλώδες σύστημα του πορώδους αποτελείται από μεγαλύτερους και μικρότερους πόρους. Τελικά επιτελείται η ρόφηση της διαλυμένης ουσίας στους μικρότερους πόρους. Όταν ο ρυθμός εκρόφησης γίνει ίσος με τον ρυθμό ρόφησης, επικρατούν συνθήκες ισορροπίας και εξαντλείται η ικανότητα του στερεού να ροφήσει τη διαλυμένη ουσία στη συγκεκριμένη υδατική συγκέντρωση (Chiou, 2002). Η ρόφηση είναι μια από τις σημαντικότερες διαδικασίες που καθορίζει την τύχη των υδρόφοβων οργανικών ενώσεων μέσα σε ένα σύστημα (Grathwhol, 1990, Xia and Ball, 1999, Karapanagioti and Sabatini, 2000, Allen-King et al., 2002, Cornelissen and Gustafsson, 2004). 12

13 Σχήμα 1.2. Μοριακές στρώσεις του ροφημένου φαινανθρενίου (Blanc et al., 2006) Ανάγκη για μελέτη της ρόφησης Η ρύπανση των εδαφών από PAHs είναι επικίνδυνη για το περιβάλλον και τη δημόσια υγεία, λόγω της απευθείας έκθεσης σε αυτούς ή μέσω της πρόσληψής τους από την τροφική αλυσίδα. Η κατανόηση της μεταφοράς και της τύχης των PAH στο χώμα είναι ουσιώδης για την ασφάλεια των τροφίμων και για τις στρατηγικές απορρύπανσης των εδαφών. Η ρόφηση και η δέσμευση των ρύπων επιδρά στην τοξικότητα, τη βιοδιαθεσιμότητα και γενικότερα στην κατάληξη των οργανικών ενώσεων όπως είναι οι PAHs στο περιβάλλον. Επιπλέον η ρόφηση σε αιωρούμενη σωματιδιακή ύλη καθυστερεί τη διαδικασία της μεταφοράς και αναγνωρίσθηκε ως ο κύριος μηχανισμός για την μετέπειτα σύλληψη των PAHs από εκβολικά ιζήματα. Από την άλλη, η ένωσή τους με υδρόφοβες χουμικές ουσίες, συναγωνίζεται τη ρόφηση από αιωρούμενη σωματιδιακή ύλη κρατώντας έτσι τους ρύπους στη διαλυτή φάση για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα και αυξάνοντας ετσι τη μεταφορά τους στον ανοικτό ωκεανό. Oι ρυθμοί της βιοαποδόμησης των ροφημένων χημικών στο ίζημα, όπως είναι το φαινανθρένιο, είναι μικρότεροι από αυτούς στα υδατικά συστήματα ή στις εργαστηριακές καλλιέργειες. Αυτό οφείλεται στη μείωση της διαθεσιμότητάς τους προς τους μικροοργανισμούς, λόγω της διαδικασίας της ρόφησης. Έτσι η μελέτη της ρόφησης είναι απαραίτητη ώστε να εξακριβωθεί πως επιδρά στη βιοδιαθεσιμότητα των ενώσεων αυτών. 13

14 1.6 Βιοαποδόμηση PAHs Εισαγωγή Βιοαποδόμηση ροφημένων χημικών στο έδαφος (Scow et al., 1995) Μια ποικιλόμορφη καταβολική κοινότητα, απαρτισμένη από βακτήρια, μύκητες και άλγη, μεταβολίζουν τις αρωματικές ενώσεις. Οι ρυθμοί της βιοαποδόμησης των ροφημένων χημικών είναι συνήθως πιο αργοί στο ίζημα από ότι στα υδατικά συστήματα, εν μέρει λόγω της ρόφησης και της μείωσης της διαθεσιμότητας των χημικών στους μικροοργανισμούς. Η βιοαποδόμηση, η ρόφηση, και η διάχυση εμφανίζονται ταυτόχρονα και είναι στενά συνδεδεμένες διαδικασίες. Στο έδαφος, ο ρυθμός της βιοαποδόμησης εξαρτάταιαπό το συντελεστή χημικής διάχυσης, το συντελεστή κατανομής ρόφησης, την απόσταση που πρέπει να διαχυθεί από την περιοχή της ρόφησης μέχρι τους μικροοργανισμούς που μπορούν να τα αποδομήσουν και τη σταθερά ρυθμού βιοαποδόμησης Ανάγκη μελέτης της βιοαποδόμησης Τα ροφημένα χημικά παρουσιάζουν ένα από τα πιο ενδιαφέροντα περιβαλλοντικά προβλήματα απορρύπανσης εδαφών και ιζημάτων (Scow et al., 1995). Η μικροβιολογική αποδόμηση των PAHs είναι μια πολύ σημαντική διεργασία που οδηγεί στην απορρύπανση των ιζημάτων και των επιφανειακών εδαφών. Αυτές οι ενώσεις μπορούν να αποδομηθούν πλήρως ή να μεταλλαχθούν μερικώς είτε από κοινότητες μικροοργανισμών είτε από ένα μόνο μικροοργανισμό. Επιπλέον μέσω της βιοαποδόμησης καταναλώνεται μάζα των PAHs/φαινανθρενίου, παρουσιάζοντας προβλήματα σε πειράματα κινητικής και ισορροπίας της ρόφησης (δηλαδή δεν παρουσιάζεται ισοζύγιο μάζας, Karapanagioti et al., 1999). Η κατανόηση της βιοαποδόμησης των ροφημένων χημικών είναι εν μέρει ασαφής λόγω του γεγονότος ότι ο όρος ρόφηση συχνά χρησιμοποιείται για την περιγραφή διάφορων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ρύπων και του μητρικού εδάφους Γενικές αρχές των PAHs Ο μεταβολισμός των PAHs από καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών και οι συμμεταβολικές μεταμορφώσεις από μικτές αποικίες μικροβίων μελετούνται τα τελευταία 80 χρόνια. Παρόλα αυτά για να ληφθεί η βιοαποδόμηση ως βιώσιμη τεχνολογία για την απορρύπανση περιοχών ρυπασμένων με PAHs, πρέπει να κατανοηθούν περισσότερο οι μικροοργανισμοί, οι ενζυμικές διεργασίες και οι περιβαλλοντικές συνθήκες, απαραίτητες για τη βελτιστοποίηση της αποδόμησης τέτοιων ενώσεων. 14

15 Γνωστές αρχές μεταβολισμού των PAHs: 1. Μια ευρεία ποικιλία βακτηρίων, μυκήτων, και αλγών έχουν την ικανότητα να μεταβολίζουν τους πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες (Πίνακες 1.2, 1.3, και 1.4). Γενικότερα, ο ρυθμός αποδόμησης των PAHs είναι αντιστρόφως ανάλογος με τον αριθμό των δακτυλίων στο μόριο του πολυκυκλικού αρωματικού υδρογονάνθρακα. Έτσι, τα μόρια μικρότερου μοριακού βάρους όπως το ναφθαλένιο (naphthalene), το ανθρακένιο (ΑΝ), το βενζοπυριλένιο (ΒΡΕ), το βενζοπυρίνιο (ΒΡ), το φαινανθρένιο, το πυρένιο κ.α., βιοαποδομούνται γρηγορότερα από αυτές μεγαλύτερων μοριακών βαρών όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.3 με τις ημίσιες ζωές PAHs με αύξοντες αριθμούς σε δακτυλίους (Cerniglia and Heit- kamp, 1989). Σχήμα 1.3 Ημιζωές σε εβδομάδες για την μικροβιακή αποδόμηση πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (Cerniglia, 1992). 2. Η μικροβιακή αποδόμηση πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων όπως είναι το ναφθαλένιο, το φαιναθρένιο, ανθρακένιο και ακεναφθένιο έχει καταγραφεί λεπτομερώς και συντάχθηκαν βιοχημικά μονοπάτια (Cerniglia, 1992). Λιγότερες πληροφορίες όμως υπάρχουν για τους μικροοργανισμούς ικανούς να χρησιμοποιούν PAHs υψηλού μοριακού βάρους σαν μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας (Cerniglia, 1992). 3. Οι μηχανισμοί αποδόμησης, τόσο προκαρυωτικών όσο και ευκαριωτικών μικροοργανισμών, απαιτούν την παρουσία μοριακού οξυγόνου για την έναρξη της ενζυμικής «επίθεσης» στους δακτυλίους των PAHs. 4. Έχει αναφερθεί η εμπλοκή πλασμιδίων στην αποδόμηση του τολουενίου, ναφθαλενίου, διφαινυλίου και φαινανθρενίου. Κάποια καταβολικά γονίδια συμπεριλαμβανομένου των ρυθμιστικών γονιδίων έχουν αναλυθεί εκτενώς. Όμως λίγα είναι γνωστά για τη γενετική και τους μηχανισμούς ρύθμισης που εμπλέκονται στον βακτηριακό καταβολισμό μορίων PAHs, με υψηλό μοριακό βάρος. Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες με χαμηλό μοριακό βάρος όπως το ναφθαλένιο και το φαινανθρένιο, αποδομούνται ταχέως στο ίζημα, ενώ υψηλού μοριακού βάρους είναι αρκετά ανθεκτικά παρουσία μικροβίων. Οι 15

16 ρυθμοί βιοαποδόμησης των PAHs είναι υψηλότεροι όταν βρίσκονται σε ιζήματα ήδη ρυπασμένα με PAHs παρά σε παρθένα ιζήματα. Πίνακας 1.2 Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες και η οξείδωσή τους από βακτήρια (Cerniglia, 1992). Ένωση Ναφθαλένιο Ακεναφθένιο Ανθρακένιο Φαινανθρένιο Πυρένιο Χρυσένιο Βενζ[α] ανθρακένιο Βενζο[α] πυρένιο Οργανισμοί Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes denitrificans, Mycobacterium sp., Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudornonas fluorescens, Pseudomonas paucimobitis, Pseudomonas vesicularis, Pseudornonas cepacia, Pseudomonas testosteroni, Rhodococcus sp., Corynebacteriurn renale, Moraxella sp., Streptornyces sp., Bacillus cereus Bei]erinckia sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas sp. Bei]erinckia sp., Mycobacteriurn sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas cepacia, Rhodococcus sp., Flavobacterium sp., Arthrobacter sp. Aeromonas sp., Alcaligenes faecalis, Alcaligenes denitrificans, Arthrobacter polychromogenes, Beijerinckia sp., Microeoceus sp., Myeobaeterium sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas paucimobilis, Rhodoeoeeus sp.,vibrio sp., Nocardia sp., Flavobacterium sp., Streptomyces sp., Streptomyces griseus, Acinetobacter sp. Alcaligenes denitrificans, Mycobacterium sp., Rhodococcus sp. Rhodococcus sp. Alcaligenes denitrificans, Beijerinckia sp., Pseudomonas putida Beijerinckia sp., Mycobacterium sp. 16

17 Πίνακας 1.3 Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες και η οξείδωση τους από μύκητες (Cerniglia, 1992). Ένωση Ναφθαλένιο Ανθρακένιο Ακεναφθένιο Φαινανθρένιο Πυρένιο Βενζ[α] ανθρακένιο Βενζο[α] πυρένιο Οργανισμοί Absidla glauca, Aspergillus niger, Basidiobolus ranarum, Candida utilis, Choanephora campincta, Circinella sp., Clavieeps paspali, Cokeromyces poitrassi, Conidiobolus gonimodes, Cunninghamella bainieri, Cunninghamella elegans, Cunninghamella japonica, Emericellopsis sp., Epicoccum nigrum, Gilbertella persicaria, Gliocladium sp., Helicostylum piriforme, Hyphochytrium catenoides,linderina pennispora, Mucor hiemalis, Neurospora crassa, Panaeolus cambodginensis, Panaeolus subbatteatus, PeniciUium chrysogenum, Pestalotia sp., Phlyctochytrium reinboldtae, Phycomyces blakesleeanus, Phytophthora cinnamomi, Psilocybe cubensis, Psilocybe strictipes, Psilocybe stuntzii, Psilocybe Subaeruginascens, Rhtzophlyctis harderi, Rhizophlyctis rosea, Rhizopus oryzae, Rhizopus stotonifer, Saccharomyces cerevisiae, SaproIegnia parasitica, Sminium culicis, Smittium culisetae, Smittium simulii, Sordaria firnicola, Syncephalastrum racemosum, Thamnidium anomalum, Zygorhynchus moelleri B]erkandera sp., Cunninghamella elegans, Phanerochaete chrysosporium, Ramaria sp., Rhizoctonia sotani, Trametes versicolor Cunnmghamella elegans Cunninghamella elegans, Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor Cunninghamella elegans, Phanerochaete chrysosporium Cunmnghamella elegans Aspergillus ochraceus, Bjerkandera adusta, Bjerkandera sp., Candtda maltosa, Candida tropicalis, Chrysosporium pannorum, Cunninghamella elegans, Mortierella verrucosa, Neurospora crassa,penicillium sp., Phanerochaete chrysosporium, Ramaria sp., Saccharomyces cerevisiae, Trametes versicolor, Trichoderma viride 17

18 Πίνακας 1.4 Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες και η οξείδωση τους από διαφορετικά είδη κυανοβακτηρίων και αλγών (Cerniglia, 1992). Ένωση Ναφθαλένιο Φαινανθρένιο Βενζο[α] πυρένιο Οργανισμοί Oscillatoria sp. (strain JCM), Oscillatoria sp. (strain MEV), Microcoleus chthonoplastes, Nostoc sp., Anabaena sp. (strain CA), Anabaena sp. strain IF), Agmenellum quadruplicatum, Coccochloris elabens, Aphanocapsa sp., Chlorella sorokiniana, Chlorella autotrophica, Dunaliella tertiolecta, Chlamydomonas angulosa, Ulva fasciata, Cylindrotheca sp., Amphora sp., Nitzschia sp., Synedra sp., Navicula sp., Porphyrtdium cruentum Oscillatoria sp. strain JCM, Agmeneuum quadruplicatum Selenastrum capricornutum 18

19 1.7 Προβλήματα που συναντήθηκαν κατά τη μελέτη της κινητικής των PAHs σε πειράματα αντιδραστήρων Καταλληλότητα του νατραζιδίου (NaN 3 ) Η ανάγκη για τη μελέτη της βιοαποδόμησης του φαινανθρενίου παρουσία και μη νατραζιδίου σε συνδυασμό με την αποστείρωση των αντιδραστήρων σε αυτή την εργασία, ήταν από ερωτήματα που ηγέρθηκαν από προηγούμενες μελέτες πειραμάτων κινητικής του φαινανθρενίου (Karapanagioti et al., 1999, αδημοσίευτη εργασία για την καταλληλότητα του νατραζιδίου Karapanagioti and Efstratiou). Τα ερωτήματα που είχαν τεθεί μετά την πλήρωση των μελετών αυτών ήταν (α) αν το νατραζίδιο είναι κατάλληλο ως ανασταλτικό ανάπτυξης μικροοργανισμών σε αντιδραστήρες και κατά συνέπεια συντηρητικό δειγμάτων που περιεχούν PAHs, (β) η μικροβιακή μάζα ικανή να αποδομεί το φαινανθρένιο σε αντιδραστήρες, αν μπορεί να περιοριστεί από άλλες μεθόδους για την καλύτερη και πιο αξιόπιστη μελέτη της κινητικής του φαινανθρενίου. Πλήθος πειραμάτων ρόφησης κάνουν χρήση του νατραζιδίου (Rost et al., 2002, Zhou et al., 2003, Laor et al., 1996, Cornelissen et al., 2005, Kalaitzidis et al., 2006, Karapanagioti et al., 1999). Παρατηρήθηκε όμως ότι με τη χρήση του NaN 3 σε πειράματα ισορροπίας και κινητικής του φαινανθρενίου (Karapanagioti et al., 1999) δεν επαρκούσε για να εμποδίσει πλήρως τη βιοαποδόμηση, κυρίως σε μακρόχρονα πειράματα αλλά χανόταν ποσό μάζας του φαινανθρενίου. Το νατραζίδιο (NaN 3 ) είναι βιοκτόνο Gram αρνητικών βακτηρίων (Snyder and Lichstein, 1940) επιτρέποντας όμως την ανάπτυξη μικροοργανισμών Gram θετικών και μυκήτων που είτε συνεργιστικά είτε μόνοι τους αποδομούν το φαινανθρένιο. Αυτό αποτέλεσε ένα ακόμα λόγο για ανάγκη εξεύρεσης και μελέτης άλλων μεθόδων που αναστέλλουν τη διαδικασία της αποδόμησης του φαινανθρενίου συνδυαστικά πάντα με το νατραζίδιο. 19

20 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Υλικά Φαινανθρένιο ( Σχήμα 2.1 Δομή φαινανθρενίου Το φαινανθρένιο είναι ένας πολυκυκλικός αρωματικός υδρογονάνθρακας που αποτελείται από τρείς δακτυλίους βενζολίου (Σχήμα 2.1). Το όνομα φαινανθρένιο είσαι σύνθετο από το φαίνυλ και ανθρακένιο. Στην αγνή του μορφή βρίσκεται στον καπνό των τσιγάρων και είναι γνωστό για τους ερεθισμούς που προκαλεί και την φωτοευαισθησία του. Στη φυσική του κατάσταση βρίσκεται ως λευκοί προς κίτρινοι κρυσταλλοι. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες του φαινανθρενίου αναλύονται στον Πίνακα 2.1. Παρουσιάζει πέντε κανονικές μορφές και οι αντιδράσεις με αυτό προκύπτουν στις θέσεις 9 και 10. Κλασική σύνθεση φαινανθρενίου είναι η Bardhan-Sengupta Phenanthrene Synthesis (1932). Μερικές βασικές αντιδράσεις του φαινανθρενίου είναι: Οργανική οξείδωση σε Phenanthraquinone με χρωμικό οξύ Οργανική αναγωγή σε 9,10- διυδροφαινανθρίνη με αέριο υδρογόνο και νικέλιο Ηλεκτροφιλική αλογόνωση σε 9- Βρομοφαιανθρένιο με βρώμιο Αρωματική sulfonation σε 2 και 3- φαινανθρενιοθειικά οξέα με θειικό οξύ Οζονόλυση σε διφαινυλαλδεύδη 20

21 Πίνακας 2.1 Φυσικοχημικές ιδιότητες του φαινανθρενίου ( Φυσικοχημικές ιδιότητες Φυσική Κατάσταση: Λευκοί προς κίτρινοι κρύσταλλοι Σημείο Τήξης: C Σημείο Ζέσεως: C Ειδική Βαρύτητα: Διαλυτότητα στο νερό: Αδιάλυτο Διαλυτό σε: Τολουένιο, αιθέρα, χλωροφόρμιο, βενζένιο κ.α NFPA Μετρήσεις: Υγεία: 1 Ευφλεκτικότητα: 1 Αντιδραστικότητα: 0 Σταθερότητα της ένωσης: Σταθερό κάτω υπό κανονικές συνθήκες Εφαρμογές: Σύνθεση βαφών, εκρηκτικά και ναρκωτικά 21

22 Κανονικές μορφές του φαινανθρενίου 22

23 2.1.2 Γενικά στοιχεία για το νατραζίδιο (NaN 3 ) ( Το νατραζίδιο (NaN 3 ) είναι ένα πολύ τοξικό χημικό και στη φυσική του κατάστaση βρίσκεται ως άοσμο λευκό κρυσταλλικό στερεό, εύκολα διαλυτό στο νερό. Το διάλυμά του σε νερό υδρολύεται αργά σε ένα πολύ τοξικό αέριο, αζίδιο του υδρογόνου (HN 3 ), το οποίο δημιουργείται και όταν το NaN 3 αντιδρά με ένα πολύ ισχυρό οξύ. Επίσης έχει την ικανότητα να αντιδρά και με ιόντα βαρέων μετάλλων όπως είναι ο χαλκός, το αλουμίνιο, ή ο μόλυβδος και σχηματίζονται αζίδια μετάλλων τα οποία παρουσιάζουν μεγάλη αστάθεια. Είναι εύκολη η σύνθεσή τους και είναι εξαιρετικά εκρηκτικά. Πρέπει πάντα να λαμβάνεται με προσοχή κατά την απόρριψη του υλικού στην παρουσία πρωτευόντων μετάλλων καθώς μπορεί να αντιδράσει με αυτά. Επίσης είναι επιβλαβές για το περιβάλλον και η απόρριψή του πρέπει να γίνεται με υπεύθυνα μέσα. Είναι μερικώς διαλυτό στην αιθανόλη και αρχίζει να αποσυντίθεται σθεναρά σε μέταλλο του νατρίου και αέριο άζωτο στους 300ºC. Είναι ισχυρά τοξικό στο υδατικό περιβάλλον και πρέπει να καταστρέφεται με οξείδωση ή αναγωγή πριν την απελευθέρωση του σε αυτό. Η πιο συχνή μέθοδος σύνθεσης του NaN 3 είναι η διαδικασία Wislicenus, όπου πρώτα το νάτριο, Na, αντιδρά με αμμωνία, NH 3, για την παραγωγή νατραμιδίου. 2Na + 2NH 3 2NaNH 2 + H 2 Τότε το νατραμίδιο αντιδρά με οξείδιο του αζώτου, 2NaNH 2 + N 2 O NaN 3 +NaOH + NH 3 Το νατραζίδιο είναι κυρίως γνωστό για τη χρήση του σε αερόσακους αυτοκινήτων. Μια ηλεκτρική φόρτιση προκαλούμενη από τη σύγκρουση του αυτοκινήτου προκαλεί την έκρηξη του νατραζιδίου και ταυτόχρονα απελευθερώνεται αέριο άζωτο μέσα στο σάκο. Επίσης το NaN 3 χρησιμοποιείται ως χημικό συντηρητικό σε νοσοκομεία και εργαστήρια. Παίζει το ρόλο βιοκτόνου, ιδιαίτερα σημαντικό σε μαζικά αντιδραστήρια και διαλύματα ικανά να υποστηρίξουν τη μικροβιακή ανάπτυξη. Το νατραζίδιο δρα ως βακτηριοστατικό παρεμποδίζοντας την κυτοχρωμική οξειδάση σε gram αρνητικά βακτήρια. Gram θετικά (στρεπτόκοκκος, πνευμονόκοκκος, λακτοβάκιλος) είναι ανθεκτικά (χαρακτηριστικό όμοιο με την ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά). Επίσης χρησιμοποιείται στη γεωργία (κτηνοτροφία) για τον έλεγχο παρασίτων, σε πυροκροτητές και άλλα εκρηκτικά. 23

24 Τοξικές Επιπτώσεις Η τοξικότητα του υλικού αυτού συχνά συγκρίνεται με αυτή των αλάτων κυανίου καθώς παρουσιάζουν παρόμοια συμπτώματα. Η σοβαρότητα της δηλητηρίασης από νατραζίδιο εξαρτάται από την ποσότητα, τη διαδρομή και χρόνο της έκθεσης, καθώς και την ηλικία και την ιατρική κατάσταση του ατόμου που εκτίθεται. Εισπνέοντας το αέριο που δημιουργείται από το νατραζίδιο (αζίδιο υδρογόνου) προκαλείται μεγαλύτερη ζημιά, αλλά και η κατάποση του μπορεί να είναι ιδιαίτερα τοξική. Μεγάλες ποσότητες στον ανθρώπινο οργανισμό μπορεί να προκαλέσουν ακόμα και θάνατο. Το νατραζίδιο προτάθηκε ως επιλεκτικός ανασταλτικός παράγοντας για gram αρνητικά βακτήρια σε μελέτες των Edwards (1933, 1938) και Hartmann (1936) για την απομόνωση του στελέχους Str. Agalactiae. Οι Mallmann (1940) και Snyder and Lichstein (1940) αργότερα έδειξαν ότι το νατραζίδιο μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση των εντερόκοκκων στο νερό. 24

25 Πίνακας 2.2 Γενικά στοιχεία για το νατραζίδιο ( Νατραζίδιο Γενικά Μοριακός τύπος NaN 3 Μοριακή μάζα Μορφή g/mol Λευκό στερεό Αριθμός CAS [ ] Ιδιότητες Πυκνότητα και φάση 1.85 g/cm 3, στερεό Διαλυτότητα στο νερό 41.7 g/100 ml (17 C) Σημείο τήξης 275 C. Κίνδυνοι MSDS EU ταξινόμηση R-φράσεις S-φράσεις Εξωτερικό MSDS Υψηλά τοξικό (T+) Επικίνδυνο για το περιβάλλον (N) R21, R26, R28, R32, R50, R53 S1, S2, S28, S45, S60, S61 Σε κανονικές συνθήκες (25 ºC, 100 kpa) 25

26 2.1.3 Oxoid Άγαρ (Bridson, 1998) Το άγαρ είναι ένα πολύπλοκο σύμπλεγμα πολυσακχαριτών τα οποία εξάγονται από κάποια είδη ερυθρών αλγών, γνωστά ως αγαρόφυτα (Gelidium, Gracilaria, Pterocladia, Acanthopeltis και το είδος Ahnfeltia). Είναι εστέρας θειικού οξέος ενός γραμμικού γαλακτοματοποιητή, διαλυτό σε ζεστό νερό αλλά αδιάλυτο σε κρύο. Υδατικό διάλυμα 15% w/v πρέπει να είναι συνεκτικό στους ºC και να μην τήκεται κάτω από τους 85 ºC. Υπάρχουν δυο κύριοι πολυσακχαρίτες στο άγαρ που επηρεάζουν την απόδοσή του ως μέσο καλλιέργειας. 1. Ένα ουσιαστικά αδρανές πολυμερές, αγαρόση-(1-4) ενωμένη με 3,6- ανυδρο-a-l-γαλακτόζη που εναλλάσσεται με (1-3) ενωμένή με β-d γαλακτόζη. 2. Ένα φορτισμένο πολυμερές, η αγαροπηκτίνη, που έχει την ίδια επαναλαμβανόμενη μονάδα με την αγαρόση αλλά κάποια υπολείμματα της 3,6-άνυδρο-a-L-γαλακτόζης αντικαθίστανται με θειική L-γαλακτόζη, σε συνδυασμό με μερική αντικατάσταση υπολειμμάτων της D-γαλακτόζη με πουρουβικό οξύ 4,6-0-(1- καρβοξυεθιλένιο)-d-γαλακτόζη Η αγαρόση είναι υπεύθυνη για την υψηλή τάση να δημιουργεί γέλη το άγαρ, ενώ η αγαροπηκτίνη προσφέρει τις ιδιότητες τριβής. Η αναλογία της αγαρόσης προς αγαροπηκτίνη στο άγαρ ποικίλει ανάλογα από το άλγος από όπου προέρχεται και μπορεί να φτάσει και σε τιμές από 75% αγαρόση προς 25% αγαροπηκτίνη. Η χαρακτηριστική ιδιότητα του άγαρ να δημιουργεί γέλη υψηλής ποιότητας, η οποία και είναι αντιστρέψιμη με κύκλο υστέρησης περίπου στο εύρος των 40ºC οφείλεται σε τρία άτομα υδρογόνου πάνω στην 3,6-άνυδρο-a-Lγαλακτόζη τα οποία αναγκάζουν το μόριο να σχηματίσει έλικα με τριπλό ελικοειδές άξονα. Η αλληλεπίδραση αυτών των ελίκων προκαλούν τη δημιουργία της γέλης. Το άγαρ υδρολύεται με ζέση σε όξινο ph επειδή ο 3,6-άνυδρο-a-Lγαλακτοειδής σύνδεσμος είναι πολύ ευαίσθητος σε όξινο περιβάλλον. Η παρουσία ελεύθερων ιόντων μετάλλων Ca, Mg, και Fe στο άγαρ μπορούν να αντιδράσουν με θειικά άλατα στο μέσο καλλιέργειας και να δημιουργηθούν αδιάλυτα κατακρημνίσματα ή σωματίδια τα οποία είναι ανεπιθύμητα. Επίσης ανεπιθύμητη είναι η παρουσία χηλικών ενώσεων οι οποίες μπορούν να δεσμεύσουν αυτά τα κατιόντα και να μην είναι διαθέσιμα προς τους οργανισμούς. Η μείωση του επιπέδου θειικών στο θρεπτικό καλλιέργειας για την υπερπήδηση αυτής της αλληλεπίδρασης με τα μέταλλα συνήθως οδηγεί σε φτωχές ιδιότητες προώθησης της ανάπτυξης. 26

27 Τα άγαρ για μικροβιολογικές καλλιέργειες ποικίλουν ως εξής: 1. Bacteriological άγαρ. Διαυγές, άχρωμο προϊόν στο οποίο τα μεταλλικά στοιχεία μειώνονται καθιστώντας τα αποτελεσματικά για τις περισσότερες καλλιέργειες. 2. Επεξεργασμένο Bacteriological άγαρ. Διαυγές, άχρωμο προϊόν όπου τα μεταλλικά στοιχεία είναι σε χαμηλά επίπεδα, καθιστώντας τα συμβατά με διάφορες μεθόδους. Περαιτέρω πλεονέκτημα της χημικής επεξεργασίας για τη μείωση των διαθέσιμων κατιόντων είναι ότι υπερνικά τον ανταγωνισμό ορισμένων άγαρ να σχηματίζουν αμινογλυκοσιδικό δεσμό με αντιμικροβιακά και τετρακυκλίνη. Επίσης βελτιώνει σημαντικά τη διάχυση των αντιμικροβιακών στη δοκιμή διάχυσης. 3. Το Technical grade άγαρ. Λιγότερο διαυγές και άχρωμο προϊόν στο οποίο τα περισσότερα μεταλλικά συστατικά μπορεί να έχουν πλεονεκτήματα σε ορισμένες μεθόδους χαμηλού φωσφόρου. Τα παραπάνω άγαρ πρέπει να είναι ελεύθερα από τοξικές ουσίες από μικροοργανισμούς και ακαθαρσίες όπως είναι οι γόμες, από αζωτούχες ενώσεις, αδιάλυτα άλατα, από ελεύθερα σάκχαρα, νεκρούς μικροοργανισμούς και από ζωντανούς θερμόφιλους οργανισμούς Aγαρ Bacteriological (Bridson, 1998) Για την καλλιέργεια των μικροοργανισμών των αντιδραστήρων του πειράματος ρόφησης χρησιμοποιήθηκε το άγαρ bacteriological, ένα είδος από τα άγαρ της εταιριας oxoid λόγω της χαμηλής περιεκτικότητας του σε άλατα και μέταλλα. Η ιδιότητά του αυτή δεν επιτρέπει την ανάπτυξη ανεπιθύμητων μικροοργανισμών που μπορεί να αναπτυχθούν λόγω της περιεκτικότητας σε μέταλλα. Είναι ένα επεξεργασμένο βακτηριολογικό άγαρ με πολύ υψηλή τάση δημιουργίας γέλης (1 w/v). Περιέχει χαμηλές συγκεντρώσεις Ca και Mg. Είναι συμβατό με όλους τους τύπους καλλιέργειας και παράγει ζωμό ή σχηματίζει άγαρ του ίδιου μέσου για να έχουν παρόμοιες τιμές μετάλλων. Το χαρακτηριστικό αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο σε αντιμικροβιακές μελέτες όπου διαφορές στην περιεκτικότητα μετάλλων μπορεί να επηρεάσει δραστικά τα αποτελέσματα. Επίσης είναι ιδιαίτερα ικανοποιητικό άγαρ για τη μελέτη αντιμικροβιακής διάχυσης λόγω των χαμηλών συγκεντρώσεων σε μέταλλα, επιτρέποντας ελεύθερα τη διάχυση των αντιμικροβιακών ουσιών. 27

28 2.2 Προετοιμασία αντιδραστήρων με και χωρίς NaN Υγρή φάση των αντιδραστήρων Παρασκευή συνθετικού νερού & συνθετικού νερού με νατραζίδιο Υλικά 1. 2 x 500 ml Απιονισμένο νερό 2. CaCl 2 33 mg/l (FERAK, καθαρότητας 96%) 3. CaSO 4.2H2O 18 mg/l (Riedel-de Haen, καθαρότητας 99%) 4. NaHCO 3 17 mg/l (MERCK, καθαρότητας 99.7%) mg/l NaN 3 (FLUKA, καθαρότητας 99.0%) 6. 2 x 50 μl Πρότυπου διαλύματος φαινανθρενίου σε μεθανόλη (CH3OH) (MERCK, καθαρότητας 99.8%, ACS, ISO) συγκέντρωσης 1000 mg/l (FLUKA, καθαρότητας 99.0%) 7. Σύριγγα για τον εμβολιασμό του φαινανθρενίου 8. 2 σκουρόχρωμες φιάλες των 500 ml 9. Αναλυτικός ζυγός (AND ER 180A) σκουρόχρωμα φιαλίδια με πώματα, αποστειρωμένα 11. Αυτόκαυστο Κλίβανος υγρής αποστείρωσης 12. Γάζες και αλουμινόχαρτο Μέθοδος 2 σκουρόχρωμες φιάλες των 500 ml πληρώνονται με απιονισμένο νερό και προστίθενται 33 mg/l CaCl 2, 18 mg/l CaSO 4.2H 2 O και 17 mg/l NaHCO 3. Αυτό αποτελεί το συνθετικό νερό. Σε κλίβανο υγρής αποστείρωσης τοποθετούνται οι φιάλες των 500 ml με το συνθετικό νερό κλεισμένες με γάζα και καλυμμένες με αλουμινόχαρτο, ενώ τα πώματα τοποθετούνται ξεχωριστά τυλιγμένα σε αλουμινόχαρτο στον κλίβανο. Αποστειρώνονται για 15 λεπτά στους 121 C. Όταν οι φιάλες των 500 ml με το αποστειρωμένο συνθετικό νερό φτάσουν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μεταφέρονται 50 μl πρότυπου διαλύματος φαινανθρενίου (σε μεθανόλη συγκέντρωσης 1000 mg/l ) με τη βοήθεια σύριγγας εμβολιασμού. Στην φιάλη των 500 ml με αποστειρωμένο συνθετικό νερό προστίθενται 200 mg/l NaN 3 και το διάλυμά ονομάστηκε FN. Το διάλυμά της δεύτερης φιάλης των 500 ml με καθαρό συνθετικό νερό και χωρίς προσθήκη NaN 3 ονομάστηκε FW. Ανακινούνται τα διαλύματα ελαφρά. Η προσθήκη του νατραζιδίου και του φαινανθρενίου γίνεται αφού κρυώσουν τα διαλύματα. Το πρώτο είναι εκρηκτικό σε υψηλές θερμοκρασίες και το δεύτερο πτητικό. 28

29 2.2.2 Στερεή φάση των αντιδραστήρων Υλικά 1. 6 x 8 g ιζήματος 2. Αναλυτικός ζυγός (AND ER 180A) Μέθοδος Ζυγίζονται σε αναλυτικό ζυγό 8 g ιζήματος. Η ζύγιση γίνεται για 6 διαφορετικά δείγματα Προετοιμασία των αντιδραστήρων 10 σκουρόχρωμα φιαλίδια των 100 ml αποστειρώνονται στους 121 C για 15 λεπτά σε κλίβανο υγρής αποστείρωσης, με τα πώματα ελαφρώς τοποθετημένα από πάνω τυλιγμένα με αλουμινόχαρτο. Σε 6 από αυτά προστίθενται 8 g ιζήματος (στερεή φάση των αντιδραστήρων). Κατόπιν σε 3 από αυτά προστίθενται 100 ml FW και στα υπόλοιπα 3 με ίζημα, 100 ml FΝ (υγρή φάση αντιδραστήρων). Σε 2 άδεια σκουρόχρωμα φιαλίδια ρίχνονται 100 ml FW και σε άλλα 2 άδεια, 100 ml FN, τα οποία θα αποτελέσουν τα τυφλά δείγματα. 2.3 Φθορισμομετρία Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων Υλικά 1. Απιονισμένο νερό 2. Φαινανθρένιο (FLUKA, καθαρότητας 99.0%) 3. 4 ογκομετρικές φιάλες των 100 ml 4. Φθορισμόμετρο (PERKIN ELMER LS 50B) 5. Κυψελίδα από χαλαζία (1 cm x 1cm) Μέθοδος 4 ογκομετρικές φιάλες των 100 ml πληρώνονται με 100 ml απιονισμένου νερού. Προστίθενται 1, 2, 5, και 15 μl πρότυπου διαλύματος φαινανθρενίου 1000 mg/l σε κάθε ογκομετρική φιάλη. Έτσι δημιουργούνται πρότυπα διάλυματα φαινανθρενίου συγκεντρώσεων 0.01, 0.02, 0.05 και 0.15 mg/l αντίστοιχα. Τα δείγματα αναδεύονται καλά. Έπειτα γίνεται η μέτρηση εκπομπής των προτύπων σε φθορισμόμετρο με κυψελίδα από χαλαζία. Το μήκος κύματος του φθορισμόμετρου για τη μέτρηση εκπομπής των προτύπων στο υπεριώδες είναι 252 με άνοιγμα σχισμής 2.5 και το μήκος κύματος εκπομπής καθορίζεται η τιμή 347 με άνοιγμα σχισμής

30 Κατασκευάζεται η καμπύλη προτύπων και υπολογίζεται η κλίση της για περαιτέρω χρήση όπως φαίνεται στην ανάλυση δεδομένων. Φθορισμομετρία των δειγμάτων Υλικά 1. Φθορισμόμετρο (PERKIN ELMER LS 50B) 2. Κυψελίδα από χαλαζία (1 cm x 1cm) 3. Απιονισμένο νερό 4. Αλκοόλη 90% 5. Φλόγιστρο για εξυγίανση αέρα Μέθοδος Η φθορισμομετρία ξεκινάει πάντα από το FW (απιονισμένο νερό), μετά τα τυφλά δείγματα, και έπειτα τα δείγματα με προτεραιότητα αυτά χωρίς νατραζίδιο. Ξεπλένεται η κυψελίδα προσεκτικά με απιονισμένο νερό και στη συνέχεια με αλκοόλη και αφήνεται να στεγνώσει. Γεμίζεται η κυψελίδα με υγρό από τους αντιδραστήρες προσέχοντας εξωτερικά η κυψελίδα να είναι στεγνή και τοποθετείται στο όργανο. Το μήκος κύματος του φθορισμόμετρου για τη μέτρηση εκπομπής των δειγμάτων στο υπεριώδες είναι 252 με άνοιγμα σχισμής 2.5 και το μήκος κύματος εκπομπής καθορίζεται η τιμή 347 με άνοιγμα σχισμής 2.5. Μετά το τέλος της ένδειξης αφαιρείται η κυψελίδα από το όργανο και το δείγμα ξανατοποθετείται στη σκουρόχρωμη φιάλη. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται για όλα τα δείγματα και κάτω από άσηπτες συνθήκες με φλόγιστρο και διαδοχικά γίνονται ξεπλύματα της κυψελίδας με αλκοόλη. Οι μετρήσεις αρχικά γίνονται καθημερινά, έπειτα ανά δυο μέρες και προς το τέλος του πειράματος πάλι καθημερινά. 2.4 Μικροβιολογικό μέρος Εξέταση του ιζήματος για μικροοργανισμούς Υλικά 1. 1 g ίζημα 2. 5 τριβλία με άγαρ μαγιάς (yeast extract agar) 3. φυσιολογικός ορός 4. 4 δοκιμαστικοί σωλήνες 5. 1 φλόγιστρο 6. αναδευτήρας vortex 30

31 Μέθοδος Σε 4 δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται 9 ml φυσιολογικού ορού. Στον πρώτο δοκιμαστικό σωλήνα μεταφέρεται 1 g ιζήματος. Έπειτα γίνεται ελαφρά ανακίνηση σε vortex. Στο δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα μεταφέρεται 1 ml από τον πρώτο με τη βοήθεια πιπέτας. Ακολουθεί ανάδευση στο vortex. Έτσι επιτυγχάνεται αραίωση Με τον ίδιο τρόπο επαναλαμβάνεται η διαδικασία μέχρι να επιτευχθεί αραίωση Όλες οι διαδικασίες έγιναν άσηπτα. Τέλος σε τριβλία με yeast extract agar μεταφέρονται με μικροπιπέτα ακριβείας 1 ml από κάθε δοκιμαστικό σωλήνα και επιπλέον 0.1 ml από τον τελευταίο δοκιμαστικό σωλήνα αραίωσης 10-3 για να υπάρχει επίστρωση με αραιωμένο υλικό μέχρι και Οι επιστρώσεις γίνονται ανά δύο μέρες και ανάλογα με το αν παρατηρείται κάποια σημαντική αλλαγή στις μετρήσεις φθορισμομετρίας Παρασκευή Agar bacteriological για καλλιέργεια μικροοργανισμών από τους αντιδραστήρες Υλικά 1. 1 L απιονισμένο νερό 2. κωνική φιάλη των 100 ml 3. 1 g ίζημα 4. Πλάκα θέρμανσης, 190 στροφές Schott g/l Agar bacteriological 6. Αυτόκαυστο Κλίβανος υγρής αποστείρωσης 7. 1 φλόγιστρο άδεια τριβλία Μέθοδος Σε κωνική φιάλη του ενός λίτρου ρίχνονται 1000 ml απιονισμένο νερό, 10 g άγαρ bacteriological και 33 mg/l CaCl 2, 18 mg/l CaSO 4.2H 2 O, 17 mg/l NaHCO 3. Σε θερμαινόμενη πλάκα με αναδευτήρα θερμαίνεται η κωνική φιάλη μέχρι το διάλυμα να γίνει διαφανές. Όταν αρχίσει να αφρίζει το διάλυμα αποσύρεται και μοιράζεται σε μικρότερα μπουκαλάκια με πλαστικά πώματα. Τα μπουκαλάκια αποστειρώνονται με τα πώματά τους ελαφρά βιδωμένα σε κλίβανο υγρής αποστείρωσης για 15 λεπτά στους 121 C. Όταν το διάλυμα κρυώσει προστίθενται με τη βοήθεια σύριγγας 100 μl φαινανθρενίου στο άγαρ. Τέλος σε κάθε τριβλίο αποστειρωμένο ρίχνονται περίπου 15 ml υγρού άγαρ. Η ποσότητα του ενός λίτρου αρκεί για περίπου 60 τριβλία κανονικού μεγέθους. Με την πάροδο λεπτών το άγαρ κρυώνει, σταθεροποιείται και αποθηκεύεται σε ψυγείο. 31

32 Για τα πειράματα χρησιμοποιούνται τριπλές δόσεις θρεπτικού άγαρ bacteriological και τριπλάσιος αριθμός τριβλίων Επίστρωση σε τριβλία με άγαρ bacteriological Υλικά 1. Φλόγιστρο 2. Υάλινη ράβδος 3. Αλκοόλη 4. Ποτήρι ζέσεως 5. Μικροπιπέτα των 200 μl (Johnson) Μέθοδος Έχοντας ανακινήσει προηγουμένως τους αντιδραστήρες, μεταφέρονται κάτω από άσηπτες συνθήκες μl από κάθε δείγμα σε διαφορετικό τριβλίο. Η ποσότητα του δείγματος του οποίου γίνεται η επίστρωση επιλέγεται βάση της ανάπτυξης των μικροοργανισμών από καλλιέργειες προηγούμενων ημερών. Π.χ. όταν παρατηρείται μεγάλη ανάπτυξη σε τριβλία προηγούμενων επιστρώσεων δειγμάτων, τότε μειώνεται η ποσότητα του δείγματος που μεταφέρεται στο τριβλίο, και αντίστροφα. Με κεκαμένη υάλινη ράβδο γίνεται η επίστρωση του δείγματος και με τη πάροδο 10 λεπτών αφού το υγρό έχει απορροφηθεί, τα τριβλία τοποθετούνται για επώαση. 2.5 Ανάλυση δεδομένων Εξισώσεις που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των δεδομένων: C 0 = ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΥΦΛΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΜΕΤΡΗΣΗ FW ή FN (μg/l) ΚΛΙΣΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ Ce = ΜΕΤΡΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΜΕΤΡΗΣΗ Fw ή FN (μg/l) ΚΛΙΣΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ qe = ( C 0 average Ce) x ΟΓΚΟΣ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ (μg/kg) ΜΑΖΑ ΙΖΗΜΑΤΟΣ Kd = qe / Ce (L/Kg) 32

33 Όπου : qe η μάζα ροφημένης οργανικής ουσίας (φαινανθρενίου) προς τη μάζα του ροφητή, μονάδα μέτρησης μg/kg Ce η συγκέντρωση της οργανικής ουσίας στο υδατικό διάλυμα του αντιδραστήρα εκφρασμένη σε μg/l Kd ο συντελεστής κατανομής της ρόφησης εκφρασμένος σε L/Kg C 0 η συγκέντρωση του φαινανθρενίου στο τυφλό δείγμα εκφρασμένη σε μg/l C 0average είναι ο μέσος όρος της μέτρησης C 0 των δυο τυφλών δειγμάτων 33

34 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η πτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε για να προτείνει και να λύσει ερωτήματα που τέθηκαν κατά τη μελέτη της βιοαποδόμησης του φαινανθρενίου (Karapanagioti and Efstratiou, αδημοσίευτη εργασία). Η υπόθεση που αναπτύχθηκε από τη μελέτη αυτή ήταν ότι η βιοαποδόμηση οδηγεί σε μείωση του φαινανθρενίου στο υδατικό διάλυμα, αυξάνεται η βιομάζα των μικροβίων ικανά να αποδομούν το φαινανθρένιο, δείγματα με μικρότερη αρχική βιομάζα παρουσιάζουν μικρότερους ρυθμούς αποδόμησης, και ότι η αύξηση της συγκέντρωσης των παραπροϊόντων γίνεται παράλληλα με τη μείωση της συγκέντρωσης του φαινανθρενίου. Το πείραμα της πτυχιακής εργασίας βασίζεται πάνω στα αποτελέσματα της εργασίας (αδημοσίευτη εργασία Karapanagioti and Efstratiou), και στα ερωτήματα που δημιουργήθηκαν κατά τη μελέτη της αποδόμησης του φαινανθρενίου παρουσία νατραζιδίου. Τα ερωτήματα αυτά είναι (1) αν το νατραζίδιο είναι κατάλληλο ή επαρκές ανασταλτικό της βιοαποδόμησης, (2) αν η μικροβιακή μάζα ικανή να αποδομεί το φαινανθρένιο σε αντιδραστήρες, μπορεί να περιοριστεί από άλλες μεθόδους, για την καλύτερη και πιο αξιόπιστη μελέτη της κινητικής του φαινανθρενίου. Παρακάτω, παρατίθενται τα αποτελέσματα της μελέτης (Karapanagioti and Efstratiou, αδημοσίευτη εργασία), η οποία εξετάζει τις πιθανότητες το φαινανθρένιο να αντιδρά με το νατραζίδιο, βρίσκει αποδείξεις μείωσης του φαινανθρενίου παρουσία νατραζιδίου και αναγνωρίζει και συγκρίνει μικρόβια, και τον πληθυσμό τους καθώς αποδομούν το φαινανθρένιο παρουσία και απουσία νατραζιδίου. Τέλος, συγκρίνονται με τα αποτελέσματα της πτυχιακής εργασίας η οποία μελετά την βιοαποδόμηση του φαινανθρενίου με πειράματα κινητικής ρόφησης με σειρές αποστειρωμένων αντιδραστήρων και άσηπτων συνθηκών, παρουσία και μη νατραζιδίου (NaN 3 ). Το ίζημα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη είναι από την ίδια περιοχή του ιζήματος της μελέτης Karapanagioti et al., 2001 όπου παρατηρήθηκε βιοαποδόμηση φαινανθρενίου απουσία νατραζιδίου. 34

35 3.1 Σύγκριση της καμπύλης ρόφησης φαινανθρενίου σε αποστειρωμένους αντιδραστήρες παρουσία νατραζιδίου με την καμπύλη ρόφησης φαινανθρενίου σε αποστειρωμένους αντιδραστήρες απουσία νατραζιδίου (α) 0.7 Ce/Co Χρόνος (Ημέρες) (β) Ce/Co Χρόνος (Ημέρες) Σχήμα 3.1 Ce / C 0 είναι η συγκέντρωση της οργανικής ουσίας (φαινανθρένιο) στο υδατικό διάλυμα του αντιδραστήρα προς τη συγκέντρωση του φαινανθρενίου στο τυφλό δείγμα σε σχέση με το χρόνο. Το σχεδιάγραμμα (α) είναι από δείγματα με νατραζίδιο και το (β) χωρίς νατραζίδιο. 35