ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5. ΧΡΩΜΑΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΚΑΙ ΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΟΙΝΩΝ Ιωάννης Ρούσσης

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5 ΧΡΩΜΑΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΚΑΙ ΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΟΙΝΩΝ Ιωάννης Ρούσσης Οκτώβριος 2016 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Χρώμα Οίνου Το χρώμα του οίνου είναι σημαντικός παράγοντας ποιότητας των οίνων. Οφείλεται, κυρίως, στις ανθοκυάνες, στις ταννίνες και άλλες φαινολικές ενώσεις. Ακριβής αποτίμηση του χρώματος του οίνου μπορεί να γίνει με χρωματόμετρο. Επίσης, εκτίμηση του χρώματος του οίνου μπορεί να γίνει με φωτόμετρο. Το φάσμα των ερυθρών οίνων παρουσιάζει ένα μέγιστο στα 520 nm, που οφείλεται στο κόκκινο χρώμα των ανθοκυανών. Με την παλαίωση των ερυθρών οίνων οι ανθοκυάνες καθιζάνουν είτε σχηματίζουν με ταννίνες σύμπλοκα έγχρωμα (όπως κεραμιδί) είτε άχρωμα. Έτσι, το μέγιστο στα 520 nm μειώνεται, ενώ συμμετέχει και η απορρόφηση στα 620 nm που αποτιμά το μωβ χρώμα. Η απορρόφηση στα 420 nm οφείλεται κυρίως σε διάφορες ταννίνες. Η εκτίμηση του χρώματος των λευκών οίνων γίνεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 420 nm, που αποτιμάται το κίτρινο χρώμα. Η απορρόφηση ενός λευκού οίνου στα 420 nm (γενικά στην περιοχή nm) είναι ανάλογη του βαθμού οξείδωσής του. Για την εκτίμηση του χρώματος των λευκών οίνων, μετράται η απορρόφηση διαυγούς οίνου στα 420 nm. Για τους ερυθρούς οίνους, συνήθως μετράται η απορρόφηση διαυγούς οίνου στα 420 και 520 nm. Η ένταση του χρώματος του χρώματος = Α420 nm + Α 520 nm, και η απόχρωση = Α420 nm /Α520 nm.

2 Επίσης, μετράται η απορρόφηση στα 420, 520 και 620 nm. Στην περίπτωση αυτή ένταση = Α420 nm + Α520 nm + Α620 nm. Χρώμα και φαινολικά συστατικά Το χρώμα είναι σημαντικός παράγοντας ποιότητας των οίνων. Οφείλεται στις ανθοκυάνες, τις τανίνες και άλλες φαινολικές ενώσεις. Επίσης, φαίνεται ότι υπάρχει σχέση μεταξύ χρώματος και αρώματος και γεύσης των οίνων. Χρώμα άτονο δηλώνει την ύπαρξη μέτριου αρώματος, ενώ έντονο χρώμα έντονο άρωμα. Ζωηρές χροιές δηλώνουν γευστική φρεσκάδα, ενώ άτονες χροιές πλαδαρότητα γεύσης. Στους ερυθρούς οίνους έντονες κόκκινες χροιές δηλώνουν νεότητα, η συνύπαρξη καστανών και κεραμίδι χροιών δείχνει γήρανση, και οι μπλε χροιές πολύ νέο κρασί. Στους λευκούς οίνους, η ένταση του κίτρινου χρώματος δείχνει ωριμότητα του οίνου, ενώ είναι και μέτρο της οξείδωσης του οίνου. Η παρατήρηση του χρώματος και της χροιάς του οίνου γίνεται σε ποτήρι με κλίση μπροστά σε λευκό φόντο, και με ένα καθαρό και δυνατό φωτισμό. Φαινολικά Συστατικά Οίνων Οι φαινολικές ενώσεις των οίνων διακρίνονται σε φλαβονοειδή και μη φλαβονοειδή. Στα φλαβονοειδή, που έχουν σκελετό C6-C3-C6, ανήκουν οι ανθοκυάνες, οι φλαβανόλες (κατεχίνες) και οι φλαβονόλες. Τα μη φλαβονοειδή είναι κυρίως τα βενζοικά οξέα, με σκελετό C6-C1, και τα υδροξυκινναμωμικά οξέα, με σκελετό C6-C3. Οι ανθοκυάνες είναι οι κόκκινες χρωστικές, ενώ οι φλαβανόλες υπάρχουν και ως ολιγομερή και πολυμερή που καλούνται συμπυκνωμένες ταννίνες ή προανθοκυανιδίνες (λευκοανθοκυάνες η προκυανιδίνες). Οι ανθοκυάνες είναι οι ερυθρές χρωστικές των σταφυλιών, και είναι ετεροζαχαρίτες. Στα κρασιά οι ανθοκυάνες αντιδρούν με το θειώδη ανυδρίτη με αποτέλεσμα το μερικό αποχρωματισμό. Επίσης, ενώνονται με ταννίνες παρουσία οξυγόνου. Κατά την παλαίωση με την ένωση ανθοκυανών-ταννινών σχηματίζονται έγχρωμες, άχρωμες η πορτοκαλόχρωμες. Στο κρασί η ισορροπία των μορφών των ανθοκυανών είναι συνάρτηση

3 του ph. Η συγκέντρωση των ανθοκυανών στους νέους οίνους είναι της τάξης των 400 mg/l, ενώ στους παλαιωμένους της τάξης των 90 mg/l. Οι ανθοκυάνες με δύο υδροξύλια σε ο-θέση αντιδρούν με τρισθενή σίδηρο προς σύμπλοκα κυανού χρώματος, αντίδραση που ευνοείται σε λιγότερο όξινο περιβάλλον. Η μεταβολή του χρώματος των ερυθρών οίνων μετά την οινοποίηση πιθανόν σχετίζεται με την οξείδωση του Fe II σε Fe III και τον σχηματισμό του συμπλόκου. Επίσης, το θόλωμα σιδήρου των ερυθρών οίνων με σχηματισμό συμπλόκων του Fe III με ανθοκυάνες και ταννίνες πιθανόν σχετίζεται με τον παραπάνω σχηματισμό του συμπλόκου. Οι ανθοκυάνες με αντίδραση με τα όξινα θειώδη ιόντα μετατρέπονται σε άχρωμες ενώσεις. Η αντίδραση είναι αμφίδρομη. Με προσθήκη θειώδη ανυδρίτη λαμβάνει χώρα αποχρωματισμός του οίνου, και το χρώμα του οίνου επανέρχεται προοδευτικά. Οι ανθοκυάνες μπορούν να αποχρωματιστούν με αναγωγή, αντίδραση που ευνοείται σε ισχυρά όξινο ph και είναι αμφίδρομη. Ο ασθενής χρωματισμός του οίνου μετά την αλκοολική ζύμωση, που είναι αναγωγικό φαινόμενο, πιθανόν να σχετίζεται με την αναγωγή των ανθοκυανών. Κατά την παλαίωση η συγκέντρωση των ανθοκυανών μειώνεται. Οι ταννίνες, ανάλογα με τη δομή τους, διακρίνονται στις συμπυκνωμένες και στις υδρολυόμενες ταννίνες. Οι συμπυκνωμένες ταννίνες είναι οι φυσικές ταννίνες των σταφυλικών και των οίνων. Σχηματίζονται με πολυμερισμό της φλαβανόλης-3 (κατεχίνη) και κυρίως της φλαβανοδιόλης-3,4 (λευκοανθοκυανιδίνη). Οι

4 συνήθεις ταννίνες του σταφυλιού είναι ολιγομερή με 2 μέχρι μονομερή. Οι ταννίνες των σταφυλιών βρίσκονται στα στερεά, αλλά στον οίνο μεταφέρεται μόνο μικρό τους μέρος. Η συγκέντρωσή τους στους ερυθρούς οίνους είναι 1,5-4 g/l και στους λευκούς mg/l. Οι υδρολυόμενες ταννίνες αποτελούνται από ένα ζάχαρο, όπως γλυκόζη, με το οποίο ενώνονται φαινολικές ενώσεις. Αυτές είναι κυρίως το γαλλικό οξύ και το ελλαγικό οξύ (διμερές του γαλλικού οξέος). Οι υδρολυόμενες ταννίνες δεν βρίσκονται στο σταφύλι, αλλά προέρχοντα από τις κύριες εμπορικές ταννίνες που χρησιμοποιούνταις τις κατεργασίες των οίνων και από το ξύλο του βαρελιού. Οι ανθοκυάνες και οι ταννίνες καθορίζουν το χρώμα των οίνων. Το χρώμα των νέων ερυθρών οίνων οφείλεται στις ανθοκυάνες. Δεν συμβαίνει το ίδιο για το χρώμα των παλαιωμένων οίνων, που οι ταννίνες παίζουν σημαντικό ρόλο. Πάντως, παράμετροι όπως το ph, το οξυγόνο και ο σίδηρος παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του χρώματος. Οι ταννίνες προέρχονται από πολυμερισμό των κατεχινών και των προκυανιδινών, και από το βαρέλι. Οι ταννίνες έχουν πικρή γεύση και δίνουν στα κρασιά στυφίλα. Η στυφίλα προκαλείται με ένωση των ταννινών με τις πρωτείνες του σάλιου. Έτσι, το σάλιο δεν δρά ως λιπαντικό (ύγρανση του στόματος). Επίσης, οι ταννίνες επιδρούν στους βλεννογόνους που εκκρίνουν σάλιο, που τελικά φράσσονται. Το στόμα ξηραίνεται, στεγνώνει και σκληραίνει. Στο κρασί όλες οι στυφές ουσίες είναι ταννίνες. Όλες οι ταννίνες του κρασιού δεν έχουν την ίδια χημική σύνθεση ούτε τον ίδιο βαθμό πολυμερισμού. Από το βαθμό πολυμερισμού, πάντως, εξαρτάται η δράση τους. Οι μαλακές ταννίνες προσδίνουν όγκο και σώμα στο κόκκινο κρασί, ενώ οι επιθετικές προσδίνουν στυφότητα. Οι επιθετικές ταννίνες είναι μοριακού βάρους Κατά την παλαίωση σε ξύλινο βαρέλι σχηματίζονται, με την επίδραση του οξυγόνου, μεγάλα πολυμερή. Μέθοδοι προσδιορισμού φαινολικών συστατικών Για προσδιορισμό των ολικών φαινολικών συστατικών συχνά χρησιμοποιείται η μέθοδος Folin. Η μέθοδος Folin-Ciocalteu χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό ολικών φαινολικών σε οίνους. Γενικά η Folin είναι μέθοδος αποτίμησης αντιοξειδωτικής δράσης. Την ίδια αντίδραση δίνουν κυρίως αντιοξειδωτικά όπως φαινολικά, και άλλα συστατικά όπως ανάγοντα σάκχαρα και νουκλεινικά

5 οξέα. Ο θειώδης ανυδρίτης και το ασκορβικό οξύ που προστίθενται στους οίνους αντιδρούν σε κάποιο βαθμό. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην οξείδωση των αντιοξειδωτικών σε αλκαλικό περιβάλλον με μίγμα φωσφοβολφραμικού και φωσφομολυβδαινικού οξέος. Τα οξέα ανάγονται σε μίγμα κυανών οξειδίων του βολφραμίου (W 8 Ο 23 ) και του μολυβδαινίου (Мо 8 О 23 ). Η ένταση του κυανού χρώματος, με μέγιστο στα nm, είναι ανάλογη των φαινολικών συστατικών. Μέτρο των ολικών φαινολικών αποτελεί η απορρόφηση στα 280 nm. Η απορρόφηση στα 320 nm αποτελεί μέτρο των υδροξυκινναμωμικών, η απορρόφηση στα 360 nm των φλαβονολών και στα 520 nm των ανθοκυανών. Οι φλαβανόλες-3 (κατεχίνες) προσδιορίζονται με αντίδραση με π- διμεθυλαμινοκινναμαλδεύδη και μέτρηση της απορρόφησης στα 640 nm. Οι ανθοκυάνες προσδιορίζονται με αποχρωματισμό με όξινο θειώδες και μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. Τα διάφορα φαινολικά συστατικά συχνά προσδιορίζονται με υγρή χρωματογραφία και ανιχνευτή ορατού-υπεριώδους. Συχνά, για τον ποσοτικό προσδιορισμό του συνόλου των ανθοκυανών χρησιμοποιούνται οι ιδιότητές τους α) να παρουσιάζουν αλλαγή χρώματος με μεταβολή του ph, και β) να σχηματίζουν άχρωμες ενώσεις με όξινα θειώδη ιόντα. Και στις δύο μεθόδους ακολουθεί μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. Επίσης, η άμεση μέτρηση της απορρόφηση του οίνου στα 520 nm είναι μέτρο του συνόλου των ανθοκυανών.

6 Ο φωτομετρικός προσδιορισμός των ταννινών βασίζεται στην ιδιότητά τους να μετατρέπονται μερικώς σε ανθοκυάνες με θέρμανση σε όξινο περιβάλλον. Οι παραγόμενες ανθοκυάνες προσδιορίζονται με μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Χρωματικά Χαρακτηριστικά Οίνων Για τους ερυθρούς και ροζέ οίνους, συνήθως μετράται η απορρόφηση στα 420 και 520 nm. Η ένταση του χρώματος = Α420 nm + A 520 nm, και η απόχρωση = Α420 nm / Α520 nm. Επίσης, μετράται η απορρόφηση στα 420, 520 και 620 nm. Στην περίπτωση αυτή Ένταση = Α420 nm + Α520 nm + Α620 nm. Ο διαυγής ερυθρός οίνος, εάν χρειάζεται, αραιώνεται με νερό με ph ίδιο με τον οίνο (η ρύθμιση του ph γίνεται με ασθενές κιτρικό οξύ και ρυθμιστικό φωσφορικών). Χρησιμοποιούνται κυψελίδες του 1 cm, ενώ το φωτόμετρο μηδενίζεται με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Το εύρος των τιμών απορρόφησης που είναι αποδεκτό είναι 0,3-0,7. Εάν οι απορροφήσεις είναι μεγαλύτερες, όπως στους ερυθρούς οίνους, χρησιμοποιούνται κυψελίδες του 1 mm, και το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται χ 10. Η ένταση και η απόχρωση του οίνου υπολογίζονται από τους παραπάνω τύπους και εκφράζονται σαν καθαροί αριθμοί με τρία δεκαδικά ψηφία. Για την εκτίμηση του χρώματος των λευκών οίνων, μετράται η απορρόφηση του διαυγούς οίνου στα 420 nm. Χρησιμοποιούνται

7 κυψελίδες του 1 cm, ενώ το φωτόμετρο μηδενίζεται με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Φαινολικά Συστατικά Οίνων Δείκτης φαινολικών Η αποτίμηση των φαινολικών ενώσεων με βάση την απορρόφηση στα 280 nm, βασίζεται στο ότι οι βενζολικοί δακτύλιοι των φαινολικών ενώσεων απορροφούν στο υπεριώδες με μέγιστο περίπου στα 280 nm. Για τη μέτρηση χρησιμοποιείται διαυγής οίνος (ή γλεύκος), που αραιώνεται κατάλληλα με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Μετράται η απορρόφηση στα 280 nm με κυψελίδες χαλαζία του 1 cm. Ο μηδενισμός του φασματοφωτομέτρου γίνεται με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Ο Δείκτης Φαινολικών (ΔΦ) = Απορρόφηση χ Αραίωση του οίνου. Δείκτης Folin Ολικά φαινολικά Σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml, φέρονται 0,1 ml ερυθρού οίνου (αραιωμένου 5 φορές ή με άλλη κατάλληλη αραίωση), 5 ml απ. νερού, 0,5 αντιδραστηρίου Folin, 2 ml 20 % άνυδρου ανθρακικού νατρίου. Γίνεται συμπλήρωση με απ. νερό. Ακολουθεί ανάμιξη για διάλυση, και παραμονή για 30 min (30-45 min). Μετράται η απορρόφηση στα 750 nm με κυψελίδα 1 cm, με μηδενισμό του οργάνου με το τυφλό. Οι μετρήσεις της απορρόφησης πρέπει να γίνονται σε σταθερό χρόνο για όλα τα δείγματα καθόσον το παραγόμενο χρώμα εξελίσσεται με το χρόνο. Το τυφλό παρασκευάζεται με την ίδια όπως παραπάνω διαδικασία χρησιμοποιώντας απ. νερό στη θέση του οίνου. Εάν η απορρόφηση δεν είναι στην περιοχή του 0,3 πρέπει να γίνει η κατάλληλη Στην περίπτωση των λευκών οίνων χρησιμοποιείται ο οίνος ως έχει (χωρίς αραίωση). Ο δείκτης Folin προκύπτει με πολλαπλασιασμό της απορρόφησης στα 750 nm x 20 (εμπειρικός συντελεστής) x την αραίωση του δείγματος. Επίσης, γίνεται προσδιορισμός των ολικών φαινολικών και εκφράζονται σε γαλλικό οξύ. Η συγκέντρωση των ολικών φαινολικών προκύπτει από πρότυπη καμπύλη γαλλικού οξέος, και εκφράζεται σε mg/l γαλλικού

8 οξέος. Τυπική εξίσωση: C=833 χ Α, όπου С η συγκέντρωση και Α η απορρόφηση. Φάσμα υπεριώδους και ορατού Η αποτίμηση των επιπέδων ομάδων φαινολικών συστατικών μπορεί να γίνει με λήψη φάσματος στο υπεριώδες. Η απορρόφηση στα 280 nm είναι μέτρο των ολικών φαινολικών, στα 320 nm των υδροξυκιναμμωμικών, και στα 360 nm των φλαβονολών. Μετά από κατάλληλη αραίωση του δείγματος λαμβάνεται το φάσμα υπεριώδους στο φασματοφωτόμετρο. Επίσης, μπορεί να ληφθεί και το φάσμα στο ορατό, που σχετίζεται με το χρώμα του οίνου (420 nm, 520 nm, 620 nm). Προσδιορισμός ταννινών φωτομετρικά Ο φωτομετρικός προσδιορισμός των ταννινών βασίζεται στην ιδιότητά τους να μετατρέπονται μερικώς σε ανθοκυάνες με θέρμανση σε όξινο περιβάλλον. Οι παραγόμενες ανθοκυάνες προσδιορίζονται με μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. Σε δοκιμαστικούς σωλήνες φέρονται 4 ml οίνου (αραιωμένου 50 φορές), 2 ml απεσταγμένο νερό και 6 ml π. HCl (12 Ν). Γίνεται θέρμανση σε αμμόλουτρο στους 100 ο C για 30 min. Ακολουθεί ψύξη με τρεχούμενο νερό, αφού προηγουμένως ο σωλήνας περιτυλιχθεί με σκοτεινόχρωμο περίβλημα. Αυτό επειδή οι ανθοκυάνες είναι ασταθείς στο φώς. Προστίθενται 1 ml αιθανόλης, για να σταθεροποιήσει και να κάνει πιο έντονο το χρώμα. Μετράται η απορρόφηση στα 550 nm με κυψελίδα 1 cm, με τυφλό απεσταγμένο νερό. Για τυφλό της μεθόδου γίνεται η ίδια διαδικασία χωρίς τη θέρμανση. Η συγκέντρωση ταννινών σε g/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Τυπική εξίσωση : C = 19,33 χ ΔΑ, όπου C η συγκέντρωση και ΔΑ η διαφορά απορροφήσεων του δείγματος και του τυφλού. Προσδιορισμός ανθοκυανών με αποχρωματισμό με όξινο θειώδες Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα των ανθοκυανών να δίνουν με το ιόν SO 3 H - άχρωμες ενώσεις. Στην περίπτωση αυτή πρέπει να θεωρηθεί ότι τα άλλα συστατικά του οίνου δεν συμμετέχουν και η αλλαγή του χρώματος, μετά την προσθήκη ικανής περίσσειας όξινου θειώδους άλατος, είναι ανάλογη προς την περιεκτικότητα των ανθοκυανών. Σε 1 ml οίνου προστίθεται 1 ml αιθανόλης που περιέχει 0,1 % π. HC1

9 και 20 ml 2% HC1. Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 10 ml από το παραπάνω μίγμα και 4 ml 15% όξινου θειώδους νατρίου που προκαλεί άμεσο αποχρωματισμό του οίνου. Σε ένα δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 10 ml από το μίγμα και 4 ml απεσταγμένο νερό. Μετά από παραμονή 20 λεπτών, μετράται η απορρόφηση στα 520 nm, με κυψελίδα 1 cm και τυφλό απεσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση των ανθοκυανών σε mg/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Τυπική εξίσωση: C=875 χ ΔΑ, όπου С η συγκέντρωση και ΔΑ η διαφορά των απορροφήσεων στις δύο περιπτώσεις. Αποχρωματισμός με μεταβολή του ph Σε καθένα από δύο δοκιμαστικούς σωλήνες φέρονται 1 ml οίνου, 1 ml αιθανόλης με 0,1% π. HC1, και στον ένα α) 10 ml 2% HC1 (ph 0,6), ενώ στον άλλο β) 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος πη 3,5 0,2 Μ όξινο φωσφορικό νάτριο / 0,1 Μ κιτρικό οξύ). Μετράται η απορρόφηση στα 520 nm, με κυψελίδα 1 cm και τυφλό απεσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση των ανθοκυανών σε mg/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Τυπική εξίσωση: C=385 χ ΔΑ, όπου С η συγκέντρωση και ΔΑ η διαφορά των απορροφήσεων στις δύο περιπτώσεις.