ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ:

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ: «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ» Αξιοποίηση βιομάζας μικροφυκών από επεξεργασία αποβλήτων για παραγωγή βιοαιθανόλης ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ του ΧΡΗΣΤΟΥ ΝΙΚΟΛΑΟΥ Επιβλέπoυσα Καθηγήτρια : Αθανασία Τεκερλεκοπούλου Επίκουρη Καθηγήτρια Αγρίνιο 2016

2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ: «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ» Αξιοποίηση βιομάζας μικροφυκών από επεξεργασία αποβλήτων για παραγωγή βιοαιθανόλης ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ του ΧΡΗΣΤΟΥ ΝΙΚΟΛΑΟΥ Επιβλέπουσα: Αθανασία Τεκερλεκοπούλου Επίκουρη Καθηγήτρια Εγκρίθηκε από την τριμελή εξεταστική επιτροπή την 18 η Φεβρουαρίου (Υπογραφή) (Υπογραφή) (Υπογραφή) Τεκερλεκοπούλου Αθανασία Βαγενάς Δημήτριος Αγγελής Γεώργιος Επίκουρη Καθηγήτρια Καθηγητής Καθηγητής Αγρίνιο, 2016

4 (Υπογραφή)... ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΧΡΗΣΤΟΣ Διπλωματούχος του Τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων 2016 All rights reserved

5 Ευχαριστίες Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων στο Εργαστήριο Περιβαλλοντικών Συστημάτων σε συνεργασία με το Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών, κατά το έτος Η ολοκλήρωση της μεταπτυχιακής μου εργασίας θα ήταν ανέφικτη χωρίς την καθοδήγηση της επιβλέπουσας Επίκουρης Καθηγήτριάς, κα. Αθανασίας Τεκερλεκοπούλου την οποία ευχαριστώ θερμά για την βοήθεια και την εμπιστοσύνη που μου προσέφερε. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Γεώργιο Αγγελή για τις πολύτιμες συμβουλές του καθώς και για την παραχώρηση του εργαστηρίου του για την διεξαγωγή των πειραμάτων. Τέλος, να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Δημήτριο Βαγενά για τις χρήσιμες παρατηρήσεις και για τη συμμετοχή στην τριμελή επιτροπή. Χρωστάω, ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στην υποψήφια διδάκτορα Όλγα Τσολχά για την άριστη συνεργασία που είχαμε στην εκπόνηση των πειραμάτων, για την υπομονή και τον πολύτιμο χρόνο που διέθεσε προκειμένου να μου δώσει τις απαραίτητες επιστημονικές γνώσεις και τα στοιχεία πάνω στο θέμα, αλλά και για την σημαντική βοήθεια της, που ποτέ δε δίστασε να μου δώσει. Θα ήθελα ακόμα να ευχαριστήσω τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια του τμήματος Βιολογίας, Μαριάννα Ντούρου για τη συνεργασία μας και τις πολύτιμες συμβουλές καθώς επίσης όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Περιβαλλοντικών Συστημάτων, για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στους συμφοιτητές και φίλους μου Αγγελική Καρασιώτου, Δήμητρα Καμπίτη, Αναστασία Καραμήτσου, Δημήτριο Κουτσουμπλιά, Ιλάειρα Ράπτη και Λάμπρο Τσούνη για τις όμορφες και ευχάριστες στιγμές κατά τη διάρκεια της φετινής χρονιάς. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ το χρωστάω στoυς γονείς μου Νίκο και Μαρία, στον αδερφό μου Θανάση, αλλά ειδικότερα στη θεία μου Χριστίνα η οποία έπαιξε καταλυτικό ρόλο σε πολλούς τομείς κατά τη διάρκεια της φετινής χρονιάς καθώς επίσης και στους πολυαγαπημένους μου παππούδες για όλη την βοήθεια, τη συμπαράσταση και τη στήριξη που μου έδειξαν. 1

6 Περίληψη Η αύξηση του πληθυσμού της Γης και η έντονη βιομηχανική δραστηριότητα, αφενός απαιτούν υψηλή κατανάλωση ενέργειας, αφετέρου παράγουν μεγάλους όγκους αποβλήτων. Ως αποτέλεσμα, το ενδιαφέρον πολλών ερευνητών έχει στραφεί τόσο στην παραγωγή εναλλακτικών μορφών ενέργειας όσο και στους τρόπους απορρύπανσης των αποβλήτων. Η καλλιέργεια μικροφυκών σε υγρά απόβλητα τόσο του βιομηχανικού και αστικού τομέα όσο και της γεωργοκτηνοτροφίας και της βιομηχανίας τροφίμων διαφαίνεται να αποτελεί τα τελευταία χρόνια μια σημαντική και συνδυαστική λύση των προαναφερομένων προβλημάτων. Συγκεκριμένα, η καλλιέργεια μικροφυκών στα απόβλητα έχει διττό σκοπό: από τη μία οδηγεί στην παραγωγή βιοενέργειας ή άλλων προϊόντων υψηλής αξίας από την παραγόμενη βιομάζα και από την άλλη βοηθάει στην απορρύπανση των χρησιμοποιούμενων υγρών αποβλήτων, καθώς οργανικοί και ανόργανοι ρύποι που περιέχονται σε αυτά μπορούν να αποτελέσουν θρεπτικά συστατικά για την καλλιέργεια των μικροφυκών. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία η βιομάζα που προκύπτει μπορεί να εκχυλιστεί με έναν μη αναμειγνυόμενο με το νερό διαλύτη για την ανάκτηση των λιπαρών οξέων που υπάρχουν σε αυτήν, τα οποία στη συνέχεια μετατρέπονται σε βιοντίζελ με αξιοποίηση της υπάρχουσας τεχνολογίας. Η βιομάζα, πέρα από τα λιπίδια, αποτελεί και μια πιθανή πηγή χρήσιμων υποστρωμάτων διαθέσιμα για ζύμωση που οδηγεί στην παραγωγή βιοαιθανόλης. Παρόλο που οι αναφορές για την παραγωγή βιοαιθανόλης από τα μικροφύκη είναι περιορισμένες, εντοπίζονται αρκετά πλεονεκτήματα της διεργασίας αυτής, όπως η χαμηλή κατανάλωση ενέργειας και η απλοποιημένη διεργασία της ζύμωσης σε σύγκριση με την παραγωγή βιοντίζελ από μικροφύκη. Ωστόσο, η παραγωγή βιοαιθανόλης από μικροφύκη είναι ακόμα υπό μελέτη, χωρίς η τεχνολογία αυτή να έχει περάσει ακόμη σε βιομηχανική κλίμακα. Στόχος της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ήταν η διερεύνηση όλων εκείνων των παραμέτρων (όπως βέλτιστες συνθήκες υδρόλυσης και ζύμωσης, είδος επεξεργαζόμενο υγρού αποβλήτου, κ.α.), προκειμένου να επιτευχθούν οι μέγιστες αποδόσεις παραγωγής βιοαιθανόλης που θα οδηγήσουν σε βελτιωμένη σχέση κόστους-αποδοτικότητας και ως εκ τούτου, στην αποτελεσματική εμπορική εφαρμογή των βιοκαυσίμων που παράγονται. 2

7 Για την καλλιέργεια μικροφυκών σε απόβλητα χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά είδη υγρών αποβλήτων όπως απόβλητα τυροκομείου, οινοποιείου, μείξη αποβλήτων οινοποιείου - σταφιδοποιίας καθώς και συνθετικό χημικό μέσο. Αρχικά πραγματοποιήθηκε προεπεξεργασία της παραγόμενης βιομάζας, υδρολύοντάς την με θειικό οξύ. Εξετάστηκαν δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις θεϊκού οξέος (1.5N, 2.5N) καθώς και τέσσερις διαφορετικοί χρόνοι υδρόλυσης (30,60,120,180 ), με σκοπό τη διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών για την επίτευξη της μέγιστης συγκέντρωσης σακχάρων. Στη συνέχεια ακολούθησε ζύμωση των υδρολυμάτων που προέκυψαν, με χρήση του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 για την παραγωγή βιοαιθανόλης. Μετρήσεις έδειξαν ότι η μέγιστη παραγόμενη βιοαιθανόλη κυμαινόταν από 32 μέχρι και g/l, ανάλογα με το είδος του υποστρώματος. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει ότι καλλιέργεια μικροφυκών σε υγρά απόβλητα, αποτελεί μια ελπιδοφόρα πρακτική για την παραγωγή βιοενέργειας. Επίσης, οι σημαντικές απομακρύνσεις οργανικού φορτίου και θρεπτικών συστατικών που παρατηρήθηκαν στα υγρά απόβλητα (οργανικού φορτίου 93%, ολικού αζώτου 78% και ορθοφωσφορικά 99%) δίνει τη δυνατότητα εφαρμογής της μεθόδου αυτής ως στάδιο επεξεργασίας υγρών αποβλήτων. 3

8 4

9 Abstract The rapid increase in world population as well as the ensuing intense industrial activity, on the one hand requires a high level of energy consumption, while on the other produce large volumes of waste. Consequently, the interest of many researchers has focused on both the production of alternative energy sources and the development of innovative methods for waste decontamination. Microalgae cultivation in wastewater, not only from the industrial and civil sectors but also the farming and food industries, seems, in recent years, to constitute an important as well as combinational solution to the above-mentioned problems. Namely, the cultivation of microalgae in wastes serves a two-fold objective: on the one hand, the biomass produced can be used in multiple ways, such as the production of bioenergy or other high value products, while on the other the decontamination of used wastewater can be achieved, resulting in the use of its pollutants as nutrients for microalgae cultivation. According to the literature, the biomass obtained may be extracted with a solvent insoluble in water, in order to recover the fatty acids present therein, which is then converted into biodiesel through the utilization of the existing technology. Biomass, apart from lipids, constitutes a potential source of useful substances available for fermentation, which leads to the production of bioethanol. Although reports for the bioethanol production from microalgae are limited, there are several advantages to this process which have been identified, such as low power consumption and the simplification of the fermentation process, as compared to the biodiesel production from microalgae. However, the bioethanol production from microalgae is still under study, with this technology not having been applied on an industrial scale yet. The aim of this thesis is to investigate all parameters (such as the optimal conditions for hydrolysis and fermentation, the type of wastewater under treatment etc.) in order that the maximum production of bioethanol yield may be achieved, which will lead to improved cost-effectiveness and, subsequently, the effective commercial application of the biofuels thus produced. 5

10 Hence, for microalgae cultivation in wastewater, four different types of effluent were used: dairy waste, winery waste, mixed winery - raisin waste and a synthetic chemical medium. Initially, a pre-treatment of produced biomass was performed by hydrolyzing it with sulfuric acid. Two different concentrations of sulfuric acid (1.5 N, 2.5 N) as well as four different hydrolysis times were examined (30, 60, 120, 180 ), so that the optimal conditions for achieving maximum concentration of sugars could be investigated. Subsequently, the yeast Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 was used for the fermentation of the hydrolysates obtained, in order to produce bioethanol. Measurements showed that the maximum concentration of bioethanol thus produced ranged from 32 up to g / l, depending on the type of substrate. This proves that microalgae cultivation in wastewater is a promising practice for bioenergy production. Additionally, significant removals of organic load (COD 93%) and nutrients (Total Nitrogen 78% and Orthophosphate 99%) observed in wastewaters that permit the application of this specific process as a wastewater treatment stage. 6

11 Πίνακας περιεχομένων Ευχαριστίες... 1 Περίληψη... 2 Πίνακας περιεχομένων... 7 Κατάλογος εικόνων Κατάλογος πινάκων Κατάλογος σχημάτων ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΑ Βιοαιθανόλη Πλεονεκτήματα βιοαιθανόλης Μειονεκτήματα βιοαιθανόλης ΜΙΚΡΟΦΥΚΗ Γενικά για τα μικροφύκη Βιολογία των μικροφυκών Κυανοβακτήρια Φάσεις κυτταρικής ανάπτυξης μικροφυκών Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη των μικροφυκών Επεξεργασία υγρών αποβλήτων με μικροφύκη Αστικά απόβλητα Αγροτοβιομηχανικά απόβλητα Γαλακτοκομικά απόβλητα Απόβλητα βοοειδών Απόβλητα χοιροστασίου Πτηνοτροφικά απόβλητα Απόβλητα ζυθοποιείου-οινοποιείου Bιομηχανικά απόβλητα ΒΙΟΜΑΖΑ Χαρακτηριστικά βιομάζας Κατηγορίες βιομάζας Πλεονεκτήματα βιομάζας Μειονεκτήματα βιομάζας

12 3.5 Επεξεργασία παραγόμενης βιομάζας Προεπεξεργασία βιομάζας Υδρόλυση βιομάζας Χημική υδρόλυση Ενζυματική υδρόλυση ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΒΙΟΜΑΖΑ Αλκοολική ζύμωση C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2 (1) Αναερόβια ζύμωση και παράγοντες που την επηρεάζουν Saacharomyces cerevisiae Επιμολύνσεις από βακτήρια Θερμοκρασία ph Συγκέντρωση αιθανόλης Οσμωτική πίεση Αντικείμενο και συμβολή της μεταπτυχιακής εργασίας ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εισαγωγή Προέλευση καλλιέργειας μικροφυκών Ανάπτυξη βιομάζας μικροφυκών Προσδιορισμός ξηρής βιομάζας Υδρόλυση βιομάζας Προσδιορισμός αναγόντων σακχάρων Προσδιορισμός ολικών σακχάρων (πολυσακχαριτών) Αλκοολική ζύμωση και συνθήκες καλλιέργειας ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προεπεξεργασία βιομάζας Υδρόλυση βιομάζας Παραγωγή βιοαιθανόλης Ανάπτυξη βιομάζας ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

13 7.1 Συνοπτικά Συμπεράσματα Μελλοντική εργασία ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

14 Κατάλογος εικόνων Εικόνα 5.1 Ενυδρείο ανάπτυξης μικροφυκών 45 Εικόνα 5.2 Συλλογή και ξήρανση βιομάζας.46 Εικόνα 5.3 Τεμαχισμός βιομάζας.46 Εικόνα 5.4 Δοχεία με θειικό οξύ..47 Εικόνα 5.5 Χύτρα αποστείρωσης.47 Εικόνα 5.6 Υδρόλυμα μετά από διήθηση 48 Εικόνα 5.7 Υδατόλουτρο κατά τη διαδικασία προσδιορισμού αναγόντων σακχάρων 51 Εικόνα 5.8 Προσδιορισμός ολικών σακχάρων.52 Εικόνα 5.9 Δειγματοληψία στον θάλαμο γραμμικής ροής (laminar row flow- pbi MINIFLO).53 Εικόνα 5.10 Πεχάμετρο-Θερμόμετρο (Hanna Instruments).54 Εικόνα 5.11 Οπτικό μικροσκόπιο Carl Zeiss 54 Εικόνα 5.12 Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης.54 10

15 Κατάλογος πινάκων Πίνακας 1.1 Ιδιότητες βιοαιθανόλης 14 Πίνακας 1.2 Παγκόσμια παραγωγή αιθανόλης ανά χώρα 16 Πίνακας 2.1 Επεξεργασία διαφορετικών αποβλήτων με μικροφύκη...24 Πίνακας 3.1 Παραγωγή βιοενέργειας από διάφορα υποστρώματα βιομάζας...31 Πίνακας 5.1: Θρεπτικά συστατικά συντήρησης μεικτής καλλιέργειας.45 Πίνακας 6.1 Συγκεντρώσεις βιομάζας αποβλήτων...57 Πίνακας 6.2 Συνθήκες υδρόλυσης βιομαζών...58 Πίνακας 6.3 Συγκεντρώσεις βιομαζών κατά τη συλλογή.61 Πίνακας 6.4 Μέγιστες συγκεντρώσεις σακχάρων για όλες τις συνθήκες Πίνακας 7.1 Είδη από βιομάζες που χρησιμοποιήθηκαν για παραγωγή αιθανόλης...72 Πίνακας 7.2 Υδρόλυση υποστρωμάτων και παραγωγή αιθανόλης

16 Κατάλογος σχημάτων Σχήμα 2.1 Οι φάσεις της κυτταρικής ανάπτυξης των μικροφυκών..21 Σχήμα 4.1 Ο μηχανισμός της αλκοολικής ζύμωσης 38 Σχήμα 5.1 Πρότυπη καμπύλη αναγόντων σακχάρων...50 Σχήμα 5.2 Πρότυπη καμπύλη ολικών σακχάρων.52 Σχήμα 5.3 Πρότυπη καμπύλη αιθανόλης..55 Σχήμα 6.1 Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης με συνθετικό χημικό μέσο 65 Σχήμα 6.2 Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης με μεικτό υπόστρωμα αποβλήτων (120 ).66 Σχήμα 6.3 Κινητική ανάπτυξης ζύμης με συγκεντρώσεις αναγόντων σακχάρων και αιθανόλης με μεικτό υπόστρωμα αποβλήτων (180 )...67 Σχήμα 6.4 Κινητική ανάπτυξης ζύμης σε όλα τα υποστρώματα

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΑ Η αυξανόμενη ανάγκη για χρήση ανανεώσιμων καθώς επίσης και εναλλακτικών καυσίμων είναι επιτακτική, με τα βιοκαύσιμα να παίζουν σπουδαίο ρόλο. Βιοκαύσιμα μπορούν να χαρακτηριστούν εκείνα τα καύσιμα των οποίων η μορφή είναι στερεή, υγρή ή αέρια και προέρχονται από βιομάζα αποτελώντας μορφή αποθηκευμένης ενέργειας. Οι λόγοι για τους οποίους τα βιοκαύσιμα διαρκώς εξαπλώνονται είναι το γεγονός ότι είναι φιλικότερα στο περιβάλλον και ότι υπάρχει η τάση αντικατάστασης των ορυκτών καυσίμων όσο το δυνατόν περισσότερο (Medipally et al., 2015). Είναι σημαντικό ότι στα καύσιμα αυτά δεν περιέχονται ενώσεις του θείου ή του αζώτου τα οποία συμβάλλουν στην όξυνση φαινομένων όπως το φωτοχημικό νέφος και η όξινη βροχή. Γενικότερα, τα βιοκαύσιμα εκπέμπουν πολύ μικρότερες ποσότητες αερίων θερμοκηπίου σε σχέση με τα συμβατικά καύσιμα. Τα σημαντικότερα βιοκαύσιμα σύμφωνα με την οδηγία 2003/30/ΕΚ (Ευρωπαϊκή Επιτροπή, 2003) είναι: 1. Βιοντίζελ: μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων οι οποίοι παράγονται από ζωικά ή φυτικά έλαια και λίπη. 2. Βιοαιθανόλη: η αιθανόλη η οποία παράγεται από βιοαποικοδομήσιμα απόβλητα ή βιομάζα. 3. Βιοαέριο: αέριο που παράγεται από βιομάζα. 4. Βιομεθανόλη: μεθανόλη η οποία παράγεται από βιομάζα. 5. Βιο-ΕΤΒΕ: αιθυλο-τριτοταγής-βουτυλαιθέρας παραγόμενος από βιοαιθανόλη. 6. Βιο-ΜΤΒΕ: αιθυλο-τριτοταγής-βουτυλαιθέρας παραγόμενος από μεθανόλη. 7. Συνθετικά βιοκαύσιμα 8. Βιο-υδρογόνο 9. Καθαρά φυτικά έλαια: προέρχονται από ελαιούχα φυτά (ελαιοκράμβη, σόγια, σόργο), τα οποία παράγονται με έκθλιψη, συμπίεση φυσικά ή εξευγενισμένα. 13

18 1.1 Βιοαιθανόλη Η βιοαιθανόλη είναι αλκοόλη που παράγεται από τη ζύμωση πρώτων υλών όπως είναι οι αμυλούχες, σακχαρούχες ή κυτταρινούχες πηγές. Πρόκειται για ένα υγρό, άχρωμο, χαμηλής τοξικότητας και διαυγές. Η αιθανόλη μπορεί να παραχθεί ως καύσιμο είτε με τεχνολογία από βιομάζα η οποία παράγεται σε γεωργικές περιοχές είτε από φυτά τα οποία είναι πλούσια σε σάκχαρα (Hill et al., 2006). Η αιθανόλη μπορεί να αναμειχθεί με τη βενζίνη από 1% έως 85%, με τον Ε10 (90% βενζίνη και 10% αιθανόλη) και Ε85 (15% βενζίνη και 85% αιθανόλη) να είναι οι κύριοι τύποι βενζίνης-αιθανόλης σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή νομοθεσία. Στον παρακάτω Πίνακα 1.1 παρουσιάζονται οι κυριότερες ιδιότητες της βιοαιθανόλης. Πίνακας 1.1 Ιδιότητες βιοαιθανόλης (ESPOO, 2008) Ιδιότητες Βιοαιθανόλη Μοριακό βάρος (g/mol) 46.1 Πυκνότητα 15 ο C 0.79 Απόσταξη(C) 78 Αριθμός οκτανίων (RON) 108 Θερμογόνος δύναμη (MJ/kg) 26.4 Πίεση ατμού (kpa) Υψηλή στο μίγμα Περιεκτικότητα σε οξυγόνο (wt-%) 34.7 Ισοδύναμο μεγέθους δεξαμενής 1.8 Απόσταση οδήγησης (%) 70 Ανάφλεξη καυσίμου στον αέρα (%) 3-19 Στοιχειομετρική αναλογία Αέρα/καυσίμου Πλεονεκτήματα βιοαιθανόλης Η αιθανόλη ως καύσιμο έχει αρκετά πλεονεκτήματα σε σχέση με τα συμβατικά καύσιμα, με την μείωση της ατμοσφαιρικής ρύπανσης να είναι το κυριότερο. Για το λόγο αυτό πολλές είναι οι χώρες που έχουν δώσει ιδιαίτερη έμφαση στην παραγωγή της (Πίνακας 1.2). Σύμφωνα με τον Παπανικολάου, (2006) τα πλεονεκτήματα είναι τα ακόλουθα: 1. Σε μίγμα βενζίνης με χρήση 10% αιθανόλης γίνεται καλύτερη η καύση του καυσίμου και το μονοξείδιο του άνθρακα μειώνεται κατά 25-30%. 14

19 2. Στην αιθανόλη δεν περιέχεται θείο και βελτιώνεται η καύση του καυσίμου με αποτέλεσμα την προστασία των καταλυτών στα οχήματα. 3. Σε μίγματα αιθανόλης που είναι χαμηλότερου επιπέδου, το καύσιμο οξυγονώνεται από την αιθανόλη με αποτέλεσμα την μείωση των πτητικών οργανικών ενώσεων κατά 7%. 4. Η ανάμειξη βενζίνης με 10% αιθανόλη, μειώνει το διοξείδιο του άνθρακα κατά 6-10%. 5. Είναι μη ορυκτό καύσιμο, όπου η παρασκευή και η καύση του δεν συντελούν στην αύξηση του φαινομένου του θερμοκηπίου καθώς το ισοζύγιο του διοξείδιο του άνθρακα είναι ουδέτερο. 6. Σε περίπτωση διαρροής δεν προκαλεί αρνητικές επιπτώσεις στο περιβάλλον γιατί είναι μη τοξική, βιοαποικοδομήσιμη και διαλυτή στο νερό. 7. Μείωση εκπομπών διοξειδίου του άνθρακα μέσω της χρήσης της, αφού η παραγωγή αιθανόλης μέσω ζύμωσης της βιομάζας, είναι μέρος του κύκλου του άνθρακα (C). 8. Τα υψηλής συγκέντρωσης μίγματα αιθανόλης συμβάλλουν στη μείωση των εκπομπών μονοξειδίου του αζώτου (NO) σε ποσοστό μεγαλύτερο του 20%. 9. Σαν ενισχυτής των αριθμών οκτανίων, μπορεί να μειώσει κατά 50% ή και περισσότερο, τις εκπομπές του βενζολίου και του βουταδιενίου, τα οποία είναι καρκινογόνα. 10. Η αιθανόλη ανήκει στις ανανεώσιμες πηγές ενέργειας, λόγω της προέλευσης της από τη βιομάζα 11. Οδηγεί σε αύξηση του αριθμού των οκτανίων της βενζίνης με χαμηλό κόστος. 12. Επιτυγχάνεται καλύτερη απόδοση κινητήρα, λόγω υψηλότερης συμπίεσης και καθαρότερο σύστημα καύσης. 13. Παρατηρείται μείωση εξάρτησης των κρατών από τα ορυκτά καύσιμα (Πίνακας 1.2). 14. Η παραγωγή της είναι εύκολη ακόμα και σε οικογενειακή κλίμακα, αποδίδοντας 34% περισσότερη ενέργεια από αυτή που χρειάζεται για την παραγωγή της. 15

20 Πίνακας 1.2 Παγκόσμια παραγωγή αιθανόλης ανά χώρα ( Παγκόσμια παραγωγή αιθανόλης ανά χώρα (Million Gallons) ΧΩΡΕΣ Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής Βραζιλία Ευρώπη Κίνα Καναδάς Υπόλοιπος κόσμος ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ Μειονεκτήματα βιοαιθανόλης Παρόλο που η χρήση της καύσιμης αιθανόλης έχει αρκετά πλεονεκτήματα, υπάρχει και η άποψη που επισημαίνει ότι η χρήση της δεν θα μπορέσει να λειτουργήσει θετικά. Πιο συγκεκριμένα, σύμφωνα με τον Παπανικολάου, (2006): 1. Η βιομάζα η οποία έχει φυτική προέλευση, πρέπει να χρησιμοποιηθεί ως τροφή προκειμένου να καλυφθούν οι διαρκώς αυξανόμενες ανάγκες για πρώτες ύλες στη διατροφή, από το να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή αιθανόλης. 2. Το ενεργειακό περιεχόμενο της αιθανόλης, ισοδυναμεί με τα 2/3 του αντίστοιχου της βενζίνης. Συνεπώς χρειάζεται περισσότερη αιθανόλη για να καλυφθεί η ίδια απόσταση από ένα όχημα. 3. Το κόστος παραγωγής αιθανόλης είναι υψηλότερο από το κόστος της βενζίνης, με τα σημερινά δεδομένα. 4. Υπάρχει η πεποίθηση ότι η μείωση των εκπομπών δεν είναι σημαντική και συνεισφέρει ελάχιστα στη βελτίωση της κατάστασης του περιβάλλοντος. 5. Είναι απαραίτητη η κρατική υποστήριξη, ενημέρωση του κοινού. 16

21 2.ΜΙΚΡΟΦΥΚΗ 2.1 Γενικά για τα μικροφύκη Τα μικροφύκη συγκαταλέγονται στους ταχύτερα αναπτυσσόμενους φωτοσυνθετικούς οργανισμούς οι οποίοι εκτός από την κατανάλωση διοξειδίου του άνθρακα είναι από τους πιο σημαντικούς παραγωγούς οξυγόνου στη γη. Η βιομάζα των μικροφυκών περιέχει περίπου 50% άνθρακα κατά ξηρό βάρος (Chisti, 2007). Λαμβάνοντας υπόψη την ανάπτυξη των μικροφυκών και την ικανότητα τους να μετατρέπουν την ηλιακή σε χημική ενέργεια μέσω του σχηματισμού ενώσεων άνθρακα από το ατμοσφαιρικό διοξείδιο του άνθρακα, θεωρούνται μια από τις πιο σημαντικές πηγές για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Η παραγωγή βιοκαυσίμων από τα μικροφύκη είναι εμπορικά βιώσιμη, επειδή είναι οικονομικά ανταγωνιστική σε σχέση με τα ορυκτά καύσιμα, δεν απαιτεί επιπλέον έκταση για καλλιέργεια και βελτιώνει την ποιότητα του αέρα απορροφώντας το διοξείδιο του άνθρακα της ατμόσφαιρας (Medipally et al, 2014). Επιπλέον, τα μικροφύκη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρώτη ύλη σε ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών καθώς και μεταβολικών προϊόντων, όπως είναι τα συμπληρώματα διατροφής, τα ένζυμα, οι φαρμακολογικές ουσίες, η βιομάζα, τα λιπίδια, οι χρωστικές ουσίες, οι τοξίνες, και τα πολυμερή. Από την άλλη πλευρά όμως, η καλλιέργεια των μικροφυκών είναι μια δαπανηρή διαδικασία λόγω των μεγάλων ποσοτήτων νερού, ανόργανων θρεπτικών συστατικών (κυρίως αζώτου και φωσφόρου), και του διοξειδίου του άνθρακα που απαιτούνται. Παρά το γεγονός ότι το σύνολο της παραγωγής βιοκαυσίμων από μικροφύκη, (συμπεριλαμβανομένης της επιλογής των ειδών, τις συνθήκες καλλιέργειας, της καταπολέμησης των παρασίτων, της συγκομιδής, της παραγωγής και της επεξεργασίας των λιπιδίων), έχει μελετηθεί εκτενώς κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, το κόστος παραγωγής είναι πολύ υψηλό για την εκβιομηχάνιση, και η τιμή του βιοντίζελ από μικροφύκη παραμένει εντυπωσιακά υψηλότερη από εκείνη του κανονικού ντίζελ (Chen et al, 2015). 17

22 2.2 Βιολογία των μικροφυκών Τα φύκη (algae) έχουν αναγνωριστεί ως μία από τις αρχαιότερες μορφές ζωής. Ο όρος «alga,-ae» προέρχεται από τη λατινική λέξη που σημαίνει «θαλάσσιο γρασίδι». «Φύκος» είναι η ελληνική λέξη για τα άλγη, και η μελέτη τους λέγεται φυκολογία (Bεργίνη, 2014). Τα μικροφύκη είναι είτε ευκαρυωτικοί είτε προκαρυωτικοί φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί οι οποίοι μπορούν να αναπτύσσονται γρήγορα και να επιβιώνουν σε δυσμενείς συνθήκες που επικρατούν στο περιβάλλον τους, λόγω της ιδιαίτερης δομής τους. Τα φύκη είναι μια μεγάλη πολυφυλετική κατηγορία μονοκύτταρων ή πολυκύτταρων οργανισμών τα οποία περιλαμβάνουν μαστιγωτές, κοκκοειδείς, ή παλμελοειδείς μορφές αλλά και μεγάλους αποικιακούς σχηματισμούς με νήματα, μικροθαλλούς ή πιο περίπλοκες συσσωματώσεις (Κόλλιας, 2013). Τα προκαρυωτικά κύτταρα (κυανοβακτήρια) δεν περιλαμβάνουν μεμβρανώδη οργανίδια (πλαστίδια, μιτοχόνδρια, πυρήνες, σύμπλεγμα Golgi, μαστίγια) και είναι παρόμοια με τα βακτήρια. Σε αντίθεση, τα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν μεμβρανώδη οργανίδια τα οποία ελέγχουν τις λειτουργίες του κυττάρου, επιτρέποντας τους να επιβιώσουν και να αναπαραχθούν (Brennan and Owende, 2009). Ο όρος «φύκη» περιλαμβάνει δύο μεγάλες μορφολογικές κατηγορίες: τα μακροφύκη (macroalgae), συνήθως είναι θαλάσσια είδη, και τα μικροφύκη (microalgae). Το μέγεθος είναι το κριτήριο της διάκρισης μεταξύ των δύο αυτών κατηγοριών. Τα μακροφύκη έχουν μήκος μερικών εκατοστών, το οποίο σε κάποιες περιπτώσεις μπορεί να φτάσει και πολλά μέτρα (50-70) όπως στα γιγάντια Φαιοφύκη (καφέ φύκη). Αντίθετα, το μήκος των μικροφυκών κυμαίνεται μm, τα μονοκύτταρα φύκη περίπου μm, ενώ οι νηματώδεις πολυκύτταροι σχηματισμοί όπως είναι το κυανοβακτήριο Spirulina platensis κυμαίνεται έως κάποιες εκατοντάδες μm. (Markou et al., 2010). Οι βασικότερες ομάδες μικροφυκών ανάλογα με τη σύνθεση των χρωστικών, τον κύκλο ζωής και τη βασική κυτταρική δομή τους είναι: τα Χλωροφύκη (Chlorophyta), τα Πρασινοφύκη (Prasinophytes), τα Ετεροκοντόφυτα, (Heterokontophyta) με κύριες υποδιαιρέσεις τα Χρυσοφύκη (Chrysophyceae), τα Διάτομα (Bacillariophyceae ή Diatomeae), τα Ευστιγματοφύκη (Eustigmatophyceae) και τα Ραφιδοφύκη (Raphidophytes), τα Απτόφυτα (Haptophytes, Prymnesiophyceae), τα Κρυπτοφύκη (Cryptophyceae), τα Δινομαστιγωτά (Dinophyta) και τα Κυανοβακτήρια (Cyanobacteria). 18

23 Τα μικροφύκη βρίσκονται σε όλα τα οικοσυστήματα του πλανήτη Γη. Δεν εντοπίζονται μόνο στα υδάτινα οικοσυστήματα (γλυκό, υφάλμυρο,θαλασσινό νερό και στις επιφάνειες των βράχων), αλλά εντοπίζονται και στα οικοσυστήματα του εδάφους και ζουν είτε μεμονωμένα είτε κατά ομάδες. Τα φύκη διαθέτουν απλές αναπαραγωγικές δομές, δεν διαθέτουν άνθη ή καρπούς καθώς επίσης δεν έχουν βλαστούς, πραγματικά φύλλα και ρίζες. Στα φύκη εντοπίζονται ειδικές ενώσεις στο κύτταρό τους, οι οποίες έχουν φωτοχημικές ιδιότητες, δηλαδή διάφορες χρωστικές ουσίες οι οποίες απορροφούν μια περιοχή του φάσματος του ηλιακού φωτός. Το χρώμα των φυκών οφείλεται στα διαφορετικά είδη χλωροφύλλης, a, b και c αλλά και στις καροτενοειδείς χρωστικές (Bεργίνη, 2014). Όσον αφορά το μεταβολισμό τους, τα μικροφύκη μπορεί να είναι είτε αυτότροφα είτε ετερότροφα. Τα αυτότροφα για την ανάπτυξή τους χρειάζονται ανόργανες ενώσεις όπως διοξείδιο του άνθρακα και άλατα καθώς και μια πηγή φωτός, ενώ τα ετερότροφα είναι μη φωτοσυνθετικά και χρειάζονται μια εξωτερική πηγή με οργανικές ενώσεις, όπως επίσης και θρεπτικά συστατικά ως πηγή ενέργειας. Κάποια φωτοσυνθετικά φύκη απαντώνται ως μιξότροφα, τα οποία έχουν την ικανότητα να φωτοσυνθέτουν ενώ παράλληλα χρειάζονται μια εξωτερική πηγή οργανικών θρεπτικών (Brennan and Owende, 2009). Υπάρχει η εκτίμηση ότι υπάρχουν περισσότερα από διαφορετικά είδη μικροφυκών στον πλανήτη, όμως μόνο τα από αυτά έχουν μελετηθεί (Κόλλιας, 2013). Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν κυανοβακτήρια τα οποία αποτελούν μια ιδιαίτερη κατηγορία μικροφυκών, συνεπώς αξίζει να αναφερθούμε σε αυτά λίγο περισσότερο. 2.3 Κυανοβακτήρια Τα κυανοβακτήρια γνωστά και ως μπλε-πράσινα φύκη εμφανίσθηκαν πριν 3500 δισεκατομμύρια χρόνια και είναι μια ομάδα κατά gram-αρνητικών προκαρυωτικών οργανισμών που παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλομορφία. Η ποικιλομορφία τους μπορεί να κυμανθεί από μονοκύτταρους μέχρι και πολυκύτταρους οργανισμούς, να σχηματίζει διακλαδισμένα νημάτια ή μπορεί το σχήμα τους να είναι κοκκοειδές, μπορεί να μην έχουν χρώμα ή να είναι έντονα χρωματισμένα. Επιπλέον μπορεί να είναι αυτότροφα ή ετερότροφα, θερμόφιλα ή ψυχρόφιλα, αλκαλόφιλα ή οξύφιλα και 19

24 να έχουν τη δυνατότητα να εμφανίζονται σχεδόν σε κάθε βιότοπο στη γη είτε πρόκειται για θαλασσινά, γλυκά ή υπεράλμυρα νερά (αλυκές). Ακόμη μπορούν να βρίσκονται τόσο σε ελεύθερη διαβίωση όσο και ως ενδοσυμβιωτές. Η διαφορά των κυανοβακτηρίων σε σχέση με τα υπόλοιπα βακτήρια είναι ότι πρόκειται για φωτότροφους οξυγονο-αναπαραγωγικούς οργανισμούς. Τα κυανοβακτήρια έχουν πολύ μικρό μέγεθος, αλλά απαντώνται συχνά ως μεγάλες αποικίες ή ως στρώματα. Τα κοκκοειδή είδη εμφανίζονται ως μονοκύτταροι οργανισμοί, ως αποικίες ή μάζες που έχουν διάφορα σχήματα στις οποίες τα κύτταρα διατάσσονται σε σειρές με αποτέλεσμα να σχηματίζουν μια επίπεδη πλάκα, ή ακτινικά σε σφαιρικές αποικίες. Τα τριχώματα είναι σειρές κυττάρων που δημιουργούνται από τις νηματώδεις μορφές. Τα κυανοβακτήρια παρουσιάζουν αρκετά πλεονεκτήματα για την παραγωγή βιοκαυσίμων, λαμβάνοντας υπόψη την εύκολη γενετική χειραγώγηση προκειμένου να αυξηθεί η φωτοσυνθετική τους ικανότητα και ο γρήγορος ρυθμός ανάπτυξής τους (Thajuddin and Subramanian, 2005). Κάποια από τα είδη κυανοβακτηρίων που χρησιμοποιούνται εκτενώς στη βιβλιογραφία ανήκουν στα γένη των Spirulina sp., Oscillatoria sp., και Microcystis sp., (Bahadar and Bilal Khan, 2013). 2.4 Φάσεις κυτταρικής ανάπτυξης μικροφυκών Η κυτταρική ανάπτυξη των μικροφυκών περιλαμβάνει πέντε φάσεις οι οποίες είναι: 1. η λανθάνουσα φάση (φάση επώασης) 2. η εκθετική φάση 3. η φάση του φθίνοντα ρυθμού ανάπτυξης 4. η στατική φάση 5. η φάση θανάτου Κατά τη διάρκεια της λανθάνουσας φάσης πραγματοποιείται αρκετά μικρή αύξηση της πυκνότητας της καλλιέργειας. Κατά τη φάση αυτή ο κυτταρικός μεταβολισμός προσπαθεί να προσαρμοστεί στην διαδικασία της ανάπτυξης. Κατά την εκθετική φάση, παρουσιάζεται εκθετική αύξηση σε σχέση με το χρόνο της πυκνότητας των κυττάρων. Στη φάση του φθίνοντα ρυθμού ανάπτυξης, 20

25 παρουσιάζεται μείωση του ρυθμού της κυτταρικής ανάπτυξης. Οι παράγοντες οι οποίοι οφείλονται για τη συγκεκριμένη μείωση είναι τα θρεπτικά συστατικά, το φως, το ph, το διοξείδιο του άνθρακα καθώς και άλλοι φυσικοχημικοί παράγοντες. Στην στατική φάση επικρατεί ισορροπία της δράσης των περιοριστικών παραγόντων και του ρυθμού ανάπτυξης με άμεσο αποτέλεσμα τα κύτταρα να έχουν σταθερή πυκνότητα. Τέλος, κατά τη φάση του θανάτου, η ποιότητα του νερού υποβαθμίζεται και τα θρεπτικά συστατικά εξαντλούνται. Η πυκνότητα των κυττάρων μειώνεται όλο και περισσότερο και τελικά η καλλιέργεια καταρρέει (Κόλλιας,2013). Σχήμα 2.1 Οι φάσεις της κυτταρικής ανάπτυξης των μικροφυκών (Κόλλιας, 2013). 2.5 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη των μικροφυκών Οι καλλιέργειες των μικροφυκών αποτελούν πολύπλοκα συστήματα όπου αβιοτικοί και βιοτικοί παράγοντες επηρεάζουν την ανάπτυξή τους. Παρακάτω δίνονται αναλυτικά οι εν λόγω παράγοντες: 1. Φωτισμός: Η ένταση, η διάρκεια καθώς και η ποιότητα του φωτισμού είναι παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη των μικροφυκών. Το φάσμα του φωτός πρέπει να είναι επιλεγμένο με τέτοιο τρόπο που να αξιοποιείται από τα μικροφύκη για την ανάπτυξη τους και κυμαίνεται μεταξύ nm (ενεργή φωτοσυνθετική ακτινοβολία). Τα είδη των μικροφυκών περιέχουν σε διαφορετικές αναλογίες τις διάφορες φωτοσυνθετικές χρωστικές ουσίες και ως εκ τούτου αξιοποιούν λιγότερο ή περισσότερο διαφορετικά μήκη κύματος. (Markou et al., 2010). Κατά τη διάρκεια της φωτοσύνθεσης η ηλιακή ενέργεια μετατρέπεται σε χημική ενέργεια με αποτέλεσμα να παράγονται υδατάνθρακες με τη συμβολή του διοξειδίου του άνθρακα και του νερού. O 21

26 φωτισμός θεωρείται από τους πιο καθοριστικούς παράγοντες για την ανάπτυξη. Η αύξηση πέρα από το όριο της τιμής της έντασης του φωτός, συμβάλλει στη μείωση του ρυθμού ανάπτυξης της βιομάζας. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται φωτοαναστολή. Όταν οι εντάσεις φωτός είναι μεγαλύτερες από τα επίπεδα στα οποία ο ρυθμός ανάπτυξης είναι μέγιστος τότε η ανάπτυξη των μικροφυκών φωτοαναστέλεται (Chisti, 2007). Η φωτοπερίοδος είναι μία ακόμα παράμετρος η οποία επηρεάζει την ανάπτυξη καθώς επίσης και την απόδοση των φωτοβιοαντιδραστήρων διότι διαφέρουν οι απαιτήσεις σε φωτισμό των διαφορετικών ειδών (Mata et al., 2012). 2. Θερμοκρασία: Η θερμοκρασία θεωρείται ο καθοριστικότερος παράγοντας μετά τον φωτισμό για την ανάπτυξη των μικροφυκών. Πολλά μικροφύκη έχουν τη δυνατότητα να αντέχουν σε θερμοκρασίες μέχρι και 15 o C, ενώ η βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξής τους είναι C. Η θερμοκρασία έχει συνεργιστική δράση με τον φωτισμό. Η πλειονότητα των μικροφυκών αναπτύσσεται μεταξύ C, όμως υπάρχουν και θερμόφιλα στελέχη τα οποία μπορούν να αναπτυχθούν και σε θερμοκρασίες ως C (Markou et al., 2010). 3. Θολερότητα: Η θολερότητα διαδραματίζει σημαίνοντα ρόλο στην καλλιέργεια μικροφυκών διότι επηρεάζει τη διάχυση του φωτός μέσα σε αυτή. Η ομογενοποίηση και η ανάμειξη της καλλιέργειας βοηθούν στη σωστή κατανομή των θρεπτικών, τη μεταφορά του διοξειδίου του άνθρακα καθώς και την κυκλοφορία των κυττάρων των μικροφυκών από το σκοτάδι στη ζώνη του φωτός. Η χαμηλή τιμή της θολερότητας έχει ως αποτέλεσμα τη γρήγορη ανάμειξη καθώς και τη διαπερατότητα του φωτός σε ολόκληρη την καλλιέργεια. Από την άλλη πλευρά, η υψηλή θολερότητα μπορεί να προκαλέσει παρεμπόδιση στο φως αλλά και τη καταστροφή των κυττάρων λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε βιομάζα. (Bεργίνη, 2014). 4. Αλατότητα: Kάθε είδος μικροφύκους έχει διαφορετικό επιθυμητό εύρος αλατότητας. Για τα είδη που έχουν ανθεκτικότητα στην αλατότητα, η οποία πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 20 και 24 g/l, παρόλα αυτά η αυξημένη αλατότητα επηρεάζει αρνητικά την ανάπτυξη των μικροφυκών επιδρώντας άμεσα στο σύστημα της φωτοσύνθεσης (Markou et al., 2010). 5. ph: Τα περισσότερα μικροφύκη αναπτύσσονται σε περιβάλλοντα με ph που κυμαίνεται μεταξύ 7-9. Παρόλα αυτά υπάρχουν είδη που είναι οξύφιλα 22

27 (όπως το Chlamydomonas acidophila) αλλά και αλκαλόφιλα (όπως το Arthrospira). Απότομη αλλαγή στο ph μπορεί να έχει καταστροφικές επιπτώσεις στην καλλιέργεια (Markou et al., 2010). 6. CO 2 : Το διοξείδιο του άνθρακα αποτελεί την κύρια πηγή άνθρακα, ο οποίος μαζί με το άζωτο, το φώσφορο και το κάλιο χρησιμοποιούνται ως θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη των φυκών. Η επίδραση του στην ανάπτυξη των μικροφυκών έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση της παραγωγής βιομάζας και της συσσώρευσης λιπιδίων με την αύξηση της περιεκτικότητας του CO 2 (Bεργίνη, 2014). 7. Θρεπτικά συστατικά: Τα μικροφύκη προκειμένου να πολλαπλασιαστούν εκτός από την ενέργεια αλλά και τον άνθρακα χρειάζονται και άλλα ανόργανα στοιχεία τα οποία είναι αναγκαία για τις διάφορες μεταβολικές κυτταρικές διεργασίες. Τα κυριότερα θρεπτικά στοιχεία που είναι αναγκαία για την ανάπτυξη των μικροφυκών, είναι το άζωτο, ο φώσφορος και το κάλιο. Αναγκαία αλλά σε μικρότερες ποσότητες είναι στοιχεία όπως το θείο, το πυρίτιο, το ασβέστιο, το μαγνήσιο, ο σίδηρος, το μολυβδαίνιο, το μαγγάνιο, το νικέλιο, το βόριο, το χλώριο, ο ψευδάργυρος, ο χαλκός, και το κοβάλτιο (Christenson and Sims, 2011). Σε περιπτώσεις θρεπτικής στέρησης είναι γνωστό ότι τα μικροφύκη επιβραδύνουν την ανάπτυξή τους και τείνουν να χρησιμοποιούν τα διαθέσιμα θρεπτικά συστατικά για την παραγωγή λιπιδίων ή υδατανθράκων αντί πρωτεϊνών. Συνήθως, μείωση της συγκέντρωσης αζώτου στο μέσο της καλλιέργειας οδηγεί στην σύνθεση μεγαλύτερων ποσοτήτων λιπιδίων και υδατανθράκων (Mata et al., 2012). 2.6 Επεξεργασία υγρών αποβλήτων με μικροφύκη Οι οργανικές και οι ανόργανες ουσίες οι οποίες απελευθερώνονται στο περιβάλλον απόρροια των γεωργικών, οικιακών και βιομηχανικών δραστηριοτήτων συμβάλλουν στη περιβαλλοντική ρύπανση. Η πρωτοβάθμια και η δευτεροβάθμια επεξεργασία των λυμάτων αυτών πραγματοποιείται για την απομάκρυνση των υλικών τα οποία καθιζάνουν εύκολα καθώς και για την οξείδωση της οργανικής ύλης. Ωστόσο, το τελικό αποτέλεσμα είναι πολλές φορές μια εκροή με υψηλές συγκεντρώσεις ανόργανου αζώτου και φωσφόρου, που όταν απορρίπτεται σε φυσικά 23

28 υδάτινα σώματα δημιουργεί προβλήματα ευτροφισμού καθώς ρύπανσής του από οργανικά και βαρέα μέταλλα. Η καλλιέργεια μικροφυκών μπορεί να αποτελέσει μια τριτοταγής βιολογική επεξεργασία η οποία μπορεί να συνεισφέρει στην περαιτέρω μείωση του απορριπτόμενου φορτίου στους εκάστοτε υδάτινους αποδέκτες. Τα μικροφύκη έχουν την ικανότητα να χρησιμοποιούν το ανόργανο Ν και P για να αναπτυχθούν, να απομακρύνουν τα βαρέα μέταλλα, καθώς και ορισμένες τοξικές οργανικές ενώσεις (Cai et al., 2013). Τα μικροφύκη μπορούν να επεξεργαστούν διάφορα απόβλητα όπως αστικά, οικιακά, ζωικά, αγροτοβιομηχανικά, βιομηχανικά, εκροές από εργοστάσια μεταποίησης τροφίμων καθώς και άλλα γεωργικά απόβλητα, απομακρύνοντας σε μεγάλο βαθμό το οργανικό φορτίο και τους παθογόνους μικροοργανισμούς που περιέχονται σε αυτά. (Muñoz and Guieysse, 2006) (Abdel-Raouf et al., 2012). Στον Πίνακα 2.1 παρουσιάζονται ενδεικτικές χρήσεις των αποβλήτων με μικροφύκη. Πίνακας 2.1 Επεξεργασία διαφορετικών αποβλήτων με μικροφύκη Είδος αποβλήτου Είδος μ/ο N P COD Αναφορά Οικιακά απόβλητα Απόβλητα χοιροστασίου Απόβλητα τυροκομείου Οικιακά απόβλητα Απόβλητα οινοποιείου Απόβλητα οινοποιείου Απόβλητα οινοποιείου Απόβλητα τυροκομείου Chlorella sp 93% 70% Wang et al 2010 Phormidium bonheri 80% de la Noue and Basséres 1989 P. bohneri 69% Markou, 2010 S. obliquus 100% 98% Brennan and Owende, 2009 A.platensis 90% Casazza, 2016 C. vulgaris 100% Casazza, % 98.2% Travieso,2008 Choricystis sp. 97.3% 99.7% 92.3% Tsolcha et al., Αστικά απόβλητα Η αστικοποίηση έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μεγαλύτερων ποσοτήτων αστικών λυμάτων. Τα αστικά απόβλητα κυρίως τα ακατέργαστα περιέχουν μεγάλες ποσότητες βαρέων μετάλλων, όπως είναι ο ψευδάργυρος, ο μόλυβδος και ο χαλκός, 24

29 καθώς επίσης και παθογόνους μικροοργανισμούς. Τα αστικά λύματα διαχειρίζονται σε τρία στάδια την πρωτοβάθμια, τη δευτεροβάθμια και την τριτοβάθμια επεξεργασία. Τα στερεά υλικά τα οποία καθιζάνουν ή βρίσκονται στην επιφάνεια, απομακρύνονται κατά την πρωτοβάθμια επεξεργασία με φυσικές ή χημικές μεθόδους. Τα διαλυμένα οργανικά υλικά απομακρύνονται κατά τη διάρκεια της δευτεροβάθμιας επεξεργασίας με βιολογικές ή χημικές μεθόδους, τα διαλυμένα ανόργανα συστατικά, όπως είναι το άζωτο και ο φωσφόρος απομακρύνονται στην τριτοβάθμια επεξεργασία μέσω διήθησης, τεχνητών λιμνών, προσρόφησης άνθρακα, και διαχωρισμό μεμβρανών. Τα αστικά απόβλητα είναι τα παλαιότερα και συχνότερα χρησιμοποιούμενα απόβλητα που για την επεξεργασία τους έγινε χρήση μικροφυκών (Oswald et al., 1957) (Cai et al, 2013) (Πίνακας 2.1). Σε έρευνα των Wang et al. (2010) πραγματοποιήθηκε επεξεργασία οικιακών αποβλήτων με το μικροφύκος Chlorella sp. και σημειώθηκε απομάκρυνση του P και του N σε ποσοστό έως 70% και 93%, αντίστοιχα. Σημαντικές απομακρύνσεις Ν και του P από αστικά λύματα (100% και 98%, αντίστοιχα) επιτεύχθηκαν επίσης και από τους ar ne et al. (2000), χρησιμοποιώντας το στέλεχος Scenedesmus obliquus κάτω από σταθερή θερμοκρασία των 26 0 C, συνεχή ανάδευση και υδραυλικό χρόνο παραμονής 94 ωρών Αγροτοβιομηχανικά απόβλητα Τα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα είναι πλούσια σε οργανικούς και ανόργανους ρύπους και προκαλούν περιβαλλοντικά προβλήματα όπως το φαινόμενο του ευτροφισμού, τη ρύπανση των υπόγειων νερών καθώς και την επιφανειακή ρύπανση. Η κοπριά των ζώων μπορεί να αποτελεί την κύρια πηγή των οργανικών αποβλήτων, ωστόσο υπάρχουν και άλλες σημαντικές ποσότητες οι οποίες προέρχονται από τη βιομηχανία τροφίμων, όπως τα απόβλητα οινοποιείου και τα γαλακτοκομικά απόβλητα. Οι κύριες μέθοδοι για την επεξεργασία αυτών των αποβλήτων είναι η αερόβια και η αναερόβια χώνευση. Ωστόσο, αυτές οι τεχνικές επιτυγχάνουν την αφαίρεση των οργανικών ρύπων και ελάχιστα των ανόργανων ρύπων. Οι αυξημένες συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών αλλά και οργανικού φορτίου σε αυτά τα λύματα, δεν επιτρέπουν την χρήση μονοκαλλιεργειών μικροφυκών. Από την άλλη η αφαίρεση τους μπορεί να επιτευχθεί με μεγαλύτερη επιτυχία με την χρήση μεικτής καλλιέργειας, δηλαδή χρήση μίγματος διαφόρων ειδών αυτότροφων 25

30 μικροοργανισμών (μικροφυκών) ή με τη συνεργιστική δράση αυτότροφων και ετερότροφων (μικροφύκη και βακτήρια). Κάθε ένα είδος από τη μεικτή καλλιέργεια απομακρύνει συγκεκριμένα ανόργανα συστατικά και ως εκ τούτου η συνολική απομάκρυνση μπορεί να είναι υψηλότερη (Markou et al., 2010). Στη συνέχεια αναφέρονται ενδεικτικά, κάποια είδη αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων στα οποία μελετήθηκε η επεξεργασία τους με χρήση μικροφυκών Γαλακτοκομικά απόβλητα Τα γαλακτοκομικά απόβλητα παρουσιάζουν υψηλές συγκεντρώσεις COD και BOD, περιέχουν φωσφόρο και μέταλλα καθώς και διαλυόμενα ή αιωρούμενα στερεά. Τα νερά που προέρχονται από τον καθαρισμό των δεξαμενών παραγωγής παράγουν επίσης μεγάλες ποσότητες αποβλήτων. Τα απόβλητα τα οποία περιέχουν τους περισσότερους οργανικούς ρύπους προέρχονται από τον ορρό γάλακτος, τα οποία έχουν σημαντικά υψηλά επίπεδα αζώτου και φωσφόρου. Σε έρευνα των Blier et al. (1995) χρησιμοποιήθηκε το μικροφύκος Phormidium bohneri στην τριτοβάθμια επεξεργασία εκροών ορρού γάλακτος, όπου με την πάροδο τεσσάρων ημερών καλλιέργειας παρατηρήθηκε ολική απομάκρυνση της αμμωνίας και 69% απομάκρυνση φωσφόρου. Επίσης, σε έρευνα των Woertz et al. (2009) χρησιμοποιήθηκε πολυκαλλιέργεια με κυρίαρχο στέλεχος το Scenedesmus sp. για την επεξεργασία γαλακτοκομικών αποβλήτων. Έπειτα από 15 ημέρες η απομάκρυνση της αμμωνίας και των ορθοφωσφορικών που επιτεύχθηκε ήταν 96% και 99%, αντίστοιχα Απόβλητα βοοειδών Τα απόβλητα βοοειδών περιέχουν σημαντική ποσότητα αζώτου και υψηλή περιεκτικότητα σε οργανικούς ρύπους. Ενδεικτικά, έχει χρησιμοποιηθεί το κυανοβακτήριο Spirulina σε καλλιέργεια με απόβλητα βοοειδών που αρχικά είχαν υποστεί αναερόβια χώνευση (Lincoln et al.,1996). Το κυανοβακτήριο αναπτύχθηκε γρήγορα με παραγωγικότητα βιομάζας 70 mg/(l d) για τα εργαστηριακά πειράματα και 24 mg/(ld) για τις υπαίθριες καλλιέργειες. Παράλληλα, επιτεύχθηκε απομάκρυνση αμμωνίας έως και 99%, με ρυθμό απομάκρυνσης 24 mg/(ld). 26

31 Απόβλητα χοιροστασίου Τα απόβλητα των χοίρων αποτελούνται κυρίως από τα κόπρανα, τα ούρα και τα νερά πλύσης, τα οποία σχηματίζουν ένα υλικό πολτού που περιέχει υψηλές ποσότητες οργανικών και ανόργανων συστατικών. Στην έρευνα των de la Noue and Basséres (1989) χρησιμοποιήθηκε το κυανοβακτήριο Phormidium bonheri για την επεξεργασία αποβλήτου χοιροστασίου το οποίο είχε αρχικά υποστεί αναερόβια χώνευση και εξετάστηκε σε θερμοκρασιακό εύρος 10 έως 20 o C. Το κυανοβακτήριο αποκρίθηκε θετικά στην αύξηση της θερμοκρασίας αυξάνοντας την παραγωγικότητα της βιομάζας. Η μεγαλύτερη μείωση του χημικά απαιτούμενου οξυγόνου (Chemical Oxygen Demand - COD) ήταν περίπου 80% και επιτεύχθηκε στους 20 o C. Η αμμωνία, το άζωτο και ο φώσφορος απομακρύνθηκαν εντελώς μετά από 12 ημέρες. Σε άλλη έρευνα με απόβλητο χοίρων που είχε υποστεί αερισμό χρησιμοποιήθηκε καλλιέργεια του στελέχους Spirulina maxima. Η Spirulina αναπτύχθηκε τόσο σε αραιωμένο όσο και μη αραιωμένο απόβλητο, παρουσιάζοντας αντοχή στην συγκέντρωση των ανόργανων συστατικών που περιέχονταν σε αυτό. Ωστόσο, η μέγιστη απομάκρυνση του αζώτου (75%) και του φωσφόρου (53%) επιτεύχθηκε με αραίωση 50% (Markou et al., 2010) Πτηνοτροφικά απόβλητα Tα πτηνοτροφικά απόβλητα αποτελούνται από κοπριά και απόβλητα σφαγείων. Τα απόβλητα από τα πουλερικά περιέχουν υψηλές ποσότητες ολικού αζώτου και για το λόγο αυτό απαιτείται αραίωσή τους πριν χρησιμοποιηθούν ως μέσο καλλιέργειας. Ωστόσο, συνήθως γίνεται χρήση του λύματος που προκύπτει από την αναερόβια χώνευση πτηνοτροφικών αποβλήτων για ανάπτυξη μικροφυκών και παραγωγή βιομάζας (Singh et al., 2011). Να αναφερθεί πως οι αναφορές επεξεργασίας πτηνοτροφικών αποβλήτων με χρήση μικροφυκών είναι ελάχιστες (Bradford et al., 2008) Απόβλητα ζυθοποιείου-οινοποιείου 27

32 Η ζυθοποιία παράγει μεγάλες ποσότητες αποβλήτων με υψηλό οργανικό φορτίο. Υπάρχουν τεχνολογίες για την επεξεργασία των αποβλήτων ζυθοποιίας, με κριτήριο επιλογής τεχνολογίας την ευελιξία στις συνεχείς διακυμάνσεις του οργανικού φορτίου καθώς της οικονομικής βιωσιμότητά τους (Mata et al., 2012). Τα απόβλητα οινοποιείου περιέχουν συγκεντρώσεις ολικού αζώτου και φωσφόρου ικανοποιητικές για την καλλιέργεια μικροφυκών, καθώς και βιοαποδομήσιμους οργανικούς άνθρακες που δεν είναι τοξικοί για τα μικροφύκη (φαινόλες). Τα απόβλητα αυτά ωστόσο χαρακτηρίζονται από χαμηλό ph, πιθανώς λόγω της παρουσίας οργανικών οξέων. Τα εν λόγω απόβλητα συνήθως αρχικά επεξεργάζονται με αναερόβια χώνευση, ώστε να μειωθεί το υψηλό οργανικό φορτίο που είναι πηγή οργανικού άνθρακα (Farooq et al., 2012). Να επισημανθεί ότι μέχρι σήμερα αναφορές για χρήση μικροφυκών στην επεξεργασία αποβλήτων οινοποιείου υπάρχουν μόνο εκείνες των Kim et al., (2012) και των Casazza et al., (2016) (Πίνακας 2.1). Ο τελευταίος χρησιμοποίησε απόβλητο οινοποιείου για ανάπτυξη των μικροφυκών Arthospira platensis και Chlorella vulgaris, όπου και πέτυχε μείωση αζώτου μέχρι και 100%. Επίσης, έρευνα πραγματοποιήθηκε και με χρήση συνθετικού αποβλήτου ζυθοποιείου από τους Mata et al., (2012) (με το είδος Scenedesmus obliquus), όπου παρατήρησαν ότι η ανάπτυξη της βιομάζας ενισχυόταν με την χρήση αερισμού. Τα ποσοστά απομακρύνσεων COD και ολικού αζώτου που επετεύχθησαν από τους a a et al., (2012) ήταν 68% και 20%, αντίστοιχα Bιομηχανικά απόβλητα Τα βιομηχανικά απόβλητα περιέχουν περισσότερα βαρέα μέταλλα και λιγότερο φώσφορο ή άζωτο σε σχέση με άλλα υγρά απόβλητα. Η επιλογή των μικροφυκών τα οποία έχουν τη δυνατότητα να απορροφούν μέταλλα είναι σημαντική προκειμένου να προκύψει επιτυχής συσσώρευση και άρα απομάκρυνση των στοιχείων αυτών. Προς το παρόν λίγα είδη μικροφυκών έχουν μελετηθεί ως προς την ικανότητα απορρόφησης μετάλλων. Από την άλλη πλευρά υπάρχουν αρκετές έρευνες οι οποίες αξιολογούν την αφαίρεση φωσφόρου, αζώτου και βαρέων μετάλλων από βιομηχανικά απόβλητα, με ανάπτυξη φυκών (Cai et al., 2013). Στην έρευνα των Chinnasamy et al. (2010) χρησιμοποιήθηκε μιξοτροφική καλλιέργεια για την επεξεργασία αποβλήτου ταπητοποιείας όπου επιτεύχθηκε 6,82% απόδοση σε έλαιο και 96% απομάκρυνση 28

33 των θρεπτικών συστατικών. Στην έρευνα των Wu et al. (2012) χρησιμοποιήθηκε ακατέργαστο απόβλητο από την βιομηχανία χαλιών και επιτεύχθηκε αφαίρεση 100% της αμμωνίας και των νιτρικών αλάτων και 33% του φωσφόρου. 3. ΒΙΟΜΑΖΑ Η οδηγία 2003/30/ΕΚ (Ευρωπαϊκή Επιτροπή,2003) ορίζει ως βιομάζα το βιοαποδομήσιμο κλάσμα προϊόντων, αποβλήτων και καταλοίπων από γεωργικές, δασοκομικές και βιομηχανίες συναφών δραστηριοτήτων, καθώς επίσης και από το βιοαποδομήσιμο κλάσμα των βιομηχανικών και αστικών αποβλήτων. Η βιομάζα συγκαταλέγεται στις ανανεώσιμες πηγές ενέργειας που χαρακτηρίζεται οικονομικά βιώσιμη και φιλική προς το περιβάλλον. Από τα τέλη του 20 ου αιώνα ήταν ανάμεσα στις μεγαλύτερες πηγές ενέργειας (Hall, 1997). Η βιομάζα μέσω της καύσης παράγει θερμότητα και ηλεκτρισμό ή έχει τη δυνατότητα μετατροπής της σε καύσιμο στερεής, υγρής ή αέριας μορφής με τεχνολογίες όπως αλκοολική ζύμωση, βακτηριακή ζύμωση και αεριοποίηση. 3.1 Χαρακτηριστικά βιομάζας Η βιοενέργεια δηλαδή η ενέργεια που παράγεται από τη βιομάζα είναι δευτερογενής ηλιακή ενέργεια. Πρόκειται για μορφή δεσμευμένης και αποθηκευμένης ηλιακής ενέργειας και οφείλεται στη φωτοσύνθεση των φυτικών οργανισμών. Μέσω της φωτοσύνθεσης, η χλωροφύλλη χρησιμοποιώντας το νερό, το διοξείδιο του άνθρακα και ανόργανα στοιχεία από το έδαφος μετασχηματίζει την ενέργεια που προέρχεται από τον ήλιο σε χημική (Τσούτσος, 2004) : ΝΕΡΟ+CO 2 +ΗΛΙΑΚΗ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ+ΑΝΟΡΓΑΝΑ ΑΛΑΤΑ ΒΙΟΜΑΖΑ+ O 2 Η βιομάζα αποτελεί την μοναδική πηγή ενέργειας άνθρακα η οποία μπορεί να υποκαταστήσει τα ορυκτά καύσιμα διότι τα αποθέματά της είναι ικανοποιητικά. 29

34 Επιπλέον πρόκειται για μία πηγή ενέργειας η οποία μπορεί να χαρακτηριστεί ανανεώσιμη γιατί αναπληρώνεται σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η βιομάζα έχει το πλεονέκτημα ότι είναι αποθηκευμένη ενέργεια με χημική μορφή η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί και να μετατραπεί σε μεγάλη ποικιλία προϊόντων, με απλή τεχνολογία και διαφορετικές μεθόδους. Παρόλα αυτά, η βιομάζα σαν μορφή ενέργειας χαρακτηρίζεται από χαμηλό ενεργειακό περιεχόμενο, πολυμορφία σε σχέση με τα ορυκτά καύσιμα εξαιτίας της υψηλής περιεκτικότητας σε νερό, μεγάλη διασπορά και εποχικότητα. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω χαρακτηριστικά, υπάρχουν δυσκολίες στη συλλογή, τη μεταφορά και την αποθήκευσή της με συνέπεια την αύξηση του κόστους μετατροπής της σε μορφή ενέργειας (Γουσγουριώτης, 2005). 3.2 Κατηγορίες βιομάζας Η βιομάζα μπορεί να καταταχθεί σε επιμέρους κατηγορίες όπως: 1. Αγροτο-βιομηχανικές φυτείες (ξυλώδης βιομάζα) 2. Δασικές φυτείες (ξυλώδης βιομάζα) 3. Δένδρα εκτός των δασών (ξυλώδης βιομάζα) 4. Αγροτικές φυτείες (Μη ξυλώδης βιομάζα) 5. Υπολείμματα αγροτικών φυτειών (Μη ξυλώδης βιομάζα) 6. Υπολείμματα βιομηχανικής επεξεργασίας αγροτικών προϊόντων (Μη ξυλώδης βιομάζα) 7. Απόβλητα ζώων και ανθρώπων Η βιομάζα των παραπάνω κατηγοριών έχει πολλές χρήσεις είτε για παραγωγή ενέργειας είτε για παραγωγή τροφίμων. Ανάλογα τη χώρα και τους κοινωνικοοικονομικούς παράγοντες αξιοποιείται αντίστοιχα. Στον παρακάτω Πίνακα 3.1 παρουσιάζονται ορισμένοι τύποι βιομαζών και οι χρήσεις τους στην παραγωγή ενέργειας. Πίνακας 3.1 Παραγωγή βιοενέργειας από διάφορα υποστρώματα βιομάζας Βιομάζα Βιοενέργεια Αναφορά Αλόφυτα Βιοαιθανόλη Zainul Abideen et al., 2011 Απορρίμματα τροφίμων Βιομεθάνιο Patterson et al.,

35 Μικροφύκη Βιοαιθανόλη Ho et al., Πλεονεκτήματα βιομάζας Η χρήση της βιομάζας εμφανίζει ορισμένα πλεονεκτήματα τα οποία αναφέρονται επιγραμματικά ως εξής: 1. Με την καύση της βιομάζας παραμένει σταθερό το ισοζύγιο του διοξειδίου του άνθρακα διότι οι ποσότητες που απελευθερώνονται κατά την καύση, τις δεσμεύουν τα φυτά προκειμένου να δημιουργήσουν βιομάζα. 2. Η απουσία θείου στη βιομάζα περιορίζει σημαντικά τις εκπομπές διοξειδίου του θείου το οποίο είναι υπεύθυνο για την όξινη βροχή. 3. Η αξιοποίηση της βιομάζας συμβάλλει στη μείωση των εισαγομένων καυσίμων και το εμπορικό ισοζύγιο βελτιώνεται. 4. Με την ενεργειακή αξιοποίηση της βιομάζας επιτυγχάνεται η αύξηση της απασχόλησης στις αγροτικές περιοχές, ανάπτυξη εναλλακτικών καλλιεργειών και ανάπτυξη της οικονομίας στις τοπικές κοινωνίες. 3.4 Μειονεκτήματα βιομάζας Ωστόσο, η χρήση της βιομάζας παρουσιάζει και ορισμένα μειονεκτήματα όπως: 1. Η ενεργειακή αξιοποίηση της βιομάζας αντιμετωπίζει δυσκολίες λόγω του αυξανόμενου όγκου και της μεγάλης περιεκτικότητας σε υγρασία συγκρίσει των ορυκτών καυσίμων. 2. Η βιομάζα λόγω της μεγάλης διασποράς και της εποχιακής παραγωγής έχει ως αποτέλεσμα να δημιουργούνται δυσκολίες στην συνεχή τροφοδοσία πρώτων υλών στις μονάδες επεξεργασίας. 3. Ύπαρξη δυσκολιών κατά τη διάρκεια της συλλογής, της μεταφοράς και αποθήκευσης της βιομάζας με αντίκτυπο την αύξηση του κόστους αξιοποίησης. 4. Υψηλό κόστος εξοπλισμού για την μετατροπή της βιομάζας συγκρίσει με τα συμβατικά καύσιμα (Γουσγουριώτης, 2005) 31

36 3.5 Επεξεργασία παραγόμενης βιομάζας Μετά την συγκομιδή της βιομάζας ακολουθεί η επεξεργασία της που μπορεί να περιλαμβάνει σύνθλιψη, υδρόλυση, οζόνωση, θέρμανση ή και αναερόβια χώνευση (Cesaro and Belgiorno, 2015) ; (Segneanu et al., 2013). Οι διαδικασίες αποβλέπουν στη μέγιστη απόδοση ανακτώμενων στοιχείων που θα χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια για την παραγωγή βιοενέργειας. Ακολούθως αναπτύσσονται τα στάδια επεξεργασίας βιομάζας για την παραγωγή βιοαιθανόλης Προεπεξεργασία βιομάζας Οι μέθοδοι οι οποίες χρησιμοποιούνται για την προεπεξεργασία της πρώτης ύλης μπορεί να είναι φυσικοχημικές, φυσικές ή χημικές. Κατά την προεπεξεργασία η ημικυτταρίνη, ως συστατικό των κυττάρων της βιομάζας, διαλυτοποιείται, αυξάνεται η ενεργός επιφάνειά του υλικού και μειώνεται η κρυσταλλικότητά του. (Mosier et al., 2005). Τις τελευταίες δεκαετίες έχει αναφερθεί ένα ευρύ φάσμα μεθόδων προκατεργασίας οι οποίες διακρίνονται σε τέσσερις κατηγορίες (Galbe & Zacchi, 2007; Sánchez & Cardona, 2008; Lee et al., 2008; Tomás - Pejó et al., 2008; Hayes 2009): α. φυσικές (άλεση, κονιορτοποίηση, ακτινοβόληση κτλ), β. χημικές (αλκάλια, αραιό οξύ, οξειδωτικές ενώσεις, οργανικοί διαλύτες κτλ), γ. φυσικοχημικές (προκατεργασία με ατμό, υδροθερμόλυση, υγρή οξείδωση κτλ) δ. βιολογικές, ή ακόμα και συνδυασμός των παραπάνω. α. Φυσική προεπεξεργασία Ο στόχος της άλεσης είναι η μείωση της κρυσταλλικότητάς του λιγνοκυτταρινούχου υλικού και η τροποποίηση της δομής του καθιστώντας το περισσότερο επιδεκτικό στα ένζυμα (κυτταρινάσες). Η άλεση και η μείωση του μεγέθους του υλικού είναι από τις πρώτες προκατεργασίες που εφαρμόστηκαν (Taherzadeh and Karimi, 2008). β. Χημική προεπεξεργασία Η χημική προεπεξεργασία χρησιμοποιεί χημικές ενώσεις όπως είναι οξέα, όζον, υπεροξείδια, αλκάλια, και οργανικούς διαλύτες. Οξέα όπως HCl και H 2 SO 4 χρησιμοποιούνται για την προεπεξεργασία της βιομάζας (Galbe & Zacchi 2007, 32

37 Chandel et al., 2007). Στην αλκαλική προεπεξεργασία προστίθενται αραιές βάσεις (όπως Ca(OH) 2 ή NaOH) στη βιομάζα, οι οποίες αυξάνουν την εσωτερική επιφάνεια του υλικού (Sánchez and Cardona, 2008; Tomás- Pejó et al., 2008 ; Balat et al., 2008; Hayes, 2009). Επιπλέον μπορεί να γίνει χρήση οργανικών διαλυτών ή μιγμάτων νερού και οργανικών διαλυτών με προσθήκη ενός ανόργανου οξέος (H 2 SO 4 και HCl), με αποτέλεσμα τη διάσπαση των εσωτερικών δεσμών της λιγνίνης και της ημικυτταρίνης (Pan et al., 2005; Galbe and Zacchi,2007). γ. Φυσικοχημική προεπεξεργασία Η φυσικοχημική προκατεργασία περιλαμβάνει μεθόδους που αποτελούν συνδυασμό φυσικών και χημικών μεθόδων. Η προκατεργασία με ατμό (s eam pretreatment) είναι μια από τις πλέον χρησιμοποιούμενες μεθόδους προκατεργασίας λιγνινοκυτταρινούχων υλικών (Galbe and Zacchi, 2007; Tomás-Pejó et al., 2008 ; Sánchez and Cardona, 2008; Hayes, 2009). H υδροθερμόλυση (hydrothermolysis, liquid hot-water treatment), είναι μία υδροθερμική κατεργασία στην οποία δεν απαιτείται απότομη αποσυμπίεση και δε χρησιμοποιείται κανένας καταλύτης ή χημικό. Άλλες φυσικοχημικές μέθοδοι περιλαμβάνουν την υγρή οξείδωση (wet oxidation) και την «εκτόνωση ίνας με αμμωνία» (Ammonia fiber explosion, AFEX) (Galbe and Zacchi, 2007). δ. Βιολογικές προκατεργασίες Στις βιολογικές προκατεργασίες χρησιμοποιούνται μικροοργανισμοί, που μπορούν να αποικοδομούν τη λιγνίνη. Η μέθοδος αυτή θεωρείται φιλική για το περιβάλλον, δεν απαιτεί υψηλές θερμοκρασίες και χρήση χημικών. Ο ρυθμός κατεργασίας των βιολογικών μεθόδων είναι χαμηλός προκειμένου να εφαρμοστούν σε βιομηχανική κλίμακα και μέρος της πρώτης ύλης χάνεται λόγω της κατανάλωσής του από τους μικροοργανισμούς (Kumar et al., 2008; Sanchez and Cardona, 2008) Υδρόλυση βιομάζας Μία ευρείας εφαρμογής μέθοδος προκατεργασίας της βιομάζας για παραγωγή βιοαιθανόλης είναι η υδρόλυση για το λόγο αυτό και αναλύεται αναλυτικά στη παρούσα ενότητα. 33

38 Για την μετατροπή των υδατανθράκων σε απλά σάκχαρα, πριν από την παραδοσιακή διαδικασία της ζύμωσης, πραγματοποιείται ευρέως η υδρόλυση με χρήση οξέων. Η επεξεργασία με οξύ είναι αποτελεσματική και απαιτεί χαμηλή κατανάλωση ενέργειας (Schneider et al., 2013). Για να παραχθεί βιοαιθανόλη με χρήση μικροφυκών ως υπόστρωμα ζύμωσης, θα πρέπει οι υδατάνθρακές τους να υδρολυθούν προς μονομερή, δεδομένου ότι οι ζυμομύκητες μπορούν να ζυμώνουν μόνο μονομερή σάκχαρα (Talebnia et al., 2010). Η υδρόλυση μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε χημικά είτε ενζυματικά. Το είδος της υδρόλυσης που θα επιλεχθεί προκειμένου να επιτευχθούν οι μέγιστες αποδόσεις παραγωγής βιοαιθανόλης, εξαρτάται από τον τύπο της βιομάζας. Επίσης, αξίζει να αναφερθεί ότι η χρήση βιολογικών συστημάτων με την παρουσία μυκήτων ή αλκαλικών αντιδραστηρίων οδηγούν σε απώλειες σακχάρων, καθιστώντας τα εν λόγω συστήματα μη ικανοποιητικά για υψηλές αποδόσεις παραγωγής βιοαιθανόλης (Chandel et al., 2007). Συνοπτικά η υδρόλυση πρέπει να στοχεύει στα εξής (Sun and Cheng, 2002): 1. Βέλτιστη εκμετάλλευση της ποσότητας των σακχάρων κατά την υδρόλυση ώστε να μειώνεται η απώλεια σακχάρων. 2. Να αποφεύγεται η παραγωγή παραπροϊόντων τα οποία μπορεί να δράσουν ανασταλτικά στους ζυμομύκητες και την ανάπτυξή τους. 3. Να είναι οικονομική διαδικασία Χημική υδρόλυση Με τη χημική υδρόλυση οι πολυσακχαρίτες εκτίθενται σε χημικό μέσο για ένα χρονικό διάστημα, σε συγκεκριμένη θερμοκρασία, καταλήγοντας στα μονομερή σάκχαρα. Συνήθως, τα οξέα είναι αυτά τα οποία χρησιμοποιούνται στην χημική υδρόλυση, όπως HNO 3, HCl και H 3 PO 4, τα οποία μπορεί να έχουν υψηλότερους ρυθμούς απόδοσης σακχάρων, εντούτοις το H 2 SO 4 εμφανίζει υψηλότερες αποδόσεις στην παραγωγή αιθανόλης (Markou et al., 2012). Γι αυτό το θειικό οξύ είναι το οξύ που έχει μελετηθεί πιο εκτεταμένα από όλα. Ωστόσο, έχουν εξεταστεί και άλλα οξέα όπως είναι το υδροχλωρικό κ.α. (Harms et al., 1984; Hashem et al., 1993). Η υδρόλυση με οξέα χωρίζεται σε δυο κατηγορίες : α. Υδρόλυση με πυκνό οξύ 34

39 β. Υδρόλυση με αραιό οξύ α. Υδρόλυση με πυκνό οξύ Το 1819 πρώτος ο Braconnot ανακάλυψε ότι η κυτταρίνη έχει τη δυνατότητα να μετατρέπεται σε ζυμώσιμα σάκχαρα μέσω της χρήσης πυκνού οξέος (Taherzadeh et al., 2007; Sherrard et al., 1945). Με πυκνού οξέος υδρόλυση, τα ποσοστά των απλών σακχάρων που προκύπτουν είναι υψηλότερα (με άμεσο αποτέλεσμα την επίτευξη υψηλών αποδόσεων αιθανόλης), συγκρίσει της υδρόλυσης με αραιό οξύ. Επιπροσθέτως, το πυκνό οξύ έχει τη δυνατότητα να δρα σε χαμηλές θερμοκρασίες (40-50 o C) σε σχέση με το αραιό οξύ, πλεονεκτώντας έτσι από ενεργειακής άποψης. Ωστόσο, λόγω της υψηλής συγκέντρωσης του οξέος, σε συνδυασμό με την θέρμανση, το καθιστούν εξαιρετικά διαβρωτικό. Για το λόγο αυτό η συγκεκριμένη διαδικασία απαιτεί αντιδραστήρα κατασκευασμένο από κράματα όπως είναι τα κεραμικά. Ένα ακόμα μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί και η ανάγκη απομάκρυνσης του θεϊκού οξέος πριν την παραγωγή βιοαιθανόλης, όπου κατά τη διαδικασία εξουδετέρωσης του παράγεται γύψος. (Taherzadeh et al.,2007; Chandel et al., 2007; Galbe and Zacchi, 2002). β. Υδρόλυση με αραιό οξύ Η περισσότερο χρησιμοποιούμενη μέθοδος χημικής υδρόλυσης γίνεται με τη χρήση αραιού οξέος. Η συγκεκριμένη μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε στη διάρκεια της προεπεξεργασίας, πριν την ενζυματική υδρόλυση, είτε ως μέθοδος υδρόλυσης των πολυσακχαριτών σε σάκχαρα. Οι περισσότερες μέθοδοι πλέον γίνονται σε συγκεκριμένους αντιδραστήρες και διαρκούν λίγα λεπτά (Taher adeh et al., 2007). Το μειονέκτημα της υδρόλυσης με αραιά οξέα είναι ότι λόγω των υψηλών θερμοκρασιών που απαιτούνται μέρος των σακχάρων καταστρέφεται με αποτέλεσμα να αποτελεί παρεμποδιστικό παράγοντα. Επίσης στην υδρόλυση με αραιά οξέα, η κυτταρίνη για να ανακτήσει τη γλυκόζη υδρολύεται σε υψηλές θερμοκρασίες. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή παραπροϊόντων όπως φαινολικά στοιχεία, φουρφουράλες, τα οποία οδηγούν στην παρεμπόδιση της διεργασίας. Το κόστος που 35

40 απαιτείται για τη μείωση των παρεμποδιστικών αυτών παραγόντων είναι πολύ υψηλό (Chandel et al., 2007; Palmqvist and Hahn-Hagerdal, 2000). Για να μειωθεί η επίδραση των παρεμποδιστικής δράσης των παραπροϊόντων έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι απομάκρυνσής τους,. Για να αποφευχθούν τα προβλήματα αυτά, η υδρόλυση πραγματοποιείται σε δύο φάσεις. Στην πρώτη φάση οι συνθήκες που επικρατούν είναι ήπιες και υπάρχει μετατροπή των πολυσακχαριτών σε μονοσακχαρίτες, ενώ κατά το δεύτερο στάδιο οι συνθήκες είναι εντονότερες και η κυτταρίνη υδρολύεται (Tsoutsos et al., 2011) Ενζυματική υδρόλυση Ενζυματική υδρόλυση ονομάζεται η κατάλυση της υδρόλυσης από ένζυμα (Bala, 2009), όπου οι πολυσακχαρίτες μετατρέπονται σε ζυμώσιμα σάκχαρα. Η σακχαροποίηση μέσω ενζυματικής υδρόλυσης τείνει να εκτοπίσει τη χημική υδρόλυση λόγω της τάσης για αποφυγή χημικών στην παραγωγή. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται όλο και περισσότερο χρησιμοποιώντας μεγάλης ποικιλίας ενζύμων (Soetaert, Vandamme, 2010). Η μέθοδος αυτή έχει σχετικά μικρό κόστος σε σχέση με την αλκαλική ή την χημική υδρόλυση και πραγματοποιείται σε ήπιες συνθήκες με ph 4.8 και ο C, όπου και δεν παρατηρούνται προβλήματα διάβρωσης. Η ενζυματική υδρόλυση στην ανάκτηση σακχάρων, έχει απόδοση 75-85%, και διαρκώς εξελίσσεται σαν μέθοδος. (Balat, 2009, Sun et al., 2002). Στον αντίποδα, σημαντικό μειονέκτημα της ενζυμικής υδρόλυσης είναι ο αργός ρυθμός της διεργασίας (Galbe and Zacchi, 2002; Sun and Cheng, 2002). Έχουν σημειωθεί πολλοί μικροοργανισμοί που ανήκουν στα είδη Clostridium, Cellulomonas, Thermonospora, Bacillus, Bacteriodes, Ruminococcus, Erwinia, Acetovibrio, Microbispora, Streptomyces καθώς και πολλοί μύκητες, όπως Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Phanerochaete, Humicola, Schizophillum sp οι οποίοι είναι ικανοί να παράγουν τα απαραίτητα ένζυμα για την υδρόλυση πολυσακχαριτών (Nibedita et al., 2011). 36

41 4. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΒΙΟΜΑΖΑ Η αιθανόλη μπορεί να παράγεται από διαφορετικούς τύπους βιομάζας είτε με βιολογικές είτε με χημικές διεργασίες. Οι τύποι βιομάζας που μπορούν να χρησιμοποιηθούν όπως αναφέρθηκε παραπάνω είναι σακχαρούχες, αμυλούχες και κυτταρινούχες ύλες. Στην πρώτης γενιάς πρώτη ύλη κατατάσσονται οι σακχαρούχες ύλες που περιέχουν σάκχαρα τα οποία είναι ζυμώσιμα σε αλκοόλη για την παραγωγή αιθανόλης. Οι πρώτες ύλες που προκύπτουν από τις γεωργικές εκμεταλλεύσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να παραχθεί αιθανόλη, λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε σάκχαρα. Επιπροσθέτως, τα απόβλητα ή τα παραπροϊόντα από τις βιομηχανίες τροφίμων είναι πλούσια σε σάκχαρα με χαρακτηριστικότερο παράδειγμα τη μελάσα. Παράδειγμα πρώτων υλών αποτελεί το σακχαροκάλαμο που χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα για την παραγωγή αιθανόλης παγκοσμίως. Πιο συγκεκριμένα στη Βραζιλία χρησιμοποιείται το συγκεκριμένο αγροτικό προϊόν για δεκαετίες στην παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων αιθανόλης. Οι πρώτες ύλες που είναι αμυλούχες είναι η πρώτης γενιάς ύλες. Η υδρόλυση του αμύλου σε σάκχαρα και η μετέπειτα ζύμωση των σακχάρων μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή σημαντικών ποσοτήτων αιθανόλης. Το άμυλο μπορεί να υδρολυθεί είτε ενζυματικά με μικροοργανισμούς είτε παρουσία οξέος σε χαμηλό ph και πίεση περίπου 2 atm. Αιθανόλη μπορεί να παραχθεί επίσης και από κυτταρινούχες πρώτες ύλες (με όξινη ή ενζυματική υδρόλυση της κυτταρίνης σε σάκχαρα), ωστόσο η μέθοδος αυτή χαρακτηρίζεται δύσκολη και δαπανηρή. Τα λιγνοκυτταρινούχα φυτά αποτελούν δεύτερης γενιάς πρώτη ύλη για παραγωγή βιοαιθανόλης. Έχουν χρησιμοποιηθεί κυρίως σε ερευνητικό επίπεδο καθώς παρατηρούνται σημαντικά προβλήματα εξαιτίας της ισχυρής υδρόλυσης που απαιτεί η κυτταρίνη. Οι δύο γενιές πρώτων υλών έχουν δεχτεί κριτική για το γεγονός ότι δεσμεύουν καλλιεργήσιμες εκτάσεις για την παραγωγή βιοκαυσίμων που δημιουργεί σοβαρά προβλήματα και ανταγωνίζεται την παραγωγή τροφίμων (Cardona and Sanchez, 2007; Demirbas, 2008; Lima and Natalense, 2012). Τα μικροφύκη θεωρούνται ότι θα αποτελέσουν την τρίτη γενιά πρώτης ύλης διότι δεν απαιτούν τη δέσμευση καλλιεργήσιμων εκτάσεων για την παραγωγή βιομάζας για ενεργειακούς σκοπούς, καθώς επίσης δεν διαταράσσεται το εδαφικό ισοζύγιο όταν απομακρυνθούν τα υπολείμματα της βιομάζας. 37

42 4.1 Αλκοολική ζύμωση Στην αλκοολική ζύμωση τα απλά σάκχαρα και οι δισακχαρίτες (τα οποία απελευθερώθηκαν κατά τη διάρκεια της υδρόλυσης), μετά την προσθήκη συγκεκριμένων μικροοργανισμών (ζυμών), παράγουν αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα. Η αλκοολική ζύμωση είναι μια μεταβολική διεργασία που πραγματοποιείται απουσία οξυγόνου, με το υπόστρωμα και το προϊόν να είναι οργανικές ενώσεις. Κατά τη ζύμωση το υπόστρωμα που προτιμάται είναι η γλυκόζη και το προϊόν είναι η αιθανόλη. Η αλκοολική ζύμωση είναι ένας πολύπλοκος μηχανισμός, τα διάφορα στάδια του οποίου καταλύονται από μια σειρά ενζύμων. Τα στάδια της αλκοολικής ζύμωσης φαίνονται στο παρακάτω Σχήμα 4.1: Γλυκόζη Διφωσφορική φρουκτόζη 2ATP 2ADP 2 Φωσφογλυκερικό οξύ 2 Φωσφοτριόζη 2 ADP 2 ATP 2 πυροσταφυλικό οξύ 2 NADH 2NAD+ 2 Ακεταλδεΰδη 2 Αιθανόλη + CO 2 Σχήμα 4.1 Ο μηχανισμός της αλκοολικής ζύμωσης 38

43 Συνολικά η αντίδραση της γλυκόζης προς παραγωγή αιθανόλης με τη χρήση του Saccharomyces cerevisiae μπορεί στοιχειομετρικά να παρασταθεί με την παρακάτω εξίσωση (1) (Siqueira et al., 2008): C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2 (1) 1g 0.511g 0.489g 4.2 Αναερόβια ζύμωση και παράγοντες που την επηρεάζουν Η αλκοολική ζύμωση είναι μία βιολογική διεργασία η οποία επηρεάζεται σημαντικά από παράγοντες, όπως είναι το ph, οι επιμολύνσεις από βακτήρια, η οσμωτική πίεση, η θερμοκρασία ζύμωσης και η συγκέντρωση αλκοόλης. Λόγω της απότομης μεταβολής των τιμών των παραγόντων αυτών μειώνεται ο ρυθμός της ζύμωσης με άμεσο αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού παραγωγής βιοαιθανόλης. Η μείωση του ρυθμού παραγωγής μπορεί να οφείλεται σε μια σειρά μεταβολών μικρής κλίμακας, όμως μπορεί να είναι αθροιστικές αλλά και συνεργιστικές. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι οι ζυμομύκητες, οι οποίοι μπορεί να έχουν χαμηλή ανθεκτικότητα στα οργανικά οξέα σε χαμηλά επίπεδα ph. Επίσης, μπορεί να εμφανίζουν μικρή ανθεκτικότητα στην υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης σε μεγάλες θερμοκρασίες. Η επίδραση των παραπάνω παραγόντων εξαρτάται από το είδος του ζυμομύκητα και γι αυτό το λόγο η επιλογή του κατάλληλου στελέχους είναι ζωτικής σημασίας (Kasavi et al., 2012; Nichols et al., 2006) Saacharomyces cerevisiae Χαρακτηριστικό παράδειγμα μικροοργανισμού που χρησιμοποιείται ευρέως στην αλκοολική ζύμωση είναι ο ζυμομύκητας Saacharomyces cerevisiae.. Πρόκειται για μονοκύτταρο και μονοπύρηνο οργανισμό. Αναλόγως του στελέχους το σχήμα μπορεί να ποικίλει από ωοειδές, σφαιρικό ή κυλινδρικό. Το μήκος του κυττάρου μπορεί να είναι από 5-10 μm και το πλάτος από 1-7 μm. Τα κύτταρα του αποτελούνται από τον κυτταρικό φάκελο, το κυτταρόπλασμα, τον πυρήνα, τα μιτοχόνδρια, το ενδοπλασματικό δίκτυο καθώς και άλλα οργανίδια (Walker, 1998). Ο βιολογικός κύκλος του S. cerevisiae, αποτελείται από δύο φάσεις οι οποίες είναι η απλοειδής και 39

44 η διπλοειδής. Ο Saccharomyces cerevisiae είναι ετερόθαλλος και χρειάζονται δύο συμβατά στελέχη α και a για εγγενή αναπαραγωγή. Δύο ασκοσπόρια αντίθετου συζευκτικού τύπου, έρχονται σε φυσική επαφή και μετά συγχωνεύονται. Ακολουθεί καρυογαμία και δημιουργία ζυγωτού κυττάρου. Το ζυγωτό παράγει μεγάλο αριθμό διπλοειδών εκβλαστημάτων. Υπό ορισμένες συνθήκες, μερικά διπλοειδή κύτταρα υφίστανται μείωση και μετατρέπονται σε ασκούς, καθένας από τους οποίους φέρει τέσσερα ασκοσπόρια. Τα ασκοσπόρια πολλαπλασιάζονται με εκβλαστήματα και παράγουν πολλά απλοειδή κύτταρα (Χριστιάς, 1999). Η αγενής αναπαραγωγή γίνεται με εκβλάστηση. Κατά την εκβλάστηση, το κυτταρικό πρωτόπλασμα που περιβάλλεται από λεπτή μεμβράνη, σπάει σε ένα σημείο το κυτταρικό τοίχωμα και σχηματίζει το θυγατρικό κύτταρο. Το εκβλάστημα μεγαλώνει και τελικά αποχωρίζεται από το μητρικό κύτταρο με σύσφιξη της βάσης. Το θυγατρικό κύτταρο έχει τη δυνατότητα να εκβλαστάνει ευρισκόμενο σε επαφή με το μητρικό κύτταρο δημιουργώντας έτσι μια αλυσίδα κυττάρων. Κατά την εκβλάστηση πραγματοποιείται πυρηνική διαίρεση και ο ένας θυγατρικός πυρήνας περνάει στο εκβλάστημα, ενώ ο άλλος μένει στο μητρικό κύτταρο (Alexopoulos et al., 1996) Επιμολύνσεις από βακτήρια Το αυξημένο οργανικό φορτίο στα υποστρώματα της ζύμωσης ενέχει τον κίνδυνο επιμολύνσεων από μικροοργανισμούς με κυριότερους τα βακτήρια. Είναι επιτακτική η ανάγκη να γίνεται αποστείρωση των υποστρωμάτων και η πραγματοποίηση των ζυμώσεων κάτω από ασηπτικές συνθήκες. Ένα τέτοιο εγχείρημα καθιστά ασύμφορη οικονομικά την παραγωγή αιθανόλης. Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης απελευθερώνεται διοξείδιο του άνθρακα, με αποτέλεσμα να μειώνεται η αυξητική τάση του ph των υγρών ζύμωσης και η ζύμωση να σταματά στην ένδειξη του ph 4.0. Με αυτόν τον τρόπο η ζύμωση σε ph κοντά ή κάτω από το 4.0 προφυλάσσεται, εφόσον τα επιμολυντικά βακτήρια δεν αναπτύσσονται σε τόσο χαμηλό ph (Nichols et al., 2006) Θερμοκρασία Η θερμοκρασία είναι ένας πολύ σημαντικός περιβαλλοντικός παράγοντας που έχει σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Ο Saacharomyces 40

45 cerevisiae αναπτύσσεται βέλτιστα στη θερμοκρασία των 30 C, αλλά έχει τη δυνατότητα να αναπτυχθεί και σε υψηλότερες θερμοκρασίες με μέγιστη 45 C. Μπορεί να υπάρχει σχεδόν γραμμική αύξηση του ρυθμού ανάπτυξης του ζυμομύκητα με τη θερμοκρασία (διπλασιασμός ρυθμού ανά 10 C, από τους 10 ως τους 32 C), ωστόσο υψηλές θερμοκρασίες δεν σημαίνει ότι είναι και γενικά ευνοϊκές. Η αύξηση της θερμοκρασίας προκαλεί αύξηση της αρνητικής επίδρασης της συγκέντρωσης της αιθανόλης στην ανάπτυξη της ζύμης. Η σύσταση των λιπιδίων στις κυτταρικές μεμβράνες μεταβάλλεται σε υψηλές θερμοκρασίες και παρατηρείται ότι τα λιπίδια των μεμβρανών είναι περισσότερο ρευστά. Στην αντίθετη περίπτωση, όπου η θερμοκρασία είναι χαμηλότερη από τη βέλτιστη, η μείωση της ανάπτυξης οφείλετε στην επιβράδυνση των διαφόρων ενζύμων που εμπλέκονται στις βιοχημικές διεργασίες ανάπτυξης του ζυμομύκητα (Aldiguier et al., 2004; Aranda et al., 2011; Mehdikhani et al., 2011) ph Ο S. cerevisiae είναι ζυμομύκητας ο οποίος μπορεί να αναπτυχθεί σε ένα εύρος ph αρκετά μεγάλο όπου το βέλτιστο εύρος είναι Όταν οι τιμές του ph είναι μικρότερες ή μεγαλύτερες του παρατηρείται σημαντική μείωση του ρυθμού ανάπτυξης καθώς και της παραγωγής αιθανόλης. Έχει παρατηρηθεί ότι με την αλλαγή του ph η σύσταση της βιομάζας του ζυμομύκητα (π.χ. S. cerevisiae) μεταβάλλεται (Lin et al., 2012). Η αύξηση του ph, υψηλότερο του 5.0, έχει ως αποτέλεσμα την κατανάλωση γλυκόζης από τον ζυμομύκητα και αύξησης της παραγωγής παραπροϊόντων με αποτέλεσμα να μειώνεται η παραγωγή και η απόδοση της αιθανόλης (Lin et al., 2012) Συγκέντρωση αιθανόλης Η συγκέντρωση της αιθανόλης στο υπόστρωμα ανάπτυξης είναι ένα από τα κυριότερα ζητήματα, γιατί το επίπεδο της συγκέντρωσης της αιθανόλης καθορίζει σημαντικά την οικονομική βιωσιμότητα της διεργασίας. Η ύπαρξη μεγάλων συγκεντρώσεων αιθανόλης δεν προϋποθέτει υψηλές ενεργειακές απαιτήσεις για να αποσταχθεί και να παραληφθεί η αιθανόλη. Ωστόσο, οι υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης δρουν ως ανασταλτικός παράγοντας στην ανάπτυξη του ζυμομύκητα. Επιπροσθέτως, οι υψηλές τιμές σε συγκεντρώσεις αιθανόλης προκαλούν αλλαγές στη 41

46 δομή των κυτταρικών μεμβρανών του S. cerevisiae και παρατηρείται αύξηση των ενεργειακών απαιτήσεων για τη διατήρηση του ph ενδοκυτταρικά σε επιθυμητά επίπεδα. Για να αυξηθεί η ανθεκτικότητα του ζυμομύκητα στη συγκέντρωση της αιθανόλης μπορεί να αυξηθεί σταδιακά η συγκέντρωση της αιθανόλης προκειμένου να γίνει εγκλιματισμός της ζύμης. Ο S. cerevisiae θεωρείται ένας ανθεκτικός αιθανολογόνος ζυμομύκητας σε συγκεντρώσεις αιθανόλης μέχρι και 18-20% (v/v) (Devantier et al., 2005; Dinh et al., 2008; Lin and Tanaka, 2006; Piper, 1995; Zacchi and Axelsson, 1989) Οσμωτική πίεση Οι συγκεντρώσεις των στοιχείων που εντοπίζονται στο υπόστρωμα επηρεάζουν την αλκοολική ζύμωση με επίδραση στο ισοζύγιο της οσμωτικής πίεσης μεταξύ του υποστρώματος και του κυττάρου. Η αύξηση της οσμωτικής πίεσης έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια ενδοκυτταρικών υγρών και με αυτό τον τρόπο τη συρρίκνωση του κυττάρου. Στην περίπτωση της χαμηλής πίεσης εισρέουν υγρά στο κύτταρο με συνέπεια τη διάρρηξή του. Σε φαινόμενα αυξημένης οσμωτικής πίεσης ο ζυμομύκητας αντιδρά για να το αντιμετωπίσει παράγοντας ενδοκυτταρικά προϊόντα, όπως γλυκερόλη, τρεχαλόζη κλπ (Banat et al., 1998; Mager and Siderius, 2002). 42

47 4.3 Αντικείμενο και συμβολή της μεταπτυχιακής εργασίας Σύμφωνα με τα εισαγωγικά κεφάλαια, τα είδη των βιομαζών που χρησιμοποιήθηκαν μέχρι σήμερα ως υπόστρωμα για τη παραγωγή βιοαιθανόλης είναι κυρίως λιγνοκυτταρινούχας φύσεως (δασικά υπολείμματα). Στη παρούσα εργασία εξετάστηκε η δυνατότητα παραγωγής βιοαιθανόλης από βιομάζα προερχόμενη από επεξεργασία αποβλήτων οινοποιείου και σταφιδοποιίας με μικροφύκη. Να επισημανθεί πως για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία μελετώνται τα δύο αυτά υποστρώματα για ανάπτυξη βιομάζας με σκοπό την παραγωγή βιοαιθανόλης. Στόχος της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ήταν η διερεύνηση όλων εκείνων των παραμέτρων (όπως βέλτιστες συνθήκες υδρόλυσης και ζύμωσης, είδος επεξεργαζόμενο υγρού αποβλήτου, κ.α.), προκειμένου να επιτευχθούν οι μέγιστες αποδόσεις παραγωγής βιοαιθανόλης που θα οδηγήσουν σε βελτιωμένη σχέση κόστους-αποδοτικότητας και ως εκ τούτου, στην αποτελεσματική εμπορική εφαρμογή των βιοκαυσίμων που παράγονται. Για την καλλιέργεια μικροφυκών σε απόβλητα χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά είδη υγρών αποβλήτων όπως απόβλητο τυροκομείου, οινοποιείου, μείξη αποβλήτων οινοποιείου - σταφιδοποιίας και συνθετικό χημικό μέσο. Αρχικά πραγματοποιήθηκε προεπεξεργασία της παραγόμενης βιομάζας, υδρολύοντάς την με θειικό οξύ. Εξετάστηκαν δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις θεϊκού οξέος (1.5N, 2.5N) καθώς και τέσσερις διαφορετικοί χρόνοι υδρόλυσης (30, 60, 120, 180 ) με σκοπό τη διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών για την επίτευξη της μέγιστης συγκέντρωσης σακχάρων. Στη συνέχεια ακολούθησε ζύμωση των υδρολυμάτων που προέκυψαν, με χρήση του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 για την παραγωγή βιοαιθανόλης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υδρόλυση και η ζύμωση της βιομάζας μικροφυκών από επεξεργασία αποβλήτων, οδήγησαν σε ικανοποιητική παραγωγή βιοαιθανόλης. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει ότι καλλιέργεια μικροφυκών σε υγρά απόβλητα, αποτελεί μια ελπιδοφόρα πρακτική για την παραγωγή βιοενέργειας. 43

48 5. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 5.1 Εισαγωγή Για την παραγωγή βιοαιθανόλης στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε βιομάζα μικροφυκών από επεξεργασία αποβλήτων που προήλθε από πειράματα που είχαν πραγματοποιηθεί στο Εργαστήριο Περιβαλλοντικών Συστημάτων του Τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων του Πανεπιστημίου Πατρών. Στη συνέχεια, η πραγματοποίηση των απαραίτητων ζυμώσεων για την παραγωγή βιοαιθανόλης διεξήχθησαν στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν για την καταγραφή των χαρακτηριστικών της βιομάζας καθώς και η περαιτέρω χρήση της για παραγωγή αιθανόλης δίνονται στο παρόν κεφάλαιο. 5.2 Προέλευση καλλιέργειας μικροφυκών Αρχικά, από το βιολογικό καθαρισμό του Δήμου Αγρινίου, συλλέχθηκε υγρό δείγμα αποβλήτων το οποίο διηθήθηκε και αφέθηκε για ανάπτυξη σε φιάλες αιωρούμενης ανάπτυξης. Στις φιάλες εφαρμόστηκαν οι εξής συνθήκες ανάπτυξης: τεχνητός φωτισμός Lux, ph 6-8, θερμοκρασία 25 ± 2 ο C και ελαφρά περιοδική ανάδευση. Στη συνέχεια, οι μικροοργανισμοί που επικράτησαν στην καλλιέργεια μεταφέρθηκαν σε μεγαλύτερης κλίμακας βιοαντιδραστήρες (ενυδρεία) και συντηρήθηκαν σύμφωνα με τις παραπάνω συνθήκες. Ακολούθησε ταυτοποίηση των μικροοργανισμών που επικρατούσαν και εντοπίστηκε η ανάπτυξη του θερμόφιλου κυανοβακτηρίου Leptolyngbya sp. (σε αφθονία 95%) καθώς και χρυσοφύκη του γένους Ochromonas sp. Το Leptolyngbya sp. είναι ένα θερμόφιλο κυανοβακτήριο το οποίο ανήκει στην οικογένεια των Cyanophyceae και στην τάξη των Oscilla oriales. Το Leptolyngbya sp. έχει νηματοειδή κύτταρα και το μέγεθος τους κυμαίνεται από 0.5 έως 3.2 μm. Όπως τα περισσότερα από τα είδη των κυανοβακτηρίων, το Leptolyngbya sp. παρουσιάζει ανοχή σε υψηλά τιμές pη και σε υψηλή συγκέντρωση αλατότητας και μπορεί να αναπτύσσεται καλά σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας, pη, θρεπτικών ουσιών, και αλατότητας. Το Leptolyngbya sp. στο έδαφος ευδοκιμεί σε ανθρακικά πετρώματα και ασβεστολιθικά σπήλαια και σε μαρμάρινα μνημεία (Singh et al, 2014). Από την άλλη πλευρά στους υδάτινους πόρους μπορεί να αναπτυχθεί σε θαλασσινό και γλυκό 44

49 νερό, σε ιαματικές και θερμές πηγές καθώς και σε βραχώδεις επιφάνειες. Η ανάπτυξη του στελέχους αυτού κυμαίνεται θερμοκρασιακά από 20 έως 45 ο C με βέλτιστη θερμοκρασία τους 30 ο C. Όσο αφορά το pη, μπορεί να αναπτυχθεί μεταξύ 7 και 11 όντας αλκαλόφιλο. Η καλλιέργεια του Leptolyngbya sp. σε κλειστούς αντιδραστήρες έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό κυτταρικών συστάδων και την προσκόλλησή τους στα τοιχώματα. Η μέγιστη παραγωγικότητα βιομάζας που έχει παρατηρηθεί για αυτό το στέλεχος είναι 79.8 mg l -1 d -1 (Singh et al., 2014). 5.3 Ανάπτυξη βιομάζας μικροφυκών Η καλλιέργεια που αναπτύχθηκε σύμφωνα με το ενότητα 5.2 χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο σε όλα τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στη παρούσα εργασία. Η καλλιέργεια συντηρούνταν υπό σταθερή θερμοκρασία 25 ± 2 ο C, σταθερό ph και φωτισμό έντασης Lux. Τα θρεπτικά συστατικά που χρησιμοποιήθηκαν για την συντήρηση της καλλιέργειας αναγράφονται αναλυτικά στον Πίνακα 5.1. Η εν λόγο καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο για την επεξεργασία τριών διαφορετικών αποβλήτων: οινοποιείου, σταφιδοποιίας, τυροκομείου. Τα επεξεργασμένα υγρά που προέκυψαν από την διαδικασία απομακρύνθηκαν, ενώ η μικροβιακή βιομάζα συλλέχθηκε, ξηράνθηκε και υδρολύθηκε. Πίνακας 5.1: Θρεπτικά συστατικά συντήρησης μεικτής καλλιέργειας. Θρεπτικά συστατικά Συγκέντρωση (mg/l) KNO MgSO 4. 7H 2 O 100 CaCl 2. 2H 2 O 50 KH 2 PO 4 56 K 2 HPO Εικόνα 5.1 Ενυδρείο ανάπτυξης μικροφυκών 45

50 5.4 Προσδιορισμός ξηρής βιομάζας Προκειμένου να πραγματοποιηθούν οι υδρολύσεις ήταν απαραίτητος ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της ξηρής μικροβιακής βιομάζας που συλλέχθηκε. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: 1. Φυγοκέντριση δειγμάτων στις 4000 στροφές, 15 min, σε φυγόκεντρο NF Απομάκρυνση υπερκείμενου υγρού και συλλογή βιομάζας σε προζυγισμένη φιάλη (Duran) όπου παρέμενε σε κλίβανο ξήρανσης στους 105 o C μέχρι σταθερού βάρους. 3. Το καθαρό βάρος της βιομάζας προέκυπτε από την αφαίρεση της τελικής τιμής από την αρχική τιμή. Ως εκ τούτο, υπολογίστηκαν όλες οι ξηρές βιομάζες σε g L -1. Εικόνα 5.2 Συλλογή και ξήρανση βιομάζας Στη συνέχεια, ακολούθησε σπάσιμο και τεμαχισμός της ξηρής βιομάζας ώστε να επιτύχουμε υψηλότερα ποσοστά απόδοσης σε εκλυόμενα σάκχαρα κατά την υδρόλυσή της. Εικόνα 5.3 Τεμαχισμός βιομάζας 46

51 5.5 Υδρόλυση βιομάζας Μετά τον προσδιορισμό της ξηρής βιομάζας και τον τεμαχισμό της ακολούθησε η υδρόλυσή της. Επιλέχθηκε να πραγματοποιηθεί όξινη υδρόλυση με θειικό οξύ (H 2 SO 4 ) 5% w/v (Εικόνα 5.4) για συγκεντρώσεις 1,5 N και 2,5 N σύμφωνα με τους (Markou et al., 2012). Παρασκευή διαλυμάτων θειικού οξέος για υδρόλυση 1. Για 1,5 N χρειάζεται 41,644 ml πυκνό θειικό οξύ και συμπλήρωση με απιονισμένο νερό μέχρι τα 1000 ml. 2. Για 2,5 N χρειάζεται 69,407 ml πυκνό θειικό οξύ και συμπλήρωση με απιονισμένο νερό μέχρι τα 1000 ml. Εικόνα 5.4 Δοχεία με θειικό οξύ Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε αποστείρωση του υδρολύματος σε χύτρα (Εικόνα 5.5) στους 104 o C και πίεση 0,8 bar με χρόνους παραμονής 30, 60, 120 και 180. Εικόνα 5.5 Χύτρα αποστείρωσης Το προκύπτον υδρόλυμα στη συνέχεια διηθούταν (Εικόνα 5.6) για την απομάκρυνση βιομάζας και στερεών σωματιδίων ώστε να προσδιοριστούν στη συνέχεια τα ανάγοντα και τα ολικά σάκχαρα και να ελεγχθεί η δυνατότητα ζύμωσής του. 47

52 Εικόνα 5.6 Υδρόλυμα μετά από διήθηση 5.6 Προσδιορισμός αναγόντων σακχάρων Ο προσδιορισμός των αναγόντων σακχάρων (γλυκόζη) πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο 3,5 dinitrosalicylic acid, DNS (Miller, 1959). Παρασκευή διαλύματος DNS 1. Ζύγιση 1,6g NaOH και διάλυσή του σε 20ml απιονισμένο νερό 2. Ζύγιση 1g DNS (3,5 dinitrosalicylic acid) 3. Ζύγιση 40.3g τρυγικό κάλιο-νάτριο (sodium tatrate terahydrate) Σε ποτήρι ζέσεως όγκου 100ml προστέθηκαν κατά σειρά τα εξής: 1. 50ml νερό 2. 20ml διαλύματος NaOH 3. Τοποθέτηση διαλύματος σε θερμαινόμενο αναδευτήρα σε χαμηλή θερμοκρασία (40 o C) 4. Προσθήκη με αργό ρυθμό DNS και τρυγικό κάλιο-νάτριο 5. Ογκομέτρηση μέχρι τα 100 ml 48

53 Πειραματική διαδικασία 1. Σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες μεταφέρουμε 0.5 ml δείγματος και 0.5 ml αντιδραστηρίου DNS και αναδεύονται. 2. Τα δείγματα μεταφέρονται για 5-10 min σε υδατόλουτρο στους C. 3. Τα δείγματα ψύχονται αμέσως στους 25 0 C. 4. Προσθέτουμε 5 ml απιονισμένο νερό. 5. Ανάδευση στο vortex. 6. Μέτρηση της οπτικής απορρόφηση (Abs) του δείγματος στο φασματοφωτόμετρο στα 540 nm. 7. Υπολογισμός συγκέντρωσης (C)=Abs * Αραίωση * Συντελεστή πρότυπης. Κατασκευή πρότυπης καμπύλης STOCK STANDARD 250mg glucose με H2O σε τελικό 100ml c=2.5g/l 10ml από το stock σε τελικό 100ml c =0.25g/L Έχοντας παρασκευάσει το Stock και το Standard διάλυμα, επιλέγεται και η αντίστοιχη περιοχή συγκεντρώσεων για τα πρότυπα διαλύματα. Για την παρασκευή των πρότυπων διαλυμάτων χρησιμοποιούμε τον νόμο της αραίωσης που είναι ο εξής: C 1 * V 1 = C 2 * V 2 Όπου: C 1 = 0.25 g/l V 2 = 0.01L Σταθερό για όλο το εύρος των τιμών των συγκεντρώσεων στα δείγματα. Για C 2 = 0.25g/L C 1 * V 1 = C 2 * V g/l * 0.001L = C 2 * 0.01L C 2 = 0.25g/L Συνεπώς, ρίχνουμε 1ml από το Standard διάλυμα και 9ml απιονισμένο. Για C 2 = C 1 * V 1 = C 2 * V g/l * 0.002L = C 2 * 0.01L C 2 = g/l Συνεπώς, ρίχνουμε 2ml από το Standard διάλυμα και 8ml απιονισμένο.. Για C 2 = 0.16ppm C 1 * V 1 = C 2 * V g/l * 0.003L = C 2 * 0.01L C 2 = 0.075g/L Συνεπώς, ρίχνουμε 3ml από το Standard διάλυμα και 7ml απιονισμένο. Για C 2 = 0.2ppm C 1 * V 1 = C 2 * V g/l *0.004L = C 2 * 0.01L C 2 = 0.1 g/l 49

54 Συνεπώς, ρίχνουμε 4ml από το Standard διάλυμα και 6ml απιονισμένο. Για C 2 = 0.32ppm C 1 * V 1 = C 2 * V g/l * 0.006L = C 2 * 0.01L C 2 = 0.15 g/l Συνεπώς, ρίχνουμε 6ml από το Standard διάλυμα και 4ml απιονισμένο. Για C 2 = 0.5ppm C 1 * V 1 = C 2 * V g/l *0.008L = C 2 * 0.01L C 2 = 0.29 g/l Συνεπώς, ρίχνουμε 8ml από το Standard διάλυμα και 2ml απιονισμένο. Για C 2 = 0.64ppm C 1 * V 1 = C 2 * V g/l * 0.009L = C 2 * 0.01L C 2 = g/l Συνεπώς, ρίχνουμε 9ml από το Standard διάλυμα και 1ml απιονισμένο. Για C 2 = 0.9ppm C 1 * V 1 = C 2 * V g/l * 0.01L = C 2 * 0.01L C 2 = 0.25 g/l Συνεπώς, ρίχνουμε 10ml από το Standard διάλυμα. Για C 2 = 1ppm C 1 * V 1 = C 2 * V g/l * 0.002L = C 2 * 0.01L C 2 = 0.5 g/l Συνεπώς, ρίχνουμε 2ml από το Standard διάλυμα και 8ml απιονισμένο. Στη συνέχεια κατασκευάζεται η γραφική παράσταση, έχοντας στον άξονα y τις τιμές των συγκεντρώσεων και στον άξονα x τις αντίστοιχες τιμές των απορροφήσεων. Η ζητούμενη καμπύλη βαθμονόμησης, είναι της μορφής y=β*x και με συντελεστή συσχέτισης R 2 να προσεγγίζει τη μονάδα. 2,5 Equation y = a + b*x Adj. R-Square 0,99909 Value Standard Error B Intercept 0 -- B Slope 1, ,01772 y=1,85805x 2,0 Γλυκόζη (g/l) 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Απορρόφηση (540nm) Σχήμα 5.1 Πρότυπη καμπύλη αναγόντων σακχάρων 50

55 Εικόνα 5.7 Υδατόλουτρο κατά τη διαδικασία προσδιορισμού αναγόντων σακχάρων 5.7 Προσδιορισμός ολικών σακχάρων (πολυσακχαριτών) Οι πολυσακχαρίτες είναι ενδοκυτταρικά προϊόντα των μικροφυκών. Παράγονται μέσω της διαδικασίας της φωτοσύνθεσης όπως το τελικό προϊόν κατά τη φωτοσυνθετική δραστηριότητα, το άμυλο. Οι πολυσακχαρίτες δίνουν πορτοκαλίκίτρινο χρώμα όταν επεξεργάζονται με φαινόλη και πυκνό θειικό οξύ. Η αντίδραση είναι ευαίσθητη και το χρώμα είναι σταθερό. Σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες εκ των οποίων ένα «τυφλό» και τα υπόλοιπα δείγματα με αραίωση ή χωρίς πραγματοποιούνται τα παρακάτω βήματα: 1. Στο φιαλίδιο τοποθετείται i. 1mL δείγμα ii. 1mL φαινόλη iii. 5mL H 2 SO 4 2. Όταν τα δείγματα είναι έτοιμα, ανάδευση στο vortex. 3. Τα δείγματα παραμένουν για 10 min σε ηρεμία. 4. Επανάληψη στο vortex και παραμονή σε ηρεμία για 20 min. 5. Μέτρηση της οπτικής απορρόφηση (Abs) του δείγματος στο φασματοφωτόμετρο στα 490 nm. 6. Υπολογισμός συγκέντρωσης (C)mg/L=Abs * Αραίωση * Συντελεστή πρότυπης*

56 Εικόνα 5.8 Προσδιορισμός ολικών σακχάρων 0,10 Equation y = a + b*x 0,99919 Adj. R-Square Value Standard Error B Intercept 1,12549E-5 6,87315E-4 B Slope 0, ,00139 y= x 0,08 Άμυλο (g/l) 0,06 0,04 0,02 0,00 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Απορρόφηση (490nm) Σχήμα 5.2 Πρότυπη καμπύλη ολικών σακχάρων 5.8 Αλκοολική ζύμωση και συνθήκες καλλιέργειας Βιολογικό υλικό Στην παρούσα εργασία καλλιεργήθηκε και μελετήθηκε η ζύμη Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1. Διατηρήθηκε σε θρεπτικό υλικό PDA (Po a o Dex ose Agar) σε θερμοκρασία 7±1 C (Hi achi inus- Zero Cooling) και ανανεώνονταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα για τις ανάγκες των πειραμάτων. 52

57 5.8.2 Θρεπτικά υλικά και συνθήκες καλλιέργειας Το στέλεχος καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer των 250 ml, σε όγκο θρεπτικού υλικού 50 ml. Ως θρεπτικό υλικό χρησιμοποιήθηκε PDB (Potato Dextrose Broth) ενώ ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε εκχύλισμα ζύμης (yeas ex rac 3 g/l). Το θρεπτικό υλικό εμπλουτίστηκε με ανόργανες πηγές, το θειικό αμμώνιο ((NH 4 ) 2 SO 4, 0.5 g/l) και το όξινο φωσφορικό κάλιο (HK 2 PO 4, 1 g/l). Ο εμβολιασμός των φιαλών πραγματοποιήθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες, σε θάλαμο γραμμικής ροής (laminar row flow- pbi, MINIFLO) (Εικόνα 5.9). Το εμβόλιο ήταν 1 ml, 48ωρης προκαλλιέργειας, για τη ζύμη Saacharomyces cerevisiae Πριν τον εμβολιασμό των φιαλών, ελέγχθηκε με μικροσκοπικό παρασκεύασμα για επιμολύνσεις και έγινε μέτρηση της συγκέντρωσης των κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο τύπου Neubauer (Poly-Op ic) όπου και μετρήθηκε η συγκέντρωση μέσου όρου 11.67x10 7 κύτταρα/ ml. Οι κωνικές φιάλες της καλλιέργειας τοποθετήθηκαν για επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο (ZHICHENG ZHWY 211C, Shanghai, China) εξοπλισμένο με ειδικό σύστημα αερισμού, σε θερμοκρασία 28±1 ο C και υπό ανάδευση 180 rpm (rotation per minute- στροφές ανά λεπτό). Εικόνα 5.9 Δειγματοληψία στον θάλαμο γραμμικής ροής (laminar row flow- pbi MINIFLO) Μέτρηση ph To ph (Εικόνα 5.10)ελεγχόταν καθημερινά και ρυθμιζόταν στο 4.5 ± 0.5 με προσθήκη κατάλληλης ποσότητας διαλύματος οξέος ή βάσεως, όποτε ήταν απαραίτητο. 53

58 Εικόνα 5.10 Πεχάμετρο-Θερμόμετρο (Hanna Instruments) Μικροσκοπική παρατήρηση Για τη μελέτη της μορφολογίας των ζυμών κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης, έγιναν νωπά δείγματα καλλιέργειας, τα κύτταρα της οποίας παρατηρήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο Carl Zeiss (Gmbh, Gö ingen, Germany) (Εικόνα 5.11)σε ολική μεγέθυνση 1000 φορών (=10*100). Έπειτα, ακολούθησε λήψη ψηφιακών φωτογραφιών μέσω κάμερας (Exwave HAD, Sony, Tokyo, Japan) που ήταν συνδεδεμένη με ηλεκτρονικό υπολογιστή. Με αυτό τον τρόπο προσδιορίστηκε η ανάπτυξη των κυττάρων της ζύμης (κύτταρα/ml). Εικόνα 5.11 Οπτικό μικροσκόπιο Carl Zeiss Προσδιορισμός αιθανόλης Ο προσδιορισμός της αιθανόλης έγινε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography- HPLC, Ultimate 3000, Dionex, Germany) (Εικόνα 5.12), η οποία φέρει στήλη Aminex HPX-87H (διαστάσεων:

59 mm x 7.8 mm, Bio-Rad). Ο όγκος των προς ανάλυση δειγμάτων ήταν 20 μl μέσου καλλιέργειας, που προηγουμένως είχε διηθηθεί μέσω μεμβρανών Wha man διαμέτρου πόρων 0.2 μm. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα 0,005 mg/l H 2 SO 4 (Sigma) και η ροή της ήταν 0,6 ml/min σε θερμοκρασία στήλης 65 ο C με χρόνο παραμονής έκλουσης της αιθανόλης 25 min. Η ανίχνευση της αιθανόλης πραγματοποιήθηκε από ανιχνευτή δείκτης διάθλασης RI (Reflective index, RI-101, Shodex). Η ποσοτικοποίηση τους έγινε με τη βοήθεια καμπυλών αναφοράς, οι οποίες χαράχτηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα. Η καμπύλη αναφοράς για την αιθανόλη γίνεται με τη χρήση πρότυπων διαλυμάτων αιθανόλης 2-25 g/l. 50 Equation y = a + b*x 0,9993 Adj. R-Square Value Standard Error B Intercept 0 -- B Slope 1, ,01914 Εμβαδόν κορυφής (μriu/min) Αιθανόλη (g/l) Σχήμα 5.3 Πρότυπη καμπύλη αιθανόλης Εικόνα 5.12 Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης 55