Λειτουργική ανάλυση της 5 ανοδικής περιοχής του γονιδίου hsp83 της Μεσογειακής µύγας και έκφραση του γονιδίου σε συνθήκες ψυχρού στρες.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Λειτουργική ανάλυση της 5 ανοδικής περιοχής του γονιδίου hsp83 της Μεσογειακής µύγας και έκφραση του γονιδίου σε συνθήκες ψυχρού στρες. ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΒΑΣΙΛΗΣ ΠΑΣΠΑΛΙΑΡΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2012

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα µεταπτυχιακή εργασία πραγµατοποιήθηκε στα εργαστήρια του Τοµέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Πατρών από τον Οκτώβριο του 2010 έως τον Ιούνιο του Η ανάθεση και η επίβλεψη της εργασίας έγινε από τον Καθηγητή κ. Μίντζα Αναστάσιο, τον οποίο ευχαριστώ θερµά για τη βοήθεια και την εµπιστοσύνη που µου έδειξε όλο το διάστηµα της εργασίας µου στο εργαστήριό του. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο καθηγητή κ. Χρυσάνθη Γεώργιο για την πολύτιµη βοήθειά του στις ενέσεις, και τους Καθηγητές κ. Φλυτζάνη Κωνσταντίνο και κ. Κατσώρη Παναγιώτη που δέχθηκαν να γίνουν µέλη της εξεταστικής επιτροπής. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την γιατρό κ. Χαρισιάδη Μαρίνα για την ψυχολογική υποστήριξη που µου πρόσφερε κατά τη διάρκεια όλου του µεταπτυχιακού, τη διδακτορική φοιτήτρια και φίλη µου κ. Τσακίρη Ελένη για τη συντροφιά της, όλους τους συναδέλφους στο εργαστήριο που δηµιούργησαν ένα άψογο κλίµα για εργασία και τους γονείς µου που µε στήριξαν όλο τον καιρό κατά την παραµονή µου στην Πάτρα.

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ..3 Α.1 Θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες και κυτταρικό στρες...4 Α.2 Η πρωτεΐνη HSP Α2.1 Η πρωτεΐνη HSP90 είναι ένα εξειδικευµένο εργαλείο αναδίπλωσης πρωτεϊνών 5 Α2.2 Η συµµετοχή της HSP90 στη σύνθεση πρωτεϊνικών συµπλόκων...14 Α2.3 Η HSP90 καταστέλλει την φαινοτυπική ποικιλοµορφία στη Drosophila melanogaster.16 Α.3 Ρύθµιση των hsp γονιδίων και του γονιδίου HSP90.18 Α.4 Το γονίδιο Cchsp Α.5 Το γονίδιο λουσιφεράση του θαλάσσιου κοπίποδου Metridia longa και το µεταθέσιµο γενετικό στοιχείο piggybac του σκώρου Trichoplusia ni...22 Α.6 Οι επιπτώσεις του ψυχρού στρες στα έντοµα 25 Α.7 Η µεσογειακή µύγα. Μορφολογία, κύκλος ζωής και οικονοµική σηµασία 27 Α.8 Η τεχνική της απελευθέρωσης στείρων εντόµων (Sterile Insect Technique,SIT)...29 Α.9 Στόχος της παρούσας διπλωµατικής εργασίας..31 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ...32 Β.1 Προετοιµασία δεκτικών κυττάρων (competent cells) για µετασχηµατισµό..33 Β.2 Μετασχηµατισµός βακτηρίων µε πλασµιδιακό DNA...35 Β.3 Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA..35 Β.4 Hλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωµα αγαρόζης..37 Β.5 Αποµόνωση DNA από πήκτωµα αγαρόζης (gel-extraction).38 Β.6 Αποφωσφορυλίωση άκρων DNA µε ανταρκτική φωσφατάση.39 Β.7 Σύνδεση µορίων DNA µε αντίδραση λιγάσης...39 Β.8 Καθαρισµός DNA ύστερα από PCR ή άλλες αντιδράσεις 40 Β.9 Φωτοµέτρηση διαλύµατος DNA και RNA 41 Β.10 Καλλιέργεια του εντόµου Ceratitis capitata...42 Β.11Γενετικός µετασχηµατισµός της µεσογειακής µύγας Ceratitis capitata και κατασκευή οµόζυγων διαγονιδιακών σειρών..44 1

4 Β.12 Ανατοµία ενήλικων ατόµων C. capitata...46 Β.13 Μελέτη της ενεργότητας της λουσιφεράσης σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα 46 Β.14 Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεϊνών.47 Β.15 Αποµόνωση ολικού RNA χρησιµοποιώντας το διάλυµα Tripure Isolation Reagent (Roche) 48 Β.16 Ηλεκτροφόρηση RNA σε πήκτωµα αγαρόζης 49 Β.17 Κατεργασία ολικών RNA δειγµάτων µε DNAase I 50 Β.18 RT-PCR µε το πλήρες σύστηµα αντιδραστηρίων OneStep RT-PCR (Qiagen)..51 Β.19 q-rt-pcr µε το πλήρες σύστηµα αντιδραστηρίων KAPA SYBR FAST One-Step qrt-pcr Kit.52 Γ.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 55 Γ1. Λειτουργική ανάλυση της 5 περιοχής του Cchsp83 γονιδίου σε γενετικά µετασχηµατισµένα Cchsp83P-Luc στελέχη της Μεσογειακής µύγας.56 Γ1.1. Κατασκευή ανασυνδυασµένων φορέων γενετικού µετασχηµατισµού pbac- Cchsp83P-Luc..56 Γ1.2. Γενετικός µετασχηµατισµός της µεσογειακής µύγας µε τους ανασυνδυασµένους φορείς pbac-hsp83p-luc.58 Γ1.3. Μελέτη της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς στα µετασχηµατισµένα στελέχη..60 Γ2. Βιωσιµότητα και έκφραση του γονιδίου Cchsp83 σε συνθήκες ψυχρού στρες 62 Γ2.1. Έλεγχος της βιωσιµότητας σε συνθήκες ψυχρού στρες.63 Γ2.2. Επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου Cchsp83 από το ψυχρού στρες ΣΥΖΗΤΗΣΗ...65 Ε.ΠΕΡΙΛΗΨΗ 68 Ζ.SUMMARY.70 H.ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 72 2

5 Α.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3

6 Α.1 Θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες και κυτταρικό στρες Το 1962 ο Ferrucio M. Ritossa, εξετάζοντας την επίδραση της θερµοκρασίας στους σιελογόνους αδένες της Drosophila busckii, παρατήρησε ότι η αύξηση της θερµοκρασίας είχε ως αποτέλεσµα την εµφάνιση ενός νέου προτύπου χρωµοσωµατικών διογκώσεων (puffs) στα πολυταινικά χρωµοσώµατα του εντόµου. Συγκεκριµένα, παρατήρησε ότι οι περισσότερες χρωµοσωµατικές διογκώσεις που υπήρχαν πριν από την αύξηση της θερµοκρασίας, ελαττώνονταν σε µέγεθος ή και εξαφανίζονταν τελείως, ενώ ταυτόχρονα εµφανίζονταν καινούριες. Γνωρίζοντας ότι οι χρωµοσωµατικές διογκώσεις είναι θέσεις µε έντονη µεταγραφική δραστηριότητα, ο ερευνητής αυτός κατέληξε στο συµπέρασµα ότι η αύξηση της θερµοκρασίας προκαλεί σηµαντικές αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων (Ritossa, 1962). Χρειάστηκε όµως να περάσουν 12 ακόµα χρόνια, για να ανακαλυφθούν τα προϊόντα των γονιδίων αυτών και να αποδοθούν οι όροι θερµοεπαγόµενα γονίδια και θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες αντίστοιχα (Tissieres et al., 1974). Οι θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες δεν εµφανίζονται στα κύτταρα µόνο λόγω αύξησης της θερµοκρασίας. Η σύνθεσή τους επάγεται και από άλλους περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως τα βαρέα µέταλλα, οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και η ανοξία, καθώς επίσης και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως σε περιπτώσεις µολύνσεων, τραυµατισµού των ιστών και πυρετού (Εικόνα Α1). Εικόνα Α1: Παράγοντες που επάγουν τη σύνθεση των θερµοεπαγόµενων πρωτεϊνών. Σε αυτούς συµπεριλαµβάνονται περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως η αύξηση της θερµοκρασίας, τα βαρέα µέταλλα, οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και η ανοξία, καθώς επίσης και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως σε περιπτώσεις µολύνσεων, τραυµατισµού των ιστών και πυρετού. Ακόµα τα γονίδια των θερµοεπαγόµενων πρωτεϊνών επάγονται κατά τον κυτταρικό κύκλο, την ανάπτυξη, την διαφοροποίηση, τους αυξητικούς παράγοντες και από τα πρώτο-ογκογονίδια Επιπλέον, κάποια από τα µέλη της οικογένειας των θερµοεπαγόµενων πρωτεϊνών, οι οποίες ονοµάζονται συγγενείς θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες (Heat shock cognates HSCs), συντίθενται 4

7 συστατικά (constitutively) και παίζουν ρόλο σε φυσιολογικές λειτουργίες των κυττάρων, όπως ο κυτταρικός κύκλος και η κυτταρική διαφοροποίηση (Feige and Polla, 1994). Οι θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες είναι άφθονες στα κύτταρα. Το ποσοστό των πρωτεϊνών αυτών φτάνει έως και 5-10% των ολικών πρωτεϊνών των κυττάρων, ανάλογα µε τη στρεσογόνο κατάστασή τους. Εντοπίζονται τόσο στο κυτταρόπλασµα, όσο και σε διάφορα υποκυτταρικά οργανίδια, όπως τα µιτοχόνδρια, οι χλωροπλάστες και το ενδοπλασµατικό δίκτυο. Η ταξινόµησή τους βασίζεται στο µοριακό τους βάρος, το οποίο προσδιορίζεται µε ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικά πηκτώµατα πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE). Με βάση την ονοµατολογία αυτή οι θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες χωρίζονται στις οικογένειες : HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 και shsps (µικρές θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες). Α.2 Η πρωτεΐνη HSP90 Ένα από τα κυριότερα γονίδια τα προϊόντα των οποίων αποτελούν µέρος του µηχανισµού αναδίπλωσης των πρωτεϊνών είναι το γονίδιο hsp83, το οποίο κωδικοποιεί την κυτταροπλασµατική πρωτεΐνη HSP90. Οµόλογα του γονιδίου αυτού συναντώνται από τα βακτήρια µέχρι και τον άνθρωπο, ενώ η πρωτεΐνη HSP90 αποτελεί το 1-2% των κυτταροπλασµατικών πρωτεϊνών ενός κυττάρου σε φυσιολογικές συνθήκες (Krukenberg et al. 2011), µε το ποσοστό να ανεβαίνει σε συνθήκες στρες, όπως η απότοµη αύξηση της θερµοκρασίας. Σε συνθήκες στρες παρατηρείται υπερέκφραση του γονιδίου hsp83 καθώς απαιτούνται υψηλές συγκεντρώσεις της HSP90 για τη σωστή επαναδίπλωση των αποδιαταγµένων πρωτεϊνών, ενώ σε κανονικές συνθήκες η HSP90 είναι αναγκαία για τη ρύθµιση της αναδίπλωσης ενός µεγάλου συνόλου πρωτεϊνικών υποστρωµάτων (Krukenberg et al. 2011). Επίσης, η HSP90 ενέχεται στον φαινοτυπικό καθορισµό, όπως έχουν δείξει µελέτες στη D. melanogaster (Rutherford και Lindquist 1998, Specchia et al. 2010), ενώ παράλληλα ανοίγει νέους ορίζοντες για την θεραπεία του καρκίνου, αποτελώντας η ίδια η πρωτεΐνη φαρµακευτικό στόχο (Jhaveri et al. 2011). Α2.1 Η πρωτεΐνη HSP90 είναι ένα εξειδικευµένο εργαλείο αναδίπλωσης πρωτεϊνών. Τα κύτταρα είναι εξοπλισµένα µε µοριακούς συνοδούς, εξασφαλίζοντας µε αυτόν τον τρόπο την κατάλληλη αναδίπλωση των πρωτεϊνών τόσο κατά την σύνθεσή τους όσο και σε συνθήκες αποδιατακτικού στρες. Οι διάφοροι µοριακοί συνοδοί ακολουθούν ξεχωριστές στρατηγικές αναδίπλωσης των πρωτεϊνών. Έτσι και η πρωτεΐνη HSP90 ως µοριακός συνοδός ακολουθεί τη δική της. Πιο συγκεκριµένα η HSP90 προσδένεται στα υποστρώµατά της που δεν είναι άλλο από πρωτεΐνες που είναι κοντά στο να αποκτήσουν τη φυσιολογική στερεοδιαµόρφωσή τους. Το 5

8 φαινόµενο αυτό φάνηκε σε µελέτες in vitro της µιτοχονδριακής κιτρικής συνθετάσης του χοίρου, όπου µελετήθηκε ο τρόπος µε τον οποίο η HSP90 δρα σε συνθήκες θερµικού στρες. Σ' εκείνη τη µελέτη βρέθηκε ότι η HSP90 από τη ζύµη, από τα βοοειδή και του οµολόγου της E. coli αποτρέπει αρκετά τη δηµιουργία ανενεργών συσσωµατοµάτων της κιτρικής συνθάσης στους 43 ο C. (Jakob et al. 1995) Επίσης η HSP90 συµµετέχει στην ενεργοποίηση των υποδοχέων στεροειδών ορµονών, των κινασών καθώς και στην ορθή αναδίπλωση της µυοσίνης. Τόσο ο υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών όσο και ο υποδοχέας της προγεστερόνης αλληλεπιδρούν µε την HSP90 φτάνοντας στην φυσιολογική διαµόρφωσή τους όπου µπορούν να αλληλεπιδράσουν µε την στεροειδή ορµόνη (Young et al. 2001). Παράλληλα µε αυτήν την στρατηγική η κυτταροπλασµατική HSP90 λειτουργεί ως µέρος ενός συµπλόκου αναδίπλωσης που περιλαµβάνει την HSP70, την συγγενή θερµοεπαγόµενη πρωτεΐνη HSC70 και άλλους µοριακούς συνοδούς, οι οποίοι µπορεί να ρυθµίζουν την ενδογενή ενεργότητα ATPασης της HSP90 (Young et al. 2001). Σε αυτό το στάδιο η συνεργασία ανάµεσα στην HSP90 και την HSC70 είναι τόσο συχνή, που πολλοί ερευνητές τις θεωρούν ως δύο τµήµατα ενός ενιαίου συστήµατος µοριακών συνοδών (single multichaperone machinery). Οι λειτουργίες του συστήµατος HSP90/HSC70 ρυθµίζονται και αυτές από ένα ευρύ φάσµα βοηθητικών συνοδών µορίων, τα οποία αλληλεπιδρούν είτε άµεσα και ειδικά µε ένα από τα συστατικά του, είτε σε κάποιες περιπτώσεις και µε τα δύο (Young et al., 2001). Αρκετά από αυτά τα βοηθητικά µόρια επηρεάζουν την ενεργότητα ATPάσης των HSC70 και HSP90 και µε αυτόν τον τρόπο καθορίζουν τη δέσµευση των υποστρωµάτων από τους µοριακούς συνοδούς. Ανάµεσα σε αυτά τα βοηθητικά συνοδά µόρια είναι και εκείνα τα οποία συνδέουν τις HSC70 και HSP90 και µεταφέρουν τα υποστρώµατα από τη µία στην άλλη. Μια άλλη κατηγορία βοηθητικών συνοδών µορίων αλληλεπιδρά επιλεκτικά µε κάποιες από τις κατηγορίες υποστρωµάτων της HSP90 και είτε τα οδηγεί στην HSP90, είτε τα οδηγεί σε κάποια ειδική διαδικασία αναδίπλωσης. Μια άλλη οµάδα βοηθητικών συνοδών µορίων στρατολογεί την HSC70 ή την HSP90 σε ειδικές κυτταρικές διαδικασίες που συσχετίζονται αλλά είναι ξεχωριστές από την αναδίπλωση των πρωτεϊνών, όπως η µεταφορά σε διάφορα οργανίδια και η αποικοδόµηση (Εικόνα Α2). 6

9 Εικόνα Α2: Η κυτταροπλασµατική HSP90 συµµετέχει στην αναδίπλωση των υποδοχέων των στεροειδών ορµονών της µυοσίνης και των κινασών σερινης/θρεονίνης και τυροσίνης σε ύστερο στάδιο µε τη δράση βοηθητικών συνοδών µορίων. Το σύστηµα µοριακών συνοδών HSC70/HSP90 µπορεί ακόµα, µε τη βοήθεια συγκεκριµένων βοηθητικών συνοδών µορίων, να οδηγήσει ορισµένες πρωτεΐνες σε υποκυτταρικά οργανίδια ή στο πρωτεόσωµα για αποικοδόµηση (Young et al. 2004) Η ενδογενής ενεργότητα ATPασης της HSP90 βρίσκεται στο αµινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης µε κατάλοιπα Asp79 και Glu33 να έχουν κύριο ρόλο στην πρόσδεση του ATP και στην υδρόλυσή του αντίστοιχα (Panaretou et al. 1998). Ακολουθεί η µεσαία επικράτεια που χωρίζεται από την αµινοτελική µε µία µικρότερη φορτισµένη επικράτεια. Η καρβοξυτελική επικράτεια χρησιµεύει στον οµοδιµερισµό της πρωτεΐνης, µε τη συµµετοχή της αµινοτελικής επικράτειας (επικράτεια "καπάκι", lid domain) σε ορισµένες συνθήκες (Krukenberg et al. 2011). Αυτή η πρωτοταγής δοµή της HSP90 (Εικόνα Α3) είναι συντηρηµένη τόσο στον άνθρωπο (Hsp90α και Hsp90β) όσο και στον ποντικό (Hsp84 και Hsp86), στα έντοµα όπως στη Drosophila (Hsp83) και στη ζύµη (Hsc82 και Hsp82), αποτελώντας την οικογένεια πρωτεϊνών HSP90 η οποία πέρα από την κυτταροπλασµατική HSP90 περιλαµβάνει την βακτηριακή πρωτεΐνη HtpG, τη µιτοχονδριακή πρωτεΐνη Hsp75/TRAP1 όπως επίσης και την Grp94/gp96 που βρίσκεται στο ενδοπλασµατικό δίκτυο. Η διαφορά των HtpG, 7

10 Hsp75/TRAP1 και Grp94/gp96 από το άλλα οµόλογα της HSP90 είναι ότι δεν περιέχουν τη φορτισµένη επικράτεια µε την ααµινοτελική επικράτεια. Επίσης η ενεργότητα ATPασης καθορίζει την τριτοταγή δοµή του οµοδιµερούς, άρα και τη λειτουργία του. Ακόµα η ενεργότητα ATPασης καθορίζεται από µοριακούς συνοδούς, όπως η Hop, που προσδένονται στις TRP επικράτειες της καρβοξυτελικής περιοχής. Θα γίνει λεπτοµερέστερη αναφορά γι αυτούς τους µοριακούς συνοδούς παρακάτω. Εικόνα Α3: Σχηµατική σύγκριση της δοµής της HSP90 στον άνθρωπο (HSP90, HSP90N), στο σακχαροµύκητα (yeast) και στο ανθρώπινο µιτοχονδριακό (Trap1) και ενδοπλασµατικό (Grp94) οµόλογο. Με µπλε χρώµα δείχνεται η αµινοτελική περιοχή µε ενεργότητα ATPάσης (ATP), µε κόκκινο η φορτισµένη περιοχή (ΦΠ), µε γκρι η ενδιάµεση περιοχή (ΕΠ), µε γαλάζιο η καρβοξυτελική περιοχή διµερισµού (Π ) και µε πράσινο τα σινιάλα για το µιτοχόνδριο (Μίτο) και το ενδοπλασµατικό δίκτυο (Ε ) (PhD Theodoraki, 2005). Πιο συγκεκριµένα έχουν κρυσταλλωθεί µέχρι στιγµής τρεις τριτοταγείς δοµές της HSP90 (Εικόνα Α4). Οι τρείς αυτές δοµές είναι η apo, η ATP και η ADP για τα οµόλογα του βακτηρίου, της ζύµης και του ανθρώπου. (Krukenberg et al. 2011) Η τριτοταγής δοµή της HSP90 ακολουθεί ένα συνεχόµενο κύκλο που περιλαµβάνει τις παραπάνω δοµές, και στηρίζεται στην πρόσδεση και την υδρολυση του ATP. Στην apo κατάσταση το οµοδιµερές έχει µία ανοικτή µορφή "V" και δεν έχει προσδεδεµένο ATP ή ADP. Η apo κατάσταση όπως δείχνουν εικόνες από ηλεκτρονικό µικροσκόπιο είναι αρκετά ευλύγιστη από τη στιγµή που το άνοιγµα της σχισµής είναι ευµετάβλητο στην HtpG (Shiau et al. 2006). Στην ίδια πρωτεΐνη ένα µη υδρολύσιµο ανάλογο του ATP, το AMPPNP, φαίνεται να κλείνει τη σχισµή, ενώ στην κατάσταση ADP η πρωτεΐνη παίρνει µία πιο σφαιρική δοµή (Shiau et al. 2006). Όσον αφορά την ευµεταβλητότητα της apo κατάστασης, αυτή ίσως χρησιµεύει στο γεγονός ότι η HSP90 αλληλεπιδρά µε τις εκάστοτε πρωτεΐνες µε διαφορετικό τρόπο. Έτσι µπορούν να γίνουν δύο υποθέσεις: είτε τα εκάστοτε υποστρώµατα καθορίζουν τη µορφή της apo 8

11 κατάστασης, ή οι διαφορετικές καταστάσεις apo καθορίζουν τον τρόπο µε τον οποίο θα ξεκινήσει η αναδίπλωση των υποστρωµάτων. (Krukenberg et al. 2011) Όσον αφορά την κλειστή ATP κατάσταση η πρόσδεση του ATP επιφέρει αναδιαµόρφωση της επικράτειας "καπάκι", αλλάζει την κατεύθυνση της αµινοτελικής και µεσαίας επικράτειας, ενώ παράλληλα σχετίζεται µε την απελευθέρωση ενός β-πτυχωτού φύλλου µε αποτέλεσµα την σταθεροποίηση του διµερισµού της αµινοτελικής επικράτειας. Η επικράτεια "καπάκι" βρίσκεται στα πρώτα 24 αµινοξέα της πρωτεΐνης, και έχοντας ως µοτίβο τη δοµή έλικα-στροφή-έλικα (helix-loop-helix) ενέχεται στο διµερισµό της αµινοτελικής περιοχής και στην υδρόλυση του ATP. Αφαίρεση αυτής της επικράτειας έχει ως αποτέλεσµα τη µειωµένη ενεργότητα υδρόλυσης του ATP από µεταλλαγµένα οµοδιµερή της πρωτεΐνης της ζύµης in vitro, ενώ δε σώζει τον γονότυπο HSP82-/HSC82- της ζύµης (Richter et al. 2006). Επίσης η πρόσδεση του ATP επιφέρει κλείσιµο των υδροφοβικών περιοχών προς τον πυρήνα του οµοδιµερούς, και ο βαθµός κλεισίµατος εξαρταται από το πόσο εύκολα µπορεί να διασπάσει κάθε οµόλογο το ATP (Krukenberg et al. 2011). Εικόνα Α4: Οι τρεις κρυσταλλωµένες δοµές της HSP90. Η αµινοτελική επικράτεια δείχνεται µε µπλε χρώµα, η µεσαία µε πράσινο και η καρβοξυτελική µε καφέ χρώµα. Σε όλες τις δοµές οι εκτεθειµένες υδρόφοβες περιοχές είναι χρωµατισµένες µε µωβ. Η apo και ADP δοµή απεικονίζουν την κρυσταλλοµένη HtpG, ενώ η AMPPNP δοµή απεικονίζει το οµόλογο της ζύµης (Krukenberg et al. 2011). Η διάσπαση του ATP από την HSP90 εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από την αλληλεπίδρασή της µε βοηθητικά συνοδά µόρια (co-chaperones), ένα φαινόµενο που παρατηρείται κυρίως στους ευκαρυώτες. (Krukenberg et al. 2011) Με αυτόν τον τρόπο τα βοηθητικά συνοδά µόρια καθορίζουν τη διαµόρφωση της HSP90, ενώ παράλληλα καθορίζουν και τις αλληλεπιδράσεις της HSP90 µε τα υποστρώµατά της. Παράδειγµα συνοδού µορίου που ενεργοποιεί την ενεργότητα ATPασης της HSP90 είναι η πρωτεΐνη Aha1, ενώ άλλοι παράγοντες την µπλοκάρουν όπως η p50, η Hop και η p23 (Krukenberg et al. 2011). Η αµινοτελική περιοχή της Aha1 αλληλεπιδρά µε την µεσαία επικράτεια 9

12 της HSP90 (Meyer et al. 2004), ενώ δεν λείπουν οι αλληλεπιδράσεις της Aha1 και µε τις αµινοτελικές επικράτειες του οµοδιµερούς HSP90 (Retzlaff et al. 2010). Μία µελέτη, χρησιµοποιώντας τη χρωµατογραφία φιλτραρίσµατος από gel (gel filtration chromatography) έδειξε ότι η Aha1 ανταγωνίζεται την Hop και την p23 στην πρόσδεσή τους µε την HSP90 (Harst et al. 2005). Φαίνεται έτσι ότι η Aha1 µπορεί να αντικαθιστά την Hop στα πρώιµα σύµπλοκα µε την HSP90, ενώ παράλληλα µπορεί να αντικαθιστά την p23 στα ύστερα σύµπλοκα µε την ίδια πρωτεΐνη, ενεργοποιώντας την ενεργότητα ATPασης, µε αποτέλεσµα να συνεχίζεται ο κύκλος της HSP90 (Krukenberg et al. 2011). Όσον αφορά την Hop και την p23, εκείνες έχουν την ίδια δράση, αφού µπλοκάρουν την ενεργότητα της ATPασης της HSP90, διατηρώντας την HSP90 σε µία σταθερή κατάσταση. ρουν όµως σε διαφορετικά στάδια του κύκλου της HSP90 (Krukenberg et al. 2011). Η µεν Hop, µια πρωτεΐνη µε επικράτεια TPR που προσδένεται στο καρβοξυτελικό άκρο της HSP90 και συγκεκριµένα στο MEEVD µοτίβο της, δρα σε πρώιµα στάδια του κύκλου διατηρώντας την HSP90 σε µία ανοικτή δοµή, ενώ η p23 είναι µία πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά κυρίως µε τις αµινοτελικές επικράτειες του οµοδιµερούς της HSP90, και διατηρεί την HSp90 σε κλειστή διαµόρφωση, ενώ αναστέλλει την ενεργότητα ATPασης, µε απώτερη συνέπεια την σταθεροποίηση των υποστρωµάτων της HSP90 µε το σύµπλοκο HSP90-p23. Έτσι η p23 ίσως έχει το ρόλο ενός µοριακού ρολογιού το οποίο µόλις τα υποστρώµατα ενεργοποιηθούν τότε η p23 απελευθερώνεται, η ATPαση ενεργοποιείται και οι ενεργοποιηµένες πρωτεΐνες απελευθερώνονται από το οµοδιµερές (Krukenberg et al. 2011). Η p50 µε τη σειρά της αναστέλλει την ενεργότητα ATPασης µε ένα µηχανισµό διαφορετικό από αυτόν που ακολουθούν οι Hop και p23. Αρχικά η p50 πρσδένεται στην αµινοτελίκή περιοχή της HSP90 µε την µεσαία και καρβοξυτελική επικράτειά της, σχηµατίζοντας ένα ετεροδιµερές όπου αποτελείται από δύο µορία της p50 βρισκόµενα ανάµεσα στις δύο αµινοτελικές επικράτειες της HSP90. Έτσι η p50 διατηρεί το οµοδιµερές της HSP90 σε µία ανοικτή κατάσταση, ενώ έχει ήδη προσδεθεί το ATP. Συγκεκριµένα δεν µπορούν να αλληλεπιδράσουν οι αµινοτελικές επικράτειες της HSP90, και το "καπάκι" διατηρείται στην ανοικτή κατάσταση. Επίσης δεν µπορεί να υδροληθεί το προσδεδεµένο ATP διότι το κατάλοιπο Αrg167 της p50 δηµιούργει υδρογονικό δεσµό µε το κατάλοιπο Glu33 µε αποτέλεσµα το ενεργό µόριο νερού να µην έχει την καταλληλη θέση προς διεκπεραίωση της υδρόλυσης (Roe et al. 2004). Με αυτόν τον τρόπο η p50 κρατάει τον κύκλο της HSP90 στο σηµείο που έχει προσδεθεί το ATP, ενώ παράλληλα έχει ήδη φέρει µία κινάση προς αναδίπλωση από την HSP90, αφού το αµινοτελικό άκρο της p50 αλληλεπιδρά µε τέτοιες πρωτεΐνες όπως την Cdk4 (Vaughan et al. 2006). 10

13 Πέρα από τα βοηθητικά συνοδά µόρια η ενεργότητα ATPασης και η λειτουργία της HSP90 ρυθµίζεται από µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις (Mollapour and Neckers 2011). Αυτές είναι: η φωσφοριλίωση, η ακετυλίωση, η S-νιτροσιλίωση, η οξείδωση και η ουβικιτινίωση. Η HSP90 θεωρείται ότι είναι µία φωσφοπρωτεΐνη, αφού µέχρι στιγµής έχει βρεθεί ότι φωσφοριλιώνονται 12 κατάλοιπα της HSP90β και 14 της HSP90α ισοµορφής του ανθρώπου (Mollapour and Neckers 2011). Τα επίπεδα φωσφοριλίωσης της HSP90 εξαρτώνται τόσο από το κυτταρικό περιβάλλον όσο και από το είδος του οργανισµού. Για παράδειγµα το θερµικό στρες στη ζύµη επιφέρει µείωση των φωσφοριλιωµένων καταλοίπων της πρωτεΐνης, ενώ σε κύτταρα HeLa παρατηρείται το αντίστροφο φαινόµενο. Επίσης τα επίπεδα φωσφοριλίωσης της HSP90 καθορίζονται από κινάσες όπως: την DNA-PK, την B-Raf, την Akt, την c-src, την πρωτεϊνική κινάση Α, την CK2, και την Wee1 (Mollapour and Neckers 2011). Ορισµένες από αυτές αποτελούν οι ίδιες υποστρώµατα της HSP90 όπως η CK2 και η Wee1. Πιο συγκεκριµένα η CK2 φωσφοριλιώνει δύο κατάλοιπα σερίνης (Ser-226 και Ser-255) τα οποία έχουν καθοριστικό ρόλο στην απόπτωση, αφού σε λευχεµικά κύτταρα καταστέλλεται η φωσφοριλίωση σε αυτά τα κατάλοιπα µε αποτέλεσµα την καταστολή τής λειτουργίας του αποπτοσώµατος (Mollapour and Neckers 2011). Επίσης η CK2 φωσφοριλιώνει ένα συντηρηµένο κατάλοιπο θρεονίνης (Thr-22) της HSP90 στη ζύµη, το οποίο φαίνεται να ενέχεται στην υδρόλυση του ATP από την HSP90, και κατ επέκταση στη λειτουργία της πρωτεΐνης αφού επιδρά στην αναδίπλωση των υποστρωµάτων της HSP90 (Mollapour and Neckers 2011). Από την άλλη η Wee1 του σακχαροµύκητα (Swe1) φωσφοριλιώνει ένα συντηρηµένο κατάλοιπο τυροσίνης της HSP90 στην S φάση του κυτταρικού κύκλου µε αποτέλεσµα να οδηγεί την HSP90 σε αποικοδόµηση από το πρωτεάσωµα µέσω πολυουβικιτινιλίωσης. Το ίδιο φωσφοριλιωµένο κατάλοιπο έχει ρόλο στον διµερισµό της αµινοτελικής επικράτειας και στην ενεργότητα ATPασης (Mollapour and Neckers 2011). Όσον αφορά τις υπόλοιπες µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις κατά την ακετυλίωση και την απακετυλίωση της HSP90 παρατηρείται αυξηµένη ή µειωµένη αλληλεπίδρασή της µε τα υποστρώµατά της (Mollapour and Neckers 2011). Για παράδειγµα η HDAC6 απακετυλιώνει την HSP90. Απαλείφοντας το γονίδιο της HDAC6 από ινοβλάστες εµβρύου ποντικού παρατηρείται µείωση στη λειτουργικότητα των µορίων του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (Mollapour and Neckers 2011), ενός µορίου που η λειτουργία του ρυθµίζεται από την HSP90. Επίσης η λυσίνη 294 της Hsp90α φαίνεται ότι εµπλέκεται στην αλληλεπίδραση του µοριακού συνοδού µε τα υπαστρώµατά του και µε τα βοηθητικά συνοδά µόρια Aha1, CHIP και FKBP52 (Mollapour and Neckers 2011). Κατά την S-νιτροσιλίωση ένα µόριο µονοξειδίου του αζώτου προστίθεται οµοιοπολικά στην θειοµάδα του καταλοίπου κυστεΐνης. Αυτή η τροποποίηση συµβαίνει στην 11

14 HSP90α στο κατάλοιπο Cys-597 στα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα και καταστέλλει την ενεργότητα ATPασης της (Mollapour and Neckers 2011). Ακόµα το οξειδωτικό στρες επηρεάζει αρνητικά την ενεργότητα της HSP90 όπως δείχθηκε σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του µαστού (MDA-MB-231 κύτταρα), αφού η αύξηση των ελεύθερων ριζών οξυγόνου προκαλεί την οξείδωση των θειολών της πρωτεΐνης µε πιθανό επακόλουθο την παρεµπόδιση της λειτουργίας της. Η πιθανότητα αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι ορισµένα υποστρώµατα της HSP90 όπως η µεταλλαγµένη p53, η Cdk4 και η κυκλίνη D1 οδηγούνται προς αποικοδόµηση σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες (Mollapour and Neckers 2011). Επίσης τα αντικαρκινικά φάρµακα hypericin και Taxotere ασκούνε τη δράση τους µέσω ουβικιτινίωσης της HSP90 µε αποτέλεσµα και πάλι κάποια από τα υποστρώµατα της HSP90 να αποικοδοµούνται, όπως η Raf-1, µε αποτέλεσµα την παρεµπόδιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού (Blank et al. 2003), ή να παρεµποδίζεται η µετανάστευση των ενδοθυλιακών κυττάρων του ανθρώπινου οµφάλιου λώρου (HUVECs) (Mollapour and Neckers 2011). Το κλασσικότερο παράδειγµα αναδίπλωσης υποστρώµατος από την HSP90 είναι οι υποδοχείς των στεροειδών ορµονών (Εικόνα Α5). Ο µονοµερής υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών και ο υποδοχέας της προγεστερόνης αλληλεπιδρούν µε την HSP90, ενώ είναι προσδεδεµένοι µε την HSP70/Hop, και αποκτούν την τελική δοµή στην οποία θα προσδεθεί η στεροειδής ορµόνη ύστερα από την αλληλεπίδρασή τους µε την HSP90 (Young et al. 2001), και υδρόλυση τού ATP από αυτήν (Grenert et al., 1999). Όταν το µόριο του υποδοχέα αναδιπλωθεί, τότε απελευθερώνεται από την HSP90, και είτε προσδένει τη στεροειδή ορµόνη µε απόρροια τον οµοδιµερισµό του και την ενεργοποίησή του, ή παραµένει ασταθής και αναγνωρίζεται ξανά από τον µηχανισµό των µοριακών συνοδών (Young et al. 2001). Ο µηχανισµός ενεργοποίησης του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών φαίνεται ότι περιλαµβάνει το βοηθητικό συνοδό µόριο Aha1, αφού πειράµατα sirna και εποµόλυνσης HEK-293 κυττάρων µε ανασυνδυασµένο Aha1 έδειξαν ότι στην πρώτη περίπτωση µειώνεται ενώ στη δεύτερη αυξάνεται ο ενεργός υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών (Harst et al. 2005). 12

15 Εικόνα Α5: Ο µηχανισµός αναδίπλωσης των υποδοχέων των στεροειδών ορµονών από την HSP90 (Young et al. 2001). Μία παραλλαγή του παραπάνω παραδείγµατος είναι η αναδίπλωση του υποδοχέα της εκδυσόνης στην Drosophila (Young et al. 2001). Ο λειτουργικός υποδοχέας της εκδυσόνης στη Drosophila είναι ένα ετεροδιµερές που αποτελείται από τους υποδοχείς EcR και USP (Ultraspiracle), και απαιτείται τόσο για την πρόσδεση στα στοιχεία απόκρισης DNA στην εκδυσόνη όσο και για την πρόσδεση των εκδυσοστεροειδών ορµονών (Yao et al. 1993). Η πρόσδεση του ετεροδιµερούς στα στοιχεία απόκρισης εξαρτάται και από άλλους παράγοντες ενώ παράλληλα το ετεροδιµερές µπορεί ήδη να προσδεθούν ανάλογα της εκδυσόνης (Arbeitman et al. 2000). Αυτοί οι παράγοντες είναι η HSP90 και η Hsc70 της Drosophila, όπου φαίνεται ότι αλληλεπιδρούν και µε άλλα βοηθητικά συνοδά µόρια (Hop, Hip, FKBP52, και p23) (Arbeitman et al. 2000). Η HSP90 αλληλεπιδρά επίσης µε τον µεταγραφικό παράγοντα του θερµικού στρες (Heat Shock Factor-HSF), και τον διατηρεί σε ανενεργή κατάσταση σε φυσιολογικές καταστάσεις. Σε κυτταρικό εκχύλισµα που επάγει την πρόσδεση του HSF στο DNA φαίνεται ότι χάνεται η ικανότητα πρόσδεσης του HSF σε αυτό µε την πρόσθεση της HSP90. Ακόµα σε κύτταρα HeLa που αναπτύχθηκαν κάτω από φυσιολογικές συνθήκες µπορεί να συνεντοπιστούν η HSP90 µε τον HSF και να συγκατακρηµνιστούν, ενώ σε καταστάσεις θερµικού στρες στα ίδια κύτταρα δεν παρατηρείται το ίδιο σύµπλοκο και ο HSF βρίσκεται στην τριµερή ενεργή του µορφή. (Zou et al. 1998) Η HSP90 αλληλεπιδρά ακόµα µε ένα σύνολο κινασών και µεταγραφικών παραγόντων όπως η p53, Cdk4, c-src/v-src (Xu et al. 1999), Raf (Grammatikakis et al. 1999, Schulte et al.1995) οι 13

16 οποίες ενέχονται στον κυτταρικό κύκλο (Krukenberg et al. 2011,Young et al. 2001), καθιστώντας την HSP90 φαρµακευτικό στόχο κατά του καρκίνου (Krukenberg et al. 2011). Η p53 του ανθρώπου προσδένεται στην καρβοξυτελική επικράτεια της HSP90 της ζύµης µέσω της επικράτειας πρόσδεσής της στο DNA, και η p53 έχει ήδη λάβει µέρος της τριτοταγούς δοµής της πριν από αυτήν την αλληλεπίδραση (Hagn et al. 2011). Η συνεισφορά της HSP90 σε αυτήν την αλληλεπίδραση είναι το γεγονός ότι διατηρεί την p53 σε ενεργή µορφή σε φυσιολογικές θερµοκρασίες, αφού η p53 σε θερµοκρασίες άνω των 35 ο C αποδιατάσσεται σε συνθήκες in vitro (Müller et al 2004). Η Cdk4 από την πλευρά της είναι µία κυκλινοεξαρτόµενη κινάση που προσδένεται στην HSP90 µέσω της πρωτεΐνης p50 όπως δείχνει η 3D αναδόµηση (3D reconstruction) αρνητικής χρώσης ηλεκτρονικού µικροσκοπίου (Vaughan et al. 2006). Η αναδόµηση δείχνει πιο συγκεκριµένα ένα ασύµµετρο σύµπλοκο που αποτελείται από δύο µονοµερή της HSP90, ένα µονοµερές της p50 και άλλο ένα της Cdk4. Το διµερές της HSP90 βρίσκεται στην ATP-κλειστή κατάσταση µε τις αµινοτελικές επικράτειες να µη διµερίζονται, αλλά ανάµεσά τους να βρίσκεται το µονοµερές της p50. H καρβοξυτελική επικράτεια της Cdk4 φαίνεται να αλληλεπιδρά µε τη µεσαία επικράτεια της HSP90, ενώ η αµινοτελική επικράτειά της αλληλεπιδρά µε µία αµινοτελική επικράτεια της HSP90 και µε την p50 (Vaughan et al. 2006). Η p50 φαίνεται ότι ελέγχει παράλληλα την αλληλεπίδραση της c-src/v- Src και της Raf µε την HSP90 (Hutchison et al. 1992, Grammatikakis et al. 1999). Αυτή η αλληλεπίδραση καθιστά τις πρωτεΐνες ενεργές τόσο ως κινάσες όσο και ως υποστρώµατα άλλων πρωτεϊνών (Xu et al. 1999, Grammatikakis et al. 1999). Α2.2 Η συµµετοχή της HSP90 στη σύνθεση πρωτεϊνικών συµπλόκων Άλλος ένας βιολογικός ρόλος της HSP90 είναι η σωστή σύνθεση και η διατήρηση πρωτεϊνικών συµπλόκων όπως των µικρών ριβονουκλεωπρωτεϊνικών σωµατιδίων (snornps), της RNA πολυµεράσης ΙΙ, των κινασών που σχετίζονται µε τις κινάσες της 3-φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης (PIKK), του συµπλόκου των τελοµερών, του κινητοχώρου, των συµπλόκων RISC και του πρωτεασώµατος 26S (Makhnevych and Houry 2011). Τα µικρά ριβονουκλεωπρωτεϊνικά σωµατίδια επεξεργάζονται το 35S-pre rrna µε αποτέλεσµα την παραγωγή των 5.8S, 18S και 25S rrna, και αποτελούνται από µη κωδικά RNA (snorna) και πρωτεΐνες. Η σύνθεση µίας κατηγορίας snornp εξαρτάται από την HSP90. Πιο συγκεκριµένα η HSP90 του ζυµοµύκητα αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη Tah1 και σταθεροποιεί την Pih1 in vivo. Στη συνέχεια το σύµπλοκο Tah1/Pih1 προσδένεται στο σύµπλοκο των ελικασών Rvb1/2 και έτσι σχηµατίζεται το σύµπλοκο R2TP, το οποίο µαζί µε την HSP90 ενέχεται στην σύνθεση του συµπλόκου box C/D snornp (Makhnevych and Houry 2011). Το σύµπλοκο της RNA πολυµεράσης ΙΙ αποτελείται από 12 υποµονάδες (Rpb1-12), οι οποίες αλληλεπιδρούν µεταξύ τους στο κυτταρόπλασµα πριν την είσοδο του συµπλόκου στον πυρήνα. Το 14

17 σύµπλοκο Rpb1/Rpb8 αλληλεπιδρά µε το βοηθητικό συνοδό µόριο hspagh (RPAP3) και την HSP90, σταθεροποιώντας την Rpb1 στο κυτταρόπλασµα πριν τη σύνθεση του συµπλόκου της RNA πολυµεράσης II (Boulon et al. 2010). Στη συνέχεια συνδέονται και οι υπόλοιπες υποµονάδες της RNA πολυµεράσης ΙΙ συνθέτοντας έτσι το ενεργό σύµπλοκο (Makhnevych and Houry 2011). Οι κινάσες που σχετίζονται µε τις κινάσες της 3-φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης παίρνουν το όνοµά τους από το γεγονός ότι έχουν παρόµοια αλληλουχία µε τις κινάσες της 3-φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης και είναι κινάσες σερίνης/θρεονίνης (Makhnevych and Houry 2011). Αυτή η οικογένεια κινασών έχει έξι µέλη στον άνθρωπο και είναι οι: ATM, ATR, DNA-PKcs, mtor, SMG1 και η TRRAP. Η σταθερότητα αυτών των κινασών εξαρτάται από την κινάση Tel2 όπως φάνηκε σε πειράµατα ανοσοαποτυπώµατος κατά western σε ινοβλάστες εµβρύου ποντικού στους οποίους απουσίαζε η Tel2 (Takai et al. 2007). Η Tel2 αλληλεπιδρά µε την HSP90α και το σύµπλοκο R2TP/Prefoldin, µε αποτέλεσµα να ρυθµίζεται πιθανώς η αναδίπλωση των PIKK κινασών σε κύτταρα HEK293 (Horejsí et al. 2010). Όσον αφορά τα τελοµερή αυτά είναι νουκλεοπρωτεϊνικές δοµές στο τέλος των ευκαρυωτικών χρωµοσωµάτων που προστατεύουν το τελοµερικό DNA από τυχόν καταστροφές, και το επιµηκύνουν ύστερα από κάθε αντιγραφή του (Makhnevych and Houry 2011). Η παρουσία της HSP90 εκεί έχει ως αποτέλεσµα την µετατροπή του προστατευτικού συµπλόκου των τελοµερών (Cdc13 Stn1 Ten1 DNA) σε σύµπλοκο επέκτασης των τελοµερών (Est1 Est2 Est3 Cdc13 DNA), ρυθµίζοντας την ενεργότητα πρόσδεσης της Cdc13 στο DNA της ζύµης (DeZwaan et al. 2009). Η HSP90 ενέχεται επίσης στη σύνθεση των συµπλόκων του κινητοχώρου στην εκκολαπτόµενη ζύµη (Makhnevych and Houry 2011). Το πρώτο σύµπλοκο που συντίθεται είναι το CBF3 (centromere binding factor 3) που αλληλεπιδρά ειδικά και µη ειδικά µε το στοιχείο CDE III του κεντροµερικού DNA του S. cerevisiae, και αποτελείται από τις πρωτεΐνες: Cep3, Ctf13, Skp1 και Ndc10 (Makhnevych and Houry 2011). Η ενεργότητα της Ctf13, που είναι η σύνδεση µε το στοιχείο CDE III (Saccharomyces genome database), εξαρτάται από την Skp1 και το βοηθό συνοδό µόριο της HSP90 την Sgt1 (Makhnevych and Houry 2011). Η HSP90 ρυθµίζει την αλληλεπίδραση της Sgt1 µε την Skp1 µέσω υδρόλυσης του ATP από την HSP90. Έτσι η HSP90 αλληλεπιδρώντας µε την Sgt1 και υδρολύοντας ATP ελέγχει την δηµιουργία του ετεροδιµερούς Skp1/Ctf13 που απαιτείται για την ενεργοποίηση της Ctf13 (Lingelbach and Kaplan 2004). Άλλο ένα σηµατοδοτικό µονοπάτι στο οποίο συµµετέχει η HSP90 είναι αυτό της RNA σίγησης (Makhnevych and Houry 2011). Η RNA σίγηση, που παρατηρείται στους ευκαρυώτες, είναι ένα φαινόµενο κατά το οποίο µικρά δίκλωνα µόρια RNA των ~20-30 bp καταστέλλουν την έκφραση 15

18 γονιδίων είτε σε µεταγραφικό επίπεδο ή σε µεταφραστικό επίπεδο ή µέσω επιγενετικών τροποποιήσεων του γονιδιώµατος (Meister & Tuschl 2004). Σε µεταγραφικό επίπεδο η RNA σίγηση επιτελείται από το σύµπλοκο RISC (Meister & Tuschl 2004). Το σύµπλοκο RISC (prerisc) αποτελείται από πρωτεΐνες µε κυριότερη την AGO στην οποία προσδένεται το δίκλωνο µικρό µόριο RNA (sirna). Η πρόσδεση αυτή φαίνεται ότι γίνεται ύστερα από αλληλεπίδραση της HSP90/Hsc70 µε την πρωτεΐνη AGO, και υδρόλυση του ATP στη Drosophila (Iwasaki et al. 2010). Ένα ακόµα σηµατοδοτικό µονοπάτι που συµµετέχει η HSP90 είναι αυτό της αποικοδόµησης των πρωτεϊνών µέσω του 26S πρωτεασώµατος (Makhnevych and Houry 2011). Πιο συγκεκριµένα η ενεργότητα της HSP90 χρειάζεται στην σύνθεση του 26S πρωτεασώµατος της ζύµης (Imai et al. 2003). Όταν θερµοευαίσθητα στελέχη της ζύµης (hsp82 4 hsc82) επωάζονται στην µη επιτρεπτή θερµοκρασία των 37 o C, τότε το 26S πρωτεάσωµα διασπάται σε µικρότερα σύµπλοκα (Imai et al. 2003). Στο ίδιο στέλεχος παρατηρείται το ίδιο αποτέλεσµα όταν επωάζεται σε επιτρεπτές και µη επιτρεπτές θερµοκρασίες µε γκελνταναµυκίνη, τον αναστολέα της HSP90. Όµως δεν παρατηρείται διάσπαση του 26S πρωτεασώµατος λόγω γκελνταναµυκίνης στο στέλεχος αγρίου τύπου (Imai et al. 2003). Α2.3 Η HSP90 καταστέλλει την φαινοτυπική ποικιλοµορφία στη Drosophila melanogaster. Έχει παρατηρηθεί από πολλά εργαστήρια ότι µεταλλάξεις του γονιδίου της πρωτεΐνης HSP90 (hsp83) της D. melanogaster συνδέονται µε φαινοτύπους που αφορούν µορφολογικά χαρακτηριστικά (Rutherford και Lindquist 1998). Οµόζυγα µεταλλάγµατα τέτοιου τύπου είναι θανατογόνα, οπότε τα στελέχη που χρησιµοποιούνται είναι ετερόζυγα. Όταν τα ετερόζυγα στελέχη διασταυρώνονται µε άλλες εργαστηριακές σειρές τότε προκύπτουν άτοµα µε δυσµορφίες στην κοιλία, στα µάτια ή στα πόδια, µε πολλαπλάσιες τρίχες (bristels) ή µε αλλαγές στο σχήµα ή τη φλέβωση (venation) των φτερών σε ποσοστό 1-2%. Αυτές οι µορφολογικές ανωµαλίες οφείλονται στην µη φυσιολογική λειτουργία της HSP90 επειδή: (1) παρόµοια χαρακτηριστικά εµφανίστηκαν σε µεταλλαγµένα αλληλόµορφα του hsp83 που είχαν διαφορετική καταγωγή, (2) όταν διασταυρώθηκαν στελέχη µε διαφορετικά hsp83 αλληλόµορφα τότε προέκυψαν ετεροαλληλικά άτοµα µε φαινοτύπους πιο σοβαρούς και µε µεγαλύτερη συχνότητα από τα πατρικά στελέχη, (3) όταν στελέχη αγρίου τύπου τράφηκαν µε γκελνταναµυκίνη τότε εµφάνισαν παρόµοιους φαινοτύπους (Rutherford και Lindquist 1998). Κατά τη δυσλειτουργία της HSP90 φαίνεται να εκφράζεται µία κρυφή γενετική ποικιλοµορφία περισσότερο από ότι φυσιολογικά (Rutherford και Lindquist 1998). Όµως από τη Specchia και τους 16

19 συναδέλφους της (Specchia et al. 2010) δείχθηκε ότι η δυσλειτουργία της HSP90 στις ωοθήκες και στις σπερµατοθήκες της D. melanogaster επηρεάζει τον µηχανισµό του pirna (µικρά RNAs που η λειτουργία τους εξειδικεύεται στη γαµετική σειρά) οδηγώντας στην ενεργοποίηση µεταθετών στοιχείων και στην επαγωγή µορφολογικών µεταλλάξεων. Αναλυτικότερα οι σπερµατοθήκες αρσενικών ατόµων της D. melanogaster οι οποίες φέρουν µετάλλαξη στο γονίδιο hsp83 επιδεικνύουν συσσωµατόµατα κρυσταλλίνης (crystalline aggregates), κάτι που είναι σπάνιο σε άτοµα αγρίου τύπου. Ο σχηµατισµός των συσσωµατοµάτων κρυσταλλίνης οφείλεται στην µεταγραφική ενεργοποίηση των επαναλαµβανόµενων στοιχείων Stellate στη γαµετική σειρά. Παρόµοιο φαινόµενο παρατηρείται όταν άτοµα αγρίου τύπου εκτείθενται σε γκελνταναµικίνη. Από άλλη ερευνητική οµάδα δείχθηκε ότι η µεταγραφική ενεργοποίηση του Stellate και η ενεργοποίηση των µεταθετών στοιχείων είναι απόρροια της σίγησης του µηχανισµού pirna (Aravin et al. 2001). Βρέθηκε λοιπόν ότι µεταλλάξεις της HSP90 επηρεάζουν τη δηµιουργία των pirnas που είναι ειδικά για τη σίγηση του Stellate και των µεταθετών στοιχείων. (Specchia et al. 2010) Επίσης βρέθηκε ότι σε ωοθήκες και σπερµατοθήκες µε µεταλλάξεις στο γονίδιο hsp83 αυξάνονται τα µετάγραφα των µεταθετών στοιχείων. Η αύξηση είναι πιο µεγάλη στις ωοθήκες απ' ότι στις σπερµατοθήκες ενώ είναι µεγαλύτερη στα ετεροαλληλικά άτοµα (hsp83 scratch /hsp83 e4a ) απ' ότι στα οµόζυγα (hsp83 scratch ). Παρόµοια απότελέσµατα παρατηρήθηκαν ύστερα από επώαση αγρίου τύπου ατόµων µε γκελνταναµικίνη. Η κινητικότητα των µεταθετών στοιχείων εξετάστηκε µε Southern ανάλυση και βρέθηκε ότι τα µεταθετά στοιχεία aurora, I, και Bari1 µετατίθενται σε διάφορες θέσεις του γονιδιώµατος συγκρίνοντας την πατρική µε την F1 γενιά οι οποίες ήταν οµόζυγες (hsp83 scratch ) ή ετεροαλληλικές (hsp83 scratch /hsp83 e4a ). Επειδή η µετάθεση των µεταθετών στοιχείων είναι προκαλεί µεταλλαξηγένεση ελέγχθηκε η πιθανότητα να βρεθούν de novo µεταλλάξεις σε πληθυσµό 3220 ατόµων οµόζυγα στη µετάλλαξη hsp83 scratch. Στο 1% του συνόλου των ατόµων βρέθηκαν µορφολογικές δυσµορφίες. Ανάµεσα στις µορφολογικές δυσµορφίες βρέθηκαν και άτοµα που είχαν το φαινότυπο Scutoid ο οποίος οφείλεται σε µετάλλαξη του γονιδίου noc. Το γονίδιο noc αναλύθηκε µε inverse PCR σε άτοµα µε Scutoid φαινότυπο και βρέθηκε ότι η αλληλουχία του γονιδίου διακόπτεται από µία αλληλουχία που µοιάζει µε I-µεταθετό στοιχείο. ε βρέθηκε κάτι ανάλογο σε 1000 άτοµα αγρίου τύπου. Αυτό σηµαίνει ότι ο Scutoid φαινότυπος που βρέθηκε προκλήθηκε από µία de novo µετάλλαξη και όχι από µία προϋπάρχουσα κρυπτική µετάλλαξη η οποία εκφράστηκε µε την µετάλλαξη του hsp83 γονιδίου (Specchia et al. 2010). 17

20 Α.3 Ρύθµιση των hsp γονιδίων και του γονιδίου HSP90. Η θερµοεπαγόµενη ρύθµιση των hsp γονιδίων επιτυγχάνεται µε την ύπαρξη των στοιχείων απόκρισης στο θερµικό στρες (HSEs) ανοδικά των γονιδίων αυτών ή στο πρώτο εσώνιο. Ένα τέτοιο στοιχείο ορίζεται ως ένα δεκατετραµερές παλίδροµο µε την αλληλουχία CTnGAAnnTTCnAG στη D. melanogaster (Pehlam 1982). Τέτοια στοιχεία αν τοποθετηθούν ανοδικά του γονιδίου της β- γαλακτοζιδάσης τότε το γονίδιο αυτό επάγεται µε θερµοεπαγόµενο τρόπο σε κύτταρα S3 της Drosophila melanogaster. Αν υποστούν µεταλλάξεις τα ίδια στοιχεία τότε χάνουν δυνατότητα θερµοεπαγόµενης ρύθµισης (Amin et al. 1988). Στα στοιχεία απόκρισης του θερµικού στρες προσδένεται ο µεταγραφικός παράγοντας HSF. Ο HSF έχει µέγεθος περίπου 70 kda και αποτελείται από 4 διακριτές περιοχές (Εικόνα Α6). Στο αµινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης υπάρχει η περιοχή πρόσδεσης στο DNA. Το επόµενο τµήµα είναι υπεύθυνο για το σχηµατισµό της τριµερούς µορφής, που είναι η µεταγραφικά ενεργή µορφή του παράγοντα και αποτελείται από υδρόφοβες επαναλήψεις (HR-A/B). Στο καρβοξυτελικό άκρο εντοπίζεται η περιοχή αλληλεπίδρασης µε το σύµπλοκο έναρξης της µεταγραφής. Στην ίδια περιοχή εντοπίζονται και υδρόφοβες επαναλήψεις (HR-C) που αλληλεπιδρούν µε την περιοχή HR-A/B του παράγοντα και τον διατηρούν σε ανενεργή µορφή (µονοµερές) (Morimoto 1998). Εικόνα Α6: Ο µεταγραφικός παράγοντας του θερµικού στρες (HSF). (Α) Η πρωτοταγής δοµή του. (Β) Ο HSF βρίσκεται σε ανενεργή µονοµερή µορφή στο κυτταρόπλασµα. Ύστερα από την επίδραση θερµικού στρες µετατοπίζεται στον πυρήνα, τριµερίζεται και προσδένεται στα HSEs (Morimoto 1998). 18

21 Πρόσφατη µελέτη έδειξε ότι σε συνεχόµενα HSEs που αποτελούνται από συνεχόµενες ανάστροφες αλληλουχίες του ngaan (nttcnngaannttcn) η πρόσδεση του HSF είναι πιο ισχυρή σε σχέση µε τα ασυνεχή HSEs που αποτελούνται από ένα ή δύο διάκενα (gaps) [ένα διάκενο, nttcnngaan(5 bp)ngaan, δύο διάκενα nttcn(5 bp)nttcn(5 bp)nttcn] (Enoki and Sakurai 2011). Η µελέτη περιορίστηκε στους πρότυπους οργανισµούς Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, και Danio rerio. Ορισµένα από τα hsp γονίδια όµως επάγονται κατά την ανάπτυξη οργανισµών όπως της Drosophila melanogaster και του Danio rerio (Michaud et al. 1997, Krone et al. 1997). Στη D. melanogaster τα γονίδια των µικρών θερµοεπαγόµενων πρωτεϊνών, όπως το hsp27, hsp26 hsp23 και hsp22, εκφράζονται σε διάφορους ιστούς κατά την ανάπτυξη, υποδηλώνοντας την ύπαρξη κι άλλων στοιχείων που ρυθµίζουν την έκφρασή τους πέρα από τα HSEs (Glaser et al 1990, Michaud et al 1997). Στον ίδιο οργανισµό φαίνεται ότι το γονίδιο hsp26 βρίσκεται υπό τον έλεγχο στοιχείων που οδηγούν την µεταγραφή του στα σπερµατοκύτταρα (Glaser et al 1990), ενώ το hsp27 και το hsp23 ελέγχονται από στοιχεία απόκρισης στην εκδυσόνη (Ireland et al. 1982). Όσον αφορά το ψάρι ζέβρα η έκθεσή του σε βαρέα µέταλλα επάγει την έκφραση της εµβρυικής Hsp70, ενώ παράλληλα µία ισοµορφή της Hsp90 (Hsp90α) εκφράζεται κατά τη διαφοροποίηση των ραβδωτών µυών (Krone et al. 1997), υποδηλώνοντας και σε αυτόν τον οργανισµό την ύπαρξη κι άλλων στοιχείων που ρυθµίζουν την έκφρασή τους πέρα από τα HSEs ή την αλληλεπίδραση του HSF µεταγραφικού παράγοντα µε άλλους παράγοντες µε αποτέλεσµα την ενεργοποίησή του, όπως συµβαίνει µε τον HSF-1 και τον STAT-1 στα θηλαστικά (Stephanou and Latchman 1999). Όσον αφορά το γονίδιο hsp83 φαίνεται ότι η αναπτυξιακή και θερµοεπαγόµενη έκφρασή του ρυθµίζεται µε διαφορετικό τρόπο στην D. melanogaster. Πιο συγκεκριµένα η εγγύς 5 ανοδική περιοχή των (-170 bp έως +1) ευθύνεται για την θερµοεπαγόµενη έκφρασή του ενώ η περιοχή των bp έως -880 bp ευθύνεται για την αναπτυξιακή έκφρασή του (Xiao and Lis 1989). Εκτενής µελέτη έχει γίνει στον υποκινητή του γονιδίου hsp82 της ζύµης. Εκείνος αποτελείται από τρία HSEs, ένα τυπικό κουτί TATA (TATA box) και από ένα µοτίβο URS1 ARE (mitotic repressor/meiotic activator motif). Σε φυσιολογικές συνθήκες εντοπίζονται προσδεδεµένες πρωτεΐνες στο εγγύς HSE (HSE-1), στο µοτίβο URS1 ARE και στο κουτί TATA, ενώ σε συνθήκες θερµικού στρες εντοπίζονται πρωτεΐνες µόνο στα τρία HSEs και στο κουτί TATA, δείχνοντας τη διαφορετική ρύθµιση αυτού του υποκινητή στις παραπάνω συνθήκες (Erkine et al. 1999, Giardina and Lis 1995). Η ρύθµιση των hsp90 στα θηλαστικά διαφέρει από τους υπόλοιπους οργανισµούς στο γεγονός ότι το εσώνιο από το όποιο αποτελείται το hsp90β παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση του γονιδίου. Αυτό συµβαίνει επειδή στο εσώνιο του hsp90β υπάρχουν δύο τυπικά HSEs και τρεις αλληλουχίες 19

22 που είναι µη τυπικά HSEs. οκιµές CAT (CAT assays) σε κύτταρα Jurkat έδειξαν ότι το εσώνιο και η 5 ανοδική περιοχή είναι χρήσιµες στην επαγωγή του hsp90β σε φυσιολογικές συνθήκες, αφού απουσία της µίας ή της άλλης περιοχής δεν επάγεται το γονίδιο-µάρτυρας όσο παρουσία και των δύο (Shen et al. 1997). Η 5 ανοδική περιοχή του hsp90β αποτελείται από ένα στοιχείο απόκρισης στο camp (CRE), ένα ανοδικό στοιχείο υποκινητή (upstream promoter element, UPE) το οποίο αποτελείται από µία αλληλουχία CAAT και µία SP1 θέση, κι από ένα κουτί TATA. Παρατηρήθηκε επίσης ότι η περιοχή του εσωνίου ρυθµίζει το hsp90β σε καταστάσεις θερµικού στρες. Συγκεκριµένα φάνηκε ότι όταν η περιοχή αυτή αφαιρείται τότε το γονίδιο-µάρτυρας σε δοκιµές CAT δεν επάγεται όσο επάγεται όταν υπάρχει (Shen et al. 1997). Επίσης ο HSF προσδένεται σε περιοχές του εσωνίου πιο έντονα απ ότι σε 5 ανοδικές περιοχές ύστερα από θερµικό στρες όπως φαίνεται σε πειράµατα EMSA, ενώ υπάρχουν εσωτερικές αλληλουχίες έναρξης της µεταγραφής εντός του εσωνίου (Shen et al. 1997). Όσον αφορά το γονίδιο hsp90α αυτό ρυθµίζεται θετικά εξ ολοκλήρου από τις 5 ανοδικές αλληλουχίες του, ενώ το έσώνιο από το οποίο αποτελείται ρυθµίζει µάλλον αρνητικά το γονίδιο σε κύτταρα Jurkat (Zhang et al. 1999). Η 5 ανοδική περιοχή του hsp90α αποτελείται από ένα ανοδικό στοιχείο υποκινητή (upstream promoter element, UPE) το οποίο δεν αποτελείται από κάποια αλληλουχία CAAT αλλά µόνο από δύο SP1 θέσεις, από τρία HSEs και από ένα κουτί TATA, ενώ το εσώνιό του αποτελείται από ένα HSE. Όσον αφορά την κατάσταση του θερµικού στρες αυτή φαίνεται να ρυθµίζεται από το εγγύς και το άπω HSE, στα οποία ο HSF φαίνεται ότι προσδένεται µε µεγαλύτερη συγγένεια (Zhang et al. 1999). Α.4 Το γονίδιο Cchsp83 Το γονίδιο hsp83 της µεσογειακής µύγας Ceratitis capitata (Cchsp83) κωδικοποιεί την οµόλογη πρωτεΐνη HSP90 η οποία ονοµάστηκε CcHSP83 ακολουθώντας το συµβολισµό της D. melanogaster (Theodoraki and Mintzas 2006). Ανάλυση κατά Southern και in situ υβριδοποίηση σε πολυτενικά χρωµοσώµατα των σιελογόνων αδένων της µεσογειακής µύγας έδειξε ότι το Cchsp83 είναι µοναδικό και χαρτογραφείται στην 94C περιοχή του έκτου χρωµοσώµατος (Theodoraki and Mintzas 2006). Σύγκριση της γενωµικής αλληλουχίας µε την cdna αλληλουχία του γονιδίου έδειξε ότι το Cchsp83 αποτελείται από δύο εξόνια που χωρίζονται από ένα εσώνιο 275 ζευγών βάσεων. Το πρώτο εξόνιο κωδικοποιεί την 5 αµετάφραστη περιοχή, ενώ το δεύτερο κωδικοποιεί το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης και την 3 αµετάφραστη περιοχή (Theodoraki et.al 2007). Πλήρης αλληλούχιση του cdna του Cchsp83 έδειξε ότι αποτελείται από ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης 715 κωδικονίων το 20

23 οποίο ξεκινάει µε AUG (Theodoraki and Mintzas 2006). Επίσης πριν από το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης υπάρχει µία αλληλουχία η οποία µοιάζει µε την αλληλουχία έναρξης της µετάφρασης της D. melanogaster, ενώ η 3 αµετάφραστη περιοχή αποτελείται από ένα κανονικό σήµα πολυαδενιλίωσης (AATAAA) 15 νουκλεοτίδια ανοδικά της πολύ(α)-ουράς (Theodoraki and Mintzas 2006). Η έκφραση του γονιδίου Cchsp83 σε διαφορετικές συνθήκες θερµικού στρες µελετήθηκαν µε RT-PCR και βρέθηκε ότι τα επίπεδα του mrna του γονιδίου αυξάνονται στους 30 ο C φτάνοντας σε µέγιστο επίπεδο µεταξύ 35 ο C και 41 ο C, ενώ στους 43 ο C έχουν τα ίδια επίπεδα µε αυτά των 30 ο C (Εικόνα Α7α) (Theodoraki and Mintzas 2006). Υψηλά επίπεδα RNA του γονιδίου Cchsp83 παρατηρήθηκαν ύστερα από 10 λεπτά θερµικού στρες, φτάνοντας στο ανώτατο όριο στα 90 λεπτά. Στις 2 ώρες το επίπεδο του RNA ήταν ίδιο µε αυτό που παρουσιαζόταν στη 1 ώρα (Εικόνα Α7β) (Theodoraki and Mintzas 2006). Επίσης τα RNA επίπεδα του γονιδίου Cchsp83 αυξάνονται λίγο ύστερα από ανάνηψη 10 λεπτών από το θερµικό στρες, και µειώνονται βαθµιαία, φτάνοντας σε µηδενικό επίπεδο µετά από 4 ώρες ανάνηψης (Εικόνα Α7γ) (Theodoraki and Mintzas 2006). Από τα παραπάνω φαίνεται ότι το γονίδιο Cchsp83 είναι θερµοεπαγόµενο (Theodoraki and Mintzas 2006). Εικόνα Α7: Ρύθµιση του Cchsp83 σε καταστάσεις θερµικού στρες. Προνύµφες ηλικίας 5 ηµερών υποβλήθηκαν σε συγκεκριµένες καταστάσεις θερµικού στρες, αποµονώθηκε ολικό RNA από αυτές και η επαγωγή της Cchsp83 µετρήθηκε µε RT-PCR τόσο σε control όσο και σε επεξεργασµένα δείγµατα. (α) Επαγωγή του Cchsp83 RNA ύστερα από επώαση στις θερµοκρασίες που φαίνονται στην εικόνα για 60 λεπτά. (β) Κινητική της µεταγραφικής ενεργοποίησης του Cchsp83 ύστερα από θερµικό σοκ στους 39 ο C. Οι αριθµοί υποδηλώνουν τα λεπτά που επωάστηκαν οι προνύµφες στους 39 ο C ενώ το C υποδηλώνει προνύµφες που δεν επωάστηκαν στους 39 ο C. (γ) Επαγωγή του Cchsp83 21

24 RNA σε διαφορετικούς χρόνους ανάκαµψης ύστερα από θερµικό σοκ στους 39 ο C για 60 λεπτά. To C είναι δείγµα χωρίς ανάκαµψη, ενώ οι αριθµοί υποδηλώνουν τα λεπτά ανάκαµψής. (Theodoraki and Mintzas 2006) Ανάλυση της 5 ανοδικής περιοχής του γονιδίου Cchsp83 έδειξε ότι αποτελείται από ένα τυπικό TATA box, 28 ζεύγη βάσεων µακριά από το σηµείο έναρξης της µεταγραφής, και από 7 θεωρητικά στοιχεία απόκρισης στο θερµικό στρες (Theodoraki et.al 2007), από τα οποία τέσσερα στοιχεία ταιριάζουν µε την αλληλουχία των στοιχείων απόκρισης του θερµικού στρες της Drosophila melanogaster (CTnGAAnnTTCnAG). Πιο συγκεκριµένα στην 5 ανοδική περιοχή του γονιδίου Cchsp83 τα πρώτα δύο στοιχεία (HSE-7 and -6) ταιριάζουν απόλυτα µε την θεωρητική αλληλουχία της Drosophila ενώ τα άλλα δύο (HSE-5 and -4) ταιριάζουν στις εφτά και στις οκτώ από τις δέκα θέσεις της αλληλουχίας. Τα υπόλοιπα τρία στοιχεία ταιριάζουν σε εφτά (HSE-3) και σε οχτώ (HSE- 2 and -1) θέσεις από τις δέκα θέσεις της αλληλουχίας (Theodoraki et.al 2007) (Εικόνα Α8). Στα θεωρητικά στοιχεία απόκρισης του θερµικού στρες ίσως προσδένεται ο παράγοντας απόκρισης στο θερµικό στρες (Heat Shock Factor, HSF) αφού τριµεριστεί, και µε αυτόν τον τρόπο επάγει την έκφραση των γονιδίων του θερµικού στρες στη µεσογειακή µύγα C. capitata. Εικόνα Α8: Η 5 ανοδική περιοχή του γονιδίου Cchsp83 µαζί µε την κωδική περιοχή του ίδιου γονιδίου. Η κωδική περιοχή ξεκινά από το +1 και µε γκρι φόντο παρουσιάζονται το πρώτο εξώνιο και µέρος του δεύτερου εξωνίου. Οι κύκλοι µε νούµερα δείχνουν τα θεωρητικά στοιχεία απόκρισης στο θερµικό στρες. Α.5 Το γονίδιο λουσιφεράση του θαλάσσιου κοπίποδου Metridia longa και το µεταθέσιµο γενετικό στοιχείο piggybac του σκώρου Trichoplusia ni Το γονίδιο της λουσιφεράσης του οργανισµού Metridia longa χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα εργασία ως γονίδιο αναφοράς για την παρακολούθηση της γονιδιακής έκφρασης του γονιδίου Cchsp83. Η Metridia longa είναι ένα θαλάσσιο κοπίποδο το οποίο εκπέµπει κυανό φως από τους επιδερµικούς αδένες του ως απάντηση σε διάφορα ερεθίσµατα (Markova et al. 2004). Η λουσιφεράση της Metridia longa είναι µία µικρή εκκρινόµενη πρωτεΐνη µε µοριακό βάρος 24 kda, έχει ως υπόστρωµα την σελεντεραζίνη (coelenterazine) και για τη δράση της δεν απαιτείται κάποιος άλλος παράγοντας (Markova et al. 2004, Stepanyuk et al. 2008). Το γεγονός ότι είναι εκκρινόµενη, της προσδίδει ένα µεγάλο πλεονέκτηµα όσον αφορά την παρακολούθηση γονιδιακής έκφρασης σε 22

25 κύτταρα, διότι δε χρειάζεται αυτά να καταστραφούν µε λύση, κι έτσι µπορούν να χρησιµοποιηθούν ξανά για περαιτέρω µελέτες (Stepanyuk et al. 2008). Το µεταθέσιµο γενετικό στοιχείο piggyback του σκώρου Trihoplusia ni αποµονώθηκε αρχικά ως µία DNA ένθεση στο γονιδίωµα βακουλοϊών οι οποίοι προσβάλλουν ορισµένες κυτταρικές σειρές του Trihoplusia ni (TN-368 και TN-5B1). Η ένθεση αυτή προκαλεί στους βακιουλοϊούς έναν επικρατή φαινότυπο κατά τον οποίο σχηµατίζονται λίγα σωµατίδια εγκόλπωσης (occlusion bodies) στο κύτταρο που έχει µολυνθεί. Τα σωµατίδια εγκόλπωσης στην προκειµένη περίπτωση χρησιµεύουν στον αποτελεσµατική εγκόλπωση των ιικών σωµατίων στον πυρήνα του κυττάρουξενιστή. (Cary et al. 1989) Το µεταθέσιµο γενετικό στοιχείο piggybac ανήκει στην κλάση ΙΙ των ευκαρυωτικών DNA µεταθέσιµων γενετικών στοιχείων (Εικόνα Α9). Αποτελείται από µία ανάστροφη αλληλουχία σε κάθε άκρο µήκους 13bp. Επίσης αποτελείται από εσωτερικές ανάστροφές αλληλουχίες µήκους 19bp που η µία απέχει 31bp από την αριστερή ακριανή ανάστροφη αλληλουχία και η άλλη απέχει 3bp από τη δεξιά ακριανή ανάστροφη αλληλουχία. Οι ακριανές ανάστροφες αλληλουχίες ίσως δηµιουργούν έναν βρόγχο ο οποίος βοηθά στην µετατόπιση του µεταθέσιµου γενετικού στοιχείου (Cary et al. 1989). Εσωτερικά του piggybac υπάρχει ένας υποκινητής της RNA πολυµεράσης ΙΙ και ένα ανοικτό πλαίσιό ανάγνωσης µήκους 2.1kb (Elick et al. 1996). Ακόµα το piggybac έχει συγκεκριµένη αλληλουχία ένθεσης στο γονιδίωµα του ξενιστή και είναι η : 5'-ΤΤΑΑ-3'. Η αλληλουχία αυτή πρέπει να βρίσκεται κοντά σε Α+Τ περιοχές (Cary et al. 1989,Elick et al. 1996). Όσον αφορά τον τρόπο µε τον οποίο αποκόπτεται το piggybac από το σηµείο ένθεσης αυτός περιλαµβάνει την ακριβή αποκοπή του από το σηµείο ένθεσης χωρίς να αφήνει µεταλλαγµένη την περιοχή όπου είχε εντεθεί. Επίσης δεν παίζει κάποιο ρόλο το πόσο µακριά βρίσκονται οι ανάστροφες αλληλουχίες του, γεγονός που βοηθάει την µεταφορά µεγάλων διαγονιδίων (Elick et al.1997). Σηµαντικό ρόλο στην αποκοπή το piggybac από το σηµείο ένθεσης έχει η αριστερή ανάστροφη αλληλουχία του όπως επίσης και οι αµέσως επόµενες από αυτήν που είναι το διπλασιασµένο σηµείο ένθεσης (ΤΤΑΑ) (Elick et al.1997). Εικόνα Α 9: Το µεταθέσιµο γενετικό στοιχείο piggybac µήκους 2,47kb. Στο διάγραµµα φαίνονται οι ανάστροφες τελικές αλληλουχίες (ITR) και οι εσωτερικές ανάστροφες αλληλουχίες (IR). Επίσης φαίνεται ο διπλασιασµένος γενετικός τόπος (ΤΤΑΑ) στον οποίο εντίθεται το piggybac (Handler 2002). 23

26 Το piggybac µπορεί να αποτελέσει φορέα µετάθεσης διαγονιδίων στο γονιδίωµα βακιουλοϊών. Η επιµόλυνση µίας κυτταρικής σειράς του εντόµου Spodoptera frugiperda (SF21AE) µε δύο πλασµίδια και µε ένα γονιδίωµα βακιουλοϊου αγρίου τύπου (AcMNPV) είχε ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία µετασχηµατισµένου ιού. Το ένα από τα δύο πλασµίδια έφερε το piggybac µαζί µε ένα γονίδιο αναφοράς για τον εντοπισµό µετασχηµατισµένων ιών (polh/lacz) ενώ το άλλο έφερε το piggybac στοιχείο που είχε µετατεθεί στην αµινοτελική περιοχή του ιικού γονιδίου που παίζει ρόλο στην δηµιουργία των σωµατιδίων εγκόλπωσης. Το γεγονός ότι η µετάθεση έγινε σε κύτταραξενιστές που ανήκαν σε έντοµο εγείρει την δυνατότητα ανάπτυξης ενός πρωτοκόλλου βάσει του οποίου η µετάθεση να γίνεται στο γονιδίωµα κυττάρων του εντόµου µε φορέα το µεταθέσιµο γενετικό στοίχειο piggybac (Fraser et al. 1995). Το 1998 έγινε η πρώτη µεταφορά διαγονιδίου στο γονιδίωµα της µεσογειακής µύγας µε τη χρήση του piggybac (Handler et al. 1998). Έκτοτε έχουν δηµιουργηθεί διαγονιδιακά στελέχη διαφόρων οργανισµών όπως της Drosophila melanogaster, του Bombyx mori, της Anastrepha ludens και της Bactrocera tryoni µε τον ίδιο φορέα (Handler et al. 1999, Tamura et al. 2000, Meza et al. 2011, Raphael et al. 2010). Συνολικά έχουν µετασχηµατιστεί µε το piggyβac έντοµα από πέντε διαφορετικές τάξεις (Handler 2002), ενώ µπορούν να µετασχηµατιστούν κυτταρικές σειρές του ποντικού και του ανθρώπου, δίνοντας ελπίδες για πιθανή χρήση του µεταθέσιµου γενετικού στοιχείου piggyβac και της τρανσποζάσης του στη µεταφορά γονιδίων κατά τη γονιδιακή θεραπεία (Feschotte 2006). Πλεονεκτήµατα του συστήµατος piggybac είναι ότι µπορεί να εντεθεί σε συγκεκριµένες θέσεις στο γονιδίωµα του κυττάρου-ξενιστή που είναι οι: ΤΤΑΑ (Cary et al. 1989,Elick et al. 1996), ενώ παράλληλα µπορεί να δεχθεί µεγάλα γονίδια εντός των ανάστροφων αλληλουχιών (Elick et al.1997, Feschotte 2006). Επίσης όταν αποκόπτεται από τη θέση ένθεσης δεν αφήνει µεταλλαγµένη την περιοχή, ενώ η ίδια η ένθεση παραµένει σταθερή για πολλές γενιές στο γονιδίωµα των µετασχηµατισµένων εντόµων (Handler et al. 1998, Tamura et al. 2000, Raphael et al. 2010). Ακόµα απαιτούνται µικρές σε µήκος αλληλουχίες για τη δηµιουργία πλασµιδίων κατάλληλων για µετασχηµατισµό εντόµων. Αυτές είναι οι ανάστροφες ακριανές αλληλουχίες (ITR, IR και ενδιάµεσες αλληλουχίες) και ορισµένες εσωτερικές αλληλουχίες µήκους 60bp 250bp που βρίσκονται δίπλα από τις ανάστροφες ακριανές αλληλουχίες (Li et al. 2001, Li et al.2005). Το piggybac µετατίθεται βάσει µίας παραλλαγής του µηχανισµού "κοψίµατος και επικόλλησης" που παρατηρήθηκε για πρώτη φορά στα προκαρυωτικά µεταθέσιµα γενετικά στοιχεία Tn10 και Tn5 (Mitra et al. 2008) Αρχικά ο µηχανισµός περιλαµβάνει τη δηµιουργία δύο εγκοπών στη σύνδεση µεταξύ των 3' άκρων του piggybac και του γονιδιώµατος του ξενιστή, αφήνοντας ελεύθερα τα 3'- OH του piggybac (Εικόνα Α10). Η δηµιουργία των εγκοπών καταλύεται από την τρανσποζάση, και 24

27 ξεκινά από την δεξιά ανάστροφη αλληλουχία του piggybac. Τα 3'-OH συνδέονται οµοιοπολικά µε τη συµπληρωµατική αλληλουχία TTAA του γονιδιώµατος του ξενιστή, σχηµατίζοντας µία δοµή λούπας (hairpin). Με το σχηµατισµό της λούπας το piggybac αποκόπτεται επακριβώς από το γονιδίωµα του ξενιστή αφήνοντας 5' µονόκλωνα προεξέχοντα άκρα σε αυτό τα οποία στη συνέχεια ενώνονται µεταξύ τους. Στη συνέχεια η δοµή της λούπας "ξεµπερδεύεται" από την τρανσποζάση, και αφήνει 5' προεξέχοντα µονόκλωνα άκρα µε αλληλουχία TTAA στο µεταθετό στοιχείο, ενώ παράλληλα απελευθερώνονται εκ νέου τα 3'-OH. Τα 3'-OH αλληλεπιδρούν µε τις 5' θυµίνες µίας αλληλουχίας στόχου TTAA/ΑΑΤΤ. Τελικά η επιδιόρθωση των ατελών αλληλουχιών που βρίσκονται πλευρικά του µεταθετού στοιχείου επιφέρουν τον διπλασιασµό της αλληλουχίας στόχου, και την ένθεση του µεταθετού στοιχείου σε νέα θέση (Mitra et al. 2008). Εικόνα Α10: Ο µηχανισµός µετάθεσης του µεταθέσιµου γενετικού στοιχείου piggybac (Mitra et al. 2008). Για περισσότερες λεπτοµέρειες ανατρέξτε στο κείµενο. Α.6 Οι επιπτώσεις του ψυχρού στρες στα έντοµα Τα έντοµα και άλλοι ποικιλόθερµοι οργανισµοί έχουν αναπτύξει διάφορους µηχανισµούς για την προστασία τους από ακραίες θερµοκρασίες. ύο είναι οι βασικές στρατηγικές που ακολουθούν: η αντοχή στο πάγωµα (freeze-tolerant), και η αποφυγή του παγώµατος (freeze-avoiding) (Sinclair et al. 2003a). Η κύρια στρατηγική που ακολουθείται είναι η δεύτερη, ενώ φαίνεται ότι τα περισσότερα παγοανθεκτικά έντοµα κατοικούν στο νότιο ηµισφαίριο (Sinclair et al. 2003a). 25

28 Η φυσιολογία που διέπει τα έντοµα που αποφεύγουν το πάγωµα (freeze-avoiding) βασίζεται στο γεγονός ότι ο οργανισµός αυτών των εντόµων αποµακρύνει από το σώµα τις ουσίες που προκαλούν το σχηµατισµό πάγου (ice nucleators), συνθέτει αντιπηκτικές πρωτεΐνες και συσσωρεύει πολυόλες (polyols) και σάκχαρά όπως τρεχαλόζη και γλυκερόλη. Με αυτόν τον τρόπο µειώνεται η θερµοκρασία στην οποία τα υγρά του σώµατος κρυσταλλώνονται και σταθεροποιούνται οι µεµβράνες τους σε χαµηλές θερµοκρασίες (Sinclair et al. 2003b). Στα παγοανθεκτικά είδη από την άλλη ο πάγος σχηµατίζεται σε θερµοκρασίες υπό το µηδέν και συνήθως περιορίζεται σε εξωκυτταρικά διαµερίσµατα όπως στην αιµολέµφο και το έντερο. Εδώ οι πολυόλες και τα σάκχαρα προστατεύουν τις µεµβράνες και τις πρωτεΐνες από µεταπτώσεις των φάσεών τους, ενώ παράλληλα ελέγχουν το µέγεθος των κρυστάλλων του πάγου και τον όγκο των κυττάρων, ο οποίος µειώνεται από την ωσµωτική αφυδάτωση που συνοδεύει το πάγωµα. Επίσης η σύνθεση αντιπηκτικών πρωτεϊνών στα παγοανθεκτικά είδη παρεµποδίζει την αύξηση και την αναδιανοµή των κρυστάλλων πάγου στο σώµα τους, όταν αυτοί έχουν σχηµατιστεί (Sinclair et al. 2003b). Πέρα από τις δύο στρατηγικές αντιµετώπισης των χαµηλών ακραίων θερµοκρασιών ορισµένα είδη ακολουθούν ορισµένες παραλλαγές. Αυτές είναι η αφυδάτωση που προσδίδει προστασία από το κρύο (cryoprotective dehydration) και η γρήγορη αντοχή στο κρύο (rapid cold hardening response). Κατά τη χειµερινή περίοδο το αρθρόποδο Onychurus articus ελαττώνει το ποσό του νερού στο σώµα του, όσο µειώνεται η θερµοκρασία του περιβάλλοντος, µε αποτέλεσµα να ελαττώνεται το σηµείο τήξης του σώµατός του. Παράλληλα µε την αφυδάτωση του σώµατος παρατηρείται αθρόα µετατροπή του γλυκογόνου του σώµατος σε τρεχαλόζη. Με τον παραπάνω τρόπο µειώνεται η πιθανότητα σχηµατισµού πάγου στο σώµα του αρθροπόδου και εξασφαλίζεται η επιβίωσή του σε θερµοκρασίες έως και -30 ο C (Sinclair et al. 2003b). Η γρήγορη αντοχή στο κρύο είναι ένα σύνολο βιοχηµικών µεταβολών που συµβαίνουν σε αρκετά έντοµα και είναι η αυξηµένη αντοχή τους σε χαµηλές θερµοκρασίες όταν αυτά υποστούν ήπιο ψυχρό στρες (Clark and Worland 2008). Η γρήγορη αντοχή στο κρύο είναι δηλαδή ένα είδος εγκλιµατισµού των εντόµων στο κρύο. Οι πιο γνωστές βιοχηµικές µεταβολές είναι τα αυξηµένα ποσοστά γλυκόζης και τραχαλόζης και η αύξηση του ποσοστού των µη κορεσµένων λιπαρών οξέων προς τα κορεσµένα στις µεµβράνες των κυττάρων (Clark and Worland 2008). Επιπροσθέτως των στρατηγικών αντιµετώπισης χαµηλών θερµοκρασιών και των παραλλαγών τους έχουν χαρακτηριστεί σε επαρκή βαθµό ορισµένοι βιοχηµικοί και γενετικοί µηχανισµοί που προστατεύουν τα έντοµα από τις χαµηλές θερµοκρασίες. Σε αυτούς συγκαταλέγονται οι αντιπηκτικές πρωτεΐνες, η αποµάκρυνση ουσιών που προκαλούν το σχηµατισµό πάγου, η σύνθεση σακχάρων χαµηλού µοριακού βάρους, αλκοολών και µη κορεσµένων λιπαρών οξέων, η αφυδάτωση, 26

29 η διάπαυση (diapause), οι θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες και η µείωση των µιτοχονδρίων σε ιστούς όπως του λιπώδους ιστού και του εγκεφάλου (Clark and Worland 2008). Η ενεργοποίηση αυτών των µηχανισµών γίνεται για να προστατευτεί το έντοµο από τις βλαβερές συνέπειες του ψυχρού κώµατος (chill coma) ή για να ανακάµψει από αυτό. Το ψυχρό κώµα είναι η αναστρέψιµη κατάσταση κατά την οποία το έντοµο δεν κινείται καθόλου (MacMillan and Sinclair 2010). Η παντελής έλλειψη κίνησης στα έντοµα της ξηράς ίσως οφείλεται σε δυσλειτουργίες του νευρικού και του µυϊκού συστήµατος (MacMillan and Sinclair 2010), παρά στην ανικανότητα του οργανισµού να οξυγονώσει αποτελεσµατικά τους ιστούς (MacMillan et al. 2012). Οι δυσλειτουργίες του νευροµυϊκού συστήµατος οφείλονται µε τη σειρά τους στη διαταραχή της οµοιόστασης των ιόντων λόγω των ανωµαλιών στη λειτουργία των ιοντικών καναλίων, των αντλιών αλλά και των µεµβρανών που βρίσκονται αυτές οι πρωτεΐνες (MacMillan and Sinclair 2010). Ένας από τους µηχανισµούς για την αντιµετώπιση του ψυχρού κώµατος ή την ανάκαµψη από αυτό είναι η αύξηση της έκφρασης των θερµοεπαγόµενων πρωτεϊνών (Clark and Worland 2008). Συγκεκριµένα δείχθηκε ότι αυξάνεται η µεταγραφή του hsp83 σε ενήλικα αρσενικά άτοµα της Drosophila melanogaster, (Colinet et al. 2010, Qin et al. 2005) όπως επίσης και των θερµοεπαγόµενων γονιδίων hsp22, hsp23, hsp26, hsp27, hsp40, hsp68, hsp70aa κατά τη διάρκεια ανάκαµψης από το ψυχρό στρες (Colinet et al. 2010). Πειράµατα RNAi επιβεβαίωσαν το πόσο σηµαντικά είναι τα γονίδια hsp70 και hsp23 στην επιβίωση του εντόµου Sarcophaga crassipalpis σε χαµηλές θερµοκρασίες κατά την περίοδο διάπαυσης (diapause) της νύµφης (Rinehart et al. 2007). Στον ίδιο οργανισµό κατά την ίδια κατάσταση το γονίδιο hsp90 υπερεκφράζεται σε συνθήκες ανάκαµψης από ψυχρό στρες (Rinehart et al. 2000). Τα παραπάνω δεδοµένα υποδηλώνουν τη σηµασία των θερµοεπαγώµενων πρωτεϊνών κατά την ανάκαµψη από το ψυχρό στρες στα έντοµα. Α.7 Η µεσογειακή µύγα. Μορφολογία, κύκλος ζωής και οικονοµική σηµασία Η µεσογειακή µύγα Ceratitis capitata (Wiedemann) είναι ένα δίπτερο, ολοµετάβολο έντοµο που ανήκει στην οικογένεια Tephritidae. Το µέγεθος των ενηλίκων ατόµων ποικίλλει από 3,5 ως 5 mm. ιαθέτουν διαφανείς πτέρυγες µε µαύρες και καφέ ζώνες καθώς και κηλίδες. Τα µάτια τους έχουν πορφυρό χρώµα και ο θώρακάς τους είναι υποκίτρινος µε µαύρες κηλίδες. Τα αρσενικά άτοµα χαρακτηρίζονται από ένα ζεύγος κεραιών στο κεφάλι, που καταλήγουν σε πεπλατυσµένους σχηµατισµούς. Χαρακτηριστικό γνώρισµα των θηλυκών ατόµων είναι ο προεξέχων ωοαποθέτης στο πίσω µέρος της κοιλίας, ο οποίος όταν εκτείνεται έχει µήκος 1,2 mm. Στην εικόνα παρουσιάζονται δύο άτοµα διαφορετικού φύλου της µεσογειακής µύγας. 27

30 Το θηλυκό άτοµο τρυπά µε τον ωοαποθέτη του την επιφάνεια των φρούτων και γεννά µικροσκοπικά αυγά σε οµάδες των Σε φυσιολογικές συνθήκες, κάθε θηλυκό άτοµο µπορεί να γεννήσει κατά µέσο όρο 250 αυγά, τα οποία µετά από 2-4 ηµέρες εκκολάπτονται σε προνύµφες πρώτου σταδίου. Η προνύµφη ζει µέσα στο φρούτο και τρέφεται από αυτό για 6-11 ηµέρες, κατά τη διάρκεια των οποίων υφίσταται δύο εκδύσεις. Όταν η προνύµφη είναι έτοιµη να βοµβυκιωθεί ανέρχεται στην επιφάνεια του καρπού και µε χαρακτηριστικό τρόπο εκτινάσσεται στο έδαφος. Αµέσως εισέρχεται στο χώµα και εκεί µεταπίπτει στο στάδιο της νύµφης µέσα σε λίγες ώρες. Το βοµβύκιο που σχηµατίζεται έχει σκούρο καφέ χρώµα και µετά από 7-11 ηµέρες εκκολάπτεται από αυτό το ενήλικο άτοµο. Τα ενήλικα άτοµα είναι αναπαραγωγικά ώριµα µετά από 2-4 ηµέρες και συνήθως ζουν µέχρι 2 µήνες. Σε εργαστηριακές συνθήκες (25 0 C, 75% υγρασία και 12ωρη φωτοπερίοδο) ο κύκλος ζωής του εντόµου διαρκεί περίπου 25 ηµέρες. Στο φυσικό περιβάλλον ο κύκλος ζωής της µεσογειακής µύγας ποικίλλει ανάλογα µε τις περιβαλλοντικές συνθήκες και µπορεί να διαρκέσει έως και 3 µήνες. Η µεσογειακή µύγα είναι ένα γηγενές είδος της Αφρικής µε πιθανό σηµείο προέλευσης την περιοχή νοτιοανατολικά της ερήµου Σαχάρα. Τα τελευταία 200 χρόνια έχει εξαπλωθεί σε πολλές τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες περιοχές της γης, όπως η λεκάνη της Μεσογείου, η κεντρική και νότια Αµερική, οι νότιες περιοχές των ΗΠΑ και η Αυστραλία. Η ραγδαία εξάπλωσή της οφείλεται κυρίως σε δραστηριότητες του ανθρώπου (εµπόριο και τουρισµός) και λιγότερο σε µεταφορά µε τη βοήθεια του ανέµου ή σε φυσική µετανάστευση. Η πρώτη καταγραφή αυτού του εντόµου σε µεσογειακές χώρες, όπως η Ισπανία και η Ιταλία, έγινε στα µέσα του 18ου αιώνα. Στις αρχές του περασµένου αιώνα, η µεσογειακή µύγα καταγράφηκε για πρώτη φορά στην αµερικάνικη ήπειρο και συγκεκριµένα στη Βραζιλία το Μέχρι το 1930 είχε φτάσει στις Ηνωµένες Πολιτείες, όπου και ανιχνεύτηκε στη Φλόριδα, στο Τέξας και στην Καλιφόρνια (Malacrida et al., 1992). Η µεσογειακή µύγα προσβάλλει περισσότερα από 200 είδη καλλιεργούµενων φρούτων, προκαλώντας κάθε χρόνο τεράστιες καταστροφές σε τροπικές-υποτροπικές και εύκρατες περιοχές, 28

31 που υπολογίζονται σε εκατοντάδες εκατοµµύρια δολάρια ετησίως. Η καταστροφή αυτή προκαλείται τόσο από την εναπόθεση των αυγών στους καρπούς και τη συνακόλουθη καταστροφή τους από τις αναπτυσσόµενες προνύµφες, όσο και από το γεγονός ότι οι περιοχές ωοαπόθεσης αποτελούν εστίες µόλυνσης για µικροοργανισµούς, όπως βακτήρια και µύκητες. Η παρασιτική αυτή δράση της µεσογειακής µύγας σε συνδυασµό µε τη µεγάλη και γρήγορη γεωγραφική της εξάπλωση, την κατατάσσουν στα έντοµα µε ιδιαίτερη οικονοµική σηµασία και καθιστούν αναγκαίο τον έλεγχο των φυσικών πληθυσµών της. Α.8 Η τεχνική της απελευθέρωσης στείρων εντόµων (Sterile Insect Technique,SIT) Για τον έλεγχο των φυσικών πληθυσµών της µεσογειακής µύγας χρησιµοποιούνται διάφορες µέθοδοι, όµως η εφαρµογή µεθόδων βιολογικού ελέγχου των φυσικών πληθυσµών επιβλαβών εντόµων βρίσκονται σήµερα σε προτεραιότητα τόσο στον Ευρωπαϊκό χώρο, όσο και σε διεθνές επίπεδο, µε κυρίαρχη µέθοδο την απελευθέρωση στείρων εντόµων (SIT, Sterile Insect Technique). Πρόκειται για µια ειδο-ειδική, φιλική προς το περιβάλλον µέθοδο, η οποία βασίζεται στη µαζική αναπαραγωγή, στείρωση και απελευθέρωση εντόµων στο περιβάλλον. Η µέθοδος αυτή προτάθηκε για πρώτη φορά από τον Knipling το 1930 µετά από µελέτες στο έντοµο Cochliomyia hominivorax. Η µέθοδος παρουσιάζει όµως προβλήµατα λόγω της ταυτόχρονης απελευθέρωσης ατόµων και των δύο φύλων στις φρουτόµυγες. Τα θηλυκά άτοµα, αν και στείρα, προσβάλλουν τα φρούτα µε αποτέλεσµα να δηµιουργούν εστίες µικροβίων σε αυτά, ενώ ταυτόχρονα έχει βρεθεί ότι υπάρχει προτίµηση ζευγαρώµατος των στείρων αρσενικών µε τα στείρα θηλυκά που απελευθερώνονται, µειώνοντας έτσι την αποτελεσµατικότητα της µεθόδου. Τα πλεονεκτήµατα της µεθόδου είναι ότι δεν χρησιµοποιούνται εντοµοκτόνα για τον έλεγχο των επιβλαβών εντόµων όπως της µεσογειακής µύγας. Επικίνδυνες ουσίες δηλαδή που µένουν στα φρούτα, στο χώµα ενώ παράλληλα χρειάζονται συνεχώς βελτίωση λόγω ανθεκτικότητας των εντόµων. Επίσης τα εντοµοκτόνα δε φτάνουν σε κάθε γωνιά του χωραφιού, ενώ δεν µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε κατοικηµένες περιοχές. Ακόµα η SIT είναι µία ειδοειδική µέθοδος που αν χρησιµοποιηθεί µε φειδώ θα µπορέσει να διατηρήσει την ισορροπία του τοπικού οικοσυστήµατος χωρίς να βλάψει άλλα ζώα ή φυτά. Η πρώτη βελτίωση της SIT αποτέλεσε η δηµιουργία στελεχών γενετικού διαχωρισµού του φύλου (GSSs, Genetic Sexing Strains), ο διαχωρισµός δηλαδή αρσενικών και θηλυκών ατόµων µε γενετικές µεθόδους και η απελευθέρωση µόνο αρσενικών στείρων ατόµων, µειώνοντας έτσι τις επιπτώσεις από την ταυτόχρονη απελευθέρωση ατόµων και των δύο φύλων. Στη Μεσογειακή µύγα, τέτοια στελέχη έχουν κατασκευαστεί και χρησιµοποιηθεί µε επιτυχία µέχρι σήµερα (Robinson, 29

32 2002). Τα στελέχη αυτά έχουν κατασκευαστεί µε αµοιβαίες ή απλές µετατοπίσεις που συνδέουν το κανονικό αλληλόµορφο ενός αυτοσωµατικού γονιδίου µε το Υ χρωµόσωµα. Τα θηλυκά άτοµα είναι οµοζυγωτικά για τη µετάλλαξη και εµφανίζουν το µεταλλαγµένο φαινότυπο, ενώ τα αρσενικά άτοµα είναι ετεροζυγωτικά και εµφανίζουν τον κανονικό φαινότυπο. Τα GSSs «πρώτης γενιάς» βασίστηκαν στη χρήση µεταλλάξεων, που προκαλούν αλλαγή του χρώµατος του βοµβυκίου σε άσπρο ή µαύρο, ενώ τα GSSs «δεύτερης γενιάς» που χρησιµοποιούνται σήµερα, βασίζονται στη χρήση µιας θερµοευαίσθητης µετάλλαξης (Robinson, 2002). Στην πρώτη περίπτωση ο διαχωρισµός των ατόµων γίνεται στο στάδιο του βοµβυκίου µε τη βοήθεια κατάλληλων µηχανών εφοδιασµένων µε φωτοκύτταρο, ενώ στη δεύτερη στο στάδιο του εµβρύου, όπου τα οµοζυγωτικά θηλυκά έµβρυα πεθαίνουν µετά από επώαση στους 32 ο C. Η γενετική αστάθεια όµως αυτών των στελεχών κάτω από συνθήκες µαζικής εκτροφής, καθώς και το γεγονός ότι ανάλογα στελέχη πρέπει να κατασκευάζονται de novo προκειµένου να χρησιµοποιηθούν στο βιολογικό έλεγχο άλλων ειδών της οικογένειας Tephritidae έχει κατευθύνει την έρευνα στην προσπάθεια κατασκευής στελεχών διαχωρισµού του φύλου «τρίτης γενιάς» µε τη χρήση µοριακών τεχνικών. Η ραγδαία ανάπτυξη της διαγονιδιακής τεχνολογίας σε επιβλαβή έντοµα τα τελευταία χρόνια, αναµένεται να συµβάλει σηµαντικά στη βελτίωση της µεθόδου SIT µέσω δηµιουργίας αποδοτικότερων GSS, και στην ανάπτυξη νέων διαγονιδιακών µεθόδων βιολογικού ελέγχου. Στην προσπάθεια αυτή, σηµαντικό ρόλο έχει η βασική έρευνα στην προσπάθειά της να δηµιουργήσει σταθερές διαγονιδιακές σειρές της µεσογειακής µύγας. Άλλες προκλήσεις είναι η ανάπτυξη γενετικών τεχνικών που θα είναι εύκολος ο διαχωρισµός των αρσενικών ατόµων από τα θηλυκά άτοµα, η εύρεση γενετικών δεικτών που θα υποδηλώνουν τα διαγονιδιακά άτοµα, η αποµόνωση και ο χαρακτηρισµός φυλοειδικών και παραγοντικά-εξαρτόµενων (conditional) υποκινητών, οι οποίοι θα ελέγχουν γονίδια που θα προσδίδουν στειρότητα στα αρσενικά άτοµα ή θα θανατώνουν την επόµενη γενιά. Ισχυροί συστατικοί υποκινητές, όπως ο υποκινητής του γονιδίου hsp83, είναι χρήσιµοι για την υψηλή έκφραση διαγονιδιακών δεικτών, όπως παραλλαγές των φθοριζουσών πρωτεϊνών GFP (EGFP) (Horn et al., 2002) και DsRed (DsRed1) (Handler and Harrell, 2001; Verkhusha et al., 2003), µε στόχο την ανάπτυξη διαγονιδιακών συστηµάτων σήµανσης του εντόµου (Horn et al., 2002; Mohammed and Coates, 2004). Όµως θα πρέπει να αποτιµηθεί η τοξικότητα τέτοιων δεικτών στον οργανισµό, όπως επίσης και η επίδρασή τους στην αρµοστικότητα (fitness) του οργανισµού (Horn et al., 2002). Πάντως τα συστήµατα αυτά αναµένεται να συµβάλλουν στην ανίχνευση και διατήρηση κατάλληλων στελεχών που χρησιµοποιούνται σε προγράµµατα βιολογικού ελέγχου καθώς και στην παρακολούθηση (monitoring) των εργαστηριακών εντόµων που απελευθερώνονται στο περιβάλλον (Ashburner et al., 1998). 30

33 Α.9 Στόχος της παρούσας διπλωµατικής εργασίας Όπως αναφέρθηκε διεξοδικά παραπάνω, οι θερµοεπαγόµενες πρωτεΐνες αποτελούν µια από τις πλέον σηµαντικές οµάδες πρωτεϊνών, δεδοµένου ότι προστατεύουν τα κύτταρα από τα τοξικά αποτελέσµατα κάθε µορφής στρες, συµµετέχουν στην ορθή διαµόρφωση και µεταφορά των πρωτεϊνών, και υπεισέρχονται σε έναν τεράστιο αριθµό λειτουργιών και παθολογικών καταστάσεων των κυττάρων. Επίσης τα γονίδια των θερµοεπαγόµενων πρωτεϊνών αποτελούν ένα πολύ ενδιαφέρον σύστηµα µελέτης της έκφρασης των γονιδίων των ευκαρυωτικών οργανισµών και οι υποκινητές τους αποτελούν εξαιρετικά µοριακά εργαλεία για την έκφραση και λειτουργική ανάλυση άλλων γονιδίων. Οι πρωτεΐνες HSP83 (HSP90), συνιστούν µια από τις ποσοτικά κυρίαρχες οµάδες θερµοεπαγόµενων πρωτεϊνών µε ιδιαίτερη σηµασία τόσο σε φυσιολογικές, όσο και σε παθολογικές καταστάσεις των κυττάρων. Στα έντοµα, µε εξαίρεση τη D. melanogaster, δεν έχουν γίνει διεξοδικές µελέτες σχετικά µε τη ρύθµιση και λειτουργία των hsp83 γονιδίων και των αντίστοιχων πρωτεϊνών τους. Στα πλαίσια των ενδιαφερόντων του εργαστηρίου, που είναι η µελέτη των θερµοεπαγόµενων πρωτεϊνών και των γονιδίων τους στη µεσογειακή µύγα, στόχος της παρούσας διπλωµατικής εργασίας ήταν η λειτουργική ανάλυση της 5 ανοδικής περιοχής του γονιδίου hsp83 της Μεσογειακής µύγας και η έκφραση του γονιδίου σε συνθήκες ψυχρού στρες. 31

34 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 32

35 Β.1 Προετοιµασία δεκτικών κυττάρων (competent cells) για µετασχηµατισµό Το 1970, οι Mandel και Higa περιέγραψαν µία µέθοδο επεξεργασίας δεκτικών κυττάρων Escherichia coli µε σκοπό την επιµόλυνση τους από αποµονωµένο φαγικό DNA (Mandel and Higa, 1970). Με µικρές τροποποιήσεις από τον Cohen και τους συνεργάτες του (Cohen et al. 1972), επιτεύχθηκε επιτυχηµένος µετασχηµατισµός µε πλασµιδιακό DNA. Ακολούθησαν διάφορες τροποποιήσεις µε σκοπό την βελτιστοποίηση της µεθόδου, ωστόσο η βασική αρχή παρέµεινε ίδια. Μία τέτοια παραλλαγή είναι και η παρασκευή δεκτικών κυττάρων µε χρήση χλωριούχου ρουβιδίου (RbCl 2 ). Παρασκευή δεκτικών κυττάρων µε χρήση χλωριούχου ρουβιδίου (RbCl 2 ) Υλικά/ ιαλύµατα - Psi θρεπτικό υλικό: bacto-tryptone 2% bacto-yeast extract 0.5% MgSO 4 0.5% Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται µε KOH στο 7.6 και στη συνέχεια αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. - SOB θρεπτικό υλικό: bacto-tryptone 2% bacto-yeast extract 0.5% NaCl 0.05% άγαρ 1% Αφού διαλυθούν τα υλικά προσθέτουµε 1ml διαλύµατος KCl 250mM και γίνεται εξισορρόπηση σε ph 7.0 µε NaOH 10M. Ακολουθεί αποστείρωση στο αυτόκαυστο και στη συνέχεια προσθέτουµε 0.5 ml αποστειρωµένου διαλύµατος MgCl 2Μ. - Tfb I διάλυµα: CH 3 COOK 30mM RbCl 2 100mM CaCl 2 10mM MnCl 2 50mM Glycerol 15% v/v Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται µε αραιό CH 3 COOH στο 5.8 και στη συνέχεια το διάλυµα αποστειρώνεται µε διήθηση σε φίλτρο 0.45 µm. - Tfb II διάλυµα: MOPS 10mM CaCl 2 75mM RbCl 2 10mM Glycerol 15% v/v 33

36 Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται µε 1Μ NaOH στο 6.5 και στη συνέχεια το διάλυµα αποστειρώνεται µε διήθηση σε φίλτρο 0.45 µm. Πορεία 1) Τρυβλίο SOB-άγαρ εµβολιάζεται µε E. coli στέλεχος από stock γλυκερόλης (-70 ) και επωάζεται στους 37 για όλη τη νύχτα. 2) Από το τρυβλίο αυτό λαµβάνεται µοναδική αποικία µε την οποία εµβολιάζονται 5 ml υγρού θρεπτικού µέσου και επωάζεται στους 37 για όλη τη νύχτα σε περιοδική ανάδευση (250 σ.α.λ.). 3) Από το προηγούµενο βήµα λαµβάνεται 1 ml καλλιέργειας µε το οποίο εµβολιάζονται 100 ml υγρού θρεπτικού µέσου Psi. Ακολουθεί επώαση στους 37 µε ανάδευση (~250 σ.α.λ.) µέχρι η απορρόφηση της καλλιέργειας να γίνει OD 550 = 0.5. Στο σηµείο αυτό παίρνουµε 850λ καλλιέργειας, τα µεταφέρουµε σε σωληνάκι eppendorf και προσθέτουµε 150λ αποστειρωµένης γλυκερόλης. Αναδεύουµε καλά, ψύχουµε το eppendorf σε υγρό Ν 2 και αποθηκεύουµε στους -70 (Βακτηριακό stock). 4) Η καλλιέργεια µεταφέρεται κάτω από άσηπτες συνθήκες σε κατάλληλο πλαστικό σωλήνα και ψύχεται για περίπου 15 λεπτά σε πάγο. 5) Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις 4000 r.p.m. για 15 λεπτά στους 4 και αφού απορριφθεί το υπερκείµενο, ο σωλήνας αναστρέφεται για ένα λεπτό ώστε να αποµακρυνθούν και τα τελευταία υπολείµµατα θρεπτικού υλικού. 6) Τα κύτταρα επαναιωρούνται µε ήπια ανάδευση σε 40ml διαλύµατος Tfb I (θερµοκρασίας 4 ) και διατηρούνται στον πάγο για 15 λεπτά. 7) Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται ώστε να έχουµε στις 4000 r.p.m. για 10 λεπτά στους 4, το υπερκείµενο απορρίπτεται και ο σωλήνας αφήνεται ανεστραµµένος για περίπου 1 λεπτό ώστε να στεγνώσει πλήρως. 8) Τα κύτταρα επαναιωρούνται µε ήπια ανάδευση σε 4ml διαλύµατος Tfb II (θερµοκρασίας 4 ) και διατηρούνται στον πάγο για 15 λεπτά. 9) Τα κύτταρα µοιράζονται σε κλάσµατα των 100µl σε παγωµένα σωληνάκια eppendorf, τα οποία στη συνέχεια ψύχονται σε υγρό Ν 2 και φυλάσσονται στους -70. Όλη η διαδικασία γίνεται σε άσηπτες συνθήκες (δουλεύουµε ανάµεσα σε δύο λύχνους). Ακολουθεί έλεγχος της απόδοσης και της ποιότητας των δεκτικών κυττάρων µε µετασχηµατισµό ελέγχου. Για το σκοπό αυτό δεκτικά βακτήρια µετασχηµατίστηκαν µε 1pg του πλασµιδίου puc 19 (50 pg/ul). 34

37 Β.2 Μετασχηµατισµός βακτηρίων µε πλασµιδιακό DNA Πορεία 1) εκτικά κύτταρα E. coli ξεπαγώνονται από τους C, προσέχοντας ώστε η θερµοκρασία τους να µην ξεπεράσει τους 4 ο C. 2) Σε κάθε αντίδραση χρησιµοποιούνται µl δεκτικά κύτταρα και η µέγιστη ποσότητα DNA που τοποθετείται είναι περίπου 5% του όγκου της αντίδρασης. 3) Τα κύτταρα µε το DNA επωάζονται στον πάγο, για 40 λεπτά και στη συνέχεια επωάζονται στους 42 0 C για 90 δευτερόλεπτα. 4) Μεταφέρονται αµέσως σε πάγο όπου ψύχονται για 5 λεπτά και τοποθετούνται σε πλαστικό σωλήνα των 15 ml όπου προστίθενται 800 µl SOC και στη συνέχεια επωάζονται στους 37 0 C για 90 λεπτά. 5) Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται µε γρήγορο spin, και αφού απορριφθούν 700 µl από το υπερκείµενο επαναδιαλύονται στα εναποµείναντα 100 µl SOC. Επιστρώνονται σε τρυβλία LB-αµπικιλίνη και αφήνονται για 10 λεπτά να απορροφηθεί το υγρό ενώ στη συνέχεια επωάζονται στους 37 ο C, για περίπου 16 ώρες. Β.3 Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA Για την αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA, ακολουθήθηκε πρωτόκολλο που βασίζεται στη λύση των κυττάρων µε NaOH και SDS. Έτσι, χρησιµοποιήθηκε το σύστηµα MN Nucleospin Plasmid της εταιρίας MN-Macherey-Nagel, το οποίο είναι κατάλληλο για µικρής κλίµακας αποµόνωση πλασµιδιακού DNA. Το σύστηµα αυτό έχει τυπική απόδοση <25 µg για 1-5 ml καλλιέργειας, και <40 µg για 5-10 ml καλλιέργειας ενώ είναι κατάλληλο για αποµόνωση φορέων <15 Kbp. Υλικά/ ιαλύµατα - ιάλυµα STE: (100ml) 2ml 5M NaCl 0.5 ml 2M Tris-HCl, ph 8 0.2ml 0.5M EDTA (ή 0.25ml 0.4M EDTA) 97.3 ml miliq H 2 O - ιαλύµατα του kit: Α1: περιέχει RNάση Α2: περιέχει NaOH το οποίο ανεβάζει το ph περίπου στο 10 και, όπως και το SDS, αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες. Α3: όξινο διάλυµα, επαναφέρει το ph στο 7 οπότε και παρατηρείται επαναδιάταξη του DNA Α4: απορρυπαντικό ΑW: απορρυπαντικό 35

38 Πορεία ΑΕ: διάλυµα έκλουσης 1) Επώαση 5 ml καλλιέργειας (από µοναδική αποικία) µετασχηµατισµένων E. Coli σε θρεπτικό υλικό µε κατάλληλο αντιβιοτικό για όλη τη νύχτα σε περιοδική ανάδευση (250 σ.α.λ.) στους 37. 2) Φυγοκέντρηση στις 7000 σ.α.λ. σε κλινική φυγόκεντρο για 15 λεπτά στους 4 και απόρριψη του υπερκειµένου. 3) Επαναιώρηση κυττάρων σε 1 ml STE και µεταφορά σε eppendorf. Ακολουθεί καλή ανάδευση µε vortex. 4) Φυγοκέντρηση στα 11000g για 30s ec. Απορρίπτουµε το υπερκείµενο. 5) Προσθέτουµε 250 µl διαλύµατος Α1 και επαναιωρούµε τα κύτταρα πολύ καλά µε vortex. 6) Προσθέτουµε 250 µl διαλύµατος Α2, αναµιγνύουµε ελαφρά αναστρέφοντας το eppendorf 6-8 φορές, επωάζουµε σε RT το µέγιστο για 5 λεπτά. (Με την προσθήκη του Α2 παρατηρείται εκχύλιση του DNA, καθώς το τοίχωµα και οι µεµβράνες των κυττάρων σπάνε. Ταυτόχρονα, και λόγω του αλκαλικού περιβάλλοντος, παρατηρείται αποδιάταξη του DNA, οπότε το ιξώδες του διαλύµατος αυξάνει κάτι το οποίο γίνεται εµφανές. Χρωµοσωµικό και πλασµιδιακό DNA λοιπόν αποδιατάσσονται, ωστόσο στο πλασµιδιακό, καθ ότι κυκλικό, οι αλυσίδες παραµένουν ενωµένες ). 7) Προσθέτουµε 300 µl διαλύµατος Α3 και αναµιγνύουµε ελαφρά αναστρέφοντας το eppendorf 6-8 φορές. (Καθώς το ph επανέρχεται στο 7, παρατηρείται επαναδιάταξη του DNA, πλασµιδιακού και χρωµοσωµικού. Όµως το χρωµοσωµικό DNA επαναδιατάσσεται µερικώς, αντίθετα µε το πλασµιδιακό το οποίο επαναδιατάσσεται πλήρως. Έτσι, σχηµατίζονται συσσωµατώµατα DNA- RNA-πρωτεΐνες τα οποία µε τη φυγοκέντρηση, που ακολουθεί, καθιζάνουν ενώ το πλασµιδιακό DNA παραµένει στο υπερκείµενο. Το ιξώδες του διαλύµατος µειώνεται). 8) Φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα g. Κρατάµε το υπερκείµενο. 9) Προετοιµάζουµε τη στήλη, φορτώνουµε το υπερκείµενο και φυγοκεντρούµε στα 11000g για 1 λεπτά (αποµακρύνουµε το έκλουµα). 10) Προσθέτουµε 600 µl διαλύµατος Α4 και φυγοκεντρούµε στα 11000g για 1 λεπτά (αποµακρύνουµε το έκλουµα). (Το Α4, όπως και το AW, είναι απορρυπαντικό και αποµακρύνει από τη silica µήτρα της στήλης ότι έχει αποµείνει από RNA, πρωτεΐνες κλπ). 36

39 11) Προσθέτουµε 500 µl διαλύµατος AW το οποίο έχουµε προθερµάνει στους 50 για 1 λεπτό, και φυγοκεντρούµε στα 11000g για 1 λεπτά (αποµακρύνουµε το έκλουµα) (προαιρετικό). 12) Ακολουθεί ξηρή φυγοκέντρηση στα 11000g για 2 λεπτά (αποµακρύνουµε το έκλουµα) 13) Μεταφέρουµε τη στήλη σε νέο σωληνάκι eppendorf και προσθέτουµε 50 µl ΑΕ. Επωάζουµε για 1 λεπτά σε RT και εκλούουµε το πλασµιδιακό DNA µε φυγοκέντρηση στα 11000g για 1 λεπτό. Μεταφέρουµε το έκλουµα σε καινούριο eppendorf. 14) Φυγοκεντρούµε στα 11000g για 5 λεπτά και µεταφέρουµε το έκλουµα σε καινούριο eppendorf. 15) Φωτοµετρούµε ώστε να εκτιµήσουµε τη συγκέντρωση του DNA και αποθηκεύουµε στους -20. Β.4 Hλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωµα αγαρόζης Για το διαχωρισµό, την ταυτοποίηση και την αποµόνωση DNA µορίων χρησιµοποιήθηκε η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης (Sambrook et al., 1989). Μόρια DNA, µεγέθους 0,2-50 kb, µπορούν να διαχωριστούν σε πηκτώµατα αγαρόζης διαφόρων συγκεντρώσεων. Όταν το πήκτωµα βρίσκεται σε ηλεκτρικό πεδίο, το DΝΑ το οποίο είναι αρνητικά φορτισµένο, κινείται προς την άνοδο µε ρυθµό αντιστρόφως ανάλογο του λογαρίθµου (log 10 ) του µοριακού βάρους του. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA σε πήκτωµα αγαρόζης εξαρτάται επίσης και από τη συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωµα. Ο πίνακας που ακολουθεί παρουσιάζει την αντιστοιχία µεταξύ της αναλογίας αγαρόζης στο πήκτωµα και του µεγέθους των τµηµάτων του DNA που µπορούν να αναλυθούν. Ποσοστό αγαρόζης (%) Μέγεθος DNA (Kb) 0, , ,7 10-0,8 0,9 7-0,5 1,2 6-0,4 1,5 4-0,2 2,0 3-0,1 Υλικά/ ιαλύµατα - ιάλυµα ηλεκτροφόρησης 0.5x TBE 37

40 Για 1 l διαλύµατος 5x TBE: 54 g Tris 27.5 g βορικό οξύ, 20 ml 0.5 M EDTA ph = 8 dh 2 O ως 1 l. - ιάλυµα δειγµάτων 6Χ: 0.25% µπλέ της βρωµοφαινόλης 0.25% κυανό του ξυλολίου 15% φικόλλη σε H 2 O. Πορεία Σε 100 ml διαλύµατος ηλεκτροφόρησης διαλύεται µε θέρµανση στους 95 0 C η αντίστοιχη ποσότητα αγαρόζης. Στη συνέχεια προστίθεται βρωµιούχο αιθίδιο σε τελική συγκέντρωση 1 µg/ml και το διάλυµα στερεοποιείται σε υποδοχέα-µήτρα διαστάσεων 14x11cm. Στα δείγµατα του DNA προστίθεται διάλυµα δειγµάτων σε τελική συγκέντωση 1Χ και αναλύονται σε οριζόντιες συσκευές ηλεκτροφόρησης, υπό σταθερή τάση 100V. Β.5 Αποµόνωση DNA από πήκτωµα αγαρόζης (gel-extraction) Για την αποµόνωση µορίων DNA από πήκτωµα αγαρόζης, χρησιµοποιήθηκε το σύστηµα MN Nucleospin Extract II της εταιρίας MN-Macherey-Nagel. Πορεία 1) Το DNA αναλύεται σε πήκτωµα αγαρόζης (1γ DNA ανά πηγαδάκι). Το πήκτωµα αποτελείται από 0.8% αγαρόζη σε τελικό όγκο 60 ml 1x TBE. 2) Όταν η ζώνη που µας ενδιαφέρει έχει διαχωριστεί πλήρως, κόβεται µε νυστέρι και µεταφέρεται σε προζυγισµένο eppendorf. Το eppendorf µε τη ζώνη, ζυγίζεται εκ νέου 3) Προσθέτουµε NT buffer (2 µl/mg πηκτώµατος) και επωάζουµε για 10 λεπτά στους 50. Ανάδευση σε vortex ώστε να διαλυθεί πλήρως το πήκτωµα. 4) Φορτώνουµε το διάλυµα στη στήλη και φυγοκεντρούµε για 1 λεπτό στα 11000g. 5) Ξεπλένουµε τη στήλη µε 600 µl NT3 buffer και φυγοκεντρούµε για 1 λεπτό στα 11000xg. 6) Επαναλαµβάνουµε το βήµα-5 µε 200 µl NT3 buffer και φυγοκεντρούµε για 1 λεπτό στα 11000xg. 7) Ακολουθεί ξηρή φυγοκέντρηση της στήλης για 2 λεπτά στα 11000xg. 8) Η στήλη ξηραίνεται στους 70 για 5 λεπτά (προαιρετικό). 9) Η στήλη εκλούεται µε 50 µl NE buffer, µε φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000xg. 10) Για µεγάλα τµήµατα DNA, χρησιµοποιούµαι προθερµασµένο NE buffer. 38

41 Το έκλουµα φυγοκεντρείτε για 5 λεπτά και το υπερκείµενο µεταφέρεται σε καθαρό σωληνάκι eppendorf και φυλάσσεται στους -20. Β.6 Αποφωσφορυλίωση άκρων DNA µε ανταρκτική φωσφατάση Υλικά/ ιαλύµατα Ανταρκτική φωσφατάση [Antarctic Phosphatase (AnP) NEB-M0289 (5U/λ)]. 10Χ Antarctic Phosphatase Reaction Buffer: 500mM Bis-Tris-propane HCl, 10mM MgCl2, 1mM ZnCl2. Πορεία Πρωτόκολλο για 1-5γ DNA (100λ αντίδρασης). 1) Αναµιγνύουµε το DNA µε την κατάλληλη ποσότητα αποστειρωµένου miliq-h2o σε τελικό όγκο 88λ. 2) Προσθέτουµε 10λ 10Χ Antarctic Phosphatase Reaction Buffer. 3) Προσθέτουµε 2λ ανταρκτική φωσφατάση και ανακινούµε ελαφρά. 4) Επωάζουµε στους 37 C για 15 λεπτά για 5 προεξέχοντα και τυφλά άκρα ή για 60 λεπτά για 3 προεξέχοντα άκρα. 5) Για να απενεργοποιήσουµε το ένζυµο, επωάζουµε για 5 λεπτά στους 60 C. Β.7 Σύνδεση µορίων DNA µε αντίδραση λιγάσης Χρησιµοποιήθηκε το ένζυµο DNA ligase της εταιρείας New England Biolabs (NEB, M0202S) που είχε 400U/λ συγκέντρωση. Πορεία Πρωτόκολλο για 10λ αντίδρασης 1) Αναµιγνύουµε το κοµµένο πλασµίδιο, το κοµµένο ένθεµα και το H 2 O µέχρι τον επιθυµητό όγκο (µέχρι τα 8λ), και επωάζουµε για 5 λεπτά στους 65 ο C. 2) Προσθέτουµε 1λ 10x ρυθµιστικό διάλυµα λιγάσης. 3) Προσθέτουµε 1λ λιγάσης και αναµιγνύουµε ήπια. 4) Επωάζουµε για όλη τη νύχτα στους 16 ο C. 5) Επωάζουµε για 20 λεπτά στους 65 ο C για να απενεργοποιήσουµε το ένζυµο 6) Προχωράµε άµεσα σε µετασχηµατισµό ή αποθηκεύουµε την αντίδραση στους -20 ο C. 39

42 Παρατηρήσεις 1. Το ένζυµο µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε οποιοδήποτε ρυθµιστικό διάλυµα της NEB µε 1mM ATP σε τελική συγκέντρωση. 2. Η συγκέντρωση του ολικού DNA στην αντίδραση δεν πρέπει να ξεπερνά τα ng/10λ αντίδρασης. Καλό θα ήταν να χρησιµοποιούνται 50ng ολικού DNA. 3. Η µοριακή αναλογία πλασµιδίου/ενθέµατος θα πρέπει να είναι 2-6. Συγκεκριµένα θα πρέπει η αναλογία να είναι 2 για 3-5kb ενθέµατος, 3 για 1-3kb ενθέµατος, 4 για 0,5-1kb ενθέµατος και 5 για ενθέµατα µικρότερα του 0,5kb. Β.8 Καθαρισµός DNA ύστερα από PCR ή άλλες αντιδράσεις Μετά το πέρας των αντιδράσεων πέψης ή αποφωσφοριλίωσης, ακολουθεί καθαρισµός του DNA προϊόντος µε χρήση του πρωτοκόλλου DNA purification from PCR or other reactions (MN Nucleospin Extract II, MN-Macherey-Nagel) (εικόνα Β1) Εικόνα Β1. ιαγραµµατική απεικόνιση του πρωτοκόλλου Πορεία Σηµείωση: Χρησιµοποιούνται µέχρι 5 µg DNA και µέχρι 100 µl δείγµατος ανά στήλη. 1) Προσθέτουµε ΝΤ buffer (200 µl /100 µl δείγµατος) και αναδεύουµε σε vortex. 2) Φορτώνουµε το διάλυµα στη στήλη και φυγοκεντρούµε για 1 λεπτά στα 11000xg. 40

43 3) Ξεπλένουµε τη στήλη µε 600 µl NT3 buffer και φυγοκεντρούµε για 1λεπτό στα 11000xg. 4) Επαναλαµβάνουµε το βήµα-3 µε 200 µl NT3 buffer (προαιρετικό). 5) Επαναφυγοκεντρούµε τη στήλη για 2 λεπτά στα 11000xg για την ολική αποµάκρυνση του διαλύµατος από τη στήλη. 6) Ξηραίνουµε τη στήλη στους 70 για 5 λεπτά (προαιρετικό). 7) Ακολουθεί έκλουση της στήλης µε 50 µl NE buffer και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000xg. Το έκλουµα φυγοκεντρείται για 5 λεπτά και το υπερκείµενο µεταφέρεται σε καθαρό σωληνάκι eppendorf και φυλάσσεται στους -20. Β.9 Φωτοµέτρηση διαλύµατος DNA και RNA Με τη διαδικασία της φωτοµέτρησης, είναι εφικτή όχι µόνο η εκτίµηση της συγκέντρωσης του δείγµατος DNA, κάτι που άλλωστε µπορεί να πραγµατοποιηθεί και µέσω της τεχνικής της ηλεκτροφόρησης, αλλά και η εκτίµηση της καθαρότητας του δείγµατος. Η απορρόφηση µιας ουσίας εξαρτάται όχι µόνο από τη δοµή αλλά και τη σύστασή της. Η οργανολογία ενός τυπικού φωτόµετρου απεικονίζεται στην εικόνα Β2. Εικόνα Β2: Σχηµατική απεικόνιση φωτόµετρου Στην εικόνα Β2 παρατηρούµε ότι το φως που εκπέµπεται από φωτεινή πηγή (light source) διαπερνά πρώτα το µονοχρωµάτορα (monochromator) ο οποίος αναλύει το φως σε όλες τις συχνότητες και µετά το δείγµα, η απορρόφηση του οποίου αποδίδεται στην οθόνη του µηχανήµατος. Προτού τοποθετήσουµε το δείγµα στο φωτόµετρο, και αφού επιλέξουµε το µήκος κύµατος, όπου στην προκειµένη επιλέγουµε τα 260 nm και 280 nm καθώς στο πρώτο απορροφά το DNA ή το RNA και στο δεύτερο απορροφούν οι πρωτεΐνες, µηδενίζουµε την ένδειξη της απορρόφησης µε το τυφλό δείγµα, το οποίο δεν απορροφά και προσοµοιάζει το προς µέτρηση δείγµα. Η απορρόφηση (Α) µιας ουσίας δίνεται από το νόµο του Beer: Α=abC, όπου a (ή ε) ο συντελεστής µοριακής απορρόφησης, b η οπτική διαδροµή (1cm), C η συγκέντρωση του δείγµατος. 41

44 Η καθαρότητα του δείγµατος DNA, υπολογίζεται από το λόγο OD 260 /OD 280 > 1.8, ενώ η συγκέντρωση υπολογίζεται από τον τύπο C = OD 260 Χ (αραίωση) x 50 µg/ml. Όσον αφορά το RNA η καθαρότητά του υπολογίζεται από τον ίδιο λόγο, ενώ η συγκέντρωσή του υπολογίζεται από τον τύπο C = OD 260 Χ (αραίωση) x 40 µg/ml. Β. 10 Καλλιέργεια του εντόµου Ceratitis capitata Στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκε εργαστηριακός πληθυσµός του εντόµου Ceratitis capitata, ο οποίος διατηρείται στο εργαστήριο Βιολογίας από το 1973 και προέρχεται από το Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο. Ο συγκεκριµένος πληθυσµός θεωρείται ως φυσιολογικό ή «αγρίου» τύπου στέλεχος και διαθέτει τη φυσιολογική δοµή για όλα τα χρωµοσώµατά του (Zacharopoulou, 1990) Επίσης χρησιµοποιήθηκε το στέλεχος white (w) για τη δηµιουργία διαγονιδικών στελεχών. Η καλλιέργεια του εντόµου πραγµατοποιείται σε ειδικό θάλαµο σταθερής θερµοκρασίας 25 0 C, µε σχετική υγρασία 70% και 12ωρο φωτοπεριοδισµό. Ενήλικα άτοµα Τα στελέχη του εντόµου διατηρούνται µαζικά σε κλουβιά από πλαστικό, τα οποία στη µία τους πλευρά, που είναι στραµµένη προς το φως, φέρουν λεπτό συνθετικό ύφασµα (οργαντίνα), εύκολα διαπερατό από τον ωοαποθέτη των θηλυκών ατόµων. Η τροφή των ενηλίκων ατόµων αποτελείται από ζάχαρη και ξηρή µαγιά (Biolux Βελγίου) σε αναλογία 1:1, ενώ το απαραίτητο νερό το παίρνουν από σπογγώδες υλικό τύπου wettex που βρίσκεται είτε στην οροφή, είτε στο κάτω µέρος του κλουβιού και εµποτίζεται από ειδική παροχετευτική διάταξη. Συλλογή αυγών Τα θηλυκά άτοµα µιµούµενα τη συµπεριφορά των αγρίων στη φύση, όπου τρυπούν το φρούτο για να αφήσουν τα αυγά τους, διαπερνούν το συνθετικό ύφασµα του κλουβιού µε τον ωοαποθέτη τους και αφήνουν τα αυγά στην εξωτερική επιφάνεια. Από εκεί τα αυγά πέφτουν σε µικρό τρυβλίο petri µε νερό, ώστε να µην ξεραθούν. Τα αυγά συλλέγονται µε διήθηση του νερού σε συνθετικό ύφασµα και µεταφέρονται στην επιφάνεια ειδικής τροφής για καλλιέργεια προνυµφών, που βρίσκεται µέσα σε τρυβλίο petri, το καπάκι του οποίου είναι διάτρητο ώστε να αερίζονται οι προνύµφες. 42

45 Προνυµφικά στάδια Στα αεριζόµενα αυτά τρυβλία petri, πραγµατοποιείται τόσο η εµβρυογένεση, η οποία διαρκεί περίπου 48 ώρες, όσο και η ανάπτυξη των προνυµφών. Το θρεπτικό υλικό στο οποίο αναπτύσσονται τα προνυµφικά στάδια του εντόµου αποτελείται από: Νερό βρύσης 900 ml Μαγιά 60 gr Ζάχαρη 60 gr Χαρτοβάµβακας (κοµµένος σε µικρά τεµάχια) 60 gr ιάλυµα Α (5,3% χοληστερόλη σε 25% αιθανόλη) 20 ml ιάλυµα Β (14,5% HCl) 20 ml ιάλυµα Γ (11% βενζοϊκό νάτριο σε 71,2% αιθανόλη) 20 ml Τα παραπάνω συστατικά αναµιγνύονται σε οµογενοποιητή (Sorval), µέχρι να προκύψει ένας οµοιογενής πολτός, ο οποίος µπορεί να διατηρηθεί στους 4 0 C ως και 15 µέρες. Οι προνύµφες τρέφονται µε αυτό το µίγµα και αναπτύσσονται µε δύο διαδοχικές εκδύσεις. Το προνυµφικό στάδιο διαρκεί περίπου 6 µέρες σε θερµοκρασία 24±1 0 C. Νυµφικά στάδια Την έκτη µέρα της ανάπτυξής τους, οι προνύµφες εκτινάσσονται µε χαρακτηριστικό τρόπο (jumping) και εγκαταλείπουν το τρυβλίο petri µε την τροφή για να προσγειωθούν σε ένα λεπτό στρώµα άµµου που το περιβάλλει. Εκεί αρχίζει και ολοκληρώνεται η βοµβυκίωση των προνυµφών, µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό της νύµφης, η οποία από άσπρο χρώµα (white pupa) σταδιακά σκουραίνει µέχρι να αποκτήσει καφέ χρώµα. Το στάδιο αυτό διαρκεί 9-10 µέρες και µέσα σε αυτό το διάστηµα οι νύµφες συλλέγονται και τοποθετούνται µέσα σε τρυβλία petri µέχρι να πραγµατοποιηθεί η µεταµόρφωσή τους σε ενήλικα άτοµα. Μόλις τα ενήλικα εκκολαφθούν, συλλέγονται και τοποθετούνται σε καθαρά κλουβιά ώστε να διατηρηθεί η καλλιέργεια. 43

46 Β.11Γενετικός µετασχηµατισµός της µεσογειακής µύγας Ceratitis capitata και κατασκευή οµόζυγων διαγονιδιακών σειρών. Το πλασµιδιακό DNA που χρησιµοποιήθηκε για τις ενέσεις σε έµβρυα της C. capitata παρασκευάστηκε µε χρήση του συστήµατος αντιδραστηρίων MN Nucleospin Plasmid της εταιρίας MN-Macherey-Nagel όπως περιγράφεται σε προηγούµενη παράγραφο µε µία διαφοροποίηση. Μετά την έκλουση του πλασµιδίου από τη στήλη, ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 12000σ.α.λ. για 15 λεπτά, µε στόχο την αποµάκρυνση του υλικού της στήλης που µπορεί να έχει συµπαρασυρθεί µε το DNA. Στη συνέχεια, το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο (µετασχηµατισµού) και το βοηθητικό πλασµίδιο αναµιγνύονται και κατακρηµνίζονται µαζί παρουσία NaCl τελικής συγκέντρωσης 0,2Μ και δύο όγκων αιθανόλης στους -20 o C για ώρες. Το ίζηµα ξεπλένεται δύο φορές µε αιθανόλη 70%, αφήνεται να στεγνώσει καλά και επαναδιαλύεται στον επιθυµητό όγκο ρυθµιστικού διαλύµατος ενέσεων (συνήθως 10µl). Βασική παράµετροι για την επιτυχία του µετασχηµατισµού είναι η καθαρότητα του µίγµατος DNA που θα χρησιµοποιηθεί στις ενέσεις, καθώς και η χρήση ισοµοριακών ποσοτήτων του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου και του βοηθητικού πλασµιδίου. Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος ενέσεων που χρησιµοποιήθηκε ήταν: 1 mm Na-Phosphate ph=6,8 µε φωσφορικό οξύ 5 mm KCl, ιεξαγωγή ενέσεων στα έµβρυα της C. capitata και οµοζύγωση των διαγονιδιακών σειρών 1) Γεµίζουµε τη βελόνα µε το ενέσιµο µίγµα και την προσαρµόζουµε στη συσκευή. 2) Συλλέγονται έµβρυα 0-20 λεπτά µετά την ωοαπόθεση, σε νερό βρύσης. Η καλλιέργεια από την οποία συλλέγονται τα αυγά αποτελείται από νεαρά ενήλικα 4-10 ηµερών του στελέχους w, που έχει άσπρο χρώµα µατιών. Επίσης, η σχετική υγρασία στο θάλαµο καλλιεργειών πρέπει να κυµαίνεται από 60-75%. 3) Μετά τη συλλογή τους, τα έµβρυα ξεπλένονται για 2 λεπτά µε ddh 2 O και ακολουθεί αποχορίωση µε διάλυµα 0,25% NaOCl για 1 λεπτό και 15 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια τα έµβρυα ξεπλένονται καλά µε ddh 2 O για 5 λεπτά. Είναι ιδιαίτερα σηµαντικό να παραµένει λίγο χόριο κοντά στους πόλους των εµβρύων, αφού κάτι τέτοιο καθιστά πιο εύκολη την είσοδο της βελόνας κατά τη διάρκεια των ενέσεων. 4) Στη συνέχεια τα έµβρυα συλλέγονται και απλώνονται στην επιφάνεια τρυβλίου µε 1,5% άγαρ και εναποτίθενται στην άκρη καλυπτρίδας πάνω σε κολλητική ταινία διπλής όψεως. Σε κάθε καλυπτρίδα τοποθετούνται 100 έµβρυα µε τρόπο ώστε ο οπίσθιος πόλος τους να κατευθύνεται προς την άκρη της καλυπτρίδας. 44

47 5) Ακολούθως τα έµβρυα καλύπτονται µε λάδι κατάλληλο για βιολογικούς ιστούς (Halocarbon oil 700), επειδή περιέχει διαλυµένο οξυγόνο και έτσι επιτρέπει στα έµβρυα να αναπνέουν. 6) Η καλυπτρίδα τοποθετείται σε σταθερό υπόβαθρο και οι ενέσεις διεξάγονται σε µικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων, αφού εφαρµοστεί η επιθυµητή πίεση στο υδραυλικό σύστηµα ενέσεων. Οι ενέσεις γίνονται στην περιοχή του οπίσθιου πόλου όπου κατά τη διαφοροποίηση θα δηµιουργηθούν τα γαµετικά κύτταρα των ενηλίκων ατόµων. Η διεξαγωγή των ενέσεων πρέπει να ολοκληρώνεται 2 ώρες µετά την εναπόθεση των αυγών, ώστε τα έµβρυα να είναι ακόµα στο προβλαστοδερµικό στάδιο. 7) Μετά το τέλος των ενέσεων οι καλυπτρίδες µε τα έµβρυα τοποθετούνται µέσα σε τρυβλίο µε τροφή, και κρατούνται µέσα σε θάλαµο 25 0 C. 8) Γενιά G0: Τα ενήλικα που εκκολάπτονται µπαίνουν σε κλουβιά µαζικών διασταυρώσεων αφού πρώτα διαχωριστούν ανάλογα µε το φύλο τους. Συγκεκριµένα, αρσενικά διασταυρώνονται µε 20 τουλάχιστον παρθένα θηλυκά w, ενώ θηλυκά διασταυρώνονται µε 20 αρσενικά w. Από τις καλλιέργειες αυτές µαζεύονται αυγά καθηµερινά για µία περίπου δέκα µέρες. Οι νύµφες αυτής της γενιάς υποβάλλονται σε καθηµερινό θερµικό στρες στους 39 0 C για µία ώρα, ώστε να επαχθεί η έκφραση του γονιδίου Ccwhite που βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή της hsp70 µέσα στο µεταθέσιµο στοιχείο piggybac. 9) Γενιά G1: Τα ενήλικα που εκκολάπτονται εξετάζονται στο στερεοσκόπιο για το χρώµα των µατιών τους. Τα άτοµα που έχουν χρωµατιστά µάτια κρατούνται και διασταυρώνονται ατοµικά µε άτοµα w του αντίθετου φύλου. Κάθε αρσενικό άτοµο µε χρωµατιστά µάτια διασταυρώνεται µε 5 θηλυκά wy, ενώ κάθε θηλυκό µε χρωµατιστά µάτια διασταυρώνεται µε 3 αρσενικά wy. Από τις διασταυρώσεις αυτές συλλέγονται αυγά για περίπου 10 µέρες. Οι νύµφες υποβάλλονται και πάλι σε καθηµερινό θερµικό στρες στους 39 0 C για µία ώρα. 10) Γενιά G2: Τα ενήλικα που εκκολάπτονται από κάθε µία από τις παραπάνω διασταυρώσεις, ελέγχονται για το χρώµα των µατιών τους και εφόσον είναι ίδιος (στη γενιά αυτή όλα τα άτοµα µε έγχρωµα µάτια που προκύπτουν είναι ετερόζυγα) διασταυρώνονται µεταξύ τους µαζικά. Αυγά από τις διασταυρώσεις αυτές συλλέγονται 2-3 φορές ανάλογα µε την αποδοτικότητά τους και οι νύµφες υποβάλλονται και πάλι σε θερµικό στρες στις ίδιες συνθήκες. 11) Γενιά G3: Από τις παραπάνω διασταυρώσεις τα ενήλικα που έχουν το πιο σκούρο χρώµα µατιών επιλέγονται και διασταυρώνονται µεταξύ τους. Οι απόγονοι τις γενιάς G2 πρέπει να ακολουθούν την αναλογία 1wy : 2ετερόζυγα (ως προς την ένθεση) :1οµόζυγο (ως προς την ένθεση), εφόσον βέβαια η ένθεση δεν είναι σε οµοζυγωτία θανατογόνος ή φυλοσύνδετη. Και στη γενιά αυτή οι νύµφες υποβάλλονται σε καθηµερινό θερµικό στρες. 45

48 12) Γενιά G4: Αν δεν υπάρχουν έντοµα µε άσπρα µάτια και όλοι οι απόγονοι έχουν το ίδιο χρώµα µατιών, τότε γίνονται µαζικές διασταυρώσεις. 13) Αν δεν υπάρχουν έντοµα µε άσπρα µάτια, η διαγονιδιακή σειρά έχει οµοζυγωθεί και είναι έτοιµη για µελέτη. Β.12 Ανατοµία ενήλικων ατόµων C. capitata Υλικά/ ιαλύµατα Πορεία ιάλυµα Reagers: 130 mm NaCl 4,7 mm KCl 1,8 mm MgCl 2 0,74 mm KH 2 PO 4 0,35 mm Na 2 HPO 4 Λαβίδες ανατοµίας 1) Αναισθητοποιούµε το άτοµο που πρόκειται να κάνουµε ανατοµία, και το εµβαπτίζουµε στο διάλυµα Reagers, όπου θα γίνει η ανατοµία. 2) Με τη µία λαβίδα πιάνουµε το άτοµο από το εµπρόσθιο άκρο της κοιλιάς, και µε την άλλη λαβίδα το πιάνουµε από τον ωοαποθέτη αν πρόκειται για θηλυκό ή από την άκρη του εντέρου αν πρόκειται για αρσενικό. 3) Τραβάµε τον ωοαποθέτη ή το έντερο µε τέτοιο τρόπο ούτως ώστε να δηµιουργηθεί µία οπή µόνο στο οπίσθιο µέρος της κοιλιάς. 4) Πιάνουµε µόνο τη ραχιαία περιοχή της οπής µε τέτοιο τρόπο ούτως ώστε η µία αιχµηρή άκρη της λαβίδας να βρίσκεται εντός του σώµατος του ατόµου, ενώ η άλλη να βρίσκεται εκτός, και τραβάµε µε προσοχή το επιθήλιο. 5) Αφαιρούµε τις ωοθήκες (µεγάλα άσπρα κυλινδρικά σωµάτια) ή τις σπερµατοθήκες (µικρά κίτρινα ωοειδή σωµάτια) και τις ξεπλένουµε δύο φορές σε διάλυµα Reagers. 6) Τοποθετούµε τους ιστούς σε σωληνάριο eppedorf και καταψύχουµε σε υγρό άζωτο. Β.13 Μελέτη της ενεργότητας της λουσιφεράσης σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα Πορεία 1) Οµογενοποίηση 5 ενήλικων ατόµων ηλικίας τεσσάρων ηµερών ή 5 προνυµφών ηλικίας πέντε ηµερών ή 5mg εµβρύων ηλικίας 24 ωρών ή 20 ζευγαριών όρχεων από ενήλικα άτοµα ηλικίας τεσσάρων ηµερών ή 10 ζευγαριών ωοθηκών από ενήλικα άτοµα ίδια ηλικίας σε 500λ ρυθµιστικού διαλύµατος οµογενοποίησης: 20mM Tris/HCl ph=7,5, 0,5Μ NaCl, 50mΜ MgCl 2. Ο ιστός που χρησιµοποιήθηκε στην οµογενοποίηση ήταν κατεψυγµένος σε υγρό άζωτο. 2) Λύση των κυττάρων και καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων µε τη χρήση υπερήχων. (burst:15sec, break:15sec) επί τρεις φορές στα 8 microns. 46

49 3) Φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στους 4 ο C στις 16000rpm, κρατώντας στη συνέχεια το υπερκείµενο. 4) ιατήρηση του υπερκειµένου στους 4 ο C µέχρι την επόµενη µέρα όπου γίνεται η µέτρηση της ενεργότητας λουσιφεράσης. 5) Φόρτωση 10λ σε ειδικά πηγαδάκια, προσθέτουµε στη συνέχεια 50λ ρυθµιστικού διαλύµατος οµογενοποίησης που περιέχει 10µΜ υποστρώµατος της λουσιφεράσης µε την ονοµασία σελεντεραζίνη (coelenterizine), και µετράµε για 3 την εκποµπή φωτός σε λουµινόµετρο Mediators thl. Β.14 Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεϊνών Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στα εκχυλίσµατα προσδιορίζεται µε τη µέθοδο Bradford. Η µέθοδος αυτή βασίζεται στη δέσµευση της χρωστικής Coomasie Briliant Blue στα βασικά κυρίως αµινοξέα των πρωτεϊνών. Η δέσµευση είναι ανάλογη της ποσότητας της πρωτεΐνης και µετατοπίζει το µήκος κύµατος της µέγιστης απορρόφησης της χρωστικής από τα 470 nm στα 595 nm. Tο χρώµα του συµπλόκου πρωτεΐνης-χρωστικής είναι σταθερό για µια ώρα περίπου και έχει υψηλό µοριακό συντελεστή απορρόφησης που συνεπάγεται υψηλή ευαισθησία στις ποσοτικές µετρήσεις πρωτεϊνικών δειγµάτων. Με τη βοήθεια διαλυµάτων αλβουµίνης ορού βοός (BSA) γνωστών συγκεντρώσεων, κατασκευάζεται πρότυπη καµπύλη απ την οποία υπολογίζονται οι συγκεντρώσεις των εκχυλισµάτων σε πρωτεΐνη. Η οπτική πυκνότητα στα 590 nm µετράται σε φωτόµετρο. Υλικά/ ιαλύµατα -Αντιδραστήριο Bradford: 85% Φωσφορικό οξύ 10% κ.ο., 95% Αιθανόλη 5% κ.ο., 1 Ν ΝaOH 5% κ.ο., Coomasie Briliant Blue G 250 0,01% κ.β. Το αντιδραστήριο διηθείται από ηθµό µε χαρτί τύπου Whatmann No. 1 για να αποµακρυνθεί η αδιάλυτη χρωστική. -Πρότυπο διάλυµα BSA (1 mg/ ml). Πορεία Σε σωληνάρια eppendorf προστίθεται 1 ml αντιδραστηρίου Bradford και στη συνέχεια µια ποσότητα δείγµατος (µέχρι όγκου 100 µl) ή το πρότυπο διάλυµα BSA (8, 12, 16, 20 και 30 µg). Οι σωλήνες αναδεύονται έντονα και µετά από 2-5 λεπτά το περιεχόµενό τους µεταφέρεται σε πλαστικές κυψελίδες ώστε να µετρηθεί η οπτική απορρόφηση των δειγµάτων. Οι µετρήσεις γίνονται σε φασµατοφωτόµετρο σε µήκος κύµατος 595 nm, µηδενίζοντας την οπτική απορρόφηση που έχει ο 47

50 µάρτυρας. Ο µάρτυρας περιλαµβάνει το αντιδραστήριο Bradford µε την προσθήκη µόνο του ρυθµιστικού διαλύµατος στο οποίο έχει πραγµατοποιηθεί η εκχύλιση των πρωτεϊνών. Β.15 Αποµόνωση ολικού RNA χρησιµοποιώντας το διάλυµα Tripure Isolation Reagent (Roche) Το διάλυµα Tripure Isolation Reagent της Roche είναι ένα µονοφασικό διάλυµα το οποίο αποτελείται από φαινόλη και γουανιδική θειακυανίνη (guanidine thiocyanate). Μπορεί να χρησιµοποιηθεί για αποµόνωση RNA, DNA και πρωτεϊνών από το ίδιο δείγµα. Υλικά/ ιαλύµατα για αποµόνωση RNA - Συσκευή οµογενοποίησης - Χλωροφόρµιο - Ισοπροπανόλη - 75% αιθανόλη - DEPC H 2 O ελεύθερο RNAασών - Γάντια - Tripure Isolation Reagent της Roche - Αποστειρωµένα ακρωρύγχια και σωληνάρια ελεύθερα από RNAασες. Πορεία 1) έκα ενήλικα άτοµα κατεψυγµένα σε υγρό άζωτο ηλικίας τεσσάρων ηµερών οµογενοποιούνται σε 1ml Tripure Isolation Reagent της Roche. Η οµογενοποίηση πρέπει να είναι ισχυρή και πλήρης για να καταστραφεί το γενοµικό DNA. 2) Φυγοκεντρούµε στις 12000x g για 10 στους 4 o C και κρατάµε το υπερκείµενο. 3) Επωάζουµε σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 µε σκοπό την πλήρη αποδιάταξη των νουκλεοπρωτεϊνικών συµπλόκων 4) Προσθέτουµε 0,2ml χλωροφορµίου, αναδεύουµε έντονα για 15, και επωάζουµε για 15 σε θερµοκρασία δωµατίου. 5) Φυγοκεντρούµε στις 12000x g για 15 στους 4 o C για να δηµιουργηθούν τρεις φάσεις στο διάλυµα. Σηµαντικό είναι να µην ξεπεραστούν τα 12000x g σε αυτό το στάδιο. 6) Μεταφέρουµε την πάνω άχρωµη φάση σε καινούργιο σωληνάριο µε προσοχή να µην πάρουµε τις κάτω φάσεις που περιέχουν DNA. 7) Κατακρηµνίζουµε το RNA ακολουθώντας τα εξής βήµατα: 1. Προσθέτουµε 0,5ml ισοπροπανόλης 2. Αναποδογυρίζουµε 15 φορές το καλά κλεισµένο σωληνάριο 48

51 3. Επωάζουµε το δείγµα για 10 σε θερµοκρασία δωµατίου για να κατακρηµνιστεί το RNA. 4. Φυγοκεντρούµε το δείγµα στα 12000x g για 10 στους 4 o C και κρατάµε το ίζηµα 8) Προσθέτουµε στο ίζηµα 1ml 75% αιθανόλη και το αναδεύουµε ήπια 9) Φυγοκεντρούµε το δείγµα στα 7500x g για 5 στους 4 o C και αποµακρύνουµε το υπερκείµενο 10) Αποµακρύνουµε την περίσσεια αιθανόλης µε τη χρήση αντλίας κενού χωρίς φυγοκέντρηση για λίγα λεπτά ή στεγνώνοντας στον αέρα. Βασικό είναι να µην στεγνώσει πλήρως το ίζηµα ειδάλλως θα αναδιαλύεται δύσκολα στο H 2 O. 11) Αναδιαλύουµε το ίζηµα σε 200λ DEPC-H 2 O µε τη χρήση πιπέτας. 12) Επωάζουµε το δείγµα στους 55 o C για 7 για την πλήρη διάλυση του RNA στο υδατικό διάλυµα (προαιρετικό). 13) Το δείγµα φυγοκεντρείται για 5 λεπτά στους 4 o C στις 12000x g και το υπερκείµενο µεταφέρεται σε καθαρό σωληνάκι eppendorf και φυλάσσεται στους -80. Εναλλακτικά προστίθεται CH 3 COONa ph=5,2 σε τελική συγκέντρωση 0,3Μ και δύο όγκοι αιθανόλη, κι ύστερα το δείγµα φυλάσσεται στους -20 ο C. Β.16 Ηλεκτροφόρηση RNA σε πήκτωµα αγαρόζης Υλικά/ ιαλύµατα - ιάλυµα ηλεκτροφόρησης 0.5x TBE Για 1 l διαλύµατος 5x TBE: 54 g Tris 27.5 g βορικό οξύ, 20 ml 0.5 M EDTA ph = 8 DEPC-H 2 O ως 1 l - ιάλυµα δειγµάτων 2Χ: 4ml 5X TBE 1,3gr φικόλη 0,01gr κυανό της βροµοφαινόλης 4,2gr ουρία DEPC-H 2 O ως 10ml Αποθήκευση σε µέρη των 0,5ml στους -20 o C - Αποστειρωµένοι ογκοµετρικοί και κωνικές ελεύθερες RNAασων Πορεία Σε 100 ml διαλύµατος ηλεκτροφόρησης διαλύεται 1g αγαρόζης µε θέρµανση στους 95 0 C. Στη συνέχεια προστίθεται βρωµιούχο αιθίδιο σε τελική συγκέντρωση 1 µg/ml και το διάλυµα στερεοποιείται σε υποδοχέα-µήτρα διαστάσεων 14x11cm, ο οποίος έχει προηγουµένως πλυθεί. Στα 49

52 δείγµατα του RNA προστίθεται διάλυµα δειγµάτων σε τελική συγκέντωση 1Χ και αναλύονται σε οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης η οποία έχει προηγουµένως πλυθεί, υπό σταθερή τάση 60V για 1 ώρα. Β.17 Κατεργασία ολικών RNA δειγµάτων µε DNAase I Κατά τη διάρκεια της αποµόνωσης του RNA µπορεί να µείνουν στα δείγµατα ίχνη χρωµοσωµατικού DNA, τα οποία ακόµα και σε πολύ µικρή ποσότητα µπορούν να επηρεάσουν το αποτέλεσµα της αντίδρασης RT-PCR. Για το λόγο αυτό, πριν από τις αντιδράσεις RT-PCR όλα τα δείγµατα RNA υποβλήθηκαν σε κατεργασία µε DNase I. Προκειµένου να διασφαλιστεί η ακεραιότητα του RNA χρησιµοποιήθηκε RNase-free DNase και συγκεκριµένα το πλήρες σύστηµα αντιδραστηρίων RQ1 RNase-free DNase I της εταιρίας Promega (#M6101). Επίσης για την αποµάκρυνση της DNAase I καθώς και των αλάτων της ακολουθήθηκε αποµόνωση µε φαινόλη/χλωροφόρµιο και κατακρήµνιση µε αιθανόλη. Υλικά/ ιαλύµατα - Πλήρες σύστηµα αντιδραστηρίων RQ1 RNase-free DNase I της εταιρίας Promega (#M6101) - Ρυθµιστικό διάλυµα ΤΕ - Εξισορροπηµένη φαινόλη - Χλωροφόρµιο : ισοαµυλική αλκοόλη (24:1) - 3Μ CH 3 COONa ph=5,2-75% αιθανόλη - Γάντια - Αποστειρωµένα ακρωρύγχια και σωληνάρια ελεύθερα από RNAασες. Πορεία 1) Σε ένα σωληνάριο 1,5ml τοποθετούνται: 10µg RNA ως τα 80λ 10Χ ρυθµιστικό διάλυµα 10λ RQ1 RNase-free DNase I 10λ (10 units) 2) Το παραπάνω δείγµα επωάζεται στους 37 ο C για 30 3) Ακολουθεί προσθήκη 1 µl διαλύµατος RQ1 DNase Stop solution για να σταµατήσει η αντίδραση. 4) Τέλος για να απενεργοποιηθεί η DNase I το δείγµα θερµαίνεται στους 65 0 C για 10 50

53 5) Φέρνουµε τον όγκο του δείγµατος στα 200λ µε ρυθµιστικό διάλυµα ΤΕ 6) Προσθέτουµε 200λ φαινόλη/χλωροφόρµιο : ισοαµυλική αλκοόλη, αναδεύουµε σε vortex για 30 και επωάζουµε σε θερµοκρασία δωµατίου για 3 7) Φυγοκεντρούµε στα 12000x g για 10 στους 4 ο C και µεταφέρουµε 150λ της υδατικής φάσης σε καθαρό σωληνάριο 8) Προσθέτουµε 150λ χλωροφόρµιο : ισοαµυλική αλκοόλη αναδεύουµε σε vortex για 30 και επωάζουµε σε θερµοκρασία δωµατίου για 1 9) Φυγοκεντρούµε στα 12000x g για 10 στους 4 ο C και µεταφέρουµε 150λ της υδατικής φάσης σε καθαρό σωληνάριο 10) Προσθέτουµε CH 3 COONa ph=5,2 σε τελική συγκέντρωση 0,3Μ και δύο όγκους αιθανόλη. Επωάζουµε για ώρες στους -80 ο C 11) Φυγοκεντρούµε στα 12000x g για 10 στους 4 ο C και πετάµε το υπερκείµενο 12) Προσθέτουµε 500λ 75% αιθανόλη και αναδεύουµε ήπια 13) Φυγοκεντρούµε στα 12000x g για 10 στους 4 ο C και πετάµε το υπερκείµενο 14) Προσθέτουµε 500λ 75% αιθανόλη και αναδεύουµε ήπια 15) Φυγοκεντρούµε στα 12000x g για 10 στους 4 ο C και πετάµε το υπερκείµενο 16) Αποµακρύνουµε τα υπολείµµατα αιθανόλης µε τη χρήση αντλίας κενού και αναδιαλύουµε το ίζηµα σε 50λ DEPC- H 2 O 17) Το δείγµα φυγοκεντρείται για 5 λεπτά στους 4 o C στις 12000x g και το υπερκείµενο µεταφέρεται σε καθαρό σωληνάκι eppendorf και φυλάσσεται στους -80. Εναλλακτικά προστίθεται CH 3 COONa ph=5,2 σε τελική συγκέντρωση 0,3Μ και δύο όγκοι αιθανόλη, κι ύστερα το δείγµα φυλάσσεται στους -20 ο C Β.18 RT-PCR µε το πλήρες σύστηµα αντιδραστηρίων OneStep RT-PCR (Qiagen) Το πλήρες σύστηµα αντιδραστηρίων αυτό παρέχει ένα µίγµα ενζύµων το οποίο περιλαµβάνει δύο αντίστροφες µεταγραφάσες και µία DNA πολυµεράση. Οι αντίστροφες µεταγραφάσες Omniscript και Sensiscript είναι σχεδιασµένες για αντίστροφη µεταγραφή ποσοτήτων RNA µεγαλύτερων από 50 ng και µικρότερων από 50 ng, αντίστοιχα. Μ αυτόν το συνδυασµό, επιτυγχάνεται η αντίστροφη µεταγραφή ποσοτήτων RNA από 1 pg έως 2 µg. Το µίγµα των ενζύµων περιέχει την HotStarTaq DNA πολυµεράση η οποία κατά τη διαδικασία της αντίστροφης µεταγραφής είναι ανενεργή. Μετά το τέλος της αντίστροφης µεταγραφής οι αντιδράσεις θερµαίνονται στους 95 ο C για 15 λεπτά ώστε να ενεργοποιηθεί η DNA πολυµεράση και ταυτόχρονα να απενεργοποιηθούν οι αντίστροφες µεταγραφάσες. 51

54 Πορεία Σε ένα σωληνάριο 0.2 ml µεταφέρονται: QIAGEN OneStep 5X ρυθµιστικό διάλυµα αντίδρασης 10 µl dntp µίγµα (10 mm κάθε dntp) 2 µl εκκινητής 1 (0,6µM) εκκινητής 2 (0,6µM) Μίγµα ενζύµων 1 µl RNA ** Y µl (**Χρησιµοποιούνται 1 pg-2 µg ολικό RNA) H 2 O ελεύθερο από νουκλεάσες µέχρι τα 25µl Σύνθεση πρώτου cdna κλώνου 1 κύκλος 50 0 C για 30 αντίστροφη µεταγραφή 1 κύκλος 95 0 C για 15 ενεργοποίηση της HotStarTaq πολυµεράσης-απενεργοποίηση των ενζύµων Omniscript και Sensiscript Σύνθεση δεύτερου cdna κλώνου και PCR 30 κύκλοι 94 0 C για 30 αποδιάταξη C* για 1 πρόσδεση των εκκινητών στο DNA 72 0 C για 1 πολυµερισµός 1 κύκλος 72 0 C για 10 ολοκλήρωση του πολυµερισµού Hsp83 58 o C Hsp70 60 o C Hsp23 56 o C Hsp27 58 o C 18S 56 o C Luc 56 o C *Θερµοκρασίες στις οποίες προσδένονται οι εκκινήτες των εκάστοτε γονιδίων Β.19 q-rt-pcr µε το πλήρες σύστηµα αντιδραστηρίων KAPA SYBR FAST One-Step qrt- PCR Kit Το πλήρες σύστηµα αντιδραστηρίων της KAPA είναι µία ευαίσθητη µέθοδος για real-time PCR χρησιµοποιώντας ως υπόστρωµα RNA. Αποτελείται από δύο βασικά διαλύµατα: το KAPA SYBR FAST Master Mix (2x) και το KAPA RT Mix (50x). Tο KAPA SYBR FAST Master Mix (2x) αποτελείται από µια καινούργια DNA πολυµεράση η οποία κατασκευάστηκε µέσω µοριακών 52

55 τροποποιήσεων, και βελτιστοποιήθηκε για πειράµατα qpcr χρησιµοποιώντας ως φθορίζουσα χρωστική την SYBR Green I. Η φθορίζουσα χρωστική SYBR Green I περιέχεται στο διάλυµα KAPA SYBR FAST Master Mix (2x). Το KAPA RT Mix (50x) περιέχει την αντίστροφη µεταγραφάση M-MuLV και RNAase αναστολέα και βελτιστοποιήθηκε για ενός βήµατος (one-step) ποσοτικοποίηση RNA. Πορεία Σε τριχοειδή των 50µl µεταφέρονται: KAPA SYBR FAST Master Mix (2x) 10µl Εκκινητής 1 (10µΜ) 0,4µl Εκκινητής 2 (10µΜ) 0,4µl BSA (1mg/µl) 5µl RNA ** Y µl (**Χρησιµοποιούνται 1 pg-100ng ολικό RNA) KAPA RT Mix (50x) 0,2µl MilliQ H 2 O µέχρι τα 20µl Η παρασκευή της αντίδρασης γίνεται στους 4 ο C σε ειδική θήκη για τριχοειδή που διατηρείται στην απλή ψύξη. Μετά την ανάµειξη των διαλυµάτων ακολουθεί φυγοκέντρηση των τριχοειδών για 5 δευτερόλεπτα στις 700 rpm. Στο πείραµα συµπεριλαµβάνεται ένα RT- και ένα RNA- δείγµα, για τον εντοπισµό τυχόν DNA µολύνσεων και για τον εντοπισµό τυχόν διµερή των εκκινητών αντίστοιχα. Οι εκκινητές πρέπει να είναι σχεδιασµένοι µε τέτοιο τρόπο ούτως ώστε να παράγεται προϊόν bp, και να υβριδοποιούνται σε διαφορετικά εξώνια µε σκοπό την ελαχιστοποίηση της DNA επιµόλυνσης. Πρωτόκολλο Σύνθεση cdna :(1 κύκλος) 42 ο C για 5 λεπτά Απενεργοποίηση του RT ενζύµου :(1 κύκλος) 95 ο C για 5 λεπτά Ποσοτικοποίηση: (45 κύκλοι) 95 ο C για 3 δευτερόλεπτα 60 ο C * για 20 δευτερόλεπτα 72 ο C για 2 δευτερόλεπτα και µία µέτρηση φθορισµού Αποδιάταξη: (1 κύκλος) 65 ο C για 15 δευτερόλεπτα 53

56 95 ο C για 1 δευτερόλεπτο. Η αύξηση σε αυτή τη θερµοκρασία γίνεται µε αργό ρυθµό (ramp rate:0,1) και το µηχάνηµα µετρά το φθορισµό συνεχόµενα. Κρύωµα: (1 κύκλος) 40 ο C για 30 δευτερόλεπτα Η αντίδραση της q-rt-pcr έγινε στο µηχάνηµα της Roche LightCycler 1.5 Hsp83 Hsp70 60 ο C 54 ο C 18S 60 ο C *Θερµοκρασίες στις οποίες προσδένονται οι εκκινήτες των εκάστοτε γονιδίων 54

57 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 55

58 Γ1. Λειτουργική ανάλυση της 5 περιοχής του Cchsp83 γονιδίου σε γενετικά µετασχηµατισµένα Cchsp83P-Luc στελέχη της Μεσογειακής µύγας Όπως αναφέρθηκε στην Εισαγωγή ο πρώτος στόχος της παρούσας διπλωµατικής εργασίας ήταν η λειτουργική ανάλυση της 5 ανοδικής περιοχής του γονιδίου hsp83 της Μεσογειακής µύγας. Για το σκοπό αυτό δηµιουργήθηκαν γενετικά µετασχηµατισµένα στελέχη της Μεσογειακής µύγας που έφεραν το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης Metridia longa υπό τον έλεγχο επικαλυπτόµενων αλληλουχιών της 5 ανοδικής περιοχής του γονιδίου Cchsp83 του εντόµου. Γ1.1. Κατασκευή ανασυνδυασµένων φορέων γενετικού µετασχηµατισµού pbac-cchsp83p-luc Στην Εικόνα Γ1Α παρουσιάζεται διαγραµµατικά το γονίδιο Cchsp83 για τη δηµιουργία των µετασχηµατισµένων στελεχών, κατασκευάστηκαν 5 ανασυνδιασµένα πλασµίδια τα οποία περιέχουν το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο αλληλουχιών της 5 ανοδικής περιοχής του γονιδίου Cchsp83 της Μεσογειακής µύγας (83P(1-5)-Luc), όπως συνοψίζεται διαγραµµατικά στην Εικόνα Γ1B. Εικόνα Γ1: (Α) Γραφική απεικόνιση του γονιδίου hsp83 της Μεσογειακής µύγας. Με µπλε συµβολίζεται η 5 περιοχή του γονιδίου, µε ροζ η κωδική περιοχή του γονιδίου και µε κόκκινα ωοειδή τα δυνητικά στοιχεία απόκρισης στη θερµότητα ενώ παράλληλα φαίνονται οι διάφορες θέσεις περιορισµού, το κουτί ΤΑΤΑ και τα σηµεία έναρξης της µεταγραφής και της µετάφρασης. (Β) Οι πέντε πλασµιδιακές κατασκεύές 83P(1-5)-Luc. (C) Ο φορέας µετασχηµατισµού piggybac. Στα άκρα του φέρει τα στοιχεία εκείνα που είναι αναγκαία για την ένθεση του στο γονιδίωµα του ξενιστή. Αµέσως µετά τα άκρα υπάρχουν µονωτές (SCS, SCS ) οι οποίοι προστατεύουν το 56

59 διαγονίδιο από επιδράσεις εξωτερικών ρυθµιστικών στοιχείων του γονιδιώνµατος του ξενιστή. Ccw: το γονίδιο white της Μεσογειακής µύγας. P και Τ: ο υποκινητής και ο τερµατιστής του γονιδίου της Drosophila melanogaster. Αρχικά κατασκευάστηκε το πλασµίδιο PHSS6-Luc. Για το σκοπό αυτό, η κωδική περιοχή του γονιδίου της λουσιφεράσης (Luc) ακολουθούµενη από τον τερµατική αλληλουχία του ιού SV40, αποµονώθηκε από το πλασµίδιο pmetluc της εταιρίας STRATAGENE και κλωνοποιήθηκε στο πλασµίδιο PHSS6 (Seifert et al., 1986) το οποίο φέρει στα άκρα του πολυσυνδέτη του δύο θέσεις για το περιοριστικό ένζυµο NotI. Ακολούθως χρησιµοποιώντας κατάλληλα σχεδιασµένους εκκινητές, αποµονώθηκαν τα τµήµατα που αντιστοιχούν στα 83P1-Luc και 83P2-Luc (Εικόνα Γ1Β). Για την κατασκευή του πλασµιδίου 83-P5-Luc, το τµήµα SpeI/HindII (~3 Kb) εντέθηκε στο πλασµίδιο 83P2-Luc, ανοδικά του τµήµατος 83P2. Με ελλείµµατα στο πλασµίδιο 83P5-Luc κατασκευάστηκαν και τα πλασµίδια 83P4-Luc και 83P3-Luc. Τέλος, τα διαγονίδια 83P(1-5)-Luc κλωνοποιήθηκαν στη µοναδική θέση NotI του φορέα γενετικού µετασχηµατισµού piggybac (pbac), σαν NotI κασέτες (Εικόνα Γ1C). Ο φορέας αυτός φέρει τους µονωτές (insulators) SCS και SCS για την ελαχιστοποίηση του επηρεασµού των διαγονιδίων από γειτονικές αλληλουχίες του γονιδιώµατος των µετασχηµατισµένων εντόµων (Sarkar et al., 2006). Ο αρχικός φορέας pbac τροποποιήθηκε αντικαθιστώντας το γονίδιο επιλογής DsRed µε το γονίδιο white της Μεσογειακής µύγας (Zwiebel et al., 1995). Εικόνα Γ2: ιαγνωστικές πέψεις των φορέων µετασχηµατισµού pbac83(p1-p5)-luc µε ένζυµα περιορισµού για τον προσδιορισµό της κατεύθυνσης του διαγονιδίου. O φορέας pbac83p1(p1) κόπηκε µε το ένζυµο BamHI απ όπου προέκυψαν οι αναµενόµενες ζώνες που δείχνουν ότι το διαγονίδιο έχει την ίδια φορά µε το w. Οι υπόλοιποι φορείς κόπηκαν µε SmaI. Τα αποτελέσµατα δείχνουν ότι στους φορείς pbac83(p2-p5)-luc (P2-P5) τα διαγονίδια έχουν την ίδια φορά µε το w ενώ στους P2I, P3I και P5I τα διαγονίδια έχουν αντίθετη φορά. 57

60 Στην Εικόνα Γ2 παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα από την πέψη των ανασυνδυασµένων φορέων pbac83p(1-5)-luc µε ένζυµα περιορισµού για να προσδιοριστεί η κατεύθυνση των διαγονιδίων. Στους φορείς pbac83p(1-5)-luc (P1-P5) τα διαγονίδια έχουν την ίδια φορά µε το w ενώ στους P2I, P3I και P5I τα διαγονίδια έχουν αντίθετη φορά. Γ1.2. Γενετικός µετασχηµατισµός της µεσογειακής µύγας µε τους ανασυνδυασµένους φορείς pbac-hsp83p-luc Από τις πέντε κατασκευές, τρεις (pbac-hsp83p1-, P3- και P5-Luc) χρησιµοποιήθηκαν για το γενετικό µετασχηµατισµό. Στο εξής οι παραπάνω κατασκευές και τα αντίστοιχα µετασχηµατισµένα στελέχη θα αναφέρονται ως P1, P3 και P5. Για τη δηµιουργία των µετασχηµατισµένων διαγονιδιακών στελεχών Μεσογειακής µύγας χρησιµοποιήθηκαν έµβρυα 2 ωρών του στελέχους white, το οποίο έχει λευκό χρώµα µατιών. Τα έµβρυα συλλέχθηκαν από ενήλικα άτοµα white ηλικίας 4 10 ηµερών, υπέστησαν αποχοριοποίηση για 1:15 λεπτά µε 0,25% διάλυµα NaOCl, στρώθηκαν σε καλυπτρίδες µε ταινία διπλής όψεως και επικαλύφθηκαν µε λάδι halocarbon700. Ακολούθησε ένεση των εµβρύων 2 ωρών, των εµβρύων δηλαδή που βρίσκονταν σε προβλαστοδερµικό στάδιο. Η ένεση έγινε στον οπίσθιο πόλο κάθε εµβρύου µε DNA από κάθε φορέα µετασχηµατισµού και ένα βοηθητικό πλασµίδιο που έφερε το γονίδιο της τρανσποζάσης. Η αναλογία που χρησιµοποιήθηκε ήταν 125 ng/µl για το βοηθητικό πλασµίδιο και 250 ng/µl για κάθε φορέα µετασχηµατισµού. Για το P1 έγιναν ενέσεις σε 1610 έµβρυα εκ των οποίων 182 ενήλικα άτοµα εκκολάφθηκαν (ποσοστό βιωσιµότητας 11,3%). Για το P3 έγιναν ενέσεις σε 1505 έµβρυα white εκ των οποίων µόλις 45 ενήλικα άτοµα εκκολάφθηκαν (ποσοστό βιωσιµότητας 2,9%), ενώ για το P5 έγιναν ενέσεις σε 1654 έµβρυα εκ των οποίων εκκολάφθηκαν 275 ενήλικα άτοµα (ποσοστό βιωσιµότητας 16,6%). Τα ενήλικα άτοµα (G0) διασταυρώθηκαν στη συνέχεια µε ενήλικα άτοµα white κι έτσι προέκυψαν άτοµα µε χρώµα µατιών στις αποχρώσεις του κόκκινου. Συγκεκριµένα για το P1 εκκολάφθηκαν πέντε άτοµα µε κόκκινο χρώµα µατιών από τα οποία προέκυψε ένα οµόζυγο στέλεχος ύστερα από διαδοχικές διασταυρώσεις όπως περιγράφεται στα Υλικά κα Μέθοδοι. Για το P3 εκκολάφθηκαν δύο άτοµα µε κόκκινο χρώµα µατιών από διαφορετικές διασταυρώσεις, από τα οποία προέκυψαν δύο οµόζυγα στελέχη, ενώ για το P5 εκκολάφθηκε ένα άτοµο µε κόκκινο χρώµα µατιών. Αν και έγιναν επανειληµµένες διασταυρώσεις δεν έγινε δυνατή η οµοζύγωσή του γεγονός που υποδηλώνει πως ή ένθεση έχει επηρεάσει την έκφραση κάποιου γονιδίου που είναι ζωτικής σηµασίας για το έντοµο. Στην εικόνα Γ3 παρουσιάζεται το στέλεχος αυτό σε ετερόζυγη κατάσταση. 58

61 Εικόνα Γ3: Μετασχηµατισµένο στέλεχος της Μεσογειακής µύγας. Αριστερά απεικονίζεται το στέλεχος white, στη µέση φαίνεται το στέλεχος P5 ενώ στα δεξιά φαίνεται ένα στέλεχος αγρίου τύπου. Γ1.3. Μελέτη της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς στα µετασχηµατισµένα στελέχη. Η ενεργότητα της λουσιφεράσης στα µετασχηµατισµένα στελέχη µετρήθηκε σε λουµινόµετρο όπως αναφέρεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Σε προκαταρτικά πειράµατα δοκιµάστηκαν διαφορετικά ρυθµιστικά διαλύµατα για την παρασκευή των πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων. Από τα πειράµατα αυτά φάνηκε ότι η παρουσία 0,5 M NaCl και 50 mm MgCl 2 δίνουν τις µέγιστες τιµές στο λουσιφερόµετρο. Έτσι το τελικό διάλυµα που χρησιµοποιήθηκε για την εκχύληση των πρωτεϊνών ήταν 20 mm Tris-HCl, ph=7,5, 0,5 M NaCl, 50 mm MgCl 2. Η ενεργότητα της λουσιφεράσης µετρήθηκε σε ενήλικα αρσενικά και θηλυκά 4 ηµερών, σε προνύµφες 5 ηµερών, και σε έµβρυα 24 ωρών (µέσο της εµβρυογένεσης) τόσο σε κανονικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες θερµικού στρες (1 ώρα στρες στους 39 o C ακολουθούµενο από 2 h ανάρωση στους 25 o C). Επίσης, η ενεργότητα της λουσιφεράσης µετρήθηκε σε ωοθήκες και όρχεις από ενήλικα άτοµα 4 ηµερών. Κάθε δείγµα µετρήθηκε δύο φορές και έγιναν 3 επαναληπτικά πειράµατα για κάθε στέλεχος. Τα αποτελέσµατα από τα ενήλικα άτοµα παρουσιάζονται στην Εικόνα Γ4A. Τα P1 και P3 στελέχη δεν έδωσαν αξιοσηµείωτα επίπεδα λουσιφεράσης και στα δύο φύλα τόσο σε κανονικές συνθήκες όσο και συνθήκες θερµικού στρες. Ο υποκινητής του P1 εκτείνεται έως το -53 και περιλαµβάνει την αλληλουχία ΤΑΤΑ ενώ ο υποκινητής του P3 εκτίνεται έως το -378 και περιλαµβάνει 2 δυνητικά στοιχεία απόκρισης στη θερµοκρασία. Ο υποκινητής του P5 που εκτείνεται έως το έδειξε σηµαντικά επίπεδα λουσιφεράσης στα θηλυκά άτοµα σε κανονικές συνθήκες. Τα επίπεδα αυτά περίπου τριπλασιάστηκαν σε συνθήκες θερµικού στρες. Αντίθετα στα αρσενικά άτοµα τα επίπεδα της λουσιφεράσης ήταν αµελητέα σε κανονικές συνθήκες και είχαν µια µικρή αύξηση µετά από θερµικό στρες. Τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώθηκαν και µε RT-PCR χρησιµοποιώντας ένα ζεύγος ολιγονουκλεοτιδίων από το γονίδιο της λουσιφεράσης (Εικόνα Γ4Β). 59

62 Εικόνα Γ4: Μετρήσεις λουσιφεράσης σε ενήλικα άτοµα ηλικίας 4 ηµερών. (A) Με αστερίσκο δείχνονται οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές των δειγµάτων σε σχέση µε τα θηλυκά άτοµα του στελέχους P5 που έχουν υποστεί θερµικό στρες. Το θερµικό στρες συνίσταται από την επώαση των ενήλικων ατόµων κατάλληλης ηλικίας στους 39 ο C µε νερό και τροφή για µία ώρα και ανάκαµψη για δύο ώρες στους 25 ο C στις ίδιες συνθήκες. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται σε µονάδες λουσιφεράσης/mg ολικής πρωτεΐνης. (Β) RT-PCR σε ολικό RNA του στελέχους P5 για τον εντοπισµό µεταγράφων του γονιδίου της λουσιφεράσης. Το 18S χρησιµοποιήθηκε για να δειχθεί το ισοφόρτωµα στις αντιδράσεις. Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι η περιοχή -378/+139 του γονιδίου Cchsp83 που περιλαµβάνει τα δύο πρώτα στοιχεία απόκρισης στη θερµότητα δεν αρκεί ούτε για την κανονική ούτε για την θερµοεπαγόµενη έκφραση του Cchsp83. Αντίθετα η περιοχή -3536/+139 που περιλαµβάνει και τα επτά στοιχεία απόκρισης στη θερµότητα είναι αρκετή τόσο για τα βασικά όσο και για τα θερµοεπαγόµενα επίπεδα στα θηλυκά άτοµα. Το γεγονός ότι δεν παρατηρείται σηµαντική έκφραση στα αρσενικά άτοµα πιθανόν να οφείλεται στο ότι το γονίδιο Cchsp83 εκφράζεται πολύ στις ωοθήκες. Για να δούµε αν αυτό είναι σωστό, µετρήθηκαν τα επίπεδα της λουσιφεράσης σε ωοθήκες και όρχεις του στελέχους P5. Όπως φαίνεται στην Eικόνα Γ5, οι ωοθήκες έδωσαν υψηλά επίπεδα λουσιφεράσης (διπλάσια από τα ενήλικα θηλυκά) ενώ τα επίπεδα λουσιφεράσης στους όρχεις ήταν αµελητέα. 60

63 Εικόνα Γ5: Μετρήσεις λουσιφεράσης σε όρχεις και ωοθήκες του στελέχους P5. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται σε µονάδες λουσιφεράσης/mg ολικής πρωτεΐνης Τα επίπεδα της λουσιφεράσης και στα τρία στελέχη µετρήθηκαν και σε προνύµφες 5 ηµερών και σε έµβρυα 24 ωρών. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στην Εικόνα Γ6. Τα αποτελέσµατα για τις προνύµφες ήταν παρόµοια µε εκείνα των ενήλικων θηλυκών. Μόνο το στέλεχος P5 έδωσε υψηλά επίπεδα λουσιφεράσης, πολύ µικρότερα όµως από εκείνα των ενήλικων θηλυκών. Στα έµβρυα τα επίπεδα της λουσιφεράσης υπό κανονικές συνθήκες βρέθηκαν παρόµοια µε εκείνα των ενηλίκων θηλυκών. Μόνο το στέλεχος P5 έδωσε υψηλά επίπεδα λουσιφεράσης. Σε συνθήκες θερµικού στρες δεν υπήρξε επαγωγή. Αυτό οφείλεται στην αδυναµία των πρώιµων εµβρύων να επάγουν τα θερµοεπαγόµενα γονίδια (βλέπε Συζήτηση). Τα µικρά επίπεδα στο στέλεχος P3A πιθανόν να οφείλονται σε πειραµατικό λάθος. Εικόνα Γ6: Μετρήσεις λουσιφεράσης σε προνύµφες ηλικίας πέντε ηµερών (Α) και έµβρυα ηλικίας 24 ωρών (Β). Τα αποτελέσµατα εκφράζονται σε µονάδες λουσιφεράσης/mg ολικής πρωτεΐνης Γ2. Βιωσιµότητα και έκφραση του γονιδίου Cchsp83 σε συνθήκες ψυχρού στρες εύτερος στόχος της παρούσας διπλωµατικής εργασίας ήταν η µελέτη της έκφρασης του γονιδίου hsp83 της Μεσογειακής µύγας και της βιωσιµότητας του εντόµου κάτω από συνθήκες 61

64 ψυχρού στρες. Για σύγκριση εξετάστηκε και το γονίδιο hsp70 που είναι το πλέον θερµοεπαγόµενο γονίδιο. Γ2.1. Έλεγχος της βιωσιµότητας σε συνθήκες ψυχρού στρες. Αρσενικά ενήλικα άτοµα ηλικίας τεσσάρων ηµερών επωάστηκαν για συγκεκριµένο χρονικό διάστηµα στους 0 ο C. Συνολικά επωάστηκαν 30 αρσενικά ενήλικα άτοµα για 2, 4, 6, 9, 12 και 24 ώρες στους 0 ο C και ακολούθως έµειναν δύο ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου να αναρρώσουν. Τα αποτελέσµατα από τρία ανεξάρτητα πειράµατα έδειξε 100% βιωσιµότητα σε σχέση µε τους µάρτυρες. Αυτό όµως που παρατηρήθηκε ήταν ότι κάποια άτοµα είχαν µειωµένη κινητικότητα, την οποία ανακτούσαν ύστερα από λίγη ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Γ2.2. Επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου Cchsp83 από το ψυχρού στρες. Η µελέτη της έκφρασης του γονιδίου Cchsp83 έγινε µε RT-PCR και qrt-pcr. Για το σκοπό αυτό δέκα ενήλικα αρσενικά ηλικίας 4 ηµερών εκτέθηκαν για διάφορα χρονικά διαστήµατα (2-24 ώρες) στους 0 ο C και ακολούθως αφέθηκαν να ανακάµψουν για 2 ώρες στους 25 ο C. Η ανάκαµψη των 2 ωρών επιλέχθηκε από προκαταρτικά πειράµατα δεδοµένου ότι έδινε τα µεγαλύτερα επίπεδα επαγωγής. Μετά την ανάρρωση στους 25 ο C, αποµονώθηκε ολικό RNA το οποίο επωάστηκε µε RNase-Free DNase (Promega) για την αποµάκρυνση του DNA. Σαν αρνητικός µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε RNA από άτοµα που δεν εκτέθηκαν σε στρες και σαν θετικός µάρτυρας άτοµα που εκτέθηκαν σε θερµικό στρες (39 ο C για 1 ώρα). Τα αποτελέσµατα από την RT-PCR παρουσιάζονται στην Εικόνα Γ7. Το hsp83 φαίνεται να παρουσιάζει αύξηση από τις 2 ώρες ψυχρού στρες σε σχέση µε το αρνητικό µάρτυρα ενώ το hsp70 αυξάνεται µετά από 4 ώρες ψυχρού στρες. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων έγινε µε qrt-pcr (Εικόνα Γ8). Τα αποτελέσµατα αντιστοιχούν σε τρία διαφορετικά πειράµατα. Σαν µάρτυρας οµαλοποίησης των τυχόν διαφορών στη ποσότητα του RNA στις αντιδράσεις χρησιµοποιήθηκε το 18S RNA της Μεσογειακής µύγας. Το θερµικό στρες έδωσε τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης και για τα δύο γονίδια. Η έκφραση του hsp83 αρχίζει να εµφανίζει αύξηση από τις 2 ώρες ψυχρού στρες και συνεχίζει να αυξάνεται έως τις 12 ώρες. Η έκφραση του hsp70 αρχίζει να αυξάνετε στις 4 ώρες ψυχρού στρες και φτάνει µέγιστα επίπεδα µετά τις 12 ώρες. Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι και τα δύο γονίδια επάγονται ισχυρά από το ψυχρό στρες µε διαφορετική όµως κινητική. 62

65 Εικόνα Γ7: Έκφραση των γονιδίων hsp83 και hsp70 της Μεσογειακής µύγας σε συνθήκες ψυχρού στρες. Ολικό RNA από αρσενικά άτοµα 4 ηµερών που υποβλήθηκαν σε διαφορετικούς χρόνους σε ψυχρό στρες υποβλήθηκαν σε RT-PCR Σαν µάρτυρας ίσης ποσότητας RNA στις αντιδράσεις χρησιµοποιήθηκε το 18S RNA της Μεσογειακής µύγας. Εικόνα Γ8: Έκφραση των γονιδίων hsp83 και hsp70 της Μεσογειακής µύγας σε συνθήκες ψυχρού στρες. Ολικό RNA από αρσενικά άτοµα 4 ηµερών που υποβλήθηκαν σε διαφορετικούς χρόνους σε ψυχρό στρες υποβλήθηκαν σε qrt-pcr Σαν µάρτυρας οµαλοποίησης των τυχόν διαφορών στη ποσότητα του RNA στις αντιδράσεις χρησιµοποιήθηκε το 18S RNA της Μεσογειακής µύγας. 63