Καραπέτσας Θανάσης. Διπλωματική Εργασία:

HTML
DOWNLOAD

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Καραπέτσας Θανάσης. Διπλωματική Εργασία:"

Εὐκλείδης Κασιδιάρης
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Διαπανεπιστημιακό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Κλινική Φαρμακολογία & Θεραπευτική» Επιβλέπων: Δρ. Αλ. Γαλάνης, Λέκτορας Μορ. Βιολογίας, «Σχεδιασμός Ειδικών Πεπτιδίων Αναστολέων της Αλληλεπίδρασης του Μεταγραφικού Παράγοντα HIF-α με τις ΜΑΡ Κινάσες με Πιθανές Φαρμακολογικές Εφαρμογές» Τμήμα Μοριακής Βιολογίας & Γενετικής, Δ.Π.Θ. Διπλωματική Εργασία: Καραπέτσας Θανάσης Αλεξανδρούπολη 200

2 Υποξία και HIF- Υποξία: Χαμηλά επίπεδα οξυγόνου σε ένα κύτταρο, ιστό, όργανο. Παρατηρείται σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις (π.χ. εμβρυογένεση, καρκίνος κ.α.). HIF- (Hypoxia Inducible Factor-): Βασικός ρυθμιστής της κυτταρικής απόκρισης στην υποξία. Ν- HIF-α HIF-β Ο HIF- ενεργοποιεί τη μεταγραφή γονιδίων που σχετίζονται με τη γλυκόλυση (π.χ.glut), την αγγειογένεση (π.χ.vegf), την ερυθροποίηση (π.χ.epo) κ.α. Εμπλέκεται σε διάφορες ασθένειες. Σημαντικός θεραπευτικός στόχος.

3 Ρύθμιση του HIF-α Διάφορες άλλες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (π.χ. φωσφορυλίωση) επηρεάζουν τη σταθερότητα και τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-α.

HIF-α και ΜΑΡ κινάσες Η υπομονάδα HIF-α αποτελεί στόχο

πυρήνα και αύξηση της ενεργότητάς του (Mylonis et al 2008).

4 HIF-α και ΜΑΡ κινάσες Η υπομονάδα HIF-α αποτελεί στόχο φωσφορυλίωσης από τις ΜΑΡ κινάσες (Richard et al 999, Minet et al 2000, Sodhi et al 200). Ο ΗIF-α φωσφορυλιώνεται από τη ΜΑΡ κινάση ERK στις θέσεις Ser64 και Ser643 (Mylonis et al 2006). Αυτή η φωσφορυλίωση οδηγεί σε συσσώρευση του HIF-α στον πυρήνα και αύξηση της ενεργότητάς του (Mylonis et al 2008). Αναστολείς των ΜΑΡ κινασών, (π.χ.pd98059) προκαλούν μείωση της μεταγραφικής ενεργότητας του HIF-α (Semenza 2002).

5 Στόχος Μελέτης Οι ΜΑΡ κινάσες φωσφορυλιώνουν τους στόχους τους μέσω αλληλεπίδρασης με συγκεκριμένες περιοχές των υποστρωμάτων (μοτίβα συναρμογής). Ανίχνευση της αλληλεπίδρασης HIF-α - ΜΑΡ κινάση και ταυτοποίηση της περιοχής αλληλεπίδρασης. Σχεδιασμός πεπτιδίων που θα αναστέλλουν την αλληλεπίδραση HIF-α ΜΑΡΚ.

Α. Κλωνοποίηση, Έκφραση, Απομόνωση και Καθαρισμός του HIF-α bhlh και των N-TADαμινοτελικών C-TAD και καρβοξυτελικών ελλειμμάτων του PAS ODD -HIF-α -826 826 bhlh PAS N-TAD ODD 66 C-TAD 826 -HIF-α

6 Α. Κλωνοποίηση, Έκφραση, Απομόνωση και Καθαρισμός του HIF-α bhlh και των N-TADαμινοτελικών C-TAD και καρβοξυτελικών ελλειμμάτων του PAS ODD -HIF-α bhlh PAS N-TAD ODD 66 C-TAD 826 -HIF-α HIF-α HIF-α kda 75 kda 40 kda * * * * * οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες -HIF-α HIF-α Protein ladder 2. -HIFα(-826) 3. -HIFα(-66) 4. -HIFα( ) 5. -HIFα(200-66) 6. 0,5μg 7. μg BSA 8. 5μg

7 Α2. Κλωνοποίηση, Έκφραση, Απομόνωση και Καθαρισμός της ΜΑΡ κινάσης ERK2 FLAG peptide ERK kda. Protein ladder 50 kda 40 kda * * 2. 6xHis ERK2 3. 0,5μg 4. μg BSA 5. 2μg 20 kda Coomassie W.B.: anti- FLAG * οι ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες

Β. Μελέτη αλληλεπίδρασης του -HIFα με την 6xHis ERK2 ERK2 Δοκιμή Κατακρήμνισης (Pull Down Assay) μg 6xHis ERK2 2μg 6xHis ERK2 5μg 6xHis ERK2 0μg 6xHis ERK2 prey prey WB: anti-flag prey

8 Β. Μελέτη αλληλεπίδρασης του -HIFα με την 6xHis ERK2 ERK2 Δοκιμή Κατακρήμνισης (Pull Down Assay) μg 6xHis ERK2 2μg 6xHis ERK2 5μg 6xHis ERK2 0μg 6xHis ERK2 prey prey WB: anti-flag prey prey non-specific binding non-specific binding ERK2 Ο HIF-α αλληλεπιδρά άμεσα και ισχυρά με τη ΜΑΡ κινάση ERK2. prey non-specific binding Input:0% 50mM NaCl 300mM NaCl 450mM NaCl WB: anti-flag

Γ. Εντοπισμός της περιοχής αλληλεπίδρασης του -HIFα με την ERK2 bhlh PAS N-TAD ODD C-TAD 826 -HIF-α -826 bhlh PAS N-TAD ODD 66 C-TAD 826 -HIF-α -826-66 200 66 66 200 66 703 -HIF-α -66 200-66 -HIF-α

9 Γ. Εντοπισμός της περιοχής αλληλεπίδρασης του -HIFα με την ERK2 bhlh PAS N-TAD ODD C-TAD 826 -HIF-α -826 bhlh PAS N-TAD ODD 66 C-TAD 826 -HIF-α HIF-α HIF-α Στην αλληλεπίδραση του HIF-α με την ERK2 συμμετέχουν δυο ξεχωριστές περιοχές HIF-α HIF-α -Elk ERK W.B. anti-flag. Input: 0% 5. -HIFα(200-66) HIFα( ) HIFα(-826) 4. -HIFα(-66) 6. -Elk(30-428) Elk-30

Δ. Μελέτη αλληλεπίδρασης του -HIFα με την 6xHis ERK2 με Φασματοσκοπία SPR

μεταξύ μακρομορίων (π.χ. πρωτεϊνών, DNA κ.λπ.

και K D ), συγγένειας αλληλεπίδρασης κ.α. Δεν απαιτείται σήμανση των μακρομορίων.

10 Δ. Μελέτη αλληλεπίδρασης του -HIFα με την 6xHis ERK2 με Φασματοσκοπία SPR (Surface Plasmon Resonance spectroscopy) Επιτρέπει τη μελέτη αλληλεπιδράσεων μεταξύ μακρομορίων (π.χ. πρωτεϊνών, DNA κ.λπ.) Υπολογισμός σε πραγματικό χρόνο (real time data) σταθερών κινητικής (k a, k d και K D ), συγγένειας αλληλεπίδρασης κ.α. Δεν απαιτείται σήμανση των μακρομορίων. Βασίζεται στη μεταβολή του δείκτη διάθλασης λόγω της αλληλεπίδρασης ή/και της διάστασης μακρομορίων. (πηγή:

Δ. Μελέτη αλληλεπίδρασης του -HIFα με την 6xHis ERK2 με Φασματοσκοπία SPR (Surface Plasmon Resonance spectroscopy) 50nm 50nm -HIFα -HIFα 6 5 4 3 2 4 5 6 3

11 Δ. Μελέτη αλληλεπίδρασης του -HIFα με την 6xHis ERK2 με Φασματοσκοπία SPR (Surface Plasmon Resonance spectroscopy) 50nm 50nm -HIFα -HIFα nM 6xHis ERK nM 6xHis ERK nM 6xHis ERK nM 6xHis ERK nM 6xHis ERK nM 6xHis ERK2 Ο HIF-α αλληλεπιδρά ισχυρά με την ERK2

Δ. Σχεδιασμός Πεπτιδίων Οι ΜΑΡ κινάσες 40 φωσφορυλιώνουν Χαρακτηριστικά: Βασικά 3-5 τους κατάλοιπα

60 40Στις περιοχές -200 και 66-826 Μοτίβα Συναρμογής: 20εντοπίζονται τα δύο NLS (Nuclear Localization

σε 0 βασικά κατάλοιπα Τα -826 δύο NLS -66είναι 200-66 πλούσια 200-826σε Elk-30 βασικά κατάλοιπα.

12 Δ. Σχεδιασμός Πεπτιδίων Οι ΜΑΡ κινάσες 40 φωσφορυλιώνουν Χαρακτηριστικά: Βασικά 3-5 τους κατάλοιπα στόχους 20 κατάλοιπα τους μέσω αλληλεπίδρασης με L-x-L 00 συγκεκριμένες περιοχές των 80 υποστρωμάτων Στις περιοχές -200 και Μοτίβα Συναρμογής: 20εντοπίζονται τα δύο NLS (Nuclear Localization Περιοχές Signal) πλούσιες του HIF-α. σε 0 βασικά κατάλοιπα Τα -826 δύο NLS -66είναι πλούσια σε Elk-30 βασικά κατάλοιπα. ακολουθούμενες από το μοτίβο L-x-L. Χαρακτηριστικά: Βασικά κατάλοιπα Σχεδιασμός πεπτιδίων: Μη τυπικά μοτίβα πρόσδεσης 3-5 κατάλοιπα L-x-L ΝH 2 - ERRKEKSRDAARSRRSKE COOH ΝH 2 - LQNAQRKRKMEHD -COOH

13 Συμπερασματικά: Ο HIF-α αλληλεπιδρά άμεσα και με μεγάλη συγγένεια με την MAP κινάση ERK2. Στην αλληλεπίδραση συμμετέχουν δυο ανεξάρτητες περιοχές του HIF-α. Σε αυτές τις περιοχές εντοπίζονται τα δύο NLS, πλούσια σε βασικά κατάλοιπα. Ο σχεδιασμός των πεπτιδίων έγινε με βάση τα NLS. Μελλοντικοί στόχοι Μελέτη της επίδρασης των πεπτιδίων in vitro και in vivo.

Βιολογίας & Γενετικής, Δ.Π.Θ. Μαρία Παυλάκη, PhD. Senior Scientist, C.I.B.I.T.

14 Επιβλέπων: Γαλάνης Αλέξης, Λέκτορας Μορ. Βιολογίας, Τμήμα Μορ. Βιολογίας & Γενετικής, Δ.Π.Θ. Ευχαριστίες Ραφαήλ Σανδαλτζόπουλος, Αναπλ. Καθηγητής Μορ. Βιολογίας, Τμήμα Μορ. Βιολογίας & Γενετικής, Δ.Π.Θ. Μαρία Παυλάκη, PhD. Senior Scientist, C.I.B.I.T. Facility, Τμήμα Μορ. Βιολογίας & Γενετικής, Δ.Π.Θ. Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Μοριακής Βιολογίας & Γενετικής, Δ.Π.Θ.

Σχετικά έγγραφα

ΕΞΩΤΕΡΙΚΕΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ Β ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ

ΕΞΩΤΕΡΙΚΕΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ Β ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ 2019-2020 A/A: 6 «Επίπεδα mirnas και δείκτες παχυσαρκίας σε πληθυσμό ενηλίκων» ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΘΕΜΑΤΟΣ: Θα μετρηθούν τα επίπεδα mirnas στο πλάσμα εθελοντών