ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΑΙ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΑΙ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑΣ ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2018

2 Εργαστηριακές ασκήσεις Προχωρημένου Εργαστηρίου Τροφίμων και Οινολογίας (ΠΕΤ-Ο) Πριν από τις εργαστηριακές ασκήσεις του ΠΕΤ-Ο παρουσιάζονται οι σημειώσεις βασικών αναλύσεων οίνου, που είναι της άσκησης Ανάλυση Οίνου του Εργαστηρίου Ανάλυσης και Τεχνολογίας Τροφίμων: Αναλύσεις βασικής σύστασης οίνου. Ι. Ρούσσης. 1. Γενικές αναλύσεις γλεύκους και οίνου. Ι. Ρούσσης, Κ. Ρηγανάκος, Χ. Πιπερίδη. 2. Χρωματικά χαρακτηριστικά και φαινολικά συστατικά οίνων. Ι. Ρούσσης. 3. Έλεγχος σταθερότητας οίνων ειδικές αναλύσεις οίνων. Ι. Ρούσσης. 4. Ενζυμικές και μικροβιακές δράσεις στη γαλακτοκομία και στην οινολογία. Ι. Ρούσσης. 5. Οξείδωση και αντιοξειδωτική δράση ελαίων και προϊόντων φρούτων. Ι. Ρούσσης. 6. Χρωστικές τροφίμων (TLC)- Αντικειμενική μέτρηση χρώματος τροφίμων. Α. Μπαδέκα, Χ. Πιπερίδη, Μ. Τασιούλα-Μάργαρη. 7. Προσδιορισμός ολικού μικροβιακού φορτίου στα τρόφιμα. Ι. Σαββαίδης. 8. Προσδιορισμός εντεροβακτηρίων στα τρόφιμα. Ι. Σαββαίδης. 9. Αρίθμηση ζυμών-μυκήτων σε γαλακτοκομικό προϊόν. Ι. Σαββαίδης 10. Ειδικές αναλύσεις οίνων. 11. Προσδιορισμός ενώσεων αρώματος γιαουρτιών και οίνων με μικροεκχύλιση στερεάς φάσης και αέρια χρωματογραφία - φασματομετρία μάζας. Ι. Ρούσσης. Σημαντικό τμήματα των ασκήσεων 10 και 11 θα παρουσιαστούν ως επίδειξη.

3 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Οίνος ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΒΑΣΙΚΗΣ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΟΙΝΟΥ Ιωάννης Ρούσσης 2018 Ο οίνος είναι αλκοολούχο ποτό που λαμβάνεται με ζύμωση χυμού σταφυλιών (γλεύκος, μούστος). Σύσταση Οίνου: Ο οίνος είναι υδατο-αλκοολικό διάλυμα διαφόρων ενώσεων. Τα κύρια συστατικά του οίνου μπορούν να διακριθούν στις παρακάτω κατηγορίες. Νερό, Αλκοόλη, Άλλες πτητικές ενώσεις, Οργανικά οξέα, Υδατάνθρακες, Αζωτούχες ενώσεις, Φαινολικές ενώσεις, Βιταμίνες, Ανόργανα συστατικά. ΑΙΘΑΝΟΛΗ Η συγκέντρωση της αιθανόλη (C 2 H 5 OH) είναι της τάξης 9-13,5 % Vol ή παραπάνω. Είναι το κύριο προϊόν της αλκοολικής ζύμωσης. Έχει σ.ζ. 78 ο C. Έχει επίδραση στην ποιότητα, στη συντήρηση και στην εμπορική αξία του οίνου. Έχει αρκετά δριμεία οσμή. Η αλκοόλη αποτελεί τη βάση για το άρωμα και το μπουκέτο των οίνων. Η αλκοόλη προσδίδει σύνθετη και ιδιαίτερη γεύση. Η αλκοόλη, μαζί με τα αναγωγικά ζάχαρα και τη γλυκερόλη αποτελούν τα συστατικά με γλυκειά γεύση. Έτσι, μετριάζουν την όξινη γεύση των οξέων και την πικράδα των φαινολικών ενώσεων. Επίσης, όσο μεγαλύτερη είναι η περιεκτικότητα σε αλκοόλη υπάρχει η εντύπωση ότι οι οίνοι είναι παχείς και πλούσιοι σε στερεό υπόλειμμα. Η αλκοόλη συμβάλει στη συντήρηση των οίνων με τις αντιμικροβιακές ιδιότητές της.

4 Αρχή μεθόδου προσδιορισμού αλκοόλης Με απόσταξη λαμβάνεται (σχεδόν αποκλειστικά) μίγμα νερού-αλκοόλης, και μετράται το ειδικό βάρος του μίγματος. Δηλαδή ο αρχικός οίνος μετασχηματίζεται σε μίγμα νερού αιθανόλης ίσου όγκου, που περιέχει όλη την αλκοόλη του οίνου. Το ειδικό βάρος μίγματος νερού-αιθανόλης εξαρτάται από την περιεκτικότητά του σε αιθανόλη. Η πυκνότητα της αιθανόλης είναι 0,789 g/cm 3. Με απόσταξη 200 ml οίνου συλλέγονται περίπου 150 ml αποστάγματος. Για την εξουδετέρωση της οξύτητας του οίνου, για να μη ληφθούν στο απόσταγμα πτητικά οξέα (οξικό, ανθρακικό και θειώδες), στα 200 ml του οίνου προστίθενται ml Ca (OH) 2 10 % w/v (Ca (OH) 2 10 %, 120 g CaO διαλύονται σε ένα λίτρο αποσταγμένο νερό ο C). Προστίθενται κόκκοι ελαφρόπετρας (πέτρες βρασμού) για παρεμπόδιση του αφρισμού (στους νέους οίνους κυρίως είναι έντονος). Μετά την απόσταξη, γίνεται συμπλήρωση του αποστάγματος με αποσταγμένο νερό στα 200 ml.

5 Πίνακας. Συσχέτιση ειδικού βάρους μίγματος νερού-αλκοόλης με την περιεκτικότητά του σε αλκοόλη. Πυκνότητα στους 20 o C 1, , ,3 0, ,5 0, ,8 0, ,0 0, ,2 0, ,5 0, ,7 0, ,0 0, ,2 0, ,4 0, ,6 0, ,8 0, ,1 0, ,3 0, ,5 0, ,7 0, ,9 0, ,1 0, ,3 Αλκοόλη, % vol O αλκοολικός τίτλος κατ όγκο, % vol, ορίζεται ως ο αριθμός των ml άνυδρης αιθανόλης σε 100 ml οίνου στους 20 o C. Η αλκοόλη, % vol, μετράται στους 20 o C. Γίνεται διόρθωση της αλκοόλης όταν η θερμοκρασία είναι διαφορετική από πίνακες. Οι οίνοι περιέχουν συνήθως 9,0 15,0 % vol.

6 Πίνακας. Διόρθωση αλκοόλης με τη θερμοκρασία. ΟΞΥΤΗΤΑ ΚΑΙ ΟΞΕΑ Ολική η ογκομετρούμενη οξύτητα: το σύνολο των ελεύθερων καρβοξυλομάδων, που είναι σε διάσταση είτε όχι, προσδιορίζεται με ογκομέτρηση με βάση. Ενεργός οξύτητα: το σύνολο των καρβοξυλομάδων που βρίσκονται σε διάσταση και αντιστοιχεί στο σύνολο των ιόντων υδρογόνου, προσδιορίζεται με πεχάμετρο. Πτητική οξύτητα: το σύνολο των οξέων της σειράς του οξικού οξέος που βρίσκονται ελεύθερα ή δεσμευμένα. Για τον προσδιορισμό γίνεται απόσταξη με υδρατμούς και ογκομέτρηση με βάση. Kύρια οξέα οίνου Οξέα σταφυλιού: Τρυγικό, Μηλικό, Κιτρικό Οξέα ζυμώσεων: Ηλεκτρικό, Γαλακτικό Πτητικά ζυμώσεων: Οξικό

7 Αρχή μεθόδου προσδιορισμού ολικής και πτητικής οξύτητας Η ολική οξύτητα κατά σύμβαση θεωρείται ότι προκύπτει με εξουδετέρωση των οξέων με άλκαλι σε ph 7. Με δείκτη κυανού της βρωμοθυμόλης η αλλαγή του χρώματος (σε κυανοπράσινο) γίνεται σε ph 7. Με φαινολοφθαλείνη η αλλαγή του χρώματος γίνεται σε ph 8,5-9. Πριν την ογκομέτρηση το CO 2 αφαιρείται με ανάδευση υπό κενό. Λαμβάνονται 10 ml οίνου, και γίνεται απομάκρυνση του CO 2 Προστίθεται νερό και γίνεται ογκομέτρηση με 0,1 Ν NaOH. 1 ml 0,1 N NaOH ,5 mg τρυγικού οξέος Τρυγικό οξύ, COOH-CH (OH)-CH (OH)-COOH Η ολική οξύτητα εκφράζεται σε g/l ως τρυγικό οξύ. Ενδεικτικές τιμές 5-8 g/l ως τρυγικό οξύ. Για την πτητική οξύτητα ο οίνος οξινίζεται με προσθήκη κρυστάλλων τρυγικού οξέος για απελευθέρωση των πτητικών οξέων από τα άλατά τους. Στη συνέχεια, με απόσταξη με υδρατμούς θεωρείται ότι παραλαμβάνεται το σύνολο των πτητικών οξέων του οίνου. Γίνεται ογκομέτρηση του αποστάγματος με διάλυμα NaOH και δείκτη φαινολοφθαλείνη. Στην πτητική οξύτητα δεν πρέπει να περιλαμβάνεται το CO 2 και το SO 2. Το CO 2 απομακρύνεται από τον οίνο πριν την απόσταξη με 1-2 min ανάδευση υπό κενό (φιάλη κενού). H διόρθωση για το SO 2 γίνεται με προσδιορισμό του ελεύθερου και του δεσμευμένου θειώδη ανυδρίτη, μετά την ογκομέτρηση με το διάλυμα NaOH. Λαμβάνονται 20 ml οίνου, μετά την απομάκρυνση του CO 2, και προστίθενται περίπου 0,5 g τρυγικού οξέος. Γίνεται απόσταξη με υδρατμούς και λαμβάνονται τουλάχιστον 250 ml αποστάγματος. Γίνεται ογκομέτρηση με 0,1 Ν NaOH και δείκτη φαινολοφθαλείνη. 1 ml 0,1 Ν NaOH mg οξικού οξέος Οξικό οξύ, CH 3 COOH Η πτητική οξύτητα εκφράζεται σε g/l ως οξικό οξύ.

8 Ενδεικτικές τιμές 0,3-0,8 g/l ως οξικό οξύ. Μέγιστες επιτρεπόμενες τιμές από την Ευρωπαϊκή νομοθεσία. Λευκοί οίνοι, 1,08 g/l ως οξικό οξύ Ερυθροί οίνοι, 1,20 g/l ως οξικό οξύ ΘΕΙΩΔΗΣ ΑΝΥΔΡΙΤΗΣ Ο θειώδης ανυδρίτης είναι το βασικό αντιοξειδωτικό και αντιμικροβιακό που χρησιμοποιείται στην οινοποίηση. Στον οίνο ο θειώδης ανυδρίτης βρίσκεται ελεύθερος ως SO 2, SO 3 2-, και κυρίως ως HSO 3 -, είτε δεσμευμένος κυρίως με καρβονυλικές ενώσεις. Υπάρχει φυσιολογικά στον οίνο μέχρι 10 mg/l. Τα θειώδη προκαλούν αλλεργικές αντιδράσεις, κυρίως σε άτομα με άσθμα. Επίσης, έχουν αρνητική επίδραση στο άρωμα και τη γεύση του οίνου. Έτσι, υπάρχει διεθνώς η τάση για μείωση των επιπέδων που χρησιμοποιείται. Μέγιστο πρόσληψης θειωδών 0,7 mg ανά Kg βάρους σώματος. Ένα ποτήρι οίνου περιέχει περίπου 10 mg θειώδη. Οι δοκιμαστές αντιλαμβάνονται τον θειώδη ανυδρίτη στα mg/l. Σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή νομοθεσία στους ερυθρούς οίνους το μέγιστο είναι 160 mg/l, και στους λευκούς οίνους το μέγιστο είναι 210 mg/l. Στην ετικέτα της φιάλης αναγράφεται υποχρεωτικά Περιέχει θειώδη, εάν η συγκέντρωση είναι μεγαλύτερη από 10 mg/l. Αρχή μεθόδου προσδιορισμού θειώδη ανυδρίτη Ο προσδιορισμός του θειώδη ανυδρίτη στον οίνο βασίζεται στην οξέιδωσή του από το ιώδιο. Η αντίδραση γίνεται σε ισχυρά όξινο περιβάλλον, καθόσον σε ph ίσο ή μεγαλύτερο από 3, το ιώδιο οξειδώνει και άλλα αναγωγικά συστατικά του οίνου, όπως πολυφαινόλες, σάκχαρα και αλδεΰδες. Έτσι, μετά από προσθήκη θειικού οξέος στον οίνο, με ογκομέτρηση με διάλυμα ιωδίου και δείκτη άμυλο προσδιορίζεται ο ελεύθερος θειώδης ανυδρίτης. Για τον προσδιορισμό του ολικού θειώδη ανυδρίτη, στον οίνο προστίθεται διάλυμα KOH για μεταβολή του ph σε ισχυρά αλκαλικό (ph οίνου περίπου 3,4) και αποδέσμευση του θειώδη ανυδρίτη που είναι δεσμευμένος, κυρίως με ακεταλδεύδη. Στη συνέχεια γίνεται

9 προσδιορισμός του θειώδη ανυδρίτη, ελεύθερου και δεσμευμένου, με οξίνηση και ογκομέτρηση με διάλυμα ιωδίου, όπως και για τον ελεύθερο θειώδη ανυδρίτη. Ελεύθερος θειώδης ανυδρίτης Σε 50 ml οίνου προστίθενται 5 ml θειικού οξέος 25 % v/v. Γίνεται ογκομέτρηση με 0,01 Ν J 2 και δείκτη άμυλο. 1 ml 0,01 N J ,32 mg SO2 Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε mg/l SO 2 Αντιδράσεις Ολικός θειώδης ανυδρίτης Σε 25 ml 1 Ν KOH προστίθενται 50 ml οίνου και υπάρχει παραμονή για 15 min. Ο δεσμευμένος θειώδης ανυδρίτης με καρβονυλικές ενώσεις απελευθερώνεται. Ακολουθεί προσθήκη 10 ml θειικού οξέος 25 % v/v. Γίνεται ογκομέτρηση με 0,01 Ν J 2 και δείκτη άμυλο. 1 ml 0,01 N J ,32 mg SO2 Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε mg/l SO 2 Αντιδράσεις

10 Επειδή συστατικά του οίνου οξειδώνονται από το ιώδιο σε ισχυρά όξινο περιβάλλον, όταν χρειάζεται ακρίβεια, σωστό είναι να γίνεται διόρθωση. Για τη διόρθωση, στον οίνο γίνεται προσθήκη διαλύματος ακεταλδεΰδης για δέσμευση του ελεύθερου θειώδη ανυδρίτη. Μετά από 30 min ακολουθεί η πορεία οξίνησης με θειικό οξύ και ογκομέτρησης με διάλυμα ιωδίου όπως στην περίπτωση του ελεύθερου θειώδους. Έτσι, με αυτή τη διαδικασία οξειδώνονται από το ιώδιο όλα τα άλλα συστατικά που μπορούν να οξειδωθούν σε ισχυρά όξινο περιβάλλον, αλλά όχι το ελεύθερο θειώδες καθόσον έχει δεσμευτεί από την ακεταλδεΰδη. Τα ml του διαλύματος ιωδίου που καταναλώνονται, αφαιρούνται από αυτά που καταναλώνονται χωρίς την προσθήκη διαλύματος ακεταλδεύδης, τόσο για τη διόρθωση του ελεύθερου θειώδους όσο και για τη διόρθωση του ολικού θειώδους. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Προσδιορισμός Αλκοόλης Σε φιάλη αποστακτικής συσκευής φέρονται 200 ml οίνου, και προστίθενται 10 ml εναιωρήματος 2 M Ca(OH) 2 και πέτρες βρασμού. Ακολουθεί απόσταξη και συλλέγονται περίπου 150 ml αποστάγματος. Με απεσταγμένο νερό γίνεται συμπλήρωση στα 200 ml (αρχικός όγκος οίνου). Με αλκοολόμετρο μετράται το ποσοστό της αλκοόλης, και με θερμόμετρο η θερμοκρασία. Γίνεται διόρθωση με αναγωγή στους 20 o C με βάση πίνακες. O αλκοολικός τίτλος κατ όγκο, % vol, ορίζεται ο αριθμός των ml άνυδρης αιθανόλης σε 100 ml οίνου στους 20 o C. Προσδιορισμός Ολικής ή Ογκομετρούμενης Οξύτητας Ποσότητα του δείγματος οίνου απαερώνεται με αντλία κενού, είτε με ελαφριά θέρμανση είτε με λουτρό υπερήχων. Στη συνέχεια, σε κωνική φιάλη φέρονται 10 ml απαερωμένου οίνου, περίπου 30 ml απεσταγμένου νερού και 1 ml διαλύματος κυανού της βρωμοθυμόλης (δείκτης).

11 Ακολουθεί ογκομέτρηση με 0,1 N NaOH, μέχρι το διάλυμα να αποκτήσει κυανοπράσινη χροιά. Το αποτέλεσμα σε g/l τρυγικού οξέος υπολογίζεται με βάση το ότι 1 ml 0,1 N NaOH ισοδυναμεί με 7,5 mg τρυγικού οξέος. Προσδιορισμός Πτητικής Οξύτητας Ποσότητα του δείγματος οίνου απαερώνεται με αντλία κενού. Στη συνέχεια, σε φιάλη αποστακτικής συσκευής φέρονται 20 ml απαερωμένου οίνου, και προστίθενται 0,5 g κρυσταλλικού τρυγικού οξέος. Ακολουθεί απόσταξη και συλλέγονται τουλάχιστον 250 ml αποστάγματος. Στη συνέχεια γίνεται ογκομέτρηση με 0,1 Ν NaOH και δείκτη φαινολοφθαλείνη. Το αποτέλεσμα σε g/l οξικού οξέος υπολογίζεται με βάση το ότι 1 ml 0,1 N NaOH ισοδυναμεί με 6 mg οξικού οξέος. Για τη διόρθωση της πτητικής οξύτητας από τον θειώδη ανυδρίτη ακολουθείται η παρακάτω διαδικασία. Μετά την ογκομέτρηση με το NaOH (με κατανάλωση έστω α ml), προστίθενται 4 σταγόνες 4 φορές αραιωμένου πυκνού HCL οξέος (ή 1 σταγόνα π. HCL οξέος) και μερικοί κρύσταλλοι KJ. Ακολουθεί ογκομέτρηση του ελεύθερου θειώδη ανυδρίτη με 0,005 Μ ιωδίου (με κατανάλωση, έστω β ml). Στη συνέχεια προστίθεται κορεσμένο διάλυμα βόρακα (βορικού νατρίου), μέχρι να επανεμφανιστεί το ροζ χρώμα. Ακολουθεί ογκομέτρηση του δεσμευμένου θειώδη ανυδρίτη με 0,005 Μ ιωδίου (με κατανάλωση, έστω γ ml). Η διορθωμένη Πτητική Οξύτητα σε g/l, ως οξικό οξύ προκύπτει από τη σχέση Πτητική Οξύτητα = 0,300 (α-0,1 β-0,05 γ) Προσδιορισμός Θειώδη Ανυδρίτη Ελεύθερο θειώδες Σε κωνική φιάλη φέρονται 25 ml οίνου, και προστίθενται 2,5 ml 25 % v/v θειικού οξέος.

12 Ακολουθεί ογκομέτρηση με διάλυμα ιωδίου 0,01 Ν και δείκτη άμυλο, μέχρι να εμφανιστεί κυανή χροιά που διατηρείται για sec. Το αποτέλεσμα σε mg/l SO 2 υπολογίζεται με βάση το ότι 1 ml 0,01 N J 2 ισοδυναμεί με 0,32 mg SO 2. Ολικό θειώδες Σε κωνική φιάλη φέρονται 25 ml οίνου και 12,5 ml διαλύματος 1 Ν KOH. Γίνεται ανακίνηση και ακολουθεί παραμονή για 10 min. Στη συνέχεια προστίθενται 5 ml 25 % v/v θειικού οξέος, και γίνεται ογκομέτρηση με διάλυμα ιωδίου 0,01 Ν και δείκτη άμυλο, μέχρι να εμφανιστεί κυανή χροιά που διατηρείται για sec. Το αποτέλεσμα σε mg/l SO 2 υπολογίζεται με βάση το ότι 1 ml 0,01 N J 2 ισοδυναμεί με 0,32 mg SO 2. Για τη διόρθωση του θειώδη ανυδρίτη ακολουθείται η παρακάτω πειραματική πορεία Σε εσμυρισμένη κωνική φιάλη φέρονται 50 ml οίνου, 2 ml αμύλου και 5 ml διαλύματος ακεταλδεΰδης 7 gr/l. Η κωνική φιάλη κλείνεται με πώμα και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 30min. Στη συνέχεια προστίθεται στην κωνική φιάλη 1,2 ml διαλύματος 25% w/v H 2 SO 4 και ακολουθεί ογκομέτρηση με 0,01 Ν Ι 2 και δείκτη άμυλο. Τέλος, γίνεται ογκομέτρηση με Ι 2 0,01Ν και δείκτη άμυλο. Για την διόρθωση αφαιρείται η τιμή 12,8 x α/2 (όπου α τα ml I 2 0,01N) από την τιμή του ελεύθερου θειώδη ανυδρίτη. Βιβλιογραφία International Organization of Vine and Wine. Compendium of International Methods of Wines and Musts Analysis. Vol. 1 and Vol. 2. Σουφλερός Ε.Η. Οίνος και αποστάγματα. Μέθοδοι ανάλυσης. Θεσσαλονίκη Τζουβάρα-Καραγιάννη Σ. Σύσταση, χημική ανάλυση και προδιαγραφές βασικών τροφίμων. Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Ιωάννινα 1991.

13 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1 ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΓΛΕΥΚΟΥΣ ΚΑΙ ΟΙΝΟΥ Ιωάννης Ρούσσης, Κυριάκος Ρηγανάκος, Χριστίνα Πιπερίδη ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Οκτώβριος 2018 ΓΛΕΥΚΟΣ Γλεύκος ή μούστος είναι ο χυμός που λαμβάνεται από σταφύλια με μικρή/ήπια πίεση ή με φυσικές κατεργασίες. Το γλεύκος είναι υδατικό σύστημα, με ενώσεις που είναι είτε διαλυμένες είτε σε κολλοειδή διασπορά. Τα κύρια συστατικά του είναι σάκχαρα, οργανικά οξέα, ανόργανες ενώσεις, αζωτούχες ενώσεις, φαινολικές ενώσεις, πηκτίνες και σε ίχνη βιταμίνες. Επίσης, το γλεύκος περιέχει ένζυμα, διαλυμένα αέρια (άζωτο, οξυγόνο) και ενώσεις αρώματος. Ανάλυση γλεύκους Οι βασικές αναλύσεις του γλεύκους είναι ο προσδιορισμός των σακχάρων και της οξύτητας, κυρίως της ογκομετρούμενης οξύτητας. Σημειώνεται ότι η σχέση των σακχάρων προς τα οξέα είναι ο πιο απλός δείκτης καθορισμού του σημείου ωρίμανσης των σταφυλιών. Προσδιορισμός των σακχάρων Ο προσδιορισμός των σακχάρων συνήθως γίνεται με διαθλασιμετρία ή αραιομετρία. Διαθλασιμετρία Με διαθλασιμετρία: με βάση τη διάθλαση που υφίσταται φωτεινή δέσμη από υγρό, γίνεται προσδιορισμός του δείκτη διάθλασης. Από το δείκτη διάθλασης προσδιορίζονται τα ολικά διαλυμένα συστατικά (στερεά). Στο γλεύκος το σύνολο σχεδόν των διαλυμένων συστατικών είναι τα σάκχαρα. Έτσι, με μέτρηση του δείκτη διάθλασης γίνεται προσδιορισμός της συγκέντρωσης των σακχάρων. Αραιομετρία Με τα αραιόμετρα γίνεται μέτρηση του ειδικού βάρους (πυκνομετρία). Από το ειδικό βάρος προσδιορίζονται τα ολικά διαλυμένα συστατικά (στερεά). Στο γλεύκος το σύνολο σχεδόν των διαλυμένων συστατικών

14 είναι τα σάκχαρα. Έτσι, με μέτρηση του ειδικού βάρους γίνεται προσδιορισμός της συγκέντρωσης των σακχάρων. Πίνακας. Υπολογισμός του σακχάρου του γλεύκους και της αλκοόλης του κρασιού που θα προκύψει από ειδικό βάρος του γλεύκους.

15 Προσδιορισμός ολικής ή ογκομετρούμενης οξύτητας Το γλεύκος είναι όξινο καθόσον περιέχει οργανικά οξέα, κυρίως το τρυγικό και επίσης τα μηλικό και κιτρικό οξύ. Ακόμη υπάρχουν και ανόργανα οξέα. Η ογκομετρούμενη οξύτητα είναι μέτρο των ελεύθερων καρβοξυλομάδων των οργανικών οξέων, είτε βρίσκονται σε διάσταση είτε όχι. Αντίθετα, το ph είναι μέτρο των ελεύθερων καρβοξυλομάδων που είναι σε διάσταση (προκύπτουν H + ). Η ογκομετρούμενη οξύτητα δεν εξαρτάται από το είδος των οξέων αλλά μόνο από τη συγκέντρωσή τους. Ως ολική οξύτητα ορίζεται το σύνολο της ογκομετρούμενης οξύτητας με άλκαλι μέχρι ph 7. Το διοξείδιο του άνθρακα δεν συμπεριλαμβάνεται στην ολική οξύτητα. Έτσι, η ολική οξύτητα προσδιορίζεται με ογκομέτρηση με άλκαλι και δείκτη που παρουσιάζει αλλαγή χρώματος στην ουδέτερη περιοχή, μετά από την απομάκρυνση του διοξειδίου του άνθρακα.. Εναλλακτικά προσδιορίζεται με άλκαλι, με προσθήκη μέχρι ph 7, που μετράται με πεχάμετρο. Προσδιορισμός θειώδη ανυδρίτη Ο θειώδης ανυδρίτης είναι το κύριο συντηρητικό που χρησιμοποιείται στην οινοποίηση. Έχει αντιμικροβιακή, αντιοξειδωτική και αντιοξειδασική δράση. Στον οίνο το διοξείδιο του θείου (ΔΘ) βρίσκεται ελεύθερο ως SO 2 και κυρίως ως HSO 3 -, είτε δεσμευμένο κυρίως με καρβονυλικές ενώσεις. Το ΔΘ χρησιμοποιείται με διάφορες μορφές : Ως αέριο SO 2, ως υγροποιημένο αέριο SO 2, ως διάλυμα όξινου θειώδους καλίου KHSO 3, και ως στερεό πυροθειώδες κάλιο (K 2 S 2 O 5 ) (μεταμπισουλφίτ). Η επίδραση της προσθήκης στον οίνο είναι η ίδια ανεξάρτητα από τη μορφή χρήσης του ΔΘ. Η ισορροπία που αποκαθίσταται μεταξύ των διαφόρων μορφών είναι η ίδια. Εξαρτάται από το ph και από την παρουσία μορίων που δεσμεύονται με το διοξείδιο του θείου.

16 ΟΙΝΟΣ Ο οίνος είναι αλκοολούχο ποτό που λαμβάνεται με ζύμωση χυμού σταφυλιών (γλεύκος, μούστος). Σύσταση Οίνου: Ο οίνος είναι υδατο-αλκοολικό διάλυμα διαφόρων ενώσεων. Τα κύρια συστατικά του οίνου μπορούν να διακριθούν στις παρακάτω κατηγορίες. Νερό, Αλκοόλη, Άλλες πτητικές ενώσεις, Οργανικά οξέα, Υδατάνθρακες, Αζωτούχες ενώσεις, Φαινολικές ενώσεις, Βιταμίνες, Ανόργανα συστατικά. Ανάλυση οίνου Προσδιορισμός αναγωγικών (ή αναγόντων) σακχάρων Οι οίνοι διακρίνονται ανάλογα με τη συγκέντρωσή τους σε σάκχαρα. Τα κύρια σάκχαρα είναι η γλυκόζη, η φρουκτόζη, η γαλακτόζη και πεντόζες, που είναι αναγωγικά σάκχαρα (ελεύθερη αλδεϋδική ή κετονική ομάδα). Οι ξηροί οίνοι περιέχουν <2 (4)g/L σάκχαρα, οι ημίξηροι 4-18g/L, οι ημίγλυκοι g/l, οι γλυκείς > 40 g/l συνήθως g/l. Η γλυκύτητα των οίνων οφείλεται στα σάκχαρα που παραμένουν αζύμωτα. Τα αζύμωτα ζάχαρα εάν ζυμωθούν μεταγενέστερα όπως μετά την εμφιάλωση ο οίνος υφίσταται αλλοίωση. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι προσδιορισμού των αναγόντων σακχάρων. Κατά την ιωδιομετρική μέθοδο ή μέθοδος Lüff τα ανάγοντα σάκχαρα του οίνου ανάγουν το δισθενή χαλκό αλκαλικού διαλύματος. Η περίσσεια των ιόντων δισθενούς χαλκού προσδιορίζεται ιωδιομετρικά με προσθήκη ιωδιούχου καλίου. Τα ιωδιούχα ανάγουν τον δισθενή χαλκό σε μονοσθενή σε όξινο περιβάλλον και απελευθερώνεται ιώδιο. 2I + 2 Cu 2+ I Cu + Το ιώδιο που προκύπτει ογκομετρείται με θειοθειικό νάτριο, παρουσία δείκτη αμύλου. 2 2 I 2 + 2S 2 O 3 2I + S 4 O 6 Ο οίνος πρέπει να έχει διαυγαστεί, για να απομακρυνθούν άλλες ενώσεις του οίνου με αναγωγική δράση όπως φαινολικές ενώσεις (χρωστικές και τανίνες).

17 Προσδιορισμός ολικού στερεού υπολείμματος ή ολικού ξηρού εκχυλίσματος Ολικό στερεό υπόλειμμα ή ολικό ξηρό εκχύλισμα οίνου είναι το σύνολο των ενώσεων που υπό καθορισμένες φυσικές συνθήκες δεν είναι πτητικές. Οι συνθήκες καθορίζονται έτσι ώστε να συμβαίνει η μικρότερη δυνατή μεταβολή στις ενώσεις που αποτελούν το στερεό υπόλειμμα. Το ελεύθερο σακχάρων εκχύλισμα προκύπτει από τη διαφορά του ολικού ξηρού εκχυλίσματος και των ολικών σακχάρων. Οι ενώσεις που αποτελούν το στερεό υπόλειμμα του οίνου είναι σάκχαρα, οργανικά άλατα, φαινολικές ενώσεις, μη πτητικά οξέα και άλλες. Το στερεό υπόλειμμα εκφράζεται σε g/l και προσδιορίζεται με προσέγγιση περίπου 0,5 gr. Το στερεό υπόλειμμα του γλεύκους είναι g/l και των ξηρών οίνων g/l. Οι γλυκείς οίνοι έχουν υψηλότερα επίπεδα στερεού υπολείμματος επειδή περιέχουν υψηλά επίπεδα σακχάρων. Οι ερυθροί οίνοι έχουν υψηλότερα επίπεδα στερεού υπολείμματος από τους ροζέ, και αυτοί από τους λευκούς, επειδή έχουν μεγαλύτερες συγκεντρώσεις φαινολικών ενώσεων. Ο προσδιορισμός του στερεού υπολείμματος οίνων είναι χρήσιμος για τη διερεύνηση προσθήκης νερού, αλκοόλης ή σακχάρων. Προσδιορισμός τέφρας και αλκαλικότητας τέφρας Τέφρα καλείται το σύνολο των ανόργανων συστατικών που υπάρχουν μετά από αποτέφρωση των οργανικών συστατικών. Είναι μέτρο των ανόργανων συστατικών. Στην τέφρα του οίνου υπάρχει το σύνολο των κατιόντων, εκτός από το αμμώνιο. Η μέση σύσταση της τέφρας οίνου είναι: Κ 2 Ο 40%, Να 2 Ο 2%, ΜgΟ 3-6%, CaΟ 4-7%, Fe 2 O 3 1%, Αl 2 Ο 3 2-1%,Ρ 2 O 5 16%, S 2 O 3 10%, SiO 2 2-4%, CO 2 18%,Cl %, ΒO 3 ίχνη.

18 Η τέφρα του οίνου συνήθως βρίσκεται σε σταθερή αναλογία με το χωρίς σάκχαρα στερεό υπόλειμμα του οίνου και είναι το 1/10 αυτού. Ο προσδιορισμός της τέφρας είναι χρήσιμος στη διερεύνηση προσθήκης νερού, σακχάρων ή αλκοόλης (ενισχυμένοι οίνοι). Οι ερυθροί οίνοι έχουν υψηλότερα επίπεδα τέφρας από τους ροζέ, και αυτοί από τους λευκούς, επειδή με την εκχύλιση μεταφέρονται ανόργανα συστατικά από τις φλούδες στο ζυμούμενο γλεύκος και τον οίνο. Τα κύρια ανόργανα συστατικά του γλεύκους είναι το K και επίσης τα Na, Ca, Mg, φωσφορικά, θειικά. Τα επίπεδα των ανόργανων συστατικών του γλεύκους είναι 2-6 g/l (συνήθως 3-4 g/l). Τα επίπεδα των ανόργανων συστατικών στον οίνο είναι χαμηλότερα 1,5-4 g/l. Η μείωση οφείλεται στην καταβύθιση όξινου τρυγικού καλίου και τρυγικού ασβεστίου κατά την οινοποίηση και στην χρήση ανόργανων ενώσεων από τον ζυμομύκητα οινοποίησης. Αλκαλικότητα της τέφρας ή ολική αλκαλικότητα της τέφρας καλείται το σύνολο των κατιόντων, εκτός από το αμμώνιο, που είναι ενωμένα με τα οργανικά οξέα του οίνου. Κατά την αποτέφρωση τα άλατα των οργανικών οξέων του οίνου μετατρέπονται σε ανθρακικά άλατα που τα οποία έχουν αλκαλική αντίδραση. Ο προσδιορισμός της τέφρας και της αλκαλικότητας της τέφρας είναι χρήσιμος για τη διερεύνηση της κανονικότητας της σύστασης των οίνων ή της νοθείας τους. Η αλκαλικότητα της τέφρας πρέπει να διαφέρει λίγο από την τέφρα. Μεγάλη διαφορά μεταξύ τους και μάλιστα όταν η αλκαλικότητα της τέφρας είναι πολύ μικρότερη από την τέφρα, δείχνει μη φυσιολογικά αυξημένη ποσότητα σε ανόργανα ανιόντα. Πιθανόν να έχουν προστεθεί οξέα εάν η τέφρα είναι σε κανονικά επίπεδα. Αντίθετα εάν η τιμή της αλκαλικότητας της τέφρας είναι πολύ μεγαλύτερη τότε υπάρχει η περίπτωση να έχει εξουδετερωθεί η οξύτητα του κρασιού με προσθήκη CaCΟ 3 ή Na 2 CΟ 3.

19 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Αναλύσεις γλεύκους Προσδιορισμός σακχάρων Διαθλασιμετρία Στην οινολογία συνήθως χρησιμοποιούνται φορητά διαθλασίμετρα βαθμολογημένα σε βαθμούς Brix. 1 Brix ισοδυναμεί με 1% σακχάρων κατά βάρος. Πορεία Μετά από ανασήκωση του κινητού μέρους του διαθλασίμερου, τοποθετούνται 1-2 σταγόνες γλεύκους στο σταθερό πρίσμα. Κλείνεται το κινητό μέρος και γίνεται ανάγνωση του της τιμής. Το πρίσμα καθαρίζεται με νερό και χαρτί. Τα διαθλασίμετρα Brix είναι βαθμονομημένα στους 20 o C. Εάν η μέτρηση γίνει σε διαφορετική θερμοκρασία γίνεται διόρθωση της τιμής. Αραιομετρία Στην οινολογία συνήθως χρησιμοποιούνται αραιόμετρα Baumé. 1 ο Be ισοδυναμεί με περίπου 1,8 % σάκχαρα κατά βάρος. Πορεία Σε ογκομετρικό κύλινδρο προστίθενται αργά-αργά (να μην σχηματιστούν φυσαλίδες ή αφρός) 200 ml δείγματος γλεύκους. Ακολούθως, βυθίζεται προσεκτικά το αραιόμετρο και αφήνεται να ισορροπήσει. Σημειώνεται η ακριβής ένδειξη. Τα αραιόμετρα Baumé είναι βαθμονομημένα στους 20 o C. Εάν η μέτρηση γίνει σε διαφορετική θερμοκρασία γίνεται διόρθωση της τιμής. Προσδιορισμός ολικής οξύτητας Από ποσότητα οίνου γίνεται απομάκρυνση του διοξειδίου του άνθρακα με χρήση φιάλης κενού και υπό ανάδευση για περίπου 1-2 min. Ακολούθως σε κωνική φιάλη προστίθενται 30 ml απ. νερού (προηγουμένως έχει θερμανθεί μέχρις βρασμού), 1 ml διαλύματος μπλε της βρωμοφαινόλης και 10 ml γλεύκους από το οποίο έχει αφαιρεθεί το διοξείδιο του άνθρακα όπως αναφέρεται παραπάνω. Στη συνέχεια γίνεται ογκομέτρηση με 0,1 Ν NaOH, μέχρι την αλλαγή

20 του χρώματος (κυανοπράσινη χροιά). Σημειώνονται τα ml του 0,1 Ν NaOH (έστω n). Η ολική οξύτητα, με ένα δεκαδικό, προκύπτει από τη σχέση N1V1=N2V2. Σε meq/l είναι Α=10 η, και εκφράζεται με ένα δεκαδικό. Επίσης, η ολική οξύτητα εκφράζεται σε τρυγικό οξύ, που είναι το κύριο οξύ στο γλεύκος και οίνο. Σε g/l προκύπτει με πολλαπλασιασμό των meq με το 0,075, και εκφράζεται με δύο δεκαδικά. Το τρυγικό οξύ είναι δικαρβοξυλικό οξύ με ΜΒ 150,087. Επίσης, ο προσδιορισμός της ολικής οξύτητας έχει περιγραφεί στο στις σημειώσεις βασικών αναλύσεων οίνου υποχρεωτικού Εργαστηρίου Ανάλυσης και Τεχνολογίας Τροφίμων (δίδονται οι σημειώσεις). Προσδιορισμός θειώδη ανυδρίτη Στο εργαστήριο ο προσδιορισμός του ολικού και ελεύθερου θειώδη ανυδρίτη θα γίνει όπως έχει περιγραφεί στο στις σημειώσεις βασικών αναλύσεων οίνου υποχρεωτικού Εργαστηρίου Ανάλυσης και Τεχνολογίας Τροφίμων (δίδονται οι σημειώσεις). Αναλύσεις Οίνου Προσδιορισμός αναγωγικών σακχάρων Διαύγαση οίνου Σε ογκομετρικό κύλινδρο φέρονται 100 ml οίνου και προστίθεται 1g ή παραπάνω λεπτόκοκκου ενεργού άνθρακα (η αναλογία ποικίλει ανάλογα με την ικανότητα προσρόφησης του άνθρακα αλλά και τον οίνο). Αν το δείγμα δεν διαυγάσει με την πρώτη εφαρμογή, ακολουθεί και δεύτερη. Ακολουθεί ανάδευση και ηρεμία για 1-2 λεπτά ή περισσότερο. Ο χρόνος παραμονής είναι ανάλογος της συγκέντρωσης των χρωστικών που περιέχονται στον οίνο και δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 10 λεπτά γιατί υπάρχει κίνδυνος ο ενεργός άνθρακας να προσροφήσει και μέρος των σακχάρων. Στη συνέχεια γίνεται διήθηση σε πτυχωτό ηθμό. Κατά τον

21 αποχρωματισμό των ερυθρών οίνων ενδείκνυται προσθήκη μικρής ποσότητας λεπτόκοκκου ενεργού άνθρακα στη βάση του ηθμού. Προσδιορισμός σακχάρων Σε εσμυρισμένη κωνική φιάλη των 300 ml προστίθενται 25 ml αλκαλικού διαλύματος χαλκού και χ ml αποχρωματισμένου οίνου και 25-χ ml νερού σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα (πρέπει να περιέχουν λιγότερο από 60 mg αναγωγικών σακχάρων, εκφρασμένα σε ιμβεροσάκχαρο). Προστίθενται 3-4 πέτρες βρασμού και η φιάλη προσαρμόζεται σε κάθετο ψυκτήρα. Πίνακας. Συσχέτιση της συγκέντρωσης σακχάρων με την αραίωση για τον προσδιορισμό. Ποσότητα οίνου Αραιώσεις 25 ml 20 ml 10 ml 5 ml 20 ml 200 ml 20 ml 10 ml 200 ml 20 ml 10 ml 200 ml 10 ml 10 ml 200 ml 5 ml Σάκχαρα Συντελεστής διαίρεσης < 2 g/l 25 < 3 g/l 20 < 6 g/l 10 < 12 g/l 5 < 30 g/l 2 < 60 g/l 1 < 120 g/l 0,5 < 240 g/l 0,25 Το μίγμα φέρεται σε βρασμό εντός 2 λεπτών και ο βρασμός συνεχίζεται ακόμα για 10 λεπτά ακριβώς. Στη συνέχεια η φιάλη απομακρύνεται και

22 ψύχεται με τρεχούμενο νερό. Ακολουθεί προσθήκη 10 ml ιωδιούχου καλίου 30% και 25 ml θειικού οξέος 25% (προσεκτικά και αργά επειδή αφρίζει). Η ογκομέτρηση γίνεται με θειοθειικό νάτριο 0,1N. Όταν εξασθενήσει αρκετά το καφέ χρώμα του ιωδίου, προστίθενται 2 ml δείκτη αμύλου και συνεχίζεται η ογκομέτρηση μέχρι την αλλαγή του χρώματος σε γαλακτώδες. Σημειώνονται τα ml Na 2 S 2 O 3 που καταναλώθηκαν (n). Παράλληλα με την ογκομέτρηση του δείγματος γίνεται και ογκομέτρηση μάρτυρα. Για τον μάρτυρα στη θέση των 25mL αποχρωματισμένου οίνου προστίθενται 25mL νερού. Σημειώνονται τα ml Na 2 S 2 O 3 που καταναλώθηκαν (n ). Η συγκέντρωση των αναγωγικών σακχάρων προκύπτει από πίνακα με βάση τη διαφορά n -η, και εκφράζεται σε ιμβερτοσάκχαρο. Το τελικό αποτέλεσμα εκφράζεται σε g/l οίνου, αφού ληφθεί υπόψη ο αρχικός όγκος του δείγματος και τυχόν αραιώσεις που έγιναν κατά τον αποχρωματισμό. Πίνακας. Αντιστοιχία των (n -η) ml του διαλύματος Na 2 S 2 O 3 0,1N και της περιεκτικότητας των αναγόντων σακχάρων σε mg. Na 2 S 2 O 3 0,1N (n- n ) ml Ανάγοντα σάκχαρα (mg) Διαφορά Na 2 S 2 O 3 0,1N (n- n ) ml Ανάγοντα σάκχαρα (mg) Διαφορά 1 2, ,0 2,7 2 4,8 2, ,7 2,7 3 7,2 2, ,5 2,8 4 9,7 2, ,3 2,8 5 12,2 2, ,2 2,9 6 14,7 2, ,1 2,9 7 17,2 2, ,0 2,9 8 19,8 2, ,0 3,0 9 22,4 2, ,0 3, ,0 2, ,1 3, ,6 2, ,2 3, ,3 2,7

23 Προσδιορισμός ολικού στερεού υπολείμματος ή ολικού ξηρού εκχυλίσματος Άμεση μέθοδος Η μέθοδος βασίζεται στην εξάτμιση οίνου σε υδατόλουτρο C και προσδιορισμό του υπολείμματος με ζύγιση (σταθμική μέθοδος). Τα αποτελέσματα που προκύπτουν είναι μικρότερα από εκείνα της έμμεσης μεθόδου επειδή απομακρύνονται πτητικά συστατικά (απώλεια βάρους). Πορεία Μεταφέρονται 20 ml οίνου, που έχουν μετρηθεί με σιφώνιο, σε προζυγισμένη κάψα από λευκόχρυσο, κυλινδρική με επίπεδο πυθμένα. Εναλλακτικά χρησιμοποιείται κάψα από νικέλιο. Η κάψα τοποθετείται σε υδατόλουτρο C (κλείνει το άνοιγμα του καλύμματος) και ο βρασμός διατηρείται επί 1,5 ώρα (εξατμίζεται η υγρή φάση). Στη συνέχεια η κάψα μεταφέρεται με μεταλλική λαβίδα σε ξηραντήρα. Αφού κρυώσει η κάψα ζυγίζεται. Από τη διαφορά των βαρών της κάψας και της κάψας με το στερεό υπόλειμμα υπολογίζεται το ολικό στερεό υπόλειμμα του οίνου σε g/l οίνου, και εκφράζεται με ένα δεκαδικό. Έμμεση μέθοδος Με την έμμεση μέθοδο το ολικό στερεό υπόλειμμα υπολογίζεται από το ειδικό βάρος του ελεύθερου αλκοόλης οίνου. Το ειδικό βάρος του ελεύθερου αλκοόλης οίνου υπολογίζεται από τη σχέση dr = dv da +1,000 Όπου dv = το ειδικό βάρος του οίνου στους 20 o C, διορθωμένη σε σχέση με την πτητική οξύτητα, σύμφωνα με τη σχέση Dv =D 0, a, όπου a η πτητική οξύτητα, και da = το ειδικό βάρος στους 20 o C μίγματος νερού αλκοόλης που έχει την ίδια αλκοολική ισχύ με τον οίνο.

24 Από το ειδικό βάρος του ελεύθερου αλκοόλης οίνου (dr) προκύπτει το ολικό ξηρό εκχύλισμα με χρήση Πίνακα. Το ολικό ξηρό εκχύλισμα εκφράζεται σε g/l με ένα δεκαδικό. Πορεία Μετράται με αραιόμετρο το ειδικό βάρος του οίνου. Στη συνέχεια γίνεται απόσταξη 200 ml οίνου και λαμβάνονται τουλάχιστον 133 ml (σωστότερα 150 ml) αποστάγματος. Το απόσταγμα συμπληρώνεται στα 200 ml με απ. νερό, και έτσι λαμβάνεται μίγμα νερού αλκοόλης που έχει την ίδια αλκοολική ισχύ με τον οίνο. Μετράται το ειδικό βάρος του μίγματος νερού αλκοόλης. Πίνακας. για τον υπολογισμό του ολικού ξηρού εκχυλίσματος οίνου (gr/l).

25 Προσδιορισμός τέφρας και αλκαλικότητας τέφρας Ο προσδιορισμός της τέφρας γίνεται με από αποτέφρωση των οργανικών συστατικών του οίνου στους C (πλήρης καύση του άνθρακα). Η τέφρα εκφράζεται σε g/lμε προσέγγιση 0,03 g. Πορεία Σε προζυγισμένο χωνευτήριο από λευκόχρυσο, φέρονται 20 ml οίνου. Ακολουθεί εξάτμιση σε υδατόλουτρο 100 ο C (εξάτμιση υγρού), και στη συνέχεια θέρμανση σε θερμαντική πλάκα στους 200 o C, μέχρι να μην παράγονται ατμοί. Το χωνευτήριο τοποθετείται σε ηλεκτρικό φούρνο στους 525 ± 25 ο C για 15 min. Ακολούθως, το χωνευτήριο απομακρύνεται από το φρούρνο και προστίθενται 5 ml απ. νερού, και γίνεται εξάτμιση σε υδατόλουτρο. Στη συνέχεια το χωνευτήριο τοποθετείται ξανά στο φούρνο για 10 min. Εάν δεν επιτευχθεί πλήρης καύση του άνθρακα, η παραπάνω διαδικασία επαναλαμβάνεται. Μετά αποκατάσταση θερμοκρασίας περιβάλλοντος, το χωνευτήριο με την τέφρα ζυγίζεται. Από τη διαφορά των βαρών του χωνευτηρίου με την τέφρα και του κενού χωνευτηρίου υπολογίζεται η τέφρα του οίνου. Η τέφρα εκφράζεται σε g/l με δύο δεκαδικά. Ο προσδιορισμός της αλκαλικότητας της τέφρας γίνεται με ογκομέτρηση με NaOH της τέφρας του οίνου μετά από διαλυτοποίησή της με θειικό οξύ εν θερμώ. Πορεία Στο χωνευτήριο λευκόχρυσου που περιέχει την τέφρα των 20 ml οίνου προστίθενται 10 ml H 2 SO 4 0,1N. Το χωνευτήριο μεταφέρεται σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας C όπου παραμένει για περίπου 15 λεπτά, ενώ τα συσσωματώματα της τέφρας θραύονται με μια γυάλινη ράβδο για να επιταχυνθεί η διάλυση. Στη συνέχεια το περιεχόμενο του χωνευτηρίου μεταφέρεται σε κωνική φιάλη, στην οποία έχει τοποθετηθεί γυάλινο χωνί με ηθμό. Γίνεται ογκομέτρηση της περίσσειας του θειικού οξέος με 0,1N NaOH. Ως δείκτης χρησιμοποιείται το πορτοκαλόχρουν του μεθυλίου με το χρώμα να αλλάζει σε κίτρινο.

26 H αλκαλικότητα της τέφρας εκφράζεται σε meq/l με ένα δεκαδικό και προκύπτει από τη σχέση: A= 5(10-n), όπου n=ο αριθμός των ml NaOH 0,1N. Εναλλακτικά, η αλκαλικότητα της τέφρας εκφράζεται σε g K 2 CO 3 /L με δύο δεκαδικά και προκύπτει από τη σχέση: Α=0,345(10-n), όπου n=ο αριθμός των ml NaOH 0,1N.

27 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 2 ΧΡΩΜΑΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΚΑΙ ΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΟΙΝΩΝ Ιωάννης Ρούσσης Οκτώβριος 2018 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Χρώμα Οίνου Το χρώμα του οίνου είναι σημαντικός παράγοντας ποιότητας των οίνων. Οφείλεται, κυρίως, στις ανθοκυάνες, στις ταννίνες και άλλες φαινολικές ενώσεις. Ακριβής αποτίμηση του χρώματος του οίνου μπορεί να γίνει με χρωματόμετρο. Επίσης, εκτίμηση του χρώματος του οίνου μπορεί να γίνει με φωτόμετρο. Το φάσμα των ερυθρών οίνων παρουσιάζει ένα μέγιστο στα 520 nm, που οφείλεται στο κόκκινο χρώμα των ανθοκυανών. Με την παλαίωση των ερυθρών οίνων οι ανθοκυάνες καθιζάνουν είτε σχηματίζουν με ταννίνες σύμπλοκα έγχρωμα (όπως κεραμιδί) είτε άχρωμα. Έτσι, το μέγιστο στα 520 nm μειώνεται, ενώ συμμετέχει και η απορρόφηση στα 620 nm που αποτιμά το μωβ χρώμα. Η απορρόφηση στα 420 nm οφείλεται κυρίως σε διάφορες ταννίνες. Η εκτίμηση του χρώματος των λευκών οίνων γίνεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 420 nm, που αποτιμάται το κίτρινο χρώμα. Η απορρόφηση ενός λευκού οίνου στα 420 nm (γενικά στην περιοχή nm) είναι ανάλογη του βαθμού οξείδωσής του. Για την εκτίμηση του χρώματος των λευκών οίνων, μετράται η απορρόφηση διαυγούς οίνου στα 420 nm. Για τους ερυθρούς οίνους, συνήθως μετράται η απορρόφηση διαυγούς οίνου στα 420 και 520 nm. Η ένταση του χρώματος του χρώματος = Α420 nm + Α 520 nm, και η απόχρωση = Α420 nm /Α520 nm.

28 Επίσης, μετράται η απορρόφηση στα 420, 520 και 620 nm. Στην περίπτωση αυτή ένταση = Α420 nm + Α520 nm + Α620 nm. Χρώμα και φαινολικά συστατικά Το χρώμα είναι σημαντικός παράγοντας ποιότητας των οίνων. Οφείλεται στις ανθοκυάνες, τις τανίνες και άλλες φαινολικές ενώσεις. Επίσης, φαίνεται ότι υπάρχει σχέση μεταξύ χρώματος και αρώματος και γεύσης των οίνων. Χρώμα άτονο δηλώνει την ύπαρξη μέτριου αρώματος, ενώ έντονο χρώμα έντονο άρωμα. Ζωηρές χροιές δηλώνουν γευστική φρεσκάδα, ενώ άτονες χροιές πλαδαρότητα γεύσης. Στους ερυθρούς οίνους έντονες κόκκινες χροιές δηλώνουν νεότητα, η συνύπαρξη καστανών και κεραμίδι χροιών δείχνει γήρανση, και οι μπλε χροιές πολύ νέο κρασί. Στους λευκούς οίνους, η ένταση του κίτρινου χρώματος δείχνει ωριμότητα του οίνου, ενώ είναι και μέτρο της οξείδωσης του οίνου. Η παρατήρηση του χρώματος και της χροιάς του οίνου γίνεται σε ποτήρι με κλίση μπροστά σε λευκό φόντο, και με ένα καθαρό και δυνατό φωτισμό. Φαινολικά Συστατικά Οίνων Οι φαινολικές ενώσεις των οίνων διακρίνονται σε φλαβονοειδή και μη φλαβονοειδή. Στα φλαβονοειδή, που έχουν σκελετό C6-C3-C6, ανήκουν οι ανθοκυάνες, οι φλαβανόλες (κατεχίνες) και οι φλαβονόλες. Τα μη φλαβονοειδή είναι κυρίως τα βενζοικά οξέα, με σκελετό C6-C1, και τα υδροξυκινναμωμικά οξέα, με σκελετό C6-C3. Οι ανθοκυάνες είναι οι κόκκινες χρωστικές, ενώ οι φλαβανόλες υπάρχουν και ως ολιγομερή και πολυμερή που καλούνται συμπυκνωμένες ταννίνες ή προανθοκυανιδίνες (λευκοανθοκυάνες η προκυανιδίνες). Οι ανθοκυάνες είναι οι ερυθρές χρωστικές των σταφυλιών, και είναι ετεροζαχαρίτες. Στα κρασιά οι ανθοκυάνες αντιδρούν με το θειώδη ανυδρίτη με αποτέλεσμα το μερικό αποχρωματισμό. Επίσης, ενώνονται με ταννίνες παρουσία οξυγόνου. Κατά την παλαίωση με την ένωση ανθοκυανών-ταννινών σχηματίζονται έγχρωμες, άχρωμες η πορτοκαλόχρωμες. Στο κρασί η ισορροπία των μορφών των ανθοκυανών είναι συνάρτηση

29 του ph. Η συγκέντρωση των ανθοκυανών στους νέους οίνους είναι της τάξης των 400 mg/l, ενώ στους παλαιωμένους της τάξης των 90 mg/l. Οι ανθοκυάνες με δύο υδροξύλια σε ο-θέση αντιδρούν με τρισθενή σίδηρο προς σύμπλοκα κυανού χρώματος, αντίδραση που ευνοείται σε λιγότερο όξινο περιβάλλον. Η μεταβολή του χρώματος των ερυθρών οίνων μετά την οινοποίηση πιθανόν σχετίζεται με την οξείδωση του Fe II σε Fe III και τον σχηματισμό του συμπλόκου. Επίσης, το θόλωμα σιδήρου των ερυθρών οίνων με σχηματισμό συμπλόκων του Fe III με ανθοκυάνες και ταννίνες πιθανόν σχετίζεται με τον παραπάνω σχηματισμό του συμπλόκου. Οι ανθοκυάνες με αντίδραση με τα όξινα θειώδη ιόντα μετατρέπονται σε άχρωμες ενώσεις. Η αντίδραση είναι αμφίδρομη. Με προσθήκη θειώδη ανυδρίτη λαμβάνει χώρα αποχρωματισμός του οίνου, και το χρώμα του οίνου επανέρχεται προοδευτικά. Οι ανθοκυάνες μπορούν να αποχρωματιστούν με αναγωγή, αντίδραση που ευνοείται σε ισχυρά όξινο ph και είναι αμφίδρομη. Ο ασθενής χρωματισμός του οίνου μετά την αλκοολική ζύμωση, που είναι αναγωγικό φαινόμενο, πιθανόν να σχετίζεται με την αναγωγή των ανθοκυανών. Κατά την παλαίωση η συγκέντρωση των ανθοκυανών μειώνεται. Οι ταννίνες, ανάλογα με τη δομή τους, διακρίνονται στις συμπυκνωμένες και στις υδρολυόμενες ταννίνες. Οι συμπυκνωμένες ταννίνες είναι οι φυσικές ταννίνες των σταφυλικών και των οίνων. Σχηματίζονται με πολυμερισμό της φλαβανόλης-3 (κατεχίνη) και κυρίως της φλαβανοδιόλης-3,4 (λευκοανθοκυανιδίνη). Οι

30 συνήθεις ταννίνες του σταφυλιού είναι ολιγομερή με 2 μέχρι μονομερή. Οι ταννίνες των σταφυλιών βρίσκονται στα στερεά, αλλά στον οίνο μεταφέρεται μόνο μικρό τους μέρος. Η συγκέντρωσή τους στους ερυθρούς οίνους είναι 1,5-4 g/l και στους λευκούς mg/l. Οι υδρολυόμενες ταννίνες αποτελούνται από ένα ζάχαρο, όπως γλυκόζη, με το οποίο ενώνονται φαινολικές ενώσεις. Αυτές είναι κυρίως το γαλλικό οξύ και το ελλαγικό οξύ (διμερές του γαλλικού οξέος). Οι υδρολυόμενες ταννίνες δεν βρίσκονται στο σταφύλι, αλλά προέρχοντα από τις κύριες εμπορικές ταννίνες που χρησιμοποιούνταις τις κατεργασίες των οίνων και από το ξύλο του βαρελιού. Οι ανθοκυάνες και οι ταννίνες καθορίζουν το χρώμα των οίνων. Το χρώμα των νέων ερυθρών οίνων οφείλεται στις ανθοκυάνες. Δεν συμβαίνει το ίδιο για το χρώμα των παλαιωμένων οίνων, που οι ταννίνες παίζουν σημαντικό ρόλο. Πάντως, παράμετροι όπως το ph, το οξυγόνο και ο σίδηρος παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του χρώματος. Οι ταννίνες προέρχονται από πολυμερισμό των κατεχινών και των προκυανιδινών, και από το βαρέλι. Οι ταννίνες έχουν πικρή γεύση και δίνουν στα κρασιά στυφίλα. Η στυφίλα προκαλείται με ένωση των ταννινών με τις πρωτείνες του σάλιου. Έτσι, το σάλιο δεν δρά ως λιπαντικό (ύγρανση του στόματος). Επίσης, οι ταννίνες επιδρούν στους βλεννογόνους που εκκρίνουν σάλιο, που τελικά φράσσονται. Το στόμα ξηραίνεται, στεγνώνει και σκληραίνει. Στο κρασί όλες οι στυφές ουσίες είναι ταννίνες. Όλες οι ταννίνες του κρασιού δεν έχουν την ίδια χημική σύνθεση ούτε τον ίδιο βαθμό πολυμερισμού. Από το βαθμό πολυμερισμού, πάντως, εξαρτάται η δράση τους. Οι μαλακές ταννίνες προσδίνουν όγκο και σώμα στο κόκκινο κρασί, ενώ οι επιθετικές προσδίνουν στυφότητα. Οι επιθετικές ταννίνες είναι μοριακού βάρους Κατά την παλαίωση σε ξύλινο βαρέλι σχηματίζονται, με την επίδραση του οξυγόνου, μεγάλα πολυμερή. Μέθοδοι προσδιορισμού φαινολικών συστατικών Για προσδιορισμό των ολικών φαινολικών συστατικών συχνά χρησιμοποιείται η μέθοδος Folin. Η μέθοδος Folin-Ciocalteu χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό ολικών φαινολικών σε οίνους. Γενικά η Folin είναι μέθοδος αποτίμησης αντιοξειδωτικής δράσης. Την ίδια αντίδραση δίνουν κυρίως αντιοξειδωτικά όπως φαινολικά, και άλλα συστατικά όπως ανάγοντα σάκχαρα και νουκλεινικά

31 οξέα. Ο θειώδης ανυδρίτης και το ασκορβικό οξύ που προστίθενται στους οίνους αντιδρούν σε κάποιο βαθμό. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην οξείδωση των αντιοξειδωτικών σε αλκαλικό περιβάλλον με μίγμα φωσφοβολφραμικού και φωσφομολυβδαινικού οξέος. Τα οξέα ανάγονται σε μίγμα κυανών οξειδίων του βολφραμίου (W 8 Ο 23 ) και του μολυβδαινίου (Мо 8 О 23 ). Η ένταση του κυανού χρώματος, με μέγιστο στα nm, είναι ανάλογη των φαινολικών συστατικών. Μέτρο των ολικών φαινολικών αποτελεί η απορρόφηση στα 280 nm. Η απορρόφηση στα 320 nm αποτελεί μέτρο των υδροξυκινναμωμικών, η απορρόφηση στα 360 nm των φλαβονολών και στα 520 nm των ανθοκυανών. Οι φλαβανόλες-3 (κατεχίνες) προσδιορίζονται με αντίδραση με π- διμεθυλαμινοκινναμαλδεύδη και μέτρηση της απορρόφησης στα 640 nm. Οι ανθοκυάνες προσδιορίζονται με αποχρωματισμό με όξινο θειώδες και μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. Τα διάφορα φαινολικά συστατικά συχνά προσδιορίζονται με υγρή χρωματογραφία και ανιχνευτή ορατού-υπεριώδους. Συχνά, για τον ποσοτικό προσδιορισμό του συνόλου των ανθοκυανών χρησιμοποιούνται οι ιδιότητές τους α) να παρουσιάζουν αλλαγή χρώματος με μεταβολή του ph, και β) να σχηματίζουν άχρωμες ενώσεις με όξινα θειώδη ιόντα. Και στις δύο μεθόδους ακολουθεί μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. Επίσης, η άμεση μέτρηση της απορρόφηση του οίνου στα 520 nm είναι μέτρο του συνόλου των ανθοκυανών.

32 Ο φωτομετρικός προσδιορισμός των ταννινών βασίζεται στην ιδιότητά τους να μετατρέπονται μερικώς σε ανθοκυάνες με θέρμανση σε όξινο περιβάλλον. Οι παραγόμενες ανθοκυάνες προσδιορίζονται με μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Χρωματικά Χαρακτηριστικά Οίνων Για τους ερυθρούς και ροζέ οίνους, συνήθως μετράται η απορρόφηση στα 420 και 520 nm. Η ένταση του χρώματος = Α420 nm + A 520 nm, και η απόχρωση = Α420 nm / Α520 nm. Επίσης, μετράται η απορρόφηση στα 420, 520 και 620 nm. Στην περίπτωση αυτή Ένταση = Α420 nm + Α520 nm + Α620 nm. Ο διαυγής ερυθρός οίνος, εάν χρειάζεται, αραιώνεται με νερό με ph ίδιο με τον οίνο (η ρύθμιση του ph γίνεται με ασθενές κιτρικό οξύ και ρυθμιστικό φωσφορικών). Χρησιμοποιούνται κυψελίδες του 1 cm, ενώ το φωτόμετρο μηδενίζεται με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Το εύρος των τιμών απορρόφησης που είναι αποδεκτό είναι 0,3-0,7. Εάν οι απορροφήσεις είναι μεγαλύτερες, όπως στους ερυθρούς οίνους, χρησιμοποιούνται κυψελίδες του 1 mm, και το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται χ 10. Η ένταση και η απόχρωση του οίνου υπολογίζονται από τους παραπάνω τύπους και εκφράζονται σαν καθαροί αριθμοί με τρία δεκαδικά ψηφία. Για την εκτίμηση του χρώματος των λευκών οίνων, μετράται η απορρόφηση του διαυγούς οίνου στα 420 nm. Χρησιμοποιούνται

33 κυψελίδες του 1 cm, ενώ το φωτόμετρο μηδενίζεται με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Φαινολικά Συστατικά Οίνων Δείκτης φαινολικών Η αποτίμηση των φαινολικών ενώσεων με βάση την απορρόφηση στα 280 nm, βασίζεται στο ότι οι βενζολικοί δακτύλιοι των φαινολικών ενώσεων απορροφούν στο υπεριώδες με μέγιστο περίπου στα 280 nm. Για τη μέτρηση χρησιμοποιείται διαυγής οίνος (ή γλεύκος), που αραιώνεται κατάλληλα με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Μετράται η απορρόφηση στα 280 nm με κυψελίδες χαλαζία του 1 cm. Ο μηδενισμός του φασματοφωτομέτρου γίνεται με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Ο Δείκτης Φαινολικών (ΔΦ) = Απορρόφηση χ Αραίωση του οίνου. Δείκτης Folin Ολικά φαινολικά Σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml, φέρονται 0,1 ml ερυθρού οίνου (αραιωμένου 5 φορές ή με άλλη κατάλληλη αραίωση), 5 ml απ. νερού, 0,5 αντιδραστηρίου Folin, 2 ml 20 % άνυδρου ανθρακικού νατρίου. Γίνεται συμπλήρωση με απ. νερό. Ακολουθεί ανάμιξη για διάλυση, και παραμονή για 30 min (30-45 min). Μετράται η απορρόφηση στα 750 nm με κυψελίδα 1 cm, με μηδενισμό του οργάνου με το τυφλό. Οι μετρήσεις της απορρόφησης πρέπει να γίνονται σε σταθερό χρόνο για όλα τα δείγματα καθόσον το παραγόμενο χρώμα εξελίσσεται με το χρόνο. Το τυφλό παρασκευάζεται με την ίδια όπως παραπάνω διαδικασία χρησιμοποιώντας απ. νερό στη θέση του οίνου. Εάν η απορρόφηση δεν είναι στην περιοχή του 0,3 πρέπει να γίνει η κατάλληλη Στην περίπτωση των λευκών οίνων χρησιμοποιείται ο οίνος ως έχει (χωρίς αραίωση). Ο δείκτης Folin προκύπτει με πολλαπλασιασμό της απορρόφησης στα 750 nm x 20 (εμπειρικός συντελεστής) x την αραίωση του δείγματος. Επίσης, γίνεται προσδιορισμός των ολικών φαινολικών και εκφράζονται σε γαλλικό οξύ. Η συγκέντρωση των ολικών φαινολικών προκύπτει από πρότυπη καμπύλη γαλλικού οξέος, και εκφράζεται σε mg/l γαλλικού

34 οξέος. Τυπική εξίσωση: C=833 χ Α, όπου С η συγκέντρωση και Α η απορρόφηση. Φάσμα υπεριώδους και ορατού Η αποτίμηση των επιπέδων ομάδων φαινολικών συστατικών μπορεί να γίνει με λήψη φάσματος στο υπεριώδες. Η απορρόφηση στα 280 nm είναι μέτρο των ολικών φαινολικών, στα 320 nm των υδροξυκιναμμωμικών, και στα 360 nm των φλαβονολών. Μετά από κατάλληλη αραίωση του δείγματος λαμβάνεται το φάσμα υπεριώδους στο φασματοφωτόμετρο. Επίσης, μπορεί να ληφθεί και το φάσμα στο ορατό, που σχετίζεται με το χρώμα του οίνου (420 nm, 520 nm, 620 nm). Προσδιορισμός ταννινών φωτομετρικά Ο φωτομετρικός προσδιορισμός των ταννινών βασίζεται στην ιδιότητά τους να μετατρέπονται μερικώς σε ανθοκυάνες με θέρμανση σε όξινο περιβάλλον. Οι παραγόμενες ανθοκυάνες προσδιορίζονται με μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. Σε δοκιμαστικούς σωλήνες φέρονται 4 ml οίνου (αραιωμένου 50 φορές), 2 ml απεσταγμένο νερό και 6 ml π. HCl (12 Ν). Γίνεται θέρμανση σε αμμόλουτρο στους 100 ο C για 30 min. Ακολουθεί ψύξη με τρεχούμενο νερό, αφού προηγουμένως ο σωλήνας περιτυλιχθεί με σκοτεινόχρωμο περίβλημα. Αυτό επειδή οι ανθοκυάνες είναι ασταθείς στο φώς. Προστίθενται 1 ml αιθανόλης, για να σταθεροποιήσει και να κάνει πιο έντονο το χρώμα. Μετράται η απορρόφηση στα 550 nm με κυψελίδα 1 cm, με τυφλό απεσταγμένο νερό. Για τυφλό της μεθόδου γίνεται η ίδια διαδικασία χωρίς τη θέρμανση. Η συγκέντρωση ταννινών σε g/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Τυπική εξίσωση : C = 19,33 χ ΔΑ, όπου C η συγκέντρωση και ΔΑ η διαφορά απορροφήσεων του δείγματος και του τυφλού. Προσδιορισμός ανθοκυανών με αποχρωματισμό με όξινο θειώδες Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα των ανθοκυανών να δίνουν με το ιόν SO 3 H - άχρωμες ενώσεις. Στην περίπτωση αυτή πρέπει να θεωρηθεί ότι τα άλλα συστατικά του οίνου δεν συμμετέχουν και η αλλαγή του χρώματος, μετά την προσθήκη ικανής περίσσειας όξινου θειώδους άλατος, είναι ανάλογη προς την περιεκτικότητα των ανθοκυανών. Σε 1 ml οίνου προστίθεται 1 ml αιθανόλης που περιέχει 0,1 % π. HC1

35 και 20 ml 2% HC1. Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 10 ml από το παραπάνω μίγμα και 4 ml 15% όξινου θειώδους νατρίου που προκαλεί άμεσο αποχρωματισμό του οίνου. Σε ένα δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 10 ml από το μίγμα και 4 ml απεσταγμένο νερό. Μετά από παραμονή 20 λεπτών, μετράται η απορρόφηση στα 520 nm, με κυψελίδα 1 cm και τυφλό απεσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση των ανθοκυανών σε mg/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Τυπική εξίσωση: C=875 χ ΔΑ, όπου С η συγκέντρωση και ΔΑ η διαφορά των απορροφήσεων στις δύο περιπτώσεις.

36 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 3 ΕΛΕΓΧΟΣ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ ΟΙΝΩΝ ΕΙΔΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΟΙΝΩΝ Ιωάννης Ρούσσης Οκτώβριος 2018 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Σταθερότητα οίνων Η σταθερότητα των οίνων αφορά την κατάσταση των οίνων κατά τη διατήρησή του. Γενικά, οίνοι που έχουν κατεργαστεί σωστά (σταθεροποιηθεί) δεν θα παρουσιάσουν φυσικοχημική, μικροβιακή ή οργανοληπτική αλλαγή και κατά συνέπεια αλλοίωση. Πάντως, δεν καθορίζεται η διάρκεια ζωής των οίνων, και επίσης η σταθερότητα των οίνων εξαρτάται από τις συνθήκες διατήρησης. Για τη σταθερότητα των οίνων έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιούνται δοκιμές σταθερότητας των οίνων, που αναφέρονται σε κανονικές συνθήκες διατήρησης. Οι δοκιμές σταθερότητας γίνονται πριν την εμφιάλωση των οίνων. Επίσης, η οργανοληπτική δοκιμασία συνεισφέρει στην αποτίμηση της σταθερότητας. Στους οίνους υπάρχουν υδρόφιλα και υδρόφοβα κολλοειδή. Τα θετικά φορτισμένα με τα αρνητικά φορτισμένα κροκιδώνονται. Παράδειγμα σιδηροκυανιούχος σίδηρος (-) και ζελατίνη (+). Όσον αφορά στα προστατευτικά κολλοειδή, το υδρόφιλο τυλίγει υδρόφοβο του ίδιου φορτίου. Η σταθερότητα των κολλοειδών εξαρτάται από την προσρόφηση ιόντων και διαλύτη. Τα κολλοειδή είναι προσροφητικά και έχουν την ικανότητα να συμπαρασύρουν διάφορα συστατικά. Με ζωικό άνθρακα απομακρύνονται ταννίνες, χρωστικές, πρωτείνες. Με μπεντονίτη απομακρύνονται πρωτείνες.

37 Στους οίνους συμβαίνει καταβύθιση μη μεταλλικών και μεταλλικών ενώσεων. Επίσης, υπάρχουν μικροβιακά θολώματα. Καταβύθιση μη μεταλλικών ενώσεων 1. Χρωστικές -- ανθοκυάνες + πρωτείνες. Οι χρωστικές απομακρύνονται με αλβουμίνη και οι πρωτείνες με μπεντονίτη. 2. Προιόντα οξείδωσης πολυφαινόλες κινόνες πολυμερισμός 3. Πρωτεΐνες στα ερυθρά κρασιά καταβύθιση πρωτεινών με ταννίνες. Απομάκρυνση με καταβύθιση πρωτεινών με μπεντονίτη. 4. Τρυγικά άλατα: όξινο τρυγικό κάλι, τρυγικό ασβέστιο. 5. Άλλα άλατα: βλενικό αβέστιο (φαιά σήψη). Οξαλικό ασβέστιο. Καταβύθιση μεταλλικών ενώσεων Θολώματα σιδήρου Fe II Fe III Fe (OH)3 Fe III + Φωσφορικά Φωσφορικός σίδηρος (κολλοειδές -) που με ιόντα ασβεστίου, καλίου, πρωτείνες (+) Λευκό θόλωμα. Fe III + ταννίνες - σύμπλοκο σιδήρου-ταννινών (κολλοειδές -) που με ιόντα ασβεστίου, καλίου, πρωτείνες (+) Κυανού θόλωμα. Θόλωμα χαλκού --θειούχος χαλκός σε κολλοειδή μορφή --μεταλλικός χαλκός σε κολλοειδή μορφή πιθανόν θειούχος χαλκός/χαλκός+πρωτείνη/πρωτείνη+ταννίνη

38 Θολώματα οίνων. Ερυθροί οίνοι Θόλωμα σιδήρου Ίζημα τρυγικών αλάτων Ίζημα χρωστικών ουσιών Λευκοί οίνοι Θόλωμα σιδήρου Θόλωμα χαλκού Πρωτεϊνικό θόλωμα Ίζημα τρυγικών αλάτων Θόλωμα οξείδωσης Θόλωμα από Ζυμομύκητες Θόλωμα από Βακτήρια Θόλωμα οξείδωσης Θόλωμα από Ζυμομύκητες Θόλωμα από Βακτήρια σπάνια Δοκιμές σταθερότητας Έχουν αναπτυχθεί δοκιμές για τη σταθερότητα των πρωτεϊνών, την οξειδωτική σταθερότητα τη σταθερότητα των μετάλλων, τη σταθερότητα των τρυγικών, τη σταθερότητα του χρώματος, τη μικροβιακή σταθερότητα. Πρωτεϊνικό θόλωμα α) Μια φιάλη με τον υπό δοκιμή οίνο τοποθετείται στους 80 o C για 30 min και κατόπιν ψύχεται. Αν δεν θολώσει και παραμείνει διαυγής μετά από 24 h είναι σταθερός. β) Προσθήκη ταννίνης 0,5 g/l. Το σύμπλοκο ταννίνη-πρωτεϊνη σχηματίζει θόλωμα. Ίζημα τρυγικών Ψύξη του οίνου στους -4 o C για μια εβδομάδα. Αν δεν εμφανιστεί κρυσταλλικό ίζημα ο οίνος είναι σταθερός. Ίζημα χρωστικών Παραμονή του οίνου στους 0-4 o C για h μπορεί να δημιουργήσει

39 θόλωμα το οποίο εξαφανίζεται όταν ο οίνος επανέλθει στη θερμοκρασία περιβάλλοντος Θόλωμα σιδήρου α) Ο οίνος τοποθετείται σε άχρωμη φιάλη μέχρι τη μέση και διοχετεύεται οξυγόνο (από οβίδα ή πεπιεσμένος αέρας). Ανακινείται για 30 sec, πωματίζεται και παραμένει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 48 h. Αν υπάρχει πλεόνασμα σιδήρου θα θολώσει. Αν διατηρείται διαυγής μετά από μια εβδομάδα, είναι σταθερός. β) Ο οίνος παραμένει στους 0 o C για μια εβδομάδα. Θόλωμα χαλκού α) Λευκή φιάλη, γεμάτη με τον υπό δοκιμή οίνο, πωματίζεται και τοποθετείται οριζόντια σε διάχυτο ηλιακό φως για 7 ημέρες ή σε υπεριώδες για 24 h. β) Μια φιάλη οίνου, γεμάτη και πωματισμένη, τοποθετείται στους 30 o C για 3-4 εβδομάδες. Αν υπάρχει περίσσεια χαλκού θα εμφανιστεί θόλωμα. Θόλωμα οξείδωσης Ο οίνος τοποθετείται σε ποτήρι κι εκτίθεται στον αέρα για 12 h. Αν δεν θολώσει σημαίνει ότι δεν υπάρχει κίνδυνος για θόλωμα οξείδωσης μετά την εμφιάλωση. Μικροβιακό θόλωμα Μια φιάλη οίνου γεμάτη και κλεισμένη με βαμβάκι τοποθετείται στους 25 o C για 8 ημέρες. Αν δεν σχηματιστεί θόλωμα ο οίνος είναι ασφαλής για ανάπτυξη ζυμών. Αν εμφανιστεί θόλωμα μετά τις 8 ημέρες ίσως αναπτυχθούν βακτήρια.

40 Διάγνωση θολωμάτων Η διάγνωση του καστανού θολώματος γίνεται με SO 2. Το θόλωμα εξαφανίζεται μετά την προσθήκη 3-5 g/hl, κατά την πρώτη μετάγγιση. Η διάγνωση των μικροβιακών θολωμάτων γίνεται με μικροσκοπική εξέταση του θολώματος άμεσα είτε μετά από φυγοκέντρηση. Μπορεί να γίνει διάκριση ζυμών και βακτηρίων. Η διάγνωση των θολωμάτων σιδήρου βασίζεται στο ότι είναι διαλυτά σε υδροχλωρικό οξύ, σε διθειώδες νάτριο, και στο ότι χρωματίζονται ερυθρά με προσθήκη θειοκυανιούχου καλίου. Επίσης, ο προσδιορισμός σιδήρου είναι σημαντικός. Η διάγνωση του θολώματος χαλκού βασίζεται στο ότι το θόλωμα διαλύεται με έκθεση στον αέρα, όπως και το ότι είναι διαλυτό στο υδροχλωρικό οξύ. Επίσης, ο χαλκός αντιδρά με 2,2-δικινολίνη (στο θόλωμα που έχει διαλυθεί σε υδροχλωρικό οξύ). Γενικά, ο προσδιορισμός χαλκού είναι σημαντικός. Η διάγνωση του πρωτεϊνικού θολώματος βασίζεται στο ότι το θόλωμα διαλύεται με θέρμανση στους 80 o C. Το πρωτεϊνικό θόλωμα δεν είναι διαλυτό στο υδροχλωρικό οξύ. Η διάγνωση των ιζημάτων τρυγικών γίνεται με μικροσκοπική παρατήρηση, κατά την οποία φαίνεται ο κρυσταλλικός χαρακτήρας τους, ενώ δεν γίνεται διάκριση των δύο τρυγικών αλάτων. Η διάκρισή τους βασίζεται σε διαφορετικές ιδιότητες των δύο αλάτων. Οι κρύσταλλοι όξινου τρυγικού καλίου έχουν όξινη γεύση, είναι διαλυτοί σε ζεστό νερό και αδιάλυτοι στο υδροχλωρικό οξύ. Οι κρύσταλλοι ουδέτερου τρυγικού ασβεστίου έχουν ουδέτερη γεύση, είναι αδιάλυτοι σε ζεστό νερό, αδιάλυτοι σε υδροχλωρικό οξύ, και αντιδρούν με οξαλικό αμμώνιο. Η διάγνωση του ιζήματος χρωστικών γίνεται με μικροσκοπική παρατήρηση των «πλακών» των χρωστικών ουσιών, ενώ συχνά παρατηρούνται και κρύσταλλοι τρυγικών αλάτων. Επίσης, άλλες δοκιμές βασίζονται στο ότι το ίζημα χρωστικών είναι διαλυτό στους 40 ο C και σε

41 50 % αλκοόλη. Μέταλλα Τα μέταλλα που κυρίως δημιουργούν προβλήματα αστάθειας είναι ο σίδηρος και ο χαλκός. Περίσσεια σιδήρου ή χαλκού στον οίνο μπορεί να προκαλέσει δημιουργία θολωμάτων ή ιζημάτων. Εάν τα επίπεδα του σιδήρου και του χαλκού είναι μεγαλύτερα από 5 mg/l και 0,2 mg/l αντίστοιχα, μπορεί να οδηγήσουν σε σχηματισμό θολωμάτων ή ιζημάτων. Επίσης, η περιεκτικότητα σε άλλα συστατικά επηρεάζει την πιθανότητα εμφάνισης του προβλήματος. Στον οίνο ο σίδηρος βρίσκεται κυρίως ως δισθενής. Η αναλογία δισθενούς/τρισθενούς σιδήρου εξαρτάται από την οξειδωτική κατάσταση του οίνου. Ο τρισθενής σίδηρος συνδέεται με φωσφορικά. Από τα μέταλλα το κάλιο και το ασβέστιο σχετίζονται κυρίως με την τρυγική σταθερότητα του οίνου. Οξείδωση οίνου Η οξείδωση του γλεύκους είναι ενζυμικό φαινόμενο (ενζυμική καστάνωση). Η οξείδωση του οίνου είναι μία πορεία που λαμβάνει χώρα με δράση ελεύθερων ριζών. Έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια αρώματος την ανάπτυξη οξειδωμένου χρώματος, όπως και την ανάπτυξη οξειδωμένου αρώματος. Σύμφωνα με την πρόσφατη γνώση η οξείδωση στον οίνο λαμβάνει χώρα με ρίζες υδροξυλίου. Στο ph του οίνου ο Fe(II) ανάγει το οξυγόνο προς υπεροξείδιο του υδρογόνου, το οποίο παρουσία Fe(II) μετασχηματίζεται σε ρίζες υδροξυλίου (αντίδραση Fenton) Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 +OH. + OH - Οι ρίζες υδροξυλίου είναι πολύ δραστικές και μη επιλεκτικές, και μπορούν να οξειδώσουν σχεδόν όλα τα συστατικά των οίνων. Με την οξείδωση των φαινολικών συστατικών από τις ρίζες υδροξυλίου ξεκινάει μια αλληλουχία αντιδράσεων. Οι κινόνες που σχηματίζονται είναι ασταθείς και αντιδρούν περαιτέρω με το σχηματισμό πολυμερών και δημιουργία καστανού χρώματος.

42 Τα αντιοξειδωτικά που προστίθενται στον οίνο μπορεί να αναστέλλουν το φαινόμενο της οξείδωσης-καστάνωσης των οίνων. Ο θειώδης ανυδρίτης δεσμεύει το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το ασκορβικό οξύ οξειδώνεται προς δευδροασκορβικό οξύ δεσμεύοντας οξυγόνο. Παράλληλα προκύπτει υπεροξείδιο του υδρογόνου. Έτσι, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιείται μαζί με θειώδη ανυδρίτη, ο οποίος δεσμεύει το υπεροξείδιο του υδρογόνου που προκύπτει. Αζωτούχα συστατικά Πρωτεΐνες Ο οίνος περιέχει άζωτο με μορφή διαφόρων αζωτούχων ενώσεων σε συγκεντρώσεις 0,5 έως 4 g/l. Οι αζωτούχες ενώσεις διακρίνονται στις ανόργανες και τις οργανικές. Οι ανόργανες περιέχονται στον οίνο ως αμμωνιακά και αποτέλούν το 5 % του συνολικού αζώτου. Το υπόλοιπο 95 % αποτελούν οι οργανικές ενώσεις, κυρίως πρωτεΐνες, πολυπεπτίδια., αμινοξέα και αμίδια. Οι πρωτεΐνες (Μ-Β. > ) μπορεί να φτάνουν το 10 % του συνολικού αζώτου, και είναι υπεύθυνες για το πρωτεϊνικό θόλωμα. Τα πολυπεπτίδια (Μ.Β.. < ) συνιστούν το % του συνολικού αζώτου. Τα αμινοξέα αποτελούν το % του συνολικού αζώτου των οίνων. Στα κόκκινα κρασιά οι πρωτεΐνες ενώνονται με τις ταννίνες και καταβυθίζονται. Αντίθετα στα λευκά κρασιά παραμένουν και μπορούν να δώσουν θόλωμα πρωτεϊνών στο εμφιαλωμένο κρασί Το ανόργανο άζωτο (ΝΗ4 + ) χρησιμοποιείται από τους ζυμομύκητες, και έτσι μειώνεται κατά την ζύμωση. Αντίθετα, τα βακτήρια χρησιμοποιούν το άζωτο των αμινοξέων. Τα κόκκινα κρασιά περιέχουν, λόγω εκχύλισης των στερεών συστατικών, μεγαλύτερα ποσά αζωτούχων ενώσεων, 0,8-4 g/l, από τα λευκά κρασιά, 0,5-1,25 g/l. Μέθοδοι προσδιορισμού πρωτεϊνών και αμινοξέων Το ολικό άζωτο μπορεί να προσδιοριστεί με τη μέθοδο Kjeldahl.

43 Επίσης, οι πρωτεΐνες προσδιορίζονται με τη μέθοδο, Bradford, και α-αμινοξέα με αντίδραση με νινυδρίνη.

44 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Πρωτεϊνική σταθερότητα Για την εκτίμηση της σταθερότητας των πρωτεϊνών στον οίνο υπάρχουν διάφορες δοκιμές. Όλες αφορούν τη μετουσίωση των πρωτεϊνών, με θέρμανση, προσθήκη οξέος ή αλκοόλης. Δοκιμή με θέρμανση Ο οίνος σε υδατόλουτρο στους 80 C για 30 min. Η εμφάνιση του τυχόν θολώματος εκδηλώνεται μετά την ψύξη του οίνου. Εάν ο οίνος εξακολουθεί να παραμένει διαυγής και μετά από 24 h προκύπτει ότι δεν υπάρχει κίνδυνος πρωτεϊνικού θολώματος. Δοκιμή με οξύ Σε 10 ml του υπό δοκιμή οίνου προστίθενται 2 σταγόνες αντιδραστηρίου οξέος. Εάν το δείγμα άμεσα παραμείνει διαυγές τότε δεν υπάρχει κίνδυνος πρωτεϊνικού θολώματος. Σταθερότητα τρυγικών αλάτων Δοκιμή αγωγιμότητας Σε ποτήρι ζέσεως φέονται 200 ml οίνου, και διατηρείται στους 0 o C. Μετράται η αγωγιμότητα και η θερμοκρασία του οίνου. Προστίθενται υπό ανάδευση 0,8 gr θρυμματισμένου όξινου τρυγικού καλίου, και μετράται η αγωγιμότητα και η θερμοκρασία. Στη συνέχεια ανά λεπτό μετράται η αγωγιμότητα μέχρι να σταθεροποιηθεί η τιμή. Σημειώνεται ο χρόνος και η τιμή της αγωγιμότητας. Η μείωση της αγωγιμότητας σε συνάρτηση με το χρόνο δηλώνει αστάθεια. Γενικά, το εύρος των αποδεκτών μεταβολών είναι από 2 σε 4 %. Οίνοι με μεγαλύτερες μεταβολές στην αγωγιμότητα θεωρούνται ασταθείς. Πάντως, χρησιμοποιούνται τα δεδομένα που καταγράφονται για τους διάφορους οίνους. Μέταλλα Προσδιορισμός σιδήρου Ο σίδηρος στον οίνο προσδιορίζεται με διάφορες φωτομετρικές μεθόδους, και με ατομική απορρόφηση. Συχνά χρησιμοποιείται η αντίδραση του τρισθενούς σιδήρου με

45 θειοκυανιούχα με σχηματισμό του έγχρωμου συμπλόκου Fe (CNS) 6-3 Μετράται η απορρόφηση στα 490 nm. Με οξείδωση του δισθενούς σιδήρου σε τρισθενή με υπεροξείδιο του υδρογόνου προσδιορίζεται ο συνολικός σίδηρος. Σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες φέρονται από 10 ml οίνου. Σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται 2 ml 3 N υδροχλωρικού οξέος και 1 ml διαλύματος 20 % θειοκυανιούχου καλίου. Ακολούθως, στον ένα σωλήνα προστίθενται 5 σταγόνες 30 % υπεροξειδίου του υδρογόνου και στον άλλο 5 σταγόνες απ. νερού. Γίνεται ανάμιξη και εκχύλιση με 10 ml μίγματος 2:1 οξικού αμυλεστέρα-μεθανόλης. Γίνεται διαχωρισμός, αφυδάτωση του εκχυλίσματος με άνυδρο θειικό νάτριο και διήθηση. Μετράται η απορρόφηση στα 490 nm. Από την απορρόφηση παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου προκύπτει ο συνολικός ανόργανος σίδηρος, και από την απορρόφηση απουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου προκύπτει ο τρισθενής σίδηρος. Κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη με μεταλλικό σίδηρο. Ένα gr σιδήρου διαλύεται σε λίγα ml θερμού πυκνού υδροχλωρικού οξέος και ακολουθεί αραίωση στο 1 L με απ. νερό. Από το διάλυμα αυτό παρασκευάζονται διαλύματα σιδήρου συγκεντρώσεων 1, 2, 5 και 10 mg/l. Σε δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται 10 ml πρότυπου διαλύματος σιδήρου. Ακολουθεί προσθήκη 2 ml 3 N υδροχλωρικού οξέος, 1 ml διαλύματος 20 % θειοκυανιούχου καλίου και 5 σταγόνες 30 % υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η εκχύλιση του συμπλόκου που σχηματίζεται γίνεται με με 10 ml μίγματος 2:1 οξικού αμυλεστέραμεθανόλης. Μετράται η απορρόφηση στα 490 nm. Στο εργαστήριο η εκχύλιση θα γίνει με διαιθυλαιθέρα. Τυπική εξίσωση Α = 0,1388C - 0,0011, όπου Α η απορρόφηση και C η συγκέντρωση σε mg/l. Προσδιορισμός χαλκού Ο χαλκός στον οίνο προσδιορίζεται με φωτομετρικές μεθόδους, και με ατομική απορρόφηση. Συχνά χρησιμοποιείται η αντίδραση του δισθενούς χαλκού με διαιθυλο διθειο καρβαμιδικά με σχηματισμό του έγχρωμου συμπλόκου

46 Μετράται η απορρόφηση στα 435 nm. Σε δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 10 ml οίνου. Ακολουθεί προσθήκη 1 ml αντιδραστηρίου υδροχλωρικού οξέος-κιτρικού οξέος, γίνεται ανάμιξη, και προστίθενται 2 ml 5 N υδροξειδίου του αμμωνίου, και γίνεται ξανά ανάμιξη. Στη συνέχεια, προστίθεται 1 ml διαλύματος 1 % διαιθυλο διθειο καρβαμιδικού νατρίου, και γίνεται καλή ανακίνηση. Μετά από 1 min προστίθενται 10 ml οξικού αμυλεστέρα και 5 ml απόλυτης μεθανόλης. Γίνεται ανάμιξη για 30 sec και ακολουθεί παραμονή για διαχωρισμό των φάσεων. Λαμβάνεται η οργανική φάση, και αφυδατώνεται με προσθήκη άνυδρου θειικού νατρίου, και ακολουθεί διήθηση. Μετράται η απορρόφηση στα 435 nm. Κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη με μεταλλικό χαλκό. Διαλύονται 0,5 gr χαλκού σε αραιό νιτρικό οξύ και ακολουθεί συμπλήρωση με απ. νερό στο 1 L. Από αυτό το διάλυμα παρασκευάζονται διαλύματα χαλκού με τη βοήθεια αλκοόλης 95 %. Στη συνέχεια, γίνεται η ίδια διαδικασία που αναφέρεται παραπάνω για τον οίνο, δηλαδή χρησιμοποιούνται 10 ml πρότυπου διαλύματος στη θέση του οίνου. Στο εργαστήριο η μέθοδος θα εφαρμοστεί χωρίς εκχύλιση. Τυπική εξίσωση Α = 0,0958 C - 0,0028, όπου Α η απορρόφηση και C η συγκέντρωση σε mg/l. Οξειδωτική σταθερότητα Η αποτίμηση της οξειδωτικής σταθερότητας λευκών οίνων θα γίνει με χρήση υπεροξειδίου του υδρογόνου στους 60 ο C. Η % αύξηση της απορρόφησης στα 420 nm αποτελεί μέτρο της οξείδωσης. Επίσης, θα χρησιμοποιηθούν θειώδης ανυδρίτης, ασκορβικό οξύ και μίγμα τους ως αναστολείς της οξείδωσης.

47 Η ταχεία οξείδωση του οίνου πραγματοποιείται με προσθήκη υπεροξειδίου του υδρογόνου και θέρμανση. Σε 5 ml οίνου προστίθενται 25 μl διαλύματος 3 % υπεροξειδίου του υδρογόνου και ακολουθεί διατήρηση στους 60 ο C για μία ώρα (και για μεγαλύτερο χρόνο). Μετά από μία ώρα (και περισσότερο) μετράται η απορρόφηση στα 420 nm, που είναι δείκτης της οξείδωσης-καστάνωσης. Η επίδραση των αντιοξειδωτικών αποτιμάται θα αποτιμάται με προσθήκη τους στον οίνο, πριν την προσθήκη υπεροξείδιου του υδρογόνου και τη θέρμανση. Ο θειώδης ανυδρίτης χρησιμοποιείται σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως 50, 100 mg/l, και μεγαλύτερες. Επίσης ασκορβικό οξύ σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως 50 και 100 mg/l, και μεγαλύτερες. Επιπλέον, θα χρησιμοποιηθούν αντίστοιχα μίγματα θειώδη ανυδρίτη και ασκορβικού οξέος. Γίνεται σύγκριση των διαφόρων δειγμάτων με και χωρίς την προσθήκη αντιοξειδωτικών. Επίσης, γίνεται σύγκριση γίνεται με μάρτυρα χωρίς προσθήκη και χωρίς θέρμανση. Πρωτεΐνες Προσδιορισμός πρωτεϊνών Ο προσδιορισμός των πρωτεϊνών και των πολυπεπτιδίων μπορεί να γίνει με την μέθοδο Bradford. Η μέθοδος στηρίζεται στο ότι το μέγιστο απορρόφησης όξινου διαλύματος της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 μετατοπίζεται από τα 465 nm στα 595 nm με σύνδεσή της με διαλυμένες πρωτεΐνες. Η χρωστική συνδέεται κυρίως με βασικά και αρωματικά αμινοξέα ιδιαιτέρα την αργινίνη. Σε 2,5 ml αραιωμένου (1 όγκος εμπορικής χρωστικής με 4 όγκους απεσταγμένου νερού) προστίθεται κατάλληλος όγκος οίνου και γίνεται ανάδευση. Μετά από παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 5 minutes μετράται η απορρόφηση στα 595 nm. Η συγκέντρωση υπολογίζεται με τη χρήση πρότυπης καμπύλης με αλβουμίνη. Τυπική πρότυπη C (mg/l) = 103 χ ΔΑ.

48 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 4 ΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΣΤΗ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ Ιωάννης Ρούσσης Ενζυμικές και μικροβιακές δράσεις στη γαλακτοκομία Οκτώβριος 2018 Προσδιορισμός πηκτικής δύναμης της πυτιάς Πυτιά είναι το προϊόν που λαμβάνεται με εκχύλιση, με διάλυμα NaCl, από το τέταρτο στομάχι, το λεγόμενο ήνυστρο, μη απογαλακτισμένων νεαρών μηρυκαστικών, κυρίως μοσχαριών αλλά και αρνιών και κατσικιών. Χρησιμοποιείται στην πήξη του γάλακτος προς τυρί. Η πυτιά περιέχει πρωτεολυτικά ένζυμα, κυρίως χυμοζίνη, δευτερευόντως πεψίνη και άλλα. Επίσης, περιέχει και άλλα ένζυμα όπως λιπάση, η οποία συμβάλλει στην λιπόλυση κατά την ωρίμανση των τυριών και προσδίδει πικάντικη γεύση. Για να χρησιμοποιηθεί η πυτιά προηγείται οξίνηση για να ενεργοποιηθεί το ένζυμο χυμοζίνη, στο οποίο οφείλεται η πηκτική δύναμη. Τα άλλα προϊόντα από άλλες πηγές που χρησιμοποιούνται στην πήξη του γάλακτος χαρακτηρίζονται ως υποκατάστατα πυτιάς η απλά ένζυμα πήξης. Κατά την ενζυμική φάση της πήξης του γάλακτος η χυμοζίνη υδρολύει τη καζεΐνη στο δεσμό φαινυλαλανίνης (105)-μεθειονίνης (106). Παράγονται η παρα-κ-καζείνη που είναι υδρόφοβη, και ένα υδρόφιλο μακροπεπτίδιο, γνωστό ως γλυκομακροπεπτίδιο, που μεταφέρεται στο τυρόγαλα. Με τη υδρόλυση της κ- καζείνης αποσταθεροποιείται το μικκύλιο των καζεινών, καθόσον το σταθεροποιεί η κ-καζείνη. Κατά τη δεύτερη φάση της πήξης του γάλακτος συμβαίνει κροκίδωση των καζεινών παρουσία ιόντων ασβεστίου σε κατάλληλη θερμοκρασία. Στη συνέχεια συμβαίνει η συναίρεση του πήγματος, δηλαδή η συρρίκνωσή του με αποβολή νερού και υδατοδιαλυτών συστατικών. Η πήξη βοηθείται από την πτώση του ph, που συμβαίνει με τη δράση της καλλιέργειας

49 εκκίνησης, δηλαδή την ζύμωση της λακτόζης από γαλακτικά βακτήρια και την παραγωγή γαλακτικού οξέος. Επίσης, στην πορεία παρασκευής του τυριού, η χυμοζίνη υδρολύει την as1-καζεΐνη στο δεσμό φαινυλαλανίνης 23-φαινυλαλανίνης24 και προκύπτει η as1-ι-καζείνη και το πεπτίδιο as1-f l-23. Η as1-ι-καζείνη συμβάλλει στην υφή του τυριού, και το πεπτίδιο asl-f l-23 με περαιτέρω διάσπασή του συμβάλλει στο άρωμα-γεύση του τυριού. Η ποιότητα της πυτιάς εξαρτάται από την αναλογία χυμοζίνης/πεψίνης, και την πηκτική της δύναμη. Πηκτική δύναμη της πυτιάς είναι η ικανότητά της για πήξη του γάλακτος. Συγκεκριμένα, είναι τα μέρη γάλακτος που πήζει ένα μέρος πυτιάς σε χρόνο 40 min στους 35 C. Εκφράζεται συνήθως ως κλάσμα με αριθμητή τη μονάδα και παρανομαστή τα μέρη του γάλακτος που μπορεί να πήξει ένα μέρος πυτιάς στις παραπάνω συνθήκες. Οι υγρές πυτιές που κυκλοφορούν στο εμπόριο έχουν πηκτική δύναμη της τάξης 1 : , ενώ η πυτιά σε σκόνη της τάξης 1 : Γαλακτικά βακτήρια Καλλιέργεια γαλακτικών βακτηρίων. Επίδραση χλωριούχου νατρίου και θερμικής κατεργασίας στην ανάπτυξη γαλακτικών βακτηρίων Στη γαλακτοκομία χρησιμοποιούνται γαλακτικά βακτήρια, όπως κυρίως στην παρασκευή τυριών και γιαουρτιού. Σε άλλα τρόφιμα χρησιμοποιούνται ζυμομύκητες, όπως στην παρασκευή ψωμιού. Στα τρόφιμα υπάρχουν αλλά και προστίθενται διάφορα αντιμικροβιακά για την αναστολή και τον έλεγχο διάφορων μικροοργανισμών. Επίσης, χρησιμοποιούνται διάφορες κατεργασίες για αναστολή και καταστροφή μικροοργανισμών, όπως οι θερμικές κατεργασίες. Τα αντιμικροβιακά είτε υπάρχουν φυσικά στα τρόφιμα είτε προστίθενται. Τα προστιθέμενα (πρόσθετα) είτε έχουν φυσική προέλευση είτε είναι συνθετικά. Μεταξύ των αντιμικροβιακών είναι το χλωριούχο νάτριο (αλάτι) που χρησιμοποιείται στην παρασκευή ψωμιού, τυριών και άλλων τροφίμων. Επίσης, χρησιμοποιούνται ο θειώδης ανυδρίτης, βενζοικά, σορβικά και προπιονικά, νιτρώδη/νιτρικά, σάκχαρα, γαλακτικό και οξικό οξύ και άλλα. Επίσης, φαινολικά συστατικά, πεπτίδια και άλλα

50 συστατικά τροφίμων έχουν αντιμικροβιακή δράση. Διάφορες θερμικές κατεργασίες εφαρμόζονται σε τρόφιμα. Τέτοιες είναι το θέρμισμα, η παστερίωση, το ζεμάτισμα, η υψηλή παστερίωση, η υπερυψηλή θέρμανση, η αποστείρωση (κονσερβοποίηση). Η αποτίμηση της αποτελεσματικότητας αντιμικροβιακών παραγόντων μπορεί να γίνει με έλεγχο της ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού των μικροοργανισμών, που έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία θολώματος και ιζήματος. Επίσης, μπορεί να γίνει με έλεγχο της μεταβολικής απόκρισης, όπως παραγωγή αερίου (όπως διοξείδιο του άνθρακα) και οξέος (όπως γαλακτικό οξύ). Ενζυμικές και μικροβιακές δράσεις στην οινολογία Ζυμομύκητες οινοποίησης Χρήση ενεργών αφυδατωμένοι ζυμομυκήτων Οι ζυμομύκητες παρουσία οξυγόνου αναπνέουν και πολλαπλασιάζονται, ενώ απουσία οξυγόνου ζυμώνουν ζάχαρα με παραγωγή διοξειδίου του άνθρακα και αλκοόλης και ο πολλαπλασιασμός τους είναι περιορισμένος. Παραδοσιακά η ζύμωση του γλεύκους γινόταν από την μικροχλωρίδα του περιβάλλοντος. Σήμερα χρησιμοποιούνται σε μεγάλο βαθμό ενεργοί αφυδατωμένοι ζυμομύκητες που επιλέγονται για ομαλή οινοποίηση και παραγωγή καλής ποιότητας οίνου. Η χρήση καλλιέργειας εκκίνησης (starters) μειώνει τον κίνδυνο επιμόλυνσης από άλλους μικροοργανισμούς που παράγουν πτητική οξύτητα, και τον κίνδυνο να σταματήσει η ζύμωση από έλλειμμα ζυμομυκήτων στο γλεύκος. Χαρακτηριστικά που εξετάζονται για την επιλογή των στελεχών ζυμομυκήτων είναι η γρήγορη εκκίνηση, ταχύτητα και ολοκλήρωση της ζύμωσης, η παραγωγή αλκοόλης και η απόδοση σακχάρων/αλκοόλη, η αντίσταση στην αλκοόλη, η μη ταραχώδης ζύμωση, οι θρεπτικές απαιτήσεις, η προσαρμογή στη θερμοκρασία οινοποίησης, ο παράγοντας killer, η ελάχιστη παραγωγή πτητικής οξύτητας, SO 2, ακεταλδεύδης, H 2 S και αφρού. Επίσης, η παραγωγή ζυμωτικών αρωμάτων, η εκχύλιση χρώματος, η μερική μείωση της οξύτητα, η συμβολή στην ισορροπία του οίνου και ο σεβασμός και αξιοποίηση της πρώτης ύλης. Η αφυδάτωση των ζυμομυκήτων και η συσκευασία σε κενό διασφαλίζουν ζωτικότητα μέχρι τρία χρόνια. Οι αφυδατωμένοι ζυμομύκητες περιέχουν 2 έως 3 χ κύτταρά ανά gr, τα οποία

51 επανενεργοποιούνται άμεσα και διατηρούν πλήρως τα αρχικά τους χαρακτηριστικά. Μετά την ενυδάτωσή τους οι ζυμομύκητες μπορούν να ξεκινήσουν αμέσως την ζύμωση. Έτσι, αποφεύγεται ο κίνδυνος επιμόλυνσης και η πιθανότητα να σταματήσει η ζύμωση. Προσθήκη 20 g ανά 100 L προσφέρουν 4 έως 6 χ κύτταρα ανά ml. Σημειώνεται ότι τα κύτταρα στη φάση της ζύμωσης είναι 60 έως 100 χ ανά ml. Επίσης, ότι οι ζυμομύκητες της καλλιέργειας εκκίνησης πρέπει να είναι 10 φορές παραπάνω από τους ενδογενείς ζυμομύκητες. Η ενεργοποίηση των αφυδατωμένων ζυμομυκήτων, πριν την προσθήκη στο γλεύκος, γίνεται είτε σε αραιωμένο γλεύκος είτε σε ζαχαρούχο διάλυμα. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Με μικροσκοπική παρατήρηση δεν γίνεται διάκριση μεταξύ ζώντων και μη μικροοργανισμών. Με τη μικροσκοπική παρατήρηση μπορεί να γίνει διάκριση μεταξύ γενών ζυμομυκήτων. Οι ζυμομύκητες Sacharomyces cereviseae διακρίνονται εύκολα από αυτούς του γένους Kloeckera. Στο Σχήμα παρατίθενται φωτογραφίες 12 στελεχών ζυμομυκήτων που απομονώθηκαν από αυθόρμητες ζυμώσεις γλεύκους. Τα 1, 2, 3, 4, 5, 6 και 12 είναι Sacharomyces cereviseae, ενώ τα 7, 8, 9, 10, 11 είναι Kloeckera apiculata. Τούτο είναι εύκολα διακριτό από τη μορφολογία των κυττάρων. Στα κύτταρα του στελέχους 12 διακρίνονται, επίσης, τα ασκοσπόρια.

52 Μετά την ενεργοποίησή του ο ζυμομύκητας προστίθεται στο γλεύκος για επιτέλεση της ζύμωσης. Ζύμωση γλεύκους Αφομοιώσιμο άζωτο γλεύκους Σημαντικός παράγοντας για επιτυχή ζύμωση είναι το σωστό επίπεδο στο γλεύκος αζώτου που είναι αφομοιώσιμο από το ζυμομύκητα. Ο ζυμομύκητας οινοποίησης χρειάζεται επαρκή πηγή αζώτου για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό του, και κατά συνέπεια για την επιτέλεση της ζύμωσης. Η έλλειψη αζώτου μπορεί να οδηγήσει σε σταμάτημα της ζύμωσης. Επίσης, λόγω χρησιμοποίησης θειούχων αμινοξέων μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό υδροθείου, που έχει αρνητική επίδραση στην ποιότητα του οίνου. Από την άλλη πλευρά, υπερβολικά επίπεδα αζώτου μπορεί να οδηγήσουν σε αλλαγές στον χαρακτήρα του αρώματος του οίνου. Επίσης, μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό καρβαμιδικού αιθυλεστέρα, που είναι επικίνδυνος για την υγεία. Τα επιθυμητά επίπεδα αζώτου που χρειάζονται για επιτέλεση της ζύμωσης κυμαίνονται στην περιοχή mg/l. Το αφομοιώσιμο άζωτο από τους ζυμομύκητες είναι το αμμωνιακό άζωτο (ΝΗ 3 / ΝΗ 4 + ) και το άζωτο α-αμινοξέων (FAN). Οι μέθοδοι που εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό του αφομοιώσιμου αζώτου είναι διάφορες. Με τη μέθοδο της φορμόλης προσδιορίζεται και το αμμωνιακό άζωτο και το άζωτο α-αμινοξέων ( ΝΗ FAN). Με την προσθήκη διαλύματος φορμαλδεύδης απελευθερώνονται ιόντα υδρογόνου και μειώνεται το ph. Τα ml διαλύματος NaOH που απαιτούνται για επαναφορά του ph στο 8,0 είναι ανάλογα του αφομοιώσιμου αζώτου. Ενοφθαλμισμός γλεύκους με το ζυμομύκητα

53 Μετά την ενεργοποίηση του αφυδατωμένου ζυμομύκητα και τον προσδιορισμό του αφομοιώσιμου αζώτου γίνεται προσθήκη του ζυμομύκητα στο γλεύκος. Εάν το αφομοιώσιμο άζωτο δεν είναι επαρκές, κανονικά γίνεται εξωγενής προσθήκη αφομοιώσιμου αζώτου για να έχει επαρκή τροφή ο ζυμομύκητας. Καλλιέργεια ζυμομυκήτων Οι ζυμομύκητες έχουν λιγότερες θρεπτικές απαιτήσεις από τα βακτήρια. Το πιο διαδεδομένο θρεπτικό υλικό είναι το YPD (Yeast Peptone Dextrose) που περιέχει πεπτόνη, εκχύλισμα ζύμης, γλυκόζη 20, 10 και 20 g/l αντίστοιχα. Γίνεται καλλιέργεια ζυμομύκητα Saccharomyces cerevesiae, αφυδατωμένος που ενεργοποιήθηκε. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται θρεπτικός ζωμός YPD. Εμβολιάζεται ο ζωμός με το αιώρημα του ζυμομύκητα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Επιπλέον, προστίθεται ο θειώδης ανυδρίτης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Σημειώνεται ότι το μεταμπισουλφίτ αποδίδει περίπου 50 % θειώδη ανυδρίτη. Χρησιμοποιούνται και τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη ζυμομύκητα είτε θειώδη ανυδρίτη. Στους δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετείται σωληνάκι Durcham, και γίνεται επώαση σε θερμοκρασία δωματίου. Παρακολουθείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού (θόλωμα) και η παραγωγή αερίου (συλλογή στο σωληνάκι Durcham).

54 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Προσδιορισμός πηκτικής δύναμης Για τον προσδιορισμό της πηκτικής δύναμης η ποσότητα της πυτιάς πρέπει να είναι τόση ώστε να επιφέρει την πήξη σε 3 μέχρι 6 min. Συνήθως για τη μέτρηση της πηκτικής δύναμης χρησιμοποιούνται 100 ml γάλακτος και 1 ml πυτιάς. Η πήξη γίνεται στους 35 C. Μετράται ο χρόνος πήξης σε sec, και η πηκτική δύναμη υπολογίζεται από τη σχέση, Πηκτική Δύναμη = (100 χ 2.400): χρόνος πήξης σε sec. Χρησιμοποιείται άπαχο γάλα που περιέχει 0,01 Μ χλωριούχο ασβέστιο. 100 ml τοποθετούνται σε ποτήρι ζέσεως και γίνεται θερμοστάτηση σε υδατόλουτρο στους 35 C. Προστίθενται με ακρίβεια 1-2 ml διαλύματος πυτιάς. Η υγρή πυτιά προστίθεται ως έχει, και η σκόνη διαλύεται σε νερό σε αναλογία 1: είτε μεγαλύτερη, ανάλογα με την πηκτική δύναμη που αναμένεται να έχει. Με την προσθήκη της πυτιάς αρχίζει η χρονομέτρηση. Γίνεται ήρεμη ανάδευση για να μη σχηματιστεί αφρός και αφήνεται σε ηρεμία για να πήξει. Ο έλεγχος της πήξης γίνεται με σπάτουλα. Εμβαπτίζεται η σπάτουλα κάθετα και ανασύρεται συνεχώς, και παρατηρείται τυχόν εμφάνιση άσπρων κόκκων πάνω σε αυτήν, που είναι ένδειξη πήξης. Μετράται ο χρόνος πήξης. Η όλη διαδικασία επαναλαμβάνεται για να υπολογιστεί ο μέσος όρος του χρόνου πήξης. Η πηκτική δύναμη υπολογίζεται από τη σχέση: Πηκτική Δύναμη = (ποσότητα γάλακτος σε ml) χ 2400 / (Ποσότητα πυτιάς σε ml) χ (χρόνος πήξης σε sec). Καλλιέργεια γαλακτικών βακτηρίων. Επίδραση χλωριούχου νατρίου και θερμικής κατεργασίας στην ανάπτυξη γαλακτικών βακτηρίων Ως καλλιέργεια μπορούν να χρησιμοποιηθούν στελέχη γαλακτικών βακτηρίων. Επίσης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί φρέσκο γιαούρτι, που συνήθως παρασκευάζεται και κατά συνέπεια συνιστά μικτή καλλιέργεια γαλακτικών βακτηρίων (στο εργαστήριο πραγματοποιείται αυτή η εφαρμογή).

55 Ως θρεπτικό υλικό χρησιμοποιείται ζωμός MRS, που περιέχει πεπτόνη, εκχύλισμα ζύμης, εκχύλισμα κρέατος, γλυκόζη, άλατα. Παρασκευάζεται αιώρημα της καλλιέργειας, στους δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετούνται σωληνάκια Durcham (ανάστροφα). Προστίθεται αντιμικροβιακό, το χλωριούχο νάτριο σε συγκεντρώσεις 2,5 και 6,5 % w/v. Χρησιμοποιούνται και τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη καλλιέργειας είτε αλατιού. Για τη θερμική κατεργασία, το υγρό θρεπτικό υλικό, αφού ενοφθαλμιστεί, κατεργάζεται στους 60 C και στους 80 C για 10 και 30 min. Γίνεται διόρθωση (αφαίρεση) του χρόνου που απαιτείται για την άνοδο της θερμοκρασίας. Χρησιμοποιούνται δύο τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη καλλιέργειας είτε χωρίς θερμική κατεργασία. Ακολουθεί η επώαση, που γίνεται στους περίπου o C. Παρακολουθείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού (θόλωμα) και η παραγωγή αερίου (συλλογή στο σωληνάκι Durcham), ενώ παρατηρείται και η αλλαγή χρώματος από την παραγωγή γαλακτικού οξέος. Ενεργοποίηση ενεργών αφυδατωμένων ζυμομυκήτων Σε 5 % διάλυμα ζάχαρης σε πόσιμο νερό C προστίθενται 100 g/l αφυδατωμένων ζυμομυκήτων. Ακολουθεί ήπια ανάδευση για λήψη αιωρήματος του ζυμομύκητα. Το αιώρημα αφήνεται 20 minutes για ενυδάτωση των ζυμομυκήτων. Προκύπτει πλούσιος αφρός με γλυκιά οσμή, που δεικνύει την ενυδάτωση του ζυμομύκητα. Χρησιμοποιείται 5 % διάλυμα ζάχαρης, διότι σε αυτή τη συγκέντρωση οι ζυμομύκητες ενυδατώνονται και πολλαπλασιάζονται. Εναλλακτικά χρησιμοποιείται αραιωμένο γλεύκος (3 όγκοι γλεύκος και 7 όγκοι πόσιμο νερό). Στο μη αραιωμένο γλεύκος η συγκέντρωση των ζαχάρων είναι πολύ υψηλή και εμποδίζει τη σωστή ενυδάτωση. Αντίθετα, στο καθαρό νερό τα κύτταρα προσροφούν πολύ νερό και διαρρηγνύονται. Οι ενυδατωμένοι ζυμομύκητες προστίθενται στο γλεύκος με διασφάλιση καλής διασπορά τους. Δόση 20 g/ 100 L θεωρείται άριστη. Κατά την προσθήκη των ζυμομυκήτων πρέπει να αποφεύγονται, αλλαγές θερμοκρασίας πάνω από 5/7 C. Έτσι, μετά την ενυδάτωση των ζυμομυκήτων γίνεται ανάμιξη με ποσότητα γλεύκος για μείωση της

56 θερμοκρασίας πριν την προσθήκη στο προς ζύμωση γλεύκος. Από την αρχή της ζύμωσης γίνεται προσθήκη αζωτούχων (αμμωνιακών είτε οργανικού αζώτου) και επίσης αδρανών ζυμομυκήτων (εμπλουτισμός σε βιταμίνες, αμινοξέα, λιπαρά οξέα, στερόλες). Ακόμη, εφαρμόζεται ήπιος αερισμός 36 έως 48 ώρες από την εκκίνηση της ζύμωσης που ευνοεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ώστε να υπάρχει μεγάλος πληθυσμός κυττάρων στο τέλος της ζύμωσης χωρίς κίνδυνο οξείδωσης. Η πορεία της ζύμωσης ελέγχεται με μέτρηση της θερμοκρασίας και της μείωσης της πυκνότητας του γλεύκους. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Με τη μικροσκοπική παρατήρηση γίνεται και διάκριση μεταξύ γενών ζυμομυκήτων. Οι ζυμομύκητες Sacharomyces cereviseae διακρίνονται εύκολα από αυτούς του γένους Kloeckera. Ο ζυμομύκητας που ενεργοποιήθηκε φέρεται σε πλάκα μικροσκοπίου και γίνεται άμεση παρατήρηση στο μικροσκόπιο. Γίνεται παρατήρηση της μορφολογίας των κυττάρων, η εκβλάστηση και τα ασκοσπόρια. Ζύμωση γλεύκους Κατ αρχή, γίνεται προσδιορισμός του αφομοιώσιμου αζώτου στο γλεύκος. Έάν δεν είναι ικανοποιητική γίνεται προσθήκη αμμωνιακών αλάτων, όπως διαμμωνιακού φωσφορικού άλατος. Στη συνέχεια, γίνεται η προσθήκη του ζυμομύκητα στο γλεύκος για την επιτέλεση της ζύμωσης. Η πορεία προσδιορισμού του αφομοιώσιμου αζώτου είναι η παρακάτω: Πορεία 1 Ποσότητα γλεύκους διηθείται με διηθητικό χαρτί είτε με σύριγγα 5-μm, είτε γίνεται φυγοκέντρηση του δείγματος. Ακολουθεί αραίωση του δείγματος, συνήθως 10 ml διηθημένου γλεύκους στα 25 ml. Τοποθετούνται 10 ml αραιωμένου γλεύκους και γίνεται ρύθμιση τουph του στο 8,0 με 0,05 Ν NaOH. Ακολουθεί προσθήκη 2 ml διαλύματος φορμαλδεύδης που έχει πρόσφατα έχει ρυθμιστεί στο ph 8,0. Στη

57 συνέχεια, γίνεται ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 8,0 με προσθήκη 0,05 Ν NaOH. Ο υπολογισμός του αφομοιώσιμου αζώτου θα γίνει από τη σχέση: YAN, mg N/L = (ml 0,05 N NaOH) x 175 Πορεία 2 Σε ποτήρι ζέσεως τοποθετούνται 100 ml γλεύκους και γίνεται ρύθμιση του ph στο 8,0 με 1 Ν NaOH, με τη χρήση πεχαμέτρου. Γίνεται συμπλήρωση με απιονισμένο νερό στα 200 ml με καλή ανάμιξη. Ακολουθεί διήθηση. Λαμβάνονται 100 ml διηθήματος σε ποτήρι ζέσεως και γίνεται ξανά ρύθμιση του ph στο 8,0 με 1 Ν NaOH, εάν χρειάζεται. Ακολούθως, προστίθενται 25 ml διαλύματος φορμαλδεύδης, που πρόσφατα είχε ρυθμιστεί στο ph 7,0. Το μίγμα αναδεύεται και γίνεται ρύθμιση του ph στο 8,0 με 0,1 Ν NaOH. Η συγκέντρωση αζώτου mg/l υπολογίζεται όπως παρακάτω: ml NaOH x 0,1 N NaOH x 14 x συντελεστή αραίωσης x 1000 / όγκο δείγματος Στο εργαστήριο θα γίνει προσδιορισμός αφομοιώσιμου αζώτου σύμφωνα με τη δεύτερη πορεία, χρησιμοποιώντας μισούς όγκους. Η ρύθμιση του ph στο 8,0 θα γίνει με ογκομέτρηση με δείκτη ερυθρό της κρεσόλης, που αλλάζει χρώμα από κίτρινο σε κόκκινο ιώδες σε ph 7,2-8,8. Για τον υπολογισμό του αφομοιώσιμου αζώτου ισχύουν τα παρακάτω. M1 V1 = M2 V2 ml NaOH x 0,1 M (NaOH) = M2 V2, όπου V2 ο όγκος του γλεύκους που υπάρχει κατά την προσθήκη της και ογκομέτρηση, και το Μ2 αφορά τις ενώσεις αζώτου στο γλεύκος Παράδειγμα καταναλώθηκαν 2 ml 0,1 M ΝαΟΗ. Σημειώνεται ότι είναι ο όγκος του 0,1 M ΝαΟΗ στην ογκομέτρηση μετά την προσθήκη φορμόλης. Η πρώτη ογκομέτρηση δεν αφορά τις ενώσεις αζώτου και δεν λαμβάνεται υπόψει.

58 Οπότε, Μ2 (ενώσεων αζώτου) = 2 χ 0,1 : V2, δηλαδή mmol N / ml, και χ 1000 mmol N / L, και χ 14 mg / L αζώτου, καθόσον οι ενώσεις αζώτου περιέχου ένα άτομο αζώτου. Καλλιέργεια ζυμομύκητα. Επίδραση θειώδη ανυδρίτη στην ανάπτυξη ζυμομύκητα Ως καλλιέργεια χρησιμοποιείται ζυμομύκητας Saccharomyces cerevisae (μαγιά κρασιού). Ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται θρεπτικός ζωμός (πεπτόνη, εκχύλισμα ζύμης, γλυκόζη, 20, 10 και 20 g/l, αντίστοιχα), ενώ μπορεί να χρησιμοποιηθεί και μηλοχυμός είτε πορτοκαλοχυμός. Παρασκευάζεται αιώρημα της μαγιάς, και εμβολιάζεται ο ζωμός χυμός (ή ο χυμός) με το αιώρημα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Προστίθενται θειώδης ανυδρίτης σε συγκεντρώσεις 20, 100, 200 mg/l. Χρησιμοποιούνται και τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη μαγιάς είτε συντηρητικού. Τοποθετείται στους δοκιμαστικούς σωλήνες σωληνάκι Durcham ανάστροφα, και γίνεται επώαση σε θερμοκρασία δωματίου. Παρακολουθείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού (θόλωμα) και η παραγωγή αερίου (συλλογή στο σωληνάκι Durcham).

59 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5 ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΕ ΕΛΑΙΑ ΚΑΙ ΠΡΟΙΌΝΤΑ ΦΡΟΥΤΩΝ Ιωάννης Ρούσσης Οκτώβριος 2018 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Αντιοξειδωτικά Δέσμευση ελευθέρων ριζών Η κατανάλωση φρούτων και λαχανικών σχετίζεται με διάφορες θετικές επιδράσεις στην υγεία, όπως με τη μείωση της συχνότητας εμφάνισης καρκίνου και καρδιαγγειακών νοσημάτων. Τούτο, που είναι κοινώς αποδεκτό, σχετίζεται με την περιεκτικότητά τους σε αντιοξειδωτικές βιταμίνες (C, Ε και την προβιταμίνη β-καροτένιο). Τα φρούτα, τα λαχανικά, και οι χυμοί τους, περιέχουν αντιοξειδωτικά όπως αντιοξειδωτικές βιταμίνες και πολυφαινόλες. Αυτά, έχουν βιολογικές δράσεις, και μεταξύ αυτών είναι η εκκαθάριση ελεύθερων ριζών ( free radical scavengers). Οι ελεύθερες ρίζες, και ειδικότερα αυτές που σχετίζονται με το οξυγόνο, εμπλέκονται σε μιά σειρά από παθολογικές καταστάσεις, όπως καρδιαγγειακές παθήσεις, παθήσεις του οφθαλμού, του αναπνευστικού συστήματος, των νεύρων, αυτοάνοσα νοσήματα, ενώ επίσης έχει αναφερθεί ότι σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου και τη γήρανση. Η φυσιολογική αντιοξειδωτική προστασία που αναπτύσσει ο οργανισμός αποτελεί έναν από τους αποτελεσματικότερους μηχανισμούς κατά των επιβλαβών αλλοιώσεων που προκαλούν οι ελεύθερες ρίζες. Έτσι, η επιτυχής λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από το επίπεδο πρόσληψης φυσικών αντιοξειδωτικών μέσω της διατροφής. Πρόσληψη δηλαδή ουσιών που εύκολα εκκαθαρίζουν τις δραστικές ελεύθερες ρίζες. Συχνά τα αντιοξειδωτικά δρουν ως δότες υδρογόνου, δηλαδή παγιδεύουν τις ελεύθερες ρίζες ( R. ) σε ανενεργά συστατικά ( RH). Επίσης, μπορεί να δρουν αντιοξειδωτικά με δέσμευση μετάλλων.

60 Αποτίμηση αντιοξειδωτικής δράσης Πολλές μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιούνται για την αποτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης. Μέθοδος Folin Η μέθοδος Folin είναι μέθοδος αποτίμησης αντιοξειδωτικής δράσης. Η μέθοδος αυτή συχνά χρησιμοποιείται για μέτρηση ολικών φαινολικών συστατικών σε διάφορα προϊόντα. Όμως, γενικά είναι μέθοδος αποτίμησης της αντιοξειδωτικής δράσης. Αρχικά η συγκεκριμένη μέθοδος σχεδιάσθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αμινοξέων τυροσίνη και θρυπτοφάνη σε πρωτεϊνούχα δείγματα. Η αρχή αυτής της μεθόδου βασίζεται στη μέτρηση της ολικής συγκέντρωσης των φαινολικών υδροξυλομάδων που βρίσκονται στο υπό ανάλυση δείγμα. Η χημική πορεία της αντίδρασης δεν είναι πλήρως γνωστή: το φαινολικό ιόν οξειδώνεται σε αλκαλικό περιβάλλον με ταυτόχρονη αναγωγή του φωσφορομολυβδαινικού και φωσφοροβολφραμικού συμπλόκου του αντιδραστηρίου (το διάλυμα χρωματίζεται από ανοιχτό κίτρινο σε κυανό). Γενικά, η μέθοδος αυτή βασίζεται στην οξείδωση των αντιοξειδωτικών σε αλκαλικό περιβάλλον με μίγμα φωσφοβολφραμικού και φωσφομολυβδαινικού οξέος. Τα οξέα ανάγονται σε μίγμα κυανών οξειδίων του βολφραμίου (W 8 Ο 23 ) και του μολυβδαινίου (Мо 8 О 23 ). Η ένταση του κυανού χρώματος, με μέγιστο στα nm, είναι ανάλογη των αντιοξειδωτικών, όπως φαινολικών συστατικών. Το εξασθενές σύμπλοκο παρουσιάζει τις ακόλουθες δομές : 3H 2 O P 2 O 5 13WO 3 5MoO 3 10H 2 O και 3H 2 O P 2 O 5 14WO 3 4MoO 3 10H 2 O Το σχηματιζόμενο χρωμοφόρο περιέχει τα δύο μέταλλα (μολυβδαίνιο και βολφράμιο) με ελαττωμένο σθένος και μετράται η απορρόφησή του στα 750 nm. Οι μετρήσεις της απορρόφησης πρέπει να γίνονται σε σταθερό χρόνο για όλα τα δείγματα καθόσον το παραγόμενο χρώμα εξελίσσεται με το χρόνο. Η μέθοδος Folin Ciocalteu είναι μία απλή, ευαίσθητη και ακριβής

61 μέθοδος προσδιορισμού ολικών φαινολικών συστατικών. Το μειονέκτημά της έγκειται στο γεγονός ότι δεν προσδιορίζει μόνο τα φαινολικά συστατικά αλλά και πρωτείνες, που περιέχουν στο μόριό τους φαινολική υδροξυλομάδα. Επίσης, σάκχαρα, νουκλεικά οξέα, αρωματικές αμίνες. Ακόμη ενώσεις όπως η βενζαλδεΰδη, το αμινοβενζοϊκό οξύ και η γλυκίνη αντιδρούν με το αντιδραστήριο. Την ίδια αντίδραση δίνουν αντιοξειδωτικά όπως φαινολικά, και άλλα συστατικά όπως ανάγοντα σάκχαρα και νουκλεινικά οξέα. Μέθοδος DPPH Το DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, 2,2-διφαινυλο-1- πικρυλυδραζίδιο) είναι μία σταθερή ρίζα που χρησιμοποιείται σε μεγάλο βαθμό για την αποτίμηση δέσμευσης ελευθέρων ριζών/αντιοξειδωτικής ικανότητας. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε αρχικά για να διαπιστωθεί η ύπαρξη ουσιών που δρουν ως δότες ατόμων υδρογόνου στα φυσικά προϊόντα, ενώ αργότερα εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας τόσο των μεμονωμένων φαινολικών συστατικών και των τροφίμων όσο και των σχετικών βιολογικών δειγμάτων. Το DPPH είναι μία από τις λίγες σταθερές και εμπορικά διαθέσιμες οργανικές ρίζες αζώτου (λ max =515 nm). To DPPH ανάγεται προς υδραζίνη όταν αντιδρά με δότες υδρογόνου, όπως αντιοξειδωτικά, και αποχρωματίζεται (από πορφυρό χρώμα σε υποκίτρινο).. Μετράται η μείωση του χρώματος με μέτρηση της απορρόφησης στα 515 nm. NO 2 NO 2 H O 2 N N N O 2 N N N NO 2 NO 2 (I) (II)

62 Η δομή της ρίζας DPPH (Ι) και η ανηγμένη μορφή της (ΙΙ). Ο χρόνος της μεθόδου μπορεί να κυμανθεί από 5 20 λεπτά έως και ~6 ώρες. Η συγκέντρωση των αντιοξειδωτικών στα διάφορα τρόφιμα και άλλα δείγματα ποικίλει. Συνεπώς, υπάρχουν διαφοροποιήσεις τόσο όσον αφορά την ταχύτητα δέσμευσης της ρίζας όσο και την τελική συνολική δέσμευσής της. Έτσι, για υπολογισμό της αντιοξειδωτικής δράσης χρησιμοποιείται ο δείκτης IC 50 (Inhibition Concentration) ή EC 50 (Efficient Concentration), που εκφράζει τη συγκέντρωση του αντιοξειδωτικού που απαιτείται για μείωση της ρίζας DPPH στο 50%. Η τιμή EC 50 είναι αντίστροφα ανάλογη με την αντιοξειδωτική δράση. Η μέθοδος είναι απλή και σχετικά φτηνή. Όμως, υπάρχουν κάποιοι περιορισμοί. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων είναι δύσκολη όταν το φάσμα απορρόφησης των δειγμάτων υπερκαλύπτει την απορρόφηση του DPPH στα 515 nm, όπως μπορεί να συμβαίνει με καροτενοειδή. Ενζυμική καστάνωση Η ενζυμική καστάνωση είναι μία από τις πιο σημαντικές μεταβολές σε διάφορα τρόφιμα. Σε ορισμένες περιπτώσεις έχει θετικά αποτελέσματα, όπως στο τσάι με την ανάπτυξη χρώματος και αρώματοςγεύσης. Στις περισσότερες, όμως, περιπτώσεις έχει αρνητικά αποτελέσματα. Συνοδεύεται από αρνητική επίδραση στο χρώμα, αλλά και στο άρωμα-γεύση και θρεπτική αξία. Το φαινόμενο συμβαίνει συχνά σε φρούτα και λαχανικά (πράσινα φυλλώδη λαχανικά, πατάτα, αβοκάντο, μανιτάρια, μήλα, σταφύλια, ροδάκινα, μπανάνα), και θαλασσινά. Θεωρείται ότι μεγάλες απώλειες σε φρούτα συμβαίνουν λόγω της ενζυμικης καστάνωσης. Για να λάβει χώρα η ενζυμική καστάνωση απαιτείται η παρουσία ενζύμου (πολυφαινολοξειδάση), υποστρώματος (φαινολικά συστατικά), και του οξυγόνου. Το ένζυμο μπορεί να έχει δράση οξειδάσης μονοφαινόλης (κρεσολάση) που καταλύει την υδροξυλίωση μονοφαινολών σε ο-διφαινόλες, και δράση οξειδάσης διφαινόλης (κατεχολάση) που καταλύει την οξείδωση διφαινολών σε κινόνες. Η πολυφαινολοξειδάση είναι φυσικά υπάρχον ένζυμο, ενώ παρεμφερές ένζυμο είναι η λακκάση που παράγεται από μύκητα. Οι κινόνες που

63 παράγονται με τις ενζυμικές αντιδράσεις πολύ μερίζονται είτε αντιδρούν με αμινοξέα, πεπτίδια και δημιουργούνται χρωστικές καστανού χρώματος (στα θαλασσινά φαιού, μαύρου χρώματος). Σημειώνεται ότι η ενζυμική καστάνωση δεν συμβαίνει σε άθικτα φρούτα και λαχανικά, καθόσον τα φαινολικά συστατικά βρίσκονται σε κυτταρικά κενοτόπια/χυμοτόπια, και το ένζυμο στο κυτταρόπλασμα. Με τραυματισμό τους έρχονται σε επαφή το ένζυμο με τα υποστρώματα, και παρουσία οξυγόνου λαμβάνει χώρα η ενζυμική καστάνωση. Ο ρυθμός του φαινομένου εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ενζύμου, τα φαινολικά υποστρώματα, το ph, τη θερμοκρασία, και τη διαθεσιμότητα του οξυγόνου. Υποστρώματα είναι οι μονοφαινόλες και οι π- διυδροξυφαινόλες, με υδροξυλίωσή τους, και οι ο-διφαινόλες, ενώ τα μεθυλουποκατεστημένα παράγωγα και οι μ-διφαινόλες δεν είναι. Για την αναστολή του φαινομένου υπάρχουν διάφορες προσεγγίσεις. Ο αποκλεισμός του οξυγόνου, η προσθήκη αναγωγικών μέσων (θειώδη, ασκορβικά, θειούχα, φαινολικά συστατικά), μέσων οξίνησης (όπως το κιτρικό οξύ), χηλικών μέσων (όπως το EDTA), μέσων συμπλοκοποίησης ( όπως τα βορικά και οι κυκλοδεξτρίνες), αναστολέων ενζύμου (όπως η 4-εξυλρεσορκινόλη και το NaCl), ενζύμων (όπως τρανσφεράσης κατεχόλης για μεθυλίωση και οξειγενάσες διάρηξης δακτυλίου). Το κιτρικό οξύ συχνά συνδυάζεται με ασκορβικό οξύ ή θειώδη ανυδρίτη. Το κιτρικό οξύ, το μηλικό οξύ σχηματίζουν σύμπλοκα με το χαλκό και αναστέλλουν το ένζυμο. Επίσης, κατεργασίες, όπως η ψύξη, η θέρμανση (και θέρμανση με υπέρηχους), η κατάψυξη και η αφυδάτωση, η ακτινοβόληση, η υπερδιήθηση, η υψηλή πίεση, και η χρήση υπερκρίσιμου διοξειδίου του άνθρακα. Η ενζυμική καστάνωση συχνά αποτιμάται με μέτρηση της απορρόφησης στα 420 nm.

64 Αντιδράσεις ενζυμικής καστάνωσης και ρόλος αναγωγικών μέσων. Αναστολή ενζυμικής καστάνωσης με ασκορβικό οξύ. Ενζυμική καστάνωση μήλου.

65 Αναστολή της ενζυμικής καστάνωσης προιόντος απουσία και παρουσία αναστολέα. Οξείδωση ελαίων Αυτοξείδωση των λιπών και των ελαίων είναι η αντίδρασή τους με το οξυγόνο. Στις αντιδράσεις μετέχουν τα ακόρεστα λιπαρά οξέα, ελεύθερα και εστεροποιημένα. Γενικά, είναι αποδεκτό ότι λαμβάνει χώρα με το μηχανισμό των ελεύθερων ριζών. Εξελίσσεται σε τρία στάδια: την έναρξη, τη διάδοση και τον τερματισμό. Πρωτογενή προιόντα της αυτοξείδωσης είναι τα υδρο-υπεροξείδια. Τα υδρουπεροξείδια είναι ασταθείς ενώσεις που διασπώνται εύκολα. Κατά τη διάσπασή τους προκύπτει ένα πλήθος πτητικών οργανικών ενώσεων (δευτερογενή προϊόντα) με μικρότερο αριθμό ατόμων άνθρακα. Οι ενώσεις αυτές είναι υπεύθυνες για τη δυσάρεστη οσμή και γεύση που χαρακτηρίζει τις οξειδωμένες λιπαρές ύλες. Πρόκειται κυρίως για αλδεύδες και κετόνες. Χαρακτηριστικές είναι διάφορες κορεσμένες αλδεύδες, όπως η πεντανάλη, η εξανάλη, η οκτανάλη, η εννεανάλη. Αντιοξειδωτικά λιπαρών υλών Αντιοξειδωτικά λιπαρών υλών είναι ενώσεις οι οποίες, ακόμη και σε μικρές συγκεντρώσεις, αναστέλλουν την αυτοξείδωση των λιπών και ελαίων. Διακρίνονται σε πρωτοταγή και δευτεροταγή αντιοξειδωτικά. Τα πρωτοταγή αντιοξειδωτικά είναι δότες Η. Έτσι, η λιπιδική ρίζα μετατρέπεται σε σταθερή ένωση και το αντιοξειδωτικό οξειδώνεται και

66 σχηματίζει ρίζα. Η ρίζα του αντιοξειδωτικού σταθεροποιείται με συντονισμό. Έτσι, δεν είναι δραστική για τη συνέχιση των αλυσιδωτών αντιδράσεων της αυτοξείδωσης. Η αποτελεσματικότητα του αντιοξειδωτικού εκφράζεται ως παράγοντας προστασίας, που είναι ο λόγος της περιόδου επαγωγής μετά την προσθήκη του αντιοξειδωτικού προς την περίοδο επαγωγής χωρίς την προσθήκη του αντιοξειδωτικού. Πορεία οξείδωσης ελαίου παρουσία και απουσία αντιοξειδωτικού (αο). Πρωτοταγή αντιοξειδωτικά είναι τα γνωστά συνθετικά αντιοξειδωτικά, βουτυλο-υδροξυ-ανισόλη (BHA), βουτυλο-υδροξυ-τολουόλιο (BHT), τριτοταγής βουτυλο-υδροξυ-κινόνη (TBHQ), προπυλικός εστέρας γαλλικού οξέος (PG). Χρησιμοποιούνται σε συγκεντρώσεις περίπου 200 ppm. Όμως, τίθενται ερωτήματα σχετικά με ενδεχόμενη τοξικότητά τους. Επίσης, στα πρωτοταγή αντιοξειδωτικά ανήκουν οι τοκοφερόλες και φαινόλες όπως το καφεικό οξύ. Τα δευτεροταγή αντιοξειδωτικά είναι αντιοξειδωτικά με την ευρύτερη έννοια του όρου, και δρουν με διάφορους τρόπους. Μέθοδοι αποτίμησης της οξείδωσης ελαίων

67 Απορρόφηση στο υπεριώδες Με μέτρηση απορρόφησης στο υπεριώδες μπορεί να γίνει εκτίμηση του βαθμού οξείδωσης ελαίων. Κατά την αυτοξείδωση παράγονται, από τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, υδρο-υπεροξείδια και άλλες ενώσεις με συζυγιακούς διπλούς δεσμούς. Τα υδρο-υπεροξείδια του λινελαικού και του λινολενικού οξέος απορροφούν στα 232 και 270 nm, αντίστοιχα. Με το σχηματισμό συζυγών διενίων προκύπτει μέγιστo απορρόφησης στα nm. Κατά το σχηματισμό υδρο-υπεροξειδίων από ακόρεστα λιπαρά οξέα, παράγονται συζυγή διένια. Η αποτίμηση αυτών γίνεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 234 nm. Τα συζυγή τριένια απορροφούν στα nm. Ο προσδιορισμός των συζυγών διενίων με την απορρόφηση στα 234 nm σχετίζεται με το περιεχόμενο σε υδρο-υπεροξείδια, δηλαδή πρωτογενή προϊόντα της οξείδωσης των λιπαρών. Είναι ευαίσθητη μέθοδος για παρακολούθηση των αρχικών σταδίων της οξείδωσης των λιπαρών κατά τη διάρκεια των οποίων τα υπεροξείδια δεν αποικοδομούνται ή αποικοδομούνται λίγο. Η απορρόφηση στα 270 nm είναι δείκτης δευτερογενούς οξείδωσης. Είναι γνωστό ότι σε προχωρημένο στάδιο οξείδωσης, τα υδρουπεροξείδια αποικοδομούνται σε δευτερογενή και πολυμερή προϊόντα τα οποία απορροφούν στα 270 nm απορρόφηση που οφείλεται σε συζυγή τριένια, ενώ η απορρόφησή τους στα 234 nm είναι μικρή. Έτσι, η απορρόφηση στα 270 nm αντανακλά και αποτιμά κυρίως τα δευτερογενή προιόντα όπως αλδεύδες και κετόνες. Αριθμός υπεροξειδίων Είναι μία από τις πιο παλιές και πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μεθόδους για μέτρηση της έκτασης της οξείδωσης στις λιπαρές ύλες. Αποτιμά την πρωτογενή οξείδωση. Το οξειδωμένο δείγμα διαλύεται σε μίγμα χλωροφορμίου οξικού οξέος και προστίθεται ιωδιούχο κάλιο σαν αναγωγικό μέσο. Τα υπεροξείδια, που είναι τα πρώτα προϊόντα αυτοξείδωσης αντιδρούν με ιωδιούχο κάλιο. Το ιώδιο που παράγεται, ογκομετρείται με θειοθειϊκό νάτριο, παρουσία δείκτη αμύλου. Ο αριθμός υπεροξειδίων εκφράζεται ως meq ιωδίου / kg λιπαρής ύλης. ROOH + 2HΙ ROH + H 2 O + Ι 2

68 Αριθμός ανισιδίνης Ο αριθμός ανισιδίνης προσδιορίζει τις υψηλού μοριακού βάρους κορεσμένες και ακόρεστες καρβονυλικές ενώσεις (μη πτητικές καρβονυλικές ενώσεις). Μετράται η απορρόφηση στα 350 nm, ενός διαλύματος λιπαρής ύλης σε ισοοκτάνιο, παρουσία αντιδραστηρίου ανισιδίνης σε οξικό οξύ. Ο αριθμός ανισιδίνης αποτιμά τη δευτερογενή οξείδωση. Δοκιμή θειοβαρβιτουρικού οξέος Η δοκιμή θειοβαρβιτουρικού οξέος μετρά το τάγγισμα σε ορισμένες τροφές καθώς και τα προϊόντα οξείδωσης σε βιολογικά συστήματα. Βασίζεται στο ροζ χρώμα που απορροφά στα 532 nm, το οποίο παράγεται από την αντίδραση του θειοβαρβιτουρικού οξέος και των προϊόντων οξείδωσης των πολυακόρεστων λιπιδίων (δευτερογενής οξείδωση).

69 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Αποτίμηση αντιοξειδωτικής δράσης δέσμευσης ελεύθερης από χυμό φρούτων Μέθοδος Folin-Ciocalteu Σε δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 0,2 ml χυμού (αραιωμένου) (είτε άλλου υγρού διαυγούς τροφίμου όπως οίνου) και 1,5 ml αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (αραιωμένου 10 φορές). Στη συνέχεια, μετά από 5 min, προστίθενται 1,5 ml διαλύματος Na 2 CO 3 60 g/l. Ακολουθεί ανάμιξη και παραμονή για 90 (30-45) min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Μετράται η απορρόφηση στα 725 (750) nm. Κατασκευάζεται πρότυπη με γαλλικό οξύ. Τυπική εξίσωση, A=0,0062 C-0,0352, όπου Α η απορρόφηση και C η συγκέντρωση σε mg/l. Ικανότητα δέσμευσης της ρίζας DPPH Σε δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 2,4 ml διαλύματος DPPH (6χ10-5 mmol/l σε μεθανόλη) και προστίθενται 0,1 ml χυμού (είτε άλλου τροφίμου όπως οίνου) και αραιώσεών τους. Μετράται η απορρόφηση στα 515 nm σε κυψελίδες 1 cm, στα 0, 5, 10 και 20 min. Ως τυφλό μετράται η απορρόφηση του διαλύματος DPPH όπου αντί για προϊόν προστίθεται 0,1 ml 12 % αλκοόλης είτε απεσταγμένου νερού. Η % αναστολή υπολογίζεται από τη σχέση (Α 0 Α t : A 0 ) x 100, όπου Α 0 η απορρόφηση τυφλού σε χρόνο 0, και Α t η απορρόφηση του δείγματος σε χρόνο t. Υπολογίζεται η συγκέντρωση ολικών φαινολικών που μειώνει στο 50 % την συγκέντρωση της ρίζας DPPH. Ως μέτρο της συγκέντρωσης της ρίζας λαμβάνεται η απορρόφηση στα 515 nm. Η συγκέντρωση της ρίζας (mg/l) υπολογίζεται από εξίσωση, με βάση την απορρόφηση στα 515 nm. Τυπική εξίσωση C=9,54 χ Α, όπου C η συγκέντρωση της ρίζας DPPH και Α η απορρόφηση.

70 Ενζυμική καστάνωση Αποφλοιώνονται και τεμαχίζονται μήλα. Τεμάχια αφήνονται εκτεθειμένα στον αέρα σε πυριατήριο στους o C ή στο περιβάλλον. Αυτά είναι ο θετικός μάρτυρας. Μετά από μία ώρα τα τεμάχια παρατηρούνται οπτικά, και βαθμολογούνται με κλίμακα 0-5. Ως αρνητικός μάρτυρας θεωρούνται τεμάχια μήλου που εξετάζονται αμέσως μετά τον τεμαχισμό. Ο θετικός μάρτυρας βαθμολογείται με 5 και ο αρνητικός με 0. Επίσης, εξετάζεται η επίδραση ασκορβικού και κιτρικού οξέος. Τεμάχια εμβαπτίζονται σε διάλυμα ασκορβικού οξέος, 2 %, ph περίπου 6. Αυτό επειδή η πολυφαινυλοξειδάση έχει ph δράσης 5-7. Τα τεμάχια παραμένουν στο διάλυμα ασκορβικού οξέος. Στη συνέχεια τεμάχια αφήνονται εκτεθειμένα στον αέρα σε πυριατήριο στους o C ή στο περιβάλλον. Μετά από μία ώρα τα τεμάχια παρατηρούνται οπτικά και βαθμολογούνται με την κλίμακα 0-5. Τεμάχια εμβαπτίζονται σε διάλυμα κιτρικού οξέος 5 % ph 3-4. Ακολούθως διατηρούνται o C σε πυριατήριο ή στο περιβάλλον. Μετά από μία ώρα τα τεμάχια παρατηρούνται οπτικά και βαθμολογούνται με την κλίμακα 0-5. Τεμάχια εμβαπτίζονται σε διάλυμα κιτρικού οξέος 5 % και ασκορβικού οξέος 2 %, ph 3-4. Ακολούθως κατεργάζονται όπως παραπάνω. Αποτίμηση οξείδωσης ελαίων Σε δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 10 ml ισοοκτανίου και 10 μl δείγματος. Ακολουθεί ανάδευση και μέτρηση της απορρόφησης στα 234 nm και 270 nm, με κυψελίδα 1 cm, και τυφλό ισοοκτάνιο. Στο εργαστήριο θα γίνει αποτίμηση του βαθμού οξείδωσης αραβοσιτέλαιου και ελαιολάδου πριν και μετά από θερμική του κατεργασία. Αποτίμηση δέσμευσης ελεύθερης ρίζας από έλαιο Αναμιγνύονται 2 ml διαλύματος DPPH σε οξικό αιθυλεστέρα με 1 ml δείγματος ελαίου είτε αραιώσεών του σε οξικό αιθυλεστέρα. Μετράται η απορρόφηση στα 515 nm για min.

71 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 8 ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ (TLC) - ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΙΚΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Επικ. Καθ. Α. Μπαδέκα, MSc. X. Πιπερίδη, Αναπλ. Καθ. Μ. Τασιούλα-Μάργαρη Οκτώβριος Εισαγωγή Το χρώμα των τροφίμων είναι πολύ σημαντικός παράγοντας για την διατροφική τους αξία, σημαντικότερος ακόμα κι από τη γεύση και το άρωμά τους, γιατί η ελκυστική εμφάνισή τους είναι το πρώτο ερέθισμα για τον καταναλωτή. Μερικοί από τους λόγους για τους οποίους προστίθενται χρώματα στα τρόφιμα είναι: α) Για να τους δώσουν ελκυστική εμφάνιση αντικαθιστώντας το φυσικό τους χρώμα, που καταστρέφεται στις συνθήκες παρασκευής ή αποθήκευσης. β) Να χρωματίσουν ορισμένα τρόφιμα, όπως παγωτά, μη αλκοολούχα ποτά κ.ά., τα οποία έχουν πολύ λίγο ή καθόλου χρώμα. γ) Να ενισχύσουν το ήδη υπάρχον φυσικό τους χρώμα. δ) Να εξασφαλιστεί η ομοιομορφία διαφόρων παρτίδων, όταν χρησιμοποιούνται πρώτες ύλες διαφόρων χρωμάτων από διαφορετικές πηγές. Απαραίτητη προϋπόθεση για να χρησιμοποιηθεί μια χρωστική, φυσική ή συνθετική, σε τρόφιμα είναι να μην θέτει σε κίνδυνο την ανθρώπινη υγεία όταν χρησιμοποιείται στις επιτρεπτές συγκεντρώσειs (~0,02%). Σε περιπτώσεις νοθείας των τροφίμων η προϋπόθεση αυτή δεν τηρείται συνήθως. Η πρώτη προσπάθεια ελέγχου της νοθείας έγινε το 1820, στη δεκαετία όμως του 1850 ευαισθητοποιήθηκε η δημόσια συνείδηση λόγω μελετών και ενημέρωσης. Ακολούθησε η εξέλιξη των μεθόδων ανάλυσης των τροφίμων και η παραγωγή και χρησιμοποίηση συνθετικών χρωμάτων παράλληλα με τα φυσικά. Τα συνθετικά χρώματα επικράτησαν των φυσικών, λόγω των

72 περισσότερων πλεονεκτημάτων τους σε σύγκριση με τα φυσικά, όπως μεγαλύτερη ποικιλία αποχρώσεων, μικρότερο κόστος, αποτελεσματικότητα σε μικρότερες συγκεντρώσεις, σημαντική ομοιομορφία από παρτίδα σε παρτίδα, απουσία χαρακτηριστικού αρώματος και γεύσης. Μετά από δεκαετίες δημιουργήθηκαν ερωτηματικά για την καταλληλότητα των συνθετικών χρωμάτων, ως πρόσθετα στα τρόφιμα. Η επιλογή τους έγινε με κριτήριο την τεχνική και τοξικολογική τους καταλληλότητα και έτσι δημιουργήθηκαν πίνακες επιτρεπτών και μη επιτρεπτών χρωμάτων για τρόφιμα, οι οποίοι όμως διαρκώς αναθεωρούνται με την εξέλιξη της έρευνας. 2. Φυσικές χρωστικές Από τα φυσικά χρώματα σπουδαιότερα είναι τα καροτενοειδή, οι ανθοκυανίvεs (ή ανθοκυάνες) και οι χρωστικές των κόκκινων τεύτλων (παντζαριών). Τα καροτενοειδή, τα οποία είναι λιποδιαλυτές χρωστικές των καρότων, έχουν Α βιταμινική δράση και παρασκευάζονται και συνθετικά. Προτιμώνται επειδή η σταθερότητά τους στο φώς είναι σημαντική σε σχέση με άλλα χρώματα. Οι ανθοκυανίvεs, είναι φυσικές χρωστικές, στις οποίες οφείλονται το πορτοκαλί, κόκκινο και μωβ χρώμα των φυτών. Οι ανθοκυανίνες είναι αρκετά θερμοάντοχες και δεν αποικοδομούνται στο φως της ημέρας. Η χρωστική των κόκκινων τεύτλων, η βηταλαΐνη, είναι μίγμα χρωστικών, που αποτελούνται από βητακυανίνες και βηταξανθίvες. 3. Οργανικά συνθετικά χρώματα Είναι έγχρωμες ουσίες που μπορούν να προστεθούν στα τρόφιμα σε μορφή διαλύματος ή αιωρήματος. Συνήθως οι ουσίες αυτές έχουν χημική συγγένεια με το υπόστρωμα-τρόφιμο και απορροφώνται εύκολα από αυτό. Και αυτά, όπως και τα φυσικά χρώματα, υφίστανται βιολογικό έλεγχο για να εξακριβωθεί η τοξικότητά τους. Τα συνθετικά χρώματα διακρίνονται επίσης σε υδατοδιαλυτά, λιποδιαλυτά, μη διαλυτά και λάκκες. 4. Απομόνωση και ταυτοποίηση χρωστικών σε ποτά

73 Μια οικονομική και σχετικά σύντομη μέθοδος διαχωρισμού και ανίχνευσης πολλών χρωστικών, η χρωματογραφία χάρτου, εφαρμόζεται σε πολλά εργαστήρια ελέγχου τροφίμων με ικανοποιητικά αποτελέσματα. Η ταυτοποίηση των χρωστικών, που περιέχουν τα ποτά, πραγματοποιείται με τη σύγκρισή τους με πρότυπα διαλύματα χρωστικών. Απομόνωση των χρωστικών Οι συνθετικές υδατοδιαλυτές χρωστικές παραλαμβάνονται από το δείγμα με τη βαφή μικρής ποσότητας μαλλιού σε ορισμένες συνθήκες, όπως περιγράφεται παρακάτω. Πειραματικό μέρος 0,3g απολιπασμένου μαλλιού (9-12 ώρες σε συσκευή Soxhlet με πετρελαϊκό αιθέρα) μεταφέρεται μέσα στο δείγμα (25ml ποτού + 25ml νερού), στο οποίο έχουν προηγουμένως προστεθεί 2ml διαλύματος KHSO 4 * 10%, 2ml διαλύματος CH 3 COONa 10% και 1ml CH 3 COOH 10%. Το δείγμα βράζεται, ώσπου να βαφεί το μαλλί, το οποίο στη συνέχεια πλένεται με άφθονο νερό και βράζεται επί 2-3 λεπτά με λίγο νερό το οποίο αποχύνεται. Ο βρασμός με νερό επαναλαμβάνεται 2-3 φορές. Το βαμμένο μαλλί στη συνέχεια ξεπλένεται, στραγγίζεται και βράζεται επί 2-3 λεπτά με λίγη αλκοόλη (5-10ml) η οποία στη συνέχεια αποχύνεται. Για την εκχύλιση και παραλαβή των χρωστικών βράζεται το μαλλί με 5-6ml αμμωνίας 10% και 20ml αλκοόλης και το εκχύλισμα μεταφέρεται σε ένα καψάκι. Η παραπάνω εκχύλιση επαναλαμβάνεται, ώσπου να αποχρωματισθεί το μαλλί εντελώς. Τα ενωμένα εκχυλίσματα, που συγκεντρώθηκαν στο καψάκι, συμπυκνώνονται μέχρι μικρού όγκου (1-2 σταγόνες). Στο τέλος της συμπύκνωσης προστίθεται στο καψάκι μία σταγόνα αμμωνίας 10%. *Αν κατά την προσθήκη του KHSO 4 εξασθενίσει ή εξαφανιστεί τελείως το χρώμα του δείγματος, εξουδετερώνεται με 1N NaOH και δείκτη χαρτί ηλιοτροπίου.

74 Χρωματογραφία του δείγματος Σε ένα ορθογώνια χαρτί χρωματογραφίας Whatman No 1 χαράζεται (με μολύβι) σε απόσταση 3cm περίπου από τη μικρή πλευρά και παράλληλα προς αυτή μία ευθεία γραμμή. Στη γραμμή αυτή σημειώνονται οι θέσεις, που θα τοποθετηθούν οι κηλίδες των προτύπων χρωστικών και οι θέσεις των δειγμάτων. Στη συνέχεια μεταφέρονται στο χαρτί μικροί όγκοι (λίγων μl) από τα πρότυπα διαλύματα των χρωστικών και από το παραπάνω εκχύλισμα του δείγματος με τη βοήθεια τριχοειδών σωλήνων. Οι σωλήνες αυτοί πρέπει να ακουμπούν πολύ ελαφρά και για μικρό χρόνο κάνω στα χαρτί, για να αποφεύγεται το "άπλωμα" των κηλίδων. (Το άπλωμα αντιμετωπίζεται με το στέγνωμα της κηλίδας με θερμό αέρα). Για κάθε διάλυμα πρέπει να χρησιμοποιείται καθαρός τριχοειδής σωλήνας, διαφορετικά τα αποτελέσματα θα είναι λανθασμένα. Επίσης για τον ίδιο λόγο το χαρτί χρωματογραφίας πρέπει να διατηρείται σχολαστικά καθαρό. Μετά την τοποθέτηση και το στέγνωμα των κηλίδων, το χαρτί μεταφέρεται στον θάλαμο χρωματογραφίας, ο οποίο έχει προηγουμένως κορεσθεί τουλάχιστον για δύο ώρες με το υγρό ανάπτυξης Ν ο 13. Το χαρτί κρεμιέται στον θάλαμο με τέτοιο τρόπο ώστε η πλευρά που περιέχει τη γραμμή με τις κηλίδες να βυθίζεται ελαφρά στο υγρό ανάπτυξης, που βρίσκεται μέσα σ' ένα σκαφίδιο τοποθετημένο στον πυθμένα του θαλάμου. Η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος γίνεται με την ανερχόμενη τεχνική και διαρκεί περίπου 3-4 ώρες. Όταν το υγρό ανάπτυξης φθάσει σε ύψος, που απέχει 2-2,5 cm από το σημείο στήριξης του χαρτιού, το χρωματογράφημα απομακρύνεται από τον θάλαμο και σημειώνεται αμέσως το μέτωπο του διαλύτη. Μετά το στέγνωμα του χαρτιού υπολογίζονται τα R f των κηλίδων του δείγματος και συγκρίνονται με τις κηλίδες των προτύπων. Εάν υπάρχουν κηλίδες του δείγματος, που δεν μπορούν να ταυτιστούν με τις συγχρωματογραφημένες πρότυπες χρωστικές, επιδιώκεται η αναγνώρισή τους σε σύγκριση με τις τιμές R f του παρακάτω πίνακα. Πίνακας: Τιμές R f ορισμένων συνθετικών χρωστικών στο υγρό ανάπτυξης Ν ο 13 Αριθμός Ε102 Ε110 Ε120 Ε122 Ε123 Ε124 Ε125 Ε127 Ε132 Ε151 Ε152

75 διαλύτη 13 0,74 0,63 0,96 0,27 0,39 0,73 0,56 0,06 0, Οι πρότυπες χρωστικές δίνουν πάντοτε μία κηλίδα, ενώ oι χρωστικές των δειγμάτων είναι συνήθως μίγματα και δίνουν σειρά από κηλίδες με διάφορα R f. Το ανεπτυγμένο χρωματογράφημα δεν χρειάζεται εμφάνιση, γιατί όλες οι χρωστικές απορροφούν στο ορατό φώς και οι κηλίδες τους είναι ευδιάκριτες επάνω στο χαρτί. Η παρατήρηση του χρωματογραφήματος στο UV δίνει μια επιπλέον πληροφορία, για την ταυτότητα των χρωστικών, που περιέχει το δείγμα. Αντικειμενική Μέτρηση Χρώματος Τροφίμων Το χρώμα είναι ένας σημαντικός παράγοντας/δείκτης για τις βιομηχανίες τροφίμων και επηρεάζει την επιλογή και προτίμηση των καταναλωτών. Το χρώμα του τροφίμου επηρεάζεται από χημικές, βιοχημικές, μικροβιακές και φυσικές αλλαγές οι οποίες συμβαίνουν κατά τα στάδια της ανάπτυξης, ωρίμανσης, συγκομιδής και επεξεργασίας. Για τη βιομηχανία τροφίμων είναι σημαντικό το σταθερό χρώμα ενός τροφίμου και υπάρχουν κάποιες πρότυπες τιμές που χαρακτηρίζουν το brand name ενός προϊόντος (π.χ. κέτσαπ) ή ελέγχουν την εμφάνιση του τελικού προϊόντος (π.χ. πατατάκια). Το χρώμα ενός σώματος είναι το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης της ορατής ακτινοβολίας ( nm) με το σώμα αυτό. Ουσιαστικά η ανακλώμενη ακτινοβολία από το σώμα αυτό είναι αυτή που δέχεται ο οφθαλμός (Σχήμα 1). Η πλήρης ανάκλαση της ακτινοβολίας αντιστοιχεί στο λευκό χρώμα ενώ η πλήρης απορρόφηση αυτής στο μαύρο χρώμα. Το κάθε άλλο χρώμα ανακλά ένα μήκος κύματος κι έτσι γίνεται αντιληπτό από τον οφθαλμό (Πίνακας 1).

76 Σχήμα 1 Πίνακας 1. Μήκη κύματος των αντίστοιχων χρωμάτων. Χρώμα Μήκος κύματος (nm) Κόκκινο 700 Πορτοκαλί 625 Κίτρινο 600 Πράσινο 525 Μπλε 450 Βιολετί (ιώδες) 400 Η αντίληψη του χρώματος από τον άνθρωπο γίνεται μέσω παρατήρησης ενός αντικειμένου υπό την επίδραση του ηλιακού ή τεχνικού φωτός. Η μέτρηση του χρώματος με όργανο χρησιμοποιεί μία πηγή φωτός η οποία υπό γωνία ή κάθετα «πέφτει» στο δείγμα και έναν δέκτη (ένα πρίσμα για την ανάλυση της ανακλώμενης ακτινοβολίας) ο οποίος βρίσκεται κάθετα ή υπό γωνία (αντίθετα από την ακτινοβολία που χτυπά το δείγμα). Κάθε χρώμα έχει τη δική του χαρακτηριστική εμφάνιση και βασίζεται σε τρία στοιχεία: 1. Απόχρωση (hue): χρώμα (κόκκινο, πράσινο, πορτοκαλί κτλ.) Η πρώτη εντύπωση. 2. Κορεσμός (chroma/saturation): ένταση του χρώματος (ντομάτα παντζάρι) 3. Φωτεινότητα (lightness/value): φωτεινά ή σκοτεινά

77 Μέτρηση Χρώματος Τροφίμων Τα όργανα μέτρησης του χρώματος χρησιμοποιούν διάφορα συστήματα καταγραφής του χρώματος τα οποία χρησιμοποιούν τις τρεις αναφερόμενες παραμέτρους. Συγκεκριμένα καταγράφονται οι παράμετροι ΧΥΖ (κόκκινο, πράσινο, μπλε) (Σχήμα 2) ή L*a*b* (φωτεινότητα, κόκκινο-πράσινο, κίτρινομπλε) (Σχήμα 3) για τον εντοπισμό του χρώματος. z x y Σχήμα 2. Παράμετροι ΧΥΖ Σχήμα 3. Παράμετροι L*a*b*

78 Πειραματικό μέρος Στο εργαστήριο θα χρησιμοποιηθεί το σύστημα L*a*b* με χρήση του χρωματόμετρου HunterLab το οποίο τίθεται σε λειτουργία τουλάχιστον 2 ώρες πριν τη μέτρηση. 1. Αραίωση δείγματος μελιού 1/10 έτσι ώστε να λάβουμε τελικό όγκο δείγματος ίσο με περίπου 50 ml. (π.χ. 5g μελιού και 45ml απεσταγμένου νερού) 2. Κάνουμε calibration του οργάνου σύμφωνα με τις οδηγίες του οργάνου. 3. Τοποθετούμε το δείγμα (50ml) σε τριβλίο Petrie. 4. Τοποθετούμε το τριβλίο στη θέση μέτρησης του οργάνου. 5. Καταγράφουμε τις παραμέτρους L*a*b*. 6. Συγκρίνουμε τις τιμές με πρότυπες τιμές διαφόρων μελιών και συμπεραίνουμε σε ποια κατηγορία ανήκει το δείγμα μας. Δείγμα L* a* b* ΕΛΑΤΗΣ 74,17-4,48 25,86 ΠΕΥΚΟΥ 74,41-3,74 22,48 ΘΥΜΑΡΙΟΥ 78,28-2,58 7,15 ΠΟΡΤΟΚΑΛΙΑΣ 78,94-1,85 4,31 ΑΝΘΟΜΕΛΟ 77,30-3,63 12,86 Βιβλιογραφία 1. S. Sahin, S.G. Sumnu, Physical Properties of Foods, Springer, HunterLab, Reston, USA. 3. S.S. Nielsen, Food Analysis, Springer, 2010.

79 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι: Κωδικοί Ε, ονομασία και χαρακτηρισμός χρωστικών τροφίμων Κωδικός Ονομασία Λειτουργία E100 Κουρκουμίνη Πορτοκαλί-κίτρινο χρώμα E100(ii) Τουρμερικό Πορτοκαλί-κίτρινο χρώμα E101 Ριβοφλαβίνη Κίτρινο χρώμα, βιταμινη B2 E101(ii) 5-φωσφορική Ριβοφλαβίνη Κίτρινο χρώμα, βιταμινη B2 E102 Ταρτραζίνη Κίτρινο χρώμα, αζώχρωμα E104 Κίτρινη Κινολίνη Πράσινο-κίτρινο χρώμα,συνθετική E106 5-φωσφορικό νάτριο Ριβοφλαβίνη Κίτρινο χρώμα, βιταμινη B2 E107 Κίτρινο 2G Κίτρινο χρώμα, αζώχρωμα E110 K ιτρινοπορτοκαλί FCF Κίτρινο χρώμα E120 Καρμίνη, κοχενίλη Κόκκινο χρώμα, φυσικό E122 Αζορουμπίνη Κόκκινο χρώμα.αζώχρωμα E123 Αμαράνθη Κόκκινο χρώμα.αζώχρωμα E124 Ερυθρό κοχενίλης (Ponceau 4R) Κόκκινο χρώμα. αζώχρωμα E127 E ρυθροσίνη Κόκκινο χρώμα, συνθετικό E128 Κόκκινο 2G Κόκκινο χρώμα, συνθετικό E129 Κόκκινο τροφίμων 17 (Allura Red AC) Κόκκινο χρώμα. αζώχρωμα E131 Μπλε V Μπλε χρώμα, συνθετικό E132 I νδικοτίνη Μπλε χρώμα, συνθετικό E133 Λαμπρό κυανούν FCF Μπλε χρώμα, συνθετικό E140 Χλωροφύλλη Πράσινο χρώμα, φυσικό E141 Συμπλέγματα χλωροφύλλης με χαλκό Πράσινο χρώμα, συνθετικό E142 Πράσινο S Πράσινο χρώμα, συνθετικό E150a-d Καραμελόχρωμα Καφέ χρώμα E151 Λαμπρό μαύρο BN Μαύρο χρώμα, αζώχρωμα

80 E153 Άνθρακας Φυσικό μαύρο χρώμα E154 Καφέ FK Καφέ χρώμα, αζώχρωμα E155 Καφέ HT Καφέ χρώμα, αζώχρωμα E160a Άλφα-, βήτα- και γάμα- καροτένιο Φυσικό πορτοκαλί-κίτρινο χρώμα E160b Ανάτο, Μπιξίνη, Νορπιξίνη Φυσικό κίτρινο χρώμα E160c Εκχύλισμα πιπεριάς Φυσικό πορτοκαλί χρώμα E160d Λυκοπένιο Φυσικό κόκκινο χρώμα E160e Βήτα-απο-8-καροτενάλη Φυσικό πορτοκαλί-κίτρινο χρώμα E160f Αιθυλεστέρας του βήτα-απο-8-καροτενικου οξέος Φυσικό πορτοκαλί-κίτρινο χρώμα E161a Φλαβοξανθίνη Φυσικό, κίτρινο χρώμα E161b Λουτε ί νη Φυσικό, κίτρινο χρώμα E161c Κρυπτοξανθίνη Φυσικό, κίτρινο χρώμα E161d Ρουβιξανθίνη Φυσικό, κίτρινο χρώμα E161e Βιολοξανθίνη Φυσικό, κίτρινο χρώμα E161f Ροδοξανθίνη Φυσικό, κίτρινο χρώμα E161g Κανθαξανθίνη Φυσικό, πορτοκαλί χρώμα E161h Κιτρονοξανθίνη Φυσικό, κίτρινο χρώμα E162 Εκχύλισμα παντζαριού Φυσικό κόκκινο χρώμα E163 Ανθοκυάνες Φυσικό κόκκινο-μωβ χρώμα E170 Ανθρακικό ασβέστιο Άσπρο χρώμα E171 Διοξείδιο του τιτανίου Άσπρο χρώμα E172 Οξείδια του σιδήρου Φυσικό κόκκινο-καφέ χρώμα E173 Αλουμίνιο Μεταλλικό (χρώμα) E174 Άργυρος Μεταλλικό (χρώμα) E175 Χρυσός Μεταλλικό (χρώμα) E180 Λιθορουμπίνη BK Κόκκινο χρώμα, αζώχρωμα 181 Ταννίνες Κίτρινο-άσπρο χρώμα και γεύση

81

82 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 7 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΙΚΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΦΟΡΤΙΟΥ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Ιωάννης Σαββαίδης Οκτώβριος 2018 Σκοπός της εργασίας είναι ο προσδιορισμός του ολικού μικροβιακού φορτίου στα τρόφιμα, καθώς και ο προσδιορισμός των Εντεροβακτηρίων που βρίσκονται στο δείγμα. Στην παρούσα άσκηση χρησιμοποιούνται οι τεχνικές της επίστρωσης για τον προσδιορισμό του μικροβιακού φορτίου, και της ενσωμάτωσης για τον προσδιορισμό των Εντεροβακτηρίων σε δείγμα προϊόντος κρέατος (κιμάς). ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μικροβιολογία του κρέατος Τα κυριότερα είδη των βακτηρίων, ζυμών και μυκήτων που αναπτύσσονται στο κρέας και τα προϊόντα του, φαίνονται στον Πίνακα. Σε γενικές γραμμές, η μικροβιακή χλωρίδα του κρέατος αντανακλά το περιβάλλον στο οποίο έγινε η σφαγή και η επεξεργασία αυτού. Κυριαρχούν τα βακτήρια αρνητικά κατά Gram, ενώ από τα βακτήρια τα οποία είναι θετικά στη χρώση κατά Gram, αυτά που συναντούνται είναι οι εντερόκοκκοι και οι γαλακτοβάκιλλοι. Είδος Χρώση κατά Gramm Συχνότητα εμφάνισης στο κρέας Acinetobacter - XX Aeromonas - XX Alcaligenes - X

83 Bacillus + X Brochrothrix + X Carnobacterium + X Citrobacter - X Clostridium + X Corynedacterium + X Enterobacter - X Enterococcus + XX Escherichia - X Flavobacterium - X Lactococcus + X Lactobacillus + X Leuconostoc + X Listeria + X Microbacterium + X Micrococcus + X Moraxella - XX Pediococcus + X Proteus - X Pseudomonas - XX Psychrobacter - XX Salmonella - X Serratia - X Shewanella - X Staphylococcus + X Weissella + X Yersinia - X

84 Πίνακας: Τα κυριότερα βακτήρια που απαντούν στο κρέας. Σημείωση: Χ: εμφανίζεται, ΧΧ: εμφανίζεται πολύ συχνά. Γενικά είναι ανάγκη να σημειωθεί ότι το κονιορτοποιημένο κρέας (κιμάς) εμφανίζει μεγαλύτερο αριθμό μικροοργανισμών από το κρέας το οποίο δεν έχει κονιορτοποιηθεί. Οι λόγοι για τους οποίους αυτό μπορεί να συμβαίνει είναι οι εξής: 1. Ο κιμάς του εμπορίου, o οποίος αποτελείται από μικρά τεμάχια κρέατος συνήθως περιέχει υψηλά επίπεδα μικροοργανισμών. Ο κιμάς που προέρχεται από μεγαλύτερα τεμάχια έχει μικρότερο μικροβιακό φορτίο 2. Ο κιμάς προσφέρει μεγάλο εμβαδόν επιφάνειας, το οποίο συμβάλει στην αυξημένη μικροβιακή χλωρίδα. Αυτό συμβαίνει διότι, καθώς μειώνεται το μέγεθος των τεμαχιδίων που αποτελούν το κιμά, αυξάνεται η συνολική επιφάνεια και έτσι αυξάνεται και η επιφανειακή ενέργεια. 3. Επιπλέον αυτή η αυξημένη επιφάνεια συντελεί στην ανάπτυξη αερόβιων βακτηρίων, τα οποία αποτελούν τη συνηθισμένη χλωρίδα που αναπτύσσεται στις χαμηλές θερμοκρασίες (είναι γνωστό ότι τα βακτήρια αναπτύσσονται στην επιφάνεια του τροφίμου). 4. Σε κάποιες εγκαταστάσεις είναι δυνατό να μη καθαρίζονται σωστά και συχνά οι συσκευές και οι εγκαταστάσεις όπου κονιορτοποιείται το κρέας. 5. Τέλος πρέπει να σημειωθεί ότι ένα κομμάτι κρέατος το οποίο είναι μολυσμένο, αρκεί για να επιμολύνει και τα υπόλοιπα καθώς θα περνούν από τη μηχανή αλέσεως. Θρεπτικά υλικά Η απομόνωση, διατήρηση και πολλαπλασιασμός των μικροοργανισμών επιτυγχάνεται σε θρεπτικά υποστρώματα τα οποία ονομάζονται θρεπτικά υλικά. Αυτά μπορεί να είναι φυσικά ή συνθετικά. Τα φυσικά θρεπτικά υλικά περιλαμβάνουν τεμάχια ιστών ή εκκρίσεις αυτών και

85 χρησιμοποιούνται ως έχουν. Τα συνθετικά ή τεχνικά υλικά αποτελούνται από διάφορες χημικές ουσίες που διαπιστωμένα είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών, και σε αυτές τις περιπτώσεις η σύνθεσή τους είναι απόλυτα ακριβής και καθορισμένη. Ο κυριότερος παράγοντας που επηρεάζει ή καθορίζει τον πολλαπλασιασμό των μικροοργανισμών είναι τα θρεπτικά συστατικά του υποστρώματος. Το υπόστρωμα θα πρέπει να περιέχει όλα τα θρεπτικά συστατικά τα οποία είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των μικροοργανισμών. Γενικά τα θρεπτικά υποστρώματα θα πρέπει να περιλαμβάνουν τα εξής συστατικά: i. Μια ή περισσότερες πηγές άνθρακα ii. Μια πηγή αζώτου iii. Βιταμίνες iv. Ανόργανα άλατα v. Ιχνοστοιχεία Επιπλέον είναι ανάγκη το ph του υποστρώματος να είναι κοντά στο 7 για να επιτευχθεί η άριστη ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Τα θρεπτικά υποστρώματα μπορεί να είναι υγρά (broths- liquid media) ή στερεά (solid media). Για την παρασκευή στερεού θρεπτικού υλικού είναι απαραίτητη η χρήση πηκτικού παράγοντα, όπως είναι το άγαρ. Αυτό το συστατικό προέρχεται από την εκχύλιση ορισμένων φυκιών (ροδοφύκη) και είναι ένας ουδέτερος υδατάνθρακας ο οποίος έχει πολύ ενδιαφέρουσες υδροφιλικές ιδιότητες. Επίσης, ως πηκτικός παράγοντας μπορεί να χρησιμοποιηθεί και η ζελατίνη, η οποία όμως συγκριτικά με τα άγαρ παρουσιάζει τα εξής μειονεκτήματα: i. Προστίθεται σε μεγαλύτερη περιεκτικότητα (12-15%). ii. Ρευστοποιείται σε θερμοκρασίες >25 ο C. iii. Επηρεάζεται από το χαμηλό ph και συχνά υδρολύεται από τα πρωτεολυτικά ένζυμα των μικροοργανισμών. Είναι ανάγκη να σημειωθεί ότι ως πηκτικός παράγοντας μπορεί να χρησιμοποιηθεί και το κολλοειδές πυρίτιο, ειδικά σε περιπτώσεις που μελετάται η φυσιολογία των μικροοργανισμών σε σχέση με τις απαιτήσεις τους σε πηγή άνθρακα. Τα θρεπτικά υποστρώματα μπορούν να διακριθούν σε γενικά και εξειδικευμένα υποστρώματα. Τα γενικά υποστρώματα περιέχουν όλα τα απαραίτητα συστατικά για την ανάπτυξη όλων σχεδόν των

86 μικροοργανισμών. Τα συστατικά αυτών των υλικών προέρχονται από την ενζυμική διάσπαση διαφόρων φυτικών και ζωικών ιστών, καζεΐνης και κυττάρων ζύμης τα οποία παρέχουν πλούσιες πηγές πολυπεπτιδίων, αμινοξέων, βιταμινών ή αλάτων, όπως π.χ. το Nutrient broth ή άγαρ. Αυτό αποτελείται από εκχύλισμα κρέατος και πεπτόνη. Τα εξειδικευμένα υποστρώματα είναι αυτά τα οποία χρησιμοποιούνται για την απομόνωση συγκεκριμένων κατηγοριών μικροοργανισμών, και αυτό γιατί η σύνθεσή τους λειτουργεί παρεμποδιστικά στην ανάπτυξη κάποιων μικροοργανισμών, ενώ είναι ευνοϊκή για την ανάπτυξη άλλων. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με τους εξής τρόπους: i. Με τη διόρθωση του ph στο θρεπτικό υπόστρωμα, π.χ. MRS Agar του οποίο έχει ph=5,7 και χρησιμοποιείται για την απαρίθμηση και απομόνωση των γαλακτικών βακτηρίων. ii. Προσθήκη αντιβιοτικών, τα οποία αναστέλλουν τη δράση των μη επιθυμητών μικροοργανισμών iii. Προσθήκη ουσιών που επιτρέπουν τη διαφοροποίηση διαφορετικών αποικιών μεταξύ τους. Τα εξειδικευμένα υποστρώματα χωρίζονται στη συνέχεια σε δυο κατηγορίες: i. Επιλεκτικά (elective) είναι εκείνα τα υποστρώματα τα οποία ικανοποιούν τις θρεπτικές απαιτήσεις ενός ή περισσοτέρων ομάδων βακτηρίων χωρίς να παρεμποδίζουν τελείως άλλες ομάδες. ii. Εκλεκτικά (selective) είναι εκείνα τα υποστρώματα τα οποία περιέχουν ένα ή περισσότερους παρεμποδιστικούς παράγοντες οι οποίοι παρεμποδίζουν την ανάπτυξη άλλων ομάδων μικροοργανισμών, αλλά επιτρέπουν την ανάπτυξη στην ομάδα που είναι επιθυμητό να απομονωθεί. Τεχνικές προσδιορισμού μικροβιακού φορτίου Ένα βακτηριακό κύτταρό ή μια ομάδα κυττάρων όταν βρεθεί σε κατάλληλο υπόστρωμα δημιουργούν μια αποικία. Έτσι ο αριθμός των αποικιών που αναπτύσσονται σε ένα ήδη εμβολιασμένο υλικό, αντιπροσωπεύουν τον πραγματικό μικροβιακό πληθυσμό. Η απαρίθμηση των αποικιών εκφράζεται ως μονάδα σχηματιζόμενων αποικιών (colony

87 forming units, cfu). Επειδή όμως κάθε καλλιέργεια μικροοργανισμών ή τρόφιμο μπορεί να περιέχει από χίλια ως εκατοντάδες εκατομμύρια βακτηριακά κύτταρα ανά όγκο, ο προσδιορισμός του μικροβιακού φορτίου χρειάζεται μια διαδικασία διαχωρισμού των βακτηρίων ώστε όταν καλλιεργηθούν σε ένα στερεό θρεπτικό υλικό, να σχηματίζουν μεμονωμένες και ευκρινείς αποικίες. Αυτή είναι η διαδικασία των διαδοχικών αραιώσεων. Ο εμβολιασμός ενός βακτηριακού εναιωρήματος σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα γίνεται με δυο ποσοτικές τεχνικές: 1. Τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης (spread plate technique): είναι η εξάπλωση γνωστού όγκου βακτηριακού εναιωρήματος σε στερεό θρεπτικό υλικό. Αυτή η μέθοδος εφαρμόζεται γενικά στους αερόβιους μικροοργανισμούς. 2. Τεχνική της ενσωμάτωσης (pour plate technique): αποτελείται από τα εξής στάδια: α) Τοποθέτηση γνωστού όγκου βακτηριακού εναιωρήματος σε τρυβλίο και β) Απόχυση θρεπτικού υλικού που περιέχει άγαρ και είναι σε θερμοκρασία ο C (ρευστή κατάσταση). Αυτή η τεχνική εφαρμόζεται στους μικροαερόφιλους και προαιρετικά αναερόβιους μικροοργανισμούς. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Παρασκευή γενικού θρεπτικού υλικού PCA: 1. Σε φιάλη του 1l ζυγίζονται 22,5 g Plate Count Agar Base (Merck) και προστίθενται 1000 ml απεσταγμένο νερό. 2. Ανάδευση του υλικού σε μαγνητικό αναδευτήρα υπό θέρμανση έτσι ώστε να διαλυθεί το άγαρ. 3. Αποστείρωση στους 120 ο C για 15 min 4. Μετά την αποστείρωση το υλικό τοποθετείται σε λουτρό ώστε να κατέβει η θερμοκρασία του στους 45 ο C. 5. Αναδεύεται ήπια το υλικό μέχρι να διαλυθεί πλήρως το άγαρ 6. υπό ασηπτικές συνθήκες (χρήση λύχνου Bunsen), μοιράζεται το υλικό σε τρυβλία. Τοποθετούνται 15 ml περίπου σε κάθε τρυβλίο. 7. Ανοίγονται τα καπάκια από τα τρυβλία ώστε να φύγει η υγρασία.

88 8. Κλείνονται τα τρυβλία και αποθηκεύονται στους 3-5 ο C, ώστε να χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια. Δειγματοληψία Πορεία Ομογενοποίσης Ζυγίζονται 25 g κιμά και προστίθενται σε αραιωτικό υγρό 225 ml που έχει ήδη τοποθετηθεί σε ειδική σακούλα (Bag mixer), κατάλληλη για να χρησιμοποιηθεί στον ομογενοποιητή. Ο ομογενοποιητής Stomacher χρησιμοποιείται για την ομογενοποίηση στερεών ή υγρών δειγμάτων διαφορετικών πυκνοτήτων. Το αρχικό διάλυμα αποτελεί την αραίωση Στη συνέχεια λαμβάνεται 1ml με χρήση πιπέττας και τοποθετείται σε δοκιμαστικό σωλήνα ο οποίος περιέχει 9 ml αραιωτικού υγρού. Αυτή είναι η αραίωση Συνεχίζοντας με τον ίδιο τρόπο φτάνουμε μέχρι την αραίωση Κάθε φορά γίνεται αλλαγή στο tip της πιπέττας και κάθε φορά που ανοίγεται ένας δοκιμαστικός σωλήνας, περνιέται το στόμιό του από το λύχνο Bunsen. Πρέπει να σημειωθεί ότι το αραιωτικό υγρό ήταν πεπτονούχο διάλυμα, το οποίο αποτελείται από 1g πεπτόνης σε 1l απεσταγμένο νερό, ώστε να διατηρηθεί η ώσμωση του κυττάρου. Τεχνική επιφανειακής επίστρωσης 1. Λαμβάνεται 100 μl από την 10-5 αραίωση και εμβολιάζονται στο τρυβλίο με την αντίστοιχη αναγραφόμενη αραίωση. Πηγαίνουμε από το αραιότερο δείγμα προς το πυκνότερο, ώστε να μην έχουμε μεταφορά υλικού. 2. Τοποθετείται το τριγωνάκι σε ποτήρι ζέσεως το οποίο περιέχει 95% αλκοόλη και μετά φλογίζεται στον λύχνο Bunsen. ΠΡΟΣΟΧΗ! Δεν τοποθετείται το φλεγόμενο τριγωνάκι μέσα στο ποτήρι με την αλκοόλη. 3. Ψύχεται το τριγωνάκι σε μια περιοχή του θρεπτικού υλικού στην οποία δεν έχει εμβολιαστεί δείγμα. Στη συνέχεια εξαπλώνεται το βακτηριακό εναιώρημα σε όλη την επιφάνεια του θρεπτικού υλικού. 4. Επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία για όλες τις αραιώσεις. 5. Αναποδογυρίζονται τα τρυβλία και τοποθετούνται σε κλίβανο θερμοκρασίας 25 ο C για 48 ώρες. Προσοχή! Η επώαση γίνεται με το θρεπτικό υλικό από πάνω, διότι δεν πρέπει να πάει υγρασία στους μικροοργανισμούς.

89 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται το Plate Count Agar (PCA), το οποίο είναι ένα γενικό θρεπτικό υλικό, τα αποτελέσματα υπολογίζονται χρησιμοποιώντας τη σχέση : cfu/ml = (μέσος όρος του αριθμού των αποικιών)*αραίωση (1) Εάν πχ. οι αποικίες που μετρήθηκαν εμφανίστηκαν στην 10-3 αραίωση είναι 196,6 από τη σχέση (1) προκύπτει για την μεσόφιλη χλωρίδα: cfu/ml = 190,6*10 3 = cfu/ml, και Χ 10 (αραίωση) συνεπώς σε log 10 log =6,28 Η ΟΜΧ (Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα) του κιμά είναι ίση με 6,28 log cfu/g ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα μικροβιολογικά κριτήρια, τα οποία καθορίζουν την καταλληλότητα των τροφίμων από το κοινό, καθορίζονται από οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Συγκεκριμένα για την ποιότητα του κρέατος σε μορφή «κιμά» έχει θεσπιστεί η οδηγία 94/65/ EEC. Με βάση την οδηγία αυτή, το ανώτατο όριο αποδοχής, είναι για τo ολική μικροβιακό φορτίο (ή μεσόφιλη αερόβια χλωρίδα) είναι της τάξεως M=5*10 6 /g, πέραν του οποίου, το δείγμα πλέον κρίνεται ακατάλληλο προς κατανάλωση, όπου Μ είναι η τιμή της Μεσόφιλης Αερόβιας Χλωρίδας.

90 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 8 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Ιωάννης Σαββαίδης Οκτώβριος 2018 Τα Εντεροβακτήρια είναι μια μεγάλη ομάδα βακτηρίων τα οποία παρουσιάζουν κοινά μορφολογικά και φυσιολογικά χαρακτηριστικά. Είναι ιδιαίτερα σημαντικά στη Μικροβιολογία Τροφίμων, διότι σχετίζονται με την αλλοίωση των τροφίμων, κάποια είναι παθογόνα και κάποια αποτελούν δείκτες της μόλυνσης των τροφίμων από περιττώματα. Κυρίως τα Εντεροβακτήρια βρίσκονται στον εντερικό σωλήνα των ζώων και των ανθρώπων, αλλά κάποια μπορεί να βρεθούν και στη φύση, όπως για παράδειγμα στα φυτά, στο έδαφος και το νερό. Όλα τα Εντεροβακτήρια είναι ράβδοι, αρνητικά στη χρώση κατά Gram, είναι θετικά στην αντίδραση με τη βενζιδίνη και την καταλάση, είναι ικανά να ζυμώσουν την γλυκόζη. Είναι αρνητικά στην αντίδραση με την οξειδάση και είναι προαιρετικά αναερόβια (facultative anaerobes). Τα περισσότερα λοιπόν μπορούν να αναπνεύσουν αναερόβια, χρησιμοποιώντας τα νιτρικά ως τελικό αποδέκτη των ηλεκτρονίων. Έτσι το νιτρικό ανάγεται σε νιτρώδες. Παρασκευή επιλεκτικού θρεπτικού υποστρώματος VRBGA 1. Σε φιάλη των 500 ml ζυγίζονται 33,1 g VRBG Agar Base (Merck) και στη συνέχεια προστίθενται 500 ml απεσταγμένου νερού. 2. Γίνεται ανάδευση του υλικού σε μαγνητικό αναδευτήρα. 3. Ακολουθεί αποστείρωση στους 121 o C για 15 λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ Δειγματοληψία Πορεία Ομογενοποίησης

91 Ακολουθείται ή ίδια διαδικασία όπως στην τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης Ζυγίζονται 25 g κιμά και προστίθενται σε αραιωτικό υγρό 225 ml που έχει ήδη τοποθετηθεί σε ειδική σακούλα (Bag mixer), κατάλληλη για να χρησιμοποιηθεί στον ομογενοποιητή. Ο ομογενοποιητής Stomacher χρησιμοποιείται για την ομογενοποίηση στερεών ή υγρών δειγμάτων διαφορετικών πυκνοτήτων. Το αρχικό διάλυμα αποτελεί την αραίωση Στη συνέχεια λαμβάνεται 1ml με χρήση πιπέττας και τοποθετείται σε δοκιμαστικό σωλήνα ο οποίος περιέχει 9ml αραιωτικού υγρού. Αυτή είναι η αραίωση Συνεχίζοντας με τον ίδιο τρόπο φτάνουμε μέχρι την αραίωση Κάθε φορά γίνεται αλλαγή στο tip της πιπέττας και κάθε φορά που ανοίγεται ένας δοκιμαστικός σωλήνας, περνιέται το στόμιό του από το λύχνο Bunsen. Πρέπει να σημειωθεί ότι το αραιωτικό υγρό ήταν πεπτονούχο διάλυμα, το οποίο αποτελείται από 1g πεπτόνης σε 1l (1000 ml) απεσταγμένο νερό, ώστε να διατηρηθεί η ώσμωση του κυττάρου. Τεχνική της ενσωμάτωσης 1. Τοποθετείται 1μl από την 10-5 αραίωση στο τρυβλίο με την αντίστοιχη αναγραφόμενη αραίωση. Πηγαίνουμε από το αραιότερο δείγμα προς το πυκνότερο, ώστε να μην έχουμε μεταφορά υλικού από το ένα δείγμα στο άλλο. 2. Αποχύνονται περίπου 20 ml VRBGA στα τρυβλία με το εμβόλιο 3. Αναδεύονται ήπια ώστε να διαφύγει υλικό έξω από το τρυβλίο 4. αφού πήξη το υλικό επαναλαμβάνεται το στάδιο Μετά την πήξη του υλικού αναποδογυρίζονται τα τρυβλία και επωάζονται σε κλίβανο θερμοκρασίας 30 ο C για 24 ώρες. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στην περίπτωση της τεχνικής της ενσωμάτωσης, δεν χρειάζεται να ληφθεί υπόψη ο συντελεστής της αραίωσης, π.χ. (1:10 όπως στην τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης, όπου χρησιμοποιήθηκαν 100 μl, και το αποτέλεσμα έπρεπε να εκφραστεί ανά ml ή 1000 μl (100 μl/1000 μl). Συνεπώς, εφόσον στην τεχνική της ενσωμάτωσης χρησιμοποιήθηκε 1 ml (προς επίστρωση), το αποτέλεσμα βγαίνει από το Μ.Ο. του αριθμού των

92 αποικιών, πολλαπλάσιαζόμενο με την αντίστοιχη αραίωση, στην οποία έγινε η καταμέτρηση των αποικών. Από τη παραπάνω σχέση (1) προκύπτει για τα Εντεροβακτήρια: Στην περίπτωση των Εντεροβακτηρίων με την τεχνική της ενσωμάτωσης, εάν ο Μ.Ο. των αποικιών που απαριθμούνται σε 2 ή 3 τρυβλία, π.χ. στην 10-1 αραίωση, είναι 49,6 Συνεπώς: Μ.Ο. Αριθμού αποικιών Χ αραίωση = 49,6*10 1 = 496 cfu/ml ή log496= 2,695. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Όσον αφορά τα Εντεροβακτήρια, το ανώτερο όριο για τα Εντεροβακτήρια είναι Μ = <10 3/ g, και συγκεκριμένα για την Escherichia coli είναι Μ=5*10 2 /g.

93 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 9 ΑΡΙΘΜΗΣΗ ΖΥΜΩΝ-ΜΥΚΗΤΩΝ ΣΕ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΚΟ ΠΡΟΙΟΝ Εισαγωγή Ιωάννης Σαββαίδης Οκτώβριος 2018 Οι μύκητες και οι ζύμες αποτελούν δείκτη των συνθηκών επεξεργασίας και συντήρησης των όξινων και ξηρών των τροφίμων. Όταν βρίσκονται σε μεγάλο αριθμό έχουν δυσμενή επίδραση στην καλή συντήρηση τους, κυρίως των προϊόντων με χαμηλό ρη, όπως: χυμοί φρούτων, αεριούχα ποτά, όξινα λαχανικά, σκληρά τυριά, γιαούρτι, κ.τ.λ., καθώς και εκείνων με υψηλή οσμωτική πίεση (ή χαμηλή ενεργότητα νερού-aw), όπως π.χ. μέλι, μαρμελάδες, συμπυκνωμένο γάλα/χυμοί και ξηρά όσπρια, σιτηρά, ξηροί καρποί, έντονα αλατισμένα (παστά) προϊόντα. Στα τρόφιμα αυτά η καταμέτρηση ζυμών-μυκήτων δίνει μια συνολική εικόνα για το μικροβιακό φορτίο, αντίστοιχη με αυτή της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας (Ο.Μ.Χ.) σε τρόφιμα που ευνοείται η ανάπτυξη βακτηρίων. Οι ζύμες και οι μύκητες ως παράγοντες αλλοίωσης παράγουν δυσάρεστη δυσοσμία μούχλας, γεώδη γεύση, οσμή αμμωνίας (ζύμες), προκαλούν μαλάκωμα υφής και έντονη πρωτεόλυση και λιπόλυση. Επίσης, κάποιοι ελάχιστοι μύκητες παράγουν μυκοτοξίνες (αφλατοξίνες, ωχρατοξίνες, εργοτοτοξίνη, πατουλίνη, κιτρινίνη, κλπ) κυρίως σε ζωοτροφές, σιτηρά και όσπρια, οι οποίες είναι ισχυρές καρκινογόνες, αλεργιογόνες ή ηπατοτοξικ ς ουσίες και αφορύν άμεσα την ασφάλεια των τροφίμων. Από την άλλη πολλοί μύκητες είναι ασφαλείς και μάλιστα κάποιοι χρησιμοποιούνται σε ζυμούνενα τρόφιμα ως καλλιέργειες ζύμωσης. Οι ζύμες δεν είναι ποτέ τροφοπαθογόνες και πολλές ζύμες είναι εδώδιμες και χρησιμοποιούνται σε ζυμούμενα τρόφιμα (π.χ. Saccharomyces cerevisiae σε κρασί, ψωμί, κλπ). Η ανάπτυξη των ζυμών προκαλεί ανεπιθύμητες μεταβολές των οργανοληπτικών ιδιοτήτων των τροφίμων, των ποτών και της άλμης, που εκδηλώνονται με την παρουσία γλοιωδών μεμβρανών, θολερότητας, ιζημάτων, με την ανάπτυξη ανωμάλων οσμών και γεύσεων, καθώς και με τη μεταβολή της οξύτητας των τροφίμων, επειδή αποδομούνται τα οργανικά οξέα. Πολλά είδη ζυμών μπορούν να μεταβολίζουν το γαλακτικό, το οξικό και το κιτρικό οξύ, τα οποία συμβάλουν στη δημιουργία του χαρακτηριστικού αρώματος, αλλά κυρίως στη συντήρηση ορισμένων τροφίμων. Αυτό έχει ως συνέπεια την άνοδο του ρη και τη δημιουργία καταλλήλων συνθηκών για την ανάπτυξη βακτηρίων.

94 Κοινά χαρακτηριστικά των ζυμών και των μυκήτων στα οποία βασίζεται η καταμέτρησή τους στα θρεπτικά υποστρώματα είναι η ικανότητα τους να αναπτύσσονται σε χαμηλές τιμές ρη (3,0-4,0) και η ανθεκτικότητά τους σε χαμηλές τιμές δραστηριότητας νερού. Λίγα είδη ζυμών και μυκήτων συμβάλουν στην παραγωγή ορισμένων τροφίμων π.χ. Penicillium roqeuforti, Penicillium caseicolum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Candida kefyr κ.ά. Τα περισσότερα είδη έχουν σημασία σαν μικροοργανισμοί που προκαλούν αλλοιώσεις στα τρόφιμα, ενώ οι μύκητες που παράγουν μυκοτοξίνες έχουν σημασία σαν παθογόνοι μικροοργανισμοί. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΡΙΘΜΗΣΗΣ Για την αρίθμηση των ζυμών και των μυκήτων χρησιμοποιούνται δύο μέθοδοι: Η μέθοδος ενσωμάτωσης Η μέθοδος τις επιφανειακής εξάπλωσης Τα κυριότερα θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των ζυμών και των μυκήτων στα τρόφιμα είναι το Sabourand Dextrose agar, το Potato Dextrose Agar και το Rose Bengal Chloramphenicol Agar. Στην παρούσα άσκηση θα χρησιμοποιηθεί το άγαρ Rose Bengaλ Chloramphenicol. Απαιτούμενα υλικά 1. Αραιωτικό υγρό (ρυθμισμένο ως προς το ph, πεπτονούχο νερό, (buffered peptone water), το οποίο χρησιμοποιείται ακριβώς όπως και στη μέθοδο προσδιορισμού της Ο.Μ.Χ. (Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας). 2. Rose Bengal Chloramphenicol Agar 3. Δείγμα (κεφίρ, ή γιααούρτι). Προετοιμασία δεκαδικών αραιώσεων Γίνεται όπως και για των προσδιορισμό της ΟΜΧ. Μέθοδος ενσωμάτωσης Ενοφθαλμίζεται διπλή σειρά τρυβλίων με όγκο ενοφθαλμίσματος 1mL από κάθε αραίωση. Το ενοφθάλμισμα ενσωματώνεται σε ml υποστρώματος Potato Dextrose Agar θερμοκρασίας 45 C. Η επώαση γίνεται στους C, για 4-5 ημέρες. Ανάγνωση αποτελεσμάτων Οι αποικίες των μυκήτων παρουσιάζουν τις χαρακτηριστικές υφές, ενώ οι αποικίες των ζυμών μοιάζουν με τις αποικίες των βακτηρίων. Σε περίπτωση αμφιβολίας, η διαφοροποίηση γίνεται με τη βοήθεια του στερεοσκοπίου.

95 Για τον υπολογισμό του πληθυσμού των ζυμών και μυκήτων, πολλαπλασιάζεται ο μέσος όρος των αποικιών τους στο κατάλληλο τρυβλίο, με τον αντίστοιχο συντελεστή αραίωσης. Το αποτέλεσμα εκφράζεται ανά ml ή g τροφίμου. Μέθοδος επιφανειακής εξάπλωσης Εμβολιάζεται διπλή σειρά τρυβλίων με Rose Bengal Chloramphenicol Agar. Ο όγκος του εμβολιάσματος είναι 0,1-0,2 ml και η εξάπλωσή του γίνεται με τη βοήθεια ράβδου που προηγουμένως έχει αποστειρωθεί σε φλόγα. Το υπόστρωμα (εντός των τρυβλίων), πριν χρησιμοποιηθεί, παραμένει σε κλίβανο σε θερμοκρασία 37 C για 3 ώρες, προκειμένου να στεγνώσει καλά η επιφάνειά του. Το υπόστρωμα αυτό έχει το πλεονέκτημα ότι περιορίζει την εξάπλωση των αποικιών, δίνοντας έτσι την ευκαιρία να αναπτυχθούν, παράλληλα, τόσο τα στελέχη που αναπτύσσονται γρήγορα, όσο και τα στελέχη που αναπτύσσονται αργά. Εάν το τρόφιμο (π.χ. κεφίρ) που εξετάζεται με τη μέθοδο αυτή είναι αρκετά αλκαλικό, πρέπει προηγουμένως να ρυθμίζεται σε ph 7,0-7,5, γιατί διαφορετικά ελαχιστοποιείται η ανασταλτική δράση του αντιβιοτικού. Η επώαση γίνεται στους C, για 4-5 ημέρες. Εικόνα

96 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 10 ΕΙΔΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΟΙΝΩΝ Ιωάννης Ρούσσης ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Οκτώβριος 2018 Προσδιορισμός οξέων Τα οργανικά οξέα είτε προέρχονται από το σταφύλι είτε σχηματίζονται κατά τις ζυμώσεις του γλεύκους και τις μικροβιακές αλλοιώσεις του οίνου. Τα κυριότερα οξέα του σταφυλιού Τρυγικό (HO 2 CCH(OH)CH(OH)CO 2 H), μηλικό (HO 2 CCH 2 CHOHCO 2 H), κιτρικό (HOC(COOH)(CH 2 COOH) 2 ), οξαλικό (HO 2 CCO 2 H), ουρονικά οξέα (σακχαρικά οξέα), (εξουρονικό οξύ, L-ασκορβικό οξύ βιταμίνη C, C 6 H 8 O 6 ). Το γλυκονικό οξύ (γλουκονικό οξύ, HOCH 2 (CHOH) 4 COOH) και άλλα οξέα υπάρχουν όταν συμβαίνει φαιά σήψη. Κατά τη ζύμωση σχηματίζονται ηλεκτρικό οξύ (HOOC-(CH 2 ) 2 -COOH) και γαλακτικό οξύ (CH 3 CH(OH)COOH), και με εστεροποίηση προκύπτουν αιθυλικοί εστέρες που συμβάλλουν σημαντικά στο άρωμα. Άλλα οξέα ζυμώσεων και μικροβιακών αλλοιώσεων είναι το κιτρομηλικό, το διμεθυλογλυκερινικό, το πυροσταφυλλικό, το α-κετογλουταρικό. Τα οξέα, μηλικό, τρυγικό, κιτρικό και γαλακτικό (υδροξυοξέα), δεσμεύουν το σίδηρο και έτσι αποφεύγονται θολώματα σιδήρου. Το κιτρικό σχηματίζει πιο ισχυρά σύμπλοκα με το σίδηρο και χρησιμοποιείται για αποφυγή θολωμάτων σιδήρου. Τα οργανικά οξέα συμβάλλουν θετικά στην ποιότητα του οίνου. Ρυθμίζουν την ογκομετρούμενη και την ενεργό οξύτητα του γλεύκους και του οίνου. Ρυθμίζουν την όξινη γεύση του οίνου. Περιορίζουν την ανάπτυξη διάφορων μικροοργανισμών όπως βακτηρίων αλλοίωσης του

97 οίνου, και έτσι συμβάλλουν στη συντήρησή του. Το χαμηλό ph ευνοεί τη ζωηρότητα του χρώματος των οίνων. Όμως, ορισμένα οξέα προσβάλλονται κάποιες φορές από μικροοργανισμούς και έτσι προκαλούνται αλλοιώσεις των οίνων. Τα οργανικά οξέα βρίσκονται είτε ως ελεύθερα οξέα είτε με τη μορφή αλάτων. Τα ελεύθερα οξέα μπορεί να βρίσκονται σε μερική διάσταση, ενώ τα άλατα βρίσκονται σε πλήρη διάσταση. Η συνολική αποτίμηση των οργανικών οξέων στους οίνους προκύπτει από α) την ολική ή ογκομετρούμενη οξύτητα, που εκφράζει το σύνολο των καρβοξυλομάδων των οξέων είτε βρίσκονται σε διάσταση είτε όχι, β) την ενεργό οξύτητα ή ph, που εκφράζει το σύνολο των καρβοξυλομάδων που βρίσκονται σε διάσταση και που αντιστοιχεί στο σύνολο των κατιόντων υδρογόνου, και γ) την αλκαλικότητα της τέφρας, που εκφράζει το σύνολο των οργανικών οξέων που βρίσκονται υπό μορφή αλάτων και που μετατρέπονται σε ανθρακικά άλατα με αποτέφρωση. Τρυγικό οξύ (2-5 g/l): το φυσικό τρυγικό οξύ του οίνου είναι το D- τρυγικό οξύ. Είναι το σπουδαιότερο από τα σταθερά οξέα του οίνου. Είναι το πιο ισχυρό και επηρεάζει την ενεργό οξύτητα του οίνου. Από τα τρία κυριότερα οξέα του σταφυλιού (τρυγικό, μηλικό, κιτρικό) το τρυγικό οξύ είναι το πιο ανθεκτικό στις βακτηριακές προσβολές. Με βάση τα παραπάνω, είναι το οξύ που ενδείκνυται περισσότερο για την αύξηση της οξύτητας της σταφυλόμαζας. Όμως, σε υψηλές δόσεις δίνει στον οίνο μία σκληρότητα και στυφότητα. Η συγκέντρωση του τρυγικού οξέος στο πράσινο σταφύλι είναι περίπου 15 g/l, και στο ώριμο περίπου 7,5 g/l, λόγω καύσης και διάλυσης στο νερό του σταφυλιού. Κατά την αλκοολική ζύμωση καθιζάνει ποσότητα όξινου τρυγικού καλίου, λόγω μικρότερης διαλυτότητας στην αλκοόλη, και η οξύτητα είναι 2,5-4 g/l. Με τα κρύα του χειμώνα, καταβυθίζονται όξινο τρυγικό κάλιο και τρυγικό ασβέστιο (αρχικά το άλας καλίου και αργότερα το άλας του ασβεστίου) (τρυγία). Έτσι, η συγκέντρωση του τρυγικού οξέος είναι 1,5-2,5 g/l.

98 Μερικές φορές το τρυγικό οξύ προσβάλλεται από γαλακτικά βακτήρια, και η συγκέντρωση του τρυγικού μηδενίζεται, ενώ αυξάνει η πτητική οξύτητα. Μηλικό οξύ (0-4 g/l): Το φυσικό μηλικό οξύ είναι το L (-) ισομερές. Έχει σημαντική επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων, και προσδίδει χορτώδη οσμή και γεύση και κάποια στυφάδα. Στα πράσινα σταφύλια η συγκέντρωσή του είναι g/l, στα ώριμα σταφύλια 2-5 g/l. Είναι ασταθές στους μικροργανισμούς. Οι συνήθεις ζύμες δεν μεταβάλλουν τη συγκέντρωση του μηλικού οξέος κατά την αλκοολική ζύμωση. Όμως, ο Schizosaccharomyces pombe μετατρέπει το μηλικό οξύ σε αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα (μηλοαλκοολική ζύμωση), και έτσι μειώνεται η οξύτητα των οίνων. Μερικές φορές λαμβάνει χώρα η μηλογαλακτική ζύμωση. Μηλογαλακτικά βακτήρια μετατρέπουν το μηλικό οξύ σε γαλακτικό οξύ και διοξείδιο του άνθρακα, και έτσι μειώνεται η οξύτητα. Η μηλογαλακτική ζύμωση ενδείκνυται για τους ερυθρούς οίνους και ιδιαίτερα οίνους με υψηλή οξύτητα, και βελτιώνει τα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά. Κιτρικό οξύ (0-1 g/l): στο σταφύλι βρίσκεται μέχρι 0,5 g/l, ενώ με την ευγενή σήψη μέχρι 0,8-1,0 g/l. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αύξηση της οξύτητας και τη γευστική βελτίωση των οίνων. Σημειώνεται ότι επιτρέπεται η προσθήκη κιτρικού στον οίνο, ενώ του τρυγικού οξέος μόνο στο γλεύκος. Όμως, είναι ευπρόσβλητο από γαλακτικά βακτήρια με αύξηση της πτητικής οξύτητας. Σωστό είναι αποφεύγεται η προσθήκη, και να προστίθεται μόνο στη δόση για προστασία από θολώματα σιδήρου και μόνο όταν είναι απαραίτητο. Επιτρεπόμενο όριο προσθήκης είναι 50 g/hl, ενώ g/hl είναι συνήθως επαρκή. Ασκορβικό οξύ (0 g/l): υπάρχει στο γλεύκος σε mg/l.

99 Καταναλώνεται από τις ζύμες κατά τη ζύμωση, και έτσι δεν υπάρχει στους οίνους. Προστίθεται στους οίνους σε δόσεις μέχρι 100 mg/l. Δρά ως αντιοξειδωτικό, καθόσον οξειδώνεται το ίδιο γρήγορα. Εμποδίζει την οξείδωση του δισθενούς σιδήρου σε τρισθενή. Παρέχει κάποια προστασία σε ενώσεις αρώματος και διατηρεί τη φρεσκάδα του οίνου. Προστίθεται κατά την εμφιάλωση, σε οίνους με επαρκή ποσότητα θειώδη ανυδρίτη. Ηλεκτρικό οξύ (0,5-1,5 g/l): σχηματίζεται κατά τη ζύμωση των ζαχάρων, και γι αυτό είναι σε κάποια αναλογία με την αλκοόλη. Έχει σημαντική επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων, καθόσον η γεύση του συνδυάζει το ξινό, το αλμυρό και το πικρό. Το ηλεκτρικό οξύ είναι πολύ ανθεκτικό σε βακτηριακές προσβολές. Γαλακτικό οξύ: L (+) γαλακτικό οξύ (0,1-3 g/l) και D (-) γαλακτικό οξύ (0,1-0,5 g/l). Βρίσκεται στους οίνους αλλά όχι στα γλεύκη. Βρίσκεται και με τα δύο του ισομερή (το αριστερόστροφο (D-) ή/και το δεξιόστροφο (L+)). Προέρχεται από τη δράση των ζυμών κατά τη ζύμωση. Παράγεται το D (-) ισομερές σε 0,1-0,4 g/l, ενώ το L (+) ισομερές μόνο σε ίχνη. Επίσης, προέρχεται από τη δράση των μηλογαλακτικών βακτηρίων κατά τη μηλογαλακτική ζύμωση. Παράγεται μόνο το L (+) ισομερές, μέχρι 3 g/l. Έτσι, είναι δείκτης της μηλογαλακτικής ζύμωσης. Ακόμη, παράγεται από τη δράση γαλακτικών βακτηρίων με προσβολή ζαχάρων (εξόζες), της γλυκερίνης και του τρυγικού οξέος. Ανάλογα με το βακτήριο παράγεται το D (-) ισομερές είτε το L (+) ισομερές. Στις περιπτώσεις βακτηριακής αλλοίωσης η ολική συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος είναι υψηλή, ακόμη και μεγαλύτερη από 10 g/l. Όταν τα επίπεδα του γαλακτικού οξέος είναι υψηλά εξετάζονται τα επίπεδα του μηλικού οξέος (για μηλογαλακτική ζύμωση), των ζαχάρων (για βακτηριακή προσβολή ζαχάρων), και του τρυγικού οξέος (για βακτηριακή προσβολή του, εκτροπή).

100 Το γαλακτικό οξύ είναι το πιο σταθερό οξύ του οίνου από χημική και βιολογική άποψη. Έτσι, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για αύξηση της οξύτητας ορισμένων οίνων (το τρυγικό οξύ που χρησιμοποιείται συνήθως προσβάλλεται από βακτήρια). Προσδιορισμός τρυγικού οξέος Αρχή μεθόδου Για τον προσδιορισμό του τρυγικού οξέος γίνεται καταβύθισή του ως όξινο τρυγικό κάλι, και ακολουθεί ογκομέτρηση με NaOH. Eνζυμικές μέθοδοι προσδιορισμού συστατικών τροφίμων H χρησιμοποίηση των ενζύμων στην ανάλυση των τροφίμων είναι σχετικά πρόσφατη. Tο κύριο πλεονέκτημα των ενζυμικών μεθόδων είναι η μεγάλη εξειδίκευση, όπως επίσης οι ήπιες συνθήκες ανάλυσης, η ευαισθησία, η ακρίβεια και η επαναληψιμότητά τους. Mειονεκτήματά τους είναι η ανασταλτική δράση διαφόρων συστατικών των τροφίμων, όπως και η αστάθεια των ενζύμων. Στις ενζυμικές μεθόδους ανάλυσης, το προσδιοριζόμενο συστατικό είναι, κατά κανόνα, το υπόστρωμα της αντίδρασης. Σύμφωνα με την εξίσωση Michaelis Menten E+S ES E+P, ενώ η αρχική ταχύτητα Uo = (Vmax [S]o)/(Km+[S]o). H συγκέντρωση του υποστρώματος μπορεί να προσδιοριστεί με δύο μεθόδους. 1. Mέθοδοι ολικής μεταβολής (total change) H αντίδραση αφήνεται να προχωρήσει το δυνατό και μετράται η ολική μεταβολή (κατανάλωση υποστρώματος ή δημιουργία προϊόντος). Όταν η ενζυμική αντίδραση δεν είναι ποσοτική υποβοηθείται με αύξηση της συγκέντρωσης αντιδραστηρίων (συνήθως των συνενζύμων), με δέσμευση κάποιου από τα προϊόντα ή με μεταβολή του ph. Oι μέθοδοι αυτές δεν απαιτούν αυστηρό έλεγχο των πολυάριθμων μεταβλητών.

101 Eφαρμόζονται είτε άμεσες μετρήσεις είτε έμμεσες με την βοήθεια συζευγμένων αντιδράσεων. Παράδειγμα αν το υπόστρωμα έχει ένα χαρακτηριστικό φάσμα απορρόφησης μπορεί να μετρηθεί η μείωση της απορρόφησης σε ένα μήκος κύματος. H μεταφορά υδρογόνου απ' το υπόστρωμα στο NAD ή NADP και η μέτρηση της απορρόφησης στα 340nm, όπου απορροφά το αναγμένο συνένζυμο, είναι η βάση πολλών ενζυμικών προσδιορισμών, όπως του προσδιορισμού της αιθανόλης με αλκοολική δεϋδρογονάση. Στις μετρήσεις με συζευγμένες αντιδράσεις προϊόν της πρώτης αντίδρασης αντιδρά με χρωμογενές αντιδραστήριο προς δημιουργία χρώματος, όπως παράδειγμα στον προσδιορισμό γλυκόζης με οξειδάση γλυκόζης και υπεροξειδάση. οξειδάση γλυκόζη γλυκόζη+h 2 O+O 2 γλουκονικό οξύ+h 2 O 2 υπεροξειδάση H 2 O 2 +λευκο-χρωστική H 2 O+χρώμα 2. Mέθοδοι μέτρησης αρχικής ταχύτητας Yπό ελεγχόμενες συνθήκες και σε μικρές συγκεντρώσεις υποστρώματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί η αρχική ταχύτητα για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του υποστρώματος. H περιοχή γραμμικότητας ισχύει για συγκεντρώσεις μικρότερες από 0,1 Km, και επειδή ο ρυθμός της αντίδρασης εξαρτάται από το ph, την θερμοκρασία και την ιονική ισχύ, οι συνθήκες πρέπει να κρατούνται αυστηρά σταθερές. Eκτός από την συγκέντρωση υποστρώματος, επίσης εφαρμόζεται και ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης αναστολέα. Aναστολέας είναι ένωση που προκαλεί μείωση του ρυθμού ενζυμικής αντίδρασης, με σχηματισμό συμπλόκου με το ένζυμο ή το υπόστρωμα. Γενικά η αρχική ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης θα μειώνεται γραμμικά με αύξηση της συγκέντρωσης του αναστολέα, σε χαμηλές συγκεντρώσεις, και θα μηδενίζεται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Παράδειγμα αποτελεί ο

102 προσδιορισμός των οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων, που είναι αναστολείς χοληνεστεράσης. Mεγάλη πρόοδο αποτέλεσε η αυτοματοποίηση των ενζυμικών μεθόδων, που επιτρέπει την εξέταση μεγάλου αριθμού δειγμάτων και καλύτερη ακρίβεια και επαναληψιμότητα, κυρίως με την εφαρμογή τεχνικών συνεχούς ροής. Γίνονται μετρήσεις απορρόφησης στο ορατό ή το υπεριώδες, φθορισμού. Επίσης χρησιμοποιούνται και άλλες μέθοδοι όπως ηλεκτροχημικές, φυγοκεντρικές, μικροθερμιδομετρικές και άλλες. Oι μετρήσεις, με ηλεκτρονικούς υπολογιστές, μετατρέπονται σε μονάδες ενζυμικής δραστικότητας ή άλλη παράμετρο που εξαρτάται απ' αυτήν. Mε την χρήση των ακινητοποιημένων ενζύμων μπορούν να ξεπεραστούν ορισμένα προβλήματα των ενζυμικών μεθόδων. Aυτά, λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης, δεν είναι ευαίσθητα στους αναστολείς, έχουν μεγαλύτερη σταθερότητα και επιτρέπουν την ξαναχρησιμοποίησή τους. Tα ακινητοποιημένα ένζυμα, σε συνδυασμό με ηλεκτροχημικές τεχνικές, βρίσκουν ιδιαίτερη εφαρμογή στην αυτοματοποίηση των ενζυμικών μεθόδων. Tέτοιος συνδυασμός είναι τα ηλεκτρόδια ενζύμου που απλοποιούν τους προσδιορισμούς. H ενζυμική ανάλυση βρίσκει εφαρμογή στον προσδιορισμό πολλών συστατικών τροφίμων. Προσδιορίζονται υδατάνθρακες (π.χ. γλυκόζη, φρουκτόζη, γαλακτόζη, σακχαρόζη, ραφινόζη, άμυλο), οργανικά οξέα (π.χ. γαλακτικό, οξικό, μυρμηκικό, μηλικό, κιτρικό, πυροσταφυλλικό), αλκοόλες και αλδεΰδες (π.χ. αιθανόλη, σορβιτόλη, γλυκερόλη, ακεταλδεΰδη) και πολλά άλλα (π.χ. τριγλυκερίδια, λεκιθίνη, χοληστερόλη, κρεατίνη+κρεατινίνη, νιτρικά, ασκορβικό οξύ, ελεύθερα λιπαρά οξέα, φωσφορικά, ολικό SO 2, αμμωνία). Kυκλοφορούν εμπορικά σύνολα (kits) για την εύκολη εφαρμογή των διαφόρων μεθόδων, ενώ επίσης πιθανή είναι η χρήση, στο άμεσο μέλλον, αυτοματοποιημένων μεθόδων στον ποιοτικό έλεγχο στις βιομηχανίες τροφίμων. Προσδιορισμός μηλικού οξέος Αρχή μεθόδου

103 Το L-μηλικό οξύ οξειδώνεται από το NAD (νικοτιναμιδοαδενινο-δινουκλεοτίδιο) παρουσία αφυδρογονάσης L-μηλικού οξέος L-μηλικό οξύ + NAD + οξαλοξικό +NADH + H + Το οξαλοξικό παρουσία L-γλουταμινικού μετατρέπεται σε L- ασπαρτικό, αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο τρανσαμινάση γλουταμινικού-οξαλοξικού (GOT). Οξαλοξικό + L-γλουταμινικό L-ασπαρτικό +2-οξογλουταρικό Το ποσό του NADH που σχηματίζεται είναι σε στοιχειομετρική αναλογία με την ποσότητα του L-μηλικού. Η αύξηση του NADH αποτιμάται με μέτρηση της απορρόφησης στα 334, 340 ή 365 nm. Προσδιορισμός διοξειδίου του άνθρακα Με τις ζυμώσεις του κρασιού παράγεται διοξείδιο του άνθρακα, μέρος του οποίου παραμένει στο κρασί. Η έκλυση του CO 2, επιδρά στην εμφάνιση του κρασιού, ενώ η πλήρης αφαίρεση του СО 2, οδηγεί σε "επίπεδη" γεύση και κρασί χωρίς φρεσκάδα. Στα 300 mg/l το СО 2 δίνει δροσερή γεύση στο κρασί και μειώνει την αρωματικότητά του, στα 600 mg/l αυξάνει την οξύτητα και μειώνει περαιτέρω την αρωματικότητα, ενώ πάνω από 1200 mg/l γίνεται αντιληπτό από το μούδιασμα που προκαλεί στο άκρο της γλώσσας. Ακόμη το CO 2 αυξάνει την ένταση της πικρής γεύσης. Ένα κρασί μπορεί να περιέχει μέχρι 2g/L СО 2 υπό ατμοσφαιρική πίεση, και χαρακτηρίζεται ήσυχο όταν δεν εμφανίζει αναβρασμό. Με αύξηση της πίεσης στο μπουκάλι ένα κρασί μπορεί να περιέχει πάνω από 2 g/l CO 2, που με το άνοιγμα του μπουκαλιού δημιουργεί αναβρασμό. Τα ημιαφρώδη κρασιά, που χαρακτηρίζονται ως σπινθηροβόλα, έχουν πίεση 1-2,5 bars (2 bars, περίπου 6 g/l CO 2 ).Τα αφρώδη κρασιά, που με το άνοιγμα του μπουκαλιού αναβράζουν έντονα, έχουν πίεση μεγαλύτερη από 3 bars (20 C). Η σύγκριση ποιότητας тсоѵ αφρωδών κρασιών, φυσικών -τεχνητών, πέρα

104 από το άρωμα και την γεύση γίνεται και με σύγκριση των φυσαλίδων που δημιουργούνται. Φυσαλίδες μικρού μεγέθους και ομοιόμορφες και έκλυση για αρκετό χρόνο δηλώνουν φυσιολογική ζύμωση που επέτρεψε την διασπορά και τον καταμερισμό του СО 2 στη μάζα του κρασιού. Αντίθετα, τα τεχνητά αφρώδη κρασιά διακρίνονται από το μεγάλο μέγεθος των φυσαλίδων του СО 2. Από το СО 2 που παράγεται με την αλκοολική ζύμωση, περίπου 80 g/l, μια ποσότητα παραμένει στο κρασί (η διαλυτότητα του στο κρασί είναι 2g/L σε ατμοσφαιρική πίεση). Τα κόκκινα κρασιά περιέχουν περίπου 400 mg/l СО 2 και τα λευκά mg/l. Προσδιορισμός σορβικού οξέος Το σορβικό οξύ, CH 3 -CH=CH-CH=CH-COOH, έχει αντιμικροβιακή δράση. Δρα στους μύκητες, ενώ έχει πολύ μικρή δράση στα βακτήρια. Πρακτικά δεν έχει δράση στα γαλακτικά και στα οξικά βακτήρια. Είναι δραστικό έναντι όλων των ζυμομυκήτων, από τους οποίους πιο ευαίσθητοι είναι του γένους Kloeckera ή Hansieniaspora. Η αποτελεσματικότητά του εξαρτάται από την αλκοόλη και το ph. Σε υψηλότερα επίπεδα αλκοόλης απαιτείται μικρότερη συγκέντρωση σορβικού οξέος. Είναι πιο δραστικό σε χαμηλότερα ph. Σε ph 3,1 είναι δύο φορές πιο δραστικό από ότι σε ph 3,5. Ο συνδυασμός του σορβικού οξέος με τον θειώδη ανυδρίτη τον καθιστά πιο αποτελεσματικό. Σημειώνεται ότι το σορβικό οξύ δεν μπορεί να αντικαταστήσει τον θειώδη ανυδρίτη αλλά για μείωσή του, κυρίως στους γλυκούς οίνους. Επειδή το σορβικό οξύ είναι ελάχιστα διαλυτό στο νερό και στην αλκοόλη, χρησιμοποιείται το σορβικό κάλιο που είναι πιο διαλυτό. Το μέγιστο όριο χρησιμοποίησής του είναι 200 mg/l. Χρησιμοποιείται σε γλυκά κρασιά για αποφυγή επαναζύμωσης. Χρησιμοποιείται μαζί με mg/l SO 2 για προστασία από την οξείδωση και για αναστολή βακτηρίων. Το σορβικό οξύ είναι αφομοιώσιμο από τον οργανισμό και δεν είναι τοξικό. Είναι λευκό, με καυστική οσμή, πτητικό, και πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στον προσδιορισμό της πτητικής οξύτητας για διόρθωση του αποτελέσματος.

105 Η προσθήκη του σορβικού οξέος στους ερυθρούς οίνους πρέπει να αποφεύγεται διότι σχηματίζει δυσάρεστη οσμή και γεύση. Δεν είναι σταθερό και διασπάται από γαλακτικά βακτήρια και προσδίδει δυσάρεστη οσμή που δύσκολα απομακρύνεται. Αρχή μεθόδου Το σορβικό οξύ παρουσιάζει μέγιστη απορρόφηση στο υπεριώδες στα 256 nm. H μέτρηση γίνεται σε απόσταγμα του οίνου, δεδομένου ότι το σορβικό οξύ είναι πτητικό με υδρατμούς. Προσδιορισμός ολικών εστέρων Οι εστέρες σχηματίζονται με αντίδραση αλκοόλης και οξέος, που είναι αμφίδρομη καθόσον συμβαίνει υδρόλυση των εστέρων. Υπάρχει μεγάλος αριθμός διαφορετικών αλκοολών και οξέων στον οίνο. Έτσι, ο αριθμός των πιθανών εστέρων είναι πολύ μεγάλος. Οι οξικοί αιθυλεστέρες είναι οι πιο κοινοί. Μόνο λίγοι εστέρες βρίσκονται στα σταφύλια, όπως ο ανθρανιλικός εστέρας που προσδίδει μια όξινη οσμή σε κάποιους οίνους. Οι εστέρες σχηματίζονται με ενζυμική εστεροποίηση κατά τη ζύμωση, και με χημική εστεροποίηση κατά την παλαίωση. Σχήμα. Ισορροπία εστεροποίησης αλκοόλης. Οι εστέρες που σχηματίζονται από οξέα με ένα καρβοξύλιο είναι ουδέτεροι, και οι εστέρες από οξέα με περισσότερα καρβοξύλια μπορεί να είναι όξινοι ή ουδέτεροι. Οι εστέρες παρουσιάζουν σημαντικό ενδιαφέρον λόγω των οργανοληπτικών τους χαρακτήρων. Εκτός από τον οξικό αιθυλεστέρα που έχει δυσάρεστη οσμή, οι εστέρες με μεγαλύτερο μοριακό βάρος

106 έχουν άρωμα λουλουδιών ή φρούτων, και συμμετέχουν αποφασιστικά στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτήρων των οίνων. Ο γαλακτικός και ο προπιονικός αιθυλεστέρας έχουν ουδέτερη οσμή και υψηλό κατώφλι αντίληψης, και έτσι δεν φαίνεται να έχουν επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων. Οι αιθυλεστέρες των λιπαρών οξέων με ζυγό αριθμό ατόμων άνθρακα και ειδικότερα με 6, 8, 10 και 12 άτομα άνθρακα (εξανοικός, οκτανοικός, δεκανοικός και δωδεκανοικός) αποτελούν σπουδαία συστατικά του αρώματος και του μπουκέτου των οίνων. Επίσης, οξικοί εστέρες όπως ο οξικός ισοαμυλεστέρας, ο οξικός βενζυλεστέρας, ο οξικός φαυνυλ αιθυλεστέρας. Ο σχηματισμός εστέρων κατά την αλκοολική ζύμωση εξαρτάται από τον ζυμομύκητα ζύμωσης, τη θερμοκρασία, το ph, τον αερισμό, ακόμη και από το στάδιο της ζύμωσης. Προσδιορισμός συνολικών πτητικών εστέρων φωτομετρικά - Αρχή μεθόδου Προσδιορισμός των συνολικών πτητικών εστέρων μπορεί να γίνει φωτομετρικά, μετά από απόσταξη του οίνου και αντίδραση με ειδικά αντιδραστήρια. Οι πτητικοί εστέρες αντιδρούν με υδροξυλαμίνη και δημιουργούν προϊόν που αντιδρά με τρισθενή σίδηρο και δημιουργεί έγχρωμο σύμπλοκο.

107 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Προσδιορισμός τρυγικού οξέος Για τον προσδιορισμό του τρυγικού οξέος γίνεται καταβύθισή του ως όξινο τρυγικό κάλι, και ακολουθεί ογκομέτρηση με NaOH. Σε περιέκτη φέρονται 10 ml δείγματος, 0,4 ml οξικού οξέος, 7,5 ml διαλύματος καταβύθισης και 2 ml αλκοόλης. Γίνεται ανάδευση με γυάλινη ράβδο μέχρι να εμφανιστεί θόλωμα από κρύσταλλους, και ακολουθεί παραμονή σε ψυγείο στους 8 ο C για περίπου μία ώρα. Στη συνέχεια γίνεται καλή ανάδευση με γυάλινη ράβδο, και ακολουθεί δεύτερη παραμονή σε ψυγείο στους 8 ο C για περίπου μία ώρα. Αμέσως γίνεται διήθηση από ηθμό πορσελάνης No 4. Ακολουθεί ξέπλυμα δύο φορές με 2 ml κάθε φορά διαλύματος έκπλυσης. Στη συνέχεια το ίζημα λαμβάνεται με απεσταγμένο νερό σε ποτήρι ζέσεως και γίνεται ογκομέτρηση με 0,1 Ν NaOH και δείκτη κυανού της βρωμοθυμόλης. Το αποτέλεσμα σε τρυγικό οξύ, g/l, προκύπτει από τη σχέση 1,5 α -2, όπου α τα ml 0,1 N NaOH που καταναλώθηκαν. Το διάλυμα καταβύθισης είναι υδατικό και περιέχει χλωριούχο κάλιο 300 g/l, τρυγικό καλιονάτριο 5,75 g/l, και οξαλικό κάλιο 1,25 g/l. Το διάλυμα έκπλυσης είναι υδατοαλκοολικό (15 % αλκοόλη) διάλυμα χλωριούχου καλίου, 125 g/l. Ενζυμικός προσδιορισμός μηλικού οξέος Διαλύματα - αντιδραστήρια Νο 1. L-γλουταμινικό οξύ, 440 mg, σε ρυθμιστικό διάλυμα γλυκυλγλυκίνης ph 10 (περίπου 30 ml), No 2. Σκόνη NAD, 210 mg, που διαλύεται σε 6 ml αποσταγμένο νερό, No3. Αιώρημα, 0,4 ml, τρανσαμινάσης γλουταμικού-οξαλοξικού, περίπου 160 U,

108 Νο 4. Διάλυμα αφυδρογονάσης L-μηλικού, περίπου 0,4 ml περίπου 2400 U, Νο 5. Διάλυμα L-μηλικού, control δοκιμής. Πορεία Σε σωλήνα προστίθενται 1,0 ml διαλύματος 1, 0,2 ml διαλύματος 2, 0,010 ml αιωρήματος 3, 0,1 ml διαλύματος δείγματος και 0,9 ml αποσταγμένου νερού. Για το τυφλό, προστίθενται 0,1 ml αποσταγμένου νερού στη θέση του διαλύματος δείγματος. Το διάλυμα δείγματος να περιέχει 0,5-35 μg L-μηλικού οξέος ανά δοκιμή (σε 0,1-1,0 ml όγκο δείγματος). Γίνεται ανάμιξη, και μετράται η απορρόφηση διαλύματος δείγματος και τυφλού σε περίπου 3 min. Απορρόφηση Α1. Ακολούθως, η αντίδραση ξεκινάει με προσθήκη 0,010 ml διαλύματος 4, σε καθένα από τα διαλύματα δείγματος και τυφλού. Γίνεται ανάμιξη, και μετράται η απορρόφηση μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, σε περίπου 5-10 min. Απορρόφηση Α2. Λαμβάνονται οι διαφορές Α2-Α1 για το τυφλό και το δείγμα, και υπολογίζεται το ΔΑ = (Α2-Α1) δείγματος (Α2-Α1) τυφλού. Οι διαφορές απορροφήσεων πρέπει να είναι τουλάχιστον 0,1. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του L-μηλικού οξέος σε g/l προκύπτει από τη σχέση: C = V x MB x ΔΑ : ε χ d x v x 1000, Όπου V τελικός όγκος σε ml, v όγκος δείγματος σε ml, ΜΒ το μοριακό βάρος του μηλικού οξέος (134,09) d η διαδρομή του φωτός σε cm, ε ο συντελεστής απόσβεσης του NADH, 6,3 στα 340 nm (L x mmol -1 x cm - 1 ).

109 C = 2,22 x 134,09 x ΔΑ : 6,3 χ 1,0 x 0,1 x 1000, Εάν το δείγμα έχει αραιωθεί το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται με τον συντελεστή αραίωσης. Προσδιορισμός διοξειδίου του άνθρακα Πορεία Σε ποτήρια ζέσεως φέρονται 30 ml 0,1 N ΝαΟΗ και. 20 ml οίνου. Το ph του μίγματος είναι περίπου 12. Στη συνέχεια προστίθενται 0,1 Μ HC1 μέχρι το ph να γίνει ακριβώς 8,3, και σημειώνονται τα ml που χρειάστηκαν. Επίσης, χρησιμοποιείται οίνος χωρίς CΟ 2. Η απομάκρυνση του CΟ 2 γίνεται με ζωηρή ανάδευση υπό κενό για μερικά λεπτά. Η συγκέντρωση του СО 2, σε mg/l, προκύπτει από τη σχέση (α-β) χ 1/10 χ 44 χ 1000/20, δηλαδή (α-β) χ 220, όπου α τα ml που καταναλώθηκαν για το δείγμα του οίνου και β τα ml που καταναλώθηκαν για το δείγμα οίνου μετά την αφαίρεση του СО 2. Εναλλακτικά, γίνεται προσδιορισμός της οξύτητας του οίνου ως έχει και μετά από την απομάκρυνση του διοξειδίου του άνθρακα, με 0,1 N NaOH και δείκτη μπλε της βρωμοθυμόλης. Ο υπολογισμός του διοξειδίου του άνθρακα γίνεται με βάση τα παρακάτω. N 1 * V 1 = N 2 * V 2, όπου Ν 1 η κανονικότητα του CO 2, V 1 ο όγκος του οίνου, Ν 2 η συγκέντρωση του NaOH, V 2 ο όγκος του NaOH που καταναλώθηκε. N 1 = Η κανονικότητα του διοξειδίου του άνθρακα μετατρέπεται σε συγκέντρωση, με βάση το ότι το CO 2 ουσιαστικά βρίσκεται στον οίνο ως H 2 CO 3, δηλαδή διπρωτικό. Μ1=Μ CO2 = = 1Μ αντιστοιχεί στο ΜΒ CO2 M 1 αντιστοιχεί σε x gr

110 Ακολούθως γίνεται μετατροπή των gr σε mg. Προσδιορισμός σορβικού οξέος φωτομετρικά Σε φιάλη φέρονται 10 ml οίνου και προστίθεται περίπου 1 g τρυγικού οξέος. Γίνεται απόσταξη με υδρατμούς και συλλέγονται 250 ml αποστάγματος. Φέρονται 5 ml αποστάγματος σε κάψα πορσελάνης διαμέτρου 55 mm και προστίθεται 1 ml 0,02 Μ υδροξειδίου του ασβεστίου. Γίνεται εξάτμιση μέχρι ξηρού σε ζέον υδατόλουτρο. Το υπόλειμμα διαλύεται σε αρκετά ml αποσταγμένου νερού, μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη των 20 ml και γίνεται συμπλήρωση με αποσταγμένο νερό. Μετράται η απορρόφηση στα 256 nm με κυψελίδα χαλαζία 1 cm. Ως τυφλό χρησιμοποιείται διάλυμα που περιέχει 1 ml 0,02 Μ υδροξειδίου του ασβεστίου αραιωμένου στα 20 ml με αποσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση του σορβικού οξέος σε mg/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Για την πρότυπη καμπύλη παρασκευάζονται σορβικού οξέος 0 0,5 1,0-2,5 και 5 mg/l. Για την παρασκευή των παραπάνω διαλυμάτων παρασκευάζεται αρχικά διάλυμα 20 mg/l. Διαλύονται 20 mg σορβικού οξέος σε 2 ml 0,1 Μ καυστικού νατρίου, μεταφέρονται σε ογκομετρική φιάλη 1 L, και γίνεται συμπλήρωση με νερό. Εναλλακτικά διαλύονται 26,8 mg σορβικού καλίου σε νερό και γίνεται συμπλήρωση στο 1 L με νερό. Τυπική πρότυπη καμπύλη, Α = 0,1771 C + 0,0152, όπου Α η απορρόφηση και C η συγκέντρωση σε mg/l. Προσδιορισμός συνολικών πτητικών εστέρων φωτομετρικά Σε φιάλη φέρονται 100 ml οίνου και 50 ml απεσταγμένου νερού. Γίνεται απόσταξη και συλλέγονται 90 ml σε ογκομετρική φιάλη που

111 είναι βυθισμένη σε πάγο. Γίνεται συμπλήρωση στα 100 ml με απεσταγμένο νερό. Σε δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 3 ml αποστάγματος, και προστίθενται 2 ml υδροχλωρικής υδροξυλαμίνης 2Μ και 2 ml ΝαΟΗ 3,5 N. Γίνεται ανάμιξη και ακολουθεί 10 min παραμονή. Στη συνέχεια, προστίθενται 2 ml HC1 4 N και 2 ml διαλύματος τριχλωριούχου σιδήρου (10 % w/v σε HC1 0,1N). Γίνεται ανάμιξη και μετράται η απορρόφηση στα 510 nm, με κυψελίδα 1 cm και τυφλό απεσταγμένο νερό. Χρησιμοποιείται τυφλό μεθόδου και κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη. Τυπική πρότυπη καμπύλη, Α = 0,0012 C + 0,034, όπου Α η απορρόφηση και C η συγκέντρωση σε mg/l. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως mg/l εξανοικού αιθυλεστέρα, δηλαδή τον εστέρα που χρησιμοποιήθηκε για την πρότυπη.

112 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 11 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΩΣΕΩΝ ΑΡΩΜΑΤΟΣ ΓΙΑΟΥΡΤΙΩΝ ΚΑΙ ΟΙΝΩΝ ΜΕ ΜΕΚΡΟΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ ΚΑΙ ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Ενώσεις Αρώματος Τροφίμων Ιωάννης Ρούσσης Οκτώβριος 2018 Οργανοληπτική δοκιμασία τροφίμων είναι η αποτίμηση της ποιότητά στους με τα αισθητήρια όργανα του ανθρώπου. Χρησιμοποιούνται η όραση, η όσφρηση, και η γεύση και η αφή. Με την όραση αποτιμάται το χρώμα, η διαύγεια και η λαμπρότητα, όπως επίσης η ρευστότητα και το ιξώδες. Με την όσφρηση αποτιμάται η οσμή και το άρωμα των τροφίμων. Υπάρχει η άμεση όσφρηση (χρήση ρινικής κοιλότητας), όπως και η όσφρηση μέσω της στοματο-ρινικής κοιλότητας. Το δεύτερο είναι το γευστικό άρωμα (ή άρωμα του στόματος), δηλαδή μέρος της γεύσης είναι ουσιαστικά όσφρηση. Με την γεύση αποτιμώνται τα γευστικά χαρακτηριστικά, όπως η γλυκύτητα, η οξύτητα, η πικρότητα, το αλμυρό. Οι στοματικές εντυπώσεις αφορούν τις γεύσεις και τις εφαπτικές εντυπώσεις. Οι εφαπτικές εντυπώσεις αφορούν τη δομή, τη ρευστότητα και το ιξώδες και αποτιμώνται από όλο το στόμα. Το σύνολο των εντυπώσεων που λαμβάνονται με τη ρινική και τη στοματική κοιλότητα καλείται flavour. Συνήθως, θεωρείται το σύνολο της γεύσης και αρώματος (γευσάρωμα). Το flavour είναι αποτέλεσμα της ισορροπίας και συγκέντρωσης πολλών ενώσεων. Το περίπου 70 % της αίσθησης του flavour οφείλεται σε πτητικές ενώσεις. Πολλές πτητικές ενώσεις είναι οσμηρές ενώσεις. Χαρακτηριστικά των πτητικών ενώσεων flavour είναι: έχουν ΜΒ < 400 Da, βρίσκονται σε συγκεντρώσεις από < 1 ppb μέχρι 1000 ppm, έχουν κατώφλι οσμής από < 0,001 ppb μέχρι > 1000 ppb.

113 Παράδειγμα, η πυραζίνη έχει 0,002 μg/l, η φουρανεόλη 0,16 μg/l, το διμεθυλοσουλφίδιο 0,33 μg/l, το διακετύλιο 7 μg/l. Διάφορες ενώσεις έχουν γεύση, όπως αμινοξέα, πεπτίδια, οργανικά οξέα, ζάχαρα, φαινολικές ενώσεις και άλλες. Η παράμετρος Δείκτης Αρώματος θεωρείται σημαντική, και ορίζεται ως ο λόγος της συγκέντρωσης της ένωσης προς το όριο ανίχνευσής της. Το όριο ανίχνευσης είναι η ελάχιστη συγκέντρωση της ένωσης σε υδατικό διάλυμα που μπορεί να γίνει αντιληπτή με την όσφρηση. Ανάλογα μπορεί να εφαρμόζονται και για τις ενώσεις γεύσης. Με τη χρήση του Δείκτη Αρώματος μπορεί να αποτιμάται η συνεισφορά κάθε ένωσης στο άρωμα. Επίσης, με τη χρήση του Δείκτη Αρώματος αναδεικνύονται οι ενώσεις που προσδίνουν το ιδιαίτερο άρωμα σε διάφορα τρόφιμα. Στην αγγλική γλώσσα για τέτοιες ενώσεις χρησιμοποιείται ο όρος Character Impact Compounds (CIC). Flavour προϊόντων ζύμωσης γάλακτος Το γιαούρτι είναι προϊόν ζύμωσης του γάλακτος με χρήση της συμβιωτικής καλλιέργειας Streptococcus thermophilus και Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus σε αναλογία 1:1. Με ζύμωση της λακτόζης παράγεται γαλακτικό οξύ, μειώνεται το ph, συμβαίνει πήξη των πρωτεϊνών και δημιουργείται η χαρακτηριστική δομή. Το γιαούρτι είναι λευκό, χωρίς συστατικά που δεν προέρχονται από το γάλα. Επίσης, περιέχει υψηλούς πληθυσμούς γαλακτικών βακτηρίων που είναι ζωντανά κατά το χρόνο διατήρησής του. Η περιεκτικότητα του γιαουρτιού σε λίπος και ΣΥΑΛ (στερεό υπόλειμμα άνευ λίπους) είναι κατά περίπου 10 % μεγαλύτερη από την περιεκτικότητα του γάλακτος από το οποίο προέρχεται. Η οξύτητα του γιαουρτιού είναι μεγαλύτερη από 0,6 % σε γαλακτικό οξύ. Για την παρασκευή του γιαουρτιού το γάλα υφίσταται θερμική κατεργασία στους o C για 30-5 min. Η θερμική κατεργασία έχει ως σκοπούς την καταστροφή των βλαστικών κυττάρων των παθογόνων μικροοργανισμών, όπως και την συμπύκνωση του γάλακτος με εξάτμιση νερού για λήψη πιο συμπαγούς γιαουρτιού. Επίσης, με μετουσίωση πρωτεϊνών του ορού ευνοούνται αλληλεπιδράσεις καζεϊνών-πρωτεϊνών ορού. Έτσι, σχηματίζεται δίκτυο πρωτεϊνών, και με τη μείωση του ph στο ισοηλεκτρικό σημείο των καζεϊνών λαμβάνει χώρα η πήξη. Εάν εφαρμοστεί απευθείας θέρμανση μπορεί το γάλα να αποκτήσει άσχημη οσμή. Μετά τη θερμική κατεργασία το γάλα ψύχεται στους o C και προστίθεται η καλλιέργεια. Η καλλιέργεια μπορεί να είναι φρέσκο

114 γιαούρτη, και προστίθεται σε αναλογία περίπου 3 %. Στη συνέχεια γίνεται επώαση στους περίπου 42 o C για λίγες ώρες, μέχρι το ph να μειωθεί στο 4,5. Ακολούθως, το γιαούρτι τοποθετείται στο ψυγείο. Το flavour του γιαουρτιού μπορεί να προέρχεται από το γάλα, να σχηματίζεται κατά τη θερμική κατεργασία, και κυρίως να σχηματίζεται με τη ζύμωση. Το γάλα έχει μάλλον ήπιο/αδύνατο flavour. Η προέλευση των συστατικών που συνεισφέρουν στο flavour του γάλακτος μπορούν να κατανεμηθούν σε τέσσερις κατηγορίες σύμφωνα με την προέλευσή τους. --Χημικές ενώσεις που προέρχονται από το μεταβολισμό του γαλακτοφόρου ζώου και/ ή τις ζωοτροφές. --Χημικές ενώσεις που παράγονται από χημικές αντιδράσεις, τις δράσεις των ενδογενών ενζύμων και/ ή τη μικροβιακή χλωρίδα πριν την επεξεργασίας του γάλακτος. --Χημικές ενώσεις που παράγονται από τη θερμική επεξεργασία του γάλακτος. --Χημικές ενώσεις που αναπτύσσονται κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Το είδος και ο αριθμός των πτητικών συστατικών που έχουν ταυτοποιηθεί στο γάλα και τα προϊόντα γάλακτος είναι μεγάλος. Ερευνητές ταυτοποίησαν στο γάλα διαφόρων ειδών ζώων και επεξεργασίας (φρέσκο, αποστειρωμένο και συμπυκνωμένο) 32 υδρογονάνθακες, 23 αλκοόλες, 29 αλδεϋδες, 23 κετόνες, 19 οργανικά οξέα, 21 εστέρες, 12 λακτόνες, 15 θειοενώσεις, 1 ακετάλη, 6 αλογονοενώσεις, 4 φαινόλες, 8 φουράνια, συνολικά 206 ενώσεις. Τα δεδομένα αυτά είναι εντυπωσιακά ως αριθμοί, όμως δεν είναι επαρκή για αποτίμηση του flavour. Για να αξιοποιηθούν τα στοιχεία αυτά πρέπει να είναι γνωστά στοιχεία, όπως η συνεισφορά τους στο άρωμα, και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους. Η συνολική αποτίμηση μια πολύ δύσκολη εργασία, πόσο μάλλον για ένα σύνθετο τρόφιμο, όπως είναι το γάλα και τα προϊόντα του. Το νωπό γάλα καλής ποιότητας έχει ένα ήπιο αλλά χαρακτηριστικό flavour. Προκαλεί μία ευχάριστη εντύπωση στο στόμα με μία ελαφρά αλμυρή και γλυκιά γεύση που οφείλονται στην παρουσία αλάτων και λακτόζης. Λόγω της ουσιαστικά μη ύπαρξης αρώματος, το γάλα είναι ένα καλό μέσο για δυσάρεστες οσμές (off-flavours). Οι οσμηρές ενώσεις παράγονται με υδρόλυση, οξείδωση, ενζυμικές και μικροβιακές δράσεις.

115 Σε ζυμούμενα προϊόντα γάλακτος, όπως το γιαούρτι, μπορεί να υπάρχουν επιπλέον ενώσεις flavour. Είναι πολύ σημαντικό να ταυτοποιούνται οι ενώσεις που συμβάλλουν καθοριστικά στην ποιότητά τους, δηλαδή είναι ενώσεις κλειδιά του flavour/αρώματός τους. Ο κύριος σκοπός της ζύμωσης στα τρόφιμα είναι η διασφάλιση σωστής συντήρησης του ζυμούμενου προϊόντος. Στο γιαούρτι και στο τυρί, η γρήγορη μετατροπή της λακτόζης του γάλακτος σε γαλακτικό οξύ είναι το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό των γαλακτικών βακτηρίων. Έτσι, με μείωση του ph και της λακτόζης, συμβαίνει αναστολή ανάπτυξης ανεπιθύμητων βακτηρίων. Εκτός από την παραγωγή γαλακτικού οξέος, οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται στις ζυμώσεις γαλακτοκομικών προϊόντων συνεισφέρουν ή καθορίζουν το flavour των προϊόντων. Το flavour του γιαουρτιού δεν είναι ιδιαίτερα σύνθετο και σχηματίζεται από συνδυασμό του γαλακτικού οξέος και διάφορων καρβονυλικών ενώσεων όπως η ακεταλδεύδη και το διακετύλιο. Στο γιαούρτι, τα βακτήρια της καλλιέργειας δρουν συνεργιστικά για απελευθέρωση αμινοξέων από τις πρωτεΐνες. Στο γιαούρτι συμβαίνει σχετικά χαμηλού επιπέδου λιπόλυση. Ανάπτυξη starters (Streptococcus thermophillus, Lactobacillus bulgaricus), μείωση του ph και σχηματισμός ακεταλδεύδης κατά την παρασκευή γιαουρτιού.

116 Η ανάπτυξη flavour στα τυριά που ωριμάζουν είναι σύνθετη και αργή διαδικασία, κατά την οποία συμβαίνουν χημικές και βιοχημικές μετατροπές συστατικών. Στα τυριά με δράση ενζύμων της πυτιάς και πρωτεολυτικών ενζύμων των γαλακτικών βακτηρίων σχηματίζονται μικρά πεπτίδια και ελεύθερα αμινοξέα από τις καζείνες. Τα μικρά πεπτίδια και αμινοξέα είναι υπεύθυνα για flavour σε ώριμα τυριά, όπως πικάντικο, ζωμού, γλυκό και αλμυρό, και επίσης ανεπιθύμητο πικρό. Επίσης, ανάπτυξη ιδιαίτερου flavour τυριών προκύπτει από αμινοξέα με σχηματισμό αλκοολών, αλδεϋδών, οξέων, εστέρων και θειούχων ενώσεων. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα είναι οι πιο σημαντικές ενώσεις flavour που προέρχονται από το λίπος με λιπόλυση. Τα γαλακτικά βακτήρια συνήθως έχουν ασθενείς λιπολυτικές δράσεις. Στο Cheddar και τυριά Ολανδικού τύπου (Gouda, Edam) συμβαίνει σχετικά χαμηλού βαθμού λιπόλυση. Σε τυριά Ιταλικού τύπου, μπλε τυριά και κάποια τυριά που ωριμάζουν με μύκητες και επιφανειακή ανάπτυξη βακτηρίων συμβαίνει εκτεταμένη λιπόλυση. Λιπαρά οξέα έχουν flavour όπως πικάντικο-οξύ, σαπωνώδεςταγγό, κηρώδες, και μερικές φορές ακόμη και πικρό. Στα τυριά, ελεύθερα λιπαρά είναι πρόδρομες ενώσεις για πολλές ενώσεις flavour, όπως μεθυλοκετόνες, λακτόνες, εστέρες, αλδεύδες και δευτεροταγείς αλκοόλες. Ενώσεις αρώματος οίνων Ο οίνος είναι προϊόν αλκοολικής ζύμωσης του γλεύκους (των ζαχάρων) με δράση ζυμομυκήτων, το οποίο υφίσταται κατεργασίες, οξειδωτική παλαίωση σε βαρέλι και αναγωγική παλαίωση στο μπουκάλι. Το άρωμα των οίνων διακρίνεται σε πρωτογενές, δευτερογενές και τριτογενές. Επίσης, υπάρχει διάκριση μεταξύ του αρώματος και του μπουκέτου του οίνου. Το άρωμα είναι σχετικά απλή σύνθεση, ενώ το μπουκέτο είναι μίξη πολλών αρωμάτων. Το πρωτογενές ή ποικιλιακό άρωμα οφείλεται σε ενώσεις αρώματος των σταφυλιών. Τέτοιες είναι τερπενικές αλκοόλες, εστέρες, ανώτερες αλκοόλες και πτητικά παράγωγα φαινολών. Επίσης, στα οσμηρά συστατικά του σταφυλιού είναι η εξανόλη και η εξενόλη, που προσδίνουν χορτώδη οσμή. Το δευτερογενές άρωμα ή άρωμα ζύμωσης οφείλεται σε ενώσεις που παράγονται κατά τη ζύμωση του γλεύκους. Τέτοιες είναι εστέρες, όπως ο οξικός αιθυλεστέρας, ο ισοαμυλικός αιθυλεστέρας, ο καπρονικός αιθυλεστέρας, ο καπρυλικός αιθυλεστέρας, ανώτερες αλκοόλες, όπως η

117 προπανόλη, η ισοβουτανόλη, η ισοαμυλική αλκοόλη, λιπαρά οξέα και άλλες. Επίσης, κατά τη μηλογαλακτική ζύμωση παράγονται ενώσεις αρώματος, όπως ο γαλακτικός αιθυλεστέρας. Το τριτογενές άρωμα ή άρωμα παλαίωσης οφείλεται σε ενώσεις που δημιουργούνται κατά την ωρίμανση και παλαίωση του οίνου. Σε αναγωγικές συνθήκες δημιουργούνται οι ενώσεις του λεγόμενου μπουκέτου των οίνων. Επίσης, δημιουργούνται εστέρες των οξέων του οίνου με την αιθανόλη, όπως ηλεκτρικός και μηλικός αιθυλεστέρας. Πολλές ενώσεις με το χαρακτηριστικό τους άρωμα συμβάλλουν στο άρωμα του οίνου. Οι εστέρες συμβάλλουν στο φρουτώδες άρωμα. Ο καπρονικός αιθυλεστέρας έχει άρωμα βιολέτας και ο ισοαμυλικός αιθυλεστέρας μπανάνας. Από άλλες ενώσεις η φανυλο-2-αιθανόλη έχει άρωμα τριαντάφυλλου, η εξανόλη χόρτου, το διακετύλιο βουτύρου. Από την άλλη πλευρά, διάφορες ενώσεις έχουν αρνητική επίδραση στο άρωμα του οίνου. Παράδειγμα, με οξείδωση μετά την μείωση του φρουτώδους αρώματος παράγεται άρωμα οξείδωσης. Με οξείδωση της αιθανόλης παράγεται ακαταλδεΰδη, που έχει έντονο χαρακτηριστικό άρωμα. Οι εστέρες και οι ανώτερες αλκοόλες συμβάλλουν σημαντικά στο άρωμα των οίνων. Οι αιθυλεστέρες υπάρχουν σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες και μικρότερες από το κατώφλι αντίληψής τους. Μεταξύ των εστέρων είναι ο οξικός αιθυλεστέρας που έχει χαρακτηριστική οσμή. Σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις συμβάλλει στο σύνθετο του αρώματος των οίνων, ενώ σε υψηλές (παράδειγμα > 180 mg/l) έχει αρνητική επίδραση. Επίσης, οι ανώτερες αλκοόλες σε μικρές συγκεντρώσεις συμβάλλουν στο σύνθετο του αρώματος των οίνων, ενώ σε μεγαλύτερες (παράδειγμα > 300 ή mg/l) έχουν ανεπιθύμητη επίδραση, προσδίνουν πικάντικο και χορτώδη χαρακτήρα. Μέθοδοι προσδιορισμού ενώσεων αρώματος Οι ενώσεις αρώματος προσδιορίζονται κυρίως με αέριο χρωματογραφία με ανιχνευτή ανάλογα με τις ενώσεις που προσδιορίζονται. Πολύ επιτυχής είναι ο συνδυασμός αέριας χρωματογραφίας με φασματοσκοπία μάζας (GC-MS). Για κάθε συστατικό του δείγματος λαμβάνεται το φάσμα μάζας με την έκλουσή του από τον αέριο χρωματογράφο. Για την ταυτοποίηση των ενώσεων χρησιμοποιούνται αποθηκευμένα φάσματα που υπάρχουν στη βιβλιοθήκη του υπολογιστή. Επίσης, χρησιμοποιούνται φάσματα πρότυπων ενώσεων, υπό τις συνθήκες της ανάλυσης. Για πτητικές ενώσεις σε σχετικά μεγάλες συγκεντρώσεις μπορεί να γίνει απευθείας έγχυση του δείγματος, ενώ συχνά προηγείται εκχύλιση.

118 Εφαρμόζεται εκχύλιση υγρού-υγρού, εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE), όπως και μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (SPME). Γενικά για τη λήψη και στη συνέχεια προσδιορισμό πτητικών ενώσεων χρησιμοποιούνται πολλές μέθοδοι. Κλασσικές είναι οι τεχνικές της απόσταξης και της εκχύλισης με χρήση διαλυτών. Νεότερες είναι οι τεχνικές ανάλυσης υπερκείμενου χώρου (του αερίου πάνω από την επιφάνεια του δείγματος). Η μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (SPME) χρησιμοποιείται σήμερα ευρέως για την ανάλυση πτητικών συστατικών. Είναι γρήγορη και δεν χρησιμοποιεί διαλύτες. Μπορούν να αναλυθούν υγρά, στερεά και αέρια δείγματα. Η λήψη (εκχύλιση) γίνεται στην επιφάνεια μιας λεπτής ίνας από πυρίτιο που έχει μία επικάλυψη. Τα διάφορα συστατικά παρουσιάζουν διαφορετική συμπεριφορά, που εξαρτάται από παράγοντες, όπως η πολικότητα, η πτητικότητα, η θερμοκρασία, και άλλα χαρακτηριστικά του δείγματος και των συνθηκών εκχύλισης Η τεχνική SPME συνδυάζεται με την αέρια χρωματογραφία. Με την υψηλή θερμοκρασία του εισαγωγέα (χώρου εισαγωγής δείγματος) και το φέρον αέριο πετυχαίνεται η εκρόφηση των ενώσεων που έχουν προσροφηθεί στην ίνα. Η χειροκίνητη συσκευή SPME αποτελείται από έμβολο με ελατήριο που κινείται μέσα σε κύλινδρο. Έτσι, το έμβολο μπορεί να βρίσκεται σε εκτεταμένη θέση κατά την εκχύλιση και εκρόφηση. Στην άκρη του εμβόλου υπάρχει βελόνα από ατσάλι που φέρει λεπτό σωλήνα από ατσάλι στον οποίο βρίσκεται μικρό τμήμα ίνας από τετηγμένο πυρίτιο. Το ακραίο εκατοστό της ίνας είναι επικαλυμμένο από λεπτή μεμβράνη. Στη μεμβράνη αυτή γίνεται η λήψη (εκχύλιση) των πτητικών συστατικών. Υπάρχουν διάφορες επιστρώσεις ινών, με διαφορετικό πάχος και πολικότητα.

119 Σχήμα. Χειροκίνητη συσκευή SPME. Αέρια Χρωματογραφία- Φασματοσκοπία Μάζας (GC/MS) Η χρωματογραφία είναι κύρια τεχνική διαχωρισμού συγγενών χημικών ενώσεων. Επιπλέον, χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ενώσεων. Η χρωματογραφία αερίου-υγρού (gas-liquid chromatography, GLC) χρησιμοποιείται ευρύτατα, και συχνότερα αναφέρεται ως αέρια χρωματογραφία (gas chromatography, GC). Βασίζεται στην κατανομή του αναλύτη μεταξύ της αέριας κινητής και μιας υγρής στατικής φάσης. Το διάλυμα του δείγματος εγχύεται στον εισαγωγέα του χρωματογράφου, όπου εξατμίζεται. Η έκλουση πραγματοποιείται με ροή αδρανούς αερίου (όπως το ήλιο), το οποίο αποτελεί την κινητή φάση.

120 Η συνηθέστερη τεχνική έγχυσης υγρού ή αερίου δείγματος είναι με μικροσύριγγα, μέσω ενός αυτοσφραγιζόμενου ελαστικού διαφράγματος σιλικόνης, γνωστού ως septum. Χρησιμοποιούνται πληρωμένες στήλες (packed) ή τριχοειδείς στήλες (capillary). Tα συστατικά του δείγματος συμπαρασύρονται από το φέρον αέριο κατά μήκος της στήλης και διαχωρίζονται. Ο διαχωρισμός πετυχαίνεται με βάση τη συγγένεια των ενώσεων με τη στατική φάση. H ταχύτητα και η ικανότητα του διαχωρισμού εξαρτώνται από τη θερμοκρασία. Έτσι, η στήλη βρίσκεται σε φούρνο, του οποίου η θερμοκρασία ελέγχεται. Από το χρωματογράφημα ως πληροφορία λαμβάνεται ο χρόνος κατακράτησης της κάθε ένωσης. Η ταυτοποίηση των ενώσεων γίνεται με φασματοσκοπική ή χημική εξέτασή τους. Το σήμα από τον ανιχνευτή αέριου χρωματογράφου χρησιμοποιείται για ποσοτικούς και ημιποσοτικούς προσδιορισμούς. Οι αναλύσεις βασίζονται στην επιφάνεια ή στο ύψος της κορυφής. Χρησιμοποιείται βαθμονόμηση και πρότυπα. Επίσης, χρησιμοποιείται η μέθοδος εσωτερικού προτύπου, που προστίθεται σε κάθε πρότυπο διάλυμα και σε κάθε δείγμα. Χρησιμοποιείται ο λόγος της επιφάνειας (ή ύψους) της κορυφής του αναλύτη προς την αντίστοιχη του εσωτερικού προτύπου. Με αέρια χρωματογραφία φασματοσκοπία μάζα; (GC/MS) πολύπλοκα μίγματα χημικών ενώσεων μπορεί να διαχωριστούν, ταυτοποιηθούν και ποσοτικοποιηθούν. Το έκλουσμα της στήλης παρακολουθείται με ανιχνευτή μάζας. Μέσω γραμμής μεταφοράς εισέρχεται σε θάλαμο ιοντισμού, όπου οι ενώσεις μετατρέπονται σε ιόντα. Τα φασματόμετρα μαζών αποτελούνται από α) το θάλαμο ιοντισμού, όπου μετατρέπεται η ένωση σε ιόντα, με απόσπαση ενός ηλεκτρονίου, β) τον αναλυτή μαζών, όπου γίνεται διαχωρισμός των ιόντων με βάση το λόγω m/z, γ) τoν ανιχνευτή.

121 Ο χώρος όπου δημιουργούνται και επιταχύνονται τα ιόντα διατηρείται σε κατάσταση υψηλού κενού. Με το υψηλό κενό δημιουργούνται σε χαμηλές θερμοκρασίες θέρμανσης ατμοί της προς προσδιορισμό ένωσης χωρίς τη διάσπασή της. Ο συνηθέστερος τρόπος ιοντισμού είναι με βομβαρδισμό των αερίων μορίων της ένωσης με δέσμη ηλεκτρονίων (ΕΙ) μεγάλης ενέργειας (συνήθως 70 ev), δημιουργείται με απώλεια ενός ηλεκτρονίου από μέρους της ένωσης μια κατιοντική ρίζα, που αντιστοιχεί στο μοριακό ιόν, που δίνει το μοριακό βάρος της ένωσης. Λόγω της υψηλής ενέργειας, το μοριακό ιόν συνήθως διασπάται και προκύπτουν περαιτέρω μικρά ιόντα που δίνουν αποτύπωμα (φάσμα μάζας) της ένωσης. Η πληροφορία αυτή χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση των ενώσεων. Το επόμενο τμήμα είναι ένας αναλυτής μάζας (φίλτρο). Συνήθης αναλυτής είναι ο τετραπολικός αναλυτής (quadrupole mass analyzer), συσκευή με την οποία τα ιόντα διαχωρίζονται με βάση τους λόγους m/z. Αποτελείται από τέσσερις μεταλλικές ράβδους, που συνδέονται ηλεκτρικά μεταξύ τους. Μόνο τα ιόντα δεδομένης μάζας μπορεί να περάσουν το τετράπολο φίλτρο μάζας. Μετά το διαχωρισμό τα ιόντα εισέρχονται σε ανιχνευτή, το σήμα ενισχύεται από πολλαπλασιαστή ηλεκτρονίων. Η πληροφορία πηγαίνει στον υπολογιστή, που καταγράφει τα δεδομένα. Ο υπολογιστής, επίσης, ελέγχει τη λειτουργία του φασματόμετρου μάζας.

122 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Προσδιορισμός πτητικών ενώσεων γιαουρτιών Ο προσδιορισμός των πτητικών ενώσεων γιαουρτιού γίνεται με μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (Solid Phase MicroExtraction, SPME) και αέρια χρωματογραφία με ανιχνευτή φασματογράφο μάζας (Gas Chromatography Mass Spectroscopy, GC-MS). Ποσότητα γιαουρτιού, 20 g, αναμιγνύεται / ομογενοποιείται με 10 g NaCl. 4,0/ 8,0 g του μίγματος τοποθετούνται σε μπουκαλάκι των 12 /15 ml με πώμα με septum (Supelco). Στο δείγμα προστίθενται 50 μl εσωτερικού προτύπου, 4-μεθυλο-2-πεντανόλη, συγκέντρωσης 4 mg/l και μικρό μαγνητάκι. Το δείγμα θερμαίνεται στους 60 / 50 ο C, παραμένει για 15 / 20 min για σταθεροποίηση. Στη συνέχεια τοποθετείται η ίνα (Supelco 50/30 μm DVB/CAR/PDMS), στο μέσο του υπερκείμενου χώρου, για 60 / 20 min. Ακολούθως, η ίνα τοποθετείται στον εισαγωγέα του αέριου χρωματογράφου, και παραμένει για 5 min ώστε να γίνει θερμική εκρόφηση. Εικόνα. Κατεργασία δείγματος μέχρι την έγχυση στον εισαγωγέα του αέριου χρωματογράφου. Για την ανάλυση χρησιμοποιείται αέριος χρωματογράφος HP 6890 Series GC system με split/splitless εισαγωγέα συνδεμένο με ανιχνευτή συλλογής μαζών HP 5973 Mass Selective Detector. Η θερμοκρασία πηγής είναι 230 ο C, και του τετραπόλου 150 ο C. Η στήλη που χρησιμοποιείται είναι J & W DB-WAX, 60 m, 0,32 mm, 0,50μm. Εφαρμόζεται η τεχνική splitless για 3 min, και στη συνέχεια η τεχνική split με αναλογία 2:1. Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα ξεκινάει από τους 35 / 40 ο C με παραμονή για 4 / 5 min. Στη συνέχεια η αύξηση είναι με ρυθμό 4 / 3 ο C /