ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ:

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ: «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ» Χρήση βιομάζας μικροφυκών για παραγωγή βιοαιθανόλης ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ της ΠΑΤΡΙΝΟΥ ΒΑΣΙΛΙΚΗΣ Επιβλέπoυσα Διδάσκουσα: Αθανασία Τεκερλεκοπούλου Επίκουρος Καθηγήτρια Αγρίνιο,

2 2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ: «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ» Χρήση βιομάζας μικροφυκών για παραγωγή βιοαιθανόλης ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ της ΠΑΤΡΙΝΟΥ ΒΑΣΙΛΙΚΗΣ Επιβλέπουσα Διδάσκουσα: Αθανασία Τεκερλεκοπούλου Επίκουρος Καθηγήτρια Εγκρίθηκε από την τριμελή εξεταστική επιτροπή την 9 η Οκτωβρίου (Υπογραφή) (Υπογραφή) (Υπογραφή) Τεκερλεκοπούλου Αθανασία Βαγενάς Δημήτριος Αγγελής Γεώργιος Επίκουρος Καθηγήτρια Καθηγητής Καθηγητής Αγρίνιο,

4 (Υπογραφή)... ΠΑΤΡΙΝΟΥ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Διπλωματούχος του Τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων 2017 All rights reserved 4

5 Στην Ειρήνη και στον Γιώργο.. 5

6 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Σε αυτό το σημείο θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους μου στάθηκαν και με καθοδήγησαν κατά την διάρκεια εκπόνησης αυτής της μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, στο Εργαστήριο Περιβαλλοντικών Συστημάτων σε συνεργασία με το Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών, το έτος Αρχικά, να ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου, κυρία Τεκερλεκοπούλου Αθανασία, Επίκουρος Καθηγήτρια του τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων του Πανεπιστημίου Πατρών για τις συμβουλές, την βοήθεια, την καθοδήγηση και την ευκαιρία που μου έδωσε να ερευνήσω ένα τόσο ενδιαφέρον θέμα. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Γεώργιο Αγγελή για την καθοδήγηση του καθώς και για την παραχώρηση του εργαστηρίου του για την διεξαγωγή των πειραμάτων. Ακόμη, να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Δημήτριο Βαγενά για τη συμμετοχή του στην τριμελή επιτροπή. Ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στην διδάκτορα Τσολχά Όλγα για την καθοριστική βοήθειά της σε όλους τους τομείς, την στήριξή της στην διεξαγωγή όλης της έρευνας, την βοήθεια και τον χρόνο που αφιέρωσε για να μου δώσει τις απαραίτητες επιστημονικές γνώσεις πάνω στο θέμα αυτό. Τελειώνοντας θα ήθελα ακόμα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα του τμήματος Βιολογίας, Μαριάννα Ντούρου για τη συνεργασία μας και την βοήθειά της. 6

7 Περίληψη Η εξάντληση των ορυκτών καυσίμων και το πρόβλημα της κλιματικής αλλαγής έχουν αυξήσει το ενδιαφέρον για την εύρεση ανανεώσιμων πηγών ενέργειας. Τα βιοκαύσιμα, όπως η βιοαιθανόλη, αποτελούν μια πολλά υποσχόμενη και βιώσιμη εναλλακτική μορφή ενέργειας. Σημαντική πρόκληση στην παραγωγή βιοαιθανόλης αποτελεί η εύρεση κατάλληλης πρώτης ύλης (βιομάζας), που θα είναι φιλική προς το περιβάλλον και οικονομικά αποδεκτή. Παράλληλα, η αύξηση του πληθυσμού, η ανάπτυξη της βιομηχανίας και κυρίως του αγροτοβιομηχανικού τομέα παραγωγής και μεταποίησης προϊόντων οδηγεί στην παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων αποβλήτων, αυξάνοντας το ενδιαφέρον αναζήτησης νέων τεχνολογιών (φυσικοχημικών και βιολογικών) για την ευνοϊκότερη προς το περιβάλλον διαχείρισή τους. Στις βιολογικές μεθόδους επεξεργασίας των αποβλήτων ανήκει και η χρήση μικροφυκών από την οποία παράγεται πολύτιμη βιομάζα. Μάλιστα, τα μικροφύκη σε συνδυασμό με την ανάπτυξή τους σε απόβλητα εξυπηρετούν διττό σκοπό καθώς οδηγούν όχι μόνο στην παραγωγή βιοενέργειας αλλά και στην απορρύπανση των υγρών αποβλήτων. Πολλά είδη μικροφυκών μπορούν να αναπτυχθούν σε πληθώρα υγρών αποβλήτων και έχουν την ικανότητα να χρησιμοποιούν τα θρεπτικά συστατικά αυτών για την ανάπτυξή τους, τα οποία και συσσωρεύουν στο εσωτερικό των κυττάρων τους ως λιπίδια, πρωτεΐνες και υδατάνθρακες. Από την βιομάζα που προκύπτει μπορεί να γίνει εκχύλιση του ενδοκυτταρικού υδατανθρακικού τους περιεχομένου από το οποίο εξάγονται σάκχαρα κατάλληλα για παραγωγή βιοαιθανόλης. Η χρήση βιομάζας μικροφυκών ως πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοαιθανόλης αποτελεί ελπιδοφόρα πρακτική λόγω των μεγάλων ποσοτήτων υδατανθράκων που είναι ενσωματωμένες σε ορισμένα είδη μικροφυκών. Ωστόσο, κρίνεται απαραίτητη η προεπεξεργασία της βιομάζας ώστε να απελευθερωθούν και να μετατραπούν οι σύνθετοι υδατάνθρακες σε απλά σάκχαρα πριν από την διαδικασία της αλκοολικής ζύμωσης. Η παραγωγή βιοαιθανόλης από βιομάζα μικροφυκών είναι σε ερευνητικό στάδιο, γι αυτό και η τεχνολογία αυτή δεν έχει περάσει ακόμη σε βιομηχανική κλίμακα. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της μέγιστης απόδοσης σε βιοαιθανόλη με τη χρήση διαφορετικών υποστρωμάτων βιομάζας μικροφυκών προερχόμενων τόσο από την επεξεργασία αποβλήτων τυροκομείου και οινοποιείου, καθώς και από βιομάζα αυτότροφης καλλιέργειας μικροφυκών χρησιμοποιώντας 7

8 τεχνητό χημικό υπόστρωμα ανάπτυξης. Η εργασία αυτή αποτελεί την συνέχεια προηγούμενης ερευνητικής μελέτης του Εργαστηρίου Περιβαλλοντικών Συστημάτων του τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων κατά την οποία πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση των παραμέτρων υδρόλυσης (χρόνος υδρόλυσης, συγκέντρωση H2SO4) και βρέθηκε ότι για χρόνο υδρόλυσης 120 και συγκέντρωση 2.5Ν H2SO4 εξάγεται μεγαλύτερο ποσοστό ζυμώσιμων σακχάρων. Για τα υποστρώματα βιομάζας από την καλλιέργεια μικροφυκών μελετήθηκαν τρεις χρόνοι υδρόλυσης (60, 120 και 180- λεπτά), ενώ για τα απόβλητα χρόνος υδρόλυσης 120. Η συγκέντρωση υδρολυτικού μέσου (2.5Ν H2SO4) ήταν σταθερή σε όλα τα υποστρώματα σύμφωνα με την αρχική μελέτη βελτιστοποίησης των παραμέτρων. Τα υδρολύματα που προέκυψαν υπεβλήθησαν σε αναερόβια αλκοολική ζύμωση με το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 προκειμένου να προσδιοριστεί η απόδοση σε βιοαιθανόλη. Κατά την διάρκεια των ζυμώσεων μελετήθηκε η επίδραση της προσθήκης θρεπτικών αλάτων και βρέθηκε ότι τα θρεπτικά άλατα ενισχύουν την ζυμωτική ικανότητα του μικροοργανισμού καθώς και η επίδραση της χρήσης σταφιδόζουμου και υδρολύματος σταφιδόζουμου για την ενίσχυση των αρχικών διαθέσιμων σακχάρων καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι το υδρόλυμα σταφιδόζουμου δρα ανασταλτικά στην ανάπτυξη των κυττάρων της ζύμης. Για τα υποστρώματα βιομάζας από αυτότροφη καλλιέργεια μικροφυκών που εξετάστηκαν, οι συνθήκες 2.5Ν H2SO4 και 120 χρόνου υδρόλυσης, με προσθήκη θρεπτικών αλάτων από την αρχή της ζύμωσης (t=0h), απέδωσαν την υψηλότερη τιμή μεταξύ αυτών με αρχική συγκέντρωση σακχάρων 73 gl -1 και ποσοστό επί της θεωρητικής απόδοσης της αιθανόλης με βάση το σύνολο των αρχικών διαθέσιμων σακχάρων 62%. Τα υδρολύματα βιομάζας από απόβλητο τυροκομείου και οινοποιείου, με συνθήκες υδρόλυσης (2.5Ν H2SO4, 120 ), για αρχικά σάκχαρα 87 gl -1 και 76 gl -1 παρουσίασαν ποσοστό επί της θεωρητικής απόδοσης της αιθανόλης 77.2 % και 55.2 % αντιστοίχως. Βιβλιογραφικά οι βιομάζες που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή βιοαιθανόλης είναι κυρίως λιγνοκυτταρινικής φύσεως με ποσοστά επί της θεωρητικής απόδοσης που κυμαίνονται μεταξύ του 70-85%. Οι αποδόσεις αυτές αναδεικνύουν την εν δυνάμει χρήση της μικροβιακής βιομάζας βασισμένη στα μικροφύκη ως πρώτη ύλη για παραγωγή βιοαιθανόλης και ιδιαίτερα αυτή από την επεξεργασία αποβλήτου τυροκομείου. 8

9 Abstract The depletion of fossil fuels and climate change increased the importance of searching for renewable energy sources. Biofuels, such as bioethanol, are a very promising and viable alternative energy source. An important goal in bioethanol production is to find suitable biomass, environmentally friendly and economically acceptable. At the same time, the growth of population, the growth of industry and mainly the growth of agroindustrial production and processing sector leaded to the production of large quantities of waste, increasing the search for new technologies (physicochemical and biological) for a more environmentally friendly management. The biological methods of waste treatment also include the use of microalgae from which valuable biomass is produced. However, microorganisms combined with waste development serve a twofold purpose as they lead not only to bioenergy production but also to the bioremediation of liquid waste. Many species of microalgae can grow in a variety of liquid waste and have the ability to use organic carbon, N and P for their growth, which accumulate inside their cells as lipids, proteins and carbohydrates. From the resulting biomass fatty acids can be extracted, which are then converted to biodiesel or their intracellular carbohydrate content from which sucrose is extracted to produce bioethanol. The usage of microalgae biomass as a raw material for the production of bioethanol is a promising practice due to the large amounts of carbohydrates incorporated into microalgal cell physiology. The cell wall polysaccharides of the microorganisms must be pretreated in order to release and convert these complex carbohydrates into simple sugars prior to the microbial fermentation process. Despite that this technology has not yet passed on an industrial scale. The aim of the present study was to investigate the maximum bioethanol yield using different microalgae biomass substrates derived from processing cheese whey and winery wastes as well as autotrophic microalgal cultivation using artificial chemical as a growth substrate. This work is a continuation of previous research that conducted to the Laboratory of Environmental Systems of the Department of Environmental Management and Natural Resources, during which optimization of hydrolytic parameters (hydrolysis time, H2SO4 concentration) was performed and it was found that for a hydrolytic period of 120 minutes and a concentration of 2.5N H2SO4 higher percentage of fermentable sugars is extracted. Three hydrolysis times 9

10 were investigated (60, 120 and 180 minutes) for the biomass substrates derived from microalgal culture, and 120 min hydrolysis time for the wastes. The concentration of hydrolytic medium (2.5N H2SO4) was the same for all substrates according to initial optimization study of parameters. The resulting hydrolysates were subjected to anaerobic alcoholic fermentation with Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 strain to determine bioethanol yield. During fermentations, the effect of nutrient addition was studied and nutrients found to enhance the fermenting capacity of the microorganism as well as the effect of using raisin broth and raisin broth hydrolyzate for enhancing the initial available sugars, suggesting that the raisin broth hydrolyzate is an inhibitor factor for the growth of yeast cells. For biomass substrates derived from autotrophic microalgal culture under 2.5N H2SO4 and 120 minute hydrolysis, with addition of nutrients from the beginning of fermentation (t = 0h) yielded the highest value among them with an initial sugar concentration of 73 gl -1 and theoretical bioethanol yield 62% of total sugars. Biomass hydrolysates from cheese whey and winery waste, under hydrolysis conditions of (2.5N H2SO4, 120 ), for initial sugars of 87gL -1 and 76 gl -1 showed theoretical bioethanol yield 77.2% and 55.2% based on the initial avaliable total sugars respectively. Literally, the biomass used for bioethanol production is mainly lignocellulosic with theoretical bioethanol yields ranging between 70-85% based on total sugars. These yields highlight the potential use of microalgal biomass as a feedstock for bioethanol production, particularly from processing cheese whey. 10

11 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Ευχαριστίες Περίληψη Abstract Πίνακας περιεχομένων Κατάλογος πινάκων Κατάλογος σχημάτων Κατάλογος εικόνων ΚΕΦΑΛΑΙΑ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΑ ΚΑΙ ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΕΙΔΗ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ Βιοαιθανόλη Πρώτες εφαρμογές βιοαιθανόλης Πλεονεκτήματα βιοαιθανόλης Μειονεκτήματα βιοαιθανόλης Παγκόσμια παραγωγή βιοαιθανόλης ΜΙΚΡΟΦΥΚΗ Γενικά για τα μικροφύκη Βιολογία των μικροφυκών Παράγοντες επίδρασης ανάπτυξης μικροφυκών Βιολογική επεξεργασία αποβλήτων με μικροφύκη Επεξεργασία αστικών αποβλήτων Επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Επεξεργασία βιομηχανικών αποβλήτων Πλεονεκτήματα χρήσης μικροφυκών για παραγωγή βιοαιθανόλης

12 3. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΒΙΟΜΑΖΑ Σύσταση λιγνοκυτταρινικής πρώτης ύλης Προεπεξεργασία βιομάζας Υδρόλυση βιομάζας Υδρόλυση με πυκνό οξύ Υδρόλυση με αραιό οξύ Ενζυμική Υδρόλυση Αλκοολική Ζύμωση Παράγοντες που επηρεάζουν την αναερόβια ζύμωση Μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή αιθανόλης ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΣΥΜΒΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5 Μέθοδοι και Υλικά Απομόνωση και ανάπτυξη καλλιέργειας Συλλογή και ξήρανση βιομάζας Υδρόλυση βιομάζας Προσδιορισμός αναγόντων σακχάρων Πειραματικές συνθήκες αλκοολικής ζύμωσης Βιολογικό υλικό Συνθήκες καλλιέργειας Μέτρηση ph Μικροσκοπική παρατήρηση Προσδιορισμός αιθανόλης Πειραματικά αποτελέσματα Παραγωγή αιθανόλης με υδρόλυμα σταφιδόζουμου Υδρόλυμα βιομάζας από καλλιέργεια μικροφυκών

13 6.1.2 Υδρόλυμα βιομάζας από επεξεργασία αποβλήτου οινοποιείου Παραγωγή αιθανόλης με προσθήκη θρεπτικών αλάτων και σταφιδόζουμου Υδρόλυμα βιομάζας από καλλιέργεια μικροφυκών με προσθήκη θρεπτικών αλάτων κατά την διάρκεια της ζύμωσης Υδρόλυμα βιομάζας από καλλιέργεια μικροφυκών με προσθήκη θρεπτικών αλάτων στην αρχή της ζύμωσης Υδρόλυμα βιομάζας από καλλιέργεια μικροφυκών κατά την διάρκεια της ζύμωσης Παραγωγή αιθανόλης χωρίς προσθήκη θρεπτικών αλάτων και με χρήση σταφιδόζουμου Υδρόλυμα βιομάζας από καλλιέργεια μικροφυκών Παραγωγή αιθανόλης με βιομάζα από επεξεργασία αποβλήτων Υδρόλυμα βιομάζας από επεξεργασία αποβλήτου οινοποιείου Υδρόλυμα βιομάζας από επεξεργασία αποβλήτου τυροκομείου ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συνοπτικά Συμπεράσματα Μελλοντική έρευνα ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

14 Κατάλογος πινάκων Πίνακας 1: Υδατανθρακικό περιεχόμενο ορισμένων μικροφυκών Πίνακας 2 : Απόδοση αιθανόλης από διαφορετικές πρώτες ύλες...36 Πίνακας 3: Σύνθεση χημικού υποστρώματος για την συντήρηση της καλλιέργειας..53 Πίνακας 4: Ποσοστό απόδοσης ζυμώσιμων σακχάρων για όλες τις συνθήκες Πίνακας 5: Σύγκριση απόδοσης αιθανόλης μετά την υδρόλυση και την ζύμωση της μικροαλγιακής βιομάζας

15 Κατάλογος σχημάτων Σχήμα 1: Συνολική παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη 38 Σχήμα 2: Δομή Λυγνοκυταριννούχας πρώτης ύλης Σχήμα 3 : To Embdem-Meyenhorf-Parnas μονοπάτι της γλυκόλυσης..47 Σχήμα 4 : Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης αναγόντων σακχάρων.57 Σχήμα 5: Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης αιθανόλης.61 Σχήμα 6: Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης από βιομάζα μικροφυκών με τεχνητό χημικό υπόστρωμα ανάπτυξης (120, 2.5N H 2SO 4, προσθήκη υδρολύματος σταφιδόζουμου)...66 Σχήμα 7: Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης από μικροβιακή βιομάζα ανάπτυξης σε απόβλητο οινοποιείου (120, 2.5N H 2SO 4, προσθήκη υδρολύματος σταφιδόζουμου).67 Σχήμα 8: Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης από βιομάζα μικροφυκών σε τεχνητό χημικό υπόστρωμα ανάπτυξης (120, 2.5N H 2SO 4 με προσθήκη θρεπτικών αλάτων κατά την ζύμωση και σταφιδόζουμο)..68 Σχήμα 9: Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης από βιομάζα μικροφυκών σε τεχνητό χημικό υπόστρωμα ανάπτυξης (120, 2.5N H 2SO 4, με προσθήκη θρεπτικών αλάτων στην αρχή της ζύμωσης και σταφιδόζουμο) 70 Σχήμα 10: Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης από βιομάζα μικροφυκών σε τεχνητό χημικό υπόστρωμα ανάπτυξης (180, 2.5N H 2SO 4, με προσθήκη θρεπτικών αλάτων κατά την ζύμωση και σταφιδόζουμο) Σχήμα 11: Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης από βιομάζα μικροφυκών σε τεχνητό χημικό υπόστρωμα ανάπτυξης (60, 2.5N H 2SO 4, προσθήκη σταφιδόζουμου) Σχήμα 12: Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης από μικροβιακή βιομάζα ανάπτυξης σε απόβλητο οινοποιείου (120, 2.5N H 2SO 4,με προσθήκη θρεπτικών αλάτων και σταφιδόζουμο)

16 Σχήμα 13: Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης από μικροβιακή βιομάζα ανάπτυξης σε απόβλητο τυροκομείου (120, 2.5N H 2SO 4, χωρίς προσθήκη θρεπτικών αλάτων και σταφιδόζουμο)

17 Κατάλογος εικόνων Εικόνα 1: Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) κυττάρων Saccharomyces cerevisiae...51 Εικόνα 2: Ενυδρείο μεικτής καλλιέργειας μικροφυκών..54 Εικόνα 3 : Χύτρα Υδρόλυσης.55 Εικόνα 4: Παρασκευή αναγόντων σακχάρων...57 Εικόνα 5 : Θάλαμος γραμμικής ροής (laminar row flow- pbi MINIFLO) 58 Εικόνα 6: Ανακινούμενος επωαστικός θάλαμος (ZHICHENG ZHWY 211C, Shanghai, China)...59 Εικόνα 7 : Πεχάμετρο (Hanna Instruments) 59 Εικόνα 8 : Oπτικό μικροσκόπιο Carl Zeiss (Gmbh, Göttingen, Germany)..60 Εικόνα 9: Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography-HPLC, Ultimate 3000, Dionex, Germany)

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΑ Ως βιοενέργεια ορίζεται η ενέργεια η οποία προκύπτει από οποιοδήποτε καύσιμο το οποίο προέρχεται από έμβιους οργανισμούς ή από τα μεταβολικά τους παράγωγα. Η βιοενέργεια προκύπτει από τη βιομάζα, η οποία ενέργεια είναι δεσμευμένη και αποθηκευμένη μορφή της ηλιακής ενέργειας σαν αποτέλεσμα της φωτοσύνθεσης των φυτών (K. J. Hintz et. al., 2003, Κατσαμάς, 2013). Βιομάζα μπορεί να αποτελεί το βιοαποικοδομήσιμο κλάσμα προϊόντων, βιομηχανικών αποβλήτων, αστικών λυμάτων και απορριμμάτων, καταλοίπων από γεωργικές και δασοκομικές δραστηριότητες συμπεριλαμβανομένων φυτικών και ζωικών ουσιών ή ακόμα και μια ομάδα μικροοργανισμών (μικροβιακή βιομάζα). Bιοκαύσιμα είναι υγρά, στερεά ή αέρια καύσιμα τα οποία παράγονται από βιομάζα. Βασική διαφορά τους με τα συμβατικά καύσιμα είναι ότι η παραγωγή και η χρήση τους είναι εξαιρετικά φιλική προς το περιβάλλον, είναι βιοαποικοδομήσιμα, μη τοξικά και έχουν χαμηλές εκπομπές ρύπων (Βασιληάς, 2012). Σύμφωνα με την οδηγία 2003/30/ΕΚ (Ευρωπαϊκή Επιτροπή, 2003) τα παραγόμενα βιοκαύσιμα είναι: Βιοαιθανόλη: αιθανόλη η οποία παράγεται από βιομάζα ή/και από το βιοαποικοδομήσιμο κλάσμα αποβλήτων. Βιομεθανόλη: μεθανόλη η οποία παράγεται από βιομάζα. Βιοντίζελ: μεθυλεστέρας ο οποίος παράγεται από φύκη, φυτικά ή ζωικά έλαια, ποιότητας ντίζελ. Βιοαέριο: καύσιμο αέριο το οποίο παράγεται από βιομάζα ή/και από το βιοαποικοδομήσιμο κλάσμα αποβλήτων, το οποίο μπορεί να καθαριστεί φτάνοντας την ποιότητα φυσικού αερίου, για χρήση ως βιοκαύσιμο ή ξυλαέριο. Βιοδιμεθυλαιθέρας: διμεθυλαιθέρας ο οποίος παράγεται από βιομάζα. Βιο ΕΤΒΕ : αιθυλοτριτοβουτυλαιθέρας ο οποίος παράγεται από βιοαιθανόλη. Βιο-ΜΤΒΕ: μεθυλοτριτοβουτυλαιθέρας, καύσιμο το οποίο παράγεται από βιομεθανόλη. 18

19 Συνθετικά βιοκαύσιμα: συνθετικοί υδρογονάνθρακες ή μείγματα συνθετικών υδρογονανθράκων που έχουν παραχθεί από βιομάζα. Βιοϋδρογόνο: υδρογόνο το οποίο παράγεται από βιομάζα ή/και από βιοαποικοδομήσιμο κλάσμα αποβλήτων. Καθαρά φυτικά έλαια: έλαια από ελαιούχα φυτά, παραγόμενα με συμπίεση, έκθλιψη ή ανάλογες μεθόδους, φυσικά ή εξευγενισμένα αλλά μη χημικώς τροποποιημένα. 1.1 Βιοαιθανόλη Η αιθανόλη (ethanol), ή αιθυλική αλκοόλη (ethyl alcohol) είναι μια απλή οργανική χημική ένωση, αποτελούμενη από δύο άτομα άνθρακα (C), πέντε άτομα υδρογόνου (H) και μια ομάδα υδροξυλίου (ομάδα -OH). Ο απλός μοριακός τύπος της ένωσης είναι: C2H6O. Ανήκει στην μεγάλη οικογένεια των υδροξυενώσεων και στην ομόλογη σειρά των κορεσμένων μονοσθενών αλκοολών (αλειφατικές ενώσεις). Η καθαρή αιθανόλη έχει πυκνότητα g/ ml, σημείο βρασμού 78.5 o C, σημείο τήξης στους -117 C και το Μοριακό Βάρος της είναι Δεν παρουσιάζει καμία επικινδυνότητα για την ανθρώπινη υγεία ενώ χαρακτηρίζεται ως ουσία υψηλής αναφλεξιμότητας με σημείο ανάφλεξης 13 ο C. Η βιοαιθανόλη είναι διαυγές και άχρωμο υγρό, με χαρακτηριστική οσμή, χαμηλής τοξικότητας και ευδιάλυτη στο νερό. Πρόκειται για αλκοόλη που παράγεται από τη ζύμωση σακχαρούχων, αμυλούχων ή κυτταρινούχων πρώτων υλών με τη βοήθεια μικροοργανισμών, όπως ζύμες, βακτήρια και νηματώδεις μύκητες (Ποϊκλή και Μαύρου, 2013). Ο όρος ζύμωση αναφέρεται σε μια αλληλουχία αντιδράσεων, που απελευθερώνουν ενέργεια από οργανικά μόρια, απουσία οξυγόνου. Πιο συγκεκριμένα στην αλκοολική ζύμωση, η ενέργεια παράγεται από την μετατροπή των σακχάρων σε αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα. Η πόσιμη αιθανόλη και ένα μεγάλο μέρος της βιομηχανικής παράγεται με την διαδικασία της αλκοολικής ζύμωσης (Παπανικολάου, 2006). Η βιοαιθανόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην παρασκευή αλκοολούχων ποτών, στη φαρμακευτική, στην ιατρική ως αντισηπτικό, σαν βιομηχανικός διαλύτης και σαν καύσιμο ή πρόσθετο καυσίμων (Ποϊκλή και Μαύρου, 2013). Επιπλέον, πλαστικά από πολυαιθυλένιο μπορούν να παραχθούν από την αιθανόλη μέσω του αιθυλενίου 19

20 (Taherzadeh and Karimi, 2007). Όσον αφορά την βιοαιθανόλη ως καύσιμο μπορεί να χρησιμοποιηθεί με τρείς τρόπους: 1) Ως μίγμα με την βενζίνη σε ποσοστά 5-85%. Τα μίγματα αυτά περιέχουν μικρές συγκεντρώσεις αιθανόλης και μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε όλα τα αυτοκίνητα, χωρίς καμία τροποποίηση στις μηχανές. Στα μίγματα η αιθανόλη δρα σαν ενισχυτής του αριθμού των οκτανίων και αντικαθιστά διάφορα άλλα πρόσθετα όπως τον μόλυβδο. Τα πια γνωστά μίγματα είναι το Ε85 (με 85% αιθανόλη και 15% βενζίνη), το Ε20 (με 20% αιθανόλη και 80% βενζίνη), το Ε10 (με 10% αιθανόλη και 90% βενζίνη) ενώ στην Βραζιλία χρησιμοποιείται ένα μείγμα που ονομάζεται βενζόλη (gasohol) και περιέχει 24% βιοαιθανόλη και 76% βενζίνη (Demirbas A., 2009). 2) Ως καθαρή μορφή αιθανόλης (περιεκτικότητα σε νερό λιγότερο από 1%), σε ειδικά σχεδιασμένες μηχανές. 3) Εμμέσως, με την τροποποίηση της σε τριτοταγή βουτυλαιθέρα (βιο ΕΤΒΕ), ο οποίος χρησιμοποιείται ως πρόσθετο στα συμβατικά καύσιμα (Παπανικολάου, 2006) Πρώτες εφαρμογές της βιοαιθανόλης Η βιοαιθανόλη είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο βιοκαύσιμο στον τομέα της μεταφοράς και έχει μακρά ιστορία ως ανανεώσιμο καύσιμο. Η χρήση της αιθανόλης είναι ήδη γνωστή από τις αρχές του Το 1826, ο Samuel Morey χρησιμοποίησε αλκοόλ στον πρώτο αμερικανικό κινητήρα εσωτερικής καύσης, ενώ τη δεκαετία του 1860 στις ΗΠΑ, χιλιάδες διυλιστήρια παράγουν τουλάχιστον 90 εκατομμύρια αμερικανικά γαλόνια ( m 3 ) αιθανόλης ετησίως, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν κυρίως για φωτισμό. Το 1860, ο γερμανός εφευρέτης Nikolaus Otto χρησιμοποίησε για πρώτη φορά αιθανόλη ως καύσιμο σε κινητήρα εσωτερικής καύσης. Τα πρώτα αυτοκίνητα που παράγονται από τις εταιρείες "Henry Ford" (μοντέλο Τ) ήταν σε θέση να λειτουργούν χρησιμοποιώντας αποκλειστικά αιθανόλη (Datta et al., 2011, Sarris and Papanikolaou, 2016). Η χρήση βιοαιθανόλης στη Βραζιλία ξεκίνησε από το 1925 ενώ στην Ευρώπη και τις ΗΠΑ, η βιοαιθανόλη χρησιμοποιείται ευρέως μέχρι τις αρχές του Το 1984, η Γερμανία και η Γαλλία άρχισαν να χρησιμοποιούν την βιοαιθανόλη ως καύσιμο σε κινητήρες εσωτερικής καύσης (Demirbas and Karsioglu, 20

21 2007). Μετά τον Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο, η χρήση της μειώθηκε μέχρι την πετρελαϊκή κρίση στη δεκαετία του 1970 λόγω του ακριβού κόστους παραγωγής σε σύγκριση με το πετρέλαιο. Το 1975 η κυβέρνηση της Βραζιλίας εισήγαγε το πρόγραμμα «Proalcool» που σκοπό είχε την αντικατάσταση της βενζίνης με αλκοόλη και έτσι η αιθανόλη επανήλθε και πάλι στο εμπορικό προσκήνιο (Παπανικολάου, 2006). Το ενδιαφέρον για τη χρήση της βιοαιθανόλης έχει αυξηθεί από τη δεκαετία του '80 ως εναλλακτικό καύσιμο σε πολλές χώρες. Η παγκόσμια παραγωγή αιθανόλης αυξήθηκε από δισεκατομμύρια γαλόνια το 2007 σε δισεκατομμύρια γαλόνια το 2015 με ελαφρά μείωση το 2012 και το 2013 ενώ οι Ηνωμένες Πολιτείες είναι ο μεγαλύτερος παραγωγός αιθανόλης με παραγωγή σχεδόν 15 δισεκατομμύρια γαλόνια το Η παραγωγή αιθανόλης από τις ΗΠΑ και την Βραζιλία συνεισφέρουν στην παγκόσμια παραγωγή αιθανόλης κατά 85% (Renewable Fuels Association, 2015) Πλεονεκτήματα βιοαιθανόλης Η βιοαιθανόλη ως καύσιμο έχει πολλά πλεονεκτήματα έναντι των συμβατικών καυσίμων, με κυριότερο ίσως αυτό της μείωσης της ατμοσφαιρικής ρύπανσης. Αναλυτικότερα αυτά είναι : 1. Η βιοαιθανόλη είναι εύκολα βιοδιασπώμενη είτε αερόβια, είτε αναερόβια στο νερό και στο χώμα, καθώς είναι μη τοξική και διαλυτή στο νερό. Στο έδαφος ή στα υπόγεια ύδατα, η ημιζωή της βιοαιθανόλης είναι μεταξύ λίγων ωρών έως λίγων ημερών και σε περίπτωση διαρροής δεν προκαλεί αρνητικές επιπτώσεις στο περιβάλλον (Ποϊκλή και Μαύρου, 2013). 2. Η αιθανόλη ως καύσιμο παρουσιάζει υψηλό αριθμό οκτανίων (Herve et al, 2011, Philbrook et al, 2013) ενώ ακόμη και μικρές ποσότητες αιθανόλης στην βενζίνη μπορούν να αυξήσουν σημαντικά τα οκτάνια του μείγματος (Datta et al, 2011, Sarris and Papanikolaou, 2016). Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα η μηχανή να αποδίδει καλύτερα, να πραγματοποιείται υψηλότερη συμπίεση και το σύστημα καύσης να είναι καθαρότερο (Κατσαμάς, 2013). 21

22 3. Έχει υψηλή περιεκτικότητα σε οξυγόνο βελτιώνοντας την απόδοση της καύσης με αποτέλεσμα να μειώνονται οι εκπομπές των αερίων του θερμοκηπίου όπως το μονοξείδιο του άνθρακα (CO) κατά 25-30%, το μονοξείδιο του αζώτου (NO) κατά 20%, ακόμη μειώνονται σημαντικά τα οξείδια του θείου (SOx),οι υδρογονάνθρακες και οι πτητικές οργανικές ενώσεις (VOCs) κατά 30%, παράγωγα που απελευθερώνονται από την καύση των συμβατικών καυσίμων (Niven, 2005, Sarris and Papanikolaou, 2016). 4. Σαν ενισχυτής των αριθμών οκτανίων, μπορεί να μειώσει κατά 50% ή και περισσότερο, τις εκπομπές του βενζενίου και του βουταδιενίου, τα οποία είναι καρκινογόνα (Κατσαμάς, 2013), μπορεί να αντικαταστήσει άλλα επιβλαβή πρόσθετα όπως ο μόλυβδος (Παπανικολάου, 2006), άλλους ενισχυτές οκτανίων όπως τους αρωματικούς υδρογονάνθρακες (βενζόλιο) ή και οξυγονοποιητές όπως τον μεθυλοτριτοβουτυλαιθέρα (ΜΤΒΕ) (Champagne, 2007). 5. Η βιοαιθανόλη αποτελεί ανανεώσιμη πηγή ενέργειας, αφού προέρχεται από βιομάζα (Κατσαμάς, 2013). 6. Η καύση της βιοαιθανόλης είναι δυνατόν να μειώσει σημαντικά τις εκπομπές CO2, αφού η παραγωγή της μέσω της ζύμωσης της βιομάζας, αποτελεί μέρος του κύκλου του άνθρακα (Wyman, 1994). 7. Τέλος μπορεί να οδηγήσει στην μείωση της εξάρτησης των κρατών από τα ορυκτά καύσιμα (Κατσαμάς, 2013) Μειονεκτήματα βιοαιθανόλης Eκτός όμως από τα πολλά πλεονεκτήματα που παρουσιάζει η βιοαιθανόλη υπάρχουν και κάποια μειονεκτήματα που σχετίζονται με την χρήση της: 1. Το ενεργειακό περιεχόμενο της αιθανόλης, ισοδυναμεί με τα 2/3 του αντίστοιχου της βενζίνης καθώς απαιτείται περισσότερη αιθανόλη για να καλυφθεί η ίδια απόσταση από ένα όχημα (Lynd and Wyman, 1999). 22

23 2. Η παρουσία νερού στο μείγμα βενζίνης βιοαιθανόλης μπορεί εύκολα να αποδεσμεύσει την βιοαιθανόλη από το μείγμα, να την κατακρατήσει και να την διαχωρίσει από το καύσιμο. Για το λόγο αυτό επιβάλλεται όλα τα συστήματα διακίνησης μειγμάτων βιοαιθανόλης να είναι «ξηρά», δηλαδή χωρίς την παρουσία υγρασίας (Ποϊκλή και Μαύρου, 2013). 3. Η βιοαιθανόλη είναι πάρα πολύ καλός διαλύτης, έχει την ικανότητα να διαλύει βαφές, σκουριές και κολλώδεις επικαθίσεις στα συστήματα αποθήκευσης και διακίνησης της, ενώ ακόμη παρουσιάζει ασυμβατότητα με κάποια μέταλλα και ελαστομερή όπως τον ψευδάργυρο, το αλουμίνιο, τον χαλκό και τον ορείχαλκο (Ποϊκλή και Μαύρου, 2013). 4. Το κόστος παραγωγής της αιθανόλης είναι ακόμα υψηλότερο από της βενζίνης (Κατσαμάς, 2013). 5. Διατυπώνεται η άποψη ότι είναι πιο σημαντικό να χρησιμοποιηθεί η βιομάζα ως τροφή για να αντιμετωπιστεί η παγκόσμια πείνα, παρά να χρησιμοποιηθεί ως πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοαιθανόλης πρώτης γενιάς (Παπανικολάου, 2006). Μια λύση που παρουσιάζει όλο και μεγαλύτερο ενδιαφέρον είναι αυτή της αξιοποίησης της βιομάζας μικροφυκών καθώς θα μπορούσε να αποτελέσει κατάλληλη και εξαιρετικά φιλική προς το περιβάλλον πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοαιθανόλης. Τα πλεονεκτήματα της χρήσης των μικροφυκών για την παραγωγή αιθανόλης θα αναλυθούν στο επόμενο κεφάλαιο Παγκόσμια παραγωγή βιοαιθανόλης Οι κύριες χώρες παραγωγής βιοαιθανόλης είναι η Βραζιλία και η ΗΠΑ, με τις Ηνωμένες Πολιτείες να αποτελούν την μεγαλύτερη χώρα παραγωγής παγκοσμίως. Σχετικά με τα εργοστάσια βιοαιθανόλης στις ΗΠΑ, το 2000 λειτουργούσαν 54 εργοστάσια, προστέθηκαν 130 ακόμη και κατασκευάστηκαν άλλα 84 με τα σημερινά δεδομένα (Ποϊκλή και Μαύρου, 2013). Στις ΗΠΑ η βιοαιθανόλη παράγεται από σιτηρά και δημητριακά, κυρίως από το υδρολυμένο άμυλο του καλαμποκιού. Το 17% της παραγωγής καλαμποκιού χρησιμοποιήθηκε στη βιομηχανία αιθανόλης για την παραγωγή 19 δισεκατομμυρίων λίτρων το 2010 (Klein, 2005), ενώ η παραγωγή 23

24 αιθανόλης στις ΗΠΑ έφτασε μόνο το 2012 τα 50 δισεκατομμύρια λίτρα (Balat et al, 2008, Kim and Dale, 2006, Sarris and Papanikolaou, 2016). Επί του παρόντος στις ΗΠΑ μόνο το 2% των οχημάτων χρησιμοποιούν αιθανόλη, συνεπώς στόχος είναι η αύξησή της κατά 30% έως το 2025 στα οχήματα μεταφοράς (Ragauskas et al., 2006, Kopsahelis et al, 2009). Η Βραζιλία είναι η δεύτερη μεγαλύτερη παραγωγός χώρα βιοαιθανόλης και η μεγαλύτερη χώρα εξαγωγών βιοαιθανόλης παγκοσμίως. Η βιοαιθανόλη στην Βραζιλία παράγεται από σακχαρώδη φυτά και κυρίως από το ζαχαροκάλαμο. Η βιοαιθανόλη από ζαχαροκάλαμο είναι το πρώτο ανανεώσιμο καύσιμο που ανταγωνίζεται οικονομικά τα ορυκτά καύσιμα που χρησιμοποιούνται στις μεταφορές, καθώς ένα στρέμμα ζαχαροκάλαμου παράγει λίτρα βιοαιθανόλης (Ποϊκλή και Μαύρου, 2013). Το 2006, στην Βραζιλία καταγράφονται περισσότερα από 300 εργοστάσια παραγωγής αιθανόλης που παράγουν 15 δισεκατομμύρια λίτρα ετησίως ενώ 3 εκατομμύρια αυτοκίνητα κινούνται με καθαρή αιθανόλη (Lin and Tanaka, 2006, Sarris and Papanikolaou, 2016). Από την άλλη πλευρά, η παραγωγή αιθανόλης στην Ευρώπη αντιπροσώπευε το 5% της παγκόσμιας παραγωγής το 2008, με τη Γερμανία και τη Γαλλία να είναι οι κύριοι παραγωγοί (Wang et al, 2012). Παρά το γεγονός ότι υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη χρήση εναλλακτικών πρώτων υλών (απόβλητα), στην Ευρώπη κύριες πρώτες ύλες για την παραγωγή αιθανόλης είναι τα σιτηρά και τα σακχαρώδη φυτά (Demirbas A., 2009). Πιστεύετε ότι ο γλυκός σόργος μπορεί να γίνει στο κοντινό μέλλον, το ζαχαροκάλαμο της Μεσογείου (Ποϊκλή και Μαύρου, 2013). Σε χώρες όπως η Κίνα και η Ινδία έχουν ξεκινήσει τεράστια προγράμματα ανάπτυξης της βιομηχανίας αιθανόλης με δυνατότητα παραγωγής που θα μπορούσε να φτάσει τα 3 και 2.7 δισεκατομμύρια λίτρα ετησίως αντίστοιχα. Η ρωσική κυβέρνηση το 2005 ανακοίνωσε πρόγραμμα ανάπτυξης της βιομηχανίας αιθανόλης, επιδοτώντας την κατασκευή 30 εργοστασίων συνολικής ετήσιας δυναμικότητας 2 εκατομμυρίων τόνων (Klein, 2005). Στην Κύπρο, Ελλάδα, Εσθονία, Λουξεμβούργο, Μάλτα, Πορτογαλία και Σλοβενία δεν έχουν γίνει ακόμη επενδύσεις στον τομέα της παραγωγής βιοαιθανόλης. Στην Ελλάδα, δεν λειτουργεί ούτε ένα εργοστάσιο παραγωγής βιοαιθανόλης. Μία αξιοσημείωτη προσπάθεια έγινε στο παρελθόν από την Ελληνική Βιομηχανία ζάχαρης, η οποία είχε ανακοινώσει το 2006 ότι θα μετέτρεπε δύο από τα εργοστάσια παραγωγής ζάχαρης σε μονάδες παραγωγής βιοαιθανόλης και ζωοτροφών. Ωστόσο η προσπάθεια αυτή δεν ολοκληρώθηκε 24

25 (Ιωαννίδης,2013). Σήμερα στην Ελλάδα εισάγεται κυρίως αιθανόλη για χρήση στα αλκοολούχα ποτά και στο οινόπνευμα ενώ το απόβλητο του εργοστασίου σταφίδας στο Αίγιο εξάγεται για την παραγωγή βιοαιθανόλης. 2. ΜΙΚΡΟΦΥΚΗ 2.1 Γενικά για τα μικροφύκη Τα μικροφύκη είναι οι ταχύτερα αναπτυσσόμενοι φωτοσυνθετικοί οργανισμοί και εκτός από την κατανάλωση CO2 και ενώσεων βασισμένων σε Ν όπως το αμμώνιο, είναι από τους σημαντικότερους παραγωγούς οξυγόνου στη γη. Η βιομάζα μικροφυκών περιέχει περίπου 50% άνθρακα κατά ξηρό βάρος (Schneider et al., 2013). Λαμβάνοντας υπόψη την ταχεία ανάπτυξη και την ικανότητα να μετατρέπουν την ηλιακή ενέργεια σε χημική μέσω του σχηματισμού ενώσεων άνθρακα από το ατμοσφαιρικό CO2, θεωρούνται μια ελπιδοφόρα πηγή σακχάρων για την παραγωγή βιοαιθανόλης. Πολλά είδη μικροφυκών, όπως το Anthrospira platensis, το Chlamydomonas reinhardtii, το Chlorella sp., το Scenedesmus dimorphus, το Tetraselmis subcordiformis (Silva and Bertuco, 2016) και το Dunaliella sp. (Schneider et al., 2013) έχουν την ικανότητα να συσσωρεύουν μεγάλες ποσότητες υδατανθράκων (Πίνακας 1). Τα μικροφύκη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρώτη ύλη για μια ευρεία ποικιλία πρακτικών και μεταβολικών προϊόντων, όπως συμπληρώματα διατροφής, φαρμακολογικές ουσίες, λιπίδια, ένζυμα, βιομάζα, πολυμερή, τοξίνες, και χρωστικές ουσίες (Chen et al, 2015). Όσον αφορά την παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη αυτή μπορεί να είναι εμπορικά βιώσιμη και οικονομικά ανταγωνιστική προς τα ορυκτά καύσιμα, καθώς δεν απαιτούνται επιπλέον εδάφη και συμβάλει στην βελτίωση της ποιότητας του αέρα απορροφώντας το CO2 της ατμόσφαιρας (Medipally et al, 2014). Ωστόσο, η καλλιέργεια τους είναι μια δαπανηρή διαδικασία εξαιτίας των μεγάλων ποσοτήτων νερού, των ανόργανων θρεπτικών συστατικών (κυρίως Ν και P), και του CO2 που απαιτούνται. Η παραγωγή βιοαιθανόλης από μικροφύκη μπορεί να είναι 25

26 περιβαλλοντικά βιώσιμη, οικονομικά αποδοτική, και κερδοφόρα αν συνδυαστεί με απόβλητα, στις οποίες το γλυκό νερό και τα ανόργανα θρεπτικά συστατικά θα αντικατασταθούν από τα αυτά. Παρά το γεγονός ότι το σύνολο της παραγωγής βιοκαυσίμων από μικροφύκη, συμπεριλαμβανομένης της επιλογής του είδους, της καλλιέργειας, της καταπολέμησης των παρασίτων, της συγκομιδής και της επεξεργασίας της βιομάζας, έχουν μελετηθεί κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, το κόστος παραγωγής είναι πολύ υψηλό για εκβιομηχάνιση. Πίνακας 1 : Υδατανθρακικό περιεχόμενο ορισμένων μικροφυκών (Silva & Bertuco, 2016). Υδατανθρακικό Στέλεχος Αναφορά περιεχόμενο % Anthrospira platensis 58 Markou et al, 2013 Chlamydomonas fasciata Ettl Asada et al, 2012 Chlamydomonas reinhardtii UTEX Choi et al, 2010 Chlorella sokoniana 40.3 Lorente et al,2015 Chlorella variabilis NC64A 37.8 Cheng et al, 2013 Chlorella vulgaris P12 41 Dragone et al, 2011 Chlorella vulgaris FSP-E 52 Ho et al, 2013 Chlorella vulgaris KMMCC 22.4 Kim et al, 2014 Chlorella sp. KR Lee et al, 2013 Chlorococcum humicola 32 Haryn et al, 2011 Chlorococcum infusionum 32 Haryn et al, 2011 Dunaliella tertiolecta LB Lee et al, 2013 Dunaliella tertiolecta LB Kim et al, 2015 Scenedesmus dimorphus Wang et al,

27 Scenedesmus obliquus 30 Miranda et al, 2012 Scenedesmus obliquus CNW-N 51.8 Ho et al, 2013 Scenedesmus bijugatus 26 Ashokkumar et al, 2015 Synechococcus elongatus PCC 28 Chow et al, 2015 Synechococcus sp. PCC 59 Mollers et al, 2014 Tetraselmis subcordiformis Yao et al, 2012 Tetraselmis subcordiformis 40 Yao et al, 2013 Tribonema sp Wang et al, Βιολογία μικροφυκών Τα φύκη προέρχονται από τη λατινική λέξη που σημαίνει «θαλάσσιο γρασίδι». και είναι αναγνωρισμένα ως μία από τις αρχαιότερες μορφές ζωής του πλανήτη ενώ η μελέτη τους ονομάζεται φυκολογία (Bεργίνη, 2014). Τα μικροφύκη είναι προκαρυωτικοί ή ευκαρυωτικοί φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί οι οποίοι αναπτύσσονται ταχύτατα και επιβιώνουν σε δυσμενείς συνθήκες, λόγω της δόμησής τους. Αποτελούν μια μεγάλη πολυφυλετική κατηγορία από μονοκύτταρους ή πολυκύτταρους οργανισμούς περιλαμβάνοντας κοκκοειδείς ή μαστιγωτές, μορφές αλλά και μεγάλους αποικιακούς σχηματισμούς με νήματα, μικροθαλλούς ή πιο περίπλοκες συσσωματώσεις (Κόλλιας, 2013). Τα Κυανοβακτήρια (προκαρυωτικά κύτταρα) δεν διαθέτουν μεμβρανώδη οργανίδια (πλαστίδια, μαστίγια, μιτοχόνδρια, πυρήνες, σύμπλεγμα Golgi) και μοιάζουν με τα βακτήρια, σε αντίθεση με τα ευκαρυωτικά κύτταρα που έχουν αυτά τα οργανίδια, επιτρέποντάς τους να επιβιώσουν και να αναπαραχθούν (Brennan and Owende, 2009). Τα φύκη περιλαμβάνουν δύο μεγάλες μορφολογικές κατηγορίες: τα μακροφύκη (macroalgae) και τα μικροφύκη (microalgae) που διαφέρουν μόνο στο μέγεθος καθώς τα μακροφύκη κυμαίνονται από μερικά εκατοστά έως m ενώ τα μικροφύκη κυμαίνονται από μm έως μm (Μάρκου και συνεργάτες, 2010). Οι βασικότερες διαιρέσεις (φύλα) των μικροφυκών περιλαμβάνουν: τα Χλωροφύκη 27

28 (Chlorophyta), τα Ετεροκοντόφυτα, (Heterokontophyta), τα Πρασινοφύκη (Prasinophytes), με υποδιαιρέσεις τα Χρυσοφύκη (Chrysophyceae), τα Διάτομα (Bacillariophyceae ή Diatomeae), τα Ευστιγματοφύκη (Eustigmatophyceae), τα Ραφιδοφύκη (Raphidophytes), τα Απτόφυτα (Haptophytes,), τα Κρυπτοφύκη (Cryptophyceae), τα Δινομαστιγωτά (Dinophyta) και τα Κυανοβακτήρια (Cyanobacteria) (Bεργίνη, 2014). Τα μικροφύκη απαντώνται σε όλα τα οικοσυστήματα του πλανήτη Γη και κυρίως στα υδάτινα οικοσυστήματα (γλυκό, υφάλμυρο, θαλασσινό νερό και επιφάνειες βράχων), και στα οικοσυστήματα του εδάφους (υγρασία εδάφους) όπου ζουν μεμονωμένα ή κατά ομάδες. Χαρακτηριστικό όλων των φυκών είναι η ύπαρξη ενώσεων στο κύτταρό τους με φωτοχημικές ιδιότητες (χρωστικές ουσίες) που απορροφούν μια περιοχή του φάσματος του ηλιακού φωτός. Το χρώμα των φυκών οφείλεται στα διάφορα είδη χρωστικών που περιέχουν όπως χλωροφύλλη, a, b και c καθώς και στις καροτινοειδείς χρωστικές (Bεργίνη, 2014). Ο μεταβολισμός τους μπορεί να είναι είτε αυτότροφος ή ετερότροφος δηλαδή να απαιτούνται μόνο ανόργανες ενώσεις όπως CO2, άλατα και μια πηγή φωτός για την αυτότροφη ανάπτυξη τους, ενώ τα ετερότροφα είναι μη φωτοσυνθετικά και ως εκ τούτου, απαιτούν μια εξωτερική πηγή οργανικών ενώσεων, καθώς και θρεπτικά συστατικά ως πηγή ενέργειας. Μερικά φύκη είναι μιξότροφα, δηλαδή έχουν την ικανότητα και να φωτοσυνθέτουν αλλά και να χρειάζονται ακόμη μια εξωτερική πηγή οργανικών θρεπτικών συστατικών (Brennan and Owende, 2009). Εκτιμάται ότι υπάρχουν περισσότερα από διαφορετικά είδη μικροφυκών στον πλανήτη, αλλά μόνο περίπου τα από αυτά έχουν μελετηθεί (Κόλλιας, 2013). 2.3 Παράγοντες επίδρασης ανάπτυξης μικροφυκών Οι καλλιέργειες των μικροφυκών είναι πολύπλοκα συστήματα και η ανάπτυξή τους επηρεάζεται από παράγοντες όπως: Ο Φωτισμός: Η διάρκεια, η ένταση και η ποιότητα του φωτισμού έχουν καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη των μικροφυκών. Τα μικροφύκη περιέχουν σε διαφορετικές αναλογίες τις χρωστικές ουσίες και γι αυτό αξιοποιούν διαφορετικά 28

29 μήκη κύματος (Μάρκου και συνεργάτες, 2010). O φωτισμός είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη των μικροφυκών και ιδιαίτερα στις ανοικτού τύπου καλλιέργειες καθώς εντάσεις φωτός μεγαλύτερες από εκείνες κατά τις οποίες ο ρυθμός της ανάπτυξης είναι μέγιστος οδηγούν σε φωτοαναστολή δηλαδή σε μείωση του ρυθμού ανάπτυξης της βιομάζας (Chisti, 2007). Η φωτοπερίοδος είναι μία ακόμη παράμετρος που επηρεάζει τόσο την ανάπτυξη των μικροφυκών και την απόδοση των φωτοβιοαντιδραστήρων αφού τα διαφορετικά είδη φυκών έχουν διαφορετικές απαιτήσεις φωτισμού (Mata et al, 2011). Η Θερμοκρασία : είναι σημαντικός παράγοντας για την ανάπτυξη των μικροφυκών και έχει συνεργιστική δράση με τον φωτισμό. Πολλά είδη μικροφύκη είναι ψυχρόφιλα και αντέχουν έως 15 C χαμηλότερα από την βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξής τους (20-25 C). Αν και τα περισσότερα μικροφύκη αναπτύσσονται μεταξύ C, υπάρχουν θερμόφιλα στελέχη που αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες έως C (Μάρκου και συνεργάτες, 2010). Η Θολερότητα: επηρεάζει τη διάχυση του φωτός στον φωτοβιοαντιδραστήρα. Απαιτείται ανάμειξη και ομογενοποίηση της καλλιέργειας για τη κατανομή των θρεπτικών συστατικών, τη μεταφορά CO2 και των κυττάρων από το σκοτάδι στη ζώνη του φωτός. Χαμηλή τιμή θολερότητας οδηγεί σε αποτελεσματική ανάμιξη και διαπερατότητα του φωτός στο σύνολο της καλλιέργειας, αντιθέτως υψηλή θολερότητα προκαλεί παρεμπόδιση της διαπερατότητας του φωτός και καταστροφή των κυττάρων λόγω υψηλής συγκέντρωσης της βιομάζας (Bεργίνη, 2014). Η Αλατότητα: Κάθε στέλεχος μικροφύκους παρουσιάζει διαφορετική προτίμηση σε αλατότητα. Για τα στελέχη που έχουν αντοχή στην αλατότητα, αυτή κυμαίνεται από g/l. Έχει βρεθεί ότι αυξημένη αλατότητα επιδρά αρνητικά στην ανάπτυξη της καλλιέργεια επηρεάζοντας την φωτοσύνθεση (Μάρκου και συνεργάτες, 2010). Το ph: Τα μικροφύκη παρουσιάζουν βέλτιστη ανάπτυξη για τιμές ph 7 έως 9. Κάποια στελέχη είναι οξύφιλα (Chlamydomonas acidophila) ενώ άλλα είναι αλκαλόφιλα (Arthrospira) (Μάρκου και συνεργάτες, 2010). 29

30 Το CO2: είναι η κύρια πηγή C, που μαζί με το N, το P και το K αποτελούν τα βασικά θρεπτικά συστατικά που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη των μικροφυκών οδηγώντας στην αύξηση της συγκέντρωσης της βιομάζας και στην συσσώρευση λιπιδίων στο εσωτερικό των κυττάρων τους (Bεργίνη, 2014). Τα Θρεπτικά συστατικά: Εκτός από φώς και C τα μικροφύκη χρειάζονται και ανόργανα συστατικά απαραίτητα για τις μεταβολικές και κυτταρικές τους διεργασίες όπως N, P, K. Σε μικρότερες ποσότητες χρειάζονται S, Si, Ca, Mg, Fe, Mo, Mn, Ni, Bo, Cl, Zn, Cu, Co (Christenson and Sims, 2011). Είναι γνωστό ότι σε περιπτώσεις θρεπτικής στέρησης τα μικροφύκη επιβραδύνουν την ανάπτυξη τους και χρησιμοποιούν τα διαθέσιμα θρεπτικά συστατικά για την παραγωγή και την συσσώρευση λιπιδίων ή υδατανθράκων αντί πρωτεϊνών. Συνήθως, μείωση της συγκέντρωσης Ν και P στο υπόστρωμα ανάπτυξης της καλλιέργειας οδηγεί στην σύνθεση μεγαλύτερων ποσοτήτων λιπιδίων και υδατανθράκων (Mata et al, 2011). 2.4 Βιολογική επεξεργασία αποβλήτων με μικροφύκη Η σύνθεση των αποβλήτων είναι αντανάκλαση του τρόπου ζωής και των τεχνολογιών που εφαρμόζονται σε μια κοινωνία. Αποτελούνται κατά κύριο λόγο από οργανικό άνθρακα με την μορφή υδατανθράκων, λίπους, πρωτεϊνών, αμινοξέων και πτητικών οξέων. Οι οργανικές και ανόργανες ουσίες που απελευθερώνονται στο περιβάλλον ως αποτέλεσμα των οικιακών, γεωργικών και βιομηχανικών δραστηριοτήτων οδηγούν σε ρύπανση. Η πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια διαδικασία επεξεργασίας των λυμάτων αυτών χρησιμοποιείται εκτενώς προκειμένου να εξαλειφθούν τα υλικά που καθιζάνουν εύκολα και ώστε να οξειδωθεί η οργανική ύλη. Το τελικό αποτέλεσμα είναι μια διαυγής, φαινομενικώς καθαρή εκροή που απορρίπτεται σε φυσικά υδάτινα σώματα. Τα ανόργανα συστατικά τους περιλαμβάνουν μεγάλες συγκεντρώσεις νατρίου, ασβεστίου, καλίου, μαγνησίου, χλωρίου, θείου, φωσφόρου, αμμωνίου, αλάτων και βαρέων μετάλλων. Αυτή η δευτερογενής εκροή μπορεί να αποτελείται από ανόργανο άζωτο και φωσφόρο προκαλώντας ευτροφισμό και μακροπρόθεσμα προβλήματα. Τα απόβλητα αυτά αποτελούν ένα ιδανικό μέσο ανάπτυξης για ένα ευρύ φάσμα μικροοργανισμών όπως βακτήρια, μύκητες, πρωτόζωα αλλά και μικροφύκη. 30

31 Η καλλιέργεια μικροφυκών μπορεί να παρέχει μια τριτοταγή βιοεπεξεργασία σε συνδυασμό με την παραγωγή δυνητικά πολύτιμης βιομάζας, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διάφορους σκοπούς. Τα μικροφύκη προσφέρουν μια κομψή λύση χάριν της ικανότητάς τους να χρησιμοποιούν το ανόργανο Ν και P για την ανάπτυξή τους, την απομάκρυνση των βαρέων μετάλλων, καθώς και ορισμένων τοξικών οργανικών ενώσεων χωρίς να οδηγούν σε δευτερογενή ρύπανση. Τα μικροφύκη μπορούν να επεξεργαστούν αστικά, οικιακά, ζωικά, αγροτοβιομηχανικά, βιομηχανικά, εκροές από εργοστάσια μεταποίησης τροφίμων και άλλα γεωργικά απόβλητα, απομακρύνοντας σε μεγάλο βαθμό το οργανικό φορτίο και τους παθογόνους μικροοργανισμούς (Abdel-Raouf et al, 2012). Στις ενότητες που ακολουθούν αναφέρεται αναλυτικότερα η εφαρμογή των μικροφυκών στην επεξεργασία των αποβλήτων αυτών Επεξεργασία αστικών αποβλήτων Η αυξανόμενη αστικοποίηση έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων αστικών λυμάτων. Σε σύγκριση με τα ζωικά απόβλητα, τα αστικά απόβλητα έχουν λιγότερο άζωτο και φώσφορο, ενώ τα ακατέργαστα αστικά λύματα περιέχουν σημαντικές ποσότητες βαρέων μετάλλων όπως μόλυβδος, ψευδάργυρος, χαλκός καθώς και πολλούς παθογόνους μικροοργανισμούς. Η επεξεργασία των αστικών λυμάτων περιλαμβάνει τρία στάδια: την πρωτοβάθμια, δευτεροβάθμια, και τριτοβάθμια επεξεργασία. Τα στερεά υλικά που βρίσκονται στην επιφάνεια ή καθιζάνουν απομακρύνονται στην πρωτοβάθμια επεξεργασία με φυσικές ή χημικές μεθόδους. Τα διαλυμένα οργανικά και κολλοειδή υλικά απομακρύνονται κατά τη διάρκεια της δευτεροβάθμιας επεξεργασίας με βιολογικές ή χημικές μεθόδους, ενώ η απομάκρυνση των διαλυμένων ανόργανων συστατικών, όπως N και o P, λαμβάνει χώρα στην τριτοβάθμια διαδικασία επεξεργασίας μέσα από μια σειρά λειτουργιών που περιλαμβάνουν: τεχνητές λίμνες, μετά-αερισμό, διήθηση, προσρόφηση άνθρακα και διαχωρισμό μεμβράνης. Διαδεδομένη επίσης είναι και η χρήση μικροφυκών για την τριτοβάθμια επεξεργασία των αστικών αποβλήτων (Cai et al, 2012). Ενδεικτικά, στην έρευνα των Wang et al, (2010) χρησιμοποιήθηκαν οικιακά απόβλητα για καλλιέργεια με το στέλεχος Chlorella sp. όπου παρατηρήθηκε 31

32 απομάκρυνση του N και του P σε ποσοστό 93% και 70%, αντίστοιχα (Olguín, 2012). Ακόμη στην έρευνα των Martinez et al., (2000) επιτεύχθηκε απομάκρυνση του P και του N από αστικά λύματα χρησιμοποιώντας το στέλεχος S. obliquus έπειτα από 94 ώρες χρόνου υδραυλικής παραμονής, σε ποσοστό 98% και 100%, αντίστοιχα (Brennan and Owende, 2009) Επεξεργασία αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Ο αγροτοβιομηχανικός τομέας παράγει σημαντικές ποσότητες αποβλήτων πλούσιων σε οργανικούς και ανόργανους ρύπους προκαλώντας μια σειρά περιβαλλοντικών προβλημάτων όπως ο ευτροφισμός, η επιφανειακή ρύπανση, η ρύπανση των υπόγειων νερών και η απελευθέρωση μεγάλων ποσοτήτων καυσαερίων. Η κύρια πηγή των οργανικών αποβλήτων είναι η κοπριά των ζώων, αλλά υπάρχουν επίσης σημαντικές ποσότητες που προέρχονται από τη βιομηχανία των τροφίμων, όπως τα γαλακτοκομικά απόβλητα, τα απόβλητα από την επεξεργασία της ελιάς και τα απόβλητα οινοποιείου. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι για την επεξεργασία αυτών των αποβλήτων αλλά αυτές που χρησιμοποιούνται κατά κύριο λόγο είναι η αερόβια και η αναερόβια χώνευση. Ωστόσο, αυτές οι τεχνικές επιτυγχάνουν μόνο δευτεροβάθμια επεξεργασία των αποβλήτων, πράγμα που σημαίνει ότι αφαιρούν τους οργανικούς ρύπους και ελάχιστα τους ανόργανους. Η αφαίρεση των ανόργανων ρύπων απαιτεί πολύ ακριβές φυσικοχημικές μεθόδους και ειδικά η αφαίρεση του φωσφόρου, ο οποίος είναι ο πιο δύσκολος ρύπος που μπορεί να αφαιρεθεί (Markou and Georgakis, 2010).Υψηλότερη συνολική απόδοση μπορεί να επιτευχθεί με την χρήση πολυκαλλιέργειας, δηλαδή τη χρήση ενός μίγματος διαφόρων ειδών μικροφυκών ή ακόμη και με το συνδυασμό μικροφυκών και βακτηρίων. Κάθε ένα από τα είδη των μικροφυκών στην πολυκαλλιέργεια απομακρύνει ένα συγκεκριμένο ποσοστό διαφορετικών ανόργανων συστατικών και ως εκ τούτου η συνολική απομάκρυνση μπορεί να είναι υψηλότερη (Markou and Georgakis, 2010). Απόβλητα χοιροστασίου Τα απόβλητα χοιροστασίου αποτελούνται από τα κόπρανα, τα ούρα και το νερό πλύσης, σχηματίζοντας ένα υλικό πολτού με υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών και 32

33 ανόργανων συστατικών. Σε έρευνα των De la Noüe και Basséres (1989) με το στέλεχος Phormidium bonheri επεξεργάσθηκε απόβλητο χοιροστασίου το οποίο είχε υποστεί αναερόβια χώνευση και μελετήθηκε σε διαφορετικά θερμοκρασιακά εύρη. Το COD παρουσίασε την μεγαλύτερη απομάκρυνση (80% ) στους 20 C o ενώ η NH3, το N και ο P απομακρύνθηκαν εντελώς μετά από 12 ημέρες. Σε άλλη έρευνα των Canizares and Domínguez (1998) απόβλητο χοίρων που είχε υποστεί αερισμό επεξεργάσθηκε με το στέλεχος Spirulina maxima. Η Spirulina δοκιμάσθηκε σε διαφορετικές αραιώσεις, και χωρίς αραίωση, με μέγιστη απομάκρυνση Ν (75%) και P (53%) με την αραίωση 50% (Markou and Georgakis, 2010). Απόβλητα βοοειδών Τα απόβλητα βοοειδών περιέχουν σημαντική ποσότητα αζώτου και υψηλή περιεκτικότητα σε οργανικούς ρύπους. Στην μελέτη των Lincoln et al (1996) το κυανοβακτήριο Spirulina καλλιεργήθηκε σε απόβλητο βοοειδών που αρχικά είχε υποστεί αναερόβια χώνευση. Επιτεύχθηκε απομάκρυνση αζώτου 24 mg / Ld και παραγωγικότητα βιομάζας 70 mg / Ld για τα εργαστηριακά πειράματα και 24 mg / L d για τις υπαίθριες καλλιέργειες (Markou and Georgakis, 2010). Πτηνοτροφικά απόβλητα Tα απόβλητα πτηνοτροφείου αποτελούνται κυρίως από κοπριά και λύματα από τα σφαγεία. Τα απόβλητα πουλερικών περιέχουν υψηλές ποσότητες αζώτου και υψηλές ποσότητες αμμωνίας και ως εκ τούτου θα πρέπει να αραιώνονται για να χρησιμοποιηθούν ως μέσο καλλιέργειας μικροφυκών. Παρόλα αυτά λίγα δεδομένα υπάρχουν σχετικά με τη χρήση αποβλήτων πτηνοτροφείου ως μέσο καλλιέργειας για επεξεργασία με μικροφύκη (Markou and Georgakis, 2010). Γαλακτοκομικά απόβλητα Η γαλακτοβιομηχανία παράγει υγρά απόβλητα υψηλής αντοχής που χαρακτηρίζονται από υψηλές συγκεντρώσεις BOD και COD. Τα γαλακτοκομικά απόβλητα περιέχουν αμμωνία, μέταλλα και φωσφόρο μαζί με υψηλά επίπεδα διαλυόμενων ή αιωρούμενων 33

34 στερεών, όπως λακτόζη, λίπη και πρωτεΐνες, που προέρχονται από το γάλα. Ακόμη το νερό που χρησιμοποιείται για τον καθαρισμό της εγκατάστασης παράγει επίσης μεγάλες ποσότητες υγρών αποβλήτων. Τα απόβλητα τα οποία περιέχουν τους περισσότερους οργανικούς ρύπους είναι του τυρογάλακτος τα οποία έχουν συνήθως g / L BOD και g / L COD και σημαντικά υψηλά επίπεδα αζώτου και φωσφόρου. Στην έρευνα των Blier et al (1995) χρησιμοποιήθηκε το μικροφύκος P. bohneri στην τριτοβάθμια επεξεργασία εκροών ορρού γάλακτος όπου παρατηρήθηκε έπειτα από τέσσερις ημέρες καλλιέργειας ολική απομάκρυνση της αμμωνίας και 69% απομάκρυνση φωσφόρου (Markou and Georgakis, 2010). Επίσης, στην έρευνα των Woertz et al, (2010) χρησιμοποιήθηκε πολυκαλλιέργεια με κυρίαρχο στέλεχος το Scenedesmus sp. για την επεξεργασία γαλακτοκομικών αποβλήτων. Έπειτα από 15 ημέρες η απομάκρυνση της αμμωνίας και των ορθοφωσφορικών ήταν 96% και 99% αντίστοιχα. Απόβλητa ζυθοποιίας - οινοποιείου Η ζυθοποιία παράγει μεγάλες ποσότητες αποβλήτων με υψηλό οργανικό φορτίο. Επί του παρόντος, υπάρχουν αρκετές τεχνολογίες για την επεξεργασία των αποβλήτων ζυθοποιίας, όπου το πιο σημαντικό κριτήριο για την επιλογή του συστήματος είναι ότι θα πρέπει να είναι αρκετά ευέλικτο ώστε να ξεπεραστούν οι συνεχείς διακυμάνσεις του οργανικού φορτίου και να διατηρηθεί η διαδικασία οικονομικά βιώσιμη (Mata et al, 2011). Επίσης, τα απόβλητα οινοποιείου περιέχουν επαρκής συγκεντρώσεις αζώτου και φωσφόρου για την καλλιέργεια των μικροφυκών, χαρακτηρίζονται από χαμηλό ph πιθανώς λόγω της παρουσίας οργανικών οξέων και περιέχουν ακόμη ίχνη μετάλλων όπως Κ, Na, Ca, και Mg. Τα απόβλητα οινοποιείου περιέχουν ακόμα και βιοαποδομήσιμους οργανικούς άνθρακες που είναι μη τοξικοί για τα μικροφύκη, για αυτό παραδοσιακά, αρχικά επεξεργάζονται με αναερόβια χώνευση ώστε να μειωθεί το υψηλό οργανικό φορτίο τους (Farooq et al, 2013). Όσον αφορά τη χρήση των μικροφυκών στην επεξεργασία αποβλήτων οινοποιείου λίγες μελέτες υπάρχουν. Ενδεικτικά, στην έρευνα των Raposo et al. (2010) μελετήθηκε η δυνατότητα μείωσης των συγκεντρώσεων αζώτου και φωσφόρου καθώς και COD και BOD, με τη χρήση του στελέχους Chlorella vulgaris ως μονοκαλλιέργεια καθώς επίσης, και με την χρήση ομάδας μικροφυκών και 34

35 κυανοβακτηρίων καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι η μίξη ήταν πιο αποτελεσματική στη μείωση αυτών των ρύπων. Σε μία έρευνα ακόμη των Mata et al, (2011) χρησιμοποιήθηκε το μικροφύκος Scenedesmus obliqus για την βιολογική επεξεργασία συνθετικού αποβλήτου οινοποιείου σε διαφορετικές λειτουργικές συνθήκες, όσον αφορά την απομάκρυνση των θρεπτικών συστατικών και βρέθηκε ότι η ανάπτυξη της βιομάζας ενισχύεται με την χρήση του αερισμού. Το COD απομακρύνθηκε σε ποσοστό 68% υπό την επίδραση διαρκoύς φωτισμού (24 h) και ένταση φωτός 4500 Lux ενώ το ολικό άζωτο απομακρύνθηκε σε ποσοστό 20% υπό 12/12h φωτισμό/σκοτάδι και ένταση φωτός Lux Bιομηχανικά απόβλητα Τα περισσότερα βιομηχανικά απόβλητα περιέχουν περισσότερα βαρέα μέταλλα και λιγότερο άζωτο ή φώσφορο από άλλα υγρά απόβλητα. Η επιλογή στελεχών μικροφυκών με υψηλή ικανότητα απορρόφησης μετάλλων είναι ζωτικής σημασίας για την επίτευξη υψηλής αποδοτικότητας στην αφαίρεση αυτών. Μέχρι στιγμής μόνο λίγα είδη φυκών έχουν μελετηθεί ως προς την ικανότητα απορρόφησης μετάλλων. Ωστόσο αρκετές έρευνες αξιολογούν την αφαίρεση αζώτου, φωσφόρου και βαρέων μετάλλων από βιομηχανικά απόβλητα, ως μέσο ανάπτυξης φυκών, όπως για παράδειγμα εκείνων που προέρχονται από τη βιομηχανία των χαλιών από τους Cai et al., Επίσης, στην έρευνα των Chinnasamy et al., 2010 χρησιμοποιήθηκε μιξότροφη καλλιέργεια για την επεξεργασία αποβλήτου ταπητοποιείας όπου επιτεύχθηκε 96% απομάκρυνση των θρεπτικών συστατικών, ενώ στην έρευνα των Wu et al, 2012 χρησιμοποιήθηκε ακατέργαστο απόβλητο από την βιομηχανία χαλιών και επιτεύχθηκε αφαίρεση 100% της αμμωνίας και των νιτρικών αλάτων και 33% του φωσφόρου. 2.5 Πλεονεκτήματα χρήσης μικροφυκών για παραγωγή βιοαιθανόλης Τα μικροφύκη θεωρούνται ως μια πολλά υποσχόμενη πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοαιθανόλης, δεδομένου ότι παρουσιάζουν ορισμένα πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τις συμβατικές καλλιέργειες για παραγωγή αιθανόλης: 35

36 1) Τα μικροφύκη έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται ταχύτατα με βιολογικό κύκλο 1-10 ημέρες (Chisti, 2007) παρουσιάζοντας μεγαλύτερη παραγωγικότητα βιομάζας ανά μονάδα επιφάνειας και χρόνου (Sanchez et al, 2016) ενώ η παραγωγή τους είναι εφικτή όλο το χρόνο (Brennan and Owende, 2009). 2) Αναπτύσσονται σε υδατικά μέσα, αλλά χρειάζονται λιγότερο νερό και μικρότερες επιφάνειες από ότι οι επίγειες καλλιέργειες. Ακόμη, μπορούν να καλλιεργηθούν σε θαλασσινό ή υφάλμυρο νερό, σε μολυσμένο νερό ποταμών ή και σε απόβλητα μειώνοντας έτσι τις απαιτήσεις σε γλυκό νερό (Brennan and Owende, 2009, Sanchez et al, 2016). 3) Μπορούν να καλλιεργηθούν σε μη καλλιεργήσιμες εκτάσεις (έρημος) με αποτέλεσμα την αποφυγή ανταγωνισμού με εκτάσεις όπου καλλιεργούνται τρόφιμα (Brennan and Owende, 2009, Sanchez et al, 2016). 4) Η καλλιέργεια μικροφυκών δεν απαιτεί ζιζανιοκτόνα ή άλλα φυτοφάρμακα (Brennan and Owende, 2009, Sanchez et al, 2016). 5) Συμβάλλουν στον μετριασμό των αερίων του θερμοκηπίου μέσω της άμεσης πρόσληψης διοξειδίου του άνθρακα από την ατμόσφαιρα ή των καυσαερίων από βιομηχανίες (1 κιλό ξηρής βιομάζας φυκών χρησιμοποιεί περίπου 1.83 κιλά CO2) (Brennan and Owende, 2009). 6) Τα μικροφύκη μπορούν να αποθηκεύσουν σημαντικές ποσότητες υδατανθράκων έως και 70% (Schneider et al, 2013) με τη μορφή αμύλου / κυτταρίνης και γλυκογόνου, τα οποία μπορούν να μετατραπούν σε ζυμώσιμα σάκχαρα για παραγωγή βιοαιθανόλης μέσω ζύμωσης (Wayman, 1996, Harun et al, 2011, Ho et al, 2012). 7) Τα μικροφύκη έχουν διαφορετική δομή κυτταρικού τοιχώματος από τα λιγνοκυτταρινικά φυτά. Η έλλειψη της λιγνίνης αποτελεί σημαντικό πλεονέκτημα καθώς απαιτείται λιγότερο έντονη προεπεξεργασία για την απελευθέρωση της βιοαποικοδομήσιμης οργανικής ύλης, σε αντίθεση με την λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα (Markou et al, 2013). 8) Εκτιμάται ότι περίπου έως L αιθανόλης /ha ετησίως μπορούν να παραχθούν από μικροφύκη (Mussatto et al., 2010, Miranda et al, 2012). Αυτή η 36

37 απόδοση είναι αρκετά μεγαλύτερη σε σχέση με τις αποδόσεις που επιτυγχάνονται από άλλες πρώτες ύλες (Πίνακας 2). Πίνακας 2: Απόδοση αιθανόλης από διαφορετικές πρώτες ύλες (Mussatto et al., 2010). Πρώτη ύλη Απόδοση αιθανόλης (L/ha) Καλαμποκάλευρο Σιτάρι Κασσάβα Γλυκός σόργος Καλαμπόκι Ζαχαρότευτλο Ζαχαροκάλαμο Γρασίδι Μικροφύκη ) Συνολικά η βιομάζα μικροφυκών εκτός από την παραγωγή βιοαιθανόλης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή και άλλων βιοκαυσίμων σύμφωνα με τους Schneider et al, 2013 και Hirano et al, 1998 (Σχήμα 1). Σχήμα 1: Συνολική παραγωγή βιοκαυσίμων από μικροφύκη (Schneider et al, 2013). 3. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΒΙΟΜΑΖΑ Επί του παρόντος, υπάρχουν τρεις γενιές βιοαιθανόλης με βάση τις διαφορετικές πρώτες ύλες. Η πρώτη γενιά βιοαιθανόλης προέρχεται από την ζύμωση της γλυκόζης 37

38 που περιέχεται στο άμυλο και στα σακχαρώδη φυτά (Ribeiro, 2013, Jambo et al, 2016). Ως πρώτες ύλες αυτής της γενιάς που χρησιμοποιούνται συχνά είναι το καλαμπόκι, το ζαχαροκάλαμο, η πατάτα, το σιτάρι και τα ζαχαρότευτλα (Havlik et al, 2011, Jambo et al, 2016). Το κύριο μειονέκτημα της παραγωγής βιοαιθανόλης πρώτης γενιάς είναι η απειλή του περιορισμού των τροφίμων που μπορεί να έχει άμεση επίδραση στον παγκόσμιο πληθυσμό καθώς αυτές οι ύλες προέρχονται από φυτά που χρησιμοποιούνται ως τρόφιμα (Arifin, 2014, Jambo et al, 2016). Σήμερα, εκατομμύρια άνθρωποι σε όλο τον κόσμο υποφέρουν από την πείνα και τον υποσιτισμό. Αυτό το πρόβλημα μπορεί να γίνει πιο έντονο καθώς η παραγωγή αιθανόλης πρώτης γενιάς μπορεί να οδηγήσει σε μείωση των διαθέσιμων καλλιεργήσιμων εκτάσεων και σε αύξηση των τιμών στα τρόφιμα (Goh and Lee, 2010, Gomez et al, 2010, Jambo et al, 2016). Η βιοαιθανόλη δεύτερης γενιάς παράγεται από λιγνοκυτταρινούχες ύλες, γεωργικά και δασικά υπολείμματα. Η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα και τα αμυλώδη απόβλητα, συμπεριλαμβανομένων των υπολειμματικών καλλιεργειών όπως χόρτα, πριονίδι, ξύλα, και ζωική κοπριά, αποτελούν εναλλακτικές και άφθονες πρώτες ύλες, οι οποίες μπορούν να υδρολυθούν σε ζυμώσιμα σάκχαρα για την επακόλουθη παραγωγή βιοαιθανόλης (John et al 2010). Υπάρχουν διάφορες έρευνες για την παραγωγή βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινούχα υπολείμματα καλλιεργειών (Kim and Dale, 2004), από αστικά στερεά απόβλητα (Mtui and Nakamura, 2005), από απόβλητα βιομηχανιών δασικών προϊόντων (Kadar et al., 2004, Fan Et al., 2003), απόβλητα φύλλων και κήπων (Lissens et al., 2004), καθώς και από κοπριά βοοειδών (Wen et al, 2004, Chen et al, 2003, 2004). Παρόλα αυτά, αυτές οι πρώτες ύλες παρουσιάζουν μειονεκτήματα που συνδέονται με τη χαμηλή απόδοση σε αιθανόλη και το υψηλό κόστος της υδρόλυσης. Οι υδατάνθρακες πρέπει να υδρολυθούν σε μονομερή και διμερή σάκχαρα πριν μεταβολιστούν. Επομένως, αν και τα αμυλούχα ή κυτταρινικά υλικά είναι φθηνότερα από τις σακχαρώδεις πρώτες ύλες, η απαίτηση της μετατροπής τους σε ζυμώσιμα σάκχαρα είναι ένα μειονέκτημα αυτών των υποστρωμάτων. Η λιγνίνη, είναι συστατικό των λιγνοκυτταρινούχων υλών, που δεν μπορεί να ζυμωθεί και απαιτεί ισχυρή υδρόλυση για την απελευθέρωση της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης (Harun et al., 2010). 38

39 Η βιοαιθανόλη τρίτης γενιάς παρέχει περισσότερα πλεονεκτήματα σε σύγκριση με την πρώτη και τη δεύτερη γενιά και εστιάζεται στη χρήση θαλάσσιων οργανισμών όπως τα μικροφύκη. Η βιομάζα τους μπορεί να περιορίσει τον ανταγωνισμό με τις ενεργειακές καλλιέργειες (Carriquiry and Timilsina, 2011, Jambo et al, 2016) καθώς αποτελούν μια ελπιδοφόρα εναλλακτική πρώτη ύλη λόγω του υψηλού λιπιδιακού και υδατανθρακικού τους περιεχομένου, της εύκολης καλλιέργειας σε διαφορετικά υδατικά περιβάλλοντα, της μικρής απαίτησης σε καλλιεργήσιμη γη καθώς και της υψηλής απορρόφησης CO2 (Singh and Olsen, 2011, Jambo et al, 2016). Η χαμηλή περιεκτικότητα των μικροφυκών σε λιγνίνη και ημικυτταρίνη, είναι σημαντικό πλεονέκτημα στην παραγωγή βιοαιθανόλης. Παρότι η έρευνα της παραγωγής βιοαιθανόλης με μικροφύκη βρίσκεται σε πρώιμο στάδιο, αυτή η πρακτική είναι πολλά υποσχόμενη για το μέλλον (Jambo et al, 2016). 3.1 Βιομάζα ως πρώτη ύλη Εκτός από τις σακχαρούχες και αμυλούχες πρώτες ύλες για την παραγωγή αιθανόλης, χρησιμοποιείται εκτεταμένα και η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα η οποία αποτελεί άφθονη πηγή και φθηνή πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Λιγνοκυτταρινούχα υλικά, ονομάζονται τα οργανικά υλικά φυτικής προέλευσης με κύρια συστατικά την ξυλόζη, την γλυκόζη και την αραβινόζη (Κούκιος, 1977). Η φυσικοχημική σύσταση της λιγνοκυτταρινικής πρώτης ύλης (ΛΠΥ) επιδρά σημαντικά στην παραγωγή αιθανόλης. Οι βασικές ομάδες από τις οποίες αποτελείται είναι οι εξής: 1) Κυτταρίνη : πολυσακχαρίτης που συνίσταται από γλυκόζη. Ανάλογα με το είδος της βιομάζας αποτελεί το 40-60% του ξηρού βάρους της ενώ η κρυσταλλική της δομή καθιστά δύσκολη την υδρόλυσή της. 2) Ημικυτταρίνη : πολυσακχαρίτης που συνίσταται από μια ποικιλία σακχάρων με πέντε (πεντόζες) και έξι (εξόζες) άτομα άνθρακα. Αποτελεί το 20-40% του ξηρού βάρους της βιομάζας και η υδρόλυση της σε απλά σάκχαρα είναι σχετικά εύκολη, όμως οι πεντόζες είναι δύσκολο να ζυμωθούν. 3) Λιγνίνη : σύνθετο πολυμερές η οποία σταθεροποιεί το σύμπλοκο κυτταρίνηςημικυτταρίνης (Σχήμα 2) του οποίου η διάσπαση είναι καθοριστικής σημασίας, έτσι 39

40 ώστε να επιτευχθεί αποδοτική υδρόλυση της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης προς διαλυτά ζυμώσιμα σάκχαρα (Κουτρούλη, 2008). Αποτελεί το 10-24% του ξηρού βάρους της βιομάζας. Μετά την μετατροπή των σακχάρων της βιομάζας σε αιθανόλη, η λιγνίνη παραμένει ως υπόλειμμα. Περιέχει μεγάλα ποσά ενέργειας και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή ηλεκτρισμού (Παπανικολάου, 2006). 4) Εκχυλίσιμα : ομάδα ουσιών που παραλαμβάνεται με εκχύλιση σε διάφορους διαλύτες. Ο διαλύτης μπορεί να είναι νερό, αιθέρας, αλκοόλη ή μείγμα βενζόλιου αλκοόλης. Τα εκχυλίσιμα κατηγοριοποιούνται σε 3 ομάδες τα τερπένια, τις ρητίνες και τις φαινόλες. Στα εκχυλίσιμα συγκαταλέγονται επίσης μικρές ποσότητες ουσιών που δεν ανήκουν στο κυτταρικό τοίχωμα, όπως πρωτεΐνες, αιθέρια έλαια και χρωστικές ουσίες. 5) Τέφρα : ανόργανα συστατικά που χρειάζονται για την ανάπτυξη της φυτικής ύλης και προσδιορίζεται με καύση και πύρωση αυτής στους 600 ο C. Tα κυρίαρχα συστατικά της είναι ανθρακικά άλατα αλκαλίων και αλκαλικών γαιών, όπως και διάφορα άλλα άλατα. Η περιεκτικότητα του ξύλου σε τέφρα είναι συνήθως μικρότερη του 1% κατά βάρος (Τσούτσος, 1990). Σχήμα 2 : Δομή λιγνοκυτταρινικής πρώτης ύλης (Κουτρούλη, 2008). 40

41 3.2 Προεπεξεργασία βιομάζας Η προεπεξεργασία της βιομάζας είναι σημαντική καθώς διαλύει την κρυσταλλική δομή της κυτταρίνης και απελευθερώνει τα ζυμώσιμα σάκχαρα έτσι ώστε να επιτευχθεί η υδρόλυση πιο γρήγορα και με μεγαλύτερες αποδόσεις αιθανόλης (Mosier et al., 2005, Harun et al, 2011). Μια κατάλληλη προεπεξεργασία μπορεί να παρεμποδίσει το σχηματισμό ανασταλτικών παραπροϊόντων στην επακόλουθη υδρόλυση και ζύμωση (Sun and Cheng, 2002, Harun et al, 2011). Όσον αφορά την παραγωγή βιοαιθανόλης από μικροφύκη, η προεπεξεργασία της βιομάζας απαιτείται για την λύση των κυττάρων και την απελευθέρωση των υδατανθράκων. Οι περισσότεροι από τους υδατάνθρακες που βρίσκονται στα κύτταρα των μικροφυκών είναι παρόντες με την μορφή πολυσακχαριτών (κυρίως αμύλου, γλυκογόνου και κυτταρίνης) ως δομικά ή αποθηκευμένα συστατικά τα οποία πρέπει να μετατραπούν μέσω της υδρόλυσης σε απλά σάκχαρα όπως γλυκόζη, φρουκτόζη, γαλακτόζη. Είναι γνωστό ότι οι αιθανολογόνοι μικροοργανισμοί μπορούν να ζυμώσουν και να μετατρέψουν σε βιοαιθανόλη μόνο τα μονομερή και διμερή σάκχαρα (Khan et al, 2017, Markou et al, 2013) γεγονός που δεικνύει την ανάγκη για προεπεξεργασία και υδρόλυση της βιομάζας. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται σήμερα για την προεπεξεργασία της βιομάζας είναι φυσικές, χημικές, βιολογικές και φυσικοχημικές (Azhar et al, 2017, Srichuwong et al, 2009). α) Φυσικές μέθοδοι Οι φυσικές μέθοδοι επεξεργασίας έχουν στόχο την μείωση των διαστάσεων της πρώτης ύλης ώστε να αυξηθεί η ενεργή επιφάνεια για την δράση των υδρολυτικών ενζύμων (Talebnia et al, 2011, Kumar et al, 2009, Μάρκου, 2013). Οι μέθοδοι αυτοί περιλαμβάνουν μηχανικά μέσα όπως θραύση και άλεση ενώ με την διαδικασία της πυρόλυσης η βιομάζα εκτίθεται σε υψηλές θερμοκρασίες (Millet et al, 1976, Cadoche and Lopez 1989, Shafizadeh and Lai, 1975, Harun and Danquah, 2011). β) Χημικές μέθοδοι Στις χημικές μεθόδους συμπεριλαμβάνονται η οζονόλυση, η όξινη υδρόλυση, η αλκαλική υδρόλυση, η οξειδωτική απολιγνοποίηση και η χρήση οργανικών διαλυτών. Αυτές οι μέθοδοι είναι εύκολες στη λειτουργία και επιφέρουν καλές αποδόσεις σε 41

42 σύντομο χρονικό διάστημα (Sarkar et al, 2012, Sarris and Papanikolaou, 2016). Η οζονόλυση εστιάζεται κυρίως στην αποικοδόμηση της λιγνίνης και της ημικυτταρίνης ενώ επηρεάζει ελάχιστα την κυτταρίνη χωρίς να παράγει τοξικούς αναστολείς για την υπόλοιπη διαδικασία. Στην όξινη υδρόλυση, χρησιμοποιούνται πυκνά ή πιο αραιά οξέα όπως το H2SO4 και το HCl (Prasad et al, 2007; Sarris and Papanikolaou, 2016). Στην αλκαλική προεπεξεργασία προστίθενται αραιές βάσεις (όπως Ca(OH)2 ή NaOH) στη βιομάζα, οι οποίες αυξάνουν την εσωτερική επιφάνεια του υλικού (Sánchez and Cardona, 2008; Tomás- Pejó et al., 2008; Balat et al., 2008; Hayes, 2009). Η χημική μέθοδος προεπεξεργασίας έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή αρκετών ανασταλτικών παραγόντων για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών όπως το οξικό οξύ, οι φουρφουράλες και η 5-υδροξυμεθυλοφουρφουράλη (Sarkar et al, 2012, Sarris and Papanikolaou, 2016). γ) Φυσικοχημικές μέθοδοι Στις φυσικοχημικές μεθόδους που αποτελούν συνδυασμό φυσικών και χημικών μεθόδων προεπεξεργασίας συμπεριλαμβάνονται η εκτόνωση υδρατμών (steam explosion) που αποτελεί την πλέον χρησιμοποιούμενη μέθοδο, η υδροθερμόλυση ή αυτοϋδρόλυση (liquid hot water), η εκτόνωση αερίων όπως η αμμωνία (Ammonia Fiber Explosion, AFX) και το διοξείδιο του άνθρακα, η χρήση μικροκυμάτων και η χρήση υπερήχων (Alvira et al., 2010; Gable and Zacchi, 2007; Hendriks and Zeeman, 2009; Kristensen et al., 2008; Mosier et al,. 2005). δ) Βιολογικές μέθοδοι Στις βιολογικές προκατεργασίες περιλαμβάνεται η χρήση μικροβίων και ενζύμων για την αποικοδόμηση της λιγνίνης. Αυτή η επεξεργασία είναι φιλική προς το περιβάλλον καθώς δεν απαιτούνται υψηλές θερμοκρασίες και χρήση χημικών με αποτέλεσμα να μην παράγονται χημικοί ανασταλτικοί παράγοντες βελτιώνοντας την διαδικασία της ζύμωσης. Μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι ο αργός ρυθμός της υδρόλυσης καθώς επίσης και το γεγονός ότι ένα μέρος της πρώτης ύλης καταναλώνεται από τους μικροοργανισμούς (Harun and Danquah, 2011). 42

43 3.2.1 Υδρόλυση βιομάζας Η υδρόλυση περιλαμβάνει τη διάσπαση των πολυμερών της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης στα μονομερή τους. Η πλήρης υδρόλυση της κυτταρίνης έχει σαν αποτέλεσμα το μονομερές της γλυκόζης, ενώ της ημικυτταρίνης αρκετές πεντόζες και εξόζες (Karimi et al.,2006, Taherzadeh et al.,1997, Taherzadeh and Karimi, 2007 ). Η υδρόλυση μπορεί να διεξαχθεί χημικά ή ενζυματικά. Η χημική υδρόλυση περιλαμβάνει την έκθεση της βιομάζας σε μια χημική ουσία για κάποιο χρονικό διάστημα, σε συγκεκριμένη θερμοκρασία, και παράγει μονομερή σάκχαρα από τα πολυμερή της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης. Η αποτελεσματική υδρόλυση εξαρτάται από το είδος της βιομάζας και είναι συνδυασμός τριών παραμέτρων, αυτών της συγκέντρωσης του οξέος, του χρόνου της υδρόλυσης και της θερμοκρασίας (Taherzadeh and Karimi, 2007). Τα οξέα που χρησιμοποιούνται κυρίως για την υδρόλυση είναι το νιτρικό, το φωσφορικό, το υδροχλωρικό και το θειικό οξύ (Μάρκου, 2013). Το θειικό οξύ είναι το πλέον χρησιμοποιούμενο οξύ (Harris et al., 1945, Taherzadeh and Karimi, 2007), καθώς επίσης και το HCl (Hashem and Rashad 1993, Taherzadeh and Karimi, 2007). Τέλος η υδρόλυση με οξέα χωρίζεται σε δύο κατηγορίες στην υδρόλυση με πυκνό οξύ και στην υδρόλυση με αραιό οξύ (Taherzadeh and Karimi, 2007) Υδρόλυση με πυκνό οξύ Η υδρόλυση με πυκνό θειικό ή υδροχλωρικό οξύ είναι μια σχετικά παλιά διαδικασία. Οι διεργασίες συμπυκνωμένων οξέων επιτυγχάνουν υψηλότερη απόδοση ζυμώσιμων σακχάρων (μέχρι 90% της θεωρητικής απόδοσης γλυκόζης) και συνεπώς υψηλότερη απόδοση αιθανόλης, σε σύγκριση με τις διεργασίες αραιού οξέος. Η υδρόλυση με πυκνό οξύ λειτουργεί σε χαμηλή θερμοκρασία από 40 C έως 50 C και χρόνο αντίδρασης 2-4 h (Μάρκου, 2013) πλεονεκτώντας έναντι της υδρόλυσης με αραιό οξύ. Σε αυτή τη μέθοδο η συγκέντρωση του οξέος είναι πολύ υψηλή 30-70%, και η θέρμανση του κατά την διάρκεια της υδρόλυσης το καθιστά εξαιρετικά διαβρωτικό. Ως εκ τούτου, η διαδικασία απαιτεί εξοπλισμό είτε από ακριβά κράματα είτε από εξειδικευμένες μη μεταλλικές κατασκευές, όπως κεραμικά ή επένδυση τούβλουάνθρακα. Η ανάκτηση του οξέος είναι μια διαδικασία απαραίτητη για την μετέπειτα ζύμωση που θα ακολουθήσει, και απαιτεί ενέργεια ενώ κατά την χρήση θειικού 43

44 οξέος, η διαδικασία εξουδετέρωσης παράγει μεγάλες ποσότητες γύψου. Το υψηλό κόστος συντήρησης έχει μειώσει σημαντικά το εμπορικό ενδιαφέρον αυτής της διαδικασίας ενώ οι περιβαλλοντικές επιπτώσεις περιορίζουν την εφαρμογή του υδροχλωρικού οξέος (Jones and Semrau 1984, Katzen et al., 1995, Wyman 1996, Taherzadeh and Karimi, 2007) Υδρόλυση με αραιό οξύ Η υδρόλυση με αραιό οξύ είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος. Είναι μια διεργασία που μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε ως προεπεξεργασία της ενζυματικής υδρόλυσης ή ως η βασική διεργασία υδρόλυσης της βιομάζας (Qureshi and Manderson 1995, Taherzadeh and Karimi, 2007). Η υδρόλυση με αραιό οξύ πραγματοποιείται σε υψηλότερες θερμοκρασίες C για σχετικά μικρό χρονικό διάστημα (Μάρκου, 2013). Ένα μειονέκτημα της αραιής-όξινης υδρόλυσης κυρίως όταν αυτή διεξάγεται σε ένα στάδιο, είναι η υποβάθμιση των σακχάρων και ο σχηματισμός ανεπιθύμητων παραπροϊόντων. Αυτό όχι μόνο μειώνει την απόδοση των διαθέσιμων ζυμώσιμων σακχάρων, αλλά και πολλά από τα παραπροϊόντα που παράγονται εμποδίζουν την παραγωγή αιθανόλης κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Οι πιθανοί αναστολείς που μπορούν να σχηματιστούν κατά τη διάρκεια της υδρόλυσης με αραιό οξύ είναι το λεβουλινικό οξύ, το ακετικό οξύ, το φορμικό οξύ (γνωστά και ως καρβοξυλικά οξέα), το ουρονικό οξύ, το 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ, το βανιλικό οξύ, η βανιλίνη, φαινολικές ενώσεις, η κινναμαλδεΰδη, η φορμαλδεΰδη, οι φουρφουράλες και η 5-υδροξυμεθυλο-φουρφουράλη (5-hydroxymethylfurfural, HMF) (Larsson et al, Taherzadeh 1999, Taherzadeh and Karimi, 2007). Προκειμένου να αποφευχθεί η υποβάθμιση των μονοσακχαριτών σε υψηλές θερμοκρασίες και ο σχηματισμός παρεμποδιστικών παραγόντων η υδρόλυση αραιού οξέος μπορεί να διεξαχθεί σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο, το οποίο διεξάγεται σε ήπιες συνθήκες, η ημικυτταρίνη μετατρέπεται σε πεντόζες και εξόζες σε ποσοστό 80-95% των συνολικών σακχάρων. Στο δεύτερο στάδιο, η βιομάζα υδρολύεται κάτω από πιο έντονες συνθήκες, επιτρέποντας την υδρόλυση της κυτταρίνης σε γλυκόζη σε ποσοστό 40-60% (Harris et al, 1984, Taherzadeh and Karimi, 2007). 44

45 Ενζυμική υδρόλυση Στην ενζυμική υδρόλυση χρησιμοποιούνται εξειδικευμένα ένζυμα που λύουν πολύ συγκεκριμένους χημικούς δεσμούς των πολυμερών υδατανθράκων παράγοντας μονομερή σάκχαρα. Διαφορετικά ένζυμα χρησιμοποιούνται για την λύση των δεσμών της κυτταρίνης, διαφορετικά για του αμύλου ή του γλυκογόνου. Για την υδρόλυση της κυτταρίνης τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται είναι διάφορες κυτταρινάσες που παράγονται από βακτήρια ή μύκητες. Ενδεικτικά, κάποια από αυτά τα βακτήρια ανήκουν στα γένη Acetovibri, Bacillus, Bacteriodes, Clostridium, Cellulomonas, Erwinia, Thermomonospora, Ruminococcus, Microbispora, Streptomyces και κάποιοι μύκητες στα γένη Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Phanerochaete, Humicola, Schizophillum (Chandel et al., 2007, Galbe and Zacchi, 2002, Lin and Tanaka, 2006, Sun and Cheng, 2002, Μάρκου 2013). Η ενζυμική υδρόλυση λαμβάνει χώρα κάτω από ήπιες συνθήκες θερμοκρασίας, ph και πίεσης ενώ ο χρησιμοποιούμενος εξοπλισμός είναι απλός καθώς δεν επιφέρεται διάβρωση. Η βέλτιστη θερμοκρασία για την δράση των ενζύμων είναι περίπου οι 50 C και βέλτιστο ph περίπου 5.0 (Gable and Zacchi, 2002, Sun and Cheng, 2002). Ένα σημαντικό μειονέκτημα της μεθόδου είναι ο αργός ρυθμός υδρόλυσης και το μεγάλο οικονομικό κόστος των ενζύμων σε σχέση με τα υλικά για την όξινη υδρόλυση (Lynd et al., 2002). Ωστόσο, είναι μια εξαιρετικά φιλική προς το περιβάλλον διεργασία και οδηγεί σε υψηλότερες αποδόσεις γλυκόζης χωρίς την παραγωγή παρεμποδιστικών παραπροϊόντων (Ho et al., 2013). 3.3 Αλκοολική ζύμωση Η αλκοολική ζύμωση είναι μια μεταβολική διεργασία που πραγματοποιείται απουσία οξυγόνου, με υπόστρωμα γλυκόζη και προϊόν την αιθανόλη. Τα σάκχαρα που παραλαμβάνονται από την υδρόλυση μετασχηματίζονται μέσω της αλκοολικής ζύμωσης από μικροοργανισμούς σε αιθανόλη ενώ το τελικό προϊόν καθαρότητας έως και 99.5 % θα ληφθεί έπειτα από κλασματική απόσταξη και αφυδάτωση (Taherzadeh and Karimi, 2007). Το είδος των μικροοργανισμών είναι ιδιαίτερα σημαντικός παράγοντας για την μετατροπή των σακχάρων σε αιθανόλη καθώς πρέπει να 45

46 διαθέτουν συγκεκριμένα χαρακτηριστικά. Ιδανικά, πρέπει να έχουν υψηλή απόδοση σε αιθανόλη, υψηλή αντοχή σε μεγάλες συγκεντρώσεις αιθανόλης, να μπορούν να ενεργήσουν σε αναερόβιες συνθήκες και να μπορούν να ζυμώσουν πληθώρα υποστρωμάτων (Κατσαμάς, 2013). Η αλκοολική ζύμωση είναι ένας πολύπλοκος μηχανισμός, τα διάφορα στάδια του οποίου καταλύονται από μια σειρά ενζύμων (Παπανικολάου, 2006, Stryer, 1997). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η ζύμωση πραγματοποιείται μέσω του κύκλου της γλυκόλυσης ακολουθώντας το μεταβολικό μονοπάτι Embdem-Meyenhorf-Parnas (EMP). Η αντίδραση της γλυκόζης προς παραγωγή αιθανόλης με τη χρήση του Saccharomyces cerevisiae μπορεί στοιχειομετρικά να παρασταθεί με την παρακάτω εξίσωση (1) (Siqueira et al., 2008): C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 (1) 1g 0.511g 0.489g Γλυκόζη Διφωσφορική φρουκτόζη 2ATP 2ADP 2 Φωσφογλυκερικό οξύ 2 Φωσφοτριόζη 2 ADP 2 ATP 2 πυροσταφυλικό οξύ 2 NADH 2NAD+ 2 Ακεταλδεΰδη 2 Αιθανόλη + CO2 Σχήμα 3 : To Embdem-Meyenhorf-Parnas μονοπάτι της γλυκόλυσης (Stryer, 1997). 46

47 3.3.1 Παράγοντες που επηρεάζουν τη ζύμωση Η αλκοολική ζύμωση ως βιολογική διεργασία επηρεάζεται καθοριστικά από διάφορους παράγοντες, από τους οποίους οι κυριότεροι είναι η θερμοκρασία της ζύμωσης, η συγκέντρωση της αλκοόλης, το ph, η οσμωτική πίεση και οι επιμολύνσεις από βακτήρια. Ο βαθμός επίδρασης των διαφόρων παραγόντων εξαρτάται από το στέλεχος του μικροοργανισμού και ως εκ τούτου η επιλογή του κατάλληλου στελέχους είναι ουσιαστικής σημασίας (Kasavi et al., 2012, Nichols et al., 2006, Μάρκου, 2013). Θερμοκρασία Η θερμοκρασία έχει καθοριστική επίδραση στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Το στέλεχος Saacharomyces cerevisiae αναπτύσσεται βέλτιστα στους 30 C, αλλά αντέχει και σε υψηλότερες θερμοκρασίες (έως 45 C) και παρουσιάζει σχεδόν γραμμική αύξηση του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων του με τη θερμοκρασία (διπλασιασμός ρυθμού ανά 10 C). Όταν η θερμοκρασία αυξάνεται προκαλείται αύξηση της αρνητικής επίδρασης της συγκέντρωσης αιθανόλης στην ανάπτυξη της ζύμης και η σύσταση των λιπιδίων στις κυτταρικές μεμβράνες παρουσιάζει μεγαλύτερη ρευστότητα. Αντιθέτως χαμηλότερες θερμοκρασίες από τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης οδηγούν σε επιβράδυνση της δράσης κάποιων ενζύμων που εμπλέκονται στις βιοχημικές διεργασίες ανάπτυξης του ζυμομύκητα (Aldiguier et al., 2004, Aranda et al., 2011, Mehdikhani et al., 2011, Μάρκου, 2013). Συγκέντρωση αιθανόλης Υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης στο υπόστρωμα ανάπτυξης προκαλούν δομικές αλλαγές στην κυτταρική μεμβράνη των μικροοργανισμών και αυξάνει τις ενεργειακές απαιτήσεις για τη διατήρηση του ενδοκυτταρικού ph στα επιθυμητά επίπεδα. Ο ζυμομύκητας S.cerevisiae είναι από τους πιο ανθεκτικούς μικροοργανισμούς στην αιθανόλη και μπορεί να αντέξει μέχρι και l8-20% ν/ν (Devantier et al., 2005, Dinh et al., 2008, Lin and Tanaka. 2006, Piper, 1995, Zacchi and Axelsson 1989, Μάρκου, 2013). 47

48 ph Το στέλεχος S.cerevisiae αναπτύσσεται σε μεγάλο εύρος ph με βέλτιστο μεταξύ Όταν οι τιμές του ph είναι μικρότερες ή μεγαλύτερες του παρατηρείται μείωση του ρυθμού ανάπτυξης, της παραγωγής αιθανόλης και σε κάποιες περιπτώσεις σχηματισμό ανασταλτικών παραπροϊόντων (Lin and Tanaka, 2012, Μάρκου, 2013). Ακόμη έχει βρεθεί ότι με την αλλαγή του ph η σύσταση της βιομάζας αυτού του στελέχους μεταβάλλεται (Lin et al., 2012, Μάρκου, 2013). Οσμωτική πίεση Οι συγκεντρώσεις των στοιχείων που εντοπίζονται στο υπόστρωμα επηρεάζουν την αλκοολική ζύμωση με επίδραση στο ισοζύγιο της οσμωτικής πίεσης μεταξύ του υποστρώματος και του κυττάρου. Η αύξηση της οσμωτικής πίεσης έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια ενδοκυτταρικών υγρών και με αυτό τον τρόπο τη συρρίκνωση του κυττάρου. Στην περίπτωση της χαμηλής πίεσης εισρέουν υγρά στο κύτταρο με συνέπεια τη διάρρηξή του. Σε φαινόμενα αυξημένης οσμωτικής πίεσης ο ζυμομύκητας αντιδρά παράγοντας ενδοκυτταρικά προϊόντα, όπως γλυκερόλη και τρεχαλόζη (Banat et al., 1998, Mager and Siderius, 2002, Μάρκου, 2013). Επιπλέον ακόμη και η υψηλή συγκέντρωση σακχάρων στο υδρόλυμα, μπορεί να οδηγήσει τα κύτταρα της ζύμης σε οσμωτική πίεση αναστέλλοντας την ζύμωση (Bafrncová et al., 1999, Siqueira et al., 2008, Ishmayana et al., 2011). Επιμολύνσεις από βακτήρια H παρουσία υψηλού οργανικού φορτίου στα υποστρώματα της ζύμωσης ενέχει τον κίνδυνο επιμολύνσεων από μικροοργανισμούς, όπως κυρίως από βακτήρια. Για αυτό θα πρέπει να γίνεται αποστείρωση των υποστρωμάτων και η πραγματοποίηση των ζυμώσεων κάτω από ασηπτικές συνθήκες, γεγονός που καθιστά ασύμφορη οικονομικά την παραγωγή αιθανόλης. Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης απελευθερώνεται CO2, με αποτέλεσμα να μειώνεται η αυξητική τάση του ph και η ζύμωση να σταματά στην ένδειξη του ph 4.0. Με αυτόν τον τρόπο η ζύμωση σε ph κοντά ή κάτω από το 4.0 προφυλάσσεται από μολύνσεις, εφόσον τα περισσότερα βακτήρια δεν αναπτύσσονται σε τόσο χαμηλό ph (Nichols et al., 2006, Μάρκου, 2013). 48

49 3.3.2 Μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή αιθανόλης Αρκετά βακτήρια, ζύμες και μύκητες έχουν αναφερθεί ότι χρησιμοποιούνται για την παραγωγή αιθανόλης (Lin and Tanaka, 2006, Harun et al, 2011). Οι συνηθέστεροι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται είναι οι ζύμες του γένους Saccharomyces ή τα βακτήρια του γένους Zymomonas (Silva and Bertucco, 2016). Ο ζυμομύκητας Saccharomyces cerevisiae είναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο στέλεχος για την ζύμωση και την παραγωγή αιθανόλης λόγω των χαρακτηριστικών του, όπως την χαμηλή συσσώρευση παραπροϊόντων, την υψηλή απόδοση σε αιθανόλη (Jambo et al., 2016, Sarris et al., 2012), την αντοχή σε συγκέντρωση αιθανόλης έως 20% v/v και την ικανότητα του να αναπτύσσεται γρήγορα κάτω από αναερόβιες συνθήκες (Guimarães et al., 2010, Kasavi et al., 2012, Markou et al, 2013). Η ζύμη αυτή παρουσιάζει μεγάλο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον καθώς χρησιμοποιείται ευρέως στην αρτοποιία, στην ζαχαροπλαστική, στην ζυθοποιία και στην παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (Παπανικολάου, 2006, Αγγελής 2007). Ωστόσο παρά το γεγονός ότι ο Saccharomyces cerevisiae μπορεί να ζυμώσει εύρος μονομερών σακχάρων,(lin and Tanaka, 2006) δεν μπορεί να ζυμώσει τις πεντόζες (με κύριο μονομερές την ξυλόζη) αλλά μόνο τις εξόζες (Harun and Danquah, 2011, Azhar et al., 2017). Saccharomyces cerevisiae Πρόκειται για μονοκύτταρο και μονοπύρηνο οργανισμό, με κυτταρικό σχήμα γενικά ελλειψοειδές (Εικόνα 1). Το μήκος του κυττάρου ποικίλει από 5-10 μm και το πλάτος από 1-3 έως 1-7 μm. Tα κύτταρα της ζύμης αποτελούνται από τον κυτταρικό φάκελο, το κυτταρόπλασμα, τον πυρήνα, τα μιτοχόνδρια, το ενδοπλασματικό δίκτυο και άλλα οργανίδια. Ο κυτταρικός φάκελος περιβάλλει και περικλείει τα κυτταρικά στοιχεία καταλαμβάνοντας περίπου το 15% του συνολικού όγκου του κυττάρου και παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της όσμωσης και της διαπερατότητας του κυττάρου (Walker, 1998). Ο S.cerevisiae παράγει σε κάθε ασκό 1-4 ασκοσπόρια. Τα ασκοσπόρια, όταν απελευθερωθούν, βλαστάνουν και δίνουν γένεση σε βλαστικά (σωματικά) απλοειδή κύτταρα, ικανά να αναπαράγονται αγενώς με εκβλαστήσεις. Το είδος είναι 49

50 ετερόθαλλο και επομένως πλασμογαμία πραγματοποιείται μόνο μεταξύ βλαστικών κυττάρων αντίθετου συζευκτικού τύπου. Δικαρυωτική φάση δεν υπάρχει, αφού αμέσως μετά την πλασμογαμία ακολουθεί καρυογαμία. Το διπλοειδές κύτταρο που παράγεται είναι ικανό προς βλάστηση και έτσι παράγονται πολλές γενεές διπλοειδών κυττάρων πριν την παραγωγή ασκοσπορίων. Σε αντίξοες συνθήκες, τα διπλοειδή κύτταρα μεταμορφώνονται σε ασκούς και ο διπλοειδής πυρήνας υφίσταται μείωση, η οποία όμως δε συνοδεύεται από μιτωτική διαίρεση, και επομένως σε κάθε ασκό παράγονται τέσσερα ασκοσπόρια (κατά το μέγιστο), ανά δύο αντίθετου συζευκτικού τύπου. Τα ασκοσπόρια μπορούν να αναπαραχθούν και παρθενογενετκά από ένα και μοναδικό βλαστικό κύτταρο. Σε ευνοϊκές συνθήκες αύξησης λαμβάνει χώρα σύζευξη των ασκοσπορίων και παραγωγή δύο διπλοειδών κυττάρων ενώ σε δυσμενείς συνθήκες ο ασκός θραύεται και απελευθερώνει ασκοσπόρια ικανά προς βλάστηση (Αγγελής, 2007). Εικόνα 1: Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) κυττάρων Saccharomyces cerevisiae (Παπανικολάου, 2006). 4. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΣΥΜΒΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σήμερα τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή βιοαιθανόλης προέρχονται κυρίως από αμυλούχες και σακχαρούχες καλλιέργειες 50

51 καθώς και από λιγνοκυτταρινούχα υπολείμματα. Στη παρούσα εργασία εξετάστηκε η δυνατότητα παραγωγής βιοαιθανόλης τόσο από αυτότροφη βιομάζα μικροφυκών, που είχε αναπτυχθεί σε τεχνητό χημικό θρεπτικό υπόστρωμα, αλλά και από βιομάζα βασισμένη στα μικροφύκη προερχόμενη από επεξεργασία πραγματικών αποβλήτων οινοποιείου και τυροκομείου. Αυτή τη στιγμή, υπάρχουν πολύ λίγες έρευνες στην διεθνή βιβλιογραφία που χρησιμοποιούν βιομάζα μικροφυκών ως υπόστρωμα παραγωγής βιοαιθανόλης (Harun and Danquah, 2011, Harun et al., 2010) ενώ ο αριθμός είναι πολύ μικρότερος για χρήση βιομάζας μικροφυκών που έχει προκύψει από επεξεργασία αποβλήτων. Στόχος της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ήταν η χρήση πηγών βιομάζας (μηδενικού κόστους) που δεν έχουν μελετηθεί εκτεταμένα στη διεθνή βιβλιογραφία,και η διερεύνηση των μέγιστων αποδόσεων βιοαιθανόλης που μπορούν να επιτευχθούν με τη χρήση τους. Σκοπός ήταν η εύρεση βέλτιστων συνθηκών προκειμένου να υπάρξει η καλύτερη σχέση κόστους-αποδοτικότητας για την εμπορική εφαρμογή των βιοκαυσίμων που παράγονται, εξετάζοντας τόσο την χρήση καθαρής βιομάζας μικροφυκών αλλά και την δυνατότητα χρήσης βιομάζας από επεξεργασία αποβλήτων. Ως υπόστρωμα ανάπτυξης των μικροφυκών χρησιμοποιήθηκαν δύο είδη υγρών αποβλήτων, απόβλητο τυροκομείου και οινοποιείου αλλά και τεχνητό χημικό μέσο. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε, σε όλες τις χρησιμοποιούμενες βιομάζες, όξινη υδρόλυση στη ξηρή βιομάζα με θειικό οξύ, σε σταθερή θερμοκρασία και πίεση αλλά με διαφορετικούς χρόνους υδρόλυσης. Σε προηγούμενη έρευνα που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Περιβαλλοντικών Συστημάτων, του τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων (Νικολάου, 2016) εξετάστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες υδρόλυσης προκειμένου να επιτευχθούν οι μέγιστες αποδόσεις ζυμώσιμων σακχάρων για τις πιο πάνω αναφερόμενες βιομάζες, όπου και βρέθηκε ότι για συγκέντρωση θεϊκού οξέος 2.5N απελευθερώνονται περισσότερα ζυμώσιμα σάκχαρα. Σε συνέχεια της προηγούμενης έρευνας, η παρούσα εργασία είχε ως στόχο την επίτευξη των μέγιστων αποδόσεων βιοαιθανόλης με βάση την βελτιστοποίηση των παραμέτρων της υδρόλυσης, εξετάζοντας παράλληλα την επίδραση της προσθήκης θρεπτικών αλάτων, της χρήσης σταφιδόζουμου και υδρολύματος σταφιδόζουμου. Για τις υδρολύσεις που πραγματοποιήθηκαν διατηρήθηκε σταθερή 51

52 συγκέντρωση θεϊκού οξέος στα 2.5N και εξετάσθηκαν τρείς διαφορετικοί χρόνοι υδρόλυσης (60-, 120-, 180- λεπτά) για τα υποστρώματα της καθαρής καλλιέργειας ενώ για την βιομάζα από επεξεργασία αποβλήτων χρόνος υδρόλυσης 120 σκοπεύοντας στην επίτευξη της βέλτιστης εκχύλισης σακχάρων. Στη συνέχεια, ακολούθησε αναερόβια αλκοολική ζύμωση των υδρολυμάτων, με χρήση του στελέχους του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 για την παραγωγή βιοαιθανόλης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υδρόλυση και η ζύμωση της μικροβιακής βιομάζας από επεξεργασία αποβλήτων τυροκομείου και οινοποιείου, οδήγησαν σε ικανοποιητική παραγωγή βιοαιθανόλης, γεγονός που ενισχύει την άποψη ότι η καλλιέργεια μικροφυκών σε υγρά απόβλητα μπορεί να αποτελέσει μια ελπιδοφόρα πρακτική για την παραγωγή βιοενέργειας. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5. ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ Στην παρούσα εργασία, η βιομάζα μικροφυκών από καλλιέργεια σε χημικό υπόστρωμα και η βιομάζα μικροφυκών από επεξεργασία αποβλήτων προήλθε από πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Περιβαλλοντικών Συστημάτων του Τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων του Πανεπιστημίου Πατρών. Οι απαραίτητες αλκοολικές ζυμώσεις με το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 για τον προσδιορισμό της βιοαιθανόλης διεξήχθησαν στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Στο κεφάλαιο που ακολουθεί δίνονται αναλυτικά όλες οι μέθοδοι και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή βιοαιθανόλης από μικροφύκη. 52

53 5.1 Απομόνωση και ανάπτυξη καλλιέργειας μικροφυκών Αρχικά, συλλέχθηκε δείγμα από την τριτοβάθμια δεξαμενή επεξεργασίας της μονάδας βιολογικού καθαρισμού του δήμου Αγρινίου. Το δείγματα αναπτύχθηκαν υπό αυτότροφες σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας 25 ± 2 ο C, τεχνητό φωτισμό Lux, ελεγχόμενο ph 6-8 και ελαφρά ανάδευση. Οι μικροοργανισμοί που επικράτησαν στην καλλιέργεια μεταφέρθηκαν σε μεγαλύτερης κλίμακας φωτοβιοαντιδραστήρες (ενυδρεία) και συντηρήθηκαν με τις παραπάνω ίδιες συνθήκες. Τα στελέχη που επικράτησαν έπειτα από ταυτοποίηση βρέθηκε ότι ήταν το θερμόφιλο κυανοβακτήριο Leptolyngbya sp. σε αφθονία 95% και ένα χρυσοφύκος του γένους Ochromonas sp. Το θερμόφιλο κυανοβακτήριο Leptolyngbya sp. ανήκει στην οικογένεια των Cyanophyceae και στην τάξη των Oscillatoriales. Στο έδαφος ευδοκιμεί σε ασβεστολιθικά και ανθρακικά πετρώματα, σε μαρμάρινα μνημεία και σε ασβεστολιθικά σπήλαια, ενώ σε υδάτινα μέσα ευδοκιμεί σε γλυκό και θαλασσινό νερό, σε θερμές και ιαματικές πηγές αλλά και σε βραχώδεις επιφάνειες. Τα κύτταρα του Leptolyngbya sp. είναι νηματοειδή ενώ το μέγεθος τους κυμαίνεται από 0.5 έως 3.2 μm και ζουν μοναχικά ή σχηματίζουν συστάδες ή στρώματα. Το Leptolyngbya sp. είναι ένα ευέλικτο στέλεχος που μπορεί να αναπτύσσεται υπό διαφορετικές συνθήκες θρεπτικών ουσιών, θερμοκρασίας, pη και αλατότητας. Με βάση την βιβλιογραφία το στέλεχος αυτό αναπτύσσεται δυναμικά σε θερμοκρασιακό εύρος από 20 έως 45 ο C με βέλτιστη θερμοκρασία τους 30 ο C και pη 7 έως 11 που σημαίνει ότι το στέλεχος είναι αλκαλόφιλο. Ενώ όταν καλλιεργείται σε κλειστούς αντιδραστήρες παρατηρείται ότι τα κύτταρα του σχηματίζουν συστάδες που προσκολλώνται στα τοιχώματα (Singh et al., 2014). Η μεικτή καλλιέργεια με επικρατών το Leptolyngbya sp. χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Τα θρεπτικά συστατικά που χρησιμοποιήθηκαν για την συντήρηση της καλλιέργειας αραιώνονταν σε τελικό όγκο 3L νερού περιέχοντας τις συγκεντρώσεις των θρεπτικών αλάτων που αναγράφονται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3: Σύνθεση χημικού υποστρώματος για την ανάπτυξη της αυτότροφης μεικτής καλλιέργειας. 53

54 Θρεπτικά συστατικά Συγκέντρωση (mg/l) KNO3 200 MgSO47H2O 100 CaCl22H2O 50 K2HPO4 108 KH2PO4 56 Εικόνα 2 : Ενυδρείο συντήρησης μεικτής καλλιέργειας μικροφυκών. 5.2 Συλλογή και ξήρανση βιομάζας Για τις υδρολύσεις της βιομάζας ήταν απαραίτητος ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της ξηρής μικροβιακής βιομάζας. Με το πέρας της επεξεργασίας των αποβλήτων και την ανάπτυξη της βιομάζας ακολουθούνταν η εξής διαδικασία: 1. Φυγοκέντριση των δειγμάτων στις 4000 στροφές, 15 min, σε φυγόκεντρο NF Απομάκρυνση υπερκείμενου υγρού, συλλογή βιομάζας σε προζυγισμένη φιάλη (Duran) όπου παρέμενε σε κλίβανο ξήρανσης στους 105 o C, 2 έως 3 ημέρες μέχρι σταθερού βάρους. 3. Το καθαρό βάρος της βιομάζας προέκυπτε από το απόβαρο της φιάλης δηλαδή την αφαίρεση της τελικής τιμής από την αρχική τιμή. Η ξηρή βιομάζα υπολογίζονταν κάθε φορά σε g L

55 4. Για την επίτευξη υψηλότερης απόδοσης ζυμώσιμων σακχάρων κατά την υδρόλυση σαν προεπεξεργασία της βιομάζας ακολουθούσε το σπάσιμο και ο τεμαχισμός αυτής με γουδί. 5.3 Υδρόλυση βιομάζας Η υδρόλυση της ξηρής και τεμαχισμένης βιομάζας πραγματοποιήθηκε με θειικό οξύ (H2SO4) 5% w/v, όπως επιλέχθηκε σύμφωνα με τους Markou et al., 2012, Miranda, et al., 2012, Ho et al., 2013, και Rizza et al., 2017 με συγκέντρωση οξέος 2.5 N (Νguyen, 2009, Danquah 2011, Νικολάου, 2016). Για την παρασκευή θειικού οξέος συγκέντρωσης 2.5 N απαιτούνται ml πυκνού θειικού οξέος και συμπλήρωση με απιονισμένο νερό μέχρι τα 1000 ml. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε υδρόλυση της βιομάζας σε χύτρα (Εικόνα 3) στους 104 o C και πίεση 0.8 bar με χρόνους υδρόλυσης 60, 120 και 180 λεπτά. Εικόνα 3 : Χύτρα Υδρόλυσης. Το προκύπτον υδρόλυμα διηθούταν για την απομάκρυνση των στερεών καταλοίπων ώστε να προσδιοριστούν στη συνέχεια τα ανάγοντα σάκχαρα και να ελεγχθεί η δυνατότητα ζύμωσής του. 55

56 5.4 Προσδιορισμός αναγόντων σακχάρων Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των αναγόντων σακχάρων (γλυκόζη) είναι απαραίτητη η κατασκευή πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης (ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ) σύμφωνα με τη μέθοδο 3.5 dinitrosalicylic acid, DNS (Miller,1959) όπως φαίνεται στο Σχήμα 4. Παρασκευή διαλύματος DNS: 1. Ζύγιση 1.6g NaOH και διάλυσή του σε 20ml απιονισμένο νερό. 2. Ζύγιση 1g DNS (3.5 dinitrosalicylic acid). 3. Ζύγιση 40.3g τρυγικό κάλιο-νάτριο (sodium tatrate terahydrate). Σε ποτήρι ζέσεως όγκου 100ml προστέθηκαν κατά σειρά τα εξής: 1. 50ml νερό ml διαλύματος NaOH. 3. Τοποθέτηση διαλύματος σε θερμαινόμενο αναδευτήρα σε χαμηλή θερμοκρασία (40 o C). 4. Προσθήκη με αργό ρυθμό DNS και τρυγικό κάλιο-νάτριο. 5. Ογκομέτρηση μέχρι τα 100 ml. Παρασκευή διαλυμάτων 1. Σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες μεταφέρουμε 0.5 ml δείγματος και 0.5 ml αντιδραστηρίου DNS και αναδεύουμε με vortex (Εικόνα 4). 2. Τα δείγματα μεταφέρονται για 5-10 min σε υδατόλουτρο στους C. 3. Τα δείγματα ψύχονται αμέσως στους 25 0 C. 4. Προσθέτουμε 5 ml απιονισμένο νερό σε κάθε δείγμα. 5. Αναδεύουμε ξανά τα δείγματα στο vortex. 6. Μετράμε την οπτική απορρόφηση (Abs) των δειγμάτων με φασματοφωτόμετρο (UV-1800, Shimadzu, North America) στα 540 nm. 7. Υπολογισμός συγκέντρωσης (C)=Abs * Αραίωση * Συντελεστή πρότυπης. 56

57 2,5 Equation y = a + b*x 0,99909 Adj. R-Square Value Standard Error B Intercept 0 -- B Slope 1, ,01772 y=1,85805x 2,0 Γλυκόζη (g/l) 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Απορρόφηση (540nm) Σχήμα 4 : Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης αναγόντων σακχάρων. Εικόνα 4 : Παρασκευή αναγόντων σακχάρων. 5.5 Πειραματικές συνθήκες αλκοολικής ζύμωσης Βιολογικό υλικό Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε για τις αλκοολικές ζυμώσεις η ζύμη Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 της συλλογής του εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Η ζύμη διατηρούνταν σε δοκιμαστικούς σωλήνες επί κεκλιμένου θρεπτικού υλικού PDA (Potato Dextose Agar, Himedia Laboratories, Mumbai, India) σε ψυγείο (Hitachi Minus- Zero Cooling) με θερμοκρασία 7±1 C και ανανεώνονταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα για τις ανάγκες των πειραμάτων. 57

58 5.5.2 Συνθήκες καλλιέργειας Ως θρεπτικό υλικό για την προκαλλιέργεια του στελέχους χρησιμοποιήθηκε PDB (Potato Dextrose Broth, Scharlau Microbiology, ) το οποίο καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 ml, σε όγκο θρεπτικού υλικού 50 ml. Ο εμβολιασμός των φιαλών πραγματοποιήθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες, σε θάλαμο γραμμικής ροής (laminar row flow- pbi, MINIFLO) (Εικόνα 5). Το εμβόλιο ήταν 1 ml, 48ωρης προκαλλιέργειας, για τη ζύμη Saccharomyces cerevisiae. Πριν τον εμβολιασμό των φιαλών, γίνονταν έλεγχος με μικροσκοπικό παρασκεύασμα για επιμολύνσεις και μέτρηση της συγκέντρωσης των κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο τύπου Neubauer (Poly-Optic) όπου προσδιορίστηκε η συγκέντρωση μέσου όρου 11 ± 0.76 x10 7 cells/ ml, για όλες τις ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν. Αρχικά, οι κωνικές φιάλες της καλλιέργειας τοποθετούνταν για επώαση δύο ωρών σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο ZHICHENG ZHWY 211C, Shanghai, China (Εικόνα 6) εξοπλισμένο με ειδικό σύστημα αερισμού, σε θερμοκρασία 28±1 ο C και υπό ανάδευση 180 rpm (rotation per minute- στροφές ανά λεπτό). Εικόνα 5: Θάλαμος γραμμικής ροής (laminar row flow- pbi, MINIFLO). 58

59 Εικόνα 6: Ανακινούμενος επωαστικός θάλαμος (ZHICHENG ZHWY 211C, Shanghai, China) Μέτρηση ph To ph (Εικόνα 7) ελεγχόταν και ρυθμιζόταν καθημερινά στο 4.5 ± 0.5 με προσθήκη κατάλληλης ποσότητας διαλύματος οξέος (HCl) ή βάσεως (NaOH), όποτε ήταν απαραίτητο. Εικόνα 7 : Πεχάμετρο ( Hanna Instruments) Μικροσκοπική παρατήρηση Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της βιομάζας κατά τα διάφορα στάδια αύξησης, έγιναν νωπά δείγματα καλλιέργειας, τα κύτταρα της οποίας παρατηρήθηκαν 59

60 σε οπτικό μικροσκόπιο Carl Zeiss (Gmbh, Göttingen, Germany) (Εικόνα 8) σε ολική μεγέθυνση 400 φορών (=10*40). H συγκέντρωση των κυττάρων υπολογίζονταν σε (cells/ml) με την χρήση του αιματοκυτταρόμετρου μετρώντας τα κύτταρα σε τέσσερα τετράγωνα αυτού ως εξής: Συγκέντρωση κυττάρων (C) = (Κύτταρα ανά τετράγωνο/4)*αραίωση*25*10 4. Εικόνα 8 : Οπτικό μικροσκόπιο Carl Zeiss (Gmbh, Göttingen, Germany) Προσδιορισμός αιθανόλης Ο προσδιορισμός της αιθανόλης πραγματοποιήθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography-HPLC, Ultimate 3000, Dionex, Germany) (Εικόνα 9), η οποία φέρει στήλη Aminex HPX-87H (διαστάσεων: 300 mm x 7.8 mm, Bio-Rad). Ο όγκος των προς ανάλυση δειγμάτων ήταν 20 μl μέσου καλλιέργειας, που προηγουμένως είχε διηθηθεί με μεμβράνη Whatman διαμέτρου πόρων 0.2 μm. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα συγκέντρωσης mg/l H2SO4 (Sigma) και η ροή της ήταν 0.6 ml/min σε θερμοκρασία στήλης 65 ο C με χρόνο έκλουσης της αιθανόλης 23 min. Η ανίχνευση της αιθανόλης πραγματοποιήθηκε από ανιχνευτή δείκτη διάθλασης RI (Reflective index, RI-101, Shodex). Η ποσοτικοποίηση έγινε με τη βοήθεια καμπυλών αναφοράς, οι οποίες χαράχτηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα. Η καμπύλη αναφοράς για την αιθανόλη έγινε με τη χρήση πρότυπων διαλυμάτων αιθανόλης συγκέντρωσης 5-50 g/l (ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ). 60

61 Εικόνα 9: Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography-HPLC, Ultimate 3000, Dionex, Germany). Εμβαδό κορυφής (μriu/min) 120 y=2,33447x Equation y = a + b*x 0,99975 Adj. R-Square Value Standard Error AREA Intercept 0 -- AREA Slope 2, , Ethanol (g/l) Σχήμα 5 : Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης αιθανόλης. 6. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στις ενότητες που ακολουθούν περιγράφονται τα βήματα για την παραγωγή βιοαιθανόλης με την χρήση βιομάζας μικροφυκών που καλλιεργήθηκε σε τεχνητό θρεπτικό υπόστρωμα σύνθεσης του Πίνακα 3 αλλά και της μικροβιακής βιομάζας που αναπτύχθηκε σε υγρά απόβλητα τυροκομείου και οινοποιείου. Τα απόβλητα που 61