ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ. ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑΣ ιευθυντής: Καθηγητής Σωκράτης Τζάρτος

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑΣ ιευθυντής: Καθηγητής Σωκράτης Τζάρτος ΤΣΙΑΜΑΛΟΣ Γ. ΠΑΝΤΕΛΕΗΜΩΝ ΙΑΤΡΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΠΑΤΡΑ 2009 ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑ ΜΕ ANTI-MuSK ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ: ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ

2 2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Πουλάς Κωνσταντίνος: Επιβλέπων Καθηγητής Τζάρτος Σωκράτης: Μέλος Επιτροπής Σιβολαπένκο Γρηγόριος: Μέλος Επιτροπής ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

3 3 I ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7 I.I Νευροµυϊκή Σύναψη 8 I.II Νευροµυϊκή Μεταβίβαση 11 Ι.ΙΙΙ Νικοτινικός Υποδοχέας της Ακετυλοχολίνης 12 Ι.IV Muscle Specific Kinase, MuSK 19 I.V Ανοσολογικό Σύστηµα 29 I.VI Παθοφυσιολογία Βαριάς Μυασθένειας (Myasthenia Gravis, 47 MG) I.VII Επιδηµιολογία MG 50 I.VIII Κλινική Εικόνα MG 51 I.IX ιάγνωση MG 53 Ι.X Θεραπεία MG 54 Ι.XI Οροαρνητική Βαριά Μυασθένεια (Seronegative Myasthenia 56 Gravis, SNMG) Ι.ΧΙΙ Γενικά για τη σύνθεση πεπτιδίων 59 ΙΙ ΣΤΟΧΟΣ 65 ΙΙΙ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 68 ΙΙΙ. Ι ΥΛΙΚΑ 68 ΙΙΙ. Ι Α Εργαστηριακός Εξοπλισµός 69 ΙΙΙ. Ι Β Αντιδραστήρια 70 ΙΙΙ. Ι Γ Αντισώµατα 70 ΙΙΙ. Ι Βιολογικοί παράγοντες 71 ΙΙΙ. Ι Ε ιαλύµατα 71 ΙΙΙ. ΙΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 72 ΙΙΙ. ΙΙ ΣΤ Καλλιέργεια ΤΕ671 κυττάρων 72 ΙΙΙ. ΙΙ Ζ Απόψυξη κυττάρων από το υγρό άζωτο 73 ΙΙΙ. ΙΙ Η Ψύξη κυττάρων για αποθήκευση στο υγρό άζωτο 73 ΙΙΙ. ΙΙ Θ Προσδιορισµός κυτταρικής βιωσιµότητας 74 ΙΙΙ. ΙΙ Ι Επίδραση ορών στην κυτταρική σειρά ΤΕ ΙΙΙ. ΙΙ ΙΑ Ανοσοπροσδιορισµός για έλεγχο ύπαρξης αντισωµάτων έναντι 76 του ανθρώπινου AChR ΙΙΙ. ΙΙ IΒ Σύνθεση πεπτιδίων σε στερεή φάση 77 ΙΙΙ. ΙΙ ΙΓ Καθαρισµός πεπτιδίων 78

4 4 ΙΙΙ. ΙΙ Ι Λουτρό Υπερήχων 78 ΙΙΙ. ΙΙ ΙΕ ELISA 79 ΙΙΙ. ΙΙ ΙΣΤ Προσδιορισµός των τάξεων και υποτάξεων των MuSK 81 αντισωµάτων ΙΙΙ. ΙΙ ΙΖ Ακινητοποίηση των IgG4 σε ενεργοποιηµένα µε CNBr 82 σφαιρίδια σεφαρόζης ΙΙΙ. ΙΙ ΙΗ Ανοσοπροσρρόφηση IgG4 αντισωµάτων έναντι της MuSK 82 ΙΙΙ. ΙΙ ΙΘ Συλλογή επιδηµιολογικών δεδοµένων 83 IV ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 84 IV.I Επίδραση MuSK-MG ορών στην κυτταρική σειρά ΤΕ IV.II Χαρτογράφηση των επιτόπων της MuSK 87 IV.III Προσδιορισµός ανοσολογικής εικόνας της MuSK-MG 97 IV.IV Επιδηµιολογική εικόνα MuSK-MG στην Ελλάδα 105 V ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 109 VI ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ 116 ΠΡΟΛΟΓΟΣ

5 5 Όσα βουνά κι αν ανεβείτε, απ τις κορφές τους θ αγναντεύετε άλλες κορφές ψηλότερες, µιαν άλλη πλάση ξελογιάστρα και στην κορφή σα φτάσετε την κατάψηλη, πάλι θα καταλάβετε πως βρίσκεστε σαν πρώτα κάτω απ όλα τ άστρα. ( ωδεκάλογος του Γύφτου, Κ. Παλαµάς) Κάθε ταξίδι, όσο συναρπαστικό και ευχάριστο και αν είναι, όσες εκπλήξεις και νέες εµπειρίες και αν επιφυλάσσει στους ταξιδιώτες, δεν παύει να απαιτεί προσπάθεια, κόπο, αφοσίωση, πίστη σε έναν τελικό σκοπό και διάθεση χρόνου από την πλευρά των ταξιδιωτών. Το ίδιο ισχύει και για το ταξίδι προς τη γνώση και την έρευνα. Μοναδική διαφορά αποτελεί το γεγονός ότι το συγκεκριµένο ταξίδι είναι αέναο. Όσες επιστηµονικές κορφές και να κατακτήσει κάποιος στο χώρο της επιστήµης, ο γαλαξίας των γνώσεων θα µείνει ένα απόρθητο φρούριο. Στο ταξίδι αυτό, µε προορισµό τις σπουδές του Μεταπτυχιακού και τη ιπλωµατική µου, είχα την τύχη να γνωρίσω αξιόλογους καθοδηγητές και συνταξιδιώτες, οι οποίοι συνέβαλαν καθοριστικά µε την ευγενική παρακολούθηση και τις χρησιµότατες συµβουλές τους στην πραγµατοποίηση της συγκεκριµένης εργασίας. Πρώτα από όλα, θέλω να ευχαριστήσω θερµότατα τον καθηγητή Σωκράτη Τζάρτο και το λέκτορα Κων/νο Πουλά, για την ευκαιρία που µου έδωσαν να εργαστώ κοντά τους και να µυηθώ στα βασικά µυστικά του υπέροχου κόσµου της έρευνας, καθώς και για τη συνεχή υποστήριξη και καθοδήγησή τους. Η συµβολή τους στο να αγαπήσω την Ανοσολογία ήταν τεράστια. Ένα µεγάλο Ευχαριστώ δεν είναι αρκετό για την κα Ελισάβετ Τζάρτου, καθώς η συµβολή της ήταν καθοριστική στην εργασία αυτή, αφιερώνοντας τον πολύτιµο χρόνο της σε µέρος των πειραµάτων και η συνεργασία µας υπήρξε άριστη. Βαθύτατες ευχαριστίες οφείλω στην κα Άννα Κόκλα, στο Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, για την ανεκτίµητη βοήθειά της σε ένα µεγάλο τµήµα του πειραµατικού έργου, καθώς και για την υποµονή της, στη διάρκεια της συνεργασίας µας.

6 6 Φυσικά, η εκπόνηση της παρούσας διπλωµατικής εργασίας δε θα καθίστατο εφικτή, χωρίς τη συνδροµή του µεταδιδακτορικού ερευνητή, Γιώργου Λαγουµιντζή και του µεταπτυχιακού φοιτητή, Γρηγόρη Κόρδα. Η συνεργασία µας υπήρξε εξαιρετική, η συµπαράστασή τους συνεχής και το σηµαντικότερο, απέκτησα δύο καινούριους και πολύ καλούς φίλους. Τους ευχαριστώ για τις κοινές ώρες έρευνας και οµαδικής οµοψυχίας και τις στιγµές χαλάρωσης εντός και εκτός του εργαστηρίου. Τους εύχοµαι καλή συνέχεια στη σταδιοδροµία τους. Ευχαριστώ τους γονείς µου, τον πατέρα µου, Γιώργο και τη µητέρα µου, Μαρία, που ό,τι και αν αποφασίσω, µε στηρίζουν µε την αγάπη τους και την πίστη τους σε εµένα. Την αδελφή µου, Εύα, που πάντα περιµένει από εµένα το καλύτερο. Την παρούσα διπλωµατική διατριβή την αφιερώνω στους γονείς µου για ό,τι έχουν προσφέρει, υποµείνει και στερηθεί, στη διάρκεια των προπτυχιακών και µεταπτυχιακών σπουδών µου.

7 7 Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

8 8 Ι.Ι Νευροµυϊκή Σύναψη Ο σκελετικός µυς των σπονδυλωτών αποτελείται από πολυπύρηνα κύτταρα που σχηµατίζουν ίνες, οι οποίες νευρώνονται από κινητικούς νευρώνες. Το κυτταρικό σώµα κάθε κινητικού νευρώνα διαθέτει έναν επιµήκη άξονα, που εισέρχεται στο µυ και διακλαδίζεται νευρώνοντας πολλές ξεχωριστές µυϊκές ίνες. Καθώς κάθε αξονική διακλάδωση προσεγγίζει την ίνα-στόχο της, χάνει το µυελινικό της περίβληµα και είτε διακλαδίζεται περαιτέρω είτε λαµβάνει χώρα τελική διακλάδωση µέχρι το νεύρο να φτάσει στο µυ σχηµατίζοντας τη νευροµυϊκή σύναψη. Η νευροµυϊκή σύναψη είναι µια εξειδικευµένη σύναψη σχεδιασµένη να µεταδίδει ηλεκτρικές ώσεις από τη νευρική απόληξη στο σκελετικό µυ µέσω του χηµικού διαβιβαστή ακετυλοχολίνη (ACh) και διαθέτει 3 κύρια δοµικά στοιχεία: α) την προσυναπτική περιοχή, που περιλαµβάνει τη νευρική απόληξη και η οποία καλύπτεται από ένα τελικό κύτταρο Schwann, β) τη συναπτική σχισµή και γ) τη µετασυναπτική επιφάνεια (Hughes et al, 2006) (εικ.1). Το χαρακτηριστικό στοιχείο της νευρικής απόληξης είναι τα συναπτικά κυστίδια. Όταν ένα δυναµικό ενέργειας φτάσει στη νευρική απόληξη, οι δίαυλοι ασβεστίου ενεργοποιούνται, ασβέστιο εισέρχεται στην προσυναπτική απόληξη, µε αποτέλεσµα η τοπική συγκέντρωση ασβεστίου να αυξάνεται σηµαντικά και να προκαλεί τη σύντηξη της µεµβράνης του συναπτικού κυστιδίου µε τη µεµβράνη της νευρικής απόληξης (Edwards, 2007). Στη νευροµυϊκή σύναψη, 3-5 κύτταρα Schwann σχηµατίζουν ένα κάλυµµα σε στενή παράταξη µε τη νευρική απόληξη. Τα κύτταρα Schwann θεωρούνται κρίσιµα στο σχηµατισµό και τη λειτουργία της νευροµυϊκής σύναψης, καθώς τροποποιούν τη συναπτική µεταβίβαση και επηρεάζουν την αναγέννηση στο νευρικό ιστό (Auld et al, 2003).

9 9 Νευρικό κύτταρο Νευροµυϊκή σύναψη Μυϊκές ίνες Τελική κινητική πλάκα Προσυναπτική µεµβράνη Συναπτική σχισµή ACh Μετασυναπτική µεµβράνη AChR Συναπτική αύλακα Τασοεξαρτώµενα κανάλια Na+ υναµικό ενεργείας Εικόνα 1: οµή της νευροµυϊκής σύναψης Τα κύτταρα Schwann συνθέτουν και εκκρίνουν τροφικούς παράγοντες, οι οποίοι προάγουν την επιβίωση και αύξηση των κινητικών νευρώνων. Σε έµβρυα που στερούνται κυττάρων Schwann, σχηµατίζονται νευροµυϊκές συνάψεις. Ωστόσο, αυτού του είδους οι συνάψεις εξαφανίζονται ταχέως, οι κινητικοί νευρώνες αποπίπτουν και τα πειραµατόζωα δεν είναι βιώσιµα, κατά τη γέννηση ή λίγο µετά από αυτήν (Auld et al, 2003). Μετά από βλάβη στη νευρική απόληξη, τα κύτταρα Schwann αποκτούν φαγοκυτταρικές ιδιότητες και αποµακρύνουν τα άχρηστα υπολείµµατα της νευρικής απόληξης. Η διαδικασία της αποµάκρυνσης, πιθανότατα, είναι σηµαντική για την προετοιµασία της νευρικής αναγέννησης (Auld et al, 2003).

10 10 Ένας χώρος 50nm, που καλείται συναπτική σχισµή, διαχωρίζει τις κυτταρικές µεµβράνες του νεύρου και της µυϊκής ίνας. Η AChE (ακετυλοχολινεστεράση), η οποία συγκεντρώνεται στη συναπτική σχισµή, είναι ένα ένζυµο, αποτελούµενο από οµοτετραµερή σφαιρικών καταλυτικών υποµονάδων, προσκολληµένων σε µια ουρά κολλαγόνου. Φάρµακα που αναστέλλουν την AChE, όπως η πυριδοστιγµίνη και το εδροφώνιο, παρατείνουν τη διάρκεια δράσης της ACh στη µετασυναπτική µεµβράνη και είναι χρήσιµες θεραπείες για τις διαταραχές της νευροµυϊκής µεταβίβασης. Οι AChRs συνδέονται στο σαρκόλειµµα µέσω των α- και β-δυστρογλυκανών, οι οποίες συγκεντρώνονται στη νευροµυϊκή σύναψη. Οι δυστρογλυκάνες σχηµατίζουν τον πυρήνα ενός µεγαλύτερου συµπλέγµατος πρωτεϊνών, του συµπλέγµατος δυστρογλυκάνης, το οποίο έχει ως λειτουργία τη διατήρηση της µυϊκής δοµής και τη µετάδοση σήµατος. (Higginson et al, 2005). Οι κυτταροπλασµατικές προεκτάσεις των AChRs συνδέονται µε τη ραψίνη, µια πρωτεΐνη που συγκεντρώνεται, για να διαµεσολαβήσει τη συνάθροιση του AChR. Η ραψίνη και ο AChR βρίσκονται στη νευροµυϊκή σύναψη σε µια στοιχειοµετρία 1:1 και η ραψίνη δεσµεύεται άµεσα στον AChR. Οι AChRs σχηµατίζουν συναθροίσεις, όταν συνεκφράζονται µε ραψίνη. Αντίστροφα, δε σχηµατίζονται συναθροίσεις AChR σε µύες ποντικιών, στους οποίους έχει εξαλειφθεί το γονίδιο που κωδικοποιεί τη ραψίνη. Η ραψίνη φέρει ξεχωριστές περιοχές, υπεύθυνες για σύνδεση µε τη µεµβράνη και αλληλεπίδραση µε τον AChR. Συνεπώς, η ραψίνη είναι απαραίτητη για τη συνάθροιση του AChR (εικ.2).

11 11 Εικόνα 2: Πρωτεϊνικά στοιχεία της νευροµυϊκής σύναψης Η νευροµυϊκή σύναψη επιδεικνύει δοµικές και λειτουργικές διαφοροποιήσεις ανάµεσα στα είδη. Οι εξωοφθαλµικοί µύες των θηλαστικών επιδεικνύουν τη µεγαλύτερη δοµική ποικιλοµορφία, όσον αφορά τις νευροµυϊκές συνάψεις. Ι.ΙΙ Νευροµυϊκή µεταβίβαση Οι αρχιτεκτονικές και µοριακές εξειδικεύσεις της νευροµυϊκής σύναψης στοχεύουν στην επίτευξη επικοινωνίας µεταξύ νεύρου και µυός. Η µετασυναπτική εκπόλωση, που προκαλείται από την ελευθέρωση ACh από τα συναπτικά κυστίδια, εξαιτίας ενός νευρικού δυναµικού ενέργειας, είναι το δυναµικό της τελικής κινητικής πλάκας. Το εύρος του δυναµικού της τελικής κινητικής πλάκας είναι συνάρτηση του αριθµού των κυστιδίων του µεταβιβαστή. Ορισµένα φάρµακα µπορούν να αυξήσουν την απελευθέρωση ACh από τις προσυναπτικές νευρικές απολήξεις. Η επαναλαµβανόµενη διέγερση ελαττώνει την ελευθέρωση µεταβιβαστή, η οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες- θα µειώσει τα δυναµικά της τελικής κινητικής πλάκας, αλλά συνήθως- όχι τόσο, ώστε να εµποδιστεί η παραγωγή δυναµικού ενέργειας, µε εξαίρεση ακραίες συνθήκες.

12 12 Η διάχυση της ACh στη συναπτική σχισµή, µετά την απελευθέρωσή της, είναι ταχεία, εξαιτίας της µικρής απόστασης που πρέπει να διανυθεί και της σχετικά υψηλής σταθεράς διάχυσης της ACh. Η δράση της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) τερµατίζει τη δράση της ACh (Ruff, 2003). Το σαρκόλειµµα της µετασυναπτικής επιφάνειας περιέχει µεγάλη πυκνότητα υποδοχέων ακετυλοχολίνης (AChR). Ενεργοποίηση του AChR επιτρέπει τη δίοδο κατιόντων µέσω του πόρου του AChR, η οποία οδηγεί στην παραγωγή δυναµικού ενέργειας στο µυϊκό κύτταρο, µε αποτέλεσµα την προαγωγή της µυϊκής συστολής (Ruff, 2003). Όταν το δυναµικό ενέργειας εισέλθει στη νευρική απόληξη, η εκπόλωση επιφέρει τη διάνοιξη των εξαρτώµενων από το δυναµικό διαύλων Ca ++ στην προσυναπτική µεµβράνη, επιτρέποντας την εισρροή ιόντων Ca ++. Το γεγονός αυτό προκαλεί τη σύντηξη των συναπτικών κυστιδίων µε την προσυναπτική µεµβράνη, ελευθερώνοντας ακετυλοχολίνη (ACh) στη συναπτική σχισµή. Τα µόρια ACh που περιέχονται σ ένα µονήρες κυστίδιο αναφέρονται ως κβάντα και ο αριθµός των κβάντων που ελευθερώνονται από µια µονήρη νευρική ώση είναι γνωστός ως κβαντικό περιεχόµενο. Η δέσµευση της ACh στον AChR επιφέρει τη διάνοιξη του κατιοντικού του διαύλου. Κατιόντα, κυρίως Na +, εισέρχονται στο µυϊκό κύτταρο, προκαλώντας ένα δυναµικό τελικής κινητικής πλάκας. Αυτή η ακολουθία γεγονότων οδηγεί στο άνοιγµα των εξαρτώµενων από το δυναµικό διαύλων Na + και επιπρόσθετη εισρροή ιόντων Na +. Το µυϊκό δυναµικό ενέργειας που προκύπτει εξαπλώνεται σ όλη τη µυϊκή ίνα. Το σήµα µεταδίδεται στο σαρκοπλασµατικό δίκτυο από όπου ιόντα Ca ++ ελευθερώνονται. Τα ιόντα δεσµεύονται στην τροπονίνη C, οδηγώντας, µέσω των τροπονινών Ι και Τ και της τροποµυοσίνης, σε συστολή των ινιδίων ακτίνης και µυοσίνης του µυοϊνιδίου. Ι.ΙΙΙ Νικοτινικός Υποδοχέας της Ακετυλοχολίνης Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης (AChR), στη νευροµυϊκή σύναψη, συνιστά µια ιδιαίτερα µελετηµένη µεγάλη µεµβρανική πρωτεΐνη, ενώ είναι και το αυτοαντιγόνο στην αυτοάνοση νόσο Βαριά Μυασθένεια (Myasthenia gravis, MG). Ο µυϊκού τύπου νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης, που εντοπίζεται στη νευροµυϊκή σύναψη και στα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo, είναι το γνωστότερο µέλος της οικογένειας του νικοτινικού AChR και ανήκει στην

13 13 υπεροικογένεια των διαύλων που µεταφέρουν ιόντα µετά από πρόσδεση νευροδιαβιβαστών. Η υπεροικογένεια αυτή περιλαµβάνει τους υποδοχείς για GABA, σεροτονίνη (5ΗΤ3) και γλυκίνη. Ο µυϊκού τύπου AChR είναι γλυκοπρωτεϊνη, αποτελούµενη από 5 οµόλογες υποµονάδες, µε τη στοιχειοµετρία α 2 βγδ και µε συνολικό µοριακό βάρος περίπου 290kD. Στον ενήλικα µυ, η εµβρυϊκή γ-υποµονάδα αντικαθίσταται από την οµόλογη ε-υποµονάδα. Οι νευρικού τύπου νικοτινικοί AChRs έχουν επίσης πενταµερή δοµή, αλλά αποτελούνται µόνο από α- και β-υποµονάδες (α2-α9, β2-β4), που είναι οµόλογες µε τις µυϊκού τύπου υποµονάδες (Barrantes, 1992). Οι πλήρεις αµινοξικές αλληλουχίες για όλες τις υποµονάδες του AChR από αρκετά είδη είναι γνωστές. Ο αριθµός των αµινοξέων ανά υποµονάδα µυϊκού τύπου AChR ποικίλλει από 437 για την α-υποµονάδα µέχρι (ανάλογα µε το είδος) για τη δ-υποµονάδα. Για ένα δεδοµένο είδος, οι 5 υποµονάδες είναι περίπου 40% οµόλογες. Συγκρίνοντας τους AChRs από το ηλεκτρικό όργανο του Torpedo και τον ανθρώπινο µυ, οι α-υποµονάδες επιδεικνύουν περίπου 80% οµολογία, όσον αφορά τα κατάλοιπα και οι άλλες υποµονάδες περίπου 55%. Το αµινοτελικό άκρο κάθε υποµονάδας εντοπίζεται εξωκυτταρικά. Η ακετυλοχολίνη που ελευθερώνεται από τη νευρική απόληξη δεσµεύεται στον AChR και προκαλεί το άνοιγµα του διαύλου κατιόντων (ενδογενές µέρος του AChR), επιτρέποντας στο Na + να εισέλθει στο µυϊκό κύτταρο. Η ακετυλοχολίνη δεσµεύεται σε 2 δεσµευτικές θέσεις ανά µόριο AChR, µία σε κάθε α-υποµονάδα. Τα κατάλοιπα Cys στις θέσεις α192 και α193 παίζουν κρίσιµο ρόλο στη δέσµευση της ACh, ενώ τα κατάλοιπα Trp86, Tyr93, Trp149, Tyr151, Tyr190 και Tyr198 φαίνεται, επίσης, να ενέχονται στη δέσµευση της ACh. Οι θέσεις δέσµευσης για αρκετούς αγωνιστές και ανταγωνιστές της ACh έχουν µελετηθεί εκτεταµένα. Οι α-τοξίνες του δηλητηρίου των φιδιών, µια οµάδα µικρών πρωτεϊνών µε µοριακό βάρος περίπου 7,5-8 kd, οι οποίες περιλαµβάνουν την α-µπουγκαροτοξίνη (α-βτχ) από το Bungarus multicinctus, δεσµεύονται µε υψηλή συγγένεια και στις 2 α-υποµονάδες κοντά στις θέσεις δέσµευσης της ACh και αναστέλλουν συναγωνιστικά τη λειτουργία του AChR. Και οι 4 υποµονάδες απαιτούνται για έναν πλήρως λειτουργικό AChR. Το εξωκυτταρικό µισό του αµινοτελικού άκρου κάθε υποµονάδας (200 κατάλοιπα) ακολουθείται από 4 υδρόφοβες διαµεµβρανικές περιοχές, Μ1-Μ4, που σχηµατίζουν τον ιοντικό δίαυλο, µε τις Μ1, Μ2 και Μ3 να χωρίζονται από µικρές αλληλουχίες,

14 14 ενώ η Μ3 και η Μ4 χωρίζονται από µια µεγάλη κυτταροπλασµατική περιοχή. Τα 2 σύγχρονα δοµικά µοντέλα για τον AChR προβλέπουν ότι οι Μ1-Μ4 σχηµατίζουν 4 υδρόφοβες α-έλικες, κάθε µία από τις οποίες διασχίζει τη µεµβράνη άπαξ. Μελέτες ηλεκτρονικής µικροσκοπίας των κρυστάλλων του Torpedo έχουν δείξει ότι ο AChR είναι κύλινδρος, µήκους Å και πλάτους 80 Å, εκτεινόµενος προς τα έξω και από τις 2 µεριές της µεµβράνης και σχεδόν κάθετα προς το επίπεδο της µεµβράνης (Unwin, 2003) (εικ. 3). Εικόνα 3: οµικό µοντέλο AChR α. Το πρότυπο σχήµα των υποµονάδων διαµέσου της µεµβράνης. β. Σχηµατική αναπαράσταση της τεταρτοταγή δοµής του µορίου του AChR, παρουσιάζοντας την διευθέτηση των υποµονάδων, τις περιοχές σύνδεση της ACh και το κατιονικό κανάλι. γ. Απεικόνιση του AChR στα 4,6 Α 0 όπως προσδιορίστηκε από ηλεκτρονική µικροσκοπία κρυστάλλων µεµβρανών Torpedo εµβυθισµένων σε πάγο. Nat Rev Neurosci. 3, (2002). Ο AChR είναι πολύ ισχυρό ανοσογόνο. ιάφορα είδη ζώων, όταν ανοσοποιούνται µε ακέραιο AChR ή θραύσµατά του, αποκρίνονται µε παραγωγή αντισωµάτων έναντι διάφορων θέσεων του µορίου. Μία µόνο ένεση µε λιγότερο από

15 15 1µg καθαρού AChR ανά αρουραίο αρκεί, για να εκλυθεί ανοσολογική απόκριση έναντι του AChR. Όταν ο ακέραιος AChR χρησιµοποιείται ως ανοσογόνο, τα περισσότερα από τα αντισώµατα κατευθύνονται έναντι εξωκυτταρικών περιοχών του AChR, ενώ ένεση αποδιαταγµένων υποµονάδων του AChR, συνήθως, οδηγεί σε αντισώµατα κατευθυνόµενα έναντι κυτταροπλασµατικών περιοχών του µορίου. Η πλειονότητα των αντισωµάτων έναντι του ακέραιου διαλυτοποιηµένου AChR από το ηλεκτρικό όργανο του ψαριού Torpedo ή το µυ των θηλαστικών συναγωνίζονται µεταξύ τους για τη δέσµευση σε µια ειδική περιοχή της α- υποµονάδας, την κύρια ανοσογόνο περιοχή (MIR, Main Immunogenic Region). Τα αντι-mir µονοκλωνικά αντισώµατα (monoclonal antibodies, mabs) είναι πολύ αποτελεσµατικά στην παθητική πρόκληση Μυασθένειας (MG) σε πειραµατόζωα. Οι επίτοποι για αρκετά αντι-mir mabs εντοπίζονται µεταξύ των καταλοίπων της α-υποµονάδας (Tzartos et al, 1991). Επιπλέον, έχουν παραχθεί αντισώµατα έναντι άλλων εξωκυτταρικών περιοχών σε καθεµιά από τις υποµονάδες του AChR. Οι επίτοποι για πολλά από αυτά τα mabs έχουν αναγνωριστεί χρησιµοποιώντας προσεγγίσεις, όπως χαρτογράφηση συνθετικών πεπτιδίων, κ.ά. Όταν ένας σηµαντικός αριθµός αντι-achr mabs έγινε διαθέσιµος, φάνηκε ότι τα περισσότερα από αυτά συναγωνίζονταν µεταξύ τους για δέσµευση στην περιοχή ΜΙR. Το mab35 έγινε το αντι-μιr mab αναφοράς. Η δέσµευση αυτού του mab εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό (όχι, όµως, απόλυτα) από τη φυσική διαµόρφωση του AChR. Τα αντι-μιr mabs φαίνεται να επικρατούν στο ρεπερτόριο των αντισωµάτων της ανθρώπινης MG (Lindstrom et al, 1981). Επιπλέον, άλλα πειράµατα έχουν δείξει επικράτηση των αντισωµάτων έναντι της α-υποµονάδας, παρ ότι αντισώµατα έναντι και των άλλων υποµονάδων σαφώς υπάρχουν. Αντισώµατα κατευθυνόµενα έναντι της κυτταροπλασµατικής περιοχής του AChR δεν έχουν ανιχνευτεί, ακόµα, σε ορούς µυασθενικών. Τέτοια αντισώµατα, εφόσον υφίστανται πράγµατι, θα αποτελούν ένα µικρό ποσοστό. Ωστόσο, όταν ζώα ενίονται µε αποδιαταγµένο µε SDS AChR ή τις αποµονωµένες υποµονάδες του, τα περισσότερα από τα αντισώµατα που παράγονται κατευθύνονται έναντι των κυτταροπλασµατικών περιοχών του µορίου. Κυτταροπλασµατικοί επίτοποι έχουν ανιχνευτεί και µελετηθεί από αρκετές οµάδες. Με χρήση συνθετικών πεπτιδίων, ο Ralston και συν. χαρτογράφησαν τις θέσεις δέσµευσης για τα αντισώµατα που παράγονται από αρουραίους

16 16 ανοσοποιηµένους µε αποδιαταγµένη α-υποµονάδα και βρέθηκε ότι τα περισσότερα δεσµεύονται στα κατάλοιπα της α-υποµονάδας. Ειδικότερα, οι επίτοποι στις περιοχές α και β αποδείχτηκαν εξαιρετικά ανοσογόνοι. Οι επίτοποι αυτοί ονοµάστηκαν Πολύ Ανοσογόνοι Κυτταροπλασµατικοί Επίτοποι (Very Immunogenic Cytoplasmic Epitopes, VICE) στις α- και β-υποµονάδες (VICE-α, VICE-β). Και οι 2 αυτοί επίτοποι παρουσιάζουν ειδικό ενδιαφέρον. Ο VICE-α στη MG και ο VICE-β στη φωσφορυλίωση του AChR. Για το λόγο αυτόν, οι 2 αυτοί επίτοποι έχουν µελετηθεί εκτενώς, ώστε να καθοριστεί ο ρόλος κάθε αµινοξικού καταλοίπου. Τα αντι-vice-α mabs αναγνωρίζουν ειδικά µια πρωτεΐνη 153kDa (p153), η οποία βρίσκεται σε θυµώµατα µυασθενικών, όχι, όµως και σε θυµώµατα µη µυασθενικών. Η πρωτεΐνη αυτή περιέχει έναν παρόµοιο προς το VICE-α επίτοπο. Στην περίπτωση της σχετιζόµενης µε θύµωµα MG, έχει προταθεί ότι η αρχική ανοσολογική απόκριση κατευθύνεται έναντι της p153 και τα αντισώµατα που προκύπτουν αντιδρούν διασταυρωτά και προκαλούν την έναρξη αυτοάνοσης απόκρισης έναντι του AChR (Marx et al, 1990). ιασταυρωτή αντίδραση των αντι- VICE-α mabs µε άλλα µόρια των σκελετικών µυών, εκτός του AChR, έχει, επίσης, αναφερθεί. Ορισµένα mabs, συµπεριλαµβανοµένων και εκείνων που κατευθύνονται έναντι του VICE-β, βρέθηκε ότι δεσµεύονται σε θέσεις φωσφορυλίωσης στον AChR. Η φωσφορυλίωση του AChR έχει εµπλακεί στη συνάθροιση, ρύθµιση της λειτουργίας και αποδόµηση του µορίου. Στην οροαρνητική MG (Seronegative MG, SNMG), δηλαδή στη µυασθένεια, κατά την οποία δεν ανιχνεύονται αντι-achr αντισώµατα, αντισώµατα που δεν κατευθύνονται έναντι του AChR δρουν σε άλλα συστατικά της µετασυναπτικής µεµβράνης, τα οποία, στη συνέχεια, επηρεάζουν τη λειτουργία του AChR αυξάνοντας τη φωσφορυλίωσή του. Ο AChR φωσφορυλιώνεται σε τουλάχιστον 8 κατάλοιπα (όλα µεταξύ των τµηµάτων Μ3 και Μ4 κάθε υποµονάδας) από µια camp-εξαρτώµενη πρωτεϊνική κινάση, από την PKC και από πρωτεϊνικές κινάσες Tyr. Έχουν πραγµατοποιηθεί πειράµατα έκφρασης διαφόρων AChR υβριδίων, όπως Torpedo α/mouse βγδ, mouse α/torpedo βγ, human α/torpedo βγδ και human δ/torpedo αβγ, σε ινοβλάστες (Loutrari et al, 1992, Loutrari et al, 1997). Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκε σύγκριση της δέσµευσης διαφόρων mabs ή MG ορών σε αυτά τα υβρίδια µε τη δέσµευσή τους σε Torpedo, προέλευσης ποντικού και

17 17 ανθρώπινο AChR. Όλα τα αντι-μιr mabs που δοκιµάστηκαν βρέθηκε ότι δεσµεύονται στην α-υποµονάδα των υβριδικών AChRs. Μεγάλες οµάδες αλληλοεπικαλυπτόµενων συνθετικών πεπτιδίων χρησιµοποιήθηκαν, για να ελεγχθούν οι επίτοποι για πολλά αντι-achr mabs. Χρησιµοποιώντας 26 πεπτίδια, µε µήκος κατάλοιπα και καλύπτοντας το µεγαλύτερο τµήµα της ανθρώπινης α-υποµονάδας, 8 αντι-μιr mabs βρέθηκε να δεσµεύονται στο πεπτίδιο α Η χρήση µιας οµάδας µικρότερων πεπτιδίων µέσα στην αλληλουχία α63-80 βοήθησε στον περαιτέρω εντοπισµό της δέσµευσης των ίδιων mabs στο δεκαπεπτίδιο α67-76 (WNPDDYGGVK) του ανθρώπινου AChR (Tzartos et al, 1988). Χρησιµοποιώντας όλα τα πιθανά συνεχόµενα αλληλοεπικαλυπτόµενα εξαπεπτίδια, µέσα στην Torpedo και ανθρώπινη α40-91 αλληλουχία, η περιοχή ΜΙR εντοπίστηκε σε 3 εξαπεπτίδια, α66-71, α67-72 και α68-73, δηλώνοντας ότι το τετραπεπτίδιο α68-71 είναι το κρίσιµο τµήµα δέσµευσης (Papadouli et al, 1990). Xρησιµοποιώντας πεπτιδικά ανάλογα του Torpedo και του ανθρώπινου ΜΙR α67-76, µε µονήρεις αµινοξικές αντικαταστάσεις, µελετήθηκε εκτεταµένα η συνεισφορά κάθε καταλοίπου στην αντιγονικότητα του ΜΙR. εκατρία ανάλογα (κυρίως, υποκαταστάσεις Ala) του Torpedo και του ανθρώπινου α67-76 συντέθηκαν (Papadouli et al, 1990). Μελέτες δέσµευσης, στις οποίες χρησιµοποιήθηκαν 6 αντι- ΜΙR mabs, αποκάλυψαν ότι η υποκατάσταση των Asn68 και Asp71 µε Ala οδήγησε σε σχεδόν πλήρη απώλεια της δέσµευσης όλων των mabs που δοκιµάστηκαν, ενώ η υποκατάσταση των καταλοίπων α67, α69, α70 και α72 µε Ala οδήγησε σε ελαττωµένη δέσµευση µόνο ορισµένων αντι-μιr mabs. Γενικά, οι υποκαταστάσεις στην περιοχή α68-71 ήταν οι πιο κρίσιµες. O Bellone και συν. (Bellone et al, 1989) έδειξαν ότι η αντικατάσταση των καταλοίπων α68 και α69 µε Gly µείωσε δραµατικά τη δέσµευση των περισσότερων mabs και ότι αντικαταστάσεις στα κατάλοιπα α71 και α72 µε Gly µείωσαν, επίσης, τη δέσµευση αρκετών mabs, αλλά όχι τόσο δραµατικά. Ο λειτουργικός ρόλος των αντι-μιr mabs έχει µελετηθεί σε πειραµατόζωα και καλλιέργειες µυϊκών κυττάρων. Αρουραίοι, στους οποίους χορηγήθηκαν 2 αντι- ΜΙR mabs (Lennon et al, 1980), επέδειξαν συµπτώµατα MG και απώλεια του µυϊκού AChR. Αντίθετα, 4 mabs έναντι άλλων πλην των ΜΙR θέσεων δεν προκάλεσαν ούτε συµπτώµατα MG ούτε απώλεια AChR (Tzartos et al, 1987).

18 18 Η ικανότητα των αντι-μιr mabs να προκαλούν απώλεια AChR µέσω αντιγονικής τροποποίησης έχει µελετηθεί σε καλλιέργειες µυϊκών κυττάρων από διάφορες ζωικές και ανθρώπινες πηγές (Conti-Tronconi et al, 1981). Πέντε mabs, κατευθυνόµενα έναντι του κυτταροπλασµατικού τµήµατος του AChR, δεν προκάλεσαν αντιγονική τροποποίηση. Το ενδιαφέρον βρίσκεται στο γεγονός ότι, από τα mabs που δοκιµάστηκαν για αντιγονική τροποποίηση του AChR, τα αντι-μιr mabs ήταν τα αποτελεσµατικότερα. Χρησιµοποιώντας συνθετικά πεπτίδια, η θέση δέσµευσης της α-βτχ έχει εντοπιστεί, κυρίως, στα κατάλοιπα α (Barkas et al, 1987, Wilson et al, 1988). Τα αντισώµατα που αναστέλλουν τη δέσµευση της α-βτχ δεν αναστέλλουν απαραίτητα τη δέσµευση της ACh και τη λειτουργία διαύλου, αφού η α-βτχ είναι πολύ µεγαλύτερο µόριο από την ACh. Αντισώµατα έναντι άλλων εξωκυττάριων θέσεων στις α- και µη α-υποµονάδες µπορούν να παραχθούν σε πειραµατόζωα και βρίσκονται σε MG ορούς. Χρησιµοποιώντας ακέραιο AChR ως αντιγόνο, έχουν παραχθεί ορισµένα mabs έναντι της α-υποµονάδας, που κατευθύνονται σε εξωκυτταρικές θέσεις, άλλες, εκτός του ΜΙR (Tzartos et al, 1980). Ένα µεγάλο ποσοστό MG ορών περιέχει µη αντι-achr αντισώµατα, κυρίως, κατευθυνόµενα έναντι άλλων µυϊκών συστατικών (Mappouras et al, 1995). Κάποια αντι-achr αντισώµατα φαίνεται να αντιδρούν διασταυρωτά µε άλλα µόρια και µπορεί να παίζουν παθογενετικό ρόλο στη MG. Μηχανισµοί µοριακής µίµησης, που περιλαµβάνουν AChR-like επιτόπους σε µη AChR ενδογενή και εξωγενή µόρια, έχει προταθεί ότι συνεισφέρουν στην επαγωγή MG. Ο Stefansson και συν. (Stefansson et al, 1985, Dieperink et al, 1989) ανίχνευσαν κοινούς επιτόπους µεταξύ του AChR και πρωτεϊνών σε αρκετά βακτήρια, επισηµαίνοντας έναν πιθανό ρόλο στην παθογένεια της MG. Ο Schwimmbeck και συν. (Schwimmbeck et al, 1989) αποµόνωσαν αντισώµατα από έναν MG ορό χρησιµοποιώντας ένα πεπτίδιο που αντιστοιχεί στο ανθρώπινο α τµήµα. Αυτά τα αντισώµατα δεσµεύονται στον AChR και αναστέλλουν τη δέσµευση της α-βτχ στον AChR και δεσµεύονται, επίσης, σε οµόλογη περιοχή της γλυκοπρωτεϊνης D του HSV, δηλώνοντας ότι ο HSV µπορεί να σχετίζεται µε την έναρξη κάποιων περιπτώσεων MG. Ο επίτοπος ΜΙR έχει ενοχοποιηθεί, επίσης, στη µοριακή µίµηση. Ο Manfredi και συν. (Manfredi et al, 1991) αναγνώρισαν πολύ σηµαντικές οµολογίες µεταξύ της

19 19 αλληλουχίας του πεπτιδίου ΜΙR και της U1 snrnp (δείκτης 2 άλλων αυτοάνοσων νόσων). Προτάθηκε ότι διαφορετικές αυτοάνοσες νόσοι ξεκινούν µε παρόµοιο φάσµα αυτοαντιδραστικότητας και ότι, στη MG, αυτή η απόκριση εστιάζεται στον AChR και στο ΜΙR. Παρατήρησαν, ακόµα, οµολογία ανάµεσα στο ΜΙR και ένα τµήµα της pol πολυπρωτεϊνης αρκετών ανθρώπινων ρετροϊών. I.IV Muscle Specific Kinase Η ανάπτυξη της πλήρως διαφοροποιηµένης νευροµυϊκής σύναψης προχωρεί µε µια πολύπλοκη αλληλουχία γεγονότων, η οποία δεν είναι, ακόµα, πλήρως κατανοητή. Η αλληλουχία αυτή των γεγονότων εξαρτάται από αµοιβαίες αλληλεπιδράσεις µεταξύ του κινητικού νευρώνα και του µυϊκού κυττάρου. Η διεργασία λαµβάνει χώρα σε περίοδο αρκετών εβδοµάδων στα τρωκτικά και περιλαµβάνει σήµατα µε κατεύθυνση τόσο από το νεύρο προς το µυ, όσο και παλίνδροµα (από το µυ προς το νεύρο). Έχει δειχθεί ότι το µονοπάτι αγκρίνης/musk παίζει ρόλο-κλειδί στην έναρξη και διατήρηση πολλών από τις δοµικές εξειδικεύσεις της µετασυναπτικής συσκευής. Η αγκρίνη είναι µια παραγόµενη από τα νεύρα πρωτεΐνη, η οποία αποµονώθηκε, αρχικά, εξαιτίας της ικανότητάς της να επάγει τη συνάθροιση των AChRs στην επιφάνεια των µυϊκών κυττάρων. Η αγκρίνη συντίθεται και ελευθερώνεται από τους αναπτυσσόµενους νευρίτες των κινητικών νευρώνων (Magill-Solc et al, 1990). Επιπλέον, αντισώµατα έναντι της αγκρίνης ανέστειλαν το σχηµατισµό των επαγόµενων από τους κινητικούς νευρώνες συναθροίσεων (Reist et al, 1992). Η παρατήρηση αυτή οδήγησε στην υπόθεση ότι η αγκρίνη ήταν το παραγόµενο από τα νεύρα σήµα, που διαµεσολαβούσε τη συσσωµάτωση του AChR in vivo. Μικρές συναθροίσεις AChRs είναι ορατές µε ανοσοφθορισµό στην επιφάνεια των µυϊκών κυττάρων, ακόµα και επί απουσίας του νεύρου ή της αγκρίνης. Ωστόσο, µέσα σε 2h από τη νεύρωση ή την προσθήκη αγκρίνης, ο αριθµός αυτών των AChR µικροσυναθροίσεων αρχίζει να αυξάνει. Μέσα σε 14 h, ένας αριθµός µεγάλων AChR συναθροίσεων φαίνεται και η µέγιστη συνάθροιση παρατηρείται µέσα στις 24h. Ο σχηµατισµός των συναθροίσεων δε συνοδεύεται από αύξηση στα επίπεδα του ολικού AChR. Φαίνεται ότι οι προϋπάρχοντες AChRs ανακατανέµονται στην κυτταρική µεµβράνη.

20 20 Πολλές από τις πρωτεϊνες που σχετίζονται µε τους AChRs στις ώριµες συνάψεις έχει παρατηρηθεί ότι συσσωµατώνονται µε τους AChRs στα πρώιµα στάδια. Η ραψίνη, η α-δυστρογλυκάνη και η AChΕ, όλες, συνδέονται µε τις αυθόρµητες και τις επαγόµενες από αγκρίνη AChR συναθροίσεις (De La Porte et al, 1998, Gee et al, 1994). Μετά 15-20h από την κατεργασία µε αγκρίνη, µια δεύτερη οµάδα µορίων συγκεντρώνεται στις AChR συναθροίσεις, η οποία περιλαµβάνει τα κυτταροσκελετικά συστατικά α-ακτινίνη, φιλαµίνη και βινκουλίνη. Η σηµασία της αγκρίνης επιβεβαιώθηκε οριστικά µε τη δηµιουργία ενός ποντικού, στον οποίο είχε εξαλειφθεί το γονίδιο για την αγκρίνη και ο οποίος έδειξε µικρή ή καθόλου µετασυναπτική διαφοροποίηση, µε πολύ λίγες AChR συναθροίσεις και καµµία από τις φυσιολογικές δοµικές εξειδικεύσεις (Gautam et al, 1996). Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την αγκρίνη κωδικοποιεί έναν πρωτεϊνικό πυρήνα 220kDa, αλλά η αγκρίνη που αποµονώνεται από εγκέφαλο µεταναστεύει ως µια διάχυτη µπάντα kda. Κατεργασία της τελευταίας µε ηπαρινάση προκαλεί µια µετατόπιση στην καθορισµένη 220kDa µπάντα, επισηµαίνοντας ότι η αγκρίνη είναι ένα µέλος µιας οικογένειας αρνητικά φορτισµένων, έντονα γλυκοζυλιωµένων πρωτεϊνών, των πρωτεογλυκανών θειϊκής ηπαράνης. Πολλά άλλα µέλη αυτής της οικογένειας έχουν εµπλακεί σ έναν αριθµό κρίσιµων αναπτυξιακών διεργασιών, όπως έλεγχος κυτταρικής αύξησης και διαφοροποίησης και ρύθµιση γονιδιακής µεταγραφής. Η αγκρίνη διαθέτει περιοχές οµολογίας µε αρκετές γνωστές πρωτεϊνες και υφίσταται σε πολλές διαφορετικές ισοµορφές. Οι δοµικές περιοχές της αγκρίνης που απαιτούνται για την AChR συνάθροιση έχουν προσδιοριστεί. Απαλοιφή ολόκληρης της αµινοτελικής περιοχής και της κεντρικής περιοχής δεν έχει επίδραση στην ικανότητα συνάθροισης. Φαίνεται ότι αυτές οι 2 περιοχές απαιτούνται µόνο για τους προτεινόµενους ρόλους της αγκρίνης στη σύνδεση µε αυξητικούς παράγοντες και στην αναστολή πρωτεασών. Παρά το ότι η αγκρίνη αναγνωρίστηκε, αρχικά, ως ένας παράγοντας εκκρινόµενος από τους κινητικούς νευρώνες, στη συνέχεια, δείχθηκε ότι η αγκρίνη είναι ευρύτερα κατανεµηµένη. Η αγκρίνη είναι παρούσα στον εγκέφαλο, στο νωτιαίο µυελό, στο µυ, στο ήπαρ, στο νεφρό, στον πνεύµονα και σε ποικιλία άλλων ιστών. Στα πρωιµότερα στάδια της ανάπτυξης, τα ολικά επίπεδα της αγκρίνης είναι χαµηλά. Τα επίπεδα του mrna της αγκρίνης αυξάνονται στη συνέχεια, στη διάρκεια της ανάπτυξης και ελαττώνονται εκ νέου στην ενήλικη ζωή.

21 21 Η αγκρίνη χαρακτηρίζεται για την ικανότητά της να επάγει συσσωµάτωση και συνάθροιση των AChRs στην επιφάνεια καλλιεργηµένων µυϊκών κυττάρων και αυτό το γεγονός την εµπλέκει σε παρόµοιες πρώιµες διεργασίες, στη διάρκεια του σχηµατισµού νευροµυϊκής σύναψης in vivo. Ο µηχανισµός δράσης της αγκρίνης έχει παραµείνει για πολύ καιρό υποθετικός, παρά το γεγονός ότι η κατεργασία µε αγκρίνη οδηγεί σε φωσφορυλίωση Tyr των υποµονάδων του AChR και αναστολείς φωσφορυλίωσης Tyr µπλοκάρουν την επαγόµενη από αγκρίνη συνάθροιση. Αφότου πρωτοαποµονώθηκε η αγκρίνη από το Torpedo, έχει λάβει χώρα εκτεταµένη έρευνα σχετικά µε την ταυτότητα του υποδοχέα που ενέχεται στη µεταγωγή της επαγόµενης από αγκρίνη συνάθροισης του AChR. Παρά το γεγονός ότι η έρευνα βρίσκεται υπό εξέλιξη, πιστεύεται ότι ο υποδοχέας µε δράση κινάσης Tyr, η MuSK, αντιπροσωπεύει µέρος αυτού του υποδοχέα. Η MuSK πρωτεΐνη είναι ένα διαµεµβρανικό πολυπεπτίδιο, µε µια ενδοκυτταρική περιοχή, που χαρακτηρίζεται από δράση κινάσης Tyr και µια µεγάλη εξωκυτταρική περιοχή, µε πρωτεϊνικά µοτίβα ανοσοσφαιρινών (Ig-like). H πρωτεΐνη φαίνεται να είναι ειδική για τη σειρά των σκελετικών µυών. Εκφράζεται σε χαµηλά επίπεδα στους µυοβλάστες. Στον ώριµο µυ, ελαττώνεται η έκφρασή της, ενώ τα επίπεδά της είναι πιο αυξηµένα στη νευροµυϊκή σύναψη. Η έκφραση της MuSK ρυθµίζεται, επίσης, από την ηλεκτρική δραστηριότητα, καθώς επάγεται δραµατικά µετά από απονεύρωση ή αναστολή της ηλεκτρικής δραστηριότητας (Bowen et al, 1998). Τα ποντίκια, στα οποία έχει εξαλειφθεί το γονίδιο που κωδικοποιεί τη MuSK, αναπτύσσονται φυσιολογικά στη µήτρα, αλλά πεθαίνουν περιγεννητικά, εξαιτίας ανικανότητας να αναπνεύσουν. Παρά το γεγονός ότι ο σκελετικός µυς αναπτύσσεται φυσιολογικά σ αυτά τα ζώα, η µετασυναπτική διαφοροποίηση είναι σχεδόν απούσα, µε τον AChR να µη συγκεντρώνεται υπό τη νευρική απόληξη (DeChiara et al, 1996). Το γεγονός ότι η MuSK είναι απαραίτητη για τη δράση της αγκρίνης υποδηλώνει ότι η MuSK µπορεί να είναι ο υποδοχέας της αγκρίνης. Επακόλουθα πειράµατα υποστήριξαν αυτήν την υπόθεση. Καλλιεργηµένα µυϊκά κύτταρα από ανεπαρκή σε MuSK ποντίκια δεν αποκρίθηκαν στην αγκρίνη, ενώ η εισαγωγή του γονιδίου της MuSK σε αυτά τα κύτταρα αποκατέστησε την απόκριση στην αγκρίνη (Herbst et al, 2000). Η αγκρίνη είχε ως αποτέλεσµα την επαγωγή ταχείας φωσφορυλίωσης της MuSK. Μια µετάλλαξη της MuSK, χαρακτηριζόµενη από ανενεργή περιοχή κινάσης, ανέστειλε την επαγόµενη από αγκρίνη συνάθροιση.

22 22 Ωστόσο, κάποιες παρατηρήσεις δηλώνουν ότι η MuSK µπορεί να µην είναι ο πλήρης υποδοχέας της αγκρίνης. Παρά το γεγονός ότι η αγκρίνη διεγείρει τη φωσφορυλίωση της MuSK σε µυϊκά κύτταρα, δεν υπάρχει άµεση δέσµευση της αγκρίνης στην εξωκυττάρια περιοχή της MuSK (Glass et al, 1996). Αυτό που συµβαίνει, στην πραγµατικότητα, είναι ότι η αγκρίνη δεν µπορεί να δεσµευτεί άµεσα σε αποµονωµένη MuSK, αλλά µπορεί να δεσµευτεί στη MuSK που βρίσκεται στην επιφάνεια µυϊκών κυττάρων. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η MuSK µπορεί να αντιπροσωπεύει µία υποµονάδα σε ένα σύµπλεγµα υποδοχέα από πολλά συστατικά για την αγκρίνη και ότι χρειάζεται επιπρόσθετο(-α) βοηθητικό (-ά) συστατικό(-ά) υποδοχέα, ώστε να συνδεθεί και, στη συνέχεια, να ενεργοποιηθεί από την αγκρίνη. Αυτό το συστατικό ονοµάζεται MASC (MuSK-Accessory Specificity Component), έχει αποµονωθεί από µυϊκά κύτταρα και έχει δειχθεί ότι απαιτείται, ώστε η αγκρίνη να δεσµευτεί στην εξωκυττάρια περιοχή της αποµονωθείσας MuSK. Επιπλέον, πειράµατα έδειξαν ότι µόνο 13 αµινοξέα, εντοπιζόµενα κοντά στη διαµεµβρανική περιοχή της MuSK, είναι απαραίτητα για τη συνάθροιση του AChR (Herbst et al, 2000). Παρά το γεγονός ότι ο πραγµατικός υποδοχέας της αγκρίνης δεν έχει αναγνωριστεί ακόµα, η πρωτεΐνη ραψίνη είναι γνωστό ότι παίζει κεντρικό ρόλο στη φυσική διεργασία της συνάθροισης. Η ραψίνη (Receptor-associated protein at the synapse, Rapsyn) είναι µια 43kDa πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται µαζί µε τους AChRs στις νευροµυϊκές συνάψεις από τα πρωιµότερα στάδια του σχηµατισµού συνάψεων (Noakes et al, 1993, Sealock et al, 1984). Η ραψίνη φαίνεται να προσδένει τους AChRs σε ένα υποσυναπτικό δίκτυο κυτταροσκελετού. Η χαρτογράφηση περιοχών στη MuSK, οι οποίες είναι απαραίτητες για την αλληλεπίδρασή της µε τη ραψίνη, δείχνει ότι αλληλουχίες µέσα και κοντά στην τέταρτη Ig-like περιοχή απαιτούνται για τη σύνδεση µε τη ραψίνη µέσω της πρωτεΐνης RATL (Rapsyn Associated Transmembrane Linker), ώστε να µεσολαβηθεί η συσσωµάτωση του AChR (Apel et al, 1997). Η φωσφορυλίωση του AChR εξαρτάται από τη ραψίνη. Η Src κινάση, η κύρια κινάση που φωσφορυλιώνει τον AChR, έχει δειχθεί ότι συνδέεται µε τη ραψίνη (Fuhrer et al, 1996). Φαίνεται ότι η αγκρίνη δεσµεύεται, αρχικά, στο σύµπλεγµα του υποδοχέα της MuSK, ενεργοποιώντας τη MuSK και επάγοντας τη µετασυναπτική συνάθροισή της και το σχηµατισµό ενός πρωτοπαθούς βασισµένου στη MuSK δικτύου. Αυτό το πρωτοπαθές, το βασισµένο στη MuSK δίκτυο, απαιτεί, εν συνεχεία, ραψίνη, ώστε να

23 23 συγκεντρωθούν επιπρόσθετα µετασυναπτικά συστατικά, όπως οι AChRs, η δυστρογλυκάνη, κ.ά. Αναλυτικότερα, η αγκρίνη διεγείρει το διµερισµό (Hopf et al, 1998) και τη δραστηριότητα κινάσης της MuSK. Το σήµα που προκαλείται από την ενεργοποίηση της MuSK εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση ενός καταλοίπου Tyr (Tyr553) στην παραµεµβρανική οµόφωνη θέση αναγνώρισης (NPXY) για τις πρωτεϊνες που περιέχουν περιοχή δέσµευσης φωσφοτυροσίνης (Herbst et al, 2000) (εικ. 4). Αυτή η φωσφοτυροσίνη απαιτείται, για να συγκεντρωθούν σηµατοδοτικά συστατικά (Herbst et al, 2000). Επιπρόσθετα, η αγκρίνη προκαλεί ταχεία ενεργοποίηση των Src κινασών και φωσφορυλίωση Tyr στις β και δ υποµονάδες του AChR, (Mittaud et al, 2001), µε τη φωσφορυλίωση της β να απαιτείται για την αποτελεσµατική συνάθροιση του AChR (Borges et al, 2001). Η φωσφορυλίωση Tyr, καθώς και οι Src και Fyn κινάσες, είναι απαραίτητες για τη σταθεροποίηση των συναθροίσεων (Smith et al, 2001). Εικόνα 4: Οργάνωση του υποδοχέα µε δράση κινάσης τυροσίνης, MuSK. Η εξωκυττάρια περιοχή της MuSK περιέχει 4 immunoglobulin-like τµήµατα, (Ig-1 to Ig-4) και µια περιοχή µε 6 συντηρηµένα κατάλοιπα Cys, (C6 box). Το πρώτο Ig-like τµήµα απαιτείται για την απόκριση στην αγκρίνη (αλληλεπίδραση µε αγκρίνη/ MASC), ενώ το τέταρτο Ig-like τµήµα για την αλληλεπίδραση ραψίνης- RATL. Στην κυτταροπλασµατική περιοχή της MuSK, µια θέση αναγνώρισης NPXY για πρωτεϊνες που διαθέτουν µέρη δέσµευσης φωσφοτυροσίνης (Phosphotyrosine Binding, PTB). Όπως και οι AChRs, σχηµατίζει και η ραψίνη συσσωµατώµατα, αυτόµατα ή µετά από επαγωγή από την αγκρίνη. Η ραψίνη και ο AChR βρίσκονται σε ισοµοριακές συγκεντρώσεις στη νευροµυϊκή σύναψη (LaRochelle et al, 1986). Όταν ο AChR εκφράζεται σε ωοκύτταρα Xenopus, οι υποδοχείς κατανέµονται διάχυτα στην κυτταρική επιφάνεια. Ταυτόχρονη έκφραση της ραψίνης και του AChR έχει ως αποτέλεσµα αυξηµένο χρόνο ηµιζωής του τελευταίου, δηλώνοντας ότι αυτή η

24 24 σύνδεση µπορεί να είναι µερικώς υπεύθυνη για την αυξηµένη σταθερότητα των AChRs µετά τη συναπτογένεση (Phillips et al, 1997, Wang et al, 1999). Η ραψίνη είναι σε θέση να προκαλέσει συνάθροιση αρκετών πρωτεϊνών της νευροµυϊκής σύναψης, άλλων, εκτός του AChR. Η ικανότητα της ραψίνης να προκαλεί συνάθροιση πρωτεϊνών της νευροµυϊκής σύναψης οδήγησε στην υπόθεση ότι αποτελεί µια πρωτεΐνη-οδηγό, η οποία συγκεντρώνει τις άλλες συναπτικές πρωτεϊνες στα σηµεία επαφής νεύρου/µυός. Τα ποντίκια, στα οποία απουσιάζει το γονίδιο για τη ραψίνη, παρέχουν µια in vivo υποστήριξη σ αυτήν την πρόταση. Οι AChRs, η δυστρογλυκάνη και άλλες πρωτεϊνες δε συναθροίζονται στις νευροµυϊκές συνάψεις αυτών των ποντικιών. Η MuSK δεν παίζει απλά έναν δοµικό ρόλο, στη διάρκεια του σχηµατισµού της νευροµυϊκής σύναψης, καθώς µελέτες µε τη δηµιουργία µεταλλάξεων αποκαλύπτουν ότι η δραστηριότητα κινάσης της MuSK απαιτείται για την επαγωγή συνάθροισης του AChR. Επιπλέον, η ενεργοποίηση της MuSK είναι απαραίτητη συνθήκη, ώστε να διαµεσολαβηθε ένα πρώιµο γεγονός-κλειδί στο σχηµατισµό της νευροµυϊκής σύναψης, τη φωσφορυλίωση του AChR. Ωστόσο, ούτε η ενεργοποίηση της MuSK ούτε η φωσφορυλίωση του AChR αρκούν για την AChR συνάθροιση, δηλώνοντας ότι η φωσφορυλίωση του AChR δεν είναι το γεγονός-κλειδί που θα προκαλέσει την AChR συνάθροιση και το σχηµατισµό της νευροµυϊκής σύναψης. Μελέτες επικεντρώνονται στη συµµετοχή της ακτίνης στη διεργασία της συσσωµάτωσης του AChR. Η διέγερση της αγκρίνης οδηγεί σε πολυµερισµό της ακτίνης και µετατόπιση της ρυθµιστικής της ακτίνης πρωτεΐνης, της κορτακτίνης (cortactin), σε µετασυναπτικές θέσεις (Dai et al, 2000). Επιπλέον, η λατρουνκουλίνη Α (latrunculin A), ένας αναστολέας του πολυµερισµού ακτίνης, µπλοκάρει την επαγόµενη από αγκρίνη συνάθροιση του AChR σε µυϊκά κύτταρα (Dai et al, 2000). Οι GTPάσες Rac/Cdc42, δύο µικρές GTPάσες, που ρυθµίζουν την οργάνωση της ακτίνης, απαιτούνται για την επαγόµενη από αγκρίνη συνάθροιση του AChR σε µυϊκά κύτταρα (Weston et al, 2000). Η πρόσφατη ανακάλυψη αρκετών αγωνιστών της MuSK έχει φωτίσει τα µοριακά γεγονότα στον καταρράκτη της ενεργοποίησης της MuSK από την αγκρίνη (εικ. 5). Αρκετοί από αυτούς τους αγωνιστές ενέχονται στην οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Επιπροσθέτως της δραστηριότητας κινάσης της MuSK, µια δραστηριότητα διαφορετική από αυτήν ενός υποδοχέα κινάσης Tyr (nonreceptor tyrosine kinase, NRTK), στον καταρράκτη της MuSK, είναι απαραίτητη για την AChR συνάθροιση. Ο Pendergast και συν. (Finn et

25 25 al, 2003) υπέθεσαν ότι οι Abelson κινάσες Tyr (Abl) έχουν ρόλο στο σχηµατισµό της σύναψης και ανέφεραν την απαίτηση αυτών των πρωτεϊνών στην επαγόµενη από αγκρίνη AChR συνάθροιση in vitro. Οι Abl κινάσες ρυθµίζουν την οργάνωση της ακτίνης (Pendergast et al, 2002) και εντοπίζονται στη µετασυναπτική µεµβράνη της αναπτυσσόµενης νευροµυϊκής σύναψης. Οι συγγραφείς πρότειναν ότι οι Abl κινάσες ενισχύουν το αρχικό σήµα και τη συνάθροιση του AChR µέσω φωσφορυλιώσεων Tyr και σταθεροποιούν τις συναθροίσεις (Finn et al, 2003). Εικόνα 5: Σηµατοδοτικό µονοπάτι της MuSK. Η εξωκυττάρια περιοχή της MuSK περιλαµβάνει θέσεις δέσµευσης για την αγκρίνη (µε τη βοήθεια της MASC) και τη RATL. Οι αγωνιστές Abl, GGT και Dvl, αλληλεπιδρώντας µε τη MuSK, ενεργοποιούν τη Rac/Cdc42, οδηγώντας σε αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού ακτίνης και συσσωµάτωση του AChR, πιθανώς µέσω του APC. Η πρωτεΐνη-οδηγός MAGI-1c, που συνδέεται στην καρβοξυτελική περιοχή της MuSK, συγκεντρώνει πολλαπλά, µη αναγνωρισµένα ακόµα, υποσυναπτικά σηµατοδοτικά µόρια. Τελικά, η πρωτεΐνη γ ρυθµίζει τη συναπτική γονιδιακή έκφραση µέσω αναστολής των MAPK-PI3K σηµατοδοτικών µονοπατιών. Η Dvl δεσµεύεται τόσο στην παραµεµβρανική περιοχή, όσο και στην περιοχή κινάσης της MuSK. Η Dvl αλληλεπιδρά, επίσης, µε την κινάση Ser/Thr PAK1, η οποία ενεργοποιείται σε µυϊκά κύτταρα σε απόκριση στην αγκρίνη. Η PAK1 είναι αγωνιστής των Rac/Cdc42 στην αναδιοργάνωση της ακτίνης.

26 26 Άλλο ένα σηµαντικό σηµατοδοτικό συστατικό στο µονοπάτι αγκρίνη/musk είναι η γερανυλο-γεράνυλο-τρανσφεράση 1 (geranylgeranyltransferase 1, GGT). Πειράµατα έδειξαν ότι η α υποµονάδα της GGT αλληλεπιδρά µε την περιοχή κινάσης της MuSK (Luo et al, 2003). Η αγκρίνη προκαλεί ταχεία αύξηση στη φωσφορυλίωση Tyr της GGT και η αναστολή είτε της έκφρασης της GGT είτε της δραστηριότητας της GGT εµποδίζει τα µυϊκά κύτταρα απ το να σχηµατίσουν συναθροίσεις AChR σε απόκριση στην αγκρίνη. Υπάρχουν ενδείξεις για ρύθµιση της συνάθροισης του AChR από την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη APC (Adenomatous Polyposis Coli), µια πρωτεΐνη που δεσµεύει ακτίνη (Wang et al, 2003). Η APC πρωτεΐνη έχει βρεθεί σε αρκετά υποκυτταρικά διαµερίσµατα, όπως το κυτταρόπλασµα και ο πυρήνας. Η APC εντοπίζεται µαζί µε τους AChRs στη µετασυναπτική µεµβράνη της νευροµυϊκής σύναψης και αλληλεπιδρά άµεσα µε τη β-υποµονάδα των AChRs, βοηθώντας τους να βρεθούν στον κυτταροσκελετό ακτίνης. Η πρωτεΐνη-οδηγός, MAGI-1c, έχει αναγνωριστεί ως σύντροφος της MuSK στη µετασυναπτική µεµβράνη των ηλεκτρικών κυττάρων του Torpedo (Strochlic et al, 2001). Η MAGI-1c είναι ένα µέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών-οδηγών MA- GUK, οι οποίες ενέχονται στην οργάνωση της µεταγωγής σήµατος στις κυτταρικές συνάψεις. Όπως συµβαίνει και µε άλλες MAGUKs που σχετίζονται µε συνάψεις, έτσι και η MAGI-1c αποτελείται από αρκετές περιοχές αλληλεπίδρασης πρωτεΐνηςπρωτεΐνης, µεταξύ των οποίων και µία περιοχή γουανυλικής κινάσης. Καθεµιά από τις περιοχές αυτές συµβάλλει στην ειδική σύνδεση µε µια µεγάλη οµάδα σηµατοδοτικών, δοµικών και κυτταροσκελετικών στοιχείων. Η MAGI-1c εντοπίζεται στις χολινεργικές συνάψεις του ηλεκτρικού κυττάρου του Torpedo και στις νευροµυϊκές συνάψεις ενήλικων αρουραίων. Η NRG, δρώντας µέσω των ErbB υποδοχέων µε δράση κινάσης Tyr στη µετασυναπτική µεµβράνη, ενεργοποιεί τη συναπτική γονιδιακή µεταγραφή διαµέσου των µονοπατιών µεταγωγής σήµατος της πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από µιτογόνα (Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK), της c-jun NH 2 -terminal kinase (JNK) και της κινάσης της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (Phosphatidyl Inositol-3 Kinase, PI3K) (εικόνα 6).

27 27 Εικόνα 6: Μεταγραφική ρύθµιση γονιδίων στη νευροµυϊκή σύναψη. Οι υποδοχείς µε δράση κινάσης Tyr ErbB 2/4 και η MuSK διεγείρουν αρκετούς σηµατοδοτικούς καταρράκτες, οι οποίοι συνεργάζονται, ώστε να ξεκινήσει η µεταγραφική ενεργοποίηση των συναπτικών γονιδίων στους υποσυναπτικούς πυρήνες. Η ενεργοποίηση των ErbB υποδοχέων από τη NRG διεγείρει τα µονοπάτια MAPK και JNK µέσω του Ras. Το γεγονός αυτό οδηγεί στην έκφραση του c-jun και στη φωσφορυλίωση του µεταγραφικού παράγοντα GABP, ο οποίος θα ενεργοποιήσει τη µεταγραφή ειδικών της σύναψης γονιδίων. Επίσης, η MuSK επάγει ενεργοποίηση της JNK µέσω του Rac/Cdc42, δηλώνοντας ότι τα 2 µονοπάτια συνδέονται. Ανασταλτικοί παράγοντες, όπως η ερµπίνη και η SHP2, καθώς και η γ, που αλληλεπιδρά µε τη MuSK, απενεργοποιούν το σηµατοδοτικό µονοπάτι του ErbB. Το ερωτηµατικό επισηµαίνει µια πιθανή ρύθµιση της αλληλεπίδρασης µεταξύ γ και MuSK από ένα ακόµα άγνωστο σήµα, το οποίο είτε δρα στη MuSK είτε σε άλλο σηµατοδοτικό µόριο. ύο αρνητικοί ρυθµιστές του µονοπατιού NRG/ErbB, η φωσφατάση Tyr SHP2 και η ερµπίνη, έχουν αναγνωριστεί. Η SHP2 αποφωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί τους ErbB υποδοχείς στη µετασυναπτική µεµβράνη µετά τη διέγερση από NRG. Η ερµπίνη συνδέεται µε την καρβοξυτελική περιοχή της ErbB2 και

28 28 ελαττώνει το σηµατοδοτικό καταρράκτη της MAPK, ο οποίος διεγείρεται από τη NRG, µέσω απενεργοποίησης του Ras (Huang et al, 2003). Εκτός του µονοπατιού NRG/ErbB, αρκετές µελέτες έδειξαν έναν ρόλο για την αγκρίνη και τη MuSK στη ρύθµιση της συναπτικής γονιδιακής µεταγραφής. Η αγκρίνη των νεύρων ή η MuSK διεγείρουν τη µεταγραφή των γονιδίων του AChR. Πρόσφατα, ο Brenner και συν. έδειξαν ότι η επαγόµενη από την αγκρίνη µεταγραφή του γονιδίου της MuSK ελέγχεται εν µέρει από το µονοπάτι NRG/ErbB και από έναν νέο παράπλευρο δρόµο, στον οποίο η MuSK διεγείρει την ενεργοποίηση των Rac και JNK (Lacazette et al, 2003). Με αυτά τα δεδοµένα, η MuSK φαίνεται να ενέχεται όχι µόνο στη συνάθροιση του AChR, αλλά και στη ρύθµιση της έκφρασης των συναπτικών γονιδίων. Σε µια συστηµατική έρευνα για συντρόφους της MuSK, ο Cartaud και συν. αναγνώρισαν την πρωτεΐνη γ σε µετασυναπτική µεµβράνη από τα ηλεκτρικά κύτταρα του Torpedo. Η πρωτεΐνη γ εντοπίζεται µαζί µε τον AChR στη νευροµυϊκή σύναψη από µύες αρουραίων. Οι πρωτεϊνες συνιστούν µια αναδυόµενη οικογένεια σηµατοδοτικών µορίων, που βρίσκονται στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς και ενέχονται στο ενδοκυττάριο σήµα (Van Hemert et al, 2001). Μεταξύ των πολλών λειτουργιών στην κυτταρική σηµατοδότηση, οι πρωτεϊνες είναι µείζονες ρυθµιστές των σηµατοδοτικών µονοπατιών της MAPK και της PI3K. Υπερέκφραση της γ σε µυϊκά κύτταρα καταστέλλει ειδικά τη µεταγραφή αρκετών συναπτικών γονιδίων, όπως αυτών που κωδικοποιούν τις α-, δ-, ε-υποµονάδες του AChR, τη ραψίνη και τη MuSK. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η MuSK µπορεί να χρησιµεύει ως οδηγός, ώστε να συγκεντρωθεί η γ κοντά στη µετασυναπτική µεµβράνη. Σε πολλές περιπτώσεις, η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών µε άλλες πρωτεϊνες ρυθµίζεται από τη φωσφορυλίωση καταλοίπων Ser σε οµόφωνες αλληλουχίες στις πρωτεϊνες-στόχους (Muslin et al, 1996). Έχει δειχθεί ότι η αγκρίνη αλληλεπιδρά µε µια ποικιλία εξωκυττάριων πρωτεϊνών, όπως α-δυστρογλυκάνη, ιντεγκρίνες, Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM), αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών τύπου 2 (Fibroblast Growth Factor-2, FGF-2), ηπαρίνη και γλυκοσυµπλέγµατα. Οι 2 πιο εκτεταµένα µελετηµένες πρωτεϊνες που δεσµεύουν αγκρίνη είναι η λαµινίνη και η α-δυστρογλυκάνη. Έχει δειχθεί ότι η λαµινίνη προκαλεί AChR συνάθροιση (Montanaro et al, 1998). Η λαµινίνη δεν επάγει φωσφορυλίωση της

29 29 MuSK, ούτε της β-υποµονάδας του AChR και, αντίθετα από την αγκρίνη, µπορεί να επάξει συνάθροιση σε µυϊκά κύτταρα, που στερούνται MuSK. Τα επαγόµενα από λαµινίνη AChR συσσωµατώµατα σχηµατίζονται πιο αργά σε σχέση µε τα αντίστοιχα που επάγονται από αγκρίνη και η συνάθροιση έχει παρατηρηθεί µόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις λαµινίνης, περίπου nmoles/lt, σε σχέση µε τα 100 pmoles/lt µε 1 nmole/lt, για την αγκρίνη (Sugiyama et al, 1997). Η α-δυστρογλυκάνη είναι η πιο άφθονη δεσµευτική της αγκρίνης πρωτεΐνη στη νευροµυϊκή σύναψη και συναθροίζεται µαζί µε τον AChR. Πρόσφατα γενετικά πειράµατα, καθώς και βιοχηµικές µελέτες, έχουν δείξει ότι η δέσµευση της αγκρίνης στην α-δυστρογλυκάνη δεν απαιτείται, για ν αρχίσει η συνάθροιση των AChRs. Ο AChR και η MuSK αποτελούν στόχους αντισωµάτων σε 2 αυτοάνοσες ασθένειες, τη Βαριά Μυασθένεια (Myasthenia Gravis, MG) και τη Μυασθένεια µε αντι-musk αντισώµατα (MuSK Myasthenia Gravis, MuSK-MG), αντίστοιχα. Για το λόγο αυτόν, κρίνεται σκόπιµο να γίνει µια σύντοµη επισκόπηση του ανοσολογικού συστήµατος στο σηµείο αυτό. I.V Ανοσολογικό σύστηµα Είµαστε διαρκώς εκτεθειµένοι σε µια µεγάλη ποικιλία βακτηρίων, ιών και παρασίτων, πολλά από τα οποία θα είχαν αναπτυχθεί µέσα στα κύτταρα και στα εξωκυτταρικά υγρά του σώµατός µας, αν δεν υπήρχε το ανοσολογικό σύστηµα. Είναι αξιοσηµείωτο ότι είµαστε, συχνά, σε θέση να αµυνθούµε εναντίον οργανισµών που ποτέ δεν είχαµε συναντήσει προηγουµένως. Καθοριστικό στοιχείο είναι η ικανότητά µας να παράγουµε περισσότερα από 10 8 διαφορετικά αντισώµατα και περισσότερους από αντιγονικούς υποδοχείς Τ-λεµφοκυττάρων. Μετά από συγκεκριµένο ερέθισµα, ακολουθεί η ανοσολογική απάντηση. Αυτή ξεκινά µε την επαφή µε το αντιγόνο. Το αντιγόνο είναι ένα ξένο µακροµόριο, το οποίο δεσµεύεται επιλεκτικά σε ένα αντίσωµα. Το αντιγόνο αναγνωρίζεται από έναν υποδοχέα, µε τον οποίο ταιριάζει απόλυτα. Αν αυτός ο υποδοχέας βρίσκεται σε διάλυµα και όχι πάνω σε µεµβράνη, ονοµάζεται αντίσωµα. ηλαδή, στη χυµική ανοσοαπόκριση, διαλυτές πρωτεϊνες, που ονοµάζονται αντισώµατα ή ανοσοσφαιρίνες, λειτουργούν ως στοιχεία αναγνώρισης, τα οποία προσδένονται σε ξένα µόρια. Τα αντισώµατα εκκρίνονται από τα πλασµατοκύτταρα, τα οποία προέρχονται από Β-λεµφοκύτταρα. Επειδή όλα τα αντισώµατα και τα περισσότερα αντιγόνα είναι µακροµόρια, το απόλυτο ταίριασµα των δύο γίνεται σε µια µικρή

30 30 περιοχή, το πολύ 12 αµινοξέων ή µερικών µορίων σακχάρου. Οι περιοχές αυτές, στα αντιγόνα, ονοµάζονται επίτοποι, ενώ, στα αντισώµατα, παράτοποι. Με άλλα λόγια, η ειδική συγγένεια ενός αντισώµατος δεν αφορά ολόκληρο το µακροµοριακό αντιγόνο, αλλά µια συγκεκριµένη θέση στο αντιγόνο, που λέγεται επίτοπος. Στην κυτταρική ανοσοαπόκριση, κύτταρα που ονοµάζονται Τ-κυτταροτοξικά λεµφοκύτταρα θανατώνουν κύτταρα που εµφανίζουν ξένα µοτίβα στην επιφάνειά τους. Μια άλλη κατηγορία είναι τα Τ-βοηθητικά λεµφοκύτταρα, που συµµετέχουν τόσο στη χυµική, όσο και στην κυτταρική ανοσία, διεγείροντας τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασµό των κατάλληλων Β-κυττάρων και των Τ-κυτταροτοξικών κυττάρων. Η κυτταρική ανοσοαπόκριση διεκπεραιώνεται από ειδικούς υποδοχείς, που βρίσκονται στις επιφάνειες των Τ-κυττάρων. Το ανοσολογικό σύστηµα αποτελείται από περίπου λεµφοκύτταρα. Τα λεµφοκύτταρα προέρχονται από διαφοροποίηση των αρχέγονων κυττάρων του µυελού των οστών και ανανεώνονται συνεχώς, ενώ-ταυτόχρονα-µεγάλος αριθµός καταστρέφεται συνεχώς. Τα κύτταρα αυτά κυκλοφορούν µε το αίµα και τη λέµφο και έρχονται σε επαφή µε κύτταρα στο θύµο, το σπλήνα, τους λεµφαδένες, το δέρµα και τους βλεννογόνους. Επικοινωνούν µεταξύ τους και µε τα άλλα κύτταρα µέσω µορίων προσκόλλησης, όπως λεµφοκίνες, κυτταροκίνες, τα οποία προσκολλώνται σε ειδικούς υποδοχείς άλλων κυττάρων και εκεί απελευθερώνουν σήµατα. ιακρίνονται 2 κύριοι τύποι λεµφοκυττάρων: τα Β-κύτταρα και τα Τ-κύτταρα. Από χηµική άποψη, οι υποδοχείς των Β-κυττάρων είναι σφαιρίνες και, έτσι, ονοµάζονται ανοσοσφαιρίνες (immunoglobulins). Υπάρχουν διάφορες τάξεις και υποτάξεις ανοσοσφαιρινών, όµως, κατά βάση, έχουν όλες την ίδια δοµή. Κάθε µονοµερές ανοσοσφαιρίνης αποτελείται από 2 ίδιες ελαφρές αλυσίδες (light chain, L) και 2 ίδιες βαριές αλυσίδες (heavy chain, H). Οι ελαφρές αλυσίδες υπάρχουν σε 2 παραλλαγές: λ και κ. Οι βαριές αλυσίδες υπάρχουν σε 5 παραλλαγές: α, δ, ε, γ,µ. Ανάλογα µε το ποια βαριά αλυσίδα υπάρχει, οι τάξεις των ανοσοσφαιρινών ονοµάζονται αντίστοιχα: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Στις ανοσοσφαιρίνες IgA και IgM, η παραπάνω απλή δοµή µπορεί να απαντάται στο διπλάσιο ή το πενταπλάσιο (ως διµερές ή πενταµερές). (πίνακας 1).