PNA ISH Detection Kit

Transcript

1 PNA ISH Detection Kit Αρ. κωδικού K5201 9η έκδοση Για υβριδίωση in situ µε συζευγµένους µε φθορισεΐνη ανιχνευτές PNA. Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για 40 εξετάσεις* τουλάχιστον. * Ο αριθµός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 25 µl ανιχνευτών και 150 ml άλλων αντιδραστηρίων ανά αντικειµενοφόρο πλάκα. ( ) P04101GR_01_K / σελ. 1/10

2 Περιεχόµενα Σελίδα Χρήση για την οποία προορίζεται... 3 Αρχή της διαδικασίας... 3 Αντιδραστήρια... 3 A. Παρεχόµενα υλικά... 3 B. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται... 4 Γ. Παρασκευή των αντιδραστηρίων... 4 Προφυλάξεις... 5 Φύλαξη... 6 ιαδικασία υβριδίωσης in situ µίας ηµέρας για ανίχνευση του RNA µε χρήση ανιχνευτών PNA... 7 Επανενυδάτωση... 8 Προεπεξεργασία... 8 Υβριδίωση... 8 Στυπτική πλύση... 8 Ανίχνευση... 8 Επίχρωση και στερέωση... 9 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία... 9 ( ) P04101GR_01_K / σελ. 2/10

3 Χρήση για την οποία προορίζεται Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το PNA ISH Detection Kit προορίζεται για τον εντοπισµό συζευγµένων µε φθορισεΐνη ανιχνευτών πεπτιδικού νουκλεϊκού οξέος (Peptide Nucleic Acid, PNA) υβριδιωµένους στο RNA-στόχο τους, σε σκευάσµατα κυττάρων ή ιστών. Αρχή της διαδικασίας Το κιτ αυτό παρέχει στο χρήστη όλα τα αντιδραστήρια που χρειάζονται για την εκτέλεση υβριδίωσης in situ για τον εντοπισµό κυτταρικού RNA, εκτός από τον ειδικό συζευγµένο µε φθορισεΐνη ανιχνευτή PNA. Σε τοµή ιστού ή επίχρισµα κυττάρων (που παρέχονται από το χρήστη), ο συζευγµένος µε φθορισεΐνη ανιχνευτής PNA υβριδιώνεται στο RNA-στόχο του, σύµφωνα µε τη διαδικασία που περιγράφεται κατωτέρω. Η υβριδίωση ακολουθείται από πλύση µε διάλυµα στυπτικής πλύσης στους 55 C επί 25 λεπτά. Κατόπιν, προστίθεται αντι-fitc κουνελιού F(ab ) συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση, το δείγµα επωάζεται σε θερµοκρασία δωµατίου επί 30 λεπτά και ακολουθεί πλύση. Η χρήση του τµήµατος αντισώµατος F(ab ) διασφαλίζει ότι η µη ειδική σύνδεση µε το δείγµα διατηρείται στο ελάχιστο δυνατό. Κατόπιν, προστίθεται υπόστρωµα (ενζυµικό υπόστρωµα, BCIP/ NBT), το δείγµα επωάζεται σε θερµοκρασία δωµατίου επί λεπτά και ακολουθεί πλύση. Η ελαφρή επίχρωση µε αιµατοξυλίνη είναι προαιρετική. Τέλος, το δείγµα στερεώνεται. Η θετική χρώση αναγνωρίζεται στο µικροσκόπιο ως σκούρο µπλε/ µαύρο χρώµα στην περιοχή της υβριδίωσης. Αντιδραστήρια A. Παρεχόµενα υλικά Φιαλίδιο υπ' αριθµ. 1 (2 ml) Πρωτεϊνάση K (x 10) 10 φορές συµπυκνωµένη πρωτεϊνάση K σε Tris/HCl 50 mmol/l, αζίδιο νατρίου 15 mmol/l, µε ph 7,5. Επειδή η πρωτεϊνάση K είναι αυτο-αποδοµούµενη, είναι πολύ σηµαντικό να φυλάσσετε το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 1 στους 2-8 C. Φιαλίδιο υπ' αριθµ. 2 (0,5 ml) Ανιχνευτής PNA/FITC αρνητικού ελέγχου (έτοιµο για χρήση) Συζευγµένοι µε φθορισεΐνη τυχαίοι ανιχνευτές PNA σε διάλυµα υβριδίωσης. Περιέχει φορµαµίδιο 30%. Φιαλίδιο υπ' αριθµ. 3 (0,5 ml) Ανιχνευτής PNA/FITC θετικού ελέγχου (έτοιµο για χρήση) Συζευγµένος µε φθορισεΐνη ανιχνευτής PNA, κατευθυνόµενος προς την δεϋδρογενάση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης, σε διάλυµα υβριδίωσης. Περιέχει φορµαµίδιο 30%. Φιαλίδιο υπ' αριθµ. 4 (25 ml) ιάλυµα στυπτικής πλύσης (x 60) 60 φορές συµπυκνωµένο διάλυµα στυπτικής πλύσης. ( ) P04101GR_01_K / σελ. 3/10

4 Φιαλίδιο υπ' αριθµ. 5 (6 ml) Αντι-FITC/AP (έτοιµο για χρήση) Συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση αντίσωµα στη φθορισεΐνη (αποµονωµένο µε συγγένεια τµήµα F(ab ) κουνελιού). Σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris 50 mmol/l, MgCl 2 5 mmol/l, ZnCl 2 0,25 mmol/l, BSA 3%, σταθεροποιητή, συντηρητικό, µε ph 7,5. Φιαλίδιο υπ' αριθµ. 6 (6 ml) Υπόστρωµα (έτοιµο για χρήση) 5-βρωµο-4-χλωρο-3-ινδολυλοφωσφορικά (BCIP) και νιτροκυανό του τεραζολίου (NBT). Σε Tris 100 mmol/l, NaCl 100 mmol/l, MgCl 2 50 mmol/l, συντηρητικό, µε ph 9,0. Περιέχει N,N-διµεθυλοφορµαµίδιο 1,7%. TBS (αλατούχο διάλυµα ρυθµισµένο µε Tris, ph 7,5) 3 συσκευασίες λεπτού φύλλου, καθεµιά από τις οποίες παρασκευάζει ένα 1 λίτρο ρυθµιστικού διαλύµατος, ph 7,5. Κάθε συσκευασία περιέχει Tris-Base 1,4 g ± 4%, Tris/HCl 6,0 g ± 4%. 8,75 g NaCl ± 4%. ιαλύστε το περιεχόµενο κάθε συσκευασίας σε 1 λίτρο καθαρού νερού. B. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται 1. Γενικός εργαστηριακός εξοπλισµός για ιστολογικές εξετάσεις. 2. Εξοπλισµός και ειδικός συζευγµένος µε φθορισεΐνη ανιχνευτής PNA που απαιτείται για το στάδιο υβριδίωσης. 3. Υδατόλουτρο ρυθµισµένο στους 55 C. Για τη στυπτική πλύση, το υδατόλουτρο πρέπει να έχει τη δυνατότητα ανακίνησης. 4. Dako Silanized Slides, αρ. κωδικού S Dako Pen, αρ. κωδικού S2002 (προαιρετικό). 6. Καθαρό νερό (π.χ. νερό Milli-Q ή απεσταγµένο). 7. Μέσο στερέωσης, Dako Faramount, αρ. κωδικού S3025, ή Dako Glycergel, αρ. κωδικού C0563. Γ. Παρασκευή των αντιδραστηρίων Ρυθµιστικό διάλυµα TBS ιαλύστε το περιεχόµενο µίας συσκευασίας TBS σε 1 L καθαρού νερού. ιάλυµα στυπτικής πλύσης (διάλυµα εργασίας) Αραιώστε τον απαιτούµενο όγκο διαλύµατος στυπτικής πλύσης από το φιαλίδιο υπ' αριθµ φορές σε καθαρό νερό και προθερµάνετε στους 55 C σε υδατόλουτρο. Πρωτεϊνάση K (διάλυµα εργασίας) Λίγο πριν από τη χρήση, αραιώστε την απαιτούµενη ποσότητα πρωτεϊνάσης K από το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 1 σε αναλογία 1:10 σε TBS. Αµέσως µετά τη χρήση, επαναφέρετε το φιαλίδιο 1 στους 2-8 C (βλ. Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία, 3). ( ) P04101GR_01_K / σελ. 4/10

5 Προφυλάξεις 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Τα φιαλίδια υπ' αριθµ. 2 και 3, δηλ. οι ανιχνευτές PNA θετικού και αρνητικού ελέγχου, περιέχουν 25-<50% φορµαµίδιο και 1-<3% χλωριούχο νάτριο. Τα φιαλίδια υπ' αριθµ. 2 και 3, επισηµαίνονται: Κίνδυνος H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. H360 Μπορεί να βλάψει τη γονιµότητα ή το έµβρυο. P201 Εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. P202 Μην το χρησιµοποιήσετε πριν διαβάσετε και κατανοήσετε τις οδηγίες προφύλαξης. P281 Χρησιµοποιείτε µέσα ατοµικής προστασίας όταν απαιτείται. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. P264 Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. P308 + P313 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή πιθανής έκθεσης: Συµβουλευθείτε/Επισκεφθείτε γιατρό. P305 + P351 + P338 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. P337 + P313 Εάν δεν υποχωρεί ο οφθαλµικός ερεθισµός: Επισκεφθείτε γιατρό. P405 Φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 3. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 6, δηλ. το υπόστρωµα, περιέχει 1-<3% N,N-διµεθυλοφορµαµίδιο και 1-<3% τροµεταµόλη. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 6 επισηµαίνονται: Κίνδυνος H360 Μπορεί να βλάψει τη γονιµότητα ή το έµβρυο. H373 Μπορεί να προκαλέσει βλάβες στα όργανα ύστερα από παρατεταµένη ή επανειληµµένη έκθεση. P201 Εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. P202 Μην το χρησιµοποιήσετε πριν διαβάσετε και κατανοήσετε τις οδηγίες προφύλαξης. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. P260 Μην αναπνέετε ατµούς. P314 Επισκεφθείτε γιατρό εάν αισθανθείτε αδιαθεσία. P308 + P313 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή πιθανότητας έκθεσης: Συµβουλευθείτε/Επισκεφθείτε γιατρό. P405 Φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. ( ) P04101GR_01_K / σελ. 5/10

6 4. Οι συσκευασίες λεπτού φύλλου του TBS (αλατούχο διάλυµα ρυθµισµένο µε Tris, ph 7,5) περιέχει 25-<50% και 25-<50% τροµεταµόλη υδροχλωρική 2-αµινο-2-(υδροξυ- µεθυλο)προπανο-1,3-διόλη. Οι συσκευασίες λεπτού φύλλου του TBS φέρουν την εξής σήµανση: Varování H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. H315 Προκαλεί ερεθισµό του δέρµατος. H335 Μπορεί να προκαλέσει ερεθισµό της αναπνευστικής οδού. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. P271 Να χρησιµοποιείται µόνο σε ανοικτό ή καλά αεριζόµενο χώρο. P261 Aποφεύγετε να αναπνέετε σκόνη/αναθυµιάσεις/αέρια/σταγονίδια/ατµούς/εκνεφώµατα. P264 Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. P304 + P340 + P312 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ: Μεταφέρετε τον παθόντα στον καθαρό αέρα και αφήστε τον να ξεκουραστεί σε στάση που διευκολύνει την αναπνοή. Καλέστε το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή ένα γιατρό εάν αισθανθείτε αδιαθεσία. P302 + P352 + P ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ: Πλύνετε µε P363 άφθονο νερό και σαπούνι. Βγάλτε τα µολυσµένα ρούχα. Πλύνετε τα µολυσµένα ενδύµατα πριν τα ξαναχρησιµοποιήσετε. P337 + P313 Εάν δεν υποχωρεί ο οφθαλµικός ερεθισµός: Επισκεφθείτε γιατρό. P405 Φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 5. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 4, δηλ. το διάλυµα στυπτικής πλύσης, περιέχει τροµεταµόλη 3,6%. Στις συγκεντρώσεις του προϊόντος, η τροµεταµόλη δεν απαιτεί σήµανση κινδύνου. ιατίθεται δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (MSDS) για τους επαγγελµατίες χρήστες, µετά από σχετικό αίτηµα. 6. Τα φιαλίδια υπ' αριθµ. 1 και 5, δηλ. η πρωτεϊνάση K και το αντι-fitc/ap, περιέχουν αζίδιο του νατρίου ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου (NaN 3 ) είναι µια χηµική ουσία ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε τις υδραυλικές σωληνώσεις από µόλυβδο και χαλκό για το σχηµατισµό ιδιαίτερα εκρηκτικών συσσωρεύσεων αζιδίων µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων µετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις. 7. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 5, δηλ. το αντι-fitc/ap, περιέχει υλικό ζωικής προέλευσης. Όπως συµβαίνει µε οποιοδήποτε προϊόν που προέρχεται από βιολογικές πηγές, θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σωστές διαδικασίες χειρισµού. Φύλαξη Τα αντιδραστήρια του κιτ πρέπει να φυλάσσονται στους 2-8 C. Τα φιαλίδια 2 και 3 πρέπει να φυλάσσονται στο σκοτάδι. Μην τα χρησιµοποιείτε µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στο φιαλίδιο. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό οποιεσδήποτε συνθήκες εκτός από εκείνες που καθορίζονται, οι συνθήκες πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη. εν υπάρχουν εµφανείς ενδείξεις που υποδεικνύουν την αστάθεια του προϊόντος αυτού. Εποµένως, θα πρέπει να αναλύονται υλικά θετικού και αρνητικού ελέγχου ταυτόχρονα µε τα ( ) P04101GR_01_K / σελ. 6/10

7 δείγµατα των ασθενών. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το προϊόν, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία µας. Επειδή η πρωτεϊνάση K είναι αυτο-αποδοµούµενη, είναι πολύ σηµαντικό να φυλάσσετε το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 1 στους 2-8 C και να ελαχιστοποιείτε την έκθεσή του σε θερµοκρασία δωµατίου. ιαδικασία υβριδίωσης in situ µίας ηµέρας για ανίχνευση του RNA µε χρήση ανιχνευτών PNA Η διαδικασία αυτή έχει αναπτυχθεί για τοµές ιστών καθηλωµένες σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένες σε παραφίνη. Τα αντιδραστήρια που περιλαµβάνονται στο κιτ αυτό, καθώς και οι συνθήκες υβριδίωσης και πλύσης, έχουν προσαρµοστεί µε τρόπο ώστε να παρέχουν βέλτιστα αποτελέσµατα όταν χρησιµοποιούνται συζευγµένοι µε φθορισεΐνη ανιχνευτές PNA της Dako. Θα πρέπει να αναλύεται ένα υλικό θετικού ελέγχου ιστού ταυτόχρονα µε τα δείγµατα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλες οι επωάσεις γίνονται σε θερµοκρασία δωµατίου εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά. ( ) P04101GR_01_K / σελ. 7/10

8 Επανενυδάτωση Προεπεξεργασία Υβριδίωση Στυπτική πλύση Ανίχνευση Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες µε τις τοµές ιστών σε ξυλένιο Εµβαπτίστε σε αιθανόλη 99% Εµβαπτίστε σε αιθανόλη 96% Εµβαπτίστε σε καθαρό νερό. Το δοχείο πρέπει να µην περιέχει RNάση (βλ. Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία, 1) Σηµειώστε µε κύκλο το δείγµα µε στυλό Dako Pen, αρ. κωδικού S2002 Εµβαπτίστε σε καθαρό νερό Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε θάλαµο υγρασίας (χρησιµοποιήστε καθαρά γάντια) Ακριβώς πριν από τη χρήση, αραιώστε την απαιτούµενη ποσότητα πρωτεϊνάσης K (αρ. φιαλιδίου 1) σε αναλογία 1:10 σε TBS, π.χ. µε προσθήκη 11 σταγόνων από το φιαλίδιο αρ. 1 (ή 500 µl) σε 4,5 ml TBS (βλ. Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία, 2) Προσθέστε 150 µl αραιωµένης πρωτεϊνάσης K σε κάθε τοµή (βλ. Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία, 3) Αµέσως µετά τη χρήση, επανατοποθετήστε το φιαλίδιο αρ. 1 στους 2-8 C Επωάστε Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε καθαρό νερό Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε αιθανόλη 96% Στεγνώστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στον αέρα Προσθέστε 1-2 σταγόνες συζευγµένου µε φθορισεΐνη ανιχνευτή PNA στην τοµή ιστών. Σε ξεχωριστές τοµές, προσθέστε ανιχνευτές ελέγχου, δηλ. από τα φιαλίδια αρ. 2 και 3 Καλύψτε τις τοµές µε καλυπτρίδα Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε θάλαµο υγρασίας (για να αποτραπεί η ξήρανση των τοµών) Τοποθετήστε το θάλαµο υγρασίας σε µια µονάδα επώασης (βλ. Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία, 4) Προθερµάνετε το διάλυµα εργασίας του διαλύµατος στυπτικής πλύσης (περιεχόµενο φιαλιδίου αρ. 4 αραιωµένο σε αναλογία 1:60), στους 55 C σε υδατόλουτρο Αφαιρέστε τις καλυπτρίδες Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο προθερµασµένο διάλυµα εργασίας του διαλύµατος στυπτικής πλύσης Προσαρµόστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε θερµοκρασία δωµατίου µε σύντοµη εµβάπτιση σε TBS Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε θάλαµο υγρασίας Προσθέστε 2-3 σταγόνες αντι-fitc/ap, φιαλίδιο αρ. 5, σε κάθε τοµή Επωάστε Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε το αντίσωµα Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε TBS Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε καθαρό νερό Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε θάλαµο υγρασίας Προσθέστε 2-5 σταγόνες υποστρώµατος, από το φιαλίδιο αρ. 6, σε κάθε τοµή (βλ. Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία, 5) Επωάστε Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε το υπόστρωµα 2 x 5 λεπτά 2 x 3 λεπτά 2 x 3 λεπτά 3 λεπτά 2 x 3 λεπτά λεπτά 2 x 3 λεπτά ~ 10 δευτ. ~ 5 λεπτά 1,5 ώρα στους 55 C 25 λεπτά στους 55 C µε ανακίνηση 10 δευτ. 30 λεπτά 2 x 3 λεπτά 2 x 1 λεπτό λεπτά ( ) P04101GR_01_K / σελ. 8/10

9 Επίχρωση και στερέωση Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε νερό βρύσης Πραγµατοποιήστε επίχρωση µε αιµατοξυλίνη, εάν είναι επιθυµητό Στερεώστε σε Faramount, αρ. κωδικού S3025 ή Glycergel, αρ. κωδικού C0563, της Dako 5 λεπτά 5-10 δευτ. Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία 1. Από το σηµείο αυτό της διαδικασίας και έως την ολοκλήρωση της υβριδίωσης, είναι σηµαντικό να αποφευχθεί η µόλυνση των τοµών µε RNάσες και οι αντικειµενοφόροι πλάκες θα πρέπει να αγγίζονται µόνο µε καθαρά, αναλώσιµα γάντια. Τα υάλινα είδη πρέπει να καθίστανται ελεύθερα από RNάση µε επώαση στους 200 C καθ' όλη τη διάρκεια της προηγούµενης νύχτας. Άλλες µέθοδοι αδρανοποίησης της RNάσης σε διαλύµατα περιγράφονται στο Molecular cloning, a laboratory manual των Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (βλ. επίσης στην ενότητα Προφυλάξεις). 2. ιαλύστε το περιεχόµενο µίας συσκευασίας TBS σε 1 L καθαρού νερού (χωρίς RNάση). 3. Επειδή η πρωτεϊνάση K είναι αυτο-αποδοµούµενη, είναι πολύ σηµαντικό να φυλάσσετε το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 1 στους 2-8 C και να ελαχιστοποιείτε την έκθεσή του σε θερµοκρασία δωµατίου. Η βέλτιστη πρωτεολυτική αφοµοίωση ενδέχεται να ποικίλει µεταξύ διαφορετικών τεµαχίων ιστών. Σε κατεψυγµένες τοµές και κυτταροφυγόκεντρα (cytospin), η πρωτεϊνάση K πρέπει να αραιώνεται σε αναλογία µεγαλύτερη από 1:10. Ενδεικτικά, µπορείτε να αραιώσετε σε αναλογία 1:100-1:1000, ανάλογα µε την καθήλωση. 4. Έχει διαπιστωθεί ότι χρόνος επώασης 1,5 ώρας δίνει τη βέλτιστη ευαισθησία. Ωστόσο, ικανοποιητικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να επιτευχθούν µε µείωση του χρόνου επώασης στα λεπτά, ανάλογα µε την ποσότητα του στόχου που υπάρχει στο δείγµα. 5. Έχει διαπιστωθεί ότι το υπόστρωµα (BCIP/NBT), που περιλαµβάνεται στο PNA ISH Detection Kit, δίνει την ανώτατη ευαισθησία, αλλά πολύ ικανοποιητικά αποτελέσµατα δίνει επίσης το Dako New Fuchsin (αρ. κωδικού K0625). 6. Μην ανακινείτε το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 6 πριν από τη χρήση. Μερικές φορές, το υπόστρωµα σχηµατίζει ίζηµα το οποίο ενδέχεται να επηρεάσει τα αποτελέσµατα χρώσης, εάν το διάλυµα ανακινηθεί. ( ) P04101GR_01_K / σελ. 9/10

10 Υπόµνηµα συµβόλων Αριθµός καταλόγου Περιορισµοί θερµοκρασίας Αριθµός παρτίδας Κατασκευαστής In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Μακριά από το ηλιακό φως (Συµβουλευτείτε την ενότητα Φύλαξη ) Προσθέστε νερό Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Συµβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Περιεχόµενο επαρκές για «ν» εξετάσεις Ηµεροµηνία λήξης Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Παρασκευάζεται από την: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup ανία Τηλ Φαξ ( ) P04101GR_01_K / σελ. 10/10