ΙΣΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΚΑΙ ΗΠΑΤΟΣ ΑΤΟΜΩΝ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Carassius gibelio ΑΠΟ ΤΗ ΛΙΜΝΗ ΚΑΡΛΑ. ΠΙΘΑΝΕΣ ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΩΝ ΚΥΑΝΟΤΟΞΙΝΩΝ

Transcript

1 ΙΣΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΚΑΙ ΗΠΑΤΟΣ ΑΤΟΜΩΝ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Carassius gibelio ΑΠΟ ΤΗ ΛΙΜΝΗ ΚΑΡΛΑ. ΠΙΘΑΝΕΣ ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΩΝ ΚΥΑΝΟΤΟΞΙΝΩΝ Βερίλλης Π. *, Πετρίδου Ε, Κορμάς Κ.Α., Κάγκαλου Ι. Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Γεωπονική Σχολή, Τμήμα Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Περίληψη Πειραματικά δεδομένα μοριακής ανάλυσης από συλλεγέντα δείγματα νερού ( Μάιος 2010) από τη «νέα» λίμνη Κάρλα έδειξαν την ύπαρξη των δυνητικώς τοξικών κυανοβακτηρίων Anabaenopsis nadsonii και Planktothrix sp. Η μελέτη των κυανοτοξινών και οι πιθανές επιπτώσεις τους στους υδρόβιους οργανισμούς είναι ιδιαίτερα σημαντική και υπό το πρίσμα της δημόσιας υγείας. Στην παρούσα εργασία διερευνάται η ιστοπαθολογία του εγκεφάλου και του ήπατος ατόμων του είδους Carassius gibelio (κοινώς πεταλούδα) παρουσία δυνητικώς τοξικών κυανοβακτηρίων. Για το λόγο αυτό άτομα του είδους Carassius gibelio συλλέχθηκαν τον Ιούνιο 2010 από την λίμνη Κάρλα με σκοπό την μελέτη των προαναφερομένων ιστών. Ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν κατά την μικροσκοπική εξέταση ιστών του ήπατος. Υπήρξαν πυκνωτικοί πυρήνες, απώλεια της αρχιτεκτονικής δομής του ήπατος και διάχυτες αιμορραγίες σε αυτό. Οι αλλοιώσεις αυτές ίσως να οφείλονται στην πιθανή ύπαρξη κυανοτοξινών στην υδάτινη στήλη της λίμνης πιθανώς παραγόμενες από τα είδη Anabaenopsis nadsonii και Planktothrix sp.. Ο εγκέφαλος παρουσίασε φυσιολογική εικόνα, πιθανώς λόγω της ύπαρξης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Λέξεις κλειδιά: Εγκέφαλος, ήπαρ, Carassius gibelio, κυανοτοξίνες. BRAIN AND LIVER HISTOPATHOLOGICAL STUDY OF LAKE KARLA S Carassius gibelio INDIVIDUALS. THE POSSIBLE AFFECTS OF THE CYANOBACTERIAL TOXINS. Berillis P. *, Petridou E., Kormas K.A., Kagalou I. University of Thessaly, School of Agricultural Sciences, Department of Ichthyology and Aquatic Environment, pveril@apae.uth.gr Abstract Water from the new Lake Karla was collected in May Molecular analysis revealed the existence of the Anabaenopsis nadsonii and Planktorhrix sp., which are potentially toxic. The investigation of cyanobacterial toxins along with their possible effects on aquatic organisms are critical components in freshwater ecosystems functioning. Towards this, individuals of the species Carassius gibelio from L. Karla, were collected in June This study investigates brain and liver histopathology of C. gibelio individuals. Histopathological alterations in the liver of the individuals were detected by microscopic examination. Picnotic nuclei, loss of the liver structure and hemorrhagic regions were detected. These alterations may be associated with the occurrence of cyanobacterial toxins possibly produced by Anabaenopsis nadsonii and Planktorhrix sp.. The microscopic examination of the brain did not reveal alteration, probably due to the existence of the blood brain barrier. Keywords: Brain, liver, Carassius gibelio, cyanobacterial toxins.

2 1. Εισαγωγή Ο ευτροφισμός των λιμνών συνεχίζει να αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα παγκοσμίως αφού- εκτός των άλλων- συνοδεύεται από συχνές και έντονες ανθίσεις κυανοβακτηρίων. Τα κυανοβακτήρια και η επακόλουθη πιθανή αλλά πολύ συχνή παραγωγή των τοξινών, ενοχοποιούνται για την υποβάθμιση των υδάτων και για την προαγωγή τοξικών φαινομένων πολλών ζώων συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου (Chorus, 2001). Ενώ η παραγωγή των κυανοτοξινών συνιστά μια από τις πλέον επιτυχημένες οικολογικά στρατηγικές των ίδιων των κυανοβακτηρίων, η παρουσία τους ακόμη και σε συγκεντρώσεις που απαντώνται στο φυσικό περιβάλλον μπορεί να προκαλέσει βλάβες στους οργανισμούς ακόμη και να επιφέρει θάνατο (Codd et al., 1999). Η έκθεση στις κυανοτοξίνες μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω της κατανάλωσης νερού που περιέχει κυανοτοξίνες ή μέσω της επαφής με αυτό. Ο ανθρώπινος πληθυσμός μπορεί να εκτεθεί επίσης, μέσω της κατανάλωσης υδρόβιων μολυσμένων οργανισμών που περιέχουν κυανοτοξίνες. Τα πιο γνωστά γένη κυανοβακτηρίων που στελέχη τους εμφανίζουν την ικανότητα της παραγωγής τοξινών είναι τα γένη: Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Lyngbya, Microcystis, Nodularia, Nostoc και Planktothrix (Carmichael, 2001). Αυτά τα γένη μπορούν να παράγουν πολλές διαφορετικές τοξίνες, από τις οποίες οι ευρύτερα γνωστές είναι οι ηπατοτοξίνες. Οι μικροκυστίνες που ανήκουν στην ομάδα των ηπατοτοξινών παράγονται κυρίως από τα γένη Microcystis, Anabaena και Planktothrix, τα οποία εμφανίζουν τη μεγαλύτερη αφθονία στα εσωτερικά ύδατα (Codd, 1995). Η διεθνής βιβλιογραφία έχει να επιδείξει πλήθος επιστημονικών δημοσιεύσεων σχετικά με την τοξικολογία των μικροκυστινών, κυρίως εστιαζόμενες στην οξεία τοξίνωση, αποδεικνύοντας την πρόκληση μη-αναστρέψιμων βλαβών σε διάφορους ιστούς (ήπαρ, έντερο, γονάδες, νεφρό, μυς). Η χρόνια τοξίνωση παρά το γεγονός ότι αποτελεί ένα λιγότερα μελετημένο αντικείμενο, επίσης οδηγεί σε ποικίλα ιστοπαθολογικά ευρήματα (Huisman et al., 2005; Dietrich and Hoeger, 2005). Τις τελευταίες δεκαετίες οι φυσικές λίμνες στην Ελλάδα παρουσιάζουν συμπτώματα ευτροφισμού, σε μεγαλύτερο ή μικρότερο βαθμό εξ αιτίας πλήθους ανθρωπογενών παραγόντων όπως είναι η εισροή αστικών και γεωργοκτηνοτροφικών αποβλήτων, η απορροή λιπασμάτων, η μεταβολή των χρήσεων γής, κ.λ.π με αποτέλεσμα τη συχνή αλλά και παρατεταμένη άνθιση των κυανοβακτηρίων. Έχει επίσης διαπιστωθεί η παρουσία κυανοβακτηρίων και κυανοτοξινών σε αρκετές από αυτές (Lanaras et al., 1989; Vardaka et al. 2000; Moustaka-Gouni et al., 2006; Gkelis et al., 2005; Kagalou et al., 2008; Vareli et al., 2009; Papadimitriou et al., 2010)..Οι ταμιευτήρες διαφέρουν σημαντικά από τις φυσικές λίμνες, σε σχέση με τις βασικές φυσικές, χημικές και βιολογικές διαδικασίες. Μια από τις πιο σημαντικές διαφορές, είναι η υδρολογική τους κατάσταση (Straskraba and Tundisi 1999). Λόγω μιας λειτουργικής διαχείρισης του όγκου του νερού τους, οι ταμιευτήρες έχουν λιγότερο χρόνο διατήρησης (κατακράτησης) σε σύγκριση με εκείνου των λιμνών, έντονες διακυμάνσεις της στάθμης του νερού, όπως επίσης και περιοδικές αναμίξεις ανάλογα με τη χρήση τους (Toundisi et al. 1999). Τα χαρακτηριστικά αυτά έχουν σοβαρές επιπτώσεις μεταξύ άλλων και στη φυτοπλαγκτονική κοινωνία ενός ταμιευτήρα (Naselli-Flores 2000, Naselli-Flores and Barone 2005).

3 Η λίμνη Κάρλα είναι ένα «νέο», επαναδημιουργούμενο οικοσύστημα με σπουδαία βιολογική, οικολογική, κοινωνική και οικονομική σημασία. Ως εκ τούτου η παρακολούθηση της δομής και της λειτουργίας της ελκύει το επιστημονικό ενδιαφέρον. Με δεδομένο δε, ότι οι χρήσεις της είναι πολλές (άρδευση, αλιεία, αναψυχή, κ.λ.π) η μελέτη των κυανοτοξινών και οι πιθανές επιπτώσεις στους υδρόβιους οργανισμούς της είναι ιδιαίτερα σημαντική και υπό το πρίσμα της δημόσιας υγείας. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν και παρουσιάζονται ιστοπαθολογικά ευρήματα στο είδος Carassius gibelio σε συνάρτηση με την παρουσία τοξινοπαραγωγών κυανοβακτήριων. 2. Υλικά και Μέθοδοι Περίπου 500 ml επιφανειακού νερού συλλέχτηκε σε πλαστικό δοχείο από το νοτιοδυτικό μέρος της λίμνης Κάρλας στις 28/05/2010. Υπόδειγμα 220 ml δείγμα διηθήθηκε σε κενό <150 mm Hg εντός δύο ωρών μέσω μεμβρανικού ηθμού διαμέτρου ίσου πόρου 0,2 μm μετά από προκαταρκτική διήθηση από ηθμό πλέγματος 180 μm. Η εκχύλιση του DNA έγινε με το εμπορικό UltraClean Soil DNA isolation Kit (MoBio, USA) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Η ποιότητα και η συγκέντρωση (11,5 ng/μl) του ολικού DNA έγινε με φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 και το δείγμα φυλάχτηκε στους -20 C μέχρι περαιτέρω ανάλυση. Για την ενίσχυση με PCR (35 κύκλοι) χρησιμοποιήθηκαν οι ειδικοί για κυανοβακτήρια εκκινητές των übel Net al. (1997) ενώ όλη η διαδικασία κλωνοποίησης, αλληλούχισης και επεξεργασίας των φυλοτύπων έγινε σύμφωνα με τους Kormas et al. (2011). Στις 16/6/2011 πραγματοποιήθηκε πειραματική αλιεία στη λίμνη Κάρλα. Αλιεύθηκαν άτομα του είδους Carassius gibelio. Πραγματοποιήθηκε τομή στην κοιλιακή χώρα και αφαιρέθηκε τμήμα του ήπατος. Μια δεύτερη τομή στην περιοχή του κρανίου οδήγησε στην αφαίρεση του εγκεφάλου. Οι λήψεις των δυο αυτών οργάνων έγιναν κάτω από ασηπτικές συνθήκες και με χειρουργικά εργαλεία τα οποία πρότερα είχαν αποστειρωθεί σε κλίβανο θερμοκρασίας 200 C για τουλάχιστον 2 ώρες. Τόσο ο εγκέφαλος όσο και το τμήμα του ήπατος που αφαιρέθηκε τοποθετήθηκαν σε γυάλινα δοχεία και υπερκαλύφθηκαν με διάλυμα ουδέτερης φορμόλης 4% και αφέθηκαν σε θερμοκρασία 4 C για 24 ώρες. Εν συνεχεία ακολούθησε περαιτέρω τεμαχισμός του εγκεφάλου με κάθετες τομές, ώστε η κάθε μια να περιλαμβάνει το σύνολο των στρωμάτων που τον απαρτίζουν. Προτιμήθηκε η τομή του εγκεφάλου να γίνει μετά τη μονιμοποίησή του και όχι αμέσως μετά τη λήψη, λόγω του ότι η διαδικασία της μονιμοποίησης είχε προκαλέσει σκλήρυνση του ιστού και η τομή του μπορούσε να γίνει ευκολότερα και ακριβέστερα. Λόγω του μικρού μεγέθους του εγκεφάλου δεν υπήρξε πρόβλημα μη σωστής μονιμοποίησης του συνόλου του εγκεφαλικού ιστού. Ακολούθησε το στάδιο της αφυδατώσεως με διαδοχικές εμβαπτίσεις των ιστοτεμαχιδίων σε αλκοολικά διαλύματα αυξανόμενου βαθμού. Τα ιστοτεμαχίδια υπέστησαν την διαδικασία της αφυδάτωσης με διαδοχική εμβάπτιση σε αλκοολικά διαλύματα αυξανόμενης συγκέντρωσης (70%, 95%, 100%) και με τελική εμβάπτιση σε καθαρή ακετόνη. Εν συνεχεία τα ιστοτεμαχίδια εμβαπτίστηκαν δύο φορές σε ξυλόλη για μία ώρα την κάθε φορά, ολοκληρώνοντας έτσι την διαδικασία της διαύγασης. Ακολούθησε εμποτισμός των ιστοτεμαχιδίων με υγρή παραφίνη. Τέλος τα ιστοτεμαχίδια εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Το καθένα από τα σκηνομένα σε παραφίνη ιστοτεμαχίδια τμήθηκε περιφερειακά με νυστέρι ώστε να δημιουργηθεί

4 παρασκεύασμα σχήματος μικρού κύβου, το οποίο ήταν ενδεδειγμένο για την μετέπειτα τομή στον μικροτόμο. Οι τομές που ελήφθησαν ήταν πάχους 5μm. Από το κάθε παρασκεύασμα ελήφθησαν δέκα τομές. Προκειμένου να διενεργηθεί ενδελεχής εξέταση του ήπατος και του εγκεφάλου των ατόμων του είδους Carassius gibelio, οι ιστολογικές τομές χρωματίστηκαν διάλυμα χρώσης αιματοξυλίνηςεωσίνης. Οι ιστολογικές τομές μελετήθηκαν ενδελεχώς σε οπτικό μικροσκόπιο (Pathological Microscope Radical RMH-4B). Μέσω ειδικά προσαρμοσμένης στο μικροσκόπιο κάμερας και ειδικού λογισμικού (Future WinJoe, Future Optics SCI&Tech Co., Ltd ) ελήφθησαν ψηφιακές εικόνες από τις ιστολογικές τομές. 3. Αποτελέσματα Συνολικά βρέθηκαν οκτώ κυανοβακτηριακοί φυλότυποι και τέσσερις που ανήκαν στο φύλο των Verrucomicrobia (Εικ.1). Δύο εκ των κυανοβακτηριακών φυλοτύπων σχετίζονται με είδη τα οποία δυνητικώς παράγουν κυανοτοξίνες, τα Anabaenopsis nadsonii και Planktothrix agardhii. Οι φυλότυποι των Verrucomicrobia είναι γνωστό ότι εμφανίζονται σε κυανοβακτηριακές ανθίσεις νερού με τη χρήση των συγκεκριμένων εκκινητών (Kormas et al. 2011). Η ιστοπαθολογική εξέταση του ήπατος και του εγκεφάλου των ατόμων του είδους Carassius gibelio κατέδειξε αλλοιώσεις μόνο όσον αφορά το ήπαρ, ενώ η ιστολογική εικόνα των εγκεφάλου χαρακτηρίζεται ως φυσιολογική (Εικ. 3). Οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις του ήπατος εστιάζονται στην απώλεια της αρχιτεκτονικής δομής του ηπατικού παρεγχύματος και στην ύπαρξη αιμορραγιών μέσα σε αυτό (Εικ. 2). Πιο συγκεκριμένα παρατηρήθηκε θολερή εξοίδηση (ύπαρξη κενοτοπίων εντός των κυττάρων), ύπαρξη πυκνωτικών πυρήνων, θραύση κυτταρικών μεμβρανών και πυρηνορρηξία.

5 Εικόνα 1: Φυλογενετικό δέντρο των σχέσεων των 16s rrna γονιδίων των μοναδικών κυανοβακτηριακών φυλοτύπων που ανιχνεύθηκαν στο νερό της λίμνης Κάρλας, βασισμένο στη μέθοδο neighbour-joining όπως καθορίζεται από την ανάλυση αποστάσεων Jukes-Cantor. Οι αριθμοί στις παρενθέσεις είναι αριθμοί καταχώρησης της GenBank. Οι φυλότυποι που βρέθηκαν επισημαίνονται με μαύρο ρόμβο. Η κλίμακα αντιπροσωπεύει 2% φυλογενετική απόσταση.

6 Εικόνα 2: Α) Φυσιολογική ιστοπαθολογική εικόνα ήπατος Carassius gibelio (Χ100). Β) Ιστοπαθολογική εικόνα ήπατος Carassius gibelio με απεικόνιση φλέβας (μεγάλο βέλος), περιφερειακών εσωτερικών αιμορραγιών (διπλό βέλος) και ύπαρξη κενοτοπίων (βέλος) (Χ100). Γ) Ιστοπαθολογική εικόνα ήπατος Carassius gibelio με θολερή εξοίδηση (βέλος), φυσιολογικού κυττάρου (διπλό βέλος) και πυρηνορρηξία (μεγάλο βέλος) (Χ400). Δ) Ιστοπαθολογική εικόνα ήπατος Carassius gibelio με απεικόνιση πυκνωτικών πυρήνων που καταδεικνύονται με βέλη (Χ400).

7 Εικόνα 3: Α) Φυσιολογική ιστοπαθολογική εικόνα εγκεφάλου Carassius gibelio (Χ100). Διακρίνονται κατά αύξουσα σειρά αρίθμησης η μοριώδης στιβάδα, η έξω κοκκώδης στιβάδα και η έξω στιβάδα πυραμοειδών κυττάρων. Β) Ιστοπαθολογική εικόνα εγκεφάλου Carassius gibelio σε μεγέθυνση (Χ400). Διακρίνονται κατά αύξουσα σειρά αρίθμησης η μοριώδης στιβάδα, η έξω κοκκώδης στιβάδα και η έξω στιβάδα πυραμοειδών κυττάρων. 4. Συμπεράσματα/Συζήτηση Η ύπαρξη των οκτώ κυανοβακτηριακών φυλότυπων και κυρίως των δύο που σχετίζονται με τα δυο είδη Anabaenopsis nadsonii και Planktothrix agardhii αναπόφευκτα οδήγησε στο ερώτημα εάν και πως αυτά μπορούν να επηρεάσουν τους υδρόβιους οργανισμούς της λίμνης. Οι ιχθύες μπορούν να εκτεθούν σε κυανοβακτηριακές τοξίνες με διάφορους τρόπους. Υπάρχουν έρευνες που εμπλέκουν τη θνησιμότητα ιχθύων σε λίμνες και ταμιευτήρες με την έκθεσή τους σε κυανοβακτηριακές ηπατοτοξίνες (Malbrouck and Kestemont 2006, Zurawell et al. 2005). Στην παρούσα εργασία ανιχνεύτηκαν αρκετά και σημαντικά σημάδια εκφύλισης του ήπατος. Υπήρξε απώλεια της αρχιτεκτονικής δομής του ηπατικού παρεγχύματος, θολερή εξοίδηση με ύπαρξη κενοτοπίων, πυρηνορρηξία, θραύση κυτταρικών μεμβρανών, ύπαρξη αιμορραγιών στο ηπατικό παρέγχυμα και ύπαρξη πυκνωτικών πυρήνων. Όλες οι παραπάνω εκφυλίσεις έχουν αναφερθεί ως σημάδια της ενδοπεριτονιακής επίδρασης των μικροκυστινών στο ήπαρ και σε άλλα όργανα σε διάφορα είδη ιχθύων (Carbis et al. 1996, Carbis et al. 1997, Rabergh et al. 1991, Kotak et al. 1996, Fournie and Courtney 2002). Είναι όμως δύσκολο να αποδοθούν αποκλειστικά και μόνο στην παρουσία μικροκυστινών, γιατί το συστημα της λίμνης Κάρλας βρίσκεται υπο-εξέλιξη με άγνωστες μέχρις στιγμής βιολογικές διεργασίες ( είδη και αφθονία πλαγκτονικών οργανισμών, μικροσκοπικών ευκαρυωτών, παρουσία βλαβερών ουσιών κ.λ.π) και επομένως η παρούσα εικόνα πιθανόν να είναι το αποτέλεσμα συνεργιστικής δράσης περισσοτέρων του ενός παραγόντων. Παρόλα αυτά οι παρούσες

8 ενδείξεις παραπέμπουν στην ισχυρή επίδραση των μικροκυστινών. Αν και στην παρούσα μελέτη δεν μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις των μικροκυστινών στους ιστούς των ζώων και στην υδάτινη στήλη, η ύπαρξη των Anabaenopsis nadsonii και Planktothrix agardhii υποδεικνύει ότι τέτοιου είδους ιστολογικές αλλοιώσεις θα μπορούσαν να οφείλονται στις μικροκυστίνες που παράγονται από τα είδη αυτά. Επιπλέον έρευνα σχετικά με τον προσδιορισμό των μικροκυστινών στο ήπαρ των ατόμων Carassius gibelio θα ήταν ιδιαίτερα χρήσιμη. Η ιστολογική μελέτη τομών του εγκεφάλου των ατόμων Carassius gibelio δεν κατέδειξε ιστοπαθολογικά αποτελέσματα. Οι μικροκυστίνες μπορούν να διαχέονται μέσα στο σώμα μέσω του αίματος. Ίσως η μη επίδρασή τους στον εγκέφαλο να οφείλεται στην ύπαρξη του αιματοεγκεφαλικού φραγμού Ο εν λόγω φραγμός οφείλεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα που επενδύουν τα συνεχή τριχοειδή, τα οποία διατρέχουν το κεντρικό νευρικό σύστημα. Τα κύτταρα αυτά σχηματίζουν αποφρακτικές συνδέσεις μεταξύ τους, επιβραδύνοντας την διέλευση ουσιών μεταξύ των κυττάρων. Κατ αυτ ον τον τρόπο μεγαλομοριακές ουσίες (όπως είναι και οι μικροκυστίνες), εγχεόμενες στο αγγειακό σύστημα δεν μπορούν να εισέλθουν στους μεσοκυττάριους χώρους του κεντρικού νευρικού συστήματος (Hawkins and Davis 2005). 5. Ευχαριστίες Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσουν την κ. Μήτσουρα Αμαλία και την κ. Παπαδημητρίου Δότη για τη συλλογή και νεκροτόμηση των ιχθύων. 5. Βιβλιογραφία Brettum, P. and Andersen, T., The use of phytoplankton as indicators of water quality. NIVA- Report SNO 197: Carbis, C. R., Rawlin, G. T., Grant, P., Mitchell, G. F., Anderson, J. W., and McCauley, I., A study of feral carp, Cyprinus carpio L., exposed to Microcystis aeruginosa at Lake Mokoan, Australia, and possible implications for fish health. J Fish Dis, 20: Carbis, C. R., Rawlin, G. T., Mitchell, G. F., Anderson, J. W., and McCauley, I., The histopathology of carp, Cyprinus carpio L., exposed to microcystins by gavage, immersion and intraperitoneal administration. J Fish Dis, 19: Carmichael, W.W., Azevedo, S.M.F.O., An, J.S., Human fatalities from cyanobacteria: chemical and biological evidence for cyanotoxins (Caruaru syndrome). Environ. Health Persp., 109: Chorus, I., Cyanotoxin occurrence in freshwaters-a summary of survey results from different countries. p In: Cyanotoxins: Occurrence, causes consequences, Chorus I, (Ed).. Berlin: Spinger. Codd G. A., Chorus I., Burch M., Design of monitoring programmes. p In: Toxic Cyanobacteria in water: a guide to their public health consequences, monitoring and management, Chorus I. & J. Bartram (Ed.). London, New York, E & FN Spon.

9 Codd, G.A., Cyanobacterial toxins: occurrence, properties and biological significance. Wat. Sci. Tech., 32, 4: Dietrich, D. and Hoeger, S., Guidance values for microcystins in water and cyanobacterial supplement products (bluegreen algal supplements): a reasonable or misguided approach? Toxicology and Applied Pharmacology, 203: Huisman, J., Matthijs, H.C.P., Visser, P.M., Harmful cyanobacteria. Springer, Berlin Fournie, J. W., and Courtney, L. A., Histopathological evidence of regeneration following hepatotoxic effects of the cyanotoxin MC-LR in the hardhead catfish and Gulf killifish. J Aquat Anim Health, 14: Gkelis, S., Rajaniemi, P., Vardaka, E., Moustaka-Gouni, M., Lanaras, T., Sivonen, K., Limnothrix redekei (Van Goor) Meffert (cyanobacteria) strains from Lake Kastoria form a separate phyligenetic group. Microb. Ecol., 49: Hawkins, B.T., Davis, T.P., The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev, 57: Kagalou, I., Papastergiadou, E. and Leonardos, I., Long term changes in the eutrophication process in a shallow Mediterranean lake ecosystem of W. Greece: Response after the reduction of external load. Journal of Environmental Management, 87: Kormas, K.A., Gkelis, S., Vardaka, E., Moustaka-Gouni, M., Morphologic and molecular analysis of bloom-forming Cyanobacteria in two eutrophic, shallow Mediterranean lakes. Limnologica, 41: Kotak, B. J., Semalulu, S., Friytz, D. L., Prepas, E. E., Hrudey, S. E., and Coppock, R. W., Hepatic and renal pathology of intraperitoneally administered microcystin-lr in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Toxicon, 34: Lanaras, T., Tsitsamis, S., Chlichlia, C., Cook, C.M., Toxic cyanobacteria in Greek freshwaters. J. Appl. Phycol., 1: Malbrouck, C., and Kestemont, P., Effects of Microcystins on fish. Environ Toxicol Chem, 25: Moustaka Gouni, M., Vardaka, E., Michaloudi, E., Kormas, K.A., Tryfon, E., Mihalatou, H., Gkelis, S., Lanaras, T., Plankton food web structure in a eutrophic polymictic lake with a history in toxic cyanobacterial blooms. Limnol. Oceanogr.,51: Naselli-Flores, L. and Barone, R.,2005. Water-level fluctuations in Mediterranean reservoirs: setting a dewatering threshold as a management tool to improve water quality. Hydrobiologia, 548: Naselli-Flores, L., Phytoplankton assemblages in twenty-one Sicilian reservoirs: relationships between species composition and environmental factors. Hydrobiologia, 424: Nϋbel, U., Garcia-Pichel, F. and Muyzer, G., PCR primers to amplify 16S rrna genes from Cyanobacteria. Applied and Environmental Microbiology, 63: Papadimitriou, T., Kagalou, I., Bacopoulos, V. and Leonardos, I. D., Accumulation of microcystins in water and fish tissues: An estimation of risks associated with microcystins in most of the Greek Lakes. Environmental Toxicology, 25: Rabergh, C. M. I., Bylund, G., and Eriksson, J. E., Histopathological effects of microcystin-lr, a cyclic peptide toxin from the cyanobacterium (blue-green algae) Microcystis aeruginosa, on common carp (Cyprinus carpio L.) Aquat Toxicol, 20: Reynolds, C. S., Huszar, V., Kruk, C., Naselli-Flores, L., Melo, S., Towards a functional classification of the freshwater phytoplankton. Journal of Plankton Research, 24:

10 Reynolds, C.S., Vegetation Processes in the Pelagic: A Model for Ecosystem Theory. Excellence in Ecology Books, Ecology Institute, Oldendorf/Luhe. Straškraba, M. and Tundisi, J. G., Reservoir ecosystem functioning: Theory and application. p In: Theoretical reservoir ecology and its applications, J. G. Tundisi and M. Straškraba (Eds.). The Netherlands: Backhuys. Tundisi, J. G., Matsumura-Tundisi, T., Rocha, O., Theoretical basis for reservoir management. p In: Theoretical reservoir ecology and its applications, J. G. Tundisi and M. Straškraba (Eds.).. The Netherlands: Backhuys. Vardaka, E.,Moustaka-Gouni, M., Lanaras, T., Temporal and spatial distribution of planktic cyanobacteria in Lake Kastoria, Greece, a shallow, urban lake. Nord J Bot, 20: Vareli, K., Briasoulis, E., Pilidis, G., and Sainis, I., Molecular confirmation of Planktothrix rubescens as the cause of intense, microcystin Synthesizing cyanobacterial bloom in Lake Ziros, Greece. Harmful Algae, 8(3), Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., and Prepas, B. R., Hepatotoxic cyanobacteria: A review of the biological importance of microcystins in freshwater environment. J Toxicol Environ Health, B 8:1 37.