Ανάπτυξη μεθοδολογίας για την παραγωγή νανοϊνών ως νέοι φορείς ελεγχόμενης αποδέσμευσης αντιβιοτικών

Transcript

1 Ανάπτυξη μεθοδολογίας για την παραγωγή νανοϊνών ως νέοι φορείς ελεγχόμενης αποδέσμευσης αντιβιοτικών ΤΕΛΙΚΗ ΕΚΘΕΣΗ ΜΕΛΕΤΕΣ 2013 ΚΟΙΝΩΦΕΛΕΣ ΙΔΡΥΜΑ ΙΩΑΝΝΗ Σ. ΛΑΤΣΗ Φορέας Υλοποίησης: Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων Επιστημονικός Υπεύθυνος: Καθηγητής Βασίλειος Ρούσσης Ερευνητής: Δρ. Διονύσιος Βύνιας ΑΘΗΝΑ 2013

2 Εισαγωγή Η ηλεκτροκλωστοποίηση (electrospinning) είναι μια μέθοδος παρασκευής πολυμερικών ινών με διάμετρο από 0.05 μm έως 50 nm [1]. Αντίθετα με τις συμβατικές μεθόδους παραγωγής των ινών που χρησιμοποιούν μηχανικές δυνάμεις για τη δημιουργία ινών, κατά τη διάρκεια της ηλεκτροκλωστοποίησης ένα διάλυμα πολυμερούς/διαλύτη σχηματίζει μια εξαιρετικά λεπτή ίνα με την εφαρμογή ενός ηλεκτρικού πεδίου μεταξύ μιας σύριγγας και ενός γειωμένου μεταλλικού συλλέκτη. Η εκχυόμενη ποσότητα του πολυμερούς εναποτίθεται στο συλλέκτη (με ταυτόχρονη εξάτμιση του διαλύτη) με τη μορφή ενός μη υφάνσιμου υλικού με εξαιρετικά μεγάλο πηλίκο εμβαδού επιφάνειας (surface area)/μάζας, υψηλό πορώδες και μικρή διάμετρο πόρων [1, 2]. Ως αποτέλεσμα, η μικρή διάμετρος των νανοϊνών οδηγεί σε υψηλό επιφανειακό εμβαδό (high surface area), το οποίο έχει αποδειχθεί ότι oδηγεί σε μεγαλύτερη απορροφητικότητα και δυνατότητα ελεγχόμενης απελευθέρωσης χημικών ουσιών σε σύγκριση με τα αντίστοιχα πολυμερικά φιλμ [3]. Παρόλο που η πιθανή χρήση των νανοϊνών ως φορείς φαρμακευτικών ουσιών έχει συζητηθεί θεωρητικά, περιορισμένη εργαστηριακή έρευνα έχει πραγματοποιηθεί σε αυτό το ερευνητικό πεδίο [4]. Σκοπός του ερευνητικού έργου Σκοπός της παρούσας ερευνητικής προσπάθειας ήταν η παραγωγή μεμβρανών από νανοΐνες βιοσυμβατών πολυμερών ως φορείς αντιβιοτικών ουσιών. Μετά την επιβεβαίωση επιτυχούς ηλεκτροϊνοποίησης με τη χρήση μικροσκοπίας ηλεκτρονικής σάρωσης (SEM) και τη μελέτη της μορφολογίας της ίνας, η οποία επηρεάζει την απελευθέρωση των χημικών ουσιών στις μη-υφάνσιμες μεμβράνες, στόχος ήταν η αξιολόγηση της σταθερότητας του συστήματος και ιδιαίτερα του ρυθμού αποδέσμευσης του ενσωματωμένου αντιβιοτικού με τη χρήση χρωματογραφικών ή φασματοσκοπικών μεθόδων (π.χ. HPLC, UV). Μεθοδολογία & Αποτελέσματα Πειραματική διάταξη ηλεκτροϊνοποίησης για τη παρασκευή νανοϊνών με τη μέθοδο της ηλεκτροϊνοποίησης Η πειραματική διάταξη ηλεκτροϊνοποίησης που έχει διαμορφωθεί στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας παρουσιάζεται στην Εικόνα 1. 2

3 Εικόνα 1. Σύστημα παραγωγής νανοϊνών. Για τη συλλογή των νανοϊνών χρησιμοποιήθηκαν δυο διαφορετικοί τύποι συλλέκτη α) στατικός και β) περιστρεφόμενο τύμπανο (Εικόνα 2). Εικόνα 2. Στατικός συλλέκτης (αριστερά) και περιστρεφόμενο τύμπανο (δεξιά) για τη συλλογή των νανοϊνών. Επιλογή των πολυμερών για τη παρασκευή νανοϊνών με τη μέθοδο της ηλεκτροϊνοποίησης Για την υλοποίηση της παρούσας μελέτης επιλέχθηκαν ως πολυμερή η οξική κυτταρίνη (cellulose acetate, CA), το πολυγαλακτικό οξύ (polylactic acid, PLA) και η πολυκαπρολακτόνη (polycaprolactone, PCL) με βασικά κριτήρια (α) την βιοσυμβατότητα, (β) την ασφάλεια χρήσης στον άνθρωπο, (γ) την ικανότητα βιοαποικοδόμησης και (δ) την εμπορική διαθεσιμότητα τους. 3

4 Στα αρχικά πειράματα χρησιμοποιήθηκε η οξική κυτταρίνη λόγω του συγκριτικά χαμηλού της κόστους και της ευκολίας χειρισμού της με διαφορετικούς διαλύτες όπως χλωροφόρμιο, συνδυασμούς χλωροφόρμιου/ακετόνης και συνδυασμούς ακετόνης/νερού που έχουν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για την παραγωγή νανοϊνών με διάμετρο από 800 nm έως 1.3 μm [5]. Μελέτη βελτιστοποίησης παραμέτρων παρασκευής νανοϊνών Οι ακόλουθοι παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν τη παρασκευή νανοϊνών με τη μέθοδο του electrospinning εξετάστηκαν και βελτιστοποιήθηκαν για τις νανοϊνες CA: συγκέντρωση πολυμερούς: 5%, 10%, 17% και 20% σύστημα χρησιμοποιούμενου διαλύτη: Me 2 CO, Me 2 CO / H 2 O 90:10, Me 2 CO / H 2 O 80:20 και Me 2 CO / H 2 O 70:30 απόσταση της βελόνας από τον συλλέκτη: 9, 10, 11 και 12 cm εφαρμοζόμενη τάση: 10, 12, 14 και 16 kv ρυθμός τροφοδοσίας της σύριγγας: 0,1, 0,5, 1 και 2 ml/h τύπος συλλέκτη: στατικός (8 cm x 15 cm και 4 cm x 8 cm) και περιστρεφόμενο τύμπανο (500, 1000, 1500 και 2000 rpm) (Πίνακας 1). Με βάση τις προκαταρκτικές δοκιμές οι βέλτιστες παράμετροι για την επίτευξη της μικρότερης δυνατής διαμέτρου ίνας είναι οι ακόλουθες: 17% CA σε Me 2 CO / H 2 O 90:10, με απόσταση βελόνας-συλλέκτη 11 cm, τάση 14 kv, ρυθμό τροφοδοσίας 1 ml/h και στατικό συλλέκτη (Εικόνα 3). Εικόνα 3. Ανάλυση νανοϊνών 17% CA με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης. 4

5 Παραγωγή νανοϊνών τροποποιημένων με αντιβιοτικά και μελέτη των παραμέτρων ενσωμάτωσης των αντιβιοτικών στις νανοϊνες Νανοϊνες CA τροποποιημένες με νεομυκίνη Αρχικά δοκιμάστικε η τροποποίηση των νανοϊνών με το αντιβιοτικό νεομυκίνη. H νεομυκίνη (neomycin, NMC) είναι ένα αμινογλυκοσικό αντιβιοτικό, το οποίο έχει ευρεία χρήση σε ιατρικές συνταγές όπως κρέμες, σταγόνες για τα μάτια και αλοιφές [6]. Εντούτοις, υπάρχουν ενδείξεις για αλλεργικές αντιδράσεις στη χρήση του και οι δοσολογίες του πρέπει να είναι σε μικρές συγκεντρώσεις. Η νεομυκίνη ανήκει στην κατηγορία των αντιβιοτικών αμινογλυκοσιδών που περιέχουν δύο ή περισσότερα αμινοσάκχαρα που συνδέονται με γλυκοζιτικούς δεσμούς, με τη δομή της να παρουσιάζεται στην Εικόνα 4. Εικόνα 4. Χημική δομή της νεομυκίνης. Για την παραγωγή των νανοϊνών τροποποιημένων με NMC δοκιμάστηκαν διαφορετικές συνθήκες κατά την ηλεκτροϊνοποίηση (Πίνακες 1-3). Πίνακας 1. Επίδραση της συγκέντρωσης NMC στην παρασκευή νανοϊνών. CA (% wt) NMC (% wt) Διαλύτες Me 2 CO / H 2 O Τάση (kv) : : : Ρυθμός τροφοδοσίας (ml/h) Πίνακας 2. Επίδραση της προσθήκης DMSO στο διάλυμα του electrospinning. CA (% wt) NMC (% wt) Διαλύτες Me 2 CO / H 2 O / DMSO Τάση (kv) :1: :1: :1: Ρυθμός τροφοδοσίας (ml/h) 5

6 Πίνακας 3. Επίδραση της απόστασης βελόνας-συλλέκτη. CA (% wt) NMC (% wt) Διαλύτες Me 2 CO / H 2 O Απόσταση βελόναςσυλλέκτη (cm) Τάση (kv) :1: :1: :1: Ρυθμός τροφοδοσίας (ml/h) Τα συμπεράσματα που προέκυψαν από τις προκαταρκτικές δοκιμές ήταν τα ακόλουθα: Για συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του 3% η διάλυση της νεομυκίνης στο προτεινόμενο σύστημα διαλύτη δεν κατέστη εφικτή. Η προσθήκη του DMSO στο διάλυμα του electrospinning βοήθησε στην καλύτερη διάλυση της νεομυκίνης. Η μεμβράνη νανοϊνών που παρήχθη με την απόσταση συλλέκτη και βελόνας να είναι στα 12 cm ήταν πιο ομοιόμορφη με τις ίνες να μην είναι ομοιόμορφα κατανεμημένες και το δείγμα να είναι ογκώδες και χνουδωτό, ενώ στα 11 cm το δείγμα ήταν πιο ομοιόμορφο με την επιφάνεια του να δείχνει πιο λεία και με το βέλτιστο ρυθμό τροφοδοσίας να είναι στο 1 ml/h (Εικόνες 5 και 6). Εικόνα 5. Νανοϊνες CA τροποποιημένες με 3% νεομυκίνη. 6

7 Εικόνα 6. Ανάλυση νανοϊνών CA τροποποιημένων με 3% NMC με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης. Κατά τον έλεγχο της χημικής σταθερότητας της NMC μετά το electrospinning κατέστη σαφές με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR πως η χημική δομή της NMC με τις συνθήκες που έγιναν τα πειράματα τροποποιήθηκε (Εικόνες 7 και 8). Συγκεκριμένα μετά την ηλεκτροκλωστοποίηση η μεμβράνη CA που περιείχε νεομυκίνης εκχυλίστηκε με MeOH και το υπόλειμμα ελέγχθηκε με φασματοσκοπία NMR. Παρά τις τροποποιημένες και κατά το δυνατόν ηπιότερες συνθήκες που ήταν δυνατόν να εφαρμοσθούν κατά την ηλεκτροϊνοποίηση δε κατέστη δυνατή η διατήρηση της σταθερότητας της νεομυκίνης ( p p m) Εικόνα 7. Φάσμα 1 Η ΝΜR της νεομυκίνης. 7

8 ( p p m) Εικόνα 8. Φάσμα 1 Η ΝΜR του δείγματος που προέκυψε μετά την εκχύλιση νανοϊνών CA τροποποιημένων με NMC. Για τον λόγο αυτό αποφασίστηκε να μην συνεχιστούν περεταίρω οι δοκιμές και να μην αξιολογηθούν οι συγκεκριμένες νανοϊνες ως προς τον ρυθμό αποδέσμευσης του αντιβιοτικού. Νανοϊνες CA τροποποιημένες με φουσιδικό οξύ To φουσιδικό οξύ (fusidic acid, FA) είναι ένα αντιβιοτικό το οποίο προέρχεται από το μύκητα Fusidium coccineum και πρόκειται για ένα σημαντικό αντιβιοτικό που είναι ενεργό ενάντια σε ανθεκτικά στη μεθικιλίνη στελέχη του βακτηρίου Staphylococcus aureus (MRSA), στο οποίο οφείλονται αρκετοί θάνατοι στα νοσοκομεία [7]. Η δομή του φουσιδικού οξέος παρουσιάζεται στην Εικόνα 9. Εικόνα 9. Χημική δομή του φουσιδικού οξέος. 8

9 Διαφορετικές συγκεντρώσεις φουσιδικού οξέος (1%, 5%, 10%, 15% και 20%) προστέθηκαν ταυτόχρονα στο διάλυμα CA και αφέθηκαν υπό ανάδευση για 24 ώρες πριν να ξεκινήσει η διαδικασία της ηλεκτροϊνοποίησης. Ο ρυθμός τροφοδοσίας του διαλύματος ηλεκτροϊνοποίησης επηρεάζει την τελική μορφή και τις ιδιότητες της παραγόμενης μεμβράνης. Στην παρούσα μελέτη, για το διάλυμα CA με φουσιδικό οξύ εξετάσθηκαν οι ρυθμοί τροφοδοσίας 0.5, 1, 2 και 5 ml/h. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι με ρυθμό τροφοδοσίας 1 ml/h ήταν εφικτή η συνεχής παραγωγή ινών χωρίς να παρουσιάζονται προβλήματα ασυνεχούς ροής κατά τη διάρκεια της ηλεκτροϊνοποίησης. Ακόμη, μελετήθηκε η επίδραση της απόστασης της βελόνας από τον συλλέκτη στην παραγωγή μεμβρανών. Για τη μικρότερη απόσταση (10 cm) μια μη ομοιόμορφη κατανομή των ινών στο συλλέκτη παρατηρήθηκε. Κατά τη μεγαλύτερη απόσταση (15 cm) οι τροποποιημένες ίνες με φουσιδικό οξύ δεν κατάφεραν να εναποτεθούν στο συλλέκτη. Όταν η απόσταση ρυθμίστηκε στα 11 cm ομοιόμορφο δείγμα μεμβράνης δημιουργήθηκε με συνεχή ροή χωρίς διακοπές του διαλύματος της ηλεκτροϊνοποίησης. Η απόσταση αυτή επιλέχθηκε για τα επόμενα πειράματα που ακολουθήθηκαν. Με βάση τις παραπάνω προκαταρκτικές μετρήσεις επιλέχθηκαν τρεις διαφορετικές συνθήκες για τη παραγωγή νανοϊνών τροποποιημένων με διαφορετικές συγκεντρώσεις φουσιδικού οξέος προκειμένου να αξιολογηθεί ο ρυθμός απελευθέρωσης του. Συγκεκριμένα, οι βέλτιστες συνθήκες ηλεκτροϊνοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή των νανοϊνών CA τροποποιημένων με 10% φουσιδικό οξύ (Εικόνες 10 και 11) ήταν οι ακόλουθες: 10% FA σε διάλυμα 17% CA σε Me2CO:H2O 9:1 Τάση: 14 kv Απόσταση της βελόνας από τον συλλέκτη: 11 cm Διάμετρος βελόνας: 18 G Ροή διαλύματος: 2 ml/h Τύπος συλλέκτη: στατικός Εικόνα 10. Νανοϊνες CA τροποποιημένες με 10% φουσιδικό οξύ. 9

10 Εικόνα 11. Ανάλυση νανοϊνών CA τροποποιημένων με 10% φουσιδικό οξύ με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης. Οι βέλτιστες συνθήκες ηλεκτροϊνοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή των νανοϊνών CA τροποποιημένων με 5% φουσιδικό οξύ (Εικόνες 12 και 13) ήταν οι ακόλουθες: 5% FA σε διάλυμα 17% CA σε Me2CO:H2O 9:1 Τάση: 14 kv Απόσταση της βελόνας από τον συλλέκτη: 11 cm Διάμετρος βελόνας: 23 G Ροή διαλύματος: 1 ml/h Τύπος συλλέκτη: στατικός Εικόνα 12. Νανοϊνες CA τροποποιημένες με 5% φουσιδικό οξύ. 10

11 Εικόνα 13. Ανάλυση νανοϊνών CA τροποποιημένων με 5% φουσιδικό οξύ με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης. Οι βέλτιστες συνθήκες ηλεκτροϊνοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή των νανοϊνών CA τροποποιημένων με 1% φουσιδικό οξύ (Εικόνες 14 και 15) ήταν οι ακόλουθες: 1% FA σε διάλυμα 17% CA σε Me2CO:H2O 9:1 Τάση: 14 kv Απόσταση της βελόνας από τον συλλέκτη: 11 cm Διάμετρος βελόνας: 23 G Ροή διαλύματος: 1 ml/h Τύπος συλλέκτη: στατικός Εικόνα 14. Νανοϊνες CA τροποποιημένες με 1% φουσιδικό οξύ. 11

12 Εικόνα 15. Ανάλυση νανοϊνών CA τροποποιημένων με 1% φουσιδικό οξύ με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης. Κατά τον έλεγχο της χημικής σταθερότητας του FA μετά το electrospinning κατέστη σαφές με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR ότι η χημική δομή του φουσιδικού οξέος παρέμεινε ανεπηρέαστη και μετά το electrospinning (Εικόνες 16 και 17). Συγκεκριμένα μετά την ηλεκτροκλωστοποίηση η μεμβράνη CA που περιείχε φουσιδικό οξύ εκχυλίστηκε με CH 2 Cl 2 και το υπόλειμμα ελέγχθηκε με φασματοσκοπία NMR ( p p m) Εικόνα 16. Φάσμα 1 Η ΝΜR του φουσιδικού οξέος. 12

13 ( p p m) Εικόνα 17. Φάσμα 1 Η ΝΜR του δείγματος που προέκυψε μετά την εκχύλιση νανοϊνών CA τροποποιημένων με FA. Νανοϊνες CA τροποποιημένες με οξοτετρακυκλίνη Η οξοτετρακυκλίνη (oxytetracycline, OTC) ανήκει στην κατηγορία των αντιβιοτικών τετρακυκλίνης και χρησιμοποιείται σε πολλές περιπτώσεις μολύνσεων [8]. Θεωρείται αντιβιοτικό ευρέως φάσματος με δράση κατά πολλών βακτηρίων και κυριότερα χρησιμοποιείται για τη θεραπεία μολύνσεων από Chlamydia και Mycoplasma. Η δομή της οξοτετρακυκλίνης παρουσιάζεται στην Εικόνα 18. Εικόνα 18. Χημική δομή της οξοτετρακυκλίνης. Για την παραγωγή των νανοϊνών CA τροποποιημένων με OTC δοκιμάστηκαν διαφορετικές συνθήκες κατά την ηλεκτροϊνοποίηση (Πίνακες 4-6). 13

14 Πίνακας 4. Επίδραση της απόστασης μεταξύ βελόνας - συλλέκτη. Τετρακυκλίνη (%) Οξική Κυτταρίνη (%) Απόσταση (cm) Ρυθμός τροφοδοσίας (ml/h) Τάση (kv) Πίνακας 5. Επίδραση του ρυθμού τροφοδοσίας του διαλύματος ηλεκτροϊνοποίησης. Τετρακυκλίνη (% ) Οξική Κυτταρίνη (%) Απόσταση (cm) Ρυθμός τροφοδοσίας (ml/h) Τάση (kv) Πίνακας 6. Επίδραση της συγκέντρωσης οξοτετρακυκλίνης. Τετρακυκλίνη (%) Οξική Κυτταρίνη (%) Απόσταση (cm) Ρυθμός τροφοδοσίας (ml/h) Τάση (kv) Με βάση τις παραπάνω μετρήσεις οι βέλτιστες συνθήκες ηλεκτροϊνοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή των νανοϊνών CA τροποποιημένων με οξοτετρακυκλίνη (Εικόνες 19 και 20) προκειμένου να αξιολογηθεί ο ρυθμός απελευθέρωσης της οξοτετρακυκλίνης ήταν οι ακόλουθες: 10% OTC σε διάλυμα 7% CA σε Me2CO Τάση: 20 kv Απόσταση της βελόνας από τον συλλέκτη: 11 cm Διάμετρος βελόνας: 23 G Ροή διαλύματος: 4 ml/h Τύπος συλλέκτη: στατικός 14

15 Εικόνα 19. Νανοϊνες CA τροποποιημένες με 10% οξοτετρακυκλίνη. Εικόνα 20. Ανάλυση νανοϊνών CA τροποποιημένων με 10% οξοτετρακυκλίνη με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης. Νανοϊνες με βάση το PLAτροποποιημένες με οξοτετρακυκλίνη Καθώς η ενσωμάτωση αντιβιοτικών σε νανοϊνες PLA έχει δείξει τάχιστη απελευθέρωση του αντιβιοτικού με βάση την βιβλιογραφία [9], αποτέλεσμα το οποίο δεν είναι επιθυμητό σε συστήματα ελεγχόμενης αποδέσμευσης, αποφασίστηκε η παραγωγή μεμβρανών νανοϊνών από PLA με την προσθήκη διαφορετικών συμπολυμερών στοχεύοντας στην βραδύτερη αποδέσμευση του αντιβιοτικού. 1) Σύστημα PLA/CA + 10% OTC Για την παραγωγή των νανοϊνών PLA/CA τροποποιημένων με OTC δοκιμάστηκαν διαφορετικές συνθήκες κατά την ηλεκτροϊνοποίηση (Πίνακες 7 και 8). 15

16 Πίνακας 7. Επίδραση του συστήματος διαλυτών στην παρασκευή μεμβρανών PLA/CA. PLA (% ) Οξική Κυτταρίνη (%) 4% 4% 4% 4% 4% 4% Σύστημα Διαλυτών Acetone (1ml) Acetone (1ml) Acetone (2ml) DCM (1ml) CHCl 3 (3ml) CHCl 3 (6ml) MeOH (0.5ml) MeOH (1ml) MeOH (2ml) Απόσταση (cm) Τάση (kv) Πίνακας 8. Επίδραση της συγκέντρωσης οξοτετρακυκλίνης στην ενσωμάτωσή της σε διάλυμα ηλεκτροϊνοποίησης. Τετρακυκλίνη (%) Οξική Κυτταρίνη (%) PLA (% ) Ac/CHCl 3 /MeOH Απόσταση (cm) :6: :6: :6: :6: Ρυθμός τροφοδοσίας (ml/h) Η παραγωγή μεμβράνης νανοϊνών μετά την ενσωμάτωση της οξοτετρακυκλίνης στα διαλύματα PLA/CA δεν κατέστη εφικτή. Αντ αυτού παρατηρήθηκε η παραγωγή εύθρυπτου υμενίου από νανοσωματίδια. 2) Σύστημα PLA/PCL + 10% OTC Για την παραγωγή των νανοϊνών PLA/PCL τροποποιημένων με OTC δοκιμάστηκαν διαφορετικές συνθήκες κατά την ηλεκτροϊνοποίηση. Οι βέλτιστες συνθήκες ηλεκτροϊνοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή των νανοϊνών PLA/PCL τροποποιημένων με οξοτετρακυκλίνη (Εικόνες 21 και 22) προκειμένου να αξιολογηθεί ο ρυθμός απελευθέρωσης της ήταν οι ακόλουθες: 10% OTC σε διάλυμα PLA/PCL 1:1,125 σε CHCl3 / MeOH 2:1 Τάση: 15 kv Απόσταση της βελόνας από τον συλλέκτη: 10 cm Διάμετρος βελόνας: 21 G Ροή διαλύματος: 100 μl/h Τύπος συλλέκτη: στατικός 16

17 Εικόνα 21. Νανοϊνες PLA/PCL τροποποιημένες με 10% οξοτετρακυκλίνη. Εικόνα 22. Ανάλυση νανοϊνών PLA/PCL τροποποιημένων με 10% οξοτετρακυκλίνη με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης. 3) Σύστημα PLA/PCL/CA + 10% OTC Για την παραγωγή των νανοϊνών PLA/PCL/CA τροποποιημένων με OTC δοκιμάστηκαν διαφορετικές συνθήκες κατά την ηλεκτροϊνοποίηση. Οι βέλτιστες συνθήκες ηλεκτροϊνοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή των νανοϊνών PLA/PCL/CA τροποποιημένων με οξοτετρακυκλίνη προκειμένου να αξιολογηθεί ο ρυθμός απελευθέρωσης της ήταν οι ακόλουθες: 10% OTC σε διάλυμα PLA/PCL/CA 1:1,125:1 σε CHCl3 / Me2CO / MeOH 2:1:1 Τάση: 15 kv Απόσταση της βελόνας από τον συλλέκτη: 10 cm Διάμετρος βελόνας: 21 G Ροή διαλύματος: 100 μl/h 17

18 Τύπος συλλέκτη: στατικός Εκτίμηση του ρυθμού αποδέσμευσης των αντιβιοτικών από τις τροποποιημένες νανοϊνες Οι παράγοντες που επηρεάζουν την απελευθέρωση ενός φαρμάκου από μεμβράνες που παράγονται με τη μέθοδο της ηλεκτροϊνοποίησης περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων τη γεωμετρία, το πάχος, τη διάμετρο και το πορώδες της ίνας, την σύνθεση της ίνας, την ικανότητα διόγκωσης της ίνας, τις αλληλεπιδράσεις του φαρμάκου με το σύστημα διαλύτη της ηλεκτροϊνοποίησης και τη διαλυτότητα του φαρμάκου στο μέσο απελευθέρωσης. Προκειμένου να αξιολογηθεί ο ρυθμός απελευθέρωσης των αντιβιοτικών ελέχθησαν τρεις πειραματικές διατάξεις (Εικόνα 23), οι οποίες μπορούν να δεχτούν νανοϊνες σε επαφή με ρυθμιστικό διάλυμα. Συγκεκριμένα, ελέγχθηκαν: (α) μία συστοιχία από Franz Cells με θάλαμο σταθερού όγκου όπου η μεμβράνη νανοϊνών έρχεται σε επαφή με το ρυθμιστικό διάλυμα μόνο από τη μία πλευρά, ενώ το προς έλεγχο δείγμα λαμβάνεται από τον πλευρικό αυλό, (β) μεμβράνες μοριακού αποκλεισμού τοποθετημένες σε ποτήρια ζέσεως με συγκεκριμένο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος, όπου η μεμβράνη νανοϊνών δεν έρχεται σε απευθείας επαφή με το ρυθμιστικό διάλυμα από το οποίο λαμβάνεται το προς έλεγχο δείγμα και (γ) φιαλίδια σταθερού όγκου με πώμα όπου η μεμβράνη νανοϊνών εμβαπτίζεται απευθείας σε συγκεκριμένο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος από το οποίο λαμβάνεται το προς έλεγχο δείγμα μετά από φυγοκέντρηση. Και στις τρεις περιπτώσεις οι πειραματικές διατάξεις ήταν τοποθετημένες σε θερμοστατούμενο υδατόλουτρο στους 37 C, ενώ το ρυθμιστικό διάλυμα βρισκόταν υπό συνεχή ανάδευση σε μαγνητικό αναδευτήρα. Όλες οι μετρήσεις έγιναν σε τρεις επαναλήψεις. Εικόνα 23. Οι τρεις πειραματικές διατάξεις για την εκτίμηση του ρυθμού αποδέσμευσης των αντιβιοτικών. 18

19 Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν μικρή απόκλιση μόνο κατά τη μέτρηση 1 ώρα μετά από την έναρξη του πειράματος και συγκεκριμένα στις μεμβράνες μοριακού αποκλεισμού μετρήθηκε 30% μικρότερη συγκέντρωση του αντιβιοτικού σε σχέση με τις δύο άλλες διατάξεις. Η παρατηρούμενη διαφορά ελαχιστοποιήθηκε μετά τη 2 η ώρα. Λόγω της μεγαλύτερης ευκολίας χειρισμού αποφασίστηκε η χρήση της τρίτης μεθόδου (Εικόνα 24). Εικόνα 24. Η πειραματική διάταξη που επιλέχθηκε για την εκτίμηση του ρυθμού αποδέσμευσης των αντιβιοτικών. Συγκεκριμένη ποσότητα από κάθε τροποποιημένη μεβράνη νανοϊνών (20-50 mg) τοποθετήθηκε σε πωματισμένα φιαλίδια με 25 ml ρυθμιστικού διαλύματος Phosphate Saline Buffer (PBS). Η συγκέντρωση του αντιβιοτικού που απελευθερώθηκε, καθώς και ο ρυθμός αποδέσμευσης καθορίστηκε με βάση τις απορροφήσεις των δειγμάτων που μετρήθηκαν σε φασματοφωτόμετρο UV-Vis στο κατάλληλο μήκος κύματος σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα και τη χρήση πρότυπων καμπυλών αναφοράς για κάθε αντιβιοτικό. Αξιολόγηση του ρυθμού αποδέσμευσης της οξοτετρακυκλίνης Στην Εικόνα 25 φαίνεται η πρότυπη καμπύλη αναφοράς που προέκυψε για την οξοτετρακυκλίνη μετά από μέτρηση των απορροφήσεων διαλυμάτων οξοτετρακυκλίνης γνωστών συγκεντρώσεων στα 364 nm. 19

20 Absorbance (364 nm) y = x R² = Concentration of OTC (mg/ml) Εικόνα 25. Πρότυπη καμπύλη αναφοράς για την οξοτετρακυκλίνη. Αξιολόγηση του ρυθμού αποδέσμευσης της οξοτετρακυκλίνης συγκέντρωσης 10% από νανοϊνες PLA/PCL Στην Εικόνα 26 παρουσιάζονται τα φάσματα UV-Vis που μετρήθηκαν στις διαφορετικές χρονικές στιγμές δειγματοληψίας (1-96 h), ενώ στον Πίνακα 9 φαίνονται οι μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση της οξοτετρακυκλίνης από τη μεμβράνη νανοϊνών PLA/PCL. Εικόνα 26. Τα φάσματα UV-Vis που μετρήθηκαν στις διαφορετικές χρονικές στιγμές δειγματοληψίας (1-96 h) για την αποδέσμευση της OTC. 20

21 Absorbance (at 364 nm) Πίνακας 9. Μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση της οξοτετρακυκλίνης από τη μεμβράνη νανοϊνών PLA/PCL. Time (h) Abs (1 st Abs (2 nd Abs (3 rd AVG Abs STDEV Released OTC (mg) release rate (%) Στις Εικόνες 27 και 28 φαίνονται το διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 364 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας και το διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης του αντιβιοτικού σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας, αντίστοιχα Time (h) Εικόνα 27. Διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 364 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας. 21

22 Release rate (%) Time (h) Εικόνα 28. Διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης της OTC σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας. Αξιολόγηση του ρυθμού αποδέσμευσης της οξοτετρακυκλίνης συγκέντρωσης 10% από νανοϊνες PLA/PCL/CA Στον Πίνακα 10 φαίνονται οι μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση της οξοτετρακυκλίνης από τη μεμβράνη νανοϊνών PLA/PCL/CA. Πίνακας 10. Μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση της οξοτετρακυκλίνης από τη μεμβράνη νανοϊνών PLA/PCL/CA. Time (h) Abs (1 st Abs (2 nd Abs (3 rd AVG Abs STDEV Released OTC (mg) release rate (%) Στις Εικόνες 29 και 30 φαίνονται το διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 364 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας και το διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης του αντιβιοτικού σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας, αντίστοιχα. 22

23 Release rate (%) Absorbance (at 364 nm) Time (h) Εικόνα 29. Διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 364 nm σε σχέση με τον 120 χρόνο δειγματοληψίας Time (h) Εικόνα 30. Διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης της OTC σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας. Αξιολόγηση του ρυθμού αποδέσμευσης της οξοτετρακυκλίνης συγκέντρωσης 10% από νανοϊνες CA Στον Πίνακα 11 φαίνονται οι μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση της οξοτετρακυκλίνης από τη μεμβράνη νανοϊνών CA. 23

24 Absorbance (at 364 nm) Πίνακας 11. Μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση της οξοτετρακυκλίνης από τη μεμβράνη νανοϊνών CA. Time Abs (1 st Abs (2 nd Abs (3 rd AVG STDEV Released release (h) Abs OTC (mg) rate (%) Στις Εικόνες 31 και 32 φαίνονται το διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 364 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας και το διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης του αντιβιοτικού σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας, αντίστοιχα Time (h) Εικόνα 31. Διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 364 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας. 24

25 Absorbance (226 nm) Release rate (%) Time (h) Εικόνα 32. Διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης της OTC σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας. Αξιολόγηση του ρυθμού αποδέσμευσης του φουσιδικού οξέος Στην Εικόνα 33 φαίνεται η πρότυπη καμπύλη αναφοράς που προέκυψε για την οξοτετρακυκλίνη μετά από μέτρηση των απορροφήσεων διαλυμάτων φουσιδικού οξέος γνωστών συγκεντρώσεων στα 226 nm y = x R² = Concentration of FA (mg/ml) Εικόνα 33. Πρότυπη καμπύλη αναφοράς για το φουσιδικό οξύ. 25

26 Αξιολόγηση του ρυθμού αποδέσμευσης του φουσιδικού οξέος συγκέντρωσης 10% από νανοϊνες οξικής κυτταρίνης Στην Εικόνα 34 παρουσιάζονται τα φάσματα UV-Vis που μετρήθηκαν στις διαφορετικές χρονικές στιγμές δειγματοληψίας (1-128 h), ενώ στον Πίνακα 12 φαίνονται οι μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση του φουσιδικού οξέος από τη μεμβράνη νανοϊνών CA. Εικόνα 34. Τα φάσματα UV-Vis που μετρήθηκαν στις διαφορετικές χρονικές στιγμές δειγματοληψίας (1-128 h) για την αποδέσμευση του FA. Πίνακας 12. Μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση του φουσιδικού οξέος από τη μεμβράνη νανοϊνών CA. Time (h) Abs (1 st Abs (2 nd Abs (3 rd AVG Abs STDEV Released FA (mg) release rate (%)

27 Release rate (%) Absorbance (at 226 nm) Στις Εικόνες 35 και 36 φαίνονται το διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 226 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας και το διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης του αντιβιοτικού σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας, αντίστοιχα Time (h) Εικόνα 35. Διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 226 nm σε σχέση με τον 30 χρόνο δειγματοληψίας Time (h) Εικόνα 36. Διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης του FA σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας. Αξιολόγηση του ρυθμού αποδέσμευσης του φουσιδικού οξέος συγκέντρωσης 5% από νανοϊνες οξικής κυτταρίνης Στον Πίνακα 13 φαίνονται οι μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση του φουσιδικού οξέος από τη μεμβράνη νανοϊνών CA. 27

28 Absorbance (at 226 nm) Πίνακας 13. Μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση του φουσιδικού οξέος από τη μεμβράνη νανοϊνών CA. Time (h) Abs (1 st Abs (2 nd Abs (3 rd AVG Abs STDEV Released FA (mg) release rate (%) Στις Εικόνες 37 και 38 φαίνονται το διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 226 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας και το διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης του αντιβιοτικού σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας, αντίστοιχα Time (h) Εικόνα 37. Διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 226 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας. 28

29 Release rate (%) Time (h) Εικόνα 38. Διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης του FA σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας. Αξιολόγηση του ρυθμού αποδέσμευσης του φουσιδικού οξέος συγκέντρωσης 1% από νανοϊνες οξικής κυτταρίνης Στον Πίνακα 14 φαίνονται οι μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση του φουσιδικού οξέος από τη μεμβράνη νανοϊνών CA. Πίνακας 14. Μετρήσεις για κάθε επανάληψη για την αποδέσμευση του φουσιδικού οξέος από τη μεμβράνη νανοϊνών CA. Time (h) Abs (1 st Abs (2 nd Abs (3 rd AVG Abs STDEV Released FA (mg) release rate (%) Στις Εικόνες 39 και 40 φαίνονται το διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 226 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας και το διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης του αντιβιοτικού σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας, αντίστοιχα. 29

30 Release rate (%) Absorbance (at 226 nm) Time (h) Εικόνα 39. Διάγραμμα απορρόφησης μετρούμενου δείγματος στα 226 nm σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας Time (h) Εικόνα 40. Διάγραμμα του ρυθμού αποδέσμευσης του FA σε σχέση με τον χρόνο δειγματοληψίας. Συμπεράσματα 1) Βελτιστοποιήθηκαν οι συνθήκες για την ηλεκτροϊνοποίηση πολυμερών τροποποιημένων με διαφορετικά αντιβιοτικά και συγκεκριμένα (α) οξικής κυτταρίνης τροποποιημένης με φουσιδικό οξύ, οξοτετρακυκλίνη και νεομυκίνη (β) πολυγαλακτικού οξέος με πολυκαπρολακτόνη ή/και με οξική κυτταρίνη τροποποιημένων με οξοτετρακυκλίνη. Υπό τις βελτιστοποιημένες συνθήκες η διάμετρος των νανοϊνών κυμαινόταν στα επίπεδα των 300 nm έως 1,5 μm. 30