Μηχανισμοί Ογκογένεσης

Transcript

1 ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ Μηχανισμοί Ογκογένεσης Δρ. Α. ΓΑΛΑΝΗΣ

2

3

4 Change in the US Death Rates* by Cause, 1950 & 2003 Rate Per 100, , ,6 180,7 193,9 190, ,3 48,1 21,9 0 Heart Diseases Cerebrovascular Diseases Pneumonia/ Influenza Cancer

5 Ανασυνδυασμένο DNA Γονίδια και Γονιδιώματα Μία Συνοπτική Παρουσίαση James D. Watson Amy A. Caudy Richard M. Myers Jan A. Witkowski

6 Ανασυνδυασμένο DNA Κεφάλαιο 15 Κατανοώντας τη γενετική βάση του καρκίνου James D. Watson Amy A. Caudy Richard M. Myers Jan A. Witkowski

7 Πρόληψη Έγκαιρη διάγνωση Θεραπευτική αγωγή Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

8 Περιβαντολλοντικοί παράγοντες αποτελούν την κύρια αιτία επαγωγής καρκίνου Το κάπνισμα ευθύνεται για το 80% περίπου των θανάτων από καρκίνο του πνεύμονα, επομένως για το 30% του συνόλου των θανάτων λόγω καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες. Επιπλέον, η μείωση των ποσοστών θανάτου από καρκίνο του πνεύμονα στους άντρες κατά 1,9% περίπου ετησίως μεταξύ 1991 και 2002 συνοδεύεται από ανάλογη μείωση του καπνίσματος.

9 ΕΙΚΟΝΑ 15.1: Συσχέτιση του καπνίσματος και της συχνότητας θανάτων από καρκίνο του πνεύμονα στις Ηνωμένες Πολιτείες από το 1900 ως το 2002.

10 Perhaps this list of ingredients that are found in cigarettes is enough to make you want to quit smoking for good! There are more than 4,000 ingredients in a cigarette other than tobacco. Common additives include yeast, wine, caffeine, beeswax and chocolate. Here are some other ingredients: Ammonia: Household cleaner Angelica root extract: Known to cause cancer in animals Arsenic: Used in rat poisons Benzene: Used in making dyes, synthetic rubber Butane: Gas; used in lighter fluid Carbon monoxide: Poisonous gas Cadmium: Used in batteries Cyanide: Deadly poison DDT: A banned insecticide Ethyl Furoate: Causes liver damage in animals Lead: Poisonous in high doses Formaldehiyde: Used to preserve dead specimens Methoprene: Insecticide Megastigmatrienone: Chemical naturally found in grapefruit juice Maltitol: Sweetener for diabetics Napthalene: Ingredient in mothballs Methyl isocyanate: Its accidental release killed 2000 people in Bhopal, India in 1984 Polonium: Cancer-causing radioactive element

11 Το πλέον κλασικό παράδειγμα συσχετισμού της έκθεσης σε ακτινοβολία και του καρκίνου προέρχεται από τις αρχές του 20ού αιώνα, όταν οι αριθμοί και οι δείκτες των ρολογιών βάφονταν με μπογιά που περιείχε ράδιο, ώστε να φωσφορίζουν και να είναι ορατοί στο σκοτάδι. Οι γυναίκες που εργάζονταν για την κατασκευή των συγκεκριμένων ρολογιών έγλειφαν τα πινέλα που χρησιμοποιούσαν, για να γίνεται μυτερή η άκρη τους. Με τον τρόπο αυτό κατάπιναν το στοιχείο ράδιο, με αποτέλεσμα να εμφανίζουν καρκίνους των οστών 8-40 χρόνια αργότερα.

12 Οι βλαπτικές επιδράσεις του αμίαντου έχουν διαπιστωθεί τουλάχιστον από τη δεκαετία του 1920, οπότε ο Βρετανός παθολόγος Dr. Cooke εξέτασε εργάτες που εκθέτονταν σε περιβάλλον σκόνης αμίαντου και ονόμασε την παρατηρούμενη ασθένεια του πνεύμονα "ασβέστωσις". Σήμερα ο αμίαντος θεωρείται ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες καρκινογένεσης (κυρίως μεσοθηλίωμα και καρκίνος του πνεύμονα), στην περίπτωση που οι ίνες του εισχωρήσουν στον ανθρώπινο οργανισμό. Η διαπιστωμένη, πλέον, ενοχοποίηση του για καρκινογένεση έχει οδηγήσει πολλές χώρες στη λήψη αυστηρών μέτρων για τον περιορισμό της χρήσης του και τη σταδιακή πλήρη απαγόρευσή του. Στην Ελλάδα η νομοθεσία θέσπιζε ένα αρκετά αυστηρό πλαίσιο για την χρήση του αμίαντου (ΠΔ 70α/1988, ΠΔ 175/97), ενώ πλέον σε εφαρμογή των ευρωπαϊκών οδηγιών 1999/77/ΕΚ και 2003/18/ΕΚ απαγορεύεται η εξόρυξη και χρήση του. 12

13 Μία τρίτη μορφή έκθεσης σε περιβαλλοντικούς παράγοντες που μπορεί να προκαλέσει καρκίνο είναι η μόλυνση από ιούς. Ο ιός του ανθρώπινου θηλώματος (HPV, human papilloma virus), συναντάται στο 50% περίπου των καρκίνων του τραχήλου. Στις Ηνωμένες Πολιτείες εμφανίζονται κάθε χρόνο περίπου νέα περιστατικά καρκίνου του τραχήλου και σχεδόν θάνατοι από αυτή την αιτία. Σε παγκόσμια κλίμακα, ο καρκίνος του τραχήλου είναι η δεύτερη συνηθέστερη μορφή καρκίνου στις γυναίκες και υπολογίζεται ότι ευθύνεται για θανάτους ετησίως. Ο Ομοσπονδιακός Οργανισμός Φαρμάκων και Τροφίμων των ΗΠΑ (FDA, Food and Drug Administration, USA) ενέκρινε πρόσφατα (το 2006) ένα εμβόλιο που παρέχει προστασία από τους τύπους 6, 11, 16 και 18 αυτής της μορφής καρκίνου. Σε δοκιμές που έγιναν σε γυναίκες, το εμβόλιο παρείχε σχεδόν 100% προστασία από την ανάπτυξη προκαρκινικών μορφών.

14

15 Πρόληψη Έγκαιρη διάγνωση Θεραπευτική αγωγή

16 Πρόληψη Έγκαιρη διάγνωση Ευαισθησία Ταχύτητα Κόστος Ακρίβεια Θεραπευτική αγωγή

17 Πρόληψη Έγκαιρη διάγνωση Ευαισθησία Ταχύτητα Κόστος Ακρίβεια Θεραπευτική αγωγή Xημειοθεραπεία Aκτινοθεραπεία Xειρουργική επέμβαση

18 Οι καρκίνοι προκύπτουν από γενετικές αλλαγές στα κύτταρά μας. Πληθυσμιακές μελέτες δείχνουν ότι η συχνότητα εμφάνισης διαφόρων μορφών καρκίνου του επιθηλιακού ιστού, όπως είναι τα καρκινώματα του παχέος εντέρου και του προστάτη, αυξάνεται σταθερά ως συνάρτηση της ηλικίας. Για παράδειγμα, η συχνότητα καρκίνου του προστάτη αυξάνεται από 24 περιστατικά ανά άντρες που ανήκουν στην ηλικιακή ομάδα σε 454 περιστατικά στην ηλικιακή ομάδα και σε 991 στις ηλικίες 65-74, αυξάνεται δηλαδή κατά 40 φορές. Ωστόσο, δεν ακολουθούν όλες οι μορφές καρκίνου αυτό το πρότυπο συσχέτισης με την ηλικία. Η συχνότητα καρκίνου του μαστού, για παράδειγμα, παρουσιάζει ταχεία αύξηση μέχρι τα 50 έτη, ενώ στη συνέχεια αυξάνεται με πιο αργό ρυθμό, κάτι που ίσως οφείλεται στο ότι αυτή η μορφή καρκίνου εμφανίζει κληρονομικές μορφές στις οποίες εκδηλώνεται πρώιμη εμφάνιση της ασθένειας.

19 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 30.1 Η επίπτωση του καρκίνου (δηλαδή η συχνότητα της διάγνωσης νέων περιπτώσεων καρκίνου) αυξάνεται σημαντικά σε συνάρτηση με την ηλικία. Κάθε σημείο στο διάγραμμα αντιπροσωπεύει τα νέα περιστατικά που εμφανίζονται κάθε χρόνο στην προηγούμενη ηλικιακή ομάδα (το πρώτο σημείο είναι για τις ηλικίες 0-20 έτη κτλ.). Η επίπτωση φτάνει σε επίπεδο κορεσμού (πλατό) μετά την ηλικία των 80 ετών.

20 Εικόνα 30.5 Οι φυσιολογικοί ινοβλάστες αναπτύσσονται σε μία στιβάδα επιμηκυσμένων κυττάρων, ενώ οι μετασχηματισμένοι ινοβλάστες είναι σφαιρικοί και αναπτύσσονται σε πολύστιβες μάζες κυττάρων. Οι φωτογραφίες είναι ευγενική προσφορά του Hidesaburo Hanafusa. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

21 Εικόνα 30.6 Η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης δείχνει ότι τα φυσιολογικά κύτταρα εκτείνονται και σχηματίζουν επιμηκυσμένες προεκτάσεις, ενώ τα καρκινικά κύτταρα είναι σφαιρικά και σχηματίζουν μικρές, συμπαγείς μάζες. Οι φωτογραφίες είναι ευγενική προσφορά του J. Michael Bishop. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

22 Όταν αναπτύσσονται σε κυτταροκαλλιέργεια φυσιολογικοί διπλοειδείς ινοβλάστες από πνεύμονα εμβρύου ανθρώπου, σχηματίζουν μία μονή στιβάδα στην επιφάνεια του τρυβλίου Petri και αναπτύσσονται σταθερά για 8 περίπου μήνες. Κατά το διάστημα αυτό διαιρούνται 60 φορές περίπου. Μάλιστα, αλλάζουν σχήμα, με αποτέλεσμα, αντί για το χαρακτηριστικό επίμηκες σχήμα των ινοβλαστών, να αποκτούν πιο πεπλατυσμένη μορφή. Τα κύτταρα αυτά χαρακτηρίζονται ως γηρασμένα (senescent). Το όριο στο πλήθος των διαιρέσεων των φυσιολογικών κυττάρων ονομάζεται όριο Hayflick (Hayflick limit). Σε αντίθεση με τους ανθρώπινους ινοβλάστες, οι εμβρυϊκοί ινοβλάστες του ποντικού υπόκεινται άμεσα σε αλλαγές που τους καθιστούν αθάνατους (immortal). Δηλαδή μετατρέπονται σε κυτταρικές σειρές με δυνατότητα απεριόριστων διαιρέσεων. Τα κύτταρα αυτά συχνά φέρουν χρωμοσωμικές αλλαγές και διακριτό σχήμα και εμφανίζουν μειωμένη εξάρτηση από συγκεκριμένους παράγοντες στο θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας. Τυπικό παράδειγμα κυττάρων αυτού του είδους είναι η σειρά εμβρυϊκών κυττάρων ποντικού 3Τ3.

23 Ωστόσο, τα κύτταρα που έχουν δυνατότητα απεριόριστων διαιρέσεων δε σχηματίζουν απαραίτητα όγκους όταν ενίονται σε ζώα. Για να γίνει αυτό, απαιτούνται και άλλες αλλαγές, όπως είναι οι αλλαγές που επάγονται από καρκινογόνες χημικές ουσίες και ακτινοβολία ή από την εισαγωγή καρκινογόνων γονιδίων (ογκογονιδίων). Όταν συμβούν αυτές οι αλλαγές, τα κύτταρα συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται, σε συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας συσσωρεύονται το ένα πάνω στο άλλο, ενώ, όταν ενίονται σε ζώα, σχηματίζουν όγκους. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα καρκινικά κύτταρα διατηρούν το χαρακτηριστικό φαινότυπό τους κατά την καλλιέργειά τους στο εργαστήριο. Η κλασική κυτταρική σειρά HeLa προήλθε από ένα αδενοκαρκίνωμα του τραχήλου το 1951 και έκτοτε αναπτύσσεται σε καλλιέργεια.

24 Τα πρώτα ογκογονίδια ανακαλύφθηκαν κατά τη μελέτη ογκογόνων ιών Υπάρχουν δύο τύποι ογκογόνων ιών: οι ιοί RNA, και οι ιοί DNA. Ο πρώτος ογκογόνος ιός που ανακαλύφθηκε ήταν ένας ιός RNA, ο ιός του σαρκώματος Rous (RSV, Rous Sarcoma Virus), που πήρε την ονομασία του από το Rous, τον επιστήμονα που τον απομόνωσε από το κοτόπουλο το Ο ιός του σαρκώματος των πτηνών, ο ιός της λευχαιμίας των αιλουροειδών (FLV, Feline Leukemia Virus) και ο ιός του όγκου του μαστού του ποντικού (MMTV, Mouse Mammary Tumour Virus) είναι ορισμένοι άλλοι ογκογόνοι ιοί RNA. Παραδείγματα ογκογόνων ιών DNA είναι ο ιός του πολυώματος του ποντικού (MPV, Mouse Polyoma Virus), ο ιός 40 του πιθήκου (SV40, Simian Virus 40), ο ιός HPV και ο αδενοϊός του ανθρώπου (Human adenovirus).

25 Οι ογκογόνοι ιοί φέρουν ογκογονίδια (oncogenes), τα οποία προκαλούν το μετασχηματισμό των κυττάρων που μολύνονται από αυτούς τους ιούς. Τα ογκογονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες, οι οποίες συχνά ονομάζονται ογκοπρωτεΐνες (oncoproteins) και έχουν ποικίλους και σημαντικούς ρόλους στο βιολογικό κύκλο του ιού, όπως κατά την έναρξη της αντιγραφής του DNA και κατά τη ρύθμιση της μεταγραφής των ιικών γονιδίων. Η ικανότητα των ογκογονιδίων να μετασχηματίζουν τα κύτταρα είναι συνέπεια των ενεργειών αυτών. Ανάμεσα στις πρωτεΐνες αυτές συγκαταλέγεται το μεγάλο αντιγόνο Τ του SV40, το μεγάλο και το μεσαίο αντιγόνο Τ του ιού του πολυώματος, οι πρωτεΐνες Ε1Α και Ε1Β του αδενοϊού, καθώς και οι πρωτεΐνες Ε6 και Ε7 των ιών του θηλώματος.

26 Οι πρωτεΐνες Ε1Α δρουν με την πρόσδεση τους σε διάφορες κυτταρικές πρωτεΐνες, οι οποίες στη συνέχεια καταστέλλουν ή ενεργοποιούν τη μεταγραφή των κατάλληλών γονιδίων στόχων. Σ αυτούς τους στόχους περιλαμβάνονται οι CBP και p300, ο TBP και οι RB και p27. Συνενεργοποιητές Βασικός μεταγραφικός παράγοντας Ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου Αναστολέας κυκλινοεξαρτώμενης κινάσης (CKI)

27 Εικόνα Ένας ρετροϊός μπορεί να ενσωματώσει κάποιο κυτταρικό πρωτοογκογονίδιο κατά τη διάρκεια ενός κύκλου μόλυνσης. Μεταγενέστερες μεταλλάξεις ή άλλες αλλαγές στο πρωτο-ογκογονίδιο μπορεί να το καταστήσουν ογκογόνο, όταν ο ιός το μεταφέρει σε ένα άλλο κύτταρο σε ένα νέο κύκλο μόλυνσης.

28 Ο RSV ανήκει στους ρετροϊούς οξέος μετασχηματισμού ΕΙΚΟΝΑ 15.2: Τα ογκογονίδια των ρετροϊών είναι ομόλογα με γονίδια φυσιολογικών κυττάρων. Μετά την υβριδοποίηση ακολούθησε επίδραση νουκλεάσης S1, ενός ενζύμου που αποικοδομεί μόνο το μονόκλωνο DNA. Ένα τμήμα του DNA του ραδιοσημασμένου γονιδίου src παρέμεινε ανθεκτικό στην επίδραση του ενζύμου, γεγονός που μαρτυρά ότι είχε σχηματίσει δίκλωνα μόρια με τμήματα DNA του κοτόπουλου. Επομένως, το DNA του κοτόπουλου θα πρέπει να διαθέτει ένα γονίδιο που να έχει μεγάλη ομοιότητα με το src.

29 Δομή της κινάσης Src

30 Eνεργοποίηση της κινάσης Src

31 Xαρακτηρισμός του πρωτο-ογκογονιδίου ras This discovery was exciting! The excitement came from the resulting conclusion that the same normal cellular gene could be activated into a potent oncogene either by a retrovirus or by a somatic mutation of the sort inflicted by mutagenic carcinogens. Reddy, E. P., Reynolds, R. K., Santos, E., and Barbacid, M. (1982). A point mutation is responsible for the acquisition of transforming properties by the T24 human bladder carcinoma oncogene. Nature 300, Tabin, C. J., Bradley, S. M., Bargmann, C. I., Weinberg, R. A., Papageorge, A. G., Scolnick, E. M., Dhar, R., Scolnick, R., Lowy, D. R., and Chang, E. H. (1982). Mechanism of activation of a human oncogene. Nature 300, Taparowsky, E., Suard, Y., Fasano, O., Shimizu, K., Goldfarb, M., and Wigler, M. (1982). Activation of the T24 bladder carcinoma transforming gene is linked to a single amino acid change. Nature 300, Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

32 EIKONA 15.4: Κλωνοποίηση ενός ενεργοποιημένου ογκογονιδίου από όγκο ανθρώπου. DNA που απομονώθηκε από τις καλλιέργειες αυτές χρησιμοποιήθηκε για το μετασχηματισμό άλλων ινοβλαστών ποντικού. Η υπόθεση ήταν ότι μέσω πολλαπλών κύκλων μετασχηματισμού θα επιλέγονταν και θα εμπλουτίζονταν τελικά τα τμήματα ανθρώπινου DNA που περιλάμβαναν κάποιο ογκογονίδιο.

33 Overview: Southern blotting was named after Edward M. Southern who developed this procedure at Edinburgh University in the It allows investigators to determine the molecular weight of a restriction fragment, to measure relative amounts in different samples and to locate a particular sequence of DNA within a complex mixture. DNA (genomic or other source) is digested with a restriction enzyme and separated by gel electrophoresis and transferred from an agarose gel onto a membrane which is then incubated with a probe which is single-stranded DNA. This probe will form base pairs with its complementary DNA sequence and bind to form a double-stranded DNA molecule. The probe is labeled before hybridization either radioactively or enzymatically (e.g. alkaline phosphatase or horseradish peroxidase). Finally, the location of the probe is detected by directly exposing the membrane to X-ray film or chemiluminescent methods.

34 Τα πρότυπα υβριδοποίησης DNA φυσιολογικών κυττάρων ήταν πανομοιότυπα με τα πρότυπα υβριδοποίησης DNA μετασχηματισμένων ινοβλαστών, με μόνη εξαίρεση έναν ιχνηθέτη του ογκογονιδίου ras του ιού του σαρκώματος Harvey (ενός ιικού ρετροϊού). Τμήματα DNA που σχετίζονταν με το γονίδιο ras εντοπίστηκαν ανεξάρτητα σε πολλούς κλώνους ινοβλαστών που είχαν μετασχηματιστεί από το DNA όγκων ανθρώπου. Μάλιστα, ο φαινότυπος του μετασχηματισμού συνέπιπτε με την παρουσία των ανθρώπινων τμημάτων ras στα κύτταρα του ποντικού. Επιπλέον, το ογκογονίδιο που κλωνοποιήθηκε από όγκο ουροδόχου κύστης υβριδιζόταν επίσης με τον ιχνηθέτη ras. Προέκυπτε λοιπόν κατηγορηματικά το εξής συμπέρασμα: το ογκογονίδιο που υπήρχε στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης και το οποίο είχε μεταφερθεί στα κύτταρα του ποντικού μέσω της διαμόλυνσης ήταν το c-ras, το κυτταρικό αντίστοιχο του ρετροϊικού ras.

35 Parada, L. F., Tabin, C. J., Shih, C., and Weinberg, R. A. (1982). Human EJ bladder carcinoma oncogene is homologue of Harvey sarcoma virus ras gene. Nature 297,

36 ΕΙΚΟΝΑ 15.5: Εντοπισμός της μεταλλαγής που ενεργοποίησε το γονίδιο ras με δημιουργία χιμαιρικών συνδυασμών γενετικού υλικού.

37 ΕΙΚΟΝΑ 15.6: Ο κύκλος ενεργοποίησης/απενεργοποίησης της πρωτεΐνης Ras.

38 Το Myc ως ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου

39 Estrogen Receptor Η Myc δρα απουσία ισχυρών μιτογονικών σημάτων προωθώντας τον κυτταρικό κύκλο αδρανοποιημένων στη φάση Gο κυττάρων

40 ΕΙΚΟΝΑ 15.7: Η απορρύθμιση της παραγωγής φυσιολογικής πρωτεΐνης Myc αρκεί για να προκαλέσει κυτταρικό μετασχηματισμό.

41 Δύο γενικές θεωρίες θα μπορούσαν να εξηγήσουν τις διαφορετικές ιδιότητες των γονιδίων v- onc και c-onc: Το ποσοτικό μοντέλο προτείνει ότι τα ιικά γονίδια δε διακρίνονται λειτουργικά από τα κυτταρικά γονίδια, αλλά είναι ογκογόνα είτε επειδή εκφράζονται σε πολύ μεγαλύτερες ποσότητες ή σε ακατάλληλους κυτταρικούς τύπους, είτε επειδή δεν μπορεί να διακοπεί η έκφρασή τους (c-myc). Το ποιοτικό μοντέλο υποθέτει ότι τα αρχικά γονίδια c-onc δεν έχουν εγγενείς ογκογόνες ιδιότητες, αλλά μετατρέπονται σε ογκογονίδια μετά από μεταλλάξεις, όπως ακριβώς τα πρωτο-ογκογονίδια μετατρέπονται σε ογκογονίδια. Η ογκογονικότητά τους οφείλεται είτε στις νέες ιδιότητες που αποκτούν είτε στην απώλεια των παλιών (c-ras). 41

42 Σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις στις οποίες είναι γνωστή η λειτουργία των ογκογονιδίων, αυτά συμμετέχουν σε σηματοδοτικά μονοπάτια μέσω των οποίων τα κύτταρα δέχονται και εκτελούν εντολές που αφορούν τον πολλαπλασιασμό τους. Οι μεταλλαγές που ενεργοποιούν τις ογκοπρωτεΐνες είναι είτε δομικές μεταλλαγές, με συνέπεια την ιδιοστατική ενεργότητά τους ανεξάρτητα από εξωκυτταρικά σήματα (π.χ. περιπτώσεις πρωτεϊνικών κινασών και Ras), είτε ρυθμιστικές μεταλλαγές, που οδηγούν σε έκφραση του ογκογονιδίου σε λάθος κυτταρικό τύπο ή χρονική στιγμή (π.χ. περιπτώσεις πυρηνικών ογκοπρωτεϊνών και αυξητικών παραγόντων). Η βλάβη ή η απορρύθμιση των ογκογονιδίων συνεπάγεται ένα συνεχές εσωτερικό σήμα που πυροδοτεί τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό απουσία εξωτερικών ερεθισμάτων.

43 To γονίδιο c-erbb κωδικοποιεί τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor). Ανακαλύφθηκε, επίσης, ένα δεύτερο συγγενικό γονίδιο, το erbb2, το οποίο ονομάζεται και HER2 (Human EGF Receptor 2). Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι το HER2 ταυτίζεται με ένα άλλο γνωστό ογκογονίδιο, το neu, το οποίο έχει κλωνοποιηθεί από νευροβλαστώματα αρουραίου. Αν και συγγενεύει στενά με τον υποδοχέα EGF, ο υποδοχέας HER2 δεν αλληλεπιδρά με τον αυξητικό παράγοντα, αλλά διεγείρει το σηματοδοτικό μονοπάτι του EGF αλληλεπιδρώντας με τον ίδιο τον υποδοχέα του EGF.

44 Οι επιστήμονες συμπέραναν ότι το HER2 ήταν πιθανόν ένας σημαντικός καρκινικός παράγοντας, όταν παρατήρησαν ότι υπερεκφράζεται στο 20-25% των περιπτώσεων καρκίνου του μαστού. Είναι εντυπωσιακό το γεγονός ότι οι όγκοι που υπερεκφράζουν το γονίδιο HER2 είναι πολύ πιο επιθετικοί και οι ασθενείς με τέτοιους όγκους παρουσιάζουν πολύ χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης απ ό,τι αυτοί με όγκους που εμφανίζουν φυσιολογικά επίπεδα HER2. Το HER2 υπερεκφράζεται και σε πολλούς καρκίνους των ωοθηκών. Και εδώ, η υπερέκφρασή του σχετίζεται με αρνητική πρόγνωση σχετικά με την επιβίωση του καρκινοπαθούς.

45 ΕΙΚΟΝΑ 15.8: Το Herceptin αποτελεί παράδειγμα ανθρωποποιημένου θεραπευτικού αντισώματος. Σχεδιάστηκε ένας βακτηριακός φορέας έκφρασης της εξωκυτταρικής επικράτειας της HER2. Το ανασυνδυασμένο αυτό πολυπεπτίδιο, που υπερεκφράστηκε στα βακτήρια, απομονώθηκε, ενέθηκε σε ποντικούς και χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή υβριδωμάτων. Εντοπίστηκε ένας κλώνος που εκφράζει ένα αντίσωμα το οποίο όχι μόνο προσδένεται στην πρωτεΐνη ΗΕR2 αλλά προκαλεί και καταστολή της αύξησης των καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν τη HER2.

46 ΕΙΚΟΝΑ 15.8: Το Herceptin αποτελεί παράδειγμα ανθρωποποιημένου θεραπευτικού αντισώματος. Οι μεταβλητές περιοχές των γονιδίων που κωδικοποιούν τόσο τη βαριά όσο και την ελαφριά αλυσίδα του αντισώματος πολλαπλασιάστηκαν με PCR και αλληλουχήθηκαν. Αυτές οι μεταβλητές περιοχές του ποντικού κλωνοποιήθηκαν σε ένα πλασμίδιο ως χίμαιρες με τις αλληλουχίες των cdna που κωδικοποιούν αντίστοιχα τις σταθερές περιοχές της ανθρώπινης ελαφριάς και βαριάς αλυσίδας. Στη συνέχεια, μετατράπηκαν, με μεταλλαξιγένεση σημείου, πολλά κωδικόνια της μεταβλητής περιοχής του αντισώματος του ποντικού, ώστε να κωδικοποιούν πλέον τα αμινοξέα που βρίσκονται στις αντίστοιχες θέσεις στις αλυσίδες των ανοσοσφαιρινών του ανθρώπου. Για την παρασκευή των ανθρωποποιημένων ελαφρών και των βαριών αλυσίδων χρειάστηκαν 24 και 32 αλλαγές αμινοξέων αντίστοιχα.

47 ΕΙΚΟΝΑ 15.8: Το Herceptin αποτελεί παράδειγμα ανθρωποποιημένου θεραπευτικού αντισώματος. Οι κλώνοι που προέκυψαν κωδικοποιούν ένα αντίσωμα σχεδόν εξολοκλήρου ανθρώπινο, με εξαίρεση τα μικρά τμήματα της μεταβλητής περιοχής που εμπλέκονται άμεσα στην πρόσδεση του αντιγόνου.

48 ΕΙΚΟΝΑ 6.5: Παραγωγή μονοκλωνικού αντισώματος (mab). Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

49 ΕΙΚΟΝΑ 6.5: Παραγωγή μονοκλωνικού αντισώματος (mab). Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

50 Η εταιρεία Genentech ανέπτυξε ένα ανθρωποποιημένο αντίσωμα αντι-her2, το οποίο ονόμασε Herceptin. Το αντίσωμα αυτό εμπόδιζε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που υπερεκφράζουν HER2 σε καλλιέργεια και σύντομα αποδείχθηκε ότι προκαλεί καταστολή των όγκων και in vivo. Το συγκεκριμένο φάρμακο εγκρίθηκε από τον FDA για τη θεραπεία μεταστατικού καρκίνου του μαστού και είναι γεγονός ότι αύξησε την επιβίωση των ασθενών από 20 μήνες σε 25 και μείωσε το ετήσιο ποσοστό θανάτων από 33% σε 22%. Το Herceptin φαίνεται να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό, όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία στις γυναίκες στις οποίες γίνεται χειρουργική αφαίρεση των όγκων που εμφανίζουν υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Αν και το 33% των γυναικών που υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία υποτροπιάζει, η συνδυαστική θεραπεία μειώνει το ποσοστό αυτό σε 15%. Το Herceptin είναι αποτελεσματικό ενάντια σε μικρές ομάδες κυττάρων που ίσως έκαναν μετάσταση σε άλλους ιστούς.

51 Πως δρα το Herceptin; Η σταθερή περιοχή αποτελεί στόχο για Τ-λεμφοκύτταρα, μακροφάγα, NK κύτταρα Επαγωγή ανοσολογικών αποκρίσεων Ύστερα από την αλληλεπίδραση Herceptin-HER2, o υποδοχέας εσωτερικεύεται και αποικοδομείται. Αναστολή της αγγειογένεσης Εμποδίζεται ο διμερισμός του υποδοχέα Καταστολή των σηματοδοτικών μονοπατιών MAPK και PI3K/Akt.

52 Τρόποι δράσης του Herceptin

53 Αποτελέσματα της δράσης του Herceptin Το Herceptin, χορηγούμενο σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, επιφέρει καθυστέρηση στην πρόοδο της ασθένειας καθώς και μεγαλύτερο διάστημα επιβίωσης. Χορηγούμενο σε γυναίκες σε μετεγχειρητικό στάδιο, μόλις το 15% υποτροπίασε σε σύγκριση με το 33% των ασθενών που δεν έπαιρναν Herceptin και υποτροπίασε.

54 Ωστόσο, δεν αποτελεί πανάκεια 10% των ασθενών δεν το ανέχονται, ενώ το 2-7% των ασθενών που λαμβάνουν Herceptin εμφανίζουν κάποια μορφή καρδιοπάθειας. Απευθύνεται μόνο σε ασθενείς με το συγκεκριμένο τύπο καρκίνου. Μικρό ποσοστό των ασθενών παρουσιάζουν πραγματική βελτίωση λαμβάνοντας μόνο Herceptin. Σε μεγάλο ποσοστό ασθενών παρατηρείται ανθεκτικότητα στο Herceptin. Στους μηχανισμούς που προσδίδουν ανθεκτικότητα συμπεριλαμβάνεται η απώλεια της p27 kip όπως επίσης και συνεχής σηματοδότηση μέσω IGF( Insulin-like Growth Factor)

55 Οι πρωτεϊνικές κινάσες τυροσίνης, πλην αυτών που είναι διαμεμβρανικοί υποδοχείς, συνιστούν τη μεγαλύτερη οικογένεια ογκογονιδίων. Αυτές οι κινάσες μη-υποδοχείς (nonreceptor kinases) βρίσκονται περιφερειακά στο κυτταρόπλασμα, κοντά στην εσωτερική επιφάνεια της κυτταροπλασματικής μεμβράνης, όπου ενεργοποιούνται κατά την πρόσδεσή τους σε κατάλοιπα φωσφοτυροσίνης ενεργοποιημένων μεμβρανικών υποδοχέων. Με τη σειρά τους οι κινάσες αυτές φωσφορυλιώνουν τις πρωτεΐνες-στόχους τους, μεταδίδοντας σήματα από υποδοχείς που βρίσκονται ανοδικά στο μονοπάτι (σε σχέση με τις κινάσες μηυποδοχείς) σε καθοδικά στοιχεία του μονοπατιού.

56

57 Ένα θεραπευτικό αντίσωμα (π.χ Herceptin) δε θα ήταν αποτελεσματικό απέναντι στα oγκοκύτταρα των ασθενών με CML. O λόγος είναι ότι η BCR-ABL είναι ενδοκυτταρική πρωτεΐνη και η καταστολή της πρέπει να γίνει στο εσωτερικό των κυττάρων. Πώς μπορεί να γίνει η καταστολή της δράσης μιας ιδιοστατικά ενεργής κινάσης;

58 ΕΙΚΟΝΑ 15.3: Ορισμένα καρκινικά κύτταρα φέρουν χρωμοσωμικές αναδιατάξεις. Πολλοί όγκοι κυττάρων Β φέρουν χρωμοσωμικές μετατοπίσεις που συνδέουν το πρωτοογκογονίδιο c-myc (τα εξόνιά του παριστάνονται με πράσινο χρώμα) με ένα από τα γονίδια των ανοσοσφαιρινών (εξόνια με μπλε χρώμα). Το γονίδιο c-myc, το οποίο φυσιολογικά είναι απενεργοποιημένο στα κύτταρα Β που έχουν ολοκληρώσει τη διαφοροποίησή τους, ενεργοποιείται εξαιτίας της γειτνίασης με τον ενισχυτή του γονιδίου της ανοσοσφαιρίνης (Ε). Τέτοια μετατοπισμένα γονίδια συνήθως παράγουν φυσιολογική πρωτεΐνη c-myc.

59 Στη χρόνια μυελογενή λευχαιμία τα καρκινικά κύτταρα φέρουν μια χαρακτηριστική χρωμοσωμική μετατόπιση, εξαιτίας της οποίας το πρωτο-ογκογονίδιο c-abl (εξόνια με κόκκινο χρώμα), που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 9, ενώνεται με το χρωμόσωμα 22, διακόπτοντας ένα γονίδιο που ονομάζεται bcr (εξόνια με πορτοκαλί χρώμα). Από τη μετατόπιση προκύπτει μια νέα πρωτεΐνική κινάση, η BCR-ABL, η ρύθμιση της οποίας δεν είναι πλέον φυσιολογική. Οι μετατοπίσεις αυτές είναι αμοιβαίες, γεγονός που σημαίνει ότι σχηματίζεται και ένα δεύτερο μη φυσιολογικό χρωμόσωμα το οποίο φέρει τα υπόλοιπα τμήματα κάθε μετατοπισμένου χρωμοσώματος. Οι χρωματισμένες περιοχές παριστάνουν εξόνια.

60 ΕΙΚΟΝΑ 15.9: Το Gleevec αναπτύχθηκε ειδικά για την καταστολή της υβριδικής κινάσης BCR-ABL.

61 Η κρυσταλλική δομή του Gleevec σε σύμπλοκο με την πρωτεΐνη BCR-ABL αποκάλυψε γιατί συνέβαινε αυτό. Παρόλο που οι περισσότερες κινάσες έχουν παρόμοιες δομές όταν βρίσκονται στην ενεργή τους κατάσταση, οι δομές τους στην ανενεργή κατάσταση παρουσιάζουν πολύ μεγαλύτερη ετερογένεια. Το Gleevec οφείλει την υψηλότατη ειδικότητα της δράσης του στο ότι προσδένεται στην ανενεργή μορφή της BCR-ABL και κλειδώνει το «βρόχο ενεργοποίησης», που ελέγχει την ενεργότητα της κινάσης ABL, στην ανενεργή διαμόρφωση.

62 Το φάρμακο αυτό είναι εκπληκτικά αποτελεσματικό για τη θεραπεία της CML. Επιφέρει καταστολή του όγκου στο 80% των ασθενών, όταν η διάγνωση γίνεται σε πρώιμα στάδια. Πριν από την ανακάλυψη του Gleevec, το υψηλότερο ποσοστό πενταετούς επιβίωσης μετά τη διάγνωση ήταν 50%, όμως με τη χορήγηση του Gleevec το 89% των ασθενών επιβιώνει για 5 ή περισσότερα χρόνια. Δυστυχώς, ορισμένοι όγκοι σε κάποιους ασθενείς αναπτύσσουν ανθεκτικότητα στο Gleevec. Η πρωτεΐνη BCR-ABL αυτών των ανθεκτικών όγκων αλληλουχήθηκε αποκαλύπτοντας μεταλλαγές που εξασθενούσαν ή απέκλειαν την πρόσδεση του φαρμάκου στην BCR-ABL ή οδηγούσαν σε υπερέκφραση της χιμαιρικής πρωτεΐνης. Οι χημικοί προσπαθούν πλέον να σχεδιάσουν νέα μόρια που είναι σε θέση να καταστέλλουν τις μεταλλαγμένες κινάσες. Το Gleevec καταστέλλει και άλλες κινάσες, δύο από τις οποίες γνωρίζουμε ότι ενέχονται στον καρκίνο: τον υποδοχέα του Kit, σε όγκους του γαστρεντερικού σωλήνα, και τον υποδοχέα του PDGF, σε μυελοειδείς καρκίνους. Το Gleevec προσφέρει αποτελεσματική θεραπεία και στους δύο αυτούς τύπους καρκίνου.

63

64

65

66

67 H ογκογονικότητα είναι υπολειπόμενη σε σχέση με τη φυσιολογική αύξηση. ΕΙΚΟΝΑ 15.10: Ο φαινότυπος φυσιολογικής ανάπτυξης είναι επικρατής σε σχέση με το μετασχηματισμένο φαινότυπο.

68 ΕΙΚΟΝΑ 15.10: Ο φαινότυπος φυσιολογικής ανάπτυξης είναι επικρατής σε σχέση με το μετασχηματισμένο φαινότυπο.

69 ΕΙΚΟΝΑ 15.11: Η ανάπτυξη σποραδικού και κληρονομικού ρετινοβλαστώματος.

70 Ποια είναι όμως η λειτουργία της πρωτεΐνης RB; Πώς ελέγχει τον κυτταρικό κύκλο; Χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουν την πρωτεΐνη RB, διαπιστώθηκε ότι αυτή βρίσκεται στον πυρήνα και ότι σε κύτταρα που μόλις διαιρέθηκαν (δηλαδή μόλις ολοκλήρωσαν τη μίτωση) είναι φωσφορυλιωμένη σε μικρό μόνο βαθμό. Καθώς τα κύτταρα αρχίζουν να αντιγράφουν το DNA τους (δηλαδή κατά την είσοδο του κυτταρικού κύκλου στη φάση S), η πρωτεΐνη φωσφορυλιώνεται σε πολύ μεγάλο βαθμό. Η παρατήρηση αυτή έδειξε στους επιστήμονες ότι το εν λόγω φαινόμενο σχετίζεται με τον περιοδικό μηχανισμό μέσω του οποίου ρυθμίζεται η κυτταρική διαίρεση. Σήμερα γνωρίζουμε ότι η πρωτεΐνη RB καταστέλλει την αντιγραφή του DNA μέχρι τα κατάλληλα σήματα να επάγουν τη φωσφορυλίωσή της. Η φωσφορυλιωμένη μορφή της RB επιτρέπει τη μεταγραφή των γονιδίων που είναι απαραίτητα για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου.

71 H ανακάλυψη του p53 Lane, D. P. and Crawford, L. V. (1979). T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells. Nature 278, Linzer, D. I., Maltzman, W., and Levine, A. J. (1979). The SV40 A gene product is required for the production of a 54,000 MW cellular tumor antigen. Virology 98,

72

73

74 Βρόχος Αρνητικής Ανάδρασης Εικόνα Η ενεργότητα της p53 βρίσκεται σε ανταγωνισμό με την Mdm2, η οποία εξουδετερώνεται από την p19arf.

75 ΕΙΚΟΝΑ 15.12: Η πορεία εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η περιοχή του χρωμοσώματος 18 που φαίνεται Το να APC χάνεται (Adenomatous στους όγκους Polyposis του παχέος Coli, εντέρου αδενωματώδης (ανιχνεύεται σε πολυποδίαση > 70% των περιπτώσεων) του παχέος εντέρου), είναι η αποδείχθηκε 18q21. Η περιοχή ότι μειώνει αυτή τα περιλαμβάνει επίπεδα της δύο κυτταροπλασματικής γονίδια που ενδέχεται πρωτεΐνης να συμβάλλουν β-κατενίνη στην (βcatenin) ογκογένεση. Το γονίδιο DCC (Deleted in Παρόλο Colorectal που Cancer, υπάρχει έλλειμμα μία συγκεκριμένη στον καρκίνο σειρά του εμφάνισης Περισσότερα παχέος εντέρου) αυτών των από κωδικοποιεί γεγονότων τα μισά καρκινώματα ένα οι πολυπεπτίδιο, μεταλλαγές του των παχέος του γονιδίων οποίου εντέρου η ras αλληλουχία εμφανίζονται και των πολυπόδων είναι νωρίς, συγγενική για με μέγεθος με Σε παράδειγμα, αυτή τη χρωμοσωμική πάνω πρωτεΐνες από 1 κυτταρικής ενώ τα ελλείμματα περιοχή cm φέρουν πρόσφυσης p53 εντοπίζεται ενεργοποιητικές (cell αργότερα, και σημασία μεταλλαγές adhesion), το γονίδιο για σε δηλαδή την DPC4/MADH4, ανάπτυξη ένα από βιομόρια του γονίδια που όγκου ras. ενέχονται το έχει οποίο το στη αθροιστικό κωδικοποιεί δημιουργία τους τον επαφών αποτέλεσμα παράγοντα μεταξύ κυττάρων των Smad4, γεγονότων μέλος του και Οι αυτών μονοπατιού ανάμεσα μεταλλαγές και στα όχι μεταγωγής κύτταρα η του σειρά χρωμοσώματος τους. σήματος που ξεκινά από και εξωκυτταρικό 17 επιφέρουν έλλειμμα τον υποδοχέα του παράγοντα TGF-β (TGF-β, υπόστρωμα του στο γονιδίου οποίο p53. αναπτύσσονται. Το έλλειμμα Ίσως του η γονιδίου Transforming Growth Factor β, απώλεια αυτού του γονιδίου αποτελεί αυτού ένα σχετικά να επιτρέπει όψιμο στα στάδιο κατά κύτταρα μετασχηματιστικός την ανάπτυξη του όγκου του να αυξητικός όγκου διαφεύγουν και παράγοντας συναντάται από τους β). στο 70% περιορισμούς των καρκινωμάτων που τα διατηρούν αλλά σπάνια στις σε πολύποδες. φυσιολογικές τους θέσεις και να εισβάλλουν στους γύρω ιστούς, γεγονός που αποτελεί θεμελιώδη ιδιότητα των ογκοκυττάρων.

76 Ο μεταβολισμός των καρκινικών κυττάρων διαφέρει σημαντικά από αυτόν των φυσιολογικών. Τα καρκινικά κύτταρα παράγουν περισσότερο γαλακτικό οξύ και χρησιμοποιούν λιγότερο οξυγόνο απ ό,τι τα φυσιολογικά. Η διαφορά αυτή οφείλεται στον αυξημένο ρυθμό γλυκόλυσης και στο μειωμένο ρυθμό αερόβιας αναπνοής των καρκινικών κυττάρων. Αυτή η μεταβολική αλλαγή, γνωστή ως φαινόμενο του Warburg (Warburg effect), συμβαίνει σχεδόν σε κάθε μορφή καρκίνου. Πρόσφατα οι επιστήμονες παρατήρησαν ότι απλώς και μόνο το έλλειμμα του γονιδίου p53 αρκεί για να προκληθεί το φαινόμενο αυτό σε κυτταρικές σειρές. Ο μειωμένος ρυθμός αναπνοής ήταν εμφανής ακόμη και στο επίπεδο ολόκληρου του οργανισμού. Σε δοκιμασία ποντικών στην κολύμβηση παρατηρήθηκε ότι άτομα με εκμηδενιστικές μεταλλαγές του p53 είχαν τη μισή αντοχή σε σύγκριση με άτομα άγριου τύπου.

77 Ωστόσο, για την αναπνοή απαιτείται σταθερή παροχή οξυγόνου. Με ποιον Οι όμως αναπτυσσόμενοι τρόπο η μείωση όγκοι της περιορίζονται αναπνοής αποτελεί από τη διαθεσιμότητα πλεονέκτημα για παροχής την ανάπτυξη αίματος. ενός όγκου; Ένα Εκ ενδεχόμενο πρώτης πλεονέκτημα όψεως θα μπορούσε που προσδίδει να πει κανείς στα καρκινικά ότι η μετάπτωση κύτταρα από το φαινόμενο την αναπνοή του στη Warburg γλυκόλυση είναι θα οι ήταν αυξημένες μειονέκτημα, πιθανότητες επειδή επιβίωσης κατά τη γλυκόλυση εξαιτίας παράγεται της παραγωγής πολύ λιγότερη ενέργειας ενέργεια από ανά τη γλυκολυτική μόριο σακχάρου οδό. απ Επιπλέον, ό,τι κατά ορισμένα την αναπνοή. στοιχεία δείχνουν ότι η καταστολή της αναπνοής είναι ικανή να εμποδίσει το πέρασμα των κυττάρων στο στάδιο της γήρανσης, προάγοντας έτσι τη μακροβιότητα των καρκινικών κυττάρων.

78 Για να εντοπίσουν ποιος από τους στόχους του παράγοντα p53 ευθυνόταν γι αυτή τη μεταβολή του μεταβολισμού, οι βιολόγοι εξέτασαν πιθανά γονίδια-στόχους του p53 που είχαν προβλεφθεί από μελέτες σειριακής ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης. Ένα από αυτά είναι το SCO2 (Synthesis of Cytochrome c Oxidase 2, σύνθεση της οξειδάσης 2 του κυτοχρώματος c). p53 Regulates Mitochondrial Respiration Matoba, et al. Science (2006)

79 Ο υποκινητής του SCO2 περιλαμβάνει μία περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης p53. Επίσης, η έκφραση του SCO2 είναι μειωμένη στα εκμηδενιστικά μεταλλάγματα του p53. Παλαιότερες μελέτες σε κύτταρα ζυμομύκητα είχαν δείξει ότι η πρωτεΐνη SCO2 είναι απαραίτητη για τη συναρμολόγηση της οξειδάσης του κυτοχρώματος, ενός μιτοχονδριακού πρωτεϊνικού συμπλόκου που είναι απαραίτητο για την αναπνοή. Θα ήταν αναμενόμενο τα επίπεδα μιας τέτοιας πρωτεΐνης να επηρεάζουν την αναπνευστική ικανότητα των κυττάρων. Πράγματι, η υπερέκφραση του SCO2 αυξάνει τον αναπνευστικό ρυθμό των κυττάρων. Η επαγωγή της έκφρασης του SCO2 προκαλεί αποκατάσταση των φυσιολογικών επιπέδων αναπνοής σε εκμηδενιστικά μεταλλάγματα του p53, καταδεικνύοντας ότι το φαινόμενο της αναπνευστικής καταστολής του Warburg μπορεί να οφείλεται στην απώλεια του ογκοκαταστολέα p53.

80 ΑΠΟΠΤΩΣΗ

81 ΕΙΚΟΝΑ 15.13: Η απώλεια του p53 καθιστά τα κύτταρα ανθεκτικά στην απόπτωση.

82

83 Η Bcl-2 oικογένεια πρωτεϊνών Ρυθμίζουν την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια. Σχηματίζουν ομοδιμερή και ετεροδιμερή. Bcl-2 Bax Bak Bad Bcl-2 homology regions 1-4 TM : transmembrane regions

84 Η πρωτεΐνη p53 επηρεάζει και ένα δεύτερο αποπτωτικό μονοπάτι, το εξωγενές μονοπάτι (extrinsic apoptotic pathway), το οποίο ξεκινά από πρωτεϊνικούς υποδοχείς θανάτου (death receptors) που βρίσκονται στην επιφάνεια του κυττάρου και ενεργοποιούνται από τη δέσμευση των αντίστοιχων προσδετών, όπως ο παράγοντας νέκρωσης α (TNFα, Tumour Necrosis Factor α). Οι πρωτεΐνες αυτές πυροδοτούν μια διαφορετική ομάδα εναρκτήριων κασπασών (initiator caspases), οι οποίες ωστόσο ενεργοποιούν τις ίδιες εκτελεστικές κασπάσες όπως και το ενδογένες μονοπάτι (intrinsic pathway) του κυτοχρώματος c.

85

86 Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

87 Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

88 Το εξωγενές αποπτωτικό μονοπάτι (extrinsic apoptotic pathway)

89 Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

90 Επιπλέον, η ενεργοποίηση του p53 μπλοκάρει τα σήματα επιβίωσης (survival signals) ενεργοποιώντας το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη 3, η οποία προσδένεται στον αυξητικό παράγοντα ινσουλίνης (IGFBP3, Ιnsulin Growth Factor Binding Protein 3). Η πρωτεΐνη IGFBP3 εκκρίνεται από τα κύτταρα με σκοπό τη δέσμευση και συνεπώς την εξουδετέρωση του αυξητικού παράγοντα ινσουλίνης 2 (IGF2, Insulin Growth Factor 2). Με τον τρόπο αυτό παρεμποδίζονται τα σήματα επιβίωσης που μεταδίδονται φυσιολογικά από τον IGF2 μέσω της κινάσης Akt και τα οποία καταστέλλουν την κασπάση 9 και άλλες προαποπτωτικές πρωτεΐνες. Η εξασθένηση της σηματοδότησης IGF2 αυξάνει την ευαισθησία του κυττάρου σε αποπτωτικά σήματα. Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

91 Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

92

93 Καθώς οι όγκοι αναπτύσσονται, η πρόσληψη του οξυγόνου και των θρεπτικών συστατικών που απαιτούνται για την επιβίωσή τους γίνεται ολοένα δυσκολότερη. Έτσι, οι περισσότεροι όγκοι ακολουθούν τακτικές αποφυγής της απόπτωσης. Περίπου οι μισοί όγκοι εμφανίζουν μεταλλαγές του p53, ενώ οι υπόλοιποι υπόκεινται σε άλλες αλλαγές, όπως είναι η υπερέκφραση αντιαποπτωτικών γονιδίων, π.χ. του bcl-2, η υπερενεργοποίηση του μονοπατιού επιβίωσης Akt ή η απενεργοποίηση προαποπτωτικών γονιδίων, π.χ. της κασπάσης 8. Η υπερέκφραση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών και η καταστολή των προαποπτωτικών πρωτεϊνών βοηθούν τους όγκους να αποφύγουν τις επιπτώσεις σημάτων στρες και θανάτου. Η απώλεια λειτουργίας του p53 σε έναν όγκο κάνει τα κύτταρα πολύ πιο ανθεκτικά στην απόπτωση. Η απώλεια του p53 είναι ένδειξη κακής πρόγνωσης της πορείας ενός καρκινοπαθούς, επειδή τα ογκοκύτταρα συνεχίζουν να αυξάνονται παρά τις σοβαρές βλάβες του DNA που επιφέρουν η ακτινοθεραπεία ή η χημειοθεραπεία.

94

95 ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ

96 Ένας από τους πιο σημαντικούς αγγειογενετικούς παράγοντες είναι ο αυξητικός παράγοντας των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor). Ο Harold Dvorak ταυτοποίησε τον VEFG ύστερα από το βιοχημικό καθαρισμό ενός παράγοντα που προκαλούσε αύξηση της διαπερατότητας των αιμοφόρων αγγείων. Σύντομα οι βιολόγοι παρατήρησαν ότι στους ποντικούς με ελαττωματική λειτουργία του VEGF δεν εκφύονταν αιμοφόρα αγγεία και κατανόησαν ότι ο παράγοντας αυτός ήταν απαραίτητος για τα πρώτα βήματα του σχηματισμού αιμοφόρων αγγείων.

97 Ο σημαντικός ρόλος του VEFG στα πρώιμα στάδια σχηματισμού αιμοφόρων αγγείων ώθησε τους επιστήμονες να υποθέσουν ότι η καταστολή της λειτουργίας του θα μπορούσε να εμποδίσει την ανάπτυξη αιμοφόρων αγγείων προς τους όγκους. Προκειμένου να καταστείλουν τον VEFG, οι ερευνητές απομόνωσαν ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα, το οποίο, μέσω της σύνδεσής του με τον VEGF, δίνει στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος το έναυσμα για να προσλάβουν και να καταστρέψουν το σύμπλοκο αντισώματος-vefg. Ένα τέτοιο ανθρωποποιημένο αντίσωμα (αντι-vegf), με την ονομασία Avastin (ή bevacizumab), έχει εγκριθεί από τον FDA για χορήγηση σε καρκινοπαθείς σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία. Η έγκριση δόθηκε ύστερα από μελέτη, κατά την οποία εφαρμόστηκε συνδυασμένη θεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και παρατηρήθηκε ότι αυτοί έζησαν κατά μέσο όρο 5 μήνες περισσότερο απ ό,τι οι ασθενείς που λάμβαναν απλώς την τυπική θεραπεία.

98 Οι γιατροί και ερευνητές, ενδιαφέρθηκαν κατά τις τελευταίες δεκαετίες να βρουν τρόπους για να καταστέλλουν τη νεοαγγειογένεση. Το φάρμακο Avastin δημιουργήθηκε ακριβώς για να καταστέλλει το φαινόμενο αυτό και ανήκει στην κατηγορία των φαρμάκων αντι-αγγειογένεσης. Καταστρέφοντας τα αιμοφόρα αγγεία του όγκου, το φάρμακο καταστέλλει τον όγκο. In 2008, sales of Avastin were nearly $2.7 billion (Genentech report)

99 ΠΙΝΑΚΑΣ 15.1: Ενδογενείς καταστολείς της αγγειογένεσης H αγγειοστατίνη (angiostatin), είναι τμήμα του πλασμινογόνου, μιας πρωτεΐνης που ενέχεται στη θρόμβωση του αίματος. Το πλασμινογόνο πλήρους μήκους δεν επηρεάζει την ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων, αποκτά ωστόσο ισχυρή κατασταλτική δράση, αφού κοπεί πρωτεολυτικά προς αγγειοστατίνη.

100 Γιατί τα άτομα με σύνδρομο Down εμφανίζουν τόσο μειωμένα ποσοστά καρκίνου σε σχέση με το γενικό πληθυσμό; Το γονίδιο που κωδικοποιεί το κολλαγόνο τύπου XVIII, την πηγή προέλευσης της ενδοστατίνης, εδράζεται στο χρωμόσωμα 21. Πράγματι, οι ασθενείς που πάσχουν από σύνδρομο Down έχουν υψηλότερα επίπεδα ενδοστατίνης στο αίμα τους απ ό,τι τα φυσιολογικά άτομα, προφανώς επειδή διαθέτουν τρία αντίγραφα του γονιδίου του κολλαγόνου XVIII.

101 Οι επιστήμονες δημιούργησαν διαγονιδιακούς ποντικούς που εξέφραζαν 50% περισσότερη ενδοστατίνη απ ό,τι οι φυσιολογικοί. ΕΙΚΟΝΑ 15.14: Μικρές αυξήσεις των επιπέδων του αντι-αγγειογενετικού παράγοντα αγγειοστατίνη επιβραδύνουν την ανάπτυξη των όγκων.

102 Οι όγκοι που ενέθηκαν σε αυτά τα άτομα παρουσίαζαν πολύ πιο αργή ανάπτυξη απ ό,τι οι όγκοι στα φυσιολογικά άτομα. Το εύρημα αυτό ήταν ιδιαίτερα εντυπωσιακό: μία τόσο ήπια αύξηση στα επίπεδα ενός καταστολέα της αγγειογένεσης είχε τόσο μεγάλη επίδραση στην ανάπτυξη των όγκων. Ήταν σαφές ότι οι αντιαγγειογενετικοί παράγοντες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως ισχυροί καταστολείς του καρκίνου στον άνθρωπο.

103 Αμέσως καλλιεργήθηκαν προσδοκίες ότι η ενδοστατίνη και η αγγειοστατίνη θα πρόσφεραν αποτελεσματικές θεραπείες κατά του καρκίνου. Μάλιστα, αφού πρόκειται για μόρια που συναντώνται φυσιολογικά στον οργανισμό, οι παρενέργειές τους θα ήταν ελάχιστες και η φαρμακοδυναμική τους (δηλαδή η παραμονή τους στο σώμα) θα ήταν καλή. Η θεραπευτική αγωγή με το συνδυασμό των δύο αυτών παραγόντων ήταν αποτελεσματική στις παραπάνω πειραματικές συνθήκες. Εντούτοις, σύμφωνα με τους κανονισμούς του FDA οι επιμέρους ουσίες μιας συνδυαστικής θεραπείας θα πρέπει να είναι αποτελεσματικές, σε κάποιο βαθμό, και καθεμία χωριστά, για να μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε κλινικές δοκιμές. Επιπλέον, η παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων πρωτεϊνών είναι πρακτικά δύσκολη και δαπανηρή διαδικασία. Η παραγωγή μικρών, συνθετικών μορίων είναι ευκολότερη. Ένα από αυτά έχει εγκριθεί από τον FDA για χορήγηση σε ασθενείς. Πρόκειται για το μόριο SU11248, το οποίο στοχεύει κινάσες τυροσίνης, όπως οι υποδοχείς των PDGF και VEFG, και χρησιμοποιείται για θεραπεία όγκων του στρώματος του γαστρεντερικού σωλήνα και του καρκινώματος νεφρικών κυττάρων.

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114 ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ

115 Οι ερευνητές δημιούργησαν διάφορες σειρές ιδιαίτερα μεταστατικών κυττάρων από μία κυτταρική σειρά μελανώματος με αρχικά χαμηλό μεταστατικό δυναμικό και χορήγησαν κύτταρα σε ποντικούς με ενδοφλέβια ένεση. Από τη σύγκριση των προτύπων της γονιδιακής έκφρασης των όγκων που προέκυψαν εντοπίστηκε ένα γονίδιο (το GPR56) το οποίο εκφραζόταν σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα σε όλους τους όγκους που προέρχονταν από κυτταρικές σειρές με υψηλό μεταστατικό δυναμικό. Η πρωτεΐνη GPR56 ανήκει σε μία υποοικογένεια υποδοχέων που είναι συζευγμένοι με πρωτεΐνες G (GPCR, G Protein-Coupled Receptors). Οι πρωτεΐνες αυτές ονομάζονται επτα-διαμεμβρανικοί υποδοχείς, επειδή διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη, παλινδρομικά, επτά φορές. Όταν στις εξωκυτταρικές επικράτειες των GΡCR δεσμεύονται προσδέτες, οι υποδοχείς μεταδίδουν σήματα στο εσωτερικό του κυττάρου μέσω της ενεργοποίησης μιας πρωτεΐνης G.

116 Σχηματική αναπαράσταση ενός οφιοειδούς υποδοχέα Σχηματική αναπαράσταση της πρωτεΐνης G

117 Για να επιβεβαιώσουν το ρόλο της πρωτεΐνης GPR56 στη μετάσταση, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν μια κυτταρική σειρά μελανώματος, στην οποία προκάλεσαν είτε την υπερέκφραση της GPR56, από ένα διαγονίδιο, είτε την αδρανοποίηση της έκφρασής της, με παρεμβολή RNA (RNAi). Παρόλο που οι μεταβολές του επιπέδου έκφρασης της GPR56 δεν επηρέασαν το ρυθμό ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων in vitro, προκλήθηκαν δραστικές αλλαγές στην ανάπτυξη του όγκου in vivo. Τα ογκοκύτταρα με περίσσεια GPR56 δημιουργούσαν πολύ λιγότερες μεταστάσεις, ενώ τα ογκοκύτταρα στα οποία το GPR56 είχε αποσιωπηθεί χρησιμοποιώντας βραχέα RNA με δομή φουρκέτας (shrna, short hairpin RNA) ανέπτυσσαν πολύ περισσότερες μεταστάσεις. Προφανώς η GPR56 είναι σημαντική για την ανάπτυξη των μεταστάσεων, αν και δεν επηρεάζει άμεσα τον πολλαπλασιασμό των ογκοκυττάρων.

118 Ποιος είναι λοιπόν ο ρόλος της GPR56 στη μετάσταση και ποιος ο προσδέτης της; Προκειμένου να μελετηθεί η κατανομή της πρωτεΐνης GPR56 σε ιστούς, δημιουργήθηκε μια υβριδική πρωτεΐνη που περιλάμβανε ένα τμήμα της εξωκυτταρικής επικράτειας της GPR56 ενωμένο με τη σταθερή περιοχή Fc ενός αντισώματος. Η υβριδική πρωτεΐνη Fc-GPR56 μπορούσε να ανιχνευτεί με ανοσοϊστοχημική ανάλυση τομών όγκων, χρησιμοποιώντας ένα αντι-fc αντίσωμα σημασμένο με κάποια φθορίζουσα χρωστική. Διαπιστώθηκε ότι η υβριδική πρωτεΐνη GPR56 εμφάνιζε διάχυτη κατανομή στον εξωκυτταρικό χώρο. Παρατηρήθηκε ότι το πρότυπο της κατανομής ταυτιζόταν με αυτό του εξωκυτταρικού στρώματος (ECM, extracellular matrix), δηλαδή του δικτύου υδατανθράκων και πρωτεϊνών που εκκρίνουν τα κύτταρα σχηματίζοντας το υπόστρωμα μέσα στο οποίο αναπτύσσονται. Η συγκεκριμένη παρατήρηση οδήγησε στην υπόθεση ότι ο προσδέτης της GPR56 θα μπορούσε να είναι μια πρωτεΐνη του ECM.

119 Για να απομονώσουν τον υποθετικό προσδέτη, οι επιστήμονες παρασκεύασαν κλάσματα του ECM από πνεύμονες ποντικών χρησιμοποιώντας απορρυπαντικά αυξανόμενης ισχύος. Οι πρωτεΐνες του εκχυλίσματος αυτού κλασματώθηκαν με βάση το μοριακό τους βάρος. Οι πρωτεΐνες του καθαρού κλάσματος που προσδένονταν στην GPR56 χαρακτηρίστηκαν με φασματομετρία μάζας και η κύρια πρωτεΐνη που ταυτοποιήθηκε ήταν η ιστική τρανσγλουταμινάση 2 (TG2, Tissue transglutaminase 2).

120 Η TG2 εκφράζεται ευρέως στο εξωκυτταρικό στρώμα και ενέχεται στη διαδικασία επούλωσης πληγών. Επιπλέον, σε επιθετικούς όγκους συχνά παρατηρείται απώλεια έκφρασης της TG2, ενώ είναι εντυπωσιακό το ότι η χορήγηση της πρωτεΐνης TG2 με ένεση σε όγκους ποντικών, στους οποίους είχε προηγουμένως επιτευχθεί στοχευμένη αδρανοποίηση της ενδογενούς TG2, επιβράδυνε την ανάπτυξη του όγκου. Επομένως, η TG2 λειτουργεί ως ογκοκαταστολέας και υπό φυσιολογικές συνθήκες επάγει το σηματοδοτικό μονοπάτι της GPR56 για να επιφέρει καταστολή της κυτταρικής αύξησης. Η μείωση των επιπέδων της GPR56 ή η απώλεια άλλων σηματοδοτικών μορίων του μονοπατιού ευνοεί τη μετάσταση. Η TG2 αλληλεπιδρά και με τον TGF-β, έναν άλλο ογκοκαταστολέα, αλλά και με άλλα μόρια του εξωκυτταρικού στρώματος, όπως η φιμπρονεκτίνη (fibronectin) και οι ιντεγκρίνες (integrins). Είναι προφανές ότι υπάρχει ένα πολύπλοκο δίκτυο αλληλεπιδράσεων και σηματοδότησης ανάμεσα στα ογκοκύτταρα και το περιβάλλον τους, γεγονός που προσφέρει νέες δυνατότητες για την καλύτερη κατανόηση μηχανισμών μέσω των οποίων θα μπορούσαμε να ελέγξουμε τη μετάσταση.

121 GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Xu L, Begum S, Hearn JD, Hynes RO. Proc Natl Acad Sci U S A Jun 13;103(24):

122 ΕΙΚΟΝΑ 15.15: Οι πολυμορφισμοί αριθμού αντιγράφων που φέρουν τα γονιδιώματα των όγκων μπορούν να ανιχνευτούν με ανάλυση εκπροσώπησης σε μικροσυστοιχία ολιγονουκλεοτιδίων (ROMA, Representational Oligonucleotide Microarray Analysis).

123 ΕΙΚΟΝΑ 15.15: Οι πολυμορφισμοί αριθμού αντιγράφων που φέρουν τα γονιδιώματα των όγκων μπορούν να ανιχνευτούν με ανάλυση εκπροσώπησης σε μικροσυστοιχία ολιγονουκλεοτιδίων (ROMA, Representational Oligonucleotide Microarray Analysis).

124 ΕΙΚΟΝΑ 15.15: Οι πολυμορφισμοί αριθμού αντιγράφων που φέρουν τα γονιδιώματα των όγκων μπορούν να ανιχνευτούν με ανάλυση εκπροσώπησης σε μικροσυστοιχία ολιγονουκλεοτιδίων (ROMA, Representational Oligonucleotide Microarray Analysis).

125 ΕΙΚΟΝΑ 15.16: Το πολυmirna συμπεριφέρεται ως ογκογονίδιο.

126 ΕΙΚΟΝΑ 15.17: Οι θερμικοί χάρτες (heat maps) είναι ένας χρήσιμος τρόπος απεικόνισης δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από πειράματα μικροσυστοιχιών.

127 Ποια είναι όμως η διαφορά ενός κυττάρου με απεριόριστη δυνατότητα πολλαπλασιασμού από ένα κύτταρο που υφίσταται τη διαδικασία της γήρανσης; Η απάντηση είναι το ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο τελομεράση (telomerase), που καταλύει την προσθήκη των τελομερικών επαναλήψεων στα άκρα των ευκαρυωτικών χρωμοσωμάτων. Είναι εντυπωσιακό ότι περισσότερο από το 90% των ανθρώπινων όγκων εμφανίζει υπερέκφραση της τελομεράσης. Κανένα άλλο χαρακτηριστικό δεν είναι κοινό σε τόσο μεγάλο ποσοστό όγκων.

128 Οι ερευνητές δοκίμασαν αρχικά να χρησιμοποιήσουν ένα μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, short interfering RNA) προκειμένου να απενεργοποιήσουν το ριβονουκλεοτιδικό τμήμα της ενδογενούς τελομεράσης, το hter. Όπως ήταν αναμενόμενο, η καταστολή της έκφρασης του hter προκάλεσε απώλεια των τελομερών και γήρανση των κυττάρων in vitro και in vivo. Επιπλέον, αντικατέστησαν το γονίδιο hter, ώστε να παράγεται RNA hter με τροποποιημένη αλληλουχία. Αυτό το RNA λειτουργούσε ως μεταλλαγμένη μήτρα hter (MT-hTer, Mutant Template-hTer), η οποία κατεύθυνε την προσθήκη μιας μη τελομερικής αλληλουχίας στα τελομερή. Η έκφραση του MT-hTer επίσης κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και μάλιστα πιο αποτελεσματικά απ ό,τι η πλήρης καταστολή του hter μέσω της επίδρασης sirna. Τέλος, ο συνδυασμός της επίδρασης sirna με την έκφραση του MT-hTer είχε συνεργιστικό αποτέλεσμα, αφού προκάλεσε γρηγορότερη και εντονότερη καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, καθώς και εμφάνιση εστιών βλάβης DNA.