EIΣAΓΩΓH ΣTHN ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ TEXNOΛOΓIA TOY ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA

Transcript

1 ΦAPMAKEYTIKH ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΔIAΛEΞEIΣ 1-3 EIΣAΓΩΓH ΣTHN ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ TEXNOΛOΓIA TOY ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA

2 Η ΠΡΟΟΔΟΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΔΩΣΕ ΩΘΗΣΗ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ H Μοριακή Βιολογία που έχει ως αντικείμενο την ανάλυση της δομής και της έκφρασης του γενετικού υλικού ανέπτυξε μιά σειρά εργαλεία απαραίτητα για την ανάπτυξη και της Φαρμακευτικης Βιοτεχνολογίας, όπως τις δυνατότητες: Nα «κόβουμε» το DNA σε μικρότερα τμήματα Να «αρχειοθετούμε» το DNA στο εργαστήριο Nα αναλύουμε την πρωτοταγή δομή του DNA Nα μετράμε την έκφραση των γονιδίων Nα εκφράζουμε τα γονίδια σε ετερόλογα συστήματα είτε για να μελετήσουμε τη λειτουργικότητά τους ή για να παράγουμε μεγάλες ποσότητες των προϊόντων τους Να ενισχύουμε γενετικό υλικό από απειροελάχιστες ποσότητες

3 Εισαγωγή DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα αλλάζει τον φαινότυπο τους Εφαρμογή στη Φαρμακευτική Βιοτεχνολογία; Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

4 Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση Φορείς Έκφρασης

5 DNA ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΙ ΕΙΤΕ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ Η ΑΠΟ ΙΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΕΙΜΕΝΟΥ ΠΡΟΣΟΧΗ: ΝΑ ΜΕΛΕΤΗΘΕΙ Το DNA είναι ένα ΤΕΡΑΣΤΙΟ μόριο (ακόμη και το DNA των σχετικά μικρών βακτηριακών γονιδιωμάτων είναι αρκετά μεγάλο) που είναι εξαιρετικά ευαίσθητο στη μηχανική καταπόνηση, δηλαδή μπορεί πολύ εύκολα να «σπάσει» σε μικρότερα θραύσματα κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών χειρισμών. ΕΠΟΜΕΝΩΣ ü Το «κόψιμο» του DNA σε μικρότερα θεραύσματα μπορεί να βελτιώσει τη μηχανική του σταθερότητα και να απλοποιήσει το χειρισμό του

6 ΠΩΣ MΠOPOYME NA «KOΨOYME» TO DNA ΣE MIKPOTEPA ΘPAYΣMATA; ME TH XPHΣH EIΔIKΩN ENZYMΩN YΠAPXOYN ΠPOΫΠOΘEΣEIΣ; NAI, TA ENZYMA AYTA ΘA ΠPEΠEI NA ΔIAΣΠOYN TO DNA ΠANTA ΣTIΣ IΔIEΣ AΛΛHΛOYXIEΣ OI OΠOIEΣ EINAI EK TΩN ΠPOTEPΩN ΓNΩΣTEΣ

7 ENΔONOYKΛEAΣEΣ ΠEPIOPIΣMOY Oι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ένζυμα τα οποία αναγνωρίζουν συγκεκριμένες παλινδρομικές αλληλουχίες του DNA και τις διασπούν πάντα στο ίδιο σημείο. Μπορύν να θεωρηθούν σαν «μοριακά ψαλίδια» που κόβουν το DNA Παραδείγματα στις επόμενες διαφάνειες

8 ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΟΙ ENΔONOYKΛEAΣEΣ ΠEPIOPIΣMOY; Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού είναι ενδονουκλεάσες οι οποίες αναγνωρίζουν συγκεκριµένες παλινδροµικές αλληλουχίες στο DNA, το οποίο διασπούν πάντα στις ίδιες προκαθορισµένες θεσεις. Θα δείξουμε μερικά παραδείγματα στις επόμενες δύο διαφάνειες

9 ΤΕΣΣΕΡΙΣ ΔΗΜΟΦΙΛΕΙΣ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

10 ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΩΝ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ θέση διάσπασης Σακχαροφωσφορικός σκελετός HindIII EcoRI AluI NotI PstI

11 ΑΠΟ ΠΟΥ ΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙ ΟΙ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ; Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού αποµονώθηκαν αρχικά από βακτήρια. Είναι συστατικά ενός µηχανισµού άµυνας των βακτηρίων ενάντια σε εισβολή ξένου γενετικού υλικού, π.χ. από µόλυνση µε κάποιον βακτηριοφάγο. Γιατί οι ενδονουκλεάσες περιορισµού δεν διασπούν και το DNA του βακτηρίου που τα παράγει;

12 ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗ ΧΗΜΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΥ DNA ΤΟ ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΕΙ ΑΠΟ ΠΕΨΗ ΑΠΟ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI EcoRI μεθυλάση Μη μεθυλιωμένο DNA «κολλώδη» άκρα Διάσπαση του DNA Μη μεθυλιωμένο DNA Μεθυλιωμένο DNA Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI Η EcoRI δε μπορεί να διασπάσει το μεθυλιωμένο DNA

13 ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΚΟΠΗ ΤΙ; Πως αναλύεται το DNA µετά την πέψη του µε ενδονουκλεάσες περιορισµού;

14 HΛEKTPOΦOPHTIKH ANAΛYΣH TΩN ΘPAYΣMATΩN TOY DNA

15 APXEΣ HΛEKTPOΦOPHTIKHΣ ANAΛYΣHΣ

16 KΛΩNOΠOIHΣH H «αρχειοθέτηση» του DNA στο εργαστήριο

17 Φορείς κλωνοποίησης - Tα πλασµίδια

18 H Διαδικασία της Kλωνοποίησης

19 Πολλαπλασιασµός των Aντιγράφων ενός Γονιδίου µε Kλωνοποίηση

20 Aπαραίτητες Iδιότητες ενός Πλασµιδιακού Φορέα Kλωνοποίησης 1. Aλληλουχίες έναρξης αντιγραφής (ORI) 2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή (π.χ.aντίσταση σε αντιβιοτικό) 3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές ενδονουκλεάσες περιορισµού (polylinker) 4. ( Έναν υποκινητή που να επιτρέπει ρυθµιζόµενη έκφραση)

21 Δηµιουργία µιας Γενωµικής Bιβλιοθήκης

22 Γενωµικές & cdna Bιβλιοθήκες

23 Διαδικασία Παρασκευής cdna

24 Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης

25 Bιβλιοθήκες DNA µπορούν να Kατασκευασθούν και σε Φάγους

26 Τα βασικά βήµατα της κλωνοποίησης DNA σε πλασµίδιο

27 Συρραφή ΘραυσµάτωνDNA µε Διαδοχική Kλωνοποίηση

28 Προσανατολισµένη κλωνοποίηση του δίκλωνου cdna σε πλασµιδιακό φορέα

29 Διάκριση µπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισµό ανασυνδυασµένων φορέων

30 ΠΩΣ MΠOPOYME NA TAYTOΠOIHΣOYME AΠOIKIEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN ANAΣYNΔYAΣMENOYΣ ΦOPEIΣ KΛΩNOΠOIHΣHΣ AΠO AYTEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN «AΔEIOYΣ» ΦOPEIΣ;

31 Kοσµίδια Τα κοσμίδια είναι πλασμιδιακοί φορείς κλωνοποίησης που περιέχουν μία ή δύο θέσεις cos. (Η θέση cos είναι μία αλληλουχία περίπου 200bp που προέρχεται από τον φάγο λ και η οποία είναι απαραίτητη για το «πακετάρισμα» του DNA σε σωματίδια φάγου). Πως κλωνοποιούμε το DNA σε ένα κοσμίδιο; 1. Χρησιμοποιούμε τη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης (polylinker) για να ενθέσουμε θραύσματα DNA που έχουν δημιουργηθεί με πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού. 2. Το DNA πακετάρεται σε φάγους, ακριβώς όπως και το DNA του ίδιου του φάγου. 3. Τα κοσμίδια πολλαπλασιάζονται μέσα στα βακτηριακά κύτταρα όπως και τα πλασμίδια (δηλ. φέρουν γονίδια που προσδίδουν στα κύτταρα αντίσταση σε αντιβιοτικό). 4. Τα κοσμίδια απομονώνονται ακριβώς όπως και τα πλασμίδια. Το πλεονέκτημα τους είναι ότι μπορούν να «πακετάρουν» μέσα στην «κεφαλή» του φάγου μεγαλύτερα σε μέγεθος θραύσματα DNA (40-55 kb of DNA, δηλ. Σε κοσμίδια μεγέθους ~5 kb μπορούμε να εισάγουμε ενθέματα kb)).

32 Kλωνοποίηση σε κοσµίδια - Παράδειγµα Το κοσμίδιο «κόβεται» με την ενδονουκλεάση BglII σε θέση κοντά στη θέση cos. Το γενωμικό DNA«κόβεται» με την ενδονουκλεάση Sau3A (μερική υδρόλυση), που δημιουργεί συμβατά «κολλώδη» άκρα με την BglII. Τα θραύσματα τα κατεργαζόμαστε με αλκαλική φωσφατάση (ΓΙΑΤΙ;) Το DNA δότης συνδέεται με το DNA δέκτη (κοσμίδιο) με την DNA λιγάση δημιουργώντας εν σειρά συνδέσεις. Το DNA καθαρίζεται με βάση το μέγεθος. Το DNA «πακετάρεται» σε φάγους.

33 Το DNA των κοσµιδίων «πακετάρεται» σε γραµµική µορφή

34 Κοσµίδια - ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ

35 YBPIΔIΣMOΣ NOYKΛEΪNIKΩN OΞEΩN

36 Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς Kλώνους µε Yβριδισµό -1

37 Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς Kλώνους µε Yβριδισµό - 2

38 ΠΩΣ MΠOPOYME NA EΠITYXOYME THN ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣH ΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN DNA (πριν την κλωνοποίηση ή και µετά);

39 Στύπωµα κατά Southern: ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και υβριδοποίηση - 1

40 Στύπωµα κατά Southern: ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και υβριδοποίηση - 2

41 ANIXNEYΣH THΣ METAΛΛAΞHΣ ΠOY ΠPOKAΛEI ΔPEΠANOKYTTAPIKH ANAIMIA ΜΕ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟ ΝΟΥΚΛΕΪΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ

42 Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων

43 Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων

44 TI KANOYME OTAN TO ΔIAΘEΣIMO ΓENETIKO YΛIKO ΔEN EINAI ΔIAΘEΣIMO ΣE ΠOΣOTHTEΣ IKANEΣ ΠPOΣ ANAΛYΣH; ΦTIAXNOYME ΠEPIΣΣOTEPO ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR)

45 PCR Η ενίσχυση του DNA in vitro

46 Ο κύκλος της τεχνικής PCR

47 Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 1

48 Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 2

49 Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 3

50 Μοριακή διαγνωστική µε PCR στην ιατροδικαστική

51 Aνίχνευση HIV µε RT-PCR

52 Xρήση RT-PCR µε πολλαπλούς εκκινητές στη µοριακή διαγνωστική µιάς ιογενούς κτηνιατρικής νόσου

53 H PCR στην κλωνοποιηση DNA και RNA

54 Χρήση της PCR πραγµατικού χρόνου για τη µέτρηση της ποσότητας των µορίων-στόχων που περιέχει ένα δείγµα

55 Μοριακοί φάροι για την PCR πραγµατικού χρόνου

56 Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση Φορείς Έκφρασης

57 Kατευθυνόµενη Mεταλλαξιγένεση

58 Eισαγωγή Kατευθυνόµενων Tροποποιήσεων στο Γενετικό Yλικό

59 Kατασκευή Διαγονιδιακών Ποντικών