Αλκαλική φωσφατάση στρεπταβιδίνης

Transcript

1 Dako LSAB 2 System-AP Κωδικός K ml Κωδικός K ml Χρήση για την οποία προορίζεται Για in vitro διαγνωστική χρήση. Οι οδηγίες αυτές ισχύουν για το Universal Dako LSAB 2 System, Alkaline Phosphatase (LSAB2 System, AP) για χρήση µε πρωτογενή αντισώµατα από κουνέλι και ποντικό που παρέχονται από το χρήστη. Το σύστηµα αυτό, αποτελούµενο από αντιδραστήρια σηµασµένης βιοτίνης στρεπταβιδίνης (LSAB), προορίζεται για την ποιοτική παρουσίαση των αντιγόνων σε ιστούς ενσωµατωµένους σε παραφίνη, τοµές κρυοστάτη και κυτταρικά παρασκευάσµατα. Το σύστηµα αυτό είναι χρήσιµο για δείγµατα που περιέχουν υψηλή ενδογενή δραστικότητα υπεροξειδάσης. Είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν ιστοί που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία σε ποικιλία µονιµοποιητικών, οι οποίοι περιλαµβάνουν αιθανόλη, B-5, Bouin s και ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµόλης. Ανατρέξτε στην ενότητα Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση ή στην ενότητα Οδηγίες του συστήµατος ανίχνευσης των ανοσοϊστοχηµικών (IHC) διαδικασιών για: (1) Αρχή της διαδικασίας, (2) Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται (3) Φύλαξη, (4) Παρασκευή δείγµατος, (5) ιαδικασία χρώσης, (6) Ποιοτικός έλεγχος, (7) Αντιµετώπιση προβληµάτων, (8) Ερµηνεία της χρώσης, (9) Γενικοί περιορισµοί. Περίληψη και επεξήγηση Ο σκοπός των τεχνικών ανοσοϊστοχηµικής (IHC) χρώσης είναι να επιτρέπει την οπτικοποίηση των ιστικών (κυτταρικών) αντιγόνων. Τα συστήµατα LSAB2 χρησιµοποιούν µια βελτιωµένη τεχνική αβιδίνης-βιοτίνης, στην οποία ένα βιοτινυλιωµένο δευτερογενές αντίσωµα αντιδρά µε διάφορα συζευγµένα µε αλκαλική φωσφατάση µόρια στρεπταβιδίνης. 1 Το LSAB2 System, AP προσφέρει µια διαδικασία χρώσης πολλαπλών εφαρµογών, η οποία επιτρέπει την ταυτόχρονη επεξεργασία πολυάριθµων δειγµάτων σε λιγότερο από µία ώρα. Πρωτογενή αντισώµατα που παράγονται είτε σε κουνέλια είτε σε ποντικούς αντιδρούν µε το βιοτινυλιωµένο αντίσωµα-σύνδεσµος που παρέχεται σε αυτά τα συστήµατα. Ο συνολικός χρόνος επώασης 40 λεπτών περίπου επιτρέπει το χειρισµό µεγάλων αριθµών δειγµάτων. Το χρωµογόνο υποστρώµατος φουξίνης παρέχεται µε το LSAB2 System, AP των 15 ml (κωδικός K0676) και έχει ως αποτέλεσµα ένα µερικώς διαλυτό ίζηµα χρώµατος φούξια στη θέση του αντιγόνου. Το Fuchsin Substrate-Chromogen System (κωδικός K0624, 110 ml) διατίθεται ως βοηθητικό προϊόν και συνιστάται για χρήση µε το LSAB2 System, AP των 110 ml (κωδικός K0674). Αρχές της διαδικασίας Παρεχόµενα υλικά Η τεχνική που χρησιµοποιείται στο σύστηµα αυτό βασίζεται στη µέθοδο LSAB. 2 Το δείγµα επωάζεται πρώτα επί 10 λεπτά µε ένα κατάλληλα χαρακτηρισµένο και αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα κουνελιού ή ποντικού (που παρέχεται από το χρήστη). Αυτό ακολουθείται από διαδοχικές επωάσεις 10 λεπτών µε το παρεχόµενο βιοτινυλιωµένο αντίσωµα-σύνδεσµο και σηµασµένη µε αλκαλική φωσφατάση στρεπταβιδίνη. Η χρώση ολοκληρώνεται µετά από επώαση 10 λεπτών µε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου. Κωδικός K0674: Παρέχονται τα ακόλουθα υλικά, που επαρκούν για 1100 τοµές ιστών, µε βάση 100 µl ανά τοµή: Ποσότητα 1x110 ml Περιγραφή Αντιδραστήριο Link Βιοτινυλιωµένες ανοσοσφαιρίνες αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (PBS) που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και 0,015 mol/l αζίδιο του νατρίου. 1x110 ml Αλκαλική φωσφατάση στρεπταβιδίνης Στρεπταβιδίνη συζευγµένη σε αλκαλική φωσφατάση σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (PBS) που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και 0,015 mol/l αζίδιο του νατρίου. Συνιστώµενα συµβατά συστήµατα υποστρώµατος: Όνοµα Κωδικός Μεγέθη εξέτασης διαθέσιµα Χρώµα FUCHSIN K εξετάσεις και 1100 εξετάσεις Φούξια FAST RED K εξετάσεις και 1100 εξετάσεις Ερυθρό BCIP/NBT K εξετάσεις Κυανό/µωβ BCIP/NBT/INT K εξετάσεις Καστανό ( ) GR_001 σελ. 1/7

2 Κωδικός K0676: Παρέχονται τα ακόλουθα υλικά, που επαρκούν για 150 τοµές ιστών, µε βάση 100 µl ανά τοµή: Ποσότητα 1x15 ml Περιγραφή Αντιδραστήριο Link Βιοτινυλιωµένες ανοσοσφαιρίνες αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (PBS) που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη. 1x15 ml Αλκαλική φωσφατάση στρεπταβιδίνης Στρεπταβιδίνη συζευγµένη µε αλκαλική φωσφατάση σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (PBS) που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και 0,015 mol/l αζίδιο του νατρίου. 1x2 ml Χρωµογόνο φουξίνης Σε HCl. 1x2 ml Παράγοντας ενεργοποίησης φουξίνης Σε υδατικό διάλυµα. 1x15 ml Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος φουξίνης Φωσφορική ναφθόλη σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris. Παρελκόµενα 1 Βαθµονοµηµένο δοκιµαστικό σωληνάριο Yλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Πρωτογενές αντίσωµα και αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου (δεν παρέχεται στο σύστηµα K0674 ή K0676) Ιστός ελέγχου (θετικός και αρνητικός) Ξυλένιο, τολουόλιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Απεσταγµένο νερό Φιάλες πλύσης Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Απορροφητικά µαντηλάκια οχεία ή λουτρά χρώσης Αντιχρώση: υδατικής βάσης, όπως Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (κωδικός S3309) υδροξείδιο του αµµωνίου 0,037 mol/l Υλικά στερέωσης, όπως Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563), Faramount, Aqueous Mounting Medium, έτοιµο για χρήση (κωδικός S3025) ή υδατικό µόνιµο υλικό στερέωσης, Ultramount (κωδικός S1964) Καλυπτρίδες Οπτικό µικροσκόπιο (20x 800x) Αντικειµενοφόροι πλάκες: αντικειµενοφόροι πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή Silanized Slides (κωδικός S3003) Προαιρετικά υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται PAP Pen (κωδικός S2002) Προφυλάξεις 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Το προϊόν αυτό περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, οι συσσωρεύσεις του NaN 3 ενδέχεται να αντιδράσουν µε τις υδραυλικές σωληνώσεις από µόλυβδο και χαλκό και να σχηµατίσουν ιδιαίτερα εκρηκτικά αζίδια µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε µεγάλες ποσότητες νερού για την πρόληψη της συσσώρευσης αζιδίων στις υδραυλικές σωληνώσεις. 3,11 3. Ελαχιστοποιήστε τη µικροβιακή µόλυνση των αντιδραστηρίων, διότι ενδέχεται να συµβεί αύξηση µη ειδικής χρώσης. 4. Φοράτε κατάλληλο ατοµικό προστατευτικό εξοπλισµό, έτσι ώστε να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. 5. Τυχόν µη χρησιµοποιηµένο διάλυµα θα πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς, εθνικούς και Ευρωπαϊκούς κανονισµούς. 6. ιατίθενται δελτία δεδοµένων ασφαλείας για τους επαγγελµατίες χρήστες κατόπιν αιτήµατος. ( ) GR_001 σελ. 2/7

3 ηλώσεις κινδύνου και ασφάλειας K0676 Παράγοντας ενεργοποίησης φουξίνης R22 Επιβλαβές σε περίπτωση καταπόσεως. Φύλαξη Τα αντιδραστήρια του LSAB2 System, AP πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. Μην καταψύχετε. Μη χρησιµοποιείτε µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στα φιαλίδια των αντιδραστηρίων και στις ετικέτες του κιτ. εν υπάρχουν εµφανή σηµεία που να υποδεικνύουν αστάθεια των προϊόντων αυτών. Εποµένως, θα πρέπει να εξετάζονται θετικά και αρνητικά υλικά ελέγχου ταυτόχρονα µε τα δείγµατα των ασθενών. Εάν παρατηρείται µη αναµενόµενη χρώση που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το κιτ, επικοινωνήστε µε το τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako. Παρασκευή αντιδραστηρίων Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση. ιάλυµα πλύσης Το TBST, 0.05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (κωδικός S3006) είναι το συνιστώµενο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης για αυτοµατοποιηµένη και χειροκίνητη IHC ανίχνευση. Το TBS, 0.05 mol/l Tris Buffered Saline (κωδικός S1968) και το PBS, 0.02 mol/l Phosphate Buffered Saline (κωδικός S3024) είναι επίσης κατάλληλα ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης για χειροκίνητη χρώση. Είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί απεσταγµένο νερό για αφαίρεση µε έκπλυση του διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου και του διαλύµατος αντιχρώσης. Το µη χρησιµοποιηµένο διάλυµα πλύσης είναι δυνατό να φυλαχθεί στους 2 8 C. Εάν το διάλυµα γίνεται νεφελώδες, απορρίψτε το. Πρωτογενές αντίσωµα Για χρήση µε τα συστήµατα LSAB2 διατίθεται µια ευρεία σειρά πρωτογενών αντισωµάτων και αρνητικών υλικών ελέγχου (σειρά προϊόντων N-Series). Εναλλακτικά, διατίθενται από την Dako συµπυκνωµένα αντισώµατα. Ωστόσο, πρέπει να προσδιορίζονται πειραµατικά από το χρήστη βέλτιστες αραιώσεις. Πρέπει να παρασκευάζονται αραιώσεις µε χρήση ρυθµιστικού διαλύµατος 0,05 mol/l Tris-HCl, ph 7,2 7,6, το οποίο περιέχει αλβουµίνη βοείου ορού 1% (Antibody Diluent, κωδικός S0809). 1 Αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου Όταν χρησιµοποιείτε έτοιµα για χρήση αντισώµατα Dako N-Series, ως αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου, συνιστάται το(α) Universal Negative Control(s). Αυτά τα υλικά ελέγχου είναι βελτιστοποιηµένα για χρήση µε τα έτοιµα για χρήση αντισώµατα N-Series είτε ποντικού (κωδικός N1698) είτε κουνελιού (κωδικός N1699). Όταν χρησιµοποιούνται συµπυκνωµένα αντισώµατα, πρέπει να συµπεριλαµβάνεται στη διαδικασία εξέτασης ένα αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου, το οποίο δεν εµφανίζει ειδική αντιδραστικότητα µε ανθρώπινους ιστούς ή φυσιολογικό/µη άνοσο ορό στην ίδια µήτρα ή στο ίδιο διάλυµα, όπως το αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα. Το ιδανικό αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου πρέπει να προέρχεται από το ίδιο ζωικό είδος και την ίδια υποτάξη µε το πρωτογενές αντίσωµα, αραιωµένο στην ίδια συγκέντρωση ανοσοσφαιρίνης ή πρωτεΐνης, όπως το αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα µε χρήση του ίδιου αραιωτικού. Ο χρόνος επώασης για το αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου πρέπει να είναι ο ίδιος µε εκείνον του πρωτογενούς αντισώµατος. ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (συµπεριλαµβάνεται στο K0676) Το Fuchsin (κωδικός K0624) συνιστάται για χρήση µε το LSAB2 System, AP. Το διάλυµα υποστρώµατοςχρωµογόνου πρέπει να χρησιµοποιείται εντός 30 λεπτών από την παρασκευή του. Για καλύτερα δυνατά αποτελέσµατα, παρασκευάζετε αµέσως πριν από τη χρήση. Το ακόλουθο πρωτόκολλο προορίζεται για την παρασκευή 2 ml διαλύµατος, το οποίο επαρκεί για 20 τοµές ιστών ή κυτταρικά δείγµατα. ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου ΒΗΜΑ 1 Τοποθετήστε τρεις σταγόνες (120 µl) χρωµογόνου φουξίνης στο βαθµονοµηµένο δοκιµαστικό σωληνάριο. Για καλύτερα δυνατά αποτελέσµατα, διανείµετε σταγόνες κρατώντας τη φιάλη κατακόρυφα και σφίγγοντας απαλά. ΒΗΜΑ 2 Προσθέστε τρεις σταγόνες (120 µl) αντιδραστηρίου ενεργοποίησης και αναµείξτε απαλά. Για καλύτερα δυνατά αποτελέσµατα, διανείµετε σταγόνες κρατώντας τη φιάλη κατακόρυφα και σφίγγοντας απαλά. ΒΗΜΑ 3 Επωάστε επί ένα λεπτό σε θερµοκρασία δωµατίου. ΒΗΜΑ 4 Προσθέστε ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος έως τη γραµµή των 2 ml (1,76 ml). Αναµείξτε και εφαρµόστε αµέσως στις αντικειµενοφόρους πλάκες.* Σηµείωση: Για την πρόληψη τυχόν µόλυνσης µην αγγίζετε το ρύγχος του σταγονόµετρου µε τα δάκτυλά σας. Εάν είναι απαραίτητη η εισαγωγή ή αφαίρεση, συνιστάται ο χειρισµός του ρύγχους του σταγονόµετρου µε γάντια. Εκπλύνετε το δοκιµαστικό σωληνάριο σχολαστικά µετά από κάθε χρήση. ( ) GR_001 σελ. 3/7

4 *Η ενδογενής δραστικότητα αλκαλικής φωσφατάσης σε µερικούς ιστούς ενδέχεται να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσµατα. Αυτή η ενδογενής δραστικότητα είναι δυνατό να ανασταλεί µε προσθήκη 0,0002 mol/l Levamisole (κωδικός X3021) στο υπόστρωµα-χρωµογόνο. Το Levamisole δεν αναστέλλει την εντερική µορφή ή τη µορφή πλακούντα της αλκαλικής φωσφατάσης και ενδέχεται να µην είναι χρήσιµο για χρώση των δειγµάτων που περιέχουν τα ισοένζυµα αυτά. Υπάρχουν διαθέσιµα επιπλέον χρωµογόνα συµβατά µε την αλκαλική φωσφατάση. Το Fast Red Substrate System (κωδικός K0597) σχηµατίζει ένα διαλυτό ερυθρό χρώµα στη θέση του αντιγόνου-στόχου. Το BCIP/NBT Substrate System (κωδικός K0598) είναι ένα έτοιµο για χρήση προϊόν που σχηµατίζει ένα αδιάλυτο προϊόν αντίδρασης κυανού-µωβ χρώµατος στη θέση του αντιγόνου-στόχου. Το BCIP/NBT/INT Substrate System (κωδικός K0599) είναι επίσης έτοιµο για χρήση και σχηµατίζει ένα καστανό διαλυτό προϊόν αντίδρασης. Παρασκευή δείγµατος Ανατρέξτε στην ενότητα Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση ή/και στο φύλλο προδιαγραφών αντισώµατος. ιαδικασία χρώσης Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Πριν από τη χρήση του συστήµατος αυτού για πρώτη φορά, ο χρήστης πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε το περιεχόµενο, ειδικά µε τα χρώµατα των αντιδραστηρίων, τα οποία εµφανίζονται σε υπόµνηµα στις συνεπτυγµένες οδηγίες που παρέχονται στο εσώκλειστο φυλλωτό ένθετο. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο σύστηµα αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων του συστήµατος ή µεταβολή των χρόνων ή των θερµοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα αποτελέσµατα. Όλα τα αντιδραστήρια του συστήµατος πρέπει να ισορροπούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) πριν από την εκτέλεση της διαδικασίας, παροµοίως, όλες οι επωάσεις πρέπει να εκτελούνται σε θερµοκρασία δωµατίου. Μην αφήνετε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χρώσης. Καλύπτετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες που εκτίθενται σε ρεύµατα αέρα. Για παρατεταµένες επωάσεις, όπου ενδέχεται να λάβει χώρα στέγνωµα ιστών, καλύψτε ή τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε υγρό περιβάλλον. Εάν πρέπει να διακοπεί το πρωτόκολλο χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες πρέπει να διατηρούνται στο λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος το οποίο ακολουθεί την επώαση του αντιδραστηρίου Link επί µία ώρα χωρίς να επηρεάζεται η απόδοση της χρώσης. Πρωτόκολλο χρώσης ΒΗΜΑ 1 ΠΡΩΤΟΓΕΝΕΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ Αφαιρέστε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα. Εφαρµόστε αρκετή ποσότητα βέλτιστα αραιωµένου πρωτογενούς αντισώµατος ή αντιδραστηρίου αρνητικού ελέγχου για την κάλυψη του δείγµατος. Επωάστε επί 10 λεπτά, εκτός εάν καθορίζεται διαφορετικά. Εκπλύνετε απαλά µε διάλυµα πλύσης από µια φιάλη διαλύµατος πλύσης (µην κατευθύνετε απευθείας στον ιστό) και τοποθετήστε σε φρέσκο λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος. ΒΗΜΑ 2 LINK Αφαιρέστε την περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως προηγουµένως. Εφαρµόστε αρκετές ΚΙΤΡΙΝΕΣ σταγόνες (LINK) για την κάλυψη του δείγµατος. Επωάστε επί 10 λεπτά. Εκπλύνετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες, όπως στο βήµα 1. ΒΗΜΑ 3 ΑΛΚΑΛΙΚΗ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗ ΣΤΡΕΠΤΑΒΙ ΙΝΗΣ Σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. Εφαρµόστε αρκετές ΚΟΚΚΙΝΕΣ σταγόνες (Streptavidin-AP) για την κάλυψη του δείγµατος. Επωάστε επί 10 λεπτά. Εκπλύνετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. ΒΗΜΑ 4 ΙΑΛΥΜΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ-ΧΡΩΜΟΓΟΝΟΥ Παρασκευάστε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (δείτε την ενότητα Παρασκευή αντιδραστηρίων ) Σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. Εφαρµόστε αρκετή ποσότητα του παρασκευασµένου διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου για την κάλυψη του δείγµατος. Επωάστε επί 10 λεπτά. Εκπλύνετε απαλά µε απεσταγµένο νερό από µια φιάλη διαλύµατος πλύσης (µην κατευθύνετε απευθείας στον ιστό) και τοποθετήστε σε λουτρό απεσταγµένου νερού. ΒΗΜΑ 5 ΑΝΤΙΧΡΩΣΗ ΚΑΙ ΣΤΕΡΕΩΣΗ Το Fuchsin (κωδικός K0624) σχηµατίζει ένα τελικό προϊόν που είναι µερικώς διαλυτό σε οργανικές ενώσεις. ( ) GR_001 σελ. 4/7

5 Εποµένως, συνιστάται η χρήση διαλύµατος αντιχρώσης υδατικής βάσης, όπως αιµατοξυλίνη Mayer ή Gill ή Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (κωδικός S3309) και ένα υλικό στερέωσης υδατικής βάσης, όπως Glycergel (κωδικός C0563), Faramount (κωδικός S3025) ή Ultramount (κωδικός S1964). Ο χρόνος επώασης της αιµατοξυλίνης πρέπει να προσδιορίζεται µε βάση τις προτιµήσεις του εκάστοτε αντιδραστηρίου. Ακολουθήστε την αντιχρώση της αιµατοξυλίνης µε πλήρη έκπλυση σε απεσταγµένο νερό, κατόπιν εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό νερού αµµωνίας 0,037 mol/l. Για βέλτιστη µόνιµη στερέωση, παρακαλούµε τοποθετήστε τις χρωµατισµένες αντικειµενοφόρους πλάκες επί 15 δευτερόλεπτα έως 2 λεπτά, σε 2 αλλαγές µε: 1. αλκοόλη 95% 2. αλκοόλη 100% 3. Συνιστάται το υποκατάστατο ξυλενίου. Είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί ξυλένιο για καθαρισµό, αλλά ενδέχεται να προκαλέσει επιπλέον απώλεια της χρώσης. Στερεώστε σε µόνιµο υλικό στερέωσης µε βάση οργανικούς διαλύτες. Η µειωµένη έκθεση σε οργανικούς διαλύτες είναι δυνατό να διατηρήσει την ένταση της χρώσης. Για τη δηµιουργία επιπλέον σήµατος, ο χρόνος επώασης του χρωµογόνου φουξίνης είναι δυνατό να αυξηθεί έως τα 30 λεπτά. Η ένταση του τελικού προϊόντος είναι δυνατό να εξασθενήσει µετά από παρατεταµένη φύλαξη, ειδικά εάν εκτεθεί σε φως. Ποιοτικός έλεγχος Τυχόν διαφορές στην επεξεργασία των ιστών και τις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σηµαντική µεταβλητότητα στα αποτελέσµατα, καθιστώντας αναγκαία την τακτική εκτέλεση εσωτερικών ελέγχων. Για περαιτέρω πληροφορίες σχετικά µε τους θετικούς και τους αρνητικούς ελέγχους, ανατρέξτε στην ενότητα Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση. Ερµηνεία χρώσης Γενικοί περιορισµοί Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν Για κατευθυντήριες οδηγίες ερµηνείας, ανατρέξτε στην ενότητα Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση. Για γενικούς περιορισµούς, ανατρέξτε στην ενότητα Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση. Έχει παρατηρηθεί ενδογενής δραστικότητα δέσµευσης αβιδίνης (EABA) σε κατεψυγµένες τοµές ήπατος (ολόκληρος ηπατικός όζος) και νεφρού (επιθήλιο σωληναρίων), καθώς και σε κατεψυγµένο και καθηλωµένο σε φορµόλη λεµφοειδή ιστό (ιστιοκύτταρα παραφλοιού). 5,8 Η EABA είναι δυνατό να κατασταλεί µε επωάσεις των 10 λεπτών, πρώτα µε αβιδίνη 0,1% και κατόπιν µε βιοτίνη 0,01% σε 0,05 mol/l ρυθµιστικού διαλύµατος Tris- HCI, ph 7,2 7,6, Biotin Blocking System (κωδικός X0590), πριν από το πρωτόκολλο χρώσης. Οι περισσότεροι τύποι ενδογενούς δραστικότητας αλκαλικής φωσφατάσης, µε την κύρια εξαίρεση της εντερικής αλκαλικής φωσφατάσης και της αλκαλικής φωσφατάσης πλακούντα, είναι δυνατό να ανασταλούν µε τη χρήση λεβαµιζόλης. 7 Εάν παρατηρείται ενδογενής δραστικότητα αλκαλικής φωσφατάσης σε ένα δείγµα, είναι δυνατό να προστεθεί λεβαµιζόλη στο διάλυµα υποστρώµατος έως τελική συγκέντρωση 0,2 mol/l Levamisole (κωδικός X3021). Αντιµετώπιση προβληµάτων Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. Καµία χρώση σε οποιαδήποτε αντικειµενοφόρο πλάκα 1α. Τα αντιδραστήρια δεν χρησιµοποιήθηκαν µε τη σωστή σειρά. 1β. Το αντιδραστήριο υποστρώµατος-χρωµογόνου αναµείχθηκε εσφαλµένα. 1α. Ανασκοπήστε την εφαρµογή των αντιδραστηρίων. 1β. Παρασκευάστε φρέσκο διάλυµα υποστρώµατοςχρωµογόνου µε χρήση των οδηγιών που περιλαµβάνονται µε το προϊόν. 2. Ασθενής χρώση όλων των αντικειµενοφόρων πλακών. 2α. Οι τοµές διατηρούν πάρα πολύ διάλυµα µετά το λουτρό πλύσης. 2β. Το µείγµα υποστρώµατοςχρωµογόνου είναι διάρκειας µεγαλύτερης από 30 λεπτά. 2γ. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν επωάστηκαν για αρκετά µεγάλο διάστηµα µε αντισώµατα ή µείγµα υποστρώµατος. 2α. Αφαιρέστε απαλά την περίσσεια διαλύµατος πριν σκουπίσετε γύρω από την τοµή. 2β. Παρασκευάστε φρέσκο διάλυµα υποστρώµατοςχρωµογόνου. 2γ. Ανασκοπήστε τους συνιστώµενους χρόνους επώασης. ( ) GR_001 σελ. 5/7

6 3. Υπερβολική χρώση υποβάθρου σε όλες τις αντικειµενοφόρους πλάκες. 3α. Τα δείγµατα περιέχουν υψηλή ενδογενή δραστικότητα αλκαλικής φωσφατάσης. 3β. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς. 3γ. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν έχουν εκπλυθεί σωστά. 3δ. Ταχύτερη από το φυσιολογικό αντίδραση υποστρώµατος λόγω π.χ. υπερβολικής θερµοκρασίας δωµατίου. 3ε. Οι τοµές στέγνωσαν κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χρώσης. 3στ.Μη ειδική δέσµευση αντιδραστηρίων σε τοµή ιστού. 3α. Προσθέστε διάλυµα Levamisole στο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (δείτε την ενότητα Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν ). 3β. Χρησιµοποιείτε φρέσκα λουτρά ξυλενίου ή τολουολίου. Εάν χρωµατίζονται ταυτόχρονα αρκετές αντικειµενοφόροι πλάκες, το δεύτερο λουτρό ξυλενίου πρέπει να περιέχει φρέσκο ξυλένιο. 3γ. Χρησιµοποιείτε φρέσκα διαλύµατα σε λουτρά ρυθµιστικού διαλύµατος και φιάλες διαλύµατος πλύσης. Ελέγξτε για το κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης. 3δ. Χρησιµοποιείτε βραχύτερο χρόνο επώασης µε το διάλυµα υποστώµατοςχρωµογόνου. 3ε. Χρησιµοποιείτε θάλαµο υγρασίας. Σκουπίστε µόνον τρεις έως τέσσερις αντικειµενοφόρους πλάκες κάθε φορά, πριν από την εφαρµογή του αντιδραστηρίου. 3στ.Εφαρµόστε ένα διάλυµα αποκλεισµού που περιέχει πρωτεΐνη (δείτε την ενότητα Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν ). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το πρόβληµα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες ή εάν η προτεινόµενη διορθωτική ενέργεια δεν επιτυγχάνει την επίλυση του προβλήµατος, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε το τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Επιπλέον πληροφορίες σχετικά µε τις τεχνικές χρώσης και την παρασκευή δειγµάτων είναι δυνατό να βρεθούν στο Handbook - Immunochemical Staining Methods 8 (διατίθεται από την Dako), Atlas of Immunohistology 9 ή στο Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 10 Αναφορές 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27(8): NCCLS. Quality assessment for immunocytochemistry; Proposed guideline. 1997; 17(10):MM4-P 3. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Protection of laboratory workers from instrumentation biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; approved guideline. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Villanova, PA 1997; Order code M29-A 5. Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981; 29: Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984; 37: Ponder BA and Wilkinson MM. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. J Histochem Cytochem 1981; 29(8): Naish SJ (ed). Handbook Immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Tubbs RR, Gephardt GM, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, 1976 ( ) GR_001 σελ. 6/7

7 Edition 05/07 ( ) GR_001 σελ. 7/7