TOP2A IQFISH pharmdx. Κωδικός K η έκδοση. Για in vitro διαγνωστική χρήση Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για 20 εξετάσεις.

Transcript

1 / TOP2A IQFISH pharmdx Κωδικός K5733 3η έκδοση Για in vitro διαγνωστική χρήση Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για 20 εξετάσεις. P04092GR_02/K σελ. 1/41

2 Περιεχόμενα Σελίδα ΕΛΛΗΝΙΚΑ... 3 Χρήση για την οποία προορίζεται... 3 Περίληψη και επεξήγηση... 3 Αρχή της διαδικασίας... 4 Αντιδραστήρια... 4 Παρεχόμενα υλικά... 4 Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται... 6 Προφυλάξεις... 6 Αποθήκευση... 9 Παρασκευή δειγμάτων... 9 Τομές εγκλεισμένες σε παραφίνη ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Α. Προετοιμασία των αντιδραστηρίων A.1 Διάλυμα προκατεργασίας A.2 Ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης A.3 Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης A.4 Σειρά διαλυμάτων αιθανόλης A.5 Διάλυμα πεψίνης B. Διαδικασία χρώσης B.1 Σημειώσεις σχετικά με τη διαδικασία B.2 Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση B.3 Πρωτόκολλο χρώσης Ποιοτικός έλεγχος Ερμηνεία της χρώσης Περιορισμοί Γενικοί περιορισμοί Χαρακτηριστικά απόδοσης Αναλυτική ευαισθησία Αναλυτική ειδικότητα Μελέτες ισχύος Επαναληψιμότητα Αναπαραγωγιμότητα Κλινική χρησιμότητα Πιλοτική μελέτη Μελέτη επιβεβαίωσης - DBCG 89D/TOP2A Σχεδιασμός μελέτης Στατιστική μεθοδολογία Αποτελέσματα Συζήτηση και συμπέρασμα Αντιμετώπιση προβλημάτων Παράρτημα Παράρτημα Παράρτημα Βιβλιογραφία Επεξήγηση συμβόλων P04092GR_02/K σελ. 2/41

3 ΕΛΛΗΝΙΚΑ Χρήση για την οποία προορίζεται Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το TOP2A IQFISH pharmdx έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση ενισχύσεων και διαγραφών (αλλαγές αριθμού αντιγράφων) του γονιδίου TOP2A με χρήση της τεχνικής in situ υβριδισμού με φθορισμό (FISH) σε μονιμοποιημένα με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα ανθρώπινου ιστού καρκίνου του μαστού. Οι διαγραφές και ενισχύσεις του γονιδίου TOP2A χρησιμεύουν ως δείκτης για την κακή πρόγνωση σε ασθενείς υψηλού κινδύνου με καρκίνο του μαστού. Η ενίσχυση του γονιδίου TOP2A που ανιχνεύεται από τη δοκιμασία TOP2A IQFISH pharmdx ενδείκνυται επίσης ως βοήθημα για την πρόβλεψη της επιβίωσης χωρίς υποτροπή σε ασθενείς υψηλού κινδύνου με καρκίνο του μαστού που λαμβάνουν αγωγή με συμπληρωματική χημειοθεραπεία με βάση την επιρουβικίνη. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας TOP2A IQFISH pharmdx προορίζονται για χρήση ως συμπλήρωμα των υπαρχόντων κλινικών και παθολογοανατομικών στοιχείων. Περίληψη και επεξήγηση Το γονίδιο TOP2A κωδικοποιεί το ένζυμο τοποϊσομεράση IIα (topo IIα), που καταλύει τη διάσπαση και επανένωση δίκλωνου DNA με αποτέλεσμα τη χαλάρωση των υπερελίκων DNA. Οι τοποϊσομεράσες τύπου II αποτελούν απαραίτητα ένζυμα που διαμετατρέπουν τοπολογικές μορφές του DNA καθιστώντας παροδικές δίκλωνες διασπάσεις στο σκελετό του DNA (1). Τα ένζυμα αυτά παίζουν σημαντικούς ρόλους σε πολλές θεμελιώδεις πυρηνικές διαδικασίες (2) μεταξύ των οποίων η αντιγραφή του DNA, η μεταγραφή, η δομή των χρωμοσωμάτων, η συμπύκνωση και ο διαχωρισμός (3). Το γονίδιο τοποϊσομεράσης IIα, το TOP2A, υπάρχει σε 2 αντίγραφα σε όλα τα φυσιολογικά διπλοειδή κύτταρα και εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 17q21 (4). Το γονίδιο TOP2A καλύπτει μια περιοχή περίπου 27,5 kb και περιέχει 35 εξόνια που κωδικοποιούν μια πρωτεΐνη 170 kda (5). Η πρωτεΐνη τοποϊσομεράση IIα έχει αναγνωριστεί ως δείκτης πολλαπλασιασμού, ενώ η έκφραση της τοποϊσομεράσης IIα διαφέρει στη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα καρκινικά κύτταρα (6). Η έκφραση της τοποϊσομεράσης IIα σε όγκους του μαστού συσχετίζεται με την έκφραση του Ki-67 (7-10). Δεν έχει διαπιστωθεί κάποια απλή σχέση για την τοποϊσομεράση IIα σε πρωτεϊνικό ή γονιδιακό επίπεδο (7, 9, 10). Μόνο το 20% των περιπτώσεων υπερέκφρασης της πρωτεΐνης τοποϊσομεράσης IIα παρουσιάζουν ενίσχυση του γονιδίου TOP2A αλλά, μεταξύ των περιπτώσεων ενίσχυσης του γονιδίου TOP2A, το 93% παρουσίασαν υπερέκφραση της πρωτεΐνης τοποϊσομεράσης IIα (11). Η υπερέκφραση της τοποϊσομεράσης IIα φαίνεται να συνίσταται από πολλούς συνεισφέροντες παράγοντες, τόσο την ειδική για τον καρκίνο ενίσχυση όσο και τον αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Οι πρωτεΐνες Ki-67 και τοποϊσομεράση IIα εκφράζονται παράλληλα, κάτι που μπορεί να ερμηνευθεί ως επιβεβαίωση της επιρροής του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων στην έκφραση της τοποϊσομεράσης IIα, ακόμα και σε περιπτώσεις με ενίσχυση του TOP2A (12). Οι τοποϊσομεράσες τύπου II αποτελούν στόχους για ανθρακυκλίνες, όπως η δοξορουβικίνη και η επιρουβικίνη, που ονομάζονται επίσης αναστολείς τοποϊσομεράσης (13-15). Η κατάσταση του HER2 ως προγνωστικός δείκτης για τις ανθρακυκλίνες αποτελεί αμφιλεγόμενο ζήτημα και έχει τονιστεί ότι λείπει η βιολογική βάση για τη σύνδεση αυτή. Επιπλέον, έχει συζητηθεί το εάν αντίθετα το HER2 πρέπει να θεωρείται βοηθητικός δείκτης ή "ψευτοδείκτης" για τον πραγματικό στόχο της ανθρακυκλίνης, την τοποϊσομεράση II (16-18). Διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός αντιγράφου του TOP2A επηρεάζει την ευαισθησία των όγκων έναντι των αναστολέων της τοποϊσομεράσης (16-28). P04092GR_02/K σελ. 3/41

4 Η κλινική απόδοση του Dako TOP2A FISH pharmdx Kit διερευνήθηκε σε δύο μελέτες που διεξήχθησαν από το Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG - Δανέζικη Ομάδα Συνεργασίας για τον Καρκίνο του Μαστού) στην Κοπεγχάγη (21, 29, 30). Η πιο πρόσφατη μελέτη (21, 30) αναφέρει ενίσχυση του γονιδίου TOP2A σε περίπου 10% των καρκίνων του μαστού και διαγραφές ίσης συχνότητας όταν συμπεριλαμβάνονται στις μελέτες όγκοι και θετικοί και αρνητικοί στο HER2. Αρχικά, εθεωρείτο ότι οι μη φυσιολογικοί αριθμοί αντιγράφων του γονιδίου TOP2A, ως αποτέλεσμα ενίσχυσης ή διαγραφής, περιορίζονταν σε όγκους με ενίσχυση του HER2 (16, 31). Πρόσφατα, ανιχνεύτηκαν αλλαγές στον αριθμό των αντιγράφων του γονιδίου TOP2A σε δείγματα όγκων με φυσιολογική κατάσταση του γονιδίου HER2 (21, 23, 29, 30, 32, 33). Στη μελέτη DBCG, οι αλλαγές του TOP2A διαπιστώνονται σε σχεδόν 60% των πρωτοπαθών όγκων του μαστού με ενίσχυση του HER2 ενώ 20% των όγκων μη φυσιολογικού TOP2A παρουσιάζουν φυσιολογική κατάσταση του HER2 (21, 23, 29, 30, 32). Η μελέτη επιβεβαιώθηκε από μια καναδέζικη μελέτη που δείχνει ότι η κατάσταση του γονιδίου TOP2A (ενίσχυση ή διαγραφή) αποτελεί σημαντικό προγνωστικό παράγοντα προς όφελος της αγωγής με χημειοθεραπεία με βάση την επιρουβικίνη (23). Περίπου 35% των ασθενών της μελέτης αυτής είχαν όγκους με ενίσχυση του HER2, και διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την κατάσταση του HER2 καθώς και παρεκκλίσεις του TOP2A (23, 34). Η πλειοψηφία των μελετών για τις παρεκκλίσεις του γονιδίου TOP2A είναι συνεπείς σε σχέση με την προγνωστική αξία των εξετάσεων του TOP2A (21-25, 30), κάτι που βρίσκεται σε αντίθεση με τα πιο διφορούμενα αποτελέσματα σχετικά με τις εξετάσεις του HER2 (35). Αν και τα γονίδια HER2 και TOP2A εντοπίζονται στο ίδιο αμπλικόνιο και ορισμένες μελέτες εστίασαν στην ταυτόχρονη ενίσχυση των γονιδίων (22, 24, 25), η μελέτη DBCG 89D καθώς και άλλες μελέτες έδειξαν ότι τα γονίδια πρέπει να αντιμετωπίζονται ανεξάρτητα και να δοκιμάζονται ξεχωριστά (10, 20, 21, 26-30). Αρχή της διαδικασίας Το TOP2A IQFISH pharmdx περιέχει όλα τα βασικά αντιδραστήρια που απαιτούνται για την ολοκλήρωση μιας διαδικασίας FISH για μονιμοποιημένα με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα τομών ιστού που υποβάλλονται σε επεξεργασία ρουτίνας. Μετά την αποπαραφίνωση και την επανενυδάτωση, τα δείγματα θερμαίνονται σε διάλυμα προκατεργασίας και ακολουθεί πρωτεολυτική χώνευση με πεψίνη. Μετά από τα βήματα θέρμανσης και πρωτεολυτικής προκατεργασίας, το κιτ αυτό χρησιμοποιεί ένα μη τοξικό, έτοιμο προς χρήση μίγμα ιχνηθετών FISH με βάση ένα συνδυασμό PNA (πεπτιδικού νουκλεϊκού οξέος) (36) και τεχνολογίας DNA. Αυτό το μίγμα ιχνηθετών αποτελείται από ένα μίγμα σημασμένων με Texas Red κλώνων κοσμιδίων που καλύπτει συνολικά 228 kb του αμπλικονίου TOP2A, και ένα μίγμα σημασμένων με φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών PNA που στοχεύουν στην κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17. Ο ειδικός υβριδισμός στους δύο στόχους έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός διακριτού ερυθρού φθορίζοντος σήματος σε κάθε αμπλικόνιο TOP2A και ενός διακριτού πράσινου φθορίζοντος σήματος σε κάθε κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17. Μετά από ισχυρή πλύση, τα δείγματα στερεώνονται με υλικό επικάλυψης φθορισμού που περιέχει DAPI και καλύπτονται με καλυπτρίδα. Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται με μικροσκόπιο φθορισμού εξοπλισμένο με τα κατάλληλα φίλτρα (βλ. Παράρτημα 3). Τα καρκινικά κύτταρα εντοπίζονται και κατόπιν αξιολογούνται αναφορικά με την αναλογία σημάτων TOP2A/CEN-17. Τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τομή ιστού χρησιμεύουν ως εσωτερικός θετικός μάρτυρας της αποτελεσματικότητας της προκατεργασίας και του υβριδισμού. Για λεπτομέρειες, δείτε την ενότητα Ερμηνεία της χρώσης. Το TOP2A IQFISH pharmdx, Κωδικός K5733, εφαρμόζεται σε μη αυτοματοποιημένες τεχνικές χρώσης. Αντιδραστήρια Παρεχόμενα υλικά Τα υλικά που παρατίθενται παρακάτω επαρκούν για 20 εξετάσεις (μια εξέταση ορίζεται ως μία περιοχή στόχος διαστάσεων 22 mm x 22 mm). Ο αριθμός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 250 µl ανά αντικειμενοφόρο πλάκα του Φιαλιδίου 2A (5 8 σταγόνες), 10 µl ανά αντικειμενοφόρο πλάκα του Φιαλιδίου 3, και 15 µl ανά αντικειμενοφόρο πλάκα του Φιαλιδίου 5. Τα διαλύματα στο P04092GR_02/K σελ. 4/41

5 Φιαλίδιο 3 και στο Φιαλίδιο 5 είναι ιξώδη και ενδέχεται να χρειαστεί σύντομη φυγοκέντρησή τους σε μικροφυγόκεντρο για να συλλεγεί το σύνολο του παρεχόμενου αντιδραστηρίου. Το κιτ παρέχει υλικά που επαρκούν για 10 ατομικούς κύκλους χρώσης (τέσσερεις ξεχωριστοί κύκλοι, όταν χρησιμοποιείται η μέθοδος εμβάπτισης σε πεψίνη). Το TOP2A IQFISH pharmdx αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Για να διασφαλιστεί ότι τα συστατικά του κιτ δεν έχουν εκτεθεί σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς, κατά την παραλαβή πρέπει να υπάρχει ακόμα ξηρός πάγος. Σημειωτέον ότι μερικά συστατικά του κιτ ενδέχεται να παραμείνουν μη κατεψυγμένα. Αυτό δεν επηρεάζει την απόδοση του TOP2A IQFISH pharmdx. Φιαλίδιο 1 Φιαλίδιο 2A Φιαλίδιο 2B Φιαλίδιο 3 Φιαλίδιο 4 Φιαλίδιο 5 Φιαλίδιο 6 Διάλυμα προκατεργασίας (20x) 150 ml, συμπυκνωμένο 20x Ρυθμιστικό διάλυμα MES (2-[N-μορφολινο]αιθανοσουλφονικό οξύ). Πεψίνη 4 x 6,0 ml, έτοιμο προς χρήση Διάλυμα πεψίνης, ph 2,0, περιέχει σταθεροποιητή και αντιμικροβιακό παράγοντα. Αραιωτικό πεψίνης (10x) 24 ml, συμπυκνωμένο 10x Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης, ph 2,0. Περιέχει αντιμικροβιακό παράγοντα. Μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH 0,2 ml, έτοιμο προς χρήση Μίγμα σημασμένων με Texas Red ιχνηθετών TOP2A DNA και σημασμένων με φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών CEN-17 PNA. Παρέχονται σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού IQISH. Ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (20x) 150 ml, συμπυκνωμένο 20x Ρυθμιστικό διάλυμα SSC (αλατούχο διάλυμα-κιτρικό νάτριο) με απορρυπαντικό (Tween20). Μέσο επικάλυψης φθορισμού 0,4 ml, έτοιμο προς χρήση Μέσο επικάλυψης φθορισμού με 500 µg/l DAPI (4,6-διαμιδίνη-2-φαινυλινδόλη). Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (20x) 500 ml, συμπυκνωμένο 20x Ρυθμιστικό διάλυμα Tris/HCl. Στεγανοποιητικό καλυπτρίδας 1 σωληνάριο, έτοιμο προς χρήση Διάλυμα για αφαιρούμενο στεγανωτικό καλυπτρίδων. P04092GR_02/K σελ. 5/41

6 ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα παρακάτω αντιδραστήρια του κιτ: Διάλυμα προκατεργασίας (20x), Πεψίνη, Αραιωτικό πεψίνης (10x), Ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (20x), Μέσο επικάλυψης φθορισμού, Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (20x) και Στεγανοποιητικό καλυπτρίδας, μπορούν να αντικατασταθούν με τα αντίστοιχα αντιδραστήρια του κιτ Dako Histology FISH Accessory Kit, Κωδικός K5799. Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Εργαστηριακά αντιδραστήρια Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό Αιθανόλη, 96% Ξυλένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Εργαστηριακός εξοπλισμός Απορροφητικά μαντηλάκια Ρυθμιζόμενες πιπέτες Βαθμονομημένο θερμόμετρο μερικής εμβάπτισης (εύρος C) Βαθμονομημένο θερμόμετρο επιφανείας (εύρος C) Καλυπτρίδες (22 mm x 22 mm) Dako Hybridizer (Κωδικός S2450/S2451)* Θερμαντική πλάκα ή κλίβανος υβριδισμού* Υγρός θάλαμος υβριδισμού* Λαβίδα Απαγωγός αναθυμιάσεων Αντικειμενοφόρες πλάκες μικροφυγόκεντρου, Dako Silanized Slides, κωδικός S3003 ή αντικειμενοφόρες πλάκες επιστρωμένες με πολυ-l-λυσίνη (δείτε την ενότητα Παρασκευή δειγμάτων) Δοχεία ή λουτρά χρώσης Χρονόμετρο (με ικανότητα χρονομέτρησης διαστημάτων 2-15 λεπτών) Αναδευτήρας περιδίνησης Υδατόλουτρο με καπάκι (ικανό να διατηρεί θερμοκρασία 37 (±2) C, 63 (±2) C και από 95 C έως 99 C) Φούρνος μικροκυμάτων με δυνατότητα ανίχνευσης εάν η προκατεργασία διεξάγεται με χρήση φούρνου μικροκυμάτων (δείτε B3. Πρωτόκολλο χρώσης. Βήμα 1: Προκατεργασία, Μέθοδος B) * Θερμαντική πλάκα ή κλίβανος υβριδισμού για τη μετουσίωση (66 (±1) C) και τον υβριδισμό (45 (±2) C) μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με υγρό θάλαμο υβριδισμού. Εξοπλισμός και παρελκόμενα μικροσκοπίου Φίλτρα για μικροσκόπιο φθορισμού: DAPI και διπλό φίλτρο FITC/Texas Red ή μονά φίλτρα FITC και Texas Red δείτε το Παράρτημα 3 για λεπτομέρειες. Ως πηγή φωτός πρέπει να χρησιμοποιηθεί μικροσκόπιο φθορισμού με λαμπτήρα υδραργύρου 100 Watt. Δεν συνιστώνται άλλες πηγές φωτός με τα φίλτρα αυτά. Θήκη αντικειμενοφόρων πλακών μικροσκοπίου (χαρτονένιος δίσκος για 20 αντικειμενοφόρες πλάκες με αρθρωτό κάλυμμα ή παρόμοιος δίσκος). Προφυλάξεις 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελματίες χρήστες. 3. Δεν απαιτείται επισήμανση κινδύνου για το Φιαλίδιο 1, Διάλυμα προεπεξεργασίας (20x). Το φύλλο δεδομένων ασφαλείας (SDS) διατίθεται σε επαγγελματίες χρήστες κατόπιν αιτήματος. P04092GR_02/K σελ. 6/41

7 4. Το Φιαλίδιο 2A, Πεψίνη, περιέχει 5-<10% προπανο-2-όλη, 0,1-<0,3% πεψίνη A και 0,011- <0,1% 5-χλωρο-2-μεθυλ-4-ισοθειαζολινο-3-όνη και 2-μεθυλ-2H-ισοθειαζολ-3-όνη. Το Φιαλίδιο 2Α είναι επισημασμένο: Κίνδυνος H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Προκαλεί σοβαρά δερματικά εγκαύματα και οφθαλμική βλάβη. Μπορεί να προκαλέσει αλλεργική δερματική αντίδραση. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτική ενδυμασία. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ: Μεταφέρετε το άτομο σε καθαρό αέρα και κρατήστε το σε άνετη για την αναπνοή θέση. Καλέστε αμέσως ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή κάποιον ιατρό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε αμέσως ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή κάποιον ιατρό. ΜΗΝ προκαλέσετε εμετό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΔΕΡΜΑ (ή με τα μαλλιά): Βγάλτε αμέσως όλα τα μολυσμένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερμίδα με νερό ή στο ντους. Καλέστε αμέσως ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή κάποιον ιατρό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Καλέστε αμέσως ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή κάποιον ιατρό. Να φυλάσσεται κλειδωμένο. Απορρίψτε τα περιεχόμενα και τον περιέκτη σύμφωνα με όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισμούς. 5. Το Φιαλίδιο 2B, Αραιωτικό πεψίνης (10x) περιέχει 50-<75% προπανο-2-όλη και υδροχλωρική 2-αμινο-2-(υδροξυμεθυλο) προπανο-1,3-διόλη 5-<10%. Το Φιαλίδιο 2B είναι επισημασμένο: Κίνδυνος H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P533 P235 P501 Εξαιρετικά εύφλεκτο υγρό και ατμός. Προκαλεί σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό. Μπορεί να προκαλέσει υπνηλία ή ζάλη. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. Μακριά από θερμότητα, θερμές επιφάνειες, σπινθήρες, γυμνές φλόγες και άλλες πηγές ανάφλεξης. Μην καπνίζετε. Να χρησιμοποιείται αντιεκρηκτικός ηλεκτρολογικός, εξαερισμού, φωτιστικός και για χειρισμό όλων των υλικών εξοπλισμός. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ: Μεταφέρετε το άτομο σε καθαρό αέρα και κρατήστε το σε άνετη για την αναπνοή θέση. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΔΕΡΜΑ (ή με τα μαλλιά): Βγάλτε αμέσως όλα τα μολυσμένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερμίδα με νερό ή στο ντους. Να διατηρείται δροσερό. Απορρίψτε τα περιεχόμενα και τον περιέκτη σύμφωνα με όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισμούς. 6. Το Φιαλίδιο 3, Μίγμα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH, περιέχει 10-<25% ανθρακικό αιθυλένιο και 3-<5% χλωριούχο νάτριο. Το Φιαλίδιο 3 είναι επισημασμένο: H319 P280 Προειδοποίηση Προκαλεί σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό. Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. P04092GR_02/K σελ. 7/41

8 P264 P305 + P351 + P338 Πλύνετε τα χέρια σας σχολαστικά μετά το χειρισμό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Αφαιρέστε τους φακούς επαφής, εάν φοράτε και εάν είναι εύκολη η αφαίρεσή τους. Συνεχίστε την έκπλυση. 7. Το Φιαλίδιο 4, Ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (20x) περιέχει 10-<25% χλωριούχο νάτριο και υδροχλωρική 2-αμινο-2-(υδροξυμεθυλο) προποανο-1,3-διόλη 10-<20%. Το Φιαλίδιο 4 είναι επισημασμένο: Προειδοποίηση H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό. H315 Προκαλεί ερεθισμούς στο δέρμα. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. P264 Πλύνετε τα χέρια σας σχολαστικά μετά το χειρισμό. P305 + P351 + P338 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Αφαιρέστε τους φακούς επαφής, εάν φοράτε και εάν είναι εύκολη η αφαίρεσή τους. Συνεχίστε την έκπλυση. 8. Το Φιαλίδιο 6, Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (20x), περιέχει 10-<25% χλωριούχο νάτριο και 10-<20% τρομεταμόλη. Το Φιαλίδιο 6 είναι επισημασμένο: Προειδοποίηση H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό. H315 Προκαλεί ερεθισμούς στο δέρμα. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. P264 Πλύνετε τα χέρια σας σχολαστικά μετά το χειρισμό. P305 + P351 + P338 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Αφαιρέστε τους φακούς επαφής, εάν φοράτε και εάν είναι εύκολη η αφαίρεσή τους. Συνεχίστε την έκπλυση. 9. Το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων περιέχει 100% ελαφρά υδρογονοκατεργασμένη νάφθα (πετρέλαιο), με την επισήμανση: Κίνδυνος H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 Εξαιρετικά εύφλεκτο υγρό και ατμός. Ενδέχεται να είναι θανάσιμο σε περίπτωση κατάποσης και εισόδου στους αεραγωγούς. Τοξικό για τους υδρόβιους οργανισμούς, με μακροχρόνιες επιπτώσεις. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. Μακριά από θερμότητα, θερμές επιφάνειες, σπινθήρες, γυμνές φλόγες και άλλες πηγές ανάφλεξης. Μην καπνίζετε. Να χρησιμοποιείται αντιεκρηκτικός ηλεκτρολογικός, εξαερισμού, φωτιστικός και για χειρισμό όλων των υλικών εξοπλισμός. Αποφύγετε την απελευθέρωσή του στο περιβάλλον. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε αμέσως ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή κάποιον ιατρό. ΜΗΝ προκαλέσετε εμετό. P04092GR_02/K σελ. 8/41

9 P303 + P361 + P353 P235 P501 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΔΕΡΜΑ (ή με τα μαλλιά): Βγάλτε αμέσως όλα τα μολυσμένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερμίδα με νερό ή στο ντους. Να διατηρείται δροσερό. Απορρίψτε τα περιεχόμενα και τον περιέκτη σύμφωνα με όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισμούς. 10. Τα δείγματα, πριν και μετά τη μονιμοποίηση, καθώς και όλα τα υλικά που εκτίθενται σε αυτά, πρέπει να υποβάλλονται σε χειρισμό ως δυνητικά μετάδοσης λοίμωξης και θα πρέπει να απορρίπτονται με κατάλληλες προφυλάξεις (37). Μην αναρροφάτε με πιπέτα τα αντιδραστήρια με το στόμα και αποφεύγετε την επαφή του δέρματος και των βλεννογόνων με αντιδραστήρια και δείγματα. Αν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή με ευαίσθητες περιοχές, πλύνετε με άφθονες ποσότητες νερού. 11. Ελαχιστοποιήστε τη μικροβιακή μόλυνση των αντιδραστηρίων ώστε να αποφύγετε εσφαλμένα αποτελέσματα. 12. Χρόνοι και θερμοκρασίες επώασης ή μέθοδοι διαφορετικές από εκείνες που καθορίζονται, ενδέχεται να δώσουν εσφαλμένα αποτελέσματα. 13. Μέθοδοι μονιμοποίησης ιστών και πάχη δειγμάτων διαφορετικά από εκείνα που καθορίζονται ενδέχεται να επηρεάσουν τη μορφολογία των ιστών ή/και την ένταση του σήματος. 14. Αποφεύγετε την εξάτμιση του Μίγματος ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix κατά τη διάρκεια του υβριδισμού διασφαλίζοντας επαρκή υγρασία στον θάλαμο υβριδισμού. 15. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί με βέλτιστο τρόπο. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσμα απώλεια της απόδοσης. 16. Φοράτε κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό, έτσι ώστε να αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. Ανατρέξτε στο Φύλλο δεδομένων ασφαλείας (SDS) για πρόσθετες πληροφορίες. 17. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο καθαρά βάζα χρώσης για τη μέθοδο εμβύθισης πεψίνης (Βήμα 2, μέθοδος Γ). Αποθήκευση Αποθηκεύστε το μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH (Φιαλίδιο 3) στους -18 C στο σκοτάδι. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια μπορούν να αποθηκευτούν στους 2 8 C στο σκοτάδι. Όλα τα αντιδραστήρια ανέχονται φύλαξη στην κατάψυξη. Η κατάψυξη και η απόψυξη των αντιδραστηρίων για έως και 10 φορές δεν επηρεάζει την απόδοση. Η έτοιμη για χρήση πεψίνη, το μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH, και το μέσο επικάλυψης φθορισμού (Φιαλίδια 2Α, 3 και 5) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσμενώς εάν εκτεθούν σε θερμότητα. Μην αφήνετε τα συστατικά αυτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH και το μέσο επικάλυψης φθορισμού (Φιαλίδια 3 και 5) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσμενώς εάν εκτεθούν σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μη φυλάσσετε τα συστατικά αυτά και μην εκτελείτε ανάλυση σε έντονο φως, όπως το άμεσο ηλιακό φως. Μη χρησιμοποιείτε το κιτ μετά την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στο κουτί του κιτ. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό συνθήκες διαφορετικές από εκείνες που καθορίζονται σε αυτό το ένθετο συσκευασίας, ο χρήστης πρέπει να επικυρώσει την απόδοση του αντιδραστηρίου (38). Δεν υπάρχουν ορατά σημάδια που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Επομένως, είναι σημαντικό να αξιολογείτε τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τομή ιστού. Εάν παρατηρηθεί μη αναμενόμενο πρότυπο φθορισμού που δεν είναι δυνατό να εξηγηθεί από διακυμάνσεις στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβλημα με το TOP2A IQFISH pharmdx, επικοινωνήστε με την Τεχνική Υπηρεσία της Dako. Παρασκευή δειγμάτων Τα δείγματα από βιοψία πρέπει να υποβάλλονται σε κατάλληλο χειρισμό για τη συντήρηση του ιστού για ανάλυση FISH. Για όλα τα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται πρότυπες μέθοδοι επεξεργασίας ιστού για ανοσοϊστοχημική χρώση (39). P04092GR_02/K σελ. 9/41

10 Τομές εγκλεισμένες σε παραφίνη Κατάλληλοι για χρήση είναι μόνον ιστοί που διατηρoύνται σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης και εγκλεισμένοι σε παραφίνη. Τα δείγματα από βιοψίες πρέπει π.χ. να τεμαχίζονται σε πάχος 3 ή 4 mm και να μονιμοποιούνται επί ώρες σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης. Κατόπιν οι ιστοί πρέπει να αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη σειρά διαλυμάτων αιθανόλης και ξυλενίου και στη συνέχεια να εμποτίζονται από τηγμένη παραφίνη που διατηρείται σε θερμοκρασία όχι μεγαλύτερη των 60 C. Κατάλληλα μονιμοποιημένοι και εγκλεισμένοι ιστοί μπορούν να διατηρηθούν επ' αόριστον, προτού τεμαχιστούν και τοποθετηθούν σε αντικειμενοφόρους εάν φυλάσσονται σε δροσερό μέρος (15 25 C) (39, 40). Άλλα μονιμοποιητικά δεν είναι κατάλληλα. Τα δείγματα ιστού πρέπει να κόβονται σε τομές 4 6 µm. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες που απαιτούνται για την ανάλυση παρεκκλίσεων του γονιδίου TOP2A και την επαλήθευση της παρουσίας όγκου πρέπει να παρασκευάζονται ταυτόχρονα. Συνιστώνται τουλάχιστον 3 διαδοχικές τομές, 1 τομή για παρουσία όγκου χρωματισμένη με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (χρώση H&E), 1 τομή για την ανάλυση παρεκκλίσεων του γονιδίου TOP2A, και 1 τομή ως εφεδρεία. Συνιστάται η επικάλυψη των τομών ιστού σε Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003 ή σε αντικειμενοφόρες πλάκες SuperFrost Plus ή επιστρωμένες με πολυ-l-λυσίνη. Τα δείγματα πρέπει να αναλύονται εντός 4 6 μηνών από την εκτέλεση της τομής, όταν φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) ή 2 έτη όταν φυλάσσονται στους 2 8 C. P04092GR_02/K σελ. 10/41

11 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Α. Προετοιμασία των αντιδραστηρίων Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση: A.1 Διάλυμα προκατεργασίας Στο Φιαλίδιο 1 ενδέχεται να σχηματιστούν κρύσταλλοι, αλλά θα διαλυθούν σε θερμοκρασία δωματίου. Βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχουν κρύσταλλοι πριν από την παρασκευή του αντιδραστηρίου. Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 1 (Διάλυμα προκατεργασίας 20x) 1:20 σε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Το μη χρησιμοποιημένο αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα μήνα. Εάν το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα παρουσιάζει νεφέλωση, απορρίψτε το. A.2 Ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 4 (Ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 20x) 1:20 σε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Το μη χρησιμοποιημένο αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα μήνα. Εάν το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα παρουσιάζει νεφέλωση, απορρίψτε το. A.3 Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 6 (Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 20x) 1:20 σε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Το μη χρησιμοποιημένο αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα μήνα. Απορρίψτε το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα εάν έχει νεφελώδη εμφάνιση. A.4 Σειρά διαλυμάτων αιθανόλης Από ένα διάλυμα αιθανόλης 96%, παρασκευάστε 3 δοχεία με αιθανόλη 70%, 85% και 96%, αντίστοιχα. Φυλάσσετε τα καλυμμένα δοχεία σε θερμοκρασία δωματίου ή στους 2 8 C και χρησιμοποιήστε για 200 αντικειμενοφόρες πλάκες κατά μέγιστο. Απορρίψτε τα διαλύματα εάν έχουν νεφελώδη εμφάνιση. A.5 Διάλυμα πεψίνης Διάλυμα πεψίνης χρειάζεται μόνο όταν χρησιμοποιείται η μέθοδος εμβάπτισης σε πεψίνη (Μέθοδος Γ). Παρασκευάστε το διάλυμα πεψίνης ως εξής: Για δοχείο χωρητικότητας έξι αντικειμενοφόρων, παρασκευάστε διάλυμα πεψίνης 60 ml: Προσθέστε 48 ml απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) στο δοχείο. Προσθέστε 6 ml κρύο (2 8 C) Αραιωτικό πεψίνης (10x) (Φιαλίδιο 2B) στο δοχείο. Προσθέστε 6 ml κρύα (2 8 C) Πεψίνη (Φιαλίδιο 2A) στο δοχείο. Τοποθετήστε καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυμα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Για δοχείο χωρητικότητας 24 αντικειμενοφόρων, παρασκευάστε διάλυμα πεψίνης 240 ml: Προσθέστε 192 ml απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) στο δοχείο. Προσθέστε 24 ml κρύο (2 8 C) Αραιωτικό πεψίνης (10x) (Φιαλίδιο 2B) στο δοχείο. Προσθέστε 24 ml κρύα (2 8 C) Πεψίνη RTU (Φιαλίδιο 2A) στο δοχείο. Τοποθετήστε καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυμα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Διάλυμα πεψίνης που έχει ισορροπήσει πρέπει να χρησιμοποιείται εντός 5 ωρών. P04092GR_02/K σελ. 11/41

12 B. Διαδικασία χρώσης B.1 Σημειώσεις σχετικά με τη διαδικασία Ο χρήστης πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί με όλα τα συστατικά πριν από τη χρήση (δείτε την ενότητα Προφυλάξεις ). Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να εξισορροπούνται στη σχετική θερμοκρασία πριν από τη χρήση ως εξής. Φιαλίδιο 1. Το αραιωμένο διάλυμα προκατεργασίας πρέπει να εξισορροπείται στους C αν χρησιμοποιείται υδατόλουτρο για την προκατεργασία (B3. Πρωτόκολλο χρώσης, Βήμα 1: Προκατεργασία, Μέθοδος Α). Αν χρησιμοποιείται φούρνος μικροκυμάτων με δυνατότητα ανίχνευσης για την προκατεργασία (B3. Πρωτόκολλο χρώσης, Βήμα 1: Προκατεργασία, Μέθοδος B) το αραιωμένο διάλυμα προκατεργασίας πρέπει να εξισορροπείται σε θερμοκρασία δωματίου στους C. Φιαλίδιο 2Α. Η πεψίνη πρέπει να εφαρμόζεται στους 2 8 C (B3, Πρωτόκολο χρώσης, Βήμα 2: Μέθοδος A και B) και να διατηρείται ψυχρό συνεχώς. Φιαλίδιο 2B: Το αραιωτικό πεψίνης (10x) πρέπει να εφαρμόζεται στους 2 8 C (B3, Πρωτόκολο χρώσης, Βήμα 2: Μέθοδος Γ). Φιαλίδιο 3. Το Μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH διαχωρίζεται σε δύο φάσεις ενώ φυλάσσεται στους -18 C. Πριν χρησιμοποιήσετε το Φιαλίδιο 3, βεβαιωθείτε ότι υπάρχει μόνο μία φάση εξισορροπώντας το μίγμα ιχνηθετών σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) και αναμιγνύοντας στη συνέχεια. Αποψύξτε το Φιαλίδιο 3 σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) για 30 λεπτά κατά μέγιστο (προστατεύοντας από δυνατό φως), και κατόπιν περιδινήστε ενδελεχώς το φιαλίδιο για 15 δευτερόλεπτα στις 2500 rpm χρησιμοποιώντας αναδευτήρα περιδίνησης. Αποθηκεύστε το Φιαλίδιο 3 στους -18 C αμέσως μετά τη χρήση. Φιαλίδιο 4. Αραιωμένο ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Ένα δοχείο πρέπει να ισορροπείται σε θερμοκρασία δωματίου, ένα άλλο στους 63 (±2) C πριν από τη χρήση. Φιαλίδιο 5. Μέσο επικάλυψης φθορισμού. Μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιαδήποτε θερμοκρασία από 2 25 C. Φιαλίδιο 6. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης πρέπει να ισορροπείται σε θερμοκρασία δωματίου στους C. Το Στεγανοποιητικό καλυπτρίδας μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιαδήποτε θερμοκρασία από 2 25 C. Όλα τα βήματα πρέπει να εκτελούνται στη θερμοκρασία που καθορίζεται. Η διαδικασία περιλαμβάνει διάφορες αφυδατώσεις ακολουθούμενες από το στέγνωμα των τομών ιστών. Βεβαιωθείτε ότι οι τομές ιστών είναι εντελώς στεγνές πριν προχωρήσετε στο επόμενο βήμα. Μην αφήνετε τις τομές ιστών να στεγνώσουν κατά τη διάρκεια των άλλων βημάτων της διαδικασίας. Εάν η διαδικασία χρώσης πρέπει να διακοπεί, οι αντικειμενοφόρες πλάκες είναι δυνατό να διατηρηθούν σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης μετά το βήμα αποπαραφίνωσης έως 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) χωρίς να επηρεάζονται τα αποτελέσματα. B.2 Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση Αποπαραφίνωση και επανενυδάτωση: Πριν από την εκτέλεση της ανάλυσης, οι αντικειμενοφόρες πλάκες με τον ιστό πρέπει να υποβάλλονται σε αποπαραφίνωση για την αφαίρεση του μέσου έγκλεισης και να επανενυδατώνονται. Αποφεύγετε την ατελή αφαίρεση της παραφίνης. Υπολειμματικό μέσο έγκλεισης έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη μη ειδική χρώση. Το βήμα αυτό πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). 1. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε λουτρό ξυλενίου και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε μία φορά. P04092GR_02/K σελ. 12/41

13 2. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε αιθανόλη 96% επί 2 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε μία φορά. 3. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε αιθανόλη 70% επί 2 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε μία φορά. 4. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια υγρού και τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (δείτε τις ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 2 λεπτά τουλάχιστον. Αρχίστε τη διαδικασία χρώσης όπως παρουσιάζεται στην ενότητα B.3, Βήμα 1, Προκατεργασία. Τα διαλύματα ξυλενίου και αλκοόλης πρέπει να αλλάζουν μετά από 200 αντικειμενοφόρες πλάκες ή λιγότερες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν υποκατάστατα ξυλενίου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο κιτ αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή μεταβολή των θερμοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσει εσφαλμένα ή ασύμφωνα αποτελέσματα. Τυχόν διαφορές στην επεξεργασία των ιστών και τις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να ακυρώσουν τα αποτελέσματα της δοκιμασίας. B.3 Πρωτόκολλο χρώσης Βήμα 1: Προκατεργασία Η προκατεργασία μπορεί να διεξαχθεί είτε με χρήση υδατόλουτρου όπως περιγράφεται στη μέθοδο Α) είτε, εναλλακτικά, με χρήση φούρνου μικροκυμάτων με δυνατότητα ανίχνευσης όπως περιγράφεται στη μέθοδο Β). Μέθοδος A: Προκατεργασία με χρήση υδατόλουτρου Γεμίστε ένα δοχείο χρώσης με το αραιωμένο διάλυμα προκατεργασίας (δείτε τις ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.1). Τοποθετήστε το δοχείο χρώσης που περιέχει αραιωμένο διάλυμα προκατεργασίας σε υδατόλουτρο. Θερμάνετε το υδατόλουτρο και το διάλυμα προκατεργασίας στους C. Μετρήστε τη θερμοκρασία εντός του δοχείου με ένα βαθμονομημένο θερμόμετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερμοκρασίας. Καλύψτε το δοχείο με καπάκι προκειμένου να σταθεροποιηθεί η θερμοκρασία και να αποφύγετε την εξάτμιση. Εμβαπτίστε τις αποπαραφινωμένες τομές σε θερμοκρασία δωματίου στο προθερμασμένο διάλυμα προκατεργασίας στο δοχείο χρώσης. Επανελέγξτε τη θερμοκρασία και επωάστε επί 10 (±1) λεπτά στους C. Αφαιρέστε ολόκληρο το δοχείο με τις αντικειμενοφόρες πλάκες από το υδατόλουτρο. Αφαιρέστε το καπάκι και αφήστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες να ψυχθούν στο διάλυμα προκατεργασίας επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε ένα δοχείο με αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (δείτε τις ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και εμβαπτίστε τις τομές επί ακόμα 3 λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Διάλυμα προκατεργασίας έχει σχεδιαστεί για χρήση για μία μόνο εφαρμογή. Μην το επαναχρησιμοποιείτε. Μέθοδος Β: Προκατεργασία με χρήση φούρνου μικροκυμάτων με δυνατότητα ανίχνευσης Γεμίστε ένα πλαστικό δοχείο με αραιωμένο διάλυμα προκατεργασίας σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Εμβαπτίστε τις αποπαραφινωμένες τομές στο διάλυμα προκατεργασίας, καλύψτε το δοχείο με τρυπημένο καπάκι και τοποθετήστε το στο φούρνο μικροκυμάτων. Επιλέξτε τη λειτουργία αισθητήρα βρασμού και πρόγραμμα που λειτουργεί επί 10 λεπτά μετά την επίτευξη της θερμοκρασίας βρασμού*. P04092GR_02/K σελ. 13/41

14 Ύστερα από τα 10 λεπτά επώασης, βγάλτε το δοχείο με τις αντικειμενοφόρες από το φούρνο, αφαιρέστε το καπάκι και αφήστε να κρυώσει επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες σε δοχείο με αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και εμβαπτίστε επί 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και εμβαπτίστε τις τομές επί ακόμα 3 λεπτά. * Η χρήση φούρνου μικροκυμάτων με δυνατότητα ανίχνευσης σημαίνει ότι ο φούρνος πρέπει να διαθέτει αισθητήρα και προγράμματα τα οποία αρχικά θερμαίνουν το διάλυμα προκατεργασίας ως το σημείο βρασμού και εν συνεχεία διατηρούν την απαιτούμενη θερμοκρασία προκατεργασίας (άνω των 95 ºC) ενώ κάνουν αντίστροφη μέτρηση του προκαθορισμένου χρόνου (10 (±1) λεπτά). Ορισμένα μοντέλα φούρνων μικροκυμάτων με δυνατότητα ανίχνευσης ενδέχεται να μην διαθέτουν δυνατότητα ελεύθερης ρύθμισης χρόνου αντίστροφης μέτρησης. Αν το μοντέλο διαθέτει μόνο προκαθορισμένα προγράμματα, βεβαιωθείτε ότι επιλέξατε πρόγραμμα που διατηρεί την απαιτούμενη θερμοκρασία προκατεργασίας (άνω των 95 ºC) επί τουλάχιστον 10 (±1) λεπτά και σταματήστε διά χειρός το πρόγραμμα μετά από 10 (±1) λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Διάλυμα προκατεργασίας έχει σχεδιαστεί για χρήση για μία μόνο εφαρμογή. Μην το επαναχρησιμοποιείτε. Βήμα 2: Πεψίνη, έτοιμη προς χρήση (RTU) ή διάλυμα πεψίνης Η επώαση πεψίνης μπορεί να διεξαχθεί με απευθείας εφαρμογή σταγόνων πεψίνης RTU στις αντικειμενοφόρες είτε σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) (Μέθοδος A) είτε στους 37 C (Μέθοδος B). Εναλλακτικά, οι αντικειμενοφόρες μπορούν να εμβαπτιστούν σε διάλυμα πεψίνης και να επωαστούν στους 37 (±2) C (Μέθοδος Γ). Μέθοδος Α) και Μέθοδος Β) Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρεθεί η περίσσεια του ρυθμιστικού διαλύματος. Με χρήση απορροφητικού υφάσματος που δεν αφήνει χνούδι (όπως απορροφητικό ταμπόν ή τεμάχιο γάζας), σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγμα για την αφαίρεση τυχόν υγρού που απομένει και για να διατηρήσετε τα αντιδραστήρια εντός της καθορισμένης περιοχής. Εφαρμόστε 5 8 σταγόνες (250 µl) ψυχρής (2 8 C) πεψίνης (Φιαλίδιο 2Α) για την κάλυψη του δείγματος. Φυλάσσετε πάντοτε την πεψίνη στους 2 8 C. Μέθοδος A: Πεψίνη, RTU - Επώαση στους C Επωάστε επί 5 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Χρόνος επώασης 5 15 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγματα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη μονιμοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγματος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε περίσσεια πεψίνης και εμβαπτίστε τις τομές στο αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (δείτε τις ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και εμβαπτίστε τις τομές επί ακόμα 3 λεπτά. Συνεχίστε με την αφυδάτωση. Μέθοδος Β: Πεψίνη, RTU - Επώαση στους 37 C Τοποθετήστε δείγμα με πεψίνη σε θερμαντική πλάκα στους 37 C π.χ. Dako Hybridizer και επωάστε επί 3 5 λεπτά. Χρόνος επώασης 3 5 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγματα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη μονιμοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγματος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να φύγει η περίσσεια πεψίνης και εμβαπτίστε τις τομές σε αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης επί 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και εμβαπτίστε τις τομές επί ακόμα 3 λεπτά. Συνεχίστε με την αφυδάτωση. Αφυδατώστε τις τομές ιστών μέσω διαβαθμισμένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τομές ιστών να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. Μέθοδος Γ: Διάλυμα πεψίνης - Εμβάπτιση αντικειμενοφόρων σε διάλυμα πεψίνης στους 37 C Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για τέσσερεις ξεχωριστούς κύκλους (60 ml διάλυμα πεψίνης, μικρό δοχείο για έξι αντικειμενοφόρες) ή ένας μόνο κύκλος (240 ml διάλυμα πεψίνης, P04092GR_02/K σελ. 14/41

15 μεγάλο δοχείο για 24 αντικειμενοφόρες). Παρασκευάστε το διάλυμα πεψίνης όπως περιγράφεται στην ενότητα A.5. Τοποθετήστε καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυμα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Βεβαιωθείτε ότι η θερμοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Μετρήστε τη θερμοκρασία μέσα στο δοχείο με βαθμονομημένο θερμόμετρο και βεβαιωθείτε ότι είναι η σωστή θερμοκρασία. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρεθεί η περίσσεια του ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης. Βυθίστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες στο διάλυμα πεψίνης στους 37 (±2) C και επωάστε για λεπτά. Χρόνος επώασης λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγματα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη μονιμοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγματος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να φύγει η περίσσεια του διαλύματος πεψίνης και εμβαπτίστε τις τομές σε αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης επί 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και εμβαπτίστε τις τομές επί ακόμα 3 λεπτά. Συνεχίστε με την αφυδάτωση. Αφυδατώστε τις τομές ιστών μέσω διαβαθμισμένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τομές ιστών να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. Βήμα 3: Μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH Το Μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH διαχωρίζεται σε δύο φάσεις ενώ φυλάσσεται στους -18 C. Πριν χρησιμοποιήσετε το Φιαλίδιο 3, βεβαιωθείτε ότι υπάρχει μόνο μία φάση εξισορροπώντας το μίγμα ιχνηθετών σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) και αναμιγνύοντας στη συνέχεια. Αποψύξτε το Φιαλίδιο 3 σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) για 30 λεπτά κατά μέγιστο (προστατεύοντας από δυνατό φως), και κατόπιν περιδινήστε ενδελεχώς το φιαλίδιο για 15 δευτερόλεπτα στις 2500 rpm χρησιμοποιώντας αναδευτήρα περιδίνησης. Αποθηκεύστε το Φιαλίδιο 3 στους -18 C αμέσως μετά τη χρήση. Απλώστε 10 µl του Μίγματος ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH (Φιαλίδιο 3) στο κέντρο της τομής ιστού. Τοποθετήστε αμέσως μια γυάλινη καλυπτρίδα 22 mm x 22 mm πάνω από το μίγμα ιχνηθετών και αφήστε το να εξαπλωθεί ομοιόμορφα κάτω από την καλυπτρίδα. Αποφύγετε το σχηματισμό φυσαλίδων αέρα. Εάν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα, κτυπήστε απαλά με μια λαβίδα για να τις απομακρύνετε από τον ιστό. Θυμηθείτε να αποθηκεύσετε το Φιαλίδιο 3 στους -18 C αμέσως μετά τη χρήση. Στεγανοποιήστε την καλυπτρίδα με το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων εξωθώντας το στεγανοποιητικό γύρω από την περιφέρεια της καλυπτρίδας. Αφήστε το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων να επικαλύψει την καλυπτρίδα και την αντικειμενοφόρο πλάκα, σχηματίζοντας έτσι στεγανοποίηση γύρω από την καλυπτρίδα. Βεβαιωθείτε ότι το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων καλύπτει ολόκληρο το χείλος της καλυπτρίδας. Προετοιμάστε το Dako Hybridizer* (κωδικός S2450/S2451) για κύκλο υβριδισμού. Βεβαιωθείτε ότι τα Humidity Control Strips (Κωδικός S2452) είναι βρεγμένα και έχουν βελτιστοποιηθεί για χρήση. Ξεκινήστε το Hybridizer και επιλέξτε πρόγραμμα που θα εκτελέσει τα εξής: Μετουσίωση στους 66 C επί 10 λεπτά και στη συνέχεια υβριδισμός στους 45 C επί λεπτά. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες στο Hybridizer, βεβαιωθείτε ότι το καπάκι έχει κλείσει καλά και ξεκινήστε το πρόγραμμα. Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο οδηγιών του Dako Hybridizer για λεπτομέρειες. *Για τη μετουσίωση και τον υβριδισμό, μπορεί να χρησιμοποιηθεί εξοπλισμός οργάνων που επιτρέπει τη δημιουργία συνθηκών πανομοιότυπων με εκείνες που περιγράφηκαν παραπάνω. Για παράδειγμα, όπως περιγράφεται παρακάτω: Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε μια επίπεδη μεταλλική ή πέτρινη επιφάνεια (θερμαντική πλάκα ή πλάκα κλιβάνου υβριδισμού) που έχετε προθερμάνει στους 66 (±1) C. Μετουσιώστε για ακριβώς 10 λεπτά. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε προθερμασμένο υγροποιημένο θάλαμο υβριδισμού. Καλύψτε το θάλαμο με καπάκι και επωάστε στους 45 (±2) C για λεπτά. Παρακαλούμε σημειώστε ότι θερμοκρασία υβριδισμού των 37 C δεν είναι κατάλληλη για χρήση με τους ιχνηθέτες που περιέχονται στο κιτ αυτό. P04092GR_02/K σελ. 15/41

16 Βήμα 4: Ισχυρή πλύση Γεμίστε δύο δοχεία χρώσης με το αραιωμένο ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (δείτε τις ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2). Συνιστάται ελάχιστος όγκος 100 ml ή 15 ml ανά αντικειμενοφόρο πλάκα σε κάθε δοχείο. Τοποθετήστε ένα από τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωμένο ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης σε θερμοκρασία δωματίου σε απαγωγό αναθυμιάσεων και το άλλο σε υδατόλουτρο. Θερμάνετε το υδατόλουτρο και το αραιωμένο ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης στους 63 (±2) C. Βεβαιωθείτε ότι η θερμοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Καλύψτε το δοχείο με καπάκι προκειμένου να σταθεροποιηθεί η θερμοκρασία και να αποφύγετε την εξάτμιση. Μετρήστε τη θερμοκρασία εντός του δοχείου υδατόλουτρου με ένα βαθμονομημένο θερμόμετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερμοκρασίας. Το ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης περιέχει απορρυπαντικό και ενδέχεται να καταστεί θολερό στους 63 C. Αυτό δεν θα επηρεάσει την απόδοση. Με χρήση λαβίδας ή γαντιών, πάρτε τις αντικειμενοφόρες πλάκες από το θάλαμο υβριδισμού και αφαιρέστε απαλά το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων καθώς και την καλυπτρίδα, και τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες στο δοχείο πρόπλυσης, σε θερμοκρασία δωματίου, μία κάθε φορά. Μην τοποθετήσετε τις αντικειμενοφόρες στο ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης πριν αφαιρέσετε τις καλυπτρίδες. Μόλις αφαιρεθούν όλες οι καλυπτρίδες, μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες πλάκες από το δοχείο πρόπλυσης που βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου στο δοχείο που βρίσκεται μέσα σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 63 (±2) C. Αμέσως μετά τη μεταφορά των αντικειμενοφόρων στο αραιωμένο ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης των 63 (±2) C στο υδατόλουτρο, πρέπει να ξεκινήσει το χρονόμετρο. Πραγματοποιήστε ισχυρή πλύση επί 10 ακριβώς λεπτά. Αφαιρέστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες από το αραιωμένο ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και εμβαπτίστε τις τομές σε αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης επί 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Αλλάξτε το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και εμβαπτίστε τις τομές επί 3 λεπτά ακόμα. Αφυδατώστε τις τομές ιστών μέσω διαβαθμισμένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τομές ιστών να στεγνώσουν εντελώς. Βήμα 5: Επικάλυψη Εφαρμόστε 15 µl του μέσου επικάλυψης φθορισμού που περιέχει DAPI (Φιαλίδιο 5) στην περιοχή στόχο της αντικειμενοφόρου και εφαρμόστε μια γυάλινη καλυπτρίδα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι αντικειμενοφόρες πλάκες είναι δυνατό να αναγνωστούν μετά από 15 λεπτά ή εντός 7 ημερών μετά την επικάλυψη. Ωστόσο, εάν οι αντικειμενοφόρες πλάκες εκτεθούν σε φως ή σε υψηλές θερμοκρασίες θα παρουσιαστεί εξασθένηση. Για την ελαχιστοποίηση της εξασθένησης, φυλάσσετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες στο σκοτάδι στους C. Ποιοτικός έλεγχος 1. Τα σήματα πρέπει να είναι έντονα, διακριτά και εύκολα στην αξιολόγηση. 2. Τα φυσιολογικά κύτταρα επιτρέπουν τον εσωτερικό έλεγχο του κύκλου χρώσης. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν 1-2 σαφώς ορατά πράσινα σήματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης CEN-17 PNA έχει υβριδιώσει με επιτυχία την κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν επίσης 1-2 σαφώς ορατά ερυθρά σήματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης TOP2A DNA έχει υβριδιώσει με επιτυχία την περιοχή-στόχο του TOP2A. Λόγω της τομής ιστού, μερικά φυσιολογικά κύτταρα θα εξακολουθούν να έχουν λιγότερα από τα αναμενόμενα 2 σήματα κάθε χρώματος. P04092GR_02/K σελ. 16/41

17 Φυσιολογικά κύτταρα που βρίσκονται στη διαδικασία κυτταρικής διαίρεσης ενδέχεται να παρουσιάζουν περισσότερα από τα φυσιολογικά 1-2 σήματα κάθε χρώματος. Εάν δεν ανιχνευτούν σήματα σε φυσιολογικά κύτταρα, υποδηλώνεται αποτυχία της δοκιμασίας και τα αποτελέσματα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 3. Κατά την αξιολόγηση με χρήση φίλτρου DAPI, η πυρηνική μορφολογία πρέπει να είναι άθικτη. Πολυάριθμα ίχνη κυττάρων και μια γενική πενιχρή πυρηνική μορφολογία υποδηλώνουν υπερβολική πέψη του δείγματος, με αποτέλεσμα απώλεια ή κατατεμαχισμό των σημάτων. Τέτοια δείγματα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 4. Τυχόν διαφορές στη μονιμοποίηση, την επεξεργασία και την έγκλειση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σημαντική μεταβλητότητα στα αποτελέσματα, καθιστώντας αναγκαία την τακτική αξιολόγηση των εσωτερικών μαρτύρων. Ερμηνεία της χρώσης Ιστός κατάλληλος για εκτίμηση Μόνο δείγματα από ασθενείς με διηθητικό καρκίνωμα πρέπει να εξετάζονται. Σε περιπτώσεις με καρκίνωμα in situ και διηθητικό καρκίνωμα στο ίδιο δείγμα, μόνον το διηθητικό συστατικό πρέπει να βαθμολογείται. Αποφεύγετε περιοχές νέκρωσης και περιοχές όπου τα πυρηνικά όρια είναι αμφίβολα. Μη συμπεριλαμβάνετε πυρήνες που απαιτούν υποκειμενική κρίση. Παραβλέψτε πυρήνες με ασθενή ένταση σήματος και μη ειδικό ή υψηλό υπόβαθρο. Χρησιμοποιήστε το φίλτρο DAPI για να ελέγξετε για ομοιόμορφη χρώση των πυρήνων. Απαρίθμηση σήματος: Εντοπίστε τον όγκο εντός του πλαισίου της χρωματισμένης με H&E αντικειμενοφόρου πλάκας και αξιολογήστε την ίδια περιοχή στην χρωματισμένη με FISH αντικειμενοφόρο πλάκα. Σαρώστε αρκετές περιοχές των καρκινικών κυττάρων έτσι ώστε να εξγήσετε πιθανή ετερογένεια. Επιλέξτε μια περιοχή που έχει καλή κατανομή των πυρήνων. Αρχίστε την ανάλυση στο άνω αριστερό τεταρτημόριο της επιλεγμένης περιοχής και, σαρώνοντας από αριστερά προς τα δεξιά, καταμετρήστε τον αριθμό των σημάτων εντός του ορίου κάθε πυρήνα που έχει αξιολογηθεί σύμφωνα με τις ακόλουθες οδηγίες (δείτε επίσης Παράρτημα 3). Εστιάστε προς τα πάνω και προς τα κάτω ώστε να εντοπίσετε όλα τα σήματα στο μεμονωμένο πυρήνα. Καταμετρήστε δύο σήματα που έχουν το ίδιο μέγεθος και διαχωρίζονται από απόσταση ίση με ή μικρότερη από τη διάμετρο του σήματος, ως μόνον ένα σήμα. Σε πυρήνες με υψηλά επίπεδα ενίσχυσης του γονιδίου TOP2A, τα σήματα TOP2A είναι δυνατό να βρίσκονται πολύ κοντά μεταξύ τους, σχηματίζοντας μια συστάδα σημάτων. Στις περιπτώσεις αυτές, ο αριθμός των σημάτων TOP2A δεν είναι δυνατό να καταμετρηθεί, αλλά πρέπει να υπολογιστεί κατά προσέγγιση. Πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στα πράσινα σήματα, καθώς είναι δυνατό να καλυφθούν από συστάδες ερυθρών σημάτων TOP2A καθιστώντας αδύνατη την παρατήρησή τους. Σε περίπτωση αμφιβολίας, παρακαλούμε ελέγξτε τα πράσινα σήματα με χρήση ειδικού φίλτρου FITC. Μην βαθμολογείτε πυρήνες χωρίς κανένα πράσινο σήμα. Βαθμολογείτε μόνον εκείνους τους πυρήνες με ένα ή περισσότερα πράσινα σήματα αναφοράς. Καταγράψτε τις καταμετρήσεις σε έναν πίνακα όπως παρουσιάζεται στο Παράρτημα 2. P04092GR_02/K σελ. 17/41

18 Οδηγός καταμέτρησης σημάτων 1 Μην καταμετράτε. Οι πυρήνες επικαλύπτονται μεταξύ τους, δεν είναι ορατές όλες οι περιοχές των πυρήνων. 2 Μετρήστε ως δύο πράσινα σήματα. 3 Δύο ερυθρά σήματα. Μην βαθμολογείτε πυρήνες με μόνο ερυθρά σήματα. 4 Καταμετρήστε ως 3 πράσινα και 12 ερυθρά σήματα (εκτίμηση συστάδων). 5 Καταμετρήστε ως 1 πράσινο και 1 ερυθρό σήμα. Δύο σήματα του ιδίου μεγέθους και διαχωρισμένα κατά απόσταση ίση ή μικρότερη από τη διάμετρο του ενός σήματος καταμετρούνται ως ένα. 6 Μην καταμετράτε (πυρήνες που έχουν υποστεί υπερβολικά ή υψηλή ή υπερβολικά χαμηλή χώνευση). Ελλείποντα σήματα στο κέντρο των πυρήνων (εμφάνιση τύπου donut). 7 Καταμετρήστε ως 2 πράσινα και 3 ερυθρά σήματα. Δύο σήματα του ιδίου μεγέθους και διαχωρισμένα κατά απόσταση ίση ή μικρότερη από τη διάμετρο του ενός σήματος καταμετρούνται ως ένα. 8 Καταμετρήστε ως 1 πράσινο και 5 ερυθρά σήματα. 9 Καταμετρήστε ως 3 πράσινα (1 πράσινο εκτός εστίασης) και 3 ερυθρά σήματα. 10 Συστάδα ερυθρών σημάτων που αποκρύπτουν πράσινα σήματα. Ελέγξτε τα πράσινα σήματα με ειδικό φίλτρο FITC ή μην καταμετράτε. Τα σήματα μπορούν να καταμετρηθούν είτε με τη συμβατική μέθοδο (41) είτε με μια εναλλακτική μέθοδο που μειώνει τον κόπο και το χρόνο του έργου (21, 29). Αντί για τη συμβατική μέθοδο καταμέτρησης σημάτων σε 60 πυρήνες, βαθμολογείται ένα σύνολο 60 συμβάντων, όπου ένα συμβάν είναι ένα ερυθρό σήμα γονιδίου. Με αυτήν την εναλλακτική μέθοδο καταμέτρησης, βαθμολογείται ένας μεταβλητός αριθμός πυρήνων μέχρι να καταμετρηθούν 60 ερυθρά σήματα TOP2A. Καταγράφονται τα αντίστοιχα πράσινα σήματα CEN-17 στους ίδιους πυρήνες. Ο ελάχιστος αριθμός πυρήνων προς βαθμολόγηση είναι 6. Σε φυσιολογικά κύτταρα, μέσος όρος 35 πυρήνων επαρκεί για την καταμέτρηση 60 ερυθρών σημάτων. Σε περιπτώσεις ενίσχυσης, περιλαμβάνονται 6-35 πυρήνες. Ακόμα και σε περιπτώσεις διαγραφών, συχνά επαρκούν λιγότεροι από 60 πυρήνες. Αν είναι δυνατόν, μετρήστε τους πυρήνες από 3 διακριτές περιοχές όγκου (42). Υπολογίστε την αναλογία TOP2A/CEN-17 διαιρώντας το συνολικό αριθμό ερυθρών σημάτων TOP2A δια του συνολικού αριθμού πράσινων σημάτων CEN-17. Δείγματα με αναλογία TOP2A/CEN-17 μεγαλύτερη ή ίση με 2 πρέπει να θεωρείται ότι παρουσιάζουν ενίσχυση του TOP2A και δείγματα με αναλογία TOP2A/CEN-17 μικρότερη του 0,8 πρέπει να θεωρείται ότι παρουσιάζουν διαγραφή του TOP2A (18, 21, 29). Αποτελέσματα ίσα ή πλησίον της τιμής αποκλεισμού (1,8 2,2 για ενισχύσεις και 0,7 0,9 για διαγραφές) πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Συνιστάται να επιβεβαιώνετε ότι οι βαθμολογίες δεν περιλαμβάνουν υψηλό ποσοστό φυσιολογικών πυρήνων. Αν η αναλογία εμπίπτει σε οποιαδήποτε από τις δύο διφορούμενες ζώνες, ή σε περίπτωση αβεβαιότητας, συνιστάται η βαθμολογία του δείγματος να επαληθεύεται με αναβαθμολόγηση από P04092GR_02/K σελ. 18/41

19 δεύτερο άτομο, μέσω της καταμέτρησης πυρήνων από 3 ακόμα περιοχές όγκου ή/και καταμέτρησης ενός συνόλου 60 πυρήνων. Συνιστάται κριτήριο αποδοχής ±10% CV. Η τελική αναλογία πρέπει να υπολογίζεται εκ νέου με βάση όλες τις βαθμολογίες. Για οριακές περιπτώσεις, είναι απαραίτητη διαβούλευση μεταξύ του παθολογοανατόμου και του θεράποντος ιατρού. Περιορισμοί Γενικοί περιορισμοί 1. Η μέθοδος FISH είναι μια διεργασία πολλαπλών βημάτων, η οποία απαιτεί ειδικευμένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, καθώς και στην επιλογή, μονιμοποίηση και επεξεργασία ιστού, παρασκευή της αντικειμενοφόρου πλάκας FISH και ερμηνεία των αποτελεσμάτων της χρώσης. 2. Τα αποτελέσματα της μεθόδου FISH εξαρτώνται από το χειρισμό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλμένη μονιμοποίηση, πλύση, στέγνωμα, θέρμανση, σχηματισμός τομών ή μόλυνση με άλλους ιστούς ή υγρά ενδέχεται να επηρεάσει τον υβριδισμό των ιχνηθετών. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσματα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των μεθόδων μονιμοποίησης και έγκλεισης ή σε εγγενείς ανωμαλίες εντός του ιστού. 3. Για βέλτιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα, οι αντικειμενοφόρες πλάκες με τον ιστό πρέπει να αποπαραφινώνονται εντελώς. Η αφαίρεση της παραφίνης χρειάζεται να ολοκληρωθεί κατά την έναρξη της διαδικασίας χρώσης. (Δείτε τις ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα B.2). 4. Πρέπει να χρησιμοποιείται μόνον υδατόλουτρο βαθμονομημένης θερμοκρασίας, θερμαντική πλάκα και φούρνος υβριδισμού. Η χρήση άλλων τύπων εξοπλισμού ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσμα την εξάτμιση του Μίγματος ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH κατά τη διάρκεια του υβριδισμού και πρέπει να επικυρώνεται από το χρήστη. Χαρακτηριστικά απόδοσης Αναλυτική ευαισθησία Η ευαισθησία του Μίγματος ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH εξετάστηκε με χρήση 18 φυσιολογικών επιθηλιακών δειγμάτων ανθρώπινου μαστού. Η αναλογία μεταξύ του αριθμού των σημάτων TOP2A και των σημάτων CEN-17 υπολογίστηκε με βάση μια καταμέτρηση 60 πυρήνων ανά δείγμα. Η αναλογία TOP2A/CEN-17 για τα 18 φυσιολογικά επιθηλιακά δείγματα ανθρώπινου μαστού ήταν μεταξύ 0,97 1,11. Αναλυτική ειδικότητα Οι ιχνηθέτες TOP2A DNA στο μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH έχουν υποβληθεί σε προσδιορισμό της αλληλουχίας του άκρου τους και χαρτογραφηθεί ώστε να επιβεβαιώνουν μια συνολική κάλυψη 228 kb, συμπεριλαμβανομένου του γονιδίου TOP2A. Οι ιχνηθέτες CEN-17 PNA στο μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH έχουν εξεταστεί μεμονωμένα και σε συνδυασμό για την επιβεβαίωση του ειδικού υβριδισμού τους στην κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17. Για να μετρηθεί η ικανότητα της δοκιμασίας να αναγνωρίζει μόνο τις ουσίες-στόχο TOP2A και CEN-17 χωρίς παρεμβολές από άλλες ουσίες, διεξήχθησαν μελέτες σε δείγματα ιστού από φυσιολογικό επιθήλιο ανθρώπινου μαστού με χρήση του Φιαλιδίου 3 που περιείχε το ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού αλλά χωρίς το μίγμα ιχνηθετών. Αξιολογήθηκε ένα σύνολο 18 δειγμάτων αναφορικά με την παρουσία σημάτων που δεν σχετίζονταν με το μίγμα ιχνηθετών. Δεν εντοπίστηκαν άλλα χρωμοσώματα-στόχοι ούτε παρατηρήθηκε παρεμβολή με στενά σχετιζόμενες ουσίες σε οποιοδήποτε εκ των 18 δειγμάτων. Μελέτες ισχύος Η ισχύς της δοκιμασίας TOP2A IQFISH pharmdx εξετάστηκε με μεταβολή του χρόνου προκατεργασίας, της θερμοκρασίας, καθώς και των μεθόδων θέρμανσης του ρυθμιστικού διαλύματος προκατεργασίας (φούρνος μικροκυμάτων ή υδατόλουτρο), του χρόνου και της μεθόδου επώασης της πεψίνης (πεψίνη RTU ή εμβάπτιση), του χρόνου και της P04092GR_02/K σελ. 19/41

20 θερμοκρασίας μετουσίωσης, του χρόνου υβριδισμού, καθώς και του χρόνου και της θερμοκρασίας ισχυρής πλύσης. Δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική διαφορά σε αποτελέσματα στις ακόλουθες πειραματικές συνθήκες: Προκατεργασία, Μέθοδος A). Υδατόλουτρο επί 10 λεπτά σε συνδυασμό με καθεμία από τις θερμοκρασίες 95 C, C, και 99 C και συγχρόνως 9, 10 και 11 λεπτά στους C Προκατεργασία, Μέθοδος B). Φούρνος μικροκυμάτων για 9, 10, και 11 λεπτά στους >95 C. Χώνευση πεψίνης, Μέθοδος A), με χρόνους επώασης 5, 10, και 15 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C). Χώνευση πεψίνης, Μέθοδος Β), με χρόνους επώασης 3, 4, και 5 λεπτών στους 37 C. Χώνευση πεψίνης, Μέθοδος Γ), με χρόνους επώασης 20, 25, και 30 λεπτών σε συνδυασμό με καθεμία από τις θερμοκρασίες των 35, 37, και 39 C. Μετουσίωση επί 10 λεπτά σε συνδυασμό με κάθε μία από τις θερμοκρασίες των 65, 66, και 67 C και συγχρόνως 9, 10, και 11 λεπτά στους 66 C. Χρόνος υβριδισμού των 60, 90, και 120 λεπτών στους 45 C. Ισχυρή πλύση επί 10 λεπτά σε συνδυασμό με κάθε μία από τις θερμοκρασίες των 61, 63, και 65 C και συγχρόνως 9, 10, και 11 λεπτά στους 63 C. Ορισμένοι συνδυασμοί χρόνου και θερμοκρασίας στα ακραία όρια των ανοχών είχαν ως αποτέλεσμα ελαφρώς υποβαθμισμένη ποιότητα δομής των ιστών αν και δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην ένταση των σημάτων. Η διαδικασία χρώσης για το TOP2A IQFISH pharmdx προσφέρει μεταβλητές πρωτοκόλλου για θερμική προκατεργασία, χώνευση πεψίνης και χρόνο υβριδισμού. Κάθε μοναδική επιλογή συνδυασμού επικυρώθηκε αναφορικά με την κατάσταση του γονιδίου TOP2A. Η επικύρωση διεξήχθη σε 10 δείγματα FFPE καρκινώματος ανθρώπινου μαστού για κάθε μία από τις 12 πιθανές επιλογές συνδυασμών. Το TOP2A FISH pharmdx Kit (K5333) χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά. Η αναλογία TOP2A/CEN-17 για κάθε μεμονωμένο δείγμα παρουσιάζεται στην Εικόνα 1. Οι διασταυρώσεις μεταβλητών μεταξύ των 12 δοκιμών και της χρώσης αναφοράς έδειξαν συνολική συμφωνία 100% (10/10) για την κατάσταση του γονιδίου TOP2A με το χαμηλότερο και ανώτερο όριο εμπιστοσύνης 95% του αμφίπλευρου ελέγχου στα 78,3% και 100%, αντίστοιχα. Η τιμή κ ήταν 1,00 και η δοκιμή McNemars έδειξε απουσία μεροληψίας (αμφίπλευρη τιμή p 1,00). P04092GR_02/K σελ. 20/41

21 Εικόνα 1. Μεμονωμένες αναλογίες TOP2A/CEN-17 για 10 δείγματα καρκινώματος ανθρώπινου μαστού χρωματισμένα με χρήση των 12 πιθανών παραλλαγών συνδυαστικών πρωτοκόλλων με το TOP2A IQFISH pharmdx (Κωδικός K5733) (Δοκιμή 1-12) και το κιτ αναφοράς (R) TOP2A FISH pharmdx Kit (Κωδικός K5333). Η πάνω οριζόντια γραμμή απεικονίζει την τιμή αποκλεισμού 2,0 και η κάτω οριζόντια γραμμή απεικονίζει την τιμή αποκλεισμού 0,8. Επαναληψιμότητα Η επαναληψιμότητα της αναλογίας TOP2A/CEN-17 διερευνήθηκε με τον προσδιορισμό TOP2A IQFISH pharmdx με χρήση διαδοχικών τομών από εννέα δείγματα καρκινώματος ανθρώπινου μαστού με κατάσταση γονιδίου TOP2A είτε με διαγραφές, είτε φυσιολογική, είτε ενισχυμένη. Οι τομές κάθε δείγματος εξετάστηκαν εις τριπλούν στον ίδιο κύκλο. Ο μέσος συντελεστής διακύμανσης ήταν 3% (εύρος από 1% έως 4%) για δείγματα με διαγραφές του TOP2A, 7% (εύρος από 2% έως 10%) για δείγματα με φυσιολογικό TOP2A, και 5,3% (εύρος από 4% έως 7%) για δείγματα με ενίσχυση του TOP2A. Εξετάστηκαν συνολικά πέντε διαδοχικές τομές τεσσάρων δειγμάτων καρκινώματος ανθρώπινου μαστού με διαφορετικά πάχη (3, 4, 5, 6, και 7 µm) με το TOP2A IQFISH pharmdx. Ο μέσος συντελεστής διακύμανσης της αναλογίας TOP2A/CEN-17 ήταν 9,8% (εύρος από 6% έως 13%). Αναπαραγωγιμότητα Η δοκιμασία TOP2A IQFISH pharmdx εξετάστηκε ως προς την αναπαραγωγιμότητα μεταξύ παρτίδων και μεταξύ παρατηρητών με χρήση τριών παρτίδων TOP2A IQFISH pharmdx και τριών παρατηρητών. Η αναπαραγωγιμότητα εξατάστηκε σε εννέα διαφορετικά δείγματα καρκινώματος ανθρώπινου μαστού με κατάσταση γονιδίου TOP2A είτε με διαγραφές, είτε φυσιολογική, είτε ενισχυμένη. Ο μέσος συντελεστής διακύμανσης για την αναπαραγωγιμότητα μεταξύ παρτίδων ήταν 3,7% για δείγματα με διαγραφές του TOP2A (εύρος από 2% έως 6%), 10,3% για δείγματα με φυσιολογικό TOP2A (εύρος από 10% έως 11%), και 9,3% για δείγματα με ενίσχυση του TOP2A (εύρος από 5% έως 12%). P04092GR_02/K σελ. 21/41

22 Ο μέσος συντελεστής διακύμανσης για την αναπαραγωγιμότητα μεταξύ παρατηρητών ήταν 13,7% για δείγματα με διαγραφές του TOP2A (εύρος από 7% έως 17%), 7% για δείγματα με φυσιολογικό TOP2A (εύρος από 2% έως 11%), και 12,7% για δείγματα με ενίσχυση του TOP2A (εύρος από 10% έως 15%). Κλινική χρησιμότητα Η δοξορουβικίνη και η επιρουβικίνη είναι ανθρακυκλίνες που βρίσκονται μεταξύ των αντικαρκινικών φαρμάκων ευρείας χρήσης και έχει διαπιστωθεί ότι η τοποϊσομεράση IIα είναι ο μοριακός στόχος της φαρμακολογικής δράσης των ενώσεων αυτών (14, 15). Η δοξορουβικίνη και η επιρουβικίνη έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικές σε έναν αριθμό κακοηθειών, μεταξύ των οποίων ο καρκίνος του μαστού, όπου χρησιμοποιούνται τόσο για μεταστατική νόσο όσο και σε συμπληρωματικό πλαίσιο (15). Για τη συμπληρωματική αγωγή του καρκίνου του μαστού, κλινικά στοιχεία έχουν δείξει ότι τα σχήματα χημειοθεραπείας που περιλαμβάνουν δοξορουβικίνη ή επιρουβικίνη έχουν ως αποτέλεσμα στατιστικά σημαντική βελτίωση της επιβίωσης σε σύγκριση με σχήματα που δεν περιέχουν ανθρακυκλίνες (43, 44). Ο θεραπευτικός δείκτης των ανθρακυκλινών είναι χαμηλός και η αυξημένη δραστικότητα προκύπτει εις βάρος μεγαλύτερης τοξικότητας σε σύγκριση με άλλα χημειοθεραπευτικά σχήματα, π.χ. CMF (κυκλοφωσφαμίδη/μεθοτρεξάτη/5-φθοριοουρακίλη) (19, 45). Εκτός από οξεία τοξικότητα, αγωγή με δοξορουβικίνη ή επιρουβικίνη ενδέχεται να προκαλέσει μακροπρόθεσμες παρενέργειες καρδιοτοξικότητας και δευτεροπαθούς οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας (AML) (6, 15). Η καρδιομυοπάθεια που προκαλείται από την θεραπεία συχνά είναι μη αναστρέψιμη και μπορεί να εξελιχθεί σε συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια πολλούς μήνες ή χρόνια μετά την ολοκλήρωση της αγωγής. Με σκοπό τη βελτιστοποίηση της ιατρικής αγωγής με δοξορουβικίνη και επιρουβικίνη είναι σημαντικό οι κλινικοί να διαθέτουν εργαλεία που να μπορούν να αναγνωρίσουν τους ασθενείς που είναι πιθανότερο να ωφεληθούν από θεραπεία με δοξορουβικίνη και επιρουβικίνη. Η κλινική απόδοση του Dako TOP2A FISH pharmdx Kit (Κωδικός K5333) διερευνήθηκε σε δύο μελέτες που διεξήχθησαν από το Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG - Δανέζικη Ομάδα Συνεργασίας για τον Καρκίνο του Μαστού) στην Κοπεγχάγη (21, 29, 30, 46). Πιλοτική μελέτη Η κλινική απόδοση του TOP2A FISH pharmdx Kit αξιολογήθηκε σε μια πιλοτική μελέτη σε δείγματα από 120 ασθενείς με καρκίνο του μαστού (29) σε συνεργασία με την DBCG. Ένα σύνολο 20 όγκων παρουσίασαν αλλαγές του αριθμού αντιγράφων του TOP2A, οι οποίες μοιράζονταν σχεδόν ισόποσα μεταξύ ενισχύσεων (n=11) και διαγραφών (n=9). Οι αλλαγές του TOP2A δεν διαπιστώθηκαν αποκλειστικά σε όγκους θετικούς για το HER2, καθώς 4 όγκοι (20% των περιπτώσεων με μη φυσιολογικό TOP2A) ήταν αρνητικοί για το HER2. Μια αναλογία (ερυθρά σήματα/πράσινα σήματα) μεγαλύτερη ή ίση με 2 διαχωρίζει μεταξύ περιπτώσεων ενίσχυσης και φυσιολογικών περιπτώσεων, ενώ μια αναλογία μικρότερη του 0,8 συσχετίζεται με διαγραφές του γονιδίου. Η πιλοτική μελέτη έδειξε ότι 2 διαφορετικές μέθοδοι καταμέτρησης έδωσαν πανομοιότυπα αποτελέσματα: τα σήματα καταμετρήθηκαν είτε σε 60 πυρήνες είτε ένα σύνολο 60 ερυθρών σημάτων καταμετρήθηκε σε συνδυασμό με τα πράσινα σήματα στους ίδιους πυρήνες. Η τελευταία μέθοδος παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι μετριέται ο υψηλότερος αριθμός κυττάρων στις περιπτώσεις των διαγραφών και στις φυσιολογικές περιπτώσεις, ενώ μετριέται ο χαμηλότερος αριθμός κυττάρων στις περιπτώσεις των ενισχύσεων. Οι περιπτώσεις των ενισχύσεων συχνά αναγνωρίζονται προφανώς με απλή θέαση του μικροσκοπίου, αλλά απαιτούν περισσότερο χρόνο για αξιολόγηση εάν πρέπει να βαθμολογηθούν 60 πυρήνες. Μελέτη επιβεβαίωσης - DBCG 89D/TOP2A Σε μεγαλύτερη κλίμακα, η κλινική απόδοση του TOP2A FISH pharmdx Kit αξιολογήθηκε με βάση δείγματα όγκων που συλλέχθηκαν προοπτικά από τη συμπληρωματική μελέτη DBCG 89D (21, 30, 46, 47). P04092GR_02/K σελ. 22/41

23 Σχεδιασμός μελέτης Ο κύριος σκοπός της μελέτης DBCG 89D/TOP2A ήταν η διερεύνηση του εάν οι παρεκκλίσεις του γονιδίου TOP2A (ενίσχυση ή διαγραφή) θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για την επιβίωση χωρίς υποτροπή και για τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς υψηλού κινδύνου με καρκίνο του μαστού που προορίζονται για αγωγή με συμπληρωματική χημειοθεραπεία με βάση την επιρουβικίνη. Ως δευτερεύοντες στόχοι, μελετήθηκαν οι προγνωστικές ιδιότητες των παρεκκλίσεων του γονιδίου TOP2A καθώς και η συσχέτιση μεταξύ TOP2A και HER2. Η μελέτη DBCG 89D σχεδιάστηκε ως ανοικτή, προοπτική, τυχαιοποιημένη μελέτη. Μετά από χειρουργική επέμβαση, 980 προεμμηνοπαυσιακές και μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με διηθητικό καρκίνο του μαστού υψηλού κινδύνου τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες CMF ή CEF (κυκλοφωσφαμίδη/επιρουβικίνη/5-φθοριοουρακίλη). Η βασική έκβαση αποτελεσματικότητας ήταν RFS (επιβίωση χωρίς υποτροπή) με την OS (συνολική επιβίωση) ως δευτερεύον τελικό σημείο. Για τη βιολογική υπομελέτη DBCG 89D/TOP2A, συλλέχθηκαν ιστοτεμάχια από ασθενείς που είχαν συμμετάσχει στη μελέτη DBCG 89D στα κέντρα μελέτης και αναλύθηκαν σε κεντρικό χώρο αναδρομικά για παρεκκλίσεις των γονιδίων TOP2A και HER2 (Dako HER2 FISH pharmdx Kit) όπως και για υπερέκφραση του HER2 (Dako HercepTest ). Ήταν διαθέσιμα ιστοτεμάχια από 806 εκ των 980 ασθενών που συμμετείχαν στη μελέτη DBCG 89D. Αναφορικά με τις παρεκκλίσεις των γονιδίων TOP2A και HER2, η αναλογία υπολογίστηκε ως ο αριθμός των σημάτων για τους ιχνηθέτες των γονιδίων διά του αριθμού σημάτων για το κεντρομερίδιο 17. Οι περιπτώσεις βαθμολογήθηκαν ως ενισχύσεις FISH των HER2 ή TOP2A όταν η αναλογία ήταν 2. Θεωρήθηκε υπάρχουσα η διαγραφή του TOP2A όταν η αναλογία ήταν <0,8. Η κατάσταση του TOP2A κατηγοριοποιήθηκε στις εξής ομάδες: Διαγραφή: Αναλογία TOP2A/CEN-17 <0,8 Φυσιολογικό: 0,8 Αναλογία TOP2A/CEN-17 <2,0 Ενίσχυση: Αναλογία TOP2A/CEN-17 2,0 Για το HercepTest, όλα τα θετικά δείγματα 1+, 2+ και 3+ υποβλήθηκαν σε ανάλυση HER2. Η βαθμολόγηση της θετικότητας HER2 (48) στη μελέτη ήταν ως εξής: Θετική: HercepTest=3+, ή HercepTest=2+ και αναλογία FISH HER2 2,0 Αρνητική: HercepTest=0,1+, ή HercepTest=2+ και αναλογία FISH HER2 <2,0 Η κλινική μελέτη (DBCG 89D) και η βιολογική υπομελέτη (DBCG 89D/TOP2A) διεξήχθησαν σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και εγκρίθηκαν από τις τοπικές Επιτροπές Δεοντολογίας. Στατιστική μεθοδολογία Το βασικό τελικό σημείο για τη μελέτη ήταν η RFS, προσδιορισμένη ως ο χρόνος από την τυχαιοποίηση έως κάποιο συμβάν ή την αποκοπή. Το δευτερεύον τελικό σημείο ήταν η OS, προσδιορισμένη ως ο χρόνος από την τυχαιοποίηση έως το θάνατο ή την αποκοπή. Το αποτέλεσμα της θεραπείας με CEF έναντι CMF για την RFS και την OS ποσοτικοποιήθηκε με όρους αναλογίας κινδύνου, και η εκτίμηση έγινε με χρήση του μοντέλου αναλογικού κινδύνου του Cox. Το μοντέλο αναλογικού κινδύνου του Cox προσαρμόστηκε σύμφωνα με τα αποτελέσματα των διαδικασιών ποιότητας προσαρμογής και τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης, προσδιορίζοντας το βασικό πολυμεταβλητό μοντέλο Cox για ανάλυση της RFS και της OS. Η αναλογία κινδύνου (HR), το διάστημα εμπιστοσύνης 95% και η τιμή p της δοκιμής κατά Wald αποδόθηκε για κάθε συμμεταβλητή και όρο αλληλεπίδρασης στο μοντέλο Cox. Η HR για αγωγή με CEF έναντι αγωγής με CMF σε κάθε υποομάδα του TOP2A (και υποομάδα του HER2) συνήχθη από τα αποτελέσματα και παρουσιάστηκε με ένα δενδρόγραμμα. Αφού προσαρμόστηκε το μοντέλο αναλογικού κινδύνου του Cox σύμφωνα με τα αποτελέσματα των διαδικασιών ποιότητας προσαρμογής και τις διερευνήσεις αλληλεπίδρασης, διεξήχθησαν 3 είδη δευτερευόντων αναλύσεων. Εκτίμηση πολυμεταβλητών στις 3 υποομάδες TOP2A: διαγραφής, φυσιολογική, ενίσχυσης. P04092GR_02/K σελ. 23/41

24 Εκτίμηση πολυμεταβλητών στις 2 υποομάδες HER2: αρνητική, θετική. Ενοποιημένη εκτίμηση πολυμεταβλητών για όλους τους ασθενείς συμπεριλαμβανομένης της αλληλεπίδρασης TOP2A και HER2. Οι συσχετίσεις μεταξύ της κατάστασης του TOP2A και των κλινικών και παθολογοανατομικών μεταβλητών, συμπεριλαμβανομένης της κατάστασης του HER2, δοκιμάστηκαν με τη δοκιμή χ2. Ο χρόνος παρακολούθησης ποσοτικοποιήθηκε με όρους μιας εκτίμησης Kaplan-Meier για την πιθανή παρακολούθηση. Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις για πιθανή μεροληψία επιλογής με χρήση της δοκιμής χ2 και της δοκιμής λογαριθμικής κατάταξης. Ασθενείς με ελλείπουσες τιμές, εκτός από την κατάσταση υποδοχέα, αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις πολυμεταβλητών στο μοντέλο αναλογικού κινδύνου του Cox. Αποτελέσματα Η ανάλυση TOP2A FISH ήταν επιτυχής στα 773 από τα 806 (96%) δείγματα καρκίνου του μαστού. Η συνολική κατανομή της κατάστασης TOP2A ανάμεσα στους επιλέξιμους ασθενείς παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Ενίσχυση του TOP2A παρουσιάστηκε σε 92 (11,9%) εκ των 773 επιλέξιμων ασθενών και διαγραφή σε 87 (11,3%). Πίνακας 1. Κατανομή της κατάστασης TOP2A Κατάσταση TOP2A n (%) Διαγραφή Φυσιολογική Ενίσχυση 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) Σύνολο 773 (100) Η κατανομή των ενισχύσεων και των διαγραφών του TOP2A σε σχέση με την κατάσταση του HER2 παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2. Κατανομή της κατάστασης HER2 σε σχέση με την κατάσταση TOP2A Κατάστασ η HER2 TOP2A N n (%) Διαγραφ ή n (%) Φυσιολογικ ή n (%) Ενίσχυση n (%) Αρνητικό 527 (100) 26 (4,9) 487 (92,4) 14 (2,7) Θετική 246 (100) 61 (24,8) 107 (43,5) 78 (31,7) Σύνολο 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) τιμή p χ 2 p< 0,0001 Κοιτώντας την κατάσταση του HER2, περισσότερες παρεκκλίσεις του TOP2A διαπιστώθηκαν ανάμεσα στους θετικούς για HER2 όγκους. Οι παρεκκλίσεις του TOP2A εμφανίστηκαν σε 139 (56,5%) εκ των 246 θετικών για HER2 όγκων και σε 40 (7,6%) εκ των 527 αρνητικών για HER2 όγκων. Έτσι, 40 (22,3%) ασθενείς με παρεκκλίσεις του TOP2A θα είχαν παραβλεφθεί εάν είχαν αναλυθεί μόνο τα θετικά για HER2 δείγματα. Η κατανομή των παρεκκλίσεων του TOP2A σε σχέση με την κατάσταση HER2 FISH παρουσιάζεται στον Πίνακα 3. Αναφορικά με την κατάσταση του HER2, διαπιστώθηκε μια σημαντική συσχέτιση με την κατάσταση του TOP2A. Πίνακας 3. Κατανομή της κατάστασης HER2 FISH σε σχέση με την κατάσταση TOP2A HER2 FISH TOP2A Φυσιολογικ ή N n (%) Διαγραφ ή n (%) Φυσιολογικ ή n (%) Ενίσχυση n (%) 539 (100) 31 (5,8) 493 (91,5) 15 (2,8) τιμή p χ 2 p< 0,0001 P04092GR_02/K σελ. 24/41

25 Ενίσχυση 234 (100) 56 (23,9) 101 (43,2) 77(32,9) Σύνολο 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) Η κατανομή των παρεκκλίσεων του TOP2A σε σχέση με τη βαθμολογία του HercepTest παρουσιάζεται στον Πίνακα 4. Αναφορικά με την κατάσταση του HER2, διαπιστώθηκε μια σημαντική συσχέτιση με την κατάσταση του TOP2A. Πίνακας 4. Κατανομή της βαθμολογίας του HercepTest σε σχέση με την κατάσταση TOP2A TOP2A N n (%) Διαγραφ ή n (%) Φυσιολογικ ή n (%) Ενίσχυση n (%) τιμή p χ (5,3) 192 (91,9) 6 (2,9) (100) (100) 13 (5,1) 238 (92,6) 6 (2,3) p< 0,0001 HercepTest (100) 3 (3,9) 65 (83,3) 10 (12,8) (26,2) 99 (43,3) 70 (30,6) (100) Σύνολο 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) Για έξι από τους 773 ασθενείς με διαθέσιμα στοιχεία για το TOP2A έλειπαν κλινικά δεδομένα και έτσι αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις πολυμεταβλητών. Για ασθενείς με διαθέσιμα αποτελέσματα της δοκιμής TOP2A, ο πιθανός χρόνος παρακολούθησης για την RFS ήταν 9,4 έτη και οι αντίστοιχοι αριθμοί συμβάντων ήταν 371. Ο διάμεσος του πιθανού χρόνου παρακολούθησης για την OS ήταν 11,1 έτη, και οι αριθμοί συμβάντων ήταν 336. Τα διαγράμματα Kaplan Meier για την RFS αναφορικά με τις 2 ομάδες αγωγής σε κάθε μία από τις 3 ομάδες του TOP2A παρουσιάζονται στην Εικόνα 2-4. Εικόνα 2. RFS για ασθενείς με αγωγή CMF και CEF με όγκους ενίσχυσης του TOP2A P04092GR_02/K σελ. 25/41

26 Εικόνα 3. RFS για ασθενείς με αγωγή CMF και CEF με όγκους φυσιολογικού TOP2A Εικόνα 4. RFS για ασθενείς με αγωγή CMF και CEF με όγκους διαγραφής TOP2A Τόσο στην ομάδα ασθενών με ενίσχυση του TOP2A όσο και στην ομάδα με διαγραφή του TOP2A, η αγωγή με CEF διαπιστώθηκε ότι είναι ανώτερη της αγωγής με CMF. Για τους ασθενείς με ενίσχυση του TOP2A, η διαφορά ήταν σημαντική (p=0,037). Δεν ήταν δυνατός ο εντοπισμός τέτοιας διαφοράς για την ομάδα ασθενών με φυσιολογικό TOP2A. Για το βασικό τελικό σημείο της μελέτης (RFS), οι αναλύσεις με χρήση του μοντέλου αναλογικού κινδύνου του Cox έδειξαν σημαντική προγνωστική αξία των παρεκκλίσεων του γονιδίου TOP2A (p=0,016). Η ομάδα ασθενών με ενισχύσεις του TOP2A παρουσίασαν σχετική μείωση κινδύνου άνω του 60% με αγωγή CEF σε σύγκριση με CMF (HR=0,389, τιμή p=0,0017). Διαπιστώθηκε μείωση κινδύνου και για τις διαγραφές του TOP2A. Ωστόσο, δεν ήταν στατιστικά σημαντική (HR=0,608, τιμή p=0,0828). Στην Εικόνα 5, η σχετική δράση των CEF σε κάθε μία από τις υποομάδες TOP2A και HER2 παρουσιάζονται σε σχέση με την RFS. P04092GR_02/K σελ. 26/41

27 Εικόνα 5. Σχετική δράση των CEF σε καθεμία από τις υποομάδες TOP2A και HER2 για την RFS (Δενδρόγραμμα) Για την OS, παρουσιάστηκαν παρόμοια αποτελέσματα με της RFS, αλλά όχι σημαντικά (p=0,14). Η ομάδα ασθενών με ενισχύσεις του TOP2A παρουσίασαν μείωση κινδύνου άνω του 50% με αγωγή CEF σε σύγκριση με CMF (HR=0,485, τιμή p=0,0142). Για την RFS, διαπιστώθηκε μη σημαντική μείωση κινδύνου για τις διαγραφές του TOP2A (HR=0,678, τιμή p=0,155). Η Εικόνα 6 παρουσιάζει τη σχετική δράση των CEF σε καθεμία από τις υποομάδες TOP2A και HER2 σε σχέση με την OS. P04092GR_02/K σελ. 27/41

28 Εικόνα 6. Σχετική δράση των CEF σε κάθε μία από τις υποομάδες TOP2A και HER2 για την OS (Δενδρόγραμμα) Διερευνήθηκε επίσης η προγνωστική αξία της κατάστασης του HER2 και τα δεδομένα δεν έδειξαν σημαντική επίδραση αναφορικά με αλληλεπιδράσεις της αγωγής, είτε για την RFS είτε για την OS. Ανάλυση της κατανομής των παρεκκλίσεων του TOP2A αναφορικά με τα χαρακτηριστικά της γραμμής βάσης έδειξε σημαντική συσχέτιση με πολλούς εκ των παγιωμένων ιστοπαθολογικών προγνωστικών παραγόντων. Επιπλέον, τα δεδομένα κατέδειξαν ότι η αναλογία γυναικών με παρεκκλίσεις του TOP2A αυξανόταν με την ηλικία, έχοντας ως αποτέλεσμα υψηλότερη συχνότητα ανάμεσα στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες απ' ό,τι στις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Οι μονομεταβλητές αναλύσεις επιβίωσης υπέδειξαν αρνητική σημαντική επίδραση τόσο για την RFS όσο και για την OS, καθώς ασθενείς με ενισχύσεις και διαγραφές παρουσίασαν σημαντική μείωση της επιβίωσης σε σύγκριση με ασθενείς με κατάσταση φυσιολογικού TOP2A. Οι καμπύλες επιβίωσης κατέδειξαν επίσης ότι ασθενείς με διαγραφές παρουσίασαν ακόμα χειρότερη πρόγνωση από τους ασθενείς με κατάσταση ενίσχυσης ή φυσιολογική κατάσταση του TOP2A. Οι καμπύλες επιβίωσης για ασθενείς με κατάσταση ενίσχυσης, διαγραφής ή φυσιολογική κατάσταση του TOP2A παρουσιάζονται στην Εικόνα 7. P04092GR_02/K σελ. 28/41

29 Εικόνα 7. Κατάσταση TOP2A αναφορικά με την RFS και την OS (N=767) Εκτός από τη συσχέτιση με παγιωμένους κλινικούς προγνωστικούς παράγοντες, διαπιστώθηκε ότι οι παρεκκλίσεις του TOP2A είχαν ανεξάρτητη προγνωστική αξία. Με χρήση του μοντέλου αναλογικού κινδύνου του Cox, αποδείχτηκε ότι μια παρέκκλιση γονιδίου TOP2A συσχετίστηκε με σημαντικά χειρότερη πρόγνωση τόσο αναφορικά με την RFS (p=0,0169) όσο και με την OS (p=0,0118). Η HR και τα όρια εμπιστοσύνης 95% με βάση το μοντέλο Cox για την RFS και την OS παρουσιάζονται στον Πίνακα 5 και 6. P04092GR_02/K σελ. 29/41

30 Πίνακας 5. HR για την RFS Συμπεριλαμβάνεται αλληλεπίδραση TOP2A και αγωγής Μεταβλητή τιμή p HR 95% Δ.Ε. Εμμηνόπαυση 0,0576 Προ Μετά 1 (0,99 1,60) 1,26 Μέγεθος όγκου <0,0001 πρ. αυξανόμενα 1,15 (1,09 1,22) cm Θετικοί <0,0001 λεμφαδένες ,01 4,16 (1,39 2,91) (2,88 6,02) Κατάσταση TOP2A Διαγραφή Φυσιολογική Ενίσχυση Κατάσταση HER2 Αρνητική Θετική 0,0169 0,2998 1,66 1 1,56 (1,12 2,45) (1,00 2,42) 1 1,15 (0,88 1,49) Πίνακας 6. HR για την OS Συμπεριλαμβάνεται αλληλεπίδραση TOP2A και αγωγής Μεταβλητή τιμή p HR 95% Δ.Ε. Εμμηνόπαυση 0,0124 Προ Μετά 1 1,37 (1,07 1,75) Μέγεθος όγκου πρ. αυξανόμενα <0,0001 1,16 (1,10 1,23) cm Θετικοί λεμφαδένες Κατάσταση TOP2A Διαγραφή Φυσιολογική Ενίσχυση Κατάσταση HER2 Αρνητική Θετική <0,0001 0,0118 0, ,62 5,50 1,82 1 1,37 (1,70 4,04) (3,58 8,45) (1,22 2,71) (0,87 2,16) 1 1,31 (1,00 1,72) Όταν οι HR των διαφόρων μεταβλητών στον Πίνακα 5 (RFS) κατατάσσονται αναφορικά με την προγνωστική αξία, ο κατάλογος έχει ως εξής: αριθμός θετικών λεμφαδένων > κατάσταση TOP2A > κατάσταση εμμηνόπαυσης > κατάσταση HER2 και μέγεθος όγκου. Όπως φαίνεται από την κατάταξη αυτή, ο αριθμός θετικών λεμφαδένων είναι η μία μεταβλητή που διαθέτει τη μεγαλύτερη προγνωστική επίδραση και ακολουθεί η κατάσταση του TOP2A, η κατάσταση της εμμηνόπαυσης, το μέγεθος του όγκου και η κατάσταση του HER2. Όταν επαναλήφθηκε η κατάταξη για την OS (Πίνακας 6), τα αποτελέσματα ήταν P04092GR_02/K σελ. 30/41

31 παρόμοια με της RFS, υποδεικνύοντας ισχυρή προγνωστική αξία της κατάστασης του TOP2A. Διερευνήθηκε επίσης η προγνωστική αξία της κατάστασης του HER2 και οι μονομεταβλητές αναλύσεις επιβίωσης υπέδειξαν αρνητική σημαντική επίδραση τόσο για την RFS όσο και για την OS, καθώς οι θετικοί για HER2 ασθενείς παρουσίασαν μείωση της επιβίωσης σε σύγκριση με ασθενείς με φυσιολογική κατάσταση HER2. Η βασική ανάλυση της RFS με χρήση της ανάλυσης παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου του Cox δεν έδειξε σημαντική επίδραση της κατάστασης του HER2. Κατά την επανάληψη της ανάλυσης αναφορικά με την OS, η θετική για HER2 κατάσταση αποδείχτηκε ότι παρουσιάζει σημαντική αρνητική επίδραση επί της επιβίωσης. Συζήτηση και συμπέρασμα Η μελέτη DBCG 89D/TOP2A κατέδειξε σημαντική προβλεπτική και προγνωστική αξία των παρεκκλίσεων του γονιδίου TOP2A. Με βάση τις συγκρίσεις με την κατάσταση του HER2, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η κατάσταση του HER2 και η κατάσταση του TOP2A δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά μεταξύ τους, ούτε για την προβλεπτική ούτε για την προγνωστική αξία τους. Το TOP2A είναι ο μοριακός στόχος της φαρμακολογικής δράσης της επιρουβικίνης και η μελέτη κατέδειξε ότι οι παρεκκλίσεις του γονιδίου TOP2A, ιδιαιτέρως οι ενισχύσεις, είναι χρήσιμες ως προγνωστικός δείκτης για την απόκριση στην επιρουβικίνη. Η χημειοθεραπεία με βάση τις ανθρακυκλίνες με δοξορουβικίνη ή επιρουβικίνη είναι μεταξύ των δραστικότερων σχημάτων για τον καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, οι ενώσεις αυτές παρουσιάζουν σημαντικές οξείες και μακροπρόθεσμες σοβαρές παρενέργειες, όπως καρδιοτοξικότητα και λευχαιμία. Συγκριτική μελέτη μεταξύ TOP2A FISH pharmdx Kit και TOP2A IQFISH pharmdx Το Dako TOP2A IQFISH pharmdx (Κωδικός K5733) συγκρίθηκε με το Dako TOP2A FISH pharmdx Kit (Κωδικός K5333) σε μια συγκριτική μελέτη 80 δειγμάτων ιστού καρκινώματος ανθρώπινου μαστού. Η διασταύρωση μεταβλητών της κατάστασης του γονιδίου TOP2A που έγινε από τους δυο προσδιορισμούς κατέληξε σε γενική συμφωνία 100% με χαμηλότερο και ανώτερο όριο για το διάστημα εμπιστοσύνης 95% στα 96,9% και 100%. Η τιμή κ ήταν 1. P04092GR_02/K σελ. 31/41

32 Αντιμετώπιση προβλημάτων Πρόβλημα Πιθανή αιτία Προτεινόμενη ενέργεια 1. Δεν παρουσιάζονται σήματα ή είναι ασθενή 1α. Το κιτ κατά τη διάρκεια της μεταφοράς ή της αποθήκευσης του εκτέθηκε σε υψηλές θερμοκρασίες. 1β. Το μικροσκόπιο δεν λειτουργεί σωστά - Ακατάλληλο σετ φίλτρου - Ακατάλληλος λαμπτήρας - Ο λαμπτήρας υδραργύρου είναι πάρα πολύ παλιός - Ακάθαρτοι ή/και ραγισμένοι φακοί συλλέκτες - Ακατάλληλο έλαιο κατάδυσης 1α. Ελέγξτε τις συνθήκες φύλαξης. Βεβαιωθείτε ότι υπήρχε ξηρός πάγος κατά την παραλαβή της αποστολής. Βεβαιωθείτε ότι το φιαλίδιο 3 αποθηκεύτηκε στους -18 C στο σκοτάδι. Βεβαιωθείτε ότι τα φιαλίδια 2Α και 5 αποθηκεύτηκαν στους 2 8 C και ότι τα φιαλίδια αποθηκεύτηκαν στο σκοτάδι. 1β. Ελέγξτε το μικροσκόπιο και βεβαιωθείτε ότι τα χρησιμοποιημένα φίλτρα είναι κατάλληλα για χρήση με τα φθορισμοχρώματα του κιτ και ότι ο λαμπτήρας υδραργύρου είναι σωστός και δεν έχει χρησιμοποιηθεί πέρα από την αναμενόμενη διάρκεια ζωής του. (Δείτε το παράρτημα 3). Σε περίπτωση αμφιβολίας, παρακαλούμε επικοινωνήστε με τον τοπικό προμηθευτή του μικροσκοπίου σας. 1γ. Εξασθενημένα σήματα 1γ. Αποφύγετε τη μικροσκοπική εξέταση μακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρές πηγές φωτός. 1δ. Εσφαλμένες συνθήκες προκατεργασίας 1ε. Εξάτμιση του μίγματος ιχνηθετών κατά τη διάρκεια του υβριδισμού 1δ. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόμενη θερμοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόμενο χρόνο. 1ε. Διασφαλίστε επαρκή υγρασία στο θάλαμο υβριδισμού 2. Απουσία πράσινων σημάτων 3. Δεν υπάρχουν ερυθρά σήματα 2α. Εσφαλμένες συνθήκες ισχυρής πλύσης 3α. Εσφαλμένες συνθήκες προκατεργασίας 2α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιούνται οι συνιστώμενες τιμές θερμοκρασίας και χρόνου ισχυρής πλύσης και ότι οι καλυπτρίδες αφαιρούνται πριν από την εκτέλεση της ισχυρής πλύσης 3α. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόμενη θερμοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόμενο χρόνο P04092GR_02/K σελ. 32/41

33 Πρόβλημα Πιθανή αιτία Προτεινόμενη ενέργεια 4. Περιοχές χωρίς σήμα 4α. Ο όγκος του ιχνηθέτη είναι πάρα πολύ μικρός 4β. Έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα κατά τη διάρκεια της εφαρμογής ή της επικάλυψης του μίγματος ιχνηθετών 4α. Βεβαιωθείτε ότι ο όγκος του ιχνηθέτη είναι αρκετά μεγάλος για την κάλυψη της περιοχής κάτω από την καλυπτρίδα 4β. Αποφύγετε το σχηματισμό φυσαλίδων αέρα. Εάν παρατηρηθούν, κτυπήστε ελαφρά με χρήση λαβίδας για να τις αφαιρέσετε 5. Υπερβολική χρώση υποβάθρου 6. Πενιχρή μορφολογία ιστού 5α. Ακατάλληλη μονιμοποίηση ιστού 5β. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς 5γ. Η θερμοκρασία ισχυρής πλύσης είναι πάρα πολύ χαμηλή 5δ. Παρατεταμένη έκθεση της υβριδιωμένης τομής σε ισχυρό φως 6α. Εσφαλμένη επεξεργασία με πεψίνη 6β. Εσφαλμένες συνθήκες προκατεργασίας ενδέχεται να έχουν ως αποτέλεσμα ασαφή ή νεφελώδη εμφάνιση 6γ. Πάρα πολύ μακρά επεξεργασία με Πεψίνη ή πάρα πολύ λεπτό πάχος τομής ενδέχεται να προκαλέσει την εμφάνιση ιχνών κυττάρων ή κυττάρων σχήματος κουλούρας. 5α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιούνται μόνον τομές ιστών μονιμοποιημένες με φορμαλίνη και εγκλεισμένες σε παραφίνη 5β. Ακολουθήστε τις διαδικασίες αποπαραφίνωσης και επανενυδάτωσης που περιγράφονται στην ενότητα B.2 5γ. Βεβαιωθείτε ότι η θερμοκρασία ισχυρής πλύσης είναι 63 (±2) C 5δ. Αποφύγετε τη μικροσκοπική εξέταση μακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρό φως 6α. Τηρείτε τους συνιστώμενους χρόνους επώασης της πεψίνης. Δείτε την ενότητα B.3, βήμα 2. Βεβαιωθείτε ότι ο χειρισμός της πεψίνης γίνεται στη σωστή θερμοκρασία. Δείτε την ενότητα B.1 6β. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόμενη θερμοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόμενο χρόνο 6γ. Μειώστε το χρόνο επώασης της πεψίνης. Δείτε την ενότητα B.3, βήμα 2. Βεβαιωθείτε ότι το πάχος της τομής είναι 4 6 µm. P04092GR_02/K σελ. 33/41

34 Πρόβλημα Πιθανή αιτία Προτεινόμενη ενέργεια 7. Υψηλό επίπεδο πράσινου αυτοφθορισμού στην αντικειμενοφόρο συμπεριλαμβανομέ νων περιοχών χωρίς ιστό FFPE 7. Χρήση ληγμένων ή μη συνιστώμενων γυάλινων αντικειμενοφόρων 7. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης για την επιστρωμένη γυάλινη αντικειμενοφόρο (Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003, ή αντικειμενοφόρες πλάκες επιστρωμένες με πολυ-lλυσίνη). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το πρόβλημα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες ή εάν η προτεινόμενη διορθωτική ενέργεια δεν επιτυγχάνει την επίλυση του προβλήματος, παρακαλούμε επικοινωνήστε με την Τεχνική Υπηρεσία της Dako για περαιτέρω βοήθεια. P04092GR_02/K σελ. 34/41

35 Παράρτημα 1 TOP2A IQFISH pharmdx, Κωδικός K5733 Λίστα ελέγχου του πρωτοκόλλου Ημερομηνία εκτέλεσης: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 Παρτίδα: Κωδ. αριθμός δείγματος: Κωδ. αριθμός εξοπλισμού: Ημερομηνία αραίωσης/λήξης του 1x Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωμένο 1:20): / Κωδ. αριθμός ημερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Ιστός μονιμοποιημένος με ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης Ναι Όχι Βήμα 1: Προκατεργασία Ημερομηνία αραίωσης/λήξης του διαλύματος προκατεργασίας (Φιαλίδιο 1 αραιωμένο 1:20) Μετρημένη θερμοκρασία του διαλύματος προκατεργασίας (95 99 C) C Προκατεργασία (10 λεπτά) και ψύξη (15 λεπτά) Πλύση σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωμένο 1:20) (2 x 3 λεπτά) Βήμα 2: Πεψίνη Διάρκεια της επεξεργασίας με πεψίνη (Φιαλίδιο 2) στους 37 C ή Διάρκεια της επεξεργασίας με πεψίνη (Φιαλίδιο 2) σε θερμοκρασία δωματίου ή Διάρκεια της εμβάπτισης σε πεψίνη στους 37 (±2) C Πλύση σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωμένο 1:20) (2 x 3 λεπτά) Αφυδάτωση αντικειμενοφόρων πλακών (3 x 2 λεπτά) σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης και στέγνωμα με αέρα Βήμα 3: Μίγμα ιχνηθετών TOP2A/CEN-17 IQISH Εφαρμογή του μίγματος ιχνηθετών (Φιαλίδιο 3), κάλυψη με καλυπτρίδα και στεγανοποίηση με στεγανοποιητικό καλυπτρίδων Μετρημένη θερμοκρασία μετουσίωσης (66 ±1 C) C Μετουσίωση επί 10 λεπτά Μετρημένη θερμοκρασία υβριδισμού (45 ±2 C) C Ολονύκτιος υβριδισμός (προστασία από το φως) Βήμα 4: Ισχυρή πλύση Ημερομηνία αραίωσης/λήξης του ισχυρού ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (Φιαλίδιο 4 αραιωμένο 1:20) Μετρημένη θερμοκρασία ισχυρού ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (63 ±2 C) C Ισχυρή πλύση (10 λεπτά) μετά την αφαίρεση των καλυπτρίδων Πλύση σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωμένο 1:20) (2 x 3 λεπτά) Αφυδάτωση αντικειμενοφόρων πλακών (3 x 2 λεπτά) σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης και στέγνωμα με αέρα Βήμα 5: Επικάλυψη Εφαρμογή 15 µl Μέσου επικάλυψης φθορισμού (Φιαλίδιο 5) και κάλυψη με καλυπτρίδα / / Λεπτά Λεπτά Λεπτά Σχόλια: Ημερομηνία και υπογραφή, Τεχνικός: P04092GR_02/K σελ. 35/41

36 Παράρτημα 2 TOP2A IQFISH pharmdx, Κωδικός K5733 Σχήμα βαθμολόγησης Κωδ. αριθμός ημερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Ημερομηνία εκτέλεσης: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 Παρτίδα: Κωδ. αριθμός δείγματος: Αρ. πυρήνων Βαθμολογία TOP2A Βαθμολογία CEN-17 Αρ. πυρήνων Βαθμολογία TOP2A Βαθμολογία CEN-17 Αρ. πυρήνων Βαθμολογία TOP2A Βαθμολογία CEN-17 Σύνολο (1-20) Σύνολο (21-40) Σύνολο (41-60) Για τον προσδιορισμό της αναλογίας TOP2A/CEN-17, μετρήστε τον αριθμό των σημάτων TOP2A και τον αριθμό των σημάτων CEN-17 είτε σε 60 πυρήνες είτε τον αριθμό των πυρήνων που απαιτείται για 60 σήματα TOP2A (δείτε την ενότητα Ερμηνεία της χρώσης). Διαιρέστε το συνολικό αριθμό των σημάτων του TOP2A διά του συνολικού αριθμού των σημάτων CEN-17. Αν η αναλογία TOP2A/CEN-17 είναι οριακή (0,7 0,9 ή 1,8 2,2), μετρήστε και πάλι το δείγμα και υπολογίστε εκ νέου την αναλογία με βάση όλα τα κύτταρα που μετρήθηκαν. Αριθμός μετρημένων κυττάρων Σήματα TOP2A Σήματα CEN-17 Αναλογία TOP2A/CEN-17 Διαγραφή γονιδίου TOP2A (Αναλογία < 0,8) Φυσιολογική κατάσταση γονιδίου TOP2A (0,8 Αναλογία <2 Ενίσχυση γονιδίου TOP2A (Αναλογία 2) Ημερομηνία και υπογραφή, Τεχνικός: Ημερομηνία και υπογραφή, Παθολογοανατόμος: Σχόλια: Για κατευθυντήριες οδηγίες βαθμολόγησης: δείτε την ενότητα Ερμηνεία της χρώσης. P04092GR_02/K σελ. 36/41

37 Παράρτημα 3 TOP2A IQFISH pharmdx, Κωδικός K5733 Προδιαγραφές μικροσκοπίου φθορισμού Η Dako συνιστά τον ακόλουθο εξοπλισμό για χρήση με το κιτ TOP2A IQFISH pharmdx, K5733: 1. Τύπος μικροσκοπίου Μικροσκόπιο επιφθορισμού. 2. Λαμπτήρας Λαμπτήρας υδραργύρου 100 W (διατηρείτε αρχείο του χρόνου λειτουργίας του λαμπτήρα). 3. Αντικειμενικοί φακοί Για διερεύνηση του ιστού, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν ξηροί αντικειμενικοί φακοί φθορισμού 10X ή ελαιοκαταδυτικοί φακοί φθορισμού 16X. Για μεγέθυνση υψηλής ισχύος και βαθμολόγηση των σημάτων, συνιστώνται μόνον ελαιοκαταδυτικοί αντικειμενικοί φακοί φθορισμού, π.χ. 100X. 4. Φίλτρα Τα φίλτρα έχουν σχεδιαστεί ατομικά για ειδικά φθορισμοχρώματα και πρέπει να επιλέγονται αναλόγως. Η Dako συνιστά τη χρήση ειδικού φίλτρου DAPI σε συνδυασμό με διπλό φίλτρο Texas Red/FITC υψηλής ποιότητας. Φίλτρο DAPI Διπλό φίλτρο Texas Red/FITC Για επιβεβαίωση είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν μονά φίλτρα Texas Red και FITC. Φθορισμόχρωμα Μήκος κύματος διέγερσης Μήκος εκπομπής FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm κύματος Τα φίλτρα είναι ειδικά για κάθε τύπο μικροσκοπίου και η χρήση κατάλληλων φίλτρων είναι ζωτικής σημασίας για την ερμηνεία. Εάν θέλετε λεπτομερείς πληροφορίες, παρακαλούμε επικοινωνήστε με τον προμηθευτή του μικροσκοπίου σας ή με τον αντιπρόσωπο της Dako. 5. Έλαιο Μη φθορίζον έλαιο. Προφυλάξεις Δεν συνιστάται χρήση λαμπτήρα υδραργύρου 50 W. Δεν είναι δυνατή η χρήση φίλτρων ροδαμίνης. Δε συνιστώνται τριπλά φίλτρα. Ένα μη βελτιστοποιημένο μικροσκόπιο μπορεί να προκαλέσει προβλήματα κατά την ανάγνωση των σημάτων φθορισμού. Είναι σημαντικό να μην έχει λήξει η φωτεινή πηγή και να έχει ευθυγραμμιστεί και εστιαστεί σωστά. Οι πελάτες πρέπει να παρακολουθούν και να ακολουθούν τις συστάσεις του κατασκευαστή για το λαμπτήρα υδραργύρου. Το μικροσκόπιο πρέπει να συντηρείται και ο λαμπτήρας υδραργύρου πρέπει να είναι σε ευθυγράμμιση πριν από την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Πρέπει να καταβάλλεται προσπάθεια έκθεσης του δείγματος σε όσο το δυνατόν λιγότερο φως διέγερσης προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η εξασθένηση του φθορισμού. Συνιστούμε να συζητάτε την εγκατάσταση του συγκεκριμένου μικροσκοπίου σας με τον κατασκευαστή πριν από την έναρξη του in situ υβριδισμού με φθορισμό ή να ανατρέχετε στη βιβλιογραφία. P04092GR_02/K σελ. 37/41

38 Βιβλιογραφία 1. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3: Austin CA, Marsh KL. Eukaryotic DNA topoisomerase II beta. Bioessays 1998;20: Roca J. The mechanisms of DNA topoisomerases. Trends Biochem Sci 1995;20: Tsai-Pflugfelder M, Liu LF, Liu AA, Tewey KM, Whang-Peng J, Knutsen T, et al. Cloning and sequencing of cdna encoding human DNA topoisomerase II and localization of the gene to chromosome region 17q Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Sng JH, Heaton VJ, Bell M, Maini P, Austin CA, Fisher LM. Molecular cloning and characterization of the human topoisomerase IIalpha and IIbeta genes: evidence for isoform evolution through gene duplication. Biochim Biophys Acta 1999;1444: Smith K, Houlbrook S, Greenall M, Carmichael J, Harris AL. Topoisomerase II alpha coamplification with erbb2 in human primary breast cancer and breast cancer cell lines: relationship to m-amsa and mitoxantrone sensitivity. Oncogene 1993;8: Petit T, Wilt M, Velten M, Millon R, Rodier JF, Borel C, et al. Comparative value of tumour grade, hormonal receptors, Ki-67, HER-2 and topoisomerase II alpha status as predictive markers in breast cancer patients treated with neoadjuvant anthracycline-based chemotherapy. Eur J Cancer 2004;40: Nakopoulou L, Lazaris AC, Kavantzas N, Alexandrou P, Athanassiadou P, Keramopoulos A, et al. DNA topoisomerase II-alpha immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer. Pathobiology 2000;68: Durbecq V, Desmed C, Paesmans M, Cardoso F, Di Leo A, Mano M, et al. Correlation between topoisomerase-iialpha gene amplification and protein expression in HER-2 amplified breast cancer. Int J Oncol 2004;25: Mueller RE, Parkes RK, Andrulis I, O'Malley FP. Amplification of the TOP2A gene does not predict high levels of topoisomerase II alpha protein in human breast tumor samples. Genes Chromosomes Cancer 2004;39: Callagy G, Pharoah P, Chin SF, Sangan T, Daigo Y, Jackson L, et al. Identification and validation of prognostic markers in breast cancer with the complementary use of array-cgh and tissue microarrays. J Pathol 2005;205: Cardoso F, Durbecq V, Larsimont D, Paesmans M, Leroy JY, Rouas G, et al. Correlation be tween complete response to anthracycline-based chemotherapy and topoisomerase II-alpha gene amplification and protein overexpression in locally advanced/metastatic breast cancer. Int J Oncol 2004;24: Hande KR. Topoisomerase II inhibitors. Cancer Chemother Biol Response Modif 2003;21: Tewey KM, Rowe TC, Yang L, Halligan BD, Liu LF. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase II. Science 1984;226: Hortobagyi GN. Anthracyclines in the treatment of cancer. An overview. Drugs 1997;54 Suppl 4: Järvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Grenman S, et al. Amplification and deletion of topoisomerase IIα associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. Am J Pathol 2000;156: Coon JS, Marcus E, Gupta-Burt S, Seelig S, Jacobson K, Chen S, et al. Amplification and Overexpression of Topoisomerase IIalpha Predict Response to Anthracycline-based Therapy in Locally Advanced Breast Cancer. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Gancberg D, Larsimont D, Tanner M, Jarvinen T, Rouas G, et al. HER-2 amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in node-positive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline-based therapy or with cyclophosphamide, methotrexate, and 5-fluorouracil. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Cardoso F, Durbecq V, Giuliani R, Mano M, Atalay G, et al. Predictive molecular markers in the adjuvant therapy of breast cancer: state of the art in the year Int J Clin Oncol 2002;7: P04092GR_02/K σελ. 38/41

39 20. Park K, Kim J, Lim S, Han S. Topoisomerase II-alpha (topoii) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy. Eur J Cancer 2003;39: Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, Nielsen KV, et al. Retrospective analysis of topoisomerase IIa amplifications and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil or cyclophosphamide, epirubicin, and fluorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group. J Clin Oncol 2005;23: Tanner M, Isola J, Wiklund T, Erikstein B, Kellokumpu-Lehtinen P, Malmstrom P, et al. Topoisomerase IIalpha gene amplification predicts favorable treatment response to tailored and dose-escalated anthracycline-based adjuvant chemotherapy in HER-2/neu-amplified breast cancer: Scandinavian Breast Group Trial J Clin Oncol 2006;24: O'Malley F, Chia S, Tu D, Shepherd L, Levine M, Huntsman D, et al. Prognostic and predictive value of topoisomerase II alpha in a randomized trial comparing CMF to CEF in premenopausal women with node positive breast cancer (NCIC CTG MA.5). Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement): Press MF, Mass RD, Zhou JY, Sullivan-Halley J, Villalobos IE, Lieberman G, et al. Association of topoisomerase II-alpha (TOP2A) gene amplification with responsiveness to anthracyclinecontaining chemotherapy among women with metastatic breast cancer entered in the Herceptin H0648g pivotal clinical trial. In: ASCO Annual Meeting; Abstract No Slamon D, Eiermann W, Robert N, al. e. Phase III randomized trial comparing doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel (AC-T) with doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel and trastuzumab (AC-TH) with docetaxel, carboplatin and trastuzumab (TCH) in HER2 positive early breast cancer patients: BCIRG 006 study. Breast Cancer Res Treat 2005; 94: S5 (Abstr 1). 26. Harris L, Dressler L, Cowan D, Berry D, Cirrincione C, Broadwater G, et al. The role of HER-2 + Topo IIa Amplification in predicting benefit form CAF dose escalation CALGB ASCO Annual Meeting; Abstract no Park K, Han S, Gwak GH, Kim HJ, Kim J, Kim KM. Topoisomerase II-alpha gene deletion is not frequent as its amplification in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2006;98(3): Villman K, Sjostrom J, Heikkila R, Hultborn R, Malmstrom P, Bengtsson NO, et al. TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. Acta Oncol 2006;45: Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Balslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol 2004;43: Knoop A, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen B, Overgaard J, During M, et al. TOP2A aberrations as predictive and prognostic marker in high-risk breast cancer patients. A randomized DBCG Trial (DBCG89D). In: Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: Järvinen TAH, Tanner M, Bärlund M, Borg Å, Isola J. Characterization of Topoisomerase IIα Gene Amplification and Deletion in Breast Cancer. Genes Chromosomes Cancer 1999;26: Jarvinen TA, Liu ET. Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer-- more common than anticipated. Cytopathology 2003;14: Bofin AM, Ytterhus B, Hagmar BM. TOP2A and HER-2 gene amplification in fine needle aspirates from breast carcinomas. Cytopathology 2003;14: Pritchard KI, Shepherd LE, O'Malley FP, Andrulis IL, Tu D, Bramwell VH, et al. HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy. N Engl J Med 2006;354: Sledge GW, Jr. Is HER-2/neu a predictor of anthracycline utility? No. J Natl Cancer Inst Monogr 2001: Nielsen KV, Müller S, Poulsen TS, Gabs S, Schonau A. Combined Use of PNA and DNA for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). In: Nielsen PE, editor. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. 2 ed. Norfolk: Horizon Bioscience; p P04092GR_02/K σελ. 39/41

40 37. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule C, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92: Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, Humphreys S, Jasani B, Miller K, et al. Best Practice No 176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2004;57: Poole CJ, Earl HM, Hiller L, Dunn JA, Bathers S, Grieve RJ, et al. Epirubicin and cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil as adjuvant therapy for early breast cancer. N Engl J Med 2006;355: Group EBCTC. Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365: Kelleher M, Miles D. 21. The adjuvant treatment of breast cancer. Int J Clin Pract 2003;57: Jørgensen JT, Nielsen KV, Ejlertsen B. Pharmacodiagnostics and Targeted Therapies - A rational approach for individualizing medical anti-cancer therapy in breast cancer. Oncologist 2007;12: Ejlertsen B, Mouridsen HT, Jensen MB, Andersen J, Cold S, Edlund P, et al. Improved outcome from substituting methotrexate with epirubicin: Results from a randomised comparison of CMF versus CEF in patients with primary breast cancer. Eur J Cancer 2007;43: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16: P04092GR_02/K σελ. 40/41

41 Επεξήγηση συμβόλων Αριθμός καταλόγου/ κωδικός αριθμός Περιορισμοί θερμοκρασίας Αριθμός παρτίδας In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Διατηρείτε μακριά από τον ήλιο (συμβουλευτείτε το τμήμα "Αποθήκευση") Περιεχόμενο επαρκές για "ν" εξετάσεις Ημερομηνία λήξης Κατασκευαστής Εικονοσύμβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύμβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύμβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύμβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύμβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Αναθεώρηση Κατασκευάζεται από την: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Τηλ Φαξ P04092GR_02/K σελ. 41/41