Το πλεονέκτημα της χρήσης του DNA των φάγων λ, ως φορέα κλωνοποίησης είναι ότι μπορούμε να ενσωματώσουμε σε αυτόν μεγαλύτερα κομμάτια DNA.

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Το πλεονέκτημα της χρήσης του DNA των φάγων λ, ως φορέα κλωνοποίησης είναι ότι μπορούμε να ενσωματώσουμε σε αυτόν μεγαλύτερα κομμάτια DNA."

Κλυταιμνήστρα Πολίτης
5 χρόνια πριν
Προβολές:

1 ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2 ο,4 ο ΚΕΦ. ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Θέμα Α: Α1.β, Α2.δ, Α3.β, Α4.γ, Α5.γ Θέμα Β: Β1. Οι υποκινητές και οι μεταγραφικοί παράγοντες αποτελούν τα ρυθμιστικά στοιχεία της μεταγραφής του DNA και επιτρέπουν στην RNA πολυμεράση να αρχίσει σωστά τη μεταγραφή. Ένας αριθμός μηχανισμών ελέγχουν ποια γονίδια θα μεταγραφούν ή/και με ποια ταχύτητα θα γίνει η μεταγραφή. To DNA των ευκαρυωτικών κυττάρων δεν οργανώνεται σε οπερόνια αλλά κάθε γονίδιο έχει το δικό του υποκινητή και μεταγράφεται αυτόνομα. Η RNA πολυμεράση λειτουργεί (όπως και στους προκαρυωτικούς οργανισμούς) με τη βοήθεια πρωτεϊνών, που ονομάζονται μεταγραφικοί παράγοντες. Μόνο που στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς οι μεταγραφικοί παράγοντες παρουσιάζουν τεράστια ποικιλία. Κάθε κυτταρικός τύπος περιέχει διαφορετικά είδη μεταγραφικών παραγόντων. Διαφορετικός συνδυασμός μεταγραφικών παραγόντων ρυθμίζει τη μεταγραφή κάθε γονιδίου. Μόνο όταν ο σωστός συνδυασμός των μεταγραφικών παραγόντων προσδεθεί στον υποκινητή ενός γονιδίου, αρχίζει η RNA πολυμεράση τη μεταγραφή ενός γονιδίου. Β2. Ο φορέας κλωνοποίησης είναι ένα μόριο DNA, π.χ. πλασμίδιο ή DNA φάγων, το οποίο μπορεί να αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα σε ένα κύτταρο-ξενιστή όπως ένα βακτήριο. Τα βασικά χαρακτηριστικά που πρέπει να έχει ένας φορέας κλωνοποίησης είναι: Να είναι κυκλικό δίκλωνο μόριο DNA. Να μπορεί να συνδεθεί με ξένο DNA. Να αντιγράφεται ανεξάρτητα από το DNA του κυττάρου ξενιστή (περιέχει Θ.Ε.Α.). Να μπορεί να δίνει τη δυνατότητα διαχωρισμού των μετασχηματισμένων κυττάρων ξενιστών από τα μη μετασχηματισμένα (π.χ. γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό). Να περιέχει μια φορά την ειδική αλληλουχία την οποία αναγνωρίζει η περιοριστική ενδονουκλεάση που θα χρησιμοποιηθεί. Το πλεονέκτημα της χρήσης του DNA των φάγων λ, ως φορέα κλωνοποίησης είναι ότι μπορούμε να ενσωματώσουμε σε αυτόν μεγαλύτερα κομμάτια DNA. 1

2 Β3. α. Παρατηρούμε ότι έχουμε ένα mrna το οποίο ταυτόχρονα μεταφράζεται από πολλά ριβοσώματα, πρόκειται δηλαδή για ένα πολύσωμα. Παρατηρούμε επίσης πως ο αριθμός των αμινοξέων που έχουν προστεθεί σε κάθε ριβόσωμα αυξάνει από αριστερά προς τα δεξιά και συμπεραίνουμε πως η μετάφραση ακολουθεί την ίδια κατεύθυνση. Γνωρίζουμε πως το ριβόσωμα μεταφράζει το mrna από το 5 άκρο προς το 3 επομένως τα το άκρο Κ αντιστοιχεί στο 5 άκρο του mrna και το Ζ στο 3 άκρο. β. Παρατηρούμε ότι ενώ αυξάνεται ο αριθμός των αμινοξέων που έχουν προστεθεί κατά την μετάφραση από το 1 ο αριστερά ριβόσωμα μέχρι το 3 ο, στο 4 ο ο αριθμός είναι μικρότερος, γεγονός που υποδηλώνει πως γίνεται σύνθεση νέου πολυπεπτιδίου. Το ίδιο συμβαίνει και μεταξύ 6 ου και 7 ου ριβοσώματος. Έχουμε δηλαδή ένα mrna από το οποίο παράγονται 3 πολυπεπτίδια και αυτό συμβαίνει μόνο όταν ένα τέτοιο mrna προκύπτει από μεταγραφή ενός οπερονίου και οπερόνια έχουμε μόνο στους προκαρυωτικούς οργανισμούς. Θέμα Γ: Γ1. Γνωρίζουμε ότι η κωδική αλυσίδα και το mrna που παράγεται κατά την μεταγραφής της μη κωδικής αλυσίδας είναι συμπληρωματικά της τελευταίας, οπότε έχουν τον ίδιο προσανατολισμός και παρόμοια αλληλουχία βάσεων, με μόνη διαφορά ότι όπου η κωδική αλυσίδα έχει Τ το mrna έχει U. Ο όρος κωδικόνιο αφορά επίσης και την κωδική αλυσίδα του γονιδίου. Βάσει αυτών παρατηρούμε ότι υπάρχει κωδικόνιο έναρξης 5 -ATG-3 το οποίο ακολουθείται από 1 κωδικόνιο και 254 βάσεις οι οποίες αντιστοιχούν σε 254:2=84 κωδικόνια και περισσεύουν 2 βάσεις οι οποίες θα αποτελούν τις 2 πρώτες βάσεις του επόμενου κωδικονίου (ο κώδικας είναι συνεχής μη επικαλυπτόμενος). 5 GGGGAACT-ATG-ATC-.(84 κωδικ.)..χχa-cac-gat-cga-taa-ccaaaaa.3 Επομένως παρατηρούμε ότι υπάρχουν συνολικά 90 κωδικόνια που κωδικοποιούν αμινοξέα και 1 μήνυμα λήξης. Άρα η πρωτεΐνη που παράγεται θα αποτελείται από 90 αμινοξέα. Γ2. Εφόσον η αλυσίδα έχει αριστερά το ΟΗ θα έχει προσανατολισμό από δεξιά προς αριστερά 5 3. Οι δύο αλυσίδες επομένως του τμήματος θα είναι: 3 -ACGTATTA CGGGCAGCTAGCTAATCGGGATTACCGATTCAT-5 5 -TGCATAATGCCCGTCGATCGATTAGCCCTAATGGCTAAGTA-3 α. Τα πρωταρχικά τμήματα θα είναι συμπληρωματικά στα 3 άκρα των αλυσίδων ώστε να μπορεί η DNA πολυμεράση που κάνει την αντιγραφή να τα επιμηκύνει μέχρι τέλους, αφού γνωρίζουμε ότι αυτή αντιγράφει με προσανατολισμό 5 3. Τμήμα για την πάνω αλυσίδα: 5 -UGCAUA-3 Τμήμα για την κάτω αλυσίδα: 3 - AUUCAU-5 2

3 β. Οι αρχικές αλυσίδες παραμένουν χωρίς ραδιενεργό φώσφορο ενώ οι νέες δημιουργούνται από ραδιενεργά δεσοξυριβονουκλεοτίδια. Επομένως μόνον οι 2 αρχικές αλυσίδες δεν θα έχουν ραδιενέργεια. Γ3. α. Στο Α μόριο το νουκλεοτίδιο που φέρει την Τ συνδέεται με το νουκλεοτίδιο που φέρει την G με 3-5 φωσφοδιεστερικό δεσμό άρα ο προσανατολισμός της εξωτερικής αλυσίδας θα είναι 5 3 δεξιόστροφα και της εσωτερικής θα είναι αριστερόστροφα για να είναι αντιπαράλληλη της εξωτερικής. Το ανάποδο συμβαίνει στο μόριο Β, δηλαδή αριστερόστροφο προσανατολισμό 5 3 η εξωτερική αλυσίδα και δεξιόστροφη η εσωτερική. Σύνθεση DNA θα γίνει και στα δύο μόρια, αφού και στα δύο συνυπάρχουν πρότυπος κλώνος (ο εξωτερικός δακτύλιος) και διαθέσιμο 3 ο άκρο στο νεοσχηματιζόμενο εσωτερικό. β. Εξαιτίας του διαφορετικού προσανατολισμού του εξωτερικού κλώνου των δύο μορίων ( ο εξωτερικός κλώνος του μορίου Α έχει δεξιόστροφο προσανατολισμό, ενώ του μορίου Β, αριστερόστροφο), οι προσανατολισμοί των συμπληρωματικών τόξων καθενός θα είναι αντιπαράλληλοι των εξωτερικών κλώνων. Δηλαδή, το εσωτερικό τόξο του μορίου Α θα επιμηκύνεται από την G (3' άκρο), ενώ το εσωτερικό τόξο του μορίου Β θα επιμηκύνεται από την Τ (3' άκρο). Επομένως, στο μόριο Α θα ενταχθεί το τμήμα: 5' CAG 3' και στο Β μόριο θα ενταχθεί το τμήμα 5' CGT 3'. Θέμα Δ: Δ1. α. Γνωρίζουμε ότι η EcoRI όπου συναντά την αλληλουχία 5'-G Α Α Τ Τ C-3' 3'-C Τ Τ A A G-5' στο γονιδίωμα, κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ του G και του Α (με κατεύθυνση 5' 3') αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα. Τα άκρα αυτά μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με τις συμπληρωματικές βάσεις άλλων κομματιών DNA που έχουν κοπεί με το ίδιο ένζυμο. Παρατηρούμε ότι στο δεδομένο τμήμα DNA η παραπάνω αλληλουχία υπάρχει 2 φορές οπότε μετά τη δράση της θα προκύψουν τα τμήματα: 3

4 5 - GCGTTAG AATTC-ATG-GGG-CAC-GCG-AGA-CCT-CGT-TAG-AAG AATTC TGAGAAT CGCAATCTTAA G TAC CCC GTG CGC TCT GGA GCA ATC TTCTTAA GACTC TTA -5 Γνωρίζουμε ότι ο όρος κωδικόνιο δεν αφορά μόνο το mrna αλλά και το γονίδιο από το οποίο παράγεται. Έτσι, για παράδειγμα, το κωδικόνιο έναρξης AUG αντιστοιχεί στο κωδικόνιο έναρξης της κωδικής αλυσίδας του γονιδίου ATG κ.ο.κ. Το τμήμα ενός γονιδίου, και του mrna του που κωδικοποιεί μια πολυπεπτιδική αλυσίδα, αρχίζει με το κωδικόνιο έναρξης και τελειώνει με το κωδικόνιο λήξης. Παρατηρούμε ότι στην αλυσίδα 1 από αριστερά προς τα δεξιά υπάρχει μήνυμα έναρξης 5 -ΑTG-3 από το οποίο με βήμα τριπλέτας συνεχώς μη επικαλυπτόμενα καταλήγουμε σε μήνυμα λήξης 5 -TAG-3. Στην αλυσίδα 2 δεν παρατηρούμε κάτι ανάλογο, οπότε συμπεραίνουμε ότι η αλυσίδα 1 είναι η κωδική και η αλυσίδα 2 η μεταγραφόμενη. β. Το ολιγοπεπτίδιο θα αποτελείται από 7 αμινοξέα γ. Ο φορέας κλωνοποίησης θα φέρει τα ίδια συμπληρωματικά μονόκλωνα άκρα με το δεδομένο τμήμα και για την σύνδεσή του με το αυτό θα αποκατασταθούν 4 φωσφοδιεστερικοί δεσμοί και 16 δεσμοί υδρογόνου δ. Κατά την έναρξη της μετάφρασης το mrna προσδένεται, μέσω μιας αλληλουχίας που υπάρχει στην 5' αμετάφραστη περιοχή του, με το ριβοσωμικό RNA της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος, σύμφωνα με τους κανόνες της συμπληρωματικότητας των βάσεων. Το πρώτο κωδικόνιο του mrna είναι πάντοτε 5 AUG 3 το οποίο βρίσκεται μετά την παραπάνω αλληλουχία της 5 αμετάφραστης περιοχής και εισέρχεται στην πρώτη θέση σύνδεσης του ριβοσώματος. Σ' αυτό προσδένεται το trna που φέρει το αμινοξύ μεθειονίνη και έτσι δημιουργείται το σύμπλοκο έναρξης της μετάφρασης. Δ2. Πλασμίδια που χρησιμοποιούνται ως φορείς κλωνοποίησης πρέπει να διαθέτουν ένα τουλάχιστον γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό, προϋπόθεση που το συγκεκριμένο πλασμίδιο πληροί, και επιπλέον να τέμνονται μία φορά από την περιοριστική ενδονουκλεάση που θα χρησιμοποιηθεί. Η περιοριστική ενδονουκλεάση δεν πρέπει επίσης να τέμνει το πλασμίδιο στην Θ.Ε.Α. Επιπλέον, η κλωνοποίηση, στην περίπτωση που είναι επιθυμητή η έκφραση ενός γονιδίου σε βακτηριακό κύτταρο και η σύνθεση της αντίστοιχης πρωτεΐνης (θεωρώντας ότι οι υποκινητές των βακτηριακών γονιδίων είναι ενεργοί σε κάθε περίπτωση), θα πρέπει να γίνει κατά τέτοιο τρόπο ώστε να περιλαμβάνεται ο υποκινητής του γονιδίου. Συνεπώς: α) Η περιοριστική ενδονουκλεάση 2 απορρίπτεται, διότι τέμνει το πλασμίδιο σε δύο σημεία, το ένα εκ των οποίων είναι η θέση έναρξης αντιγραφής. Αξίζει να σημειωθεί ότι και μόνο στη θέση έναρξης να το έτεμνε θα αποκλειόταν επίσης, διότι θα του στερούσε τη θεμελιώδη ιδιότητα των φορέων κλωνοποίησης να αντιγράφονται ανεξάρτητα μέσα στα κύτταρα-ξενιστές. Η 3 τέμνει το γονίδιο από την αρχή και μετά το πέρας του και το πλασμίδιο σε μια θέση, οπότε δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί προς αυτό το σκοπό. Επομένως για την παραγωγή της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί το γονίδιο είναι κατάλληλη η 1, που δεν καταστρέφει την αλληλουχία του υποκινητή. 4

5 β) Τα μετασχηματισμένα βακτήρια θα διαχωριστούν από τα μη μετασχηματισμένα με βάση την ανθεκτικότητά τους σε κάποιο αντιβιοτικό. Τα μη μετασχηματισμένα εφόσον δεν έχουν πλασμίδια θα είναι ευαίσθητα ενώ τα μετασχηματισμένα θα είναι ανθεκτικά. Είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί οποιοδήποτε από τα δύο αντιβιοτικά, καθώς η περιοριστική ενδονουκλεάση 1 τέμνει το πλασμίδιο εκτός των γονιδίων που προκαλούν ανθεκτικότητα στα βακτήρια. 5

Σχετικά έγγραφα

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2.

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2. ΘΕΜΑ Α Α1. γ (το πριμόσωμα) Α2. γ (οι υποκινητές και οι μεταγραφικοί παράγοντες κάθε γονιδίου) Α3. α (μεταφέρει ένα συγκεκριμένο αμινοξύ στο ριβόσωμα) Α4. β (αποδιάταξη των δύο συμπληρωματικών αλυσίδων)