HER2 IQFISH pharmdx. Κωδικός K η έκδοση

Transcript

1 HER2 IQFISH pharmdx Κωδικός K5731 3η έκδοση Το HER2 IQFISH pharmdx είναι µια δοκιµασία υβριδισµού in situ µε άµεσο φθορισµό (FISH) για τον ποσοτικό προσδιορισµό της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 σε µονιµοποιηµένα µε φορµαλίνη, εγκλεισµένα σε παραφίνη (FFPE) δείγµατα ιστού καρκίνου του µαστού και δείγµατα FFPE από ασθενείς µε αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Η δοκιµασία ενδείκνυται ως συµπλήρωµα του HercepTest κατά την αξιολόγηση ασθενών για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόµενο θεραπείας µε Herceptin. Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για 20 εξετάσεις. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 1/68

2 Περιεχόµενα Σελίδα Χρήση για την οποία προορίζεται... 4 Περίληψη και επεξήγηση - Μαστός... 5 Αρχή της διαδικασίας - Μαστός... 5 Αντιδραστήρια - Μαστός... 6 Παρεχόµενα υλικά... 6 Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται... 7 Προφυλάξεις - Μαστός... 8 Αποθήκευση - Μαστός Παρασκευή δείγµατος - Μαστός Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Μαστός Α. Παρασκευή αντιδραστηρίων - Μαστός A.1 ιάλυµα προκατεργασίας A.2 Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης A.3 Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης A.4 Σειρά αιθανόλης A.5 ιάλυµα πεψίνης B. ιαδικασία χρώσης - Μαστός B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία B.2 Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση B.3 Πρωτόκολλο χρώσης Έλεγχος Ποιότητας - Μαστός Ερµηνεία της χρώσης - Μαστός Περιορισµοί - Μαστός Χαρακτηριστικά απόδοσης - Μαστός Αναλυτική ευαισθησία Αναλυτική ειδικότητα Μελέτες ισχύος Επαναληψιµότητα Αναπαραγωγιµότητα Κλινική χρησιµότητα Αντιµετώπιση προβληµάτων - Μαστός Παράρτηµα 1 - Μαστός Παράρτηµα 2 - Μαστός Παράρτηµα 3 - Μαστός Περίληψη και επεξήγηση - Στόµαχος Αρχή της διαδικασίας - Στόµαχος Αντιδραστήρια - Στόµαχος ( ) P04090GR_01_K / σελ. 2/68

3 Παρεχόµενα υλικά Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Εξοπλισµός και παρελκόµενα µικροσκοπίου Προφυλάξεις - Στόµαχος Αποθήκευση - Στόµαχος Παρασκευή δείγµατος - Στόµαχος Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Στόµαχος Α. Παρασκευή αντιδραστηρίων - Στόµαχος A.1 ιάλυµα προκατεργασίας A.2 Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης A.3 Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης A.4 Σειρά αιθανόλης A.5 ιάλυµα πεψίνης B. ιαδικασία χρώσης - Στόµαχος B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία B.2 Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση B.3 Πρωτόκολλο χρώσης Έλεγχος Ποιότητας - Στόµαχος Ερµηνεία της χρώσης - Στόµαχος Περιορισµοί - Στόµαχος Χαρακτηριστικά απόδοσης - Στόµαχος Αναλυτική ευαισθησία Αναλυτική ειδικότητα Μελέτες ισχύος Επαναληψιµότητα Αναπαραγωγιµότητα Κλινική χρησιµότητα Αντιµετώπιση προβληµάτων - Στόµαχος Παράρτηµα 4 - Στόµαχος Παράρτηµα 5 - Στόµαχος Παράρτηµα 6 - Στόµαχος Παράρτηµα 7 - Στόµαχος Παραποµπές Επεξήγηση συµβόλων ( ) P04090GR_01_K / σελ. 3/68

4 Χρήση για την οποία προορίζεται Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το HER2 IQFISH pharmdx είναι µια δοκιµασία υβριδισµού in situ µε άµεσο φθορισµό (FISH) σχεδιασµένη για τον ποσοτικό προσδιορισµό της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 σε µονιµοποιηµένα µε φορµαλίνη, εγκλεισµένα σε παραφίνη (FFPE) δείγµατα ιστού καρκίνου του µαστού και δείγµατα FFPE από ασθενείς µε αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Το HER2 IQFISH pharmdx ενδείκνυται ως συµπλήρωµα του HercepTest κατά την αξιολόγηση ασθενών για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόµενο υποβολής τους σε θεραπεία µε Herceptin (τραστουζουµάβη) (βλ. ένθετο συσκευασίας του Herceptin ). Για τους ασθενείς µε καρκίνο, τα αποτελέσµατα από το HER2 IQFISH pharmdx προορίζονται για χρήση ως πρόσθετα των κλινικοπαθολογικών πληροφοριών που χρησιµοποιούνται επί του παρόντος για την εκτίµηση της πρόγνωσης στο στάδιο ΙΙ σε ασθενείς µε καρκίνο του µαστού και αρνητικούς λεµφαδένες. Το αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, αναφέρεται στο παρόν έγγραφο και ως καρκίνος του στοµάχου. Για την εφαρµογή στον καρκίνο του µαστού, ανατρέξτε στις σελίδες Για την εφαρµογή στον καρκίνο του στοµάχου, ανατρέξτε στις σελίδες Σηµαντικό: Σηµειώστε τις διαφορές ιστού καρκίνου του µαστού και ιστού καρκίνου του στοµάχου, ιδίως στις ενότητες ερµηνείας της χρώσης ( ) P04090GR_01_K / σελ. 4/68

5 Καρκίνος του µαστού Περίληψη και επεξήγηση - Μαστός Το ανθρώπινο γονίδιο HER2 (γνωστό και ως ERBB2 ή NEU) βρίσκεται στο χρωµόσωµα 17 και κωδικοποιεί την πρωτεΐνη HER2 ή p185 HER2. Η πρωτεΐνη HER2 είναι µια κινάση τυροσίνης µεµβρανικού υποδοχέα µε οµολογία για τον επιδερµικό υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (EGFR ή HER1) (1-2). Το γονίδιο HER2 υπάρχει σε 2 αντίγραφα σε όλα τα φυσιολογικά διπλοειδή κύτταρα. Σε ένα κλάσµα ασθενών µε καρκίνο του µαστού, το γονίδιο HER2 είναι ενισχυµένο ως µέρος της επεξεργασίας κακοήθους µετασχηµατισµού και προόδου του όγκου (3-8). Η ενίσχυση του γονιδίου HER2 γενικά οδηγεί σε υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 στην επιφάνεια κυττάρων καρκίνου του µαστού(9). Η ενίσχυση του γονιδίου HER2 ή/και η υπερέκφραση της πρωτεΐνης του έχουν καταδειχθεί στο 25 30% των περιπτώσεων καρκίνων του µαστού. Αυτή η αυξορρύθµιση σχετίζεται µε πενιχρή πρόγνωση, αυξηµένο κίνδυνο υποτροπής και µειωµένη επιβίωση. ιάφορες µελέτες έχουν δείξει ότι η κατάσταση του HER2 συσχετίζεται µε την ευαισθησία ή την ανθεκτικότητα σε ορισµένα σχήµατα χηµειοθεραπείας (10). Η κατάδειξη της υψηλής υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2 ή της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 είναι ουσιώδης για την έναρξη θεραπείας µε Herceptin, ένα µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι της πρωτεΐνης HER2. Κλινικές µελέτες έχουν δείξει ότι ασθενείς των οποίων οι όγκοι έχουν υψηλή υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 ή/και ενίσχυση του γονιδίου HER2 επωφελούνται ιδιαίτερα από τη θεραπεία µε Herceptin (11). Αρχή της διαδικασίας - Μαστός Το HER2 IQFISH pharmdx περιέχει όλα τα βασικά αντιδραστήρια που απαιτούνται για την ολοκλήρωση µιας διαδικασίας FISH για µονιµοποιηµένα µε φορµαλίνη, εγκλεισµένα σε παραφίνη δείγµατα τοµών ιστού. Μετά την αποπαραφίνωση και την επανενυδάτωση, τα δείγµατα θερµαίνονται σε ιάλυµα προκατεργασίας και ακολουθεί πρωτεολυτική χώνευση µε Πεψίνη. Μετά από τα βήµατα θέρµανσης και πρωτεολυτικής προκατεργασίας, το κιτ αυτό χρησιµοποιεί ένα µη τοξικό, έτοιµο προς χρήση Μίγµα ιχνηθετών IQISH µε βάση ένα συνδυασµό PNA (πεπτιδικού νουκλεϊκού οξέος) (12) και τεχνολογίας DNA. Αυτό το Μίγµα ιχνηθετών αποτελείται από ένα µίγµα σηµασµένων µε Texas Red ιχνηθετών DNA, που καλύπτουν µια περιοχή 218 kb η οποία περιλαµβάνει το γονίδιο HER2 στο χρωµόσωµα 17, και ένα µίγµα σηµασµένων µε φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών PNA που στοχεύουν στην κεντροµεριδιακή περιοχή του χρωµοσώµατος 17 (CEN-17). Ο ειδικός υβριδισµός στους δύο στόχους έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός διακριτού ερυθρού φθορίζοντος σήµατος σε κάθε θέση γονιδίου HER2 και ενός διακριτού πράσινου φθορίζοντος σήµατος σε κάθε κεντροµερίδιο του χρωµοσώµατος 17. Μετά από ισχυρή πλύση, τα δείγµατα στερεώνονται µε υλικό στερέωσης φθορισµού που περιέχει DAPI και καλύπτονται µε καλυπτρίδα. Με χρήση µικροσκοπίου φθορισµού που διαθέτει κατάλληλα φίλτρα (δείτε το Παράρτηµα 3), εντοπίζονται καρκινικά κύτταρα και διεξάγεται απαρίθµηση των ερυθρών (HER2) και των πράσινων (CEN-17) σηµάτων. Κατόπιν, υπολογίζεται η αναλογία HER2/CEN-17. Τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τοµή ιστού χρησιµεύουν ως εσωτερικός θετικός µάρτυρας της αποτελεσµατικότητας της προεπεξεργασίας και του υβριδισµού. Για λεπτοµέρειες, δείτε την ενότητα Ερµηνεία της χρώσης. Για διαδραστικά ηλεκτρονικά µαθήµατα, χρησιµοποιήστε το πρόγραµµα ηλεκτρονικής εκµάθησης HER2 IQFISH pharmdx που έχει σχεδιαστεί ώστε να παρέχει στους τεχνικούς του εργαστηρίου, τους παθολογοανατόµους και τους επιστήµονες ταχεία γνώση µε ακρίβεια του τρόπου επίτευξης βέλτιστων αποτελεσµάτων µε τη χρήση του HER2 IQFISH pharmdx : ( ) P04090GR_01_K / σελ. 5/68

6 Καρκίνος του µαστού Αντιδραστήρια - Μαστός Παρεχόµενα υλικά Τα υλικά που παρατίθενται παρακάτω επαρκούν για 20 εξετάσεις (µια εξέταση ορίζεται ως µία περιοχή στόχος διαστάσεων 22 mm x 22 mm). Ο αριθµός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 250 µl ανά αντικειµενοφόρο πλάκα του Φιαλιδίου 2A (5 8 σταγόνες), 10 µl ανά αντικειµενοφόρο πλάκα του Φιαλιδίου 3, και 15 µl ανά αντικειµενοφόρο πλάκα του Φιαλιδίου 5. Τα διαλύµατα στο Φιαλίδιο 3 και στο Φιαλίδιο 5 είναι ιξώδη και ενδέχεται να χρειαστεί σύντοµη φυγοκέντρησή τους σε µικροφυγόκεντρο για να συλλεγεί το σύνολο του παρεχόµενου αντιδραστηρίου. Το κιτ παρέχει υλικά που επαρκούν για 10 ατοµικούς κύκλους χρώσης (τέσσερεις ξεχωριστοί κύκλοι, όταν χρησιµοποιείται η µέθοδος εµβάπτισης σε πεψίνη). Το HER2 IQFISH pharmdx αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Για να διασφαλιστεί ότι τα συστατικά του κιτ δεν έχουν εκτεθεί σε υψηλές θερµοκρασίες κατά τη διάρκεια της µεταφοράς, κατά την παραλαβή πρέπει να υπάρχει ακόµα ξηρός πάγος. Σηµειωτέον ότι µερικά συστατικά του κιτ ενδέχεται να παραµείνουν µη κατεψυγµένα. Αυτό δεν επηρεάζει την απόδοση του HER2 IQFISH pharmdx. Φιαλίδιο 1 Φιαλίδιο 2A Φιαλίδιο 2B Φιαλίδιο 3 Φιαλίδιο 4 ιάλυµα προκατεργασίας (20x) 150 ml, συµπυκνωµένο 20x Ρυθµιστικό διάλυµα MES (2-[N-µορφολινο]αιθανοσουλφονικό οξύ). Πεψίνη 4 x 6,0 ml, έτοιµο προς χρήση ιάλυµα πεψίνης, ph 2,0, περιέχει σταθεροποιητή και αντιµικροβιακό παράγοντα. Αραιωτικό πεψίνης (10x) 24 ml, συµπυκνωµένο 10x Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης, ph 2,0. Περιέχει αντιµικροβιακό παράγοντα. Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH 0,2 ml, έτοιµο προς χρήση Μίγµα σηµασµένων µε Texas Red ιχνηθετών HER2 DNA και σηµασµένων µε φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών CEN-17 PNA. Παρέχονται σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού IQISH. Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (20x) 150 ml, συµπυκνωµένο 20x Ρυθµιστικό διάλυµα SSC (αλατούχο διάλυµα-κιτρικό νάτριο) µε απορρυπαντικό (Tween-20). Φιαλίδιο 5 Μέσο επικάλυψης φθορισµού 0,4 ml, έτοιµο προς χρήση Μέσο επικάλυψης φθορισµού µε 500 µg/l DAPI (4,6-διαµιδίνη-2-φαινυλινδόλη). ( ) P04090GR_01_K / σελ. 6/68

7 Καρκίνος του µαστού Φιαλίδιο 6 Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (20x) 500 ml, συµπυκνωµένο 20x Ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl. Στεγανοποιητικό καλυπτρίδας 1 σωληνάριο, έτοιµο προς χρήση ιάλυµα για αφαιρούµενο στεγανωτικό καλυπτρίδων. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα παρακάτω αντιδραστήρια του κιτ: ιάλυµα προκατεργασίας (20x), Πεψίνη, Αραιωτικό πεψίνης (10x), Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (20x), Μέσο επικάλυψης φθορισµού, Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (20x) και Στεγανοποιητικό καλυπτρίδας µπορούν να αντικατασταθούν µε τα αντίστοιχα αντιδραστήρια του κιτ Dako Histology FISH Accessory Kit, Κωδικός K5799. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Εργαστηριακά αντιδραστήρια Απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό Αιθανόλη, 96% Ξυλένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Εργαστηριακός εξοπλισµός Απορροφητικά µαντηλάκια Ρυθµιζόµενες πιπέτες Βαθµονοµηµένο θερµόµετρο µερικής εµβάπτισης (εύρος C) Βαθµονοµηµένο θερµόµετρο επιφανείας (εύρος C) Καλυπτρίδες (22 mm x 22 mm) Λαβίδα Απαγωγός αναθυµιάσεων Dako Hybridizer (Κωδικός S2450 ή S2451)* Θερµαντική πλάκα ή κλίβανος υβριδισµού* Υγρός θάλαµος υβριδισµού* Μικροφυγόκεντρος Αντικειµενοφόρες πλάκες, Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003 ή αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη (δείτε την ενότητα Παρασκευή δείγµατος) οχεία ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (µε ικανότητα χρονοµέτρησης διαστηµάτων 2-15 λεπτών) Αναδευτήρας περιδίνησης Υδατόλουτρο µε καπάκι (ικανό να διατηρεί θερµοκρασία 37(±2) C, 63 (±2) C και από 95 C έως 99 C) Φούρνος µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης εάν η προκατεργασία διεξάγεται µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων (βλ. Β3. Πρωτόκολλο χρώσης. Βήµα 1: Προκατεργασία, Μέθοδος Β) * Θερµαντική πλάκα ή κλίβανος υβριδισµού για τη µετουσίωση (66 (±1) C) και τον υβριδισµό (45 (±2) C) σε συνδυασµό µε υγρό θάλαµο υβριδισµού µπορούν να χρησιµοποιηθούν εναλλακτικά αντί για τον Dako Hybridizer. Εξοπλισµός και παρελκόµενα µικροσκοπίου Φίλτρα για µικροσκόπιο φθορισµού: DAPI και διπλό φίλτρο FITC/Texas Red ή µονά φίλτρα FITC και Texas Red δείτε το Παράρτηµα 3 για λεπτοµέρειες. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 7/68

8 Καρκίνος του µαστού Ως πηγή φωτός πρέπει να χρησιµοποιηθεί µικροσκόπιο φθορισµού µε λαµπτήρα υδραργύρου 100 Watt. εν συνιστώνται άλλες πηγές φωτός µε τα φίλτρα αυτά. Θήκη αντικειµενοφόρων πλακών µικροσκοπίου (χαρτονένιος δίσκος για 20 αντικειµενοφόρες πλάκες µε αρθρωτό κάλυµµα ή παρόµοιος δίσκος). Προφυλάξεις - Μαστός 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελµατίες χρήστες. 3. εν απαιτείται σήµανση κινδύνου για το φιαλίδιο 1, Pre-Treatment Solution (20x). Το Φύλλο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελµατίες χρήστες κατόπιν αίτησης. 4. Φιαλίδιο 2Α, Pepsin, περιέχει 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A, και <0.1% 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one και 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Φιαλίδιο 2A είναι σηµασµένο: Κίνδυνος H314 Προκαλεί σοβαρά δερµατικά εγκαύµατα και οφθαλµικές βλάβες. H317 Μπορεί να προκαλέσει αλλεργική δερµατική αντίδραση. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. P304 + P340 + P310 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ: Μεταφέρετε τον παθόντα στον καθαρό αέρα και αφήστε τον να ξεκουραστεί σε στάση που διευκολύνει την αναπνοή. Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. P301 + P310 + P331 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. ΜΗΝ προκαλέσετε εµετό. P303 + P361 + P353 + ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): P310 Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερµίδα µε νερό/στο ντους. Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. P305 + P310 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. P405 Φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 5. Φιαλίδιο 2B, Pepsin Diluent (10x), περιέχει 50-<75% propan-2-ol, και 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Φιαλίδιο 2B είναι σηµασµένο: Danger H225 H319 H336 P280 Υγρό και ατµοί πολύ εύφλεκτα. Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Μπορεί να προκαλέσει υπνηλία ή ζάλη. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 8/68

9 Καρκίνος του µαστού P210 Μακριά από θερµότητα, θερµές επιφάνειες, σπινθήρες, γυµνές φλόγες και άλλες πηγές ανάφλεξης. Μην καπνίζετε. P241 Να χρησιµοποιείται αντιεκρηκτικός ηλεκτρολογικός, εξαερισµού, φωτιστικός και για χειρισµό όλων των υλικών εξοπλισµός. P304 + P340 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ: Μεταφέρετε τον παθόντα στον καθαρό αέρα και αφήστε τον να ξεκουραστεί σε στάση που διευκολύνει την αναπνοή. P303 + P361 + P353 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. P235 Να διατηρείται δροσερό. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 6. Φιαλίδιο 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, περιέχει 10-<25% ethylene carbonate και 3- <5% sodium chloride. Φιαλίδιο 3 είναι σηµασµένο: H319 P280 Προσοχή P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. 7. Φιαλίδιο 4, Stringent Wash Buffer (20x), περιέχει 10-<25% sodium chloride και 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Φιαλίδιο 4 είναι σηµασµένο: H319 H315 P280 Προσοχή P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Προκαλεί ερεθισµό του δέρµατος. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. 8. Φιαλίδιο 6, Wash Buffer (20x), περιέχει 10-<25% sodium chloride και 10-<20% trometamol. Φιαλίδιο 6 είναι σηµασµένο: Προσοχή H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Προκαλεί ερεθισµό του δέρµατος. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε ( ) P04090GR_01_K / σελ. 9/68

10 Καρκίνος του µαστού προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. 9. Coverslip Sealant, περιέχει 100% ελαφρά υδρογονοκατεργασµένη νάφθα (πετρέλαιο), µε τη σήµανση: Κίνδυνος H225 Υγρό και ατµοί πολύ εύφλεκτα. H304 Μπορεί να προκαλέσει θάνατο σε περίπτωση κατάποσης και διείσδυσης στις αναπνευστικές οδούς. H411 Τοξικό για τους υδρόβιους οργανισµούς, µε µακροχρόνιες επιπτώσεις. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. P210 Μακριά από θερµότητα, θερµές επιφάνειες, σπινθήρες, γυµνές φλόγες και άλλες πηγές ανάφλεξης. Μην καπνίζετε. P241 Να χρησιµοποιείται αντιεκρηκτικός ηλεκτρολογικός, εξαερισµού, φωτιστικός και για χειρισµό όλων των υλικών εξοπλισµός. P273 Avoid release to the environment. P301 + P310 + P331 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. ΜΗΝ προκαλέσετε εµετό. P303 + P361 + P353 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερµίδα µε νερό/στο ντους. P235 Να διατηρείται δροσερό. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 10. Τα δείγµατα, πριν και µετά τη µονιµοποίηση, καθώς και όλα τα υλικά που εκτίθενται σε αυτά, πρέπει να υποβάλλονται σε χειρισµό ως δυνητικά µετάδοσης λοίµωξης και πρέπει να απορρίπτονται µε κατάλληλες προφυλάξεις (16). Μην αναρροφάτε µε πιπέτα τα αντιδραστήρια µε το στόµα και αποφεύγετε την επαφή του δέρµατος και των βλεννογόνων µε αντιδραστήρια και δείγµατα. Εάν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή µε ευαίσθητες περιοχές, πλύνετε µε άφθονο νερό. 11. Ελαχιστοποιήστε τη µικροβιακή µόλυνση των αντιδραστηρίων ώστε να αποφύγετε εσφαλµένα αποτελέσµατα. 12. Χρόνοι και θερµοκρασίες επώασης ή µέθοδοι διαφορετικές από εκείνες που καθορίζονται, ενδέχεται να δώσουν εσφαλµένα αποτελέσµατα. 13. Μέθοδοι µονιµοποίησης ιστών και πάχη δειγµάτων διαφορετικά από εκείνα που καθορίζονται ενδέχεται να επηρεάσουν τη µορφολογία των ιστών ή/και την ένταση του σήµατος. 14. Αποφεύγετε την εξάτµιση του µίγµατος ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH κατά τη διάρκεια του υβριδισµού διασφαλίζοντας επαρκή υγρασία στο θάλαµο υβριδισµού. 15. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα απώλεια της απόδοσης. 16. Φοράτε κατάλληλο ατοµικό προστατευτικό εξοπλισµό, έτσι ώστε να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. Παρακαλούµε ανατρέξτε στο δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (SDS) για επιπλέον πληροφορίες. 17. Μόνο καθαρά δοχεία χρώσης πρέπει να χρησιµοποιούνται για τη µέθοδο εµβάπτισης σε πεψίνη (Βήµα 2, µέθοδος Γ). ( ) P04090GR_01_K / σελ. 10/68

11 Καρκίνος του µαστού Αποθήκευση - Μαστός Αποθηκεύστε το Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH (Φιαλίδιο 3) στους -18 C στο σκοτάδι. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια µπορούν να αποθηκευτούν στους 2 8 C στο σκοτάδι. Όλα τα αντιδραστήρια ανέχονται φύλαξη στην κατάψυξη. Η κατάψυξη και η απόψυξη των αντιδραστηρίων για έως και 10 φορές δεν επηρεάζει την απόδοση. Τα Πεψίνη, Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH, και Μέσο επικάλυψης φθορισµού (Φιαλίδια 2Α, 3 και 5) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσµενώς εάν εκτεθούν σε θερµότητα. Μην αφήνετε τα συστατικά αυτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Το Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH και το Μέσο επικάλυψης φθορισµού (Φιαλίδια 3 και 5) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσµενώς εάν εκτεθούν σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μη φυλάσσετε τα συστατικά αυτά και µην εκτελείτε ανάλυση σε έντονο φως, όπως το άµεσο ηλιακό φως. Μη χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στο κουτί του κιτ. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό συνθήκες διαφορετικές από εκείνες που καθορίζονται σε αυτό το ένθετο συσκευασίας, ο χρήστης πρέπει να επικυρώσει την απόδοση του αντιδραστηρίου (14). εν υπάρχουν εµφανή σηµεία που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Εποµένως, είναι σηµαντικό να αξιολογείτε τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τοµή ιστού. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενο πρότυπο φθορισµού που δεν είναι δυνατό να εξηγηθεί από διακυµάνσεις στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το HER2 IQFISH pharmdx, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako. Παρασκευή δείγµατος - Μαστός είγµατα από βιοψίες, εκτοµές ή εξαιρέσεις πρέπει να υποβάλλονται σε χειρισµό έτσι ώστε να διατηρείται ο ιστός για ανάλυση FISH. Για όλα τα δείγµατα πρέπει να χρησιµοποιούνται πρότυπες µέθοδοι επεξεργασίας ιστού για ανοσοκυτταροχηµική χρώση (15). Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη Κατάλληλοι για χρήση είναι µόνον ιστοί που διατηρoύνται σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης και εγκλεισµένοι σε παραφίνη. Τα δείγµατα πρέπει π.χ. να τεµαχίζονται σε πάχος 3 ή 4 mm και να µονιµοποιούνται επί ώρες σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης. Οι ιστοί κατόπιν αφυδατώνονται σε διαβαθµισµένη σειρά αιθανόλης και ξυλενίου, και ακολουθεί διήθηση από τηγµένη παραφίνη που διατηρείται σε θερµοκρασία όχι µεγαλύτερη των 60 C. Κατάλληλα µονιµοποιηµένοι και εγκλεισµένοι ιστοί θα διατηρούνται επ αόριστον πριν από την εκτέλεση τοµών και τη στερέωση σε αντικειµενοφόρο πλάκα, εφόσον φυλάσσονται σε δροσερό χώρο (15 25 C) (15-16). Άλλα µονιµοποιητικά δεν είναι κατάλληλα. Τα δείγµατα ιστού πρέπει να κόβονται σε τοµές 4 6 µm. Οι αντικειµενοφόρες πλάκες που απαιτούνται για την ανάλυση ενίσχυσης γονιδίου HER2 και την επαλήθευση της παρουσίας όγκου πρέπει να παρασκευάζονται ταυτόχρονα. Συνιστώνται τουλάχιστον 2 διαδοχικές τοµές, 1 τοµή για παρουσία όγκου κεχρωσµένη µε αιµατοξυλίνη και ηωσίνη (χρώση H&E) και 1 τοµή για την ανάλυση ενίσχυσης γονιδίου HER2. Συνιστάται η στερέωση των τοµών ιστού σε Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003 ή σε αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη. Τα δείγµατα πρέπει να αναλύονται εντός 4 6 µηνών από την εκτέλεση της τοµής, όταν φυλάσσονται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). ( ) P04090GR_01_K / σελ. 11/68

12 Καρκίνος του µαστού Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Μαστός Α. Παρασκευή αντιδραστηρίων - Μαστός Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση: A.1 ιάλυµα προκατεργασίας Στο Φιαλίδιο 1 ενδέχεται να σχηµατιστούν κρύσταλλοι, αλλά θα διαλυθούν σε θερµοκρασία δωµατίου. Βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχουν κρύσταλλοι πριν από την παρασκευή του αντιδραστηρίου. Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 1 ( ιάλυµα προκατεργασίας 20x) µε αραίωση του συµπυκνώµατος 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.2 Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 4 (Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης 20x) µε αραίωση του συµπυκνώµατος 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.3 Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 6 (Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης 20x) µε αραίωση του συµπυκνώµατος 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.4 Σειρά αιθανόλης Από ένα διάλυµα αιθανόλης 96%, παρασκευάστε 3 δοχεία µε αιθανόλη 70%, 85% και 96%, αντίστοιχα. Φυλάσσετε τα καλυµµένα δοχεία σε θερµοκρασία δωµατίου ή στους 2 8 C και χρησιµοποιήστε για 200 αντικειµενοφόρες πλάκες κατά µέγιστο. Απορρίψτε τα διαλύµατα εάν έχουν νεφελώδη εµφάνιση. A.5 ιάλυµα πεψίνης ιάλυµα πεψίνης χρειάζεται µόνο όταν χρησιµοποιείται η µέθοδος εµβάπτισης σε πεψίνη (Μέθοδος Γ). Παρασκευάστε το διάλυµα πεψίνης ως εξής: Για δοχείο χωρητικότητας έξι αντικειµενοφόρων, παρασκευάστε διάλυµα πεψίνης 60 ml: Προσθέστε 48 ml απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) στο δοχείο. Προσθέστε 6 ml κρύο (2 8 C) Αραιωτικό πεψίνης (10x) (Φιαλίδιο 2B) στο δοχείο. Προσθέστε 6 ml κρύα (2 8 C) Πεψίνη (Φιαλίδιο 2A) στο δοχείο. Τοποθετήστε καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Για δοχείο χωρητικότητας 24 αντικειµενοφόρων, παρασκευάστε διάλυµα πεψίνης 240 ml: Προσθέστε 192 ml απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) στο δοχείο. Προσθέστε 24 ml κρύο (2 8 C) Αραιωτικό πεψίνης (10x) (Φιαλίδιο 2B) στο δοχείο. Προσθέστε 24 ml κρύα (2 8 C) Πεψίνη (Φιαλίδιο 2A) στο δοχείο. Τοποθετήστε καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. ιάλυµα πεψίνης που έχει ισορροπήσει πρέπει να χρησιµοποιείται εντός 5 ωρών. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 12/68

13 Καρκίνος του µαστού B. ιαδικασία χρώσης - Μαστός B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Ο χρήστης πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα συστατικά πριν από τη χρήση (δείτε την ενότητα Προφυλάξεις ). Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να εξισορροπούνται στη σχετική θερµοκρασία πριν από τη χρήση ως εξής: Φιαλίδιο 1: Το αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας πρέπει να εξισορροπείται στους C αν χρησιµοποιείται υδατόλουτρο για την προκατεργασία (B3. Πρωτόκολλο χρώσης, Βήµα 1: Προκατεργασία, Μέθοδος Α). Αν χρησιµοποιείται φούρνος µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης για την προκατεργασία (B3. Πρωτόκολλο χρώσης, Βήµα 1: Προκατεργασία, Μέθοδος B) το αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας πρέπει να εξισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου στους C. Φιαλίδιο 2A: Η πεψίνη πρέπει να εφαρµόζεται στους 2 8 C (B3, Πρωτόκολο χρώσης, Βήµα 2: Μέθοδος A και B) και να διατηρείται ψυχρό συνεχώς. Φιαλίδιο 2B: Το αραιωτικό πεψίνης (10x) πρέπει να εφαρµόζεται στους 2 8 C (B3, Πρωτόκολο χρώσης, Βήµα 2: Μέθοδος Γ). Φιαλίδιο 3: Το Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH διαχωρίζεται σε δύο φάσεις ενώ φυλάσσεται στους -18 C. Πριν χρησιµοποιήσετε το Φιαλίδιο 3, βεβαιωθείτε ότι υπάρχει µόνο µία φάση εξισορροπώντας το µίγµα ιχνηθετών σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) και αναµιγνύοντας στη συνέχεια. Αποψύχτε το Φιαλίδιο 3 σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) για 30 λεπτά κατά µέγιστο (προστατεύοντας από δυνατό φως), και κατόπιν περιδινήστε ενδελεχώς το φιαλίδιο για 15 δευτερόλεπτα στις 2500 rpm χρησιµοποιώντας αναδευτήρα περιδίνησης. Αποθηκεύστε το Φιαλίδιο 3 στους -18 C αµέσως µετά τη χρήση. Φιαλίδιο 4: Αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης. Ένα δοχείο πρέπει να ισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου, ένα άλλο στους 63 (±2) C πριν από τη χρήση. Φιαλίδιο 5: Μέσο επικάλυψης φθορισµού. Μπορεί να εφαρµοστεί σε οποιαδήποτε θερµοκρασία από 2 25 C. Φιαλίδιο 6: Το Αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης πρέπει να ισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου C. Το Στεγανοποιητικό καλυπτρίδας µπορεί να εφαρµοστεί σε οποιαδήποτε θερµοκρασία από 2 25 C. Όλα τα βήµατα πρέπει να εκτελούνται στη θερµοκρασία που καθορίζεται. Η διαδικασία περιλαµβάνει διάφορες αφυδατώσεις ακολουθούµενες από το στέγνωµα των τοµών ιστών. Βεβαιωθείτε ότι οι τοµές ιστών είναι εντελώς στεγνές πριν προχωρήσετε στο επόµενο βήµα. Μην αφήνετε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν κατά τη διάρκεια των άλλων βηµάτων της διαδικασίας. Εάν η διαδικασία χρώσης πρέπει να διακοπεί, οι αντικειµενοφόρες πλάκες είναι δυνατό να διατηρηθούν σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης µετά το βήµα αποπαραφίνωσης επί έως 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεάζονται τα αποτελέσµατα. B.2 Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση Αποπαραφίνωση και επανενυδάτωση: Πριν από την εκτέλεση της ανάλυσης, οι αντικειµενοφόρες πλάκες µε τον ιστό πρέπει να υποβάλλονται σε αποπαραφίνωση για την αφαίρεση του µέσου έγκλεισης και να επανενυδατώνονται. Αποφεύγετε την ατελή αφαίρεση της παραφίνης. Υπολειµµατικό µέσο έγκλεισης έχει ως αποτέλεσµα αυξηµένη µη ειδική χρώση. Το βήµα αυτό πρέπει να εκτελείται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). 1. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε λουτρό ξυλενίου και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 13/68

14 Καρκίνος του µαστού 2. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε αιθανόλη 96% επί 2 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 3. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε αιθανόλη 70% επί 2 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 4. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια υγρού και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 2 λεπτά τουλάχιστον. Αρχίστε τη διαδικασία χρώσης όπως παρουσιάζεται στην ενότητα B.3, Βήµα 1, Προκατεργασία. Τα διαλύµατα ξυλενίου και αλκοόλης πρέπει να αλλάζουν µετά από 200 αντικειµενοφόρες πλάκες ή λιγότερες. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν υποκατάστατα ξυλενίου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο κιτ αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή µεταβολή των θερµοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα ή ασύµφωνα αποτελέσµατα. Τυχόν διαφορές στην επεξεργασία των ιστών και τις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να ακυρώσουν τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού. B.3 Πρωτόκολλο χρώσης Βήµα 1: Προκατεργασία Η προκατεργασία µπορεί να διεξαχθεί είτε µε χρήση υδατόλουτρου όπως περιγράφεται στη µέθοδο Α) είτε, εναλλακτικά, µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης όπως περιγράφεται στη µέθοδο Β). Μέθοδος A: Προκατεργασία µε χρήση υδατόλουτρου Γεµίστε δοχεία χρώσης, π.χ. δοχεία Coplin, µε το αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.1). Τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το διάλυµα προκατεργασίας στους C. Μετρήστε τη θερµοκρασία εντός του δοχείου µε ένα βαθµονοµηµένο θερµόµετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερµοκρασίας. Καλύψτε τα δοχεία µε καπάκια προκειµένου να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφευχθεί τυχόν εξάτµιση. Εµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές σε θερµοκρασία δωµατίου στο προθερµασµένο διάλυµα προκατεργασίας στα δοχεία χρώσης. Επανελέγξτε τη θερµοκρασία και επωάστε επί 10 (±1) λεπτά στους C. Αφαιρέστε ολόκληρο το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρες πλάκες από το υδατόλουτρο. Αφαιρέστε το καπάκι και αφήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες να ψυχθούν στο διάλυµα προκατεργασίας επί 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε ένα δοχείο µε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το ιάλυµα προκατεργασίας έχει σχεδιαστεί για χρήση για µία µόνο εφαρµογή. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Μέθοδος Β: Προκατεργασία µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης Γεµίστε ένα πλαστικό δοχείο µε αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Εµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές στο διάλυµα προκατεργασίας, καλύψτε το δοχείο µε τρυπηµένο καπάκι και τοποθετήστε το στο φούρνο µικροκυµάτων. Επιλέξτε τη λειτουργία αισθητήρα βρασµού και πρόγραµµα που λειτουργεί επί 10 λεπτά µετά την επίτευξη της θερµοκρασίας βρασµού*. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 14/68

15 Καρκίνος του µαστού Ύστερα από τα 10 λεπτά επώασης, βγάλτε το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρες από το φούρνο, αφαιρέστε το καπάκι και αφήστε να κρυώσει επί 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες σε δοχείο µε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. * Η χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης σηµαίνει ότι ο φούρνος πρέπει να διαθέτει αισθητήρα και προγράµµατα τα οποία αρχικά θερµαίνουν το διάλυµα προκατεργασίας ως το σηµείο βρασµού και εν συνεχεία διατηρούν την απαιτούµενη θερµοκρασία προκατεργασίας (άνω των 95 ºC) ενώ κάνουν αντίστροφη µέτρηση του προκαθορισµένου χρόνου (10 (±1) λεπτά). Ορισµένα µοντέλα φούρνων µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης ενδέχεται να µην διαθέτουν δυνατότητα ελεύθερης ρύθµισης χρόνου αντίστροφης µέτρησης. Αν το µοντέλο διαθέτει µόνο προκαθορισµένα προγράµµατα, βεβαιωθείτε ότι επιλέξατε πρόγραµµα που διατηρεί την απαιτούµενη θερµοκρασία προκατεργασίας (άνω των 95 ºC) επί τουλάχιστον 10 (±1) λεπτά και σταµατήστε διά χειρός το πρόγραµµα µετά από 10 (±1) λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το διάλυµα προκατεργασίας έχει σχεδιαστεί για χρήση για µία µόνο εφαρµογή. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Βήµα 2: Πεψίνη, έτοιµη προς χρήση (RTU) ή διάλυµα πεψίνης Η επώαση πεψίνης µπορεί να διεξαχθεί µε απευθείας εφαρµογή σταγόνων πεψίνης RTU στις αντικειµενοφόρες είτε σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (Μέθοδος A) είτε στους 37 C (Μέθοδος B). Εναλλακτικά, οι αντικειµενοφόρες µπορούν να εµβαπτιστούν σε διάλυµα πεψίνης και να επωαστούν στους 37 (±2) C (Μέθοδος Γ). Μέθοδος Α και Μέθοδος Β: Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρεθεί η περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος. Με χρήση απορροφητικού υφάσµατος που δεν αφήνει χνούδι (όπως απορροφητικό ταµπόν ή τεµάχιο γάζας), σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα για την αφαίρεση τυχόν υγρού που αποµένει και για να διατηρήσετε τα αντιδραστήρια εντός της καθορισµένης περιοχής. Εφαρµόστε 5 8 σταγόνες (250 µl) ψυχρής (2 8 C) πεψίνης (Φιαλίδιο 2Α) για την κάλυψη του δείγµατος. Φυλάσσετε πάντοτε την πεψίνη στους 2 8 C. Μέθοδος A: Πεψίνη, RTU - Επώαση στους C Επωάστε επί 5 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Χρόνος επώασης 5 15 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε περίσσεια πεψίνης και εµβαπτίστε τις τοµές στο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Συνεχίστε µε την αφυδάτωση. Μέθοδος Β: Πεψίνη, RTU - Επώαση στους 37 C Τοποθετήστε δείγµα µε πεψίνη σε θερµαντική πλάκα στους 37 C π.χ. Dako Hybridizer και επωάστε επί 3 5 λεπτά. Χρόνος επώασης 3 5 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να φύγει η περίσσεια πεψίνης και εµβαπτίστε τις τοµές σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε την αφυδάτωση. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. Μέθοδος Γ: ιάλυµα πεψίνης - Εµβάπτιση αντικειµενοφόρων σε διάλυµα πεψίνης στους 37 C ( ) P04090GR_01_K / σελ. 15/68

16 Καρκίνος του µαστού Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για τέσσερεις ξεχωριστούς κύκλους (60 ml διάλυµα πεψίνης, µικρό δοχείο για έξι αντικειµενοφόρες) ή ένας µόνο κύκλος (240 ml διάλυµα πεψίνης, µεγάλο δοχείο για 24 αντικειµενοφόρες). Παρασκευάστε το διάλυµα πεψίνης όπως περιγράφεται στην ενότητα A.5. Τοποθετήστε καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Μετρήστε τη θερµοκρασία µέσα στο δοχείο µε βαθµονοµηµένο θερµόµετρο και βεβαιωθείτε ότι είναι η σωστή θερµοκρασία. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρεθεί η περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης. Βυθίστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες στο διάλυµα πεψίνης στους 37 (±2) C και επωάστε για λεπτά. Χρόνος επώασης λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να φύγει η περίσσεια πεψίνης και εµβαπτίστε τις τοµές σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε την αφυδάτωση. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. Βήµα 3: Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH Το Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH διαχωρίζεται σε δύο φάσεις ενώ φυλάσσεται στους -18 C. Πριν χρησιµοποιήσετε το Φιαλίδιο 3, βεβαιωθείτε ότι υπάρχει µόνο µία φάση εξισορροπώντας το µίγµα ιχνηθετών σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C ) και αναµιγνύοντας στη συνέχεια. Αποψύχτε το Φιαλίδιο 3 σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) για 30 λεπτά κατά µέγιστο (προστατεύοντας από δυνατό φως), και κατόπιν περιδινήστε ενδελεχώς το φιαλίδιο για 15 δευτερόλεπτα στις 2500 rpm χρησιµοποιώντας αναδευτήρα περιδίνησης. Αποθηκεύστε το Φιαλίδιο 3 στους -18 C αµέσως µετά τη χρήση. Απλώστε 10 µl του Μίγµατος ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH (Φιαλίδιο 3) στο κέντρο της τοµής ιστού. Τοποθετήστε αµέσως µια γυάλινη καλυπτρίδα 22 mm x 22 mm πάνω από το µίγµα ιχνηθετών και αφήστε το να εξαπλωθεί οµοιόµορφα κάτω από την καλυπτρίδα. Αποφύγετε το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα. Εάν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα, κτυπήστε απαλά µε χρήση λαβίδας για να τις αποµακρύνετε από τον ιστό. Θυµηθείτε να αποθηκεύσετε το Φιαλίδιο 3 στους -18 C αµέσως µετά τη χρήση. Στεγανοποιήστε την καλυπτρίδα µε το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων εξωθώντας το στεγανοποιητικό γύρω από την περιφέρεια της καλυπτρίδας. Αφήστε το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων να επικαλύψει την καλυπτρίδα και την αντικειµενοφόρο πλάκα, σχηµατίζοντας έτσι στεγανοποίηση γύρω από την καλυπτρίδα. Βεβαιωθείτε ότι το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων καλύπτει ολόκληρο το χείλος της καλυπτρίδας. Προετοιµάστε το Dako Hybridizer* (κωδικός S2450 ή S2451) για κύκλο υβριδισµού. Βεβαιωθείτε ότι τα Humidity Control Strips (Κωδικός S2452) έχουν κορεστεί και βελτιστοποιηθεί για χρήση. Ξεκινήστε το Hybridizer και επιλέξτε πρόγραµµα που θα εκτελέσει τα εξής: Μετουσίωση στους 66 C επί 10 λεπτά και στη συνέχεια υβριδισµός στους 45 C επί λεπτά. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες στο Hybridizer, βεβαιωθείτε ότι το καπάκι έχει κλείσει καλά και ξεκινήστε το πρόγραµµα. Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο οδηγιών του Dako Hybridizer για λεπτοµέρειες. * Για τη µετουσίωση και τον υβριδισµό, µπορεί να χρησιµοποιηθεί εξοπλισµός οργάνων που επιτρέπει τη δηµιουργία συνθηκών πανοµοιότυπων µε εκείνες που περιγράφηκαν παραπάνω: ( ) P04090GR_01_K / σελ. 16/68

17 Καρκίνος του µαστού Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες σε µια επίπεδη µεταλλική ή πέτρινη επιφάνεια (θερµαντική πλάκα ή πλάκα κλιβάνου υβριδισµού) που έχετε προθερµάνει στους 66 (±1) C. Μετουσιώστε για ακριβώς 10 λεπτά. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε προθερµασµένο υγροποιηµένο θάλαµο υβριδισµού. Καλύψτε το θάλαµο µε καπάκι και επωάστε στους 45 (±2) C για λεπτά. Παρακαλούµε σηµειώστε ότι θερµοκρασία υβριδισµού 37 C δεν είναι κατάλληλη για χρήση µε τους ιχνηθέτες που περιέχονται στο κιτ αυτό. Βήµα 4: Ισχυρή πλύση Γεµίστε δύο δοχεία χρώσης, π.χ. δοχεία Coplin, µε το αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2). Συνιστάται ελάχιστος όγκος 100 ml ή 15 ml ανά αντικειµενοφόρο πλάκα σε κάθε δοχείο. Τοποθετήστε ένα από τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης σε θερµοκρασία δωµατίου σε απαγωγό αναθυµιάσεων και το άλλο σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης στους 63 (±2) C. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Καλύψτε το δοχείο µε καπάκι προκειµένου να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφύγετε την εξάτµιση. Μετρήστε τη θερµοκρασία εντός του δοχείου υδατόλουτρου µε ένα βαθµονοµηµένο θερµόµετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερµοκρασίας. Το ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης περιέχει απορρυπαντικό και ενδέχεται να καταστεί θολερό στους 63 C. Αυτό δεν θα επηρεάσει την απόδοση. Με χρήση λαβίδας ή γαντιών, πάρτε τις αντικειµενοφόρες πλάκες από το θάλαµο υβριδισµού και αφαιρέστε απαλά το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων καθώς και την καλυπτρίδα, και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες στο δοχείο πρόπλυσης, σε θερµοκρασία δωµατίου, µία κάθε φορά. Μόλις αφαιρεθούν όλες οι καλυπτρίδες, µεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες πλάκες από το δοχείο πρόπλυσης που βρίσκεται σε θερµοκρασία δωµατίου στο δοχείο που βρίσκεται µέσα σε υδατόλουτρο θερµοκρασίας 63 (±2) C. Αµέσως µετά τη µεταφορά των αντικειµενοφόρων στο αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης των 63 (±2) C στο υδατόλουτρο, πρέπει να ξεκινήσει το χρονόµετρο. Πραγµατοποιήστε ισχυρή πλύση επί 10 ακριβώς λεπτά.αφαιρέστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες από το αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αλλάξτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν εντελώς. Βήµα 5: Επικάλυψη Εφαρµόστε 15 µl του µέσου επικάλυψης φθορισµού που περιέχει DAPI (Φιαλίδιο 5) στην περιοχή στόχο της αντικειµενοφόρου και εφαρµόστε µια γυάλινη καλυπτρίδα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι αντικειµενοφόρες πλάκες είναι δυνατό να αναγνωστούν µετά από 15 λεπτά ή εντός 7 ηµερών µετά την επικάλυψη. Ωστόσο, εάν οι αντικειµενοφόρες πλάκες εκτεθούν σε φως ή σε υψηλές θερµοκρασίες θα παρουσιαστεί εξασθένηση. Για την ελαχιστοποίηση της εξασθένησης, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρες πλάκες στο σκοτάδι στους C. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 17/68

18 Καρκίνος του µαστού Έλεγχος Ποιότητας - Μαστός 1. Τα σήµατα πρέπει να είναι έντονα, διακριτά και εύκολα στην αξιολόγηση. 2. Τα φυσιολογικά κύτταρα επιτρέπουν τον εσωτερικό έλεγχο της εκτέλεσης χρώσης. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν 1-2 σαφώς ορατά πράσινα σήµατα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης CEN-17 PNA έχει υβριδιώσει µε επιτυχία την κεντροµεριδιακή περιοχή του χρωµοσώµατος 17. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν επίσης 1-2 σαφώς ορατά ερυθρά σήµατα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης HER2 DNA έχει υβριδιώσει µε επιτυχία το αµπλικόνιο HER2. Λόγω της τοµής ιστού, µερικά φυσιολογικά κύτταρα θα εξακολουθούν να έχουν λιγότερα από τα αναµενόµενα 2 σήµατα κάθε χρώµατος. Εάν δεν ανιχνευτούν σήµατα σε φυσιολογικά κύτταρα, υποδηλώνεται αποτυχία του προσδιορισµού και τα αποτελέσµατα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 3. Κατά την αξιολόγηση µε χρήση φίλτρου DAPI, η πυρηνική µορφολογία πρέπει να είναι άθικτη. Πολυάριθµα ίχνη κυττάρων και µια γενική πενιχρή πυρηνική µορφολογία υποδηλώνουν υπερβολική χώνευση του δείγµατος, µε αποτέλεσµα απώλεια ή κατατεµαχισµό των σηµάτων. Τέτοια δείγµατα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 4. Τυχόν διαφορές στη µονιµοποίηση, την επεξεργασία και την έγκλειση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σηµαντική µεταβλητότητα στα αποτελέσµατα, καθιστώντας αναγκαία την τακτική αξιολόγηση των εσωτερικών µαρτύρων. Ερµηνεία της χρώσης - Μαστός Ιστός κατάλληλος για εκτίµηση Μόνο δείγµατα από ασθενείς µε διηθητικό καρκίνωµα πρέπει να εξετάζονται. Σε περιπτώσεις µε καρκίνωµα in situ και διηθητικό καρκίνωµα στο ίδιο δείγµα, µόνον το διηθητικό συστατικό πρέπει να βαθµολογείται. Αποφεύγετε περιοχές νέκρωσης και περιοχές όπου τα πυρηνικά όρια είναι αµφίβολα. Μη συµπεριλαµβάνετε πυρήνες που απαιτούν υποκειµενική κρίση. Παραβλέψτε πυρήνες µε ασθενή ένταση σήµατος και µη ειδικό ή υψηλό υπόβαθρο. Απαρίθµηση σήµατος: Εντοπίστε τον όγκο εντός του πλαισίου της κεχρωσµένης µε H&E αντικειµενοφόρου πλάκας και αξιολογήστε την ίδια περιοχή στην κεχρωσµένη µε FISH αντικειµενοφόρο πλάκα. Σαρώστε αρκετές περιοχές των καρκινικών κυττάρων έτσι ώστε να λάβετε υπόψη πιθανή ετερογένεια. Επιλέξτε µια περιοχή που έχει καλή κατανοµή των πυρήνων. Αρχίστε την ανάλυση στο άνω αριστερό τεταρτηµόριο της επιλεγµένης περιοχής και, σαρώνοντας από αριστερά προς τα δεξιά, καταµετρήστε τον αριθµό των σηµάτων εντός των ορίων κάθε πυρήνα που αξιολογείται σύµφωνα µε τις κατευθυντήριες οδηγίες παρακάτω (δείτε επίσης το παράρτηµα 3). - Εστιάστε προς τα πάνω και προς τα κάτω ώστε να εντοπίσετε όλα τα σήµατα στο µεµονωµένο πυρήνα. - Καταµετρήστε δύο σήµατα που έχουν το ίδιο µέγεθος και διαχωρίζονται κατά απόσταση ίση ή µικρότερη από τη διάµετρο του σήµατος, ως µόνον ένα σήµα. - Σε πυρήνες µε υψηλά επίπεδα ενίσχυσης του γονιδίου HER2, τα σήµατα HER2 είναι δυνατό να βρίσκονται πολύ κοντά µεταξύ τους, σχηµατίζοντας µια συστάδα σηµάτων. Στις περιπτώσεις αυτές, ο αριθµός των σηµάτων HER2 δεν είναι δυνατό να καταµετρηθεί, αλλά πρέπει να υπολογιστεί κατά προσέγγιση. Πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στα πράσινα σήµατα, καθώς είναι δυνατό να καλυφθούν από συστάδες ερυθρών σηµάτων HER2 καθιστώντας αδύνατη την παρατήρησή τους. Σε περίπτωση αµφιβολίας, παρακαλούµε ελέγξτε τα πράσινα σήµατα µε χρήση ειδικού φίλτρου FITC. Μην βαθµολογείτε πυρήνες χωρίς σήµατα ή µε σήµατα ενός µόνο χρώµατος. Βαθµολογείτε µόνον εκείνους τους πυρήνες µε ένα ή περισσότερα σήµατα FISH κάθε χρώµατος. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 18/68

19 Καρκίνος του µαστού Οδηγός καταµέτρησης σηµάτων 1 Μην καταµετράτε. Οι πυρήνες επικαλύπτονται µεταξύ τους, δεν είναι ορατές όλες οι περιοχές των πυρήνων. 2 ύο πράσινα σήµατα, µη βαθµολογείτε τους πυρήνες µε σήµατα ενός µόνο χρώµατος. 3 Καταµετρήστε ως 3 πράσινα και 12 ερυθρά σήµατα (εκτίµηση συστάδων). 4 Καταµετρήστε ως 1 πράσινο και 1 ερυθρό σήµα. ύο σήµατα του ιδίου µεγέθους και διαχωρισµένα κατά απόσταση ίση ή µικρότερη από τη διάµετρο του ενός σήµατος καταµετρούνται ως ένα. 5 Μην καταµετράτε (πυρήνες που έχουν υποστεί ή υπερβολικά υψηλή ή υπερβολικά χαµηλή χώνευση). Ελλείποντα σήµατα στο κέντρο των πυρήνων (εµφάνιση τύπου donut). 6 Καταµετρήστε ως 2 πράσινα και 3 ερυθρά σήµατα. ύο σήµατα του ιδίου µεγέθους και διαχωρισµένα κατά απόσταση ίση ή µικρότερη από τη διάµετρο του ενός σήµατος καταµετρούνται ως ένα. 7 Καταµετρήστε ως 1 πράσινο και 5 ερυθρά σήµατα. 8 Καταµετρήστε ως 3 πράσινα (1 πράσινο εκτός εστίασης) και 3 ερυθρά σήµατα. 9 Συστάδα ερυθρών σηµάτων που αποκρύπτουν πράσινα σήµατα. Ελέγξτε τα πράσινα σήµατα µε ειδικό φίλτρο FITC ή µην καταµετράτε. Καταγράψτε τις καταµετρήσεις σε έναν πίνακα όπως παρουσιάζεται στο παράρτηµα 2. Καταµετρήστε 20 πυρήνες ανά δείγµα ιστού, όταν είναι δυνατό από διακριτές περιοχές όγκων (17). Υπολογίστε την αναλογία HER2/CEN-17 διαιρώντας το συνολικό αριθµό ερυθρών σηµάτων HER2 δια του συνολικού αριθµού πράσινων σηµάτων CEN-17. είγµατα µε αναλογία HER2/CEN-17 µεγαλύτερη ή ίση µε 2 πρέπει να θεωρούνται ότι φέρουν ενισχυµένο γονίδιο HER2 (5, 17-19). Αποτελέσµατα ίσα ή πλησίον της τιµής αποκλεισµού (1,8 2,2) πρέπει να ερµηνεύονται µε προσοχή. Εάν η αναλογία είναι οριακή (1,8 2,2), καταµετρήστε 20 πυρήνες επιπλέον και επανυπολογίστε την αναλογία για τους 40 πυρήνες. Σε περίπτωση αµφιβολίας, η αντικειµενοφόρος πλάκα του δείγµατος πρέπει να επαναβαθµολογείται. Για οριακές περιπτώσεις, είναι απαραίτητη διαβούλευση µεταξύ του παθολογοανατόµου και του θεράποντος ιατρού. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 19/68

20 Καρκίνος του µαστού Περιορισµοί - Μαστός 1. Η µέθοδος FISH είναι µια διεργασία πολλαπλών βηµάτων, η οποία απαιτεί ειδικευµένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, καθώς και στην επιλογή, µονιµοποίηση και επεξεργασία ιστού, παρασκευή της αντικειµενοφόρου πλάκας FISH και ερµηνεία των αποτελεσµάτων της χρώσης. 2. Τα αποτελέσµατα της µεθόδου FISH εξαρτώνται από το χειρισµό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλµένη µονιµοποίηση, πλύση, στέγνωµα, θέρµανση, σχηµατισµός τοµών ή µόλυνση µε άλλους ιστούς ή υγρά ενδέχεται να επηρεάσει τον υβριδισµό των ιχνηθετών. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσµατα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των µεθόδων µονιµοποίησης και έγκλεισης ή σε εγγενείς ανωµαλίες εντός του ιστού. 3. Για βέλτιστα και αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα, οι αντικειµενοφόρες πλάκες µε τον ιστό πρέπει να αποπαραφινώνονται εντελώς. Η αφαίρεση της παραφίνης χρειάζεται να ολοκληρωθεί κατά την έναρξη της διαδικασίας χρώσης. ( είτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα B.2). 4. Πρέπει να χρησιµοποιείται µόνον υδατόλουτρο βαθµονοµηµένης θερµοκρασίας, θερµαντική πλάκα και φούρνος υβριδισµού. Η χρήση άλλων τύπων εξοπλισµού ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα την εξάτµιση του Μίγµατος ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH κατά τη διάρκεια του υβριδισµού και πρέπει να επικυρώνεται από το χρήστη. Χαρακτηριστικά απόδοσης - Μαστός Αναλυτική ευαισθησία Η ευαισθησία του Μίγµατος ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH εξετάστηκε µε χρήση 18 φυσιολογικών επιθηλιακών δειγµάτων ανθρώπινου µαστού. Η αναλογία µεταξύ του αριθµού των σηµάτων HER2 και των σηµάτων CEN-17 υπολογίστηκε µε βάση µια καταµέτρηση 20 πυρήνων ανά δείγµα. Η αναλογία HER2/CEN-17 για τα 18 φυσιολογικά επιθηλιακά δείγµατα ανθρώπινου µαστού ήταν µεταξύ 0,97 1,08. Αναλυτική ειδικότητα Οι ιχνηθέτες HER2 DNA στο µίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH έχουν υποβληθεί σε προσδιορισµό της αλληλουχίας του άκρου τους και χαρτογραφηθεί ώστε να επιβεβαιώνουν µια συνολική κάλυψη 218 kb, συµπεριλαµβανοµένου του γονιδίου HER2. Οι ιχνηθέτες CEN-17 PNA στο µίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH έχουν εξεταστεί µεµονωµένα και σε συνδυασµό για την επιβεβαίωση του ειδικού υβριδισµού τους στην κεντροµεριδιακή περιοχή του χρωµοσώµατος 17. Για να µετρηθεί η ικανότητα του προσδιορισµού να αναγνωρίζει µόνο τις ουσίες-στόχο HER2 και CEN-17 χωρίς παρεµβολές από άλλες ουσίες, διεξήχθησαν µελέτες σε δείγµατα ιστού από φυσιολογικό επιθήλιο ανθρώπινου µαστού µε χρήση του Φιαλιδίου 3 που περιείχε το ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού αλλά χωρίς το µίγµα ιχνηθετών. Αξιολογήθηκε ένα σύνολο 18 δειγµάτων αναφορικά µε την παρουσία σηµάτων που δεν σχετίζονταν µε το µίγµα ιχνηθετών. εν εντοπίστηκαν άλλα χρωµοσώµατα-στόχοι ούτε παρατηρήθηκε παρεµβολή µε στενά σχετιζόµενες ουσίες σε οποιοδήποτε εκ των 18 δειγµάτων. Μελέτες ισχύος Η ισχύς του προσδιορισµού HER2 IQFISH pharmdx εξετάστηκε µε µεταβολή του χρόνου προκατεργασίας, της θερµοκρασίας, καθώς των µεθόδων θέρµανσης του ρυθµιστικού διαλύµατος προκατεργασίας (φούρνος µικροκυµάτων ή υδατόλουτρο), του χρόνου και της µεθόδου επώασης της πεψίνης (πεψίνη RTU ή εµβάπτιση), του χρόνου και ( ) P04090GR_01_K / σελ. 20/68

21 Καρκίνος του µαστού της θερµοκρασίας µετουσίωσης, του χρόνου υβριδισµού, καθώς και του χρόνου και της θερµοκρασίας ισχυρής πλύσης. εν παρατηρήθηκε καµία σηµαντική διαφορά σε αποτελέσµατα στις ακόλουθες πειραµατικές συνθήκες: Προκατεργασία, Μέθοδος A). Υδατόλουτρο επί 10 λεπτά σε συνδυασµό µε καθεµία από τις θερµοκρασίες 95 C, C, και 99 C και συγχρόνως 9, 10 και 11 λεπτά στους C Προκατεργασία, Μέθοδος B). Φούρνος µικροκυµάτων για 9, 10, και 11 λεπτά στους >95 C. Χώνευση πεψίνης, Μέθοδος A), µε χρόνους επώασης 5, 10, και 15 λεπτών σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Χώνευση πεψίνης, Μέθοδος Β), µε χρόνους επώασης 3, 4, και 5 λεπτών στους 37 C. Χώνευση πεψίνης, Μέθοδος Γ), µε χρόνους επώασης 20, 25, και 30 λεπτών σε συνδυασµό µε καθεµία από τις θερµοκρασίες των 35, 37, και 39 C. Μετουσίωση επί 10 λεπτά σε συνδυασµό µε καθεµία από τις θερµοκρασίες των 65, 66, και 67 C και συγχρόνως 9, 10, και 11 λεπτά στους 66 C. Χρόνος υβριδισµού των 60, 90, και 120 λεπτών στους 45 C. Ισχυρή πλύση επί 10 λεπτά σε συνδυασµό µε καθεµία από τις θερµοκρασίες των 61, 63, και 65 C και συγχρόνως 9, 10, και 11 λεπτά στους 63 C. Σηµείωση: Για όλες τις δοκιµές ισχύος µόνο µία παράµετρος της διαδικασίας χρώσης άλλαζε κάθε φορά, ενώ όλες οι άλλες παράµετροι παρέµεναν σταθερές. Συνίσταται να τηρείτε τους χρόνους και τις θερµοκρασίες που υποδεικνύονται για τη διαδικασία χρώσης. Υβριδισµός επί 60 λεπτά απέδωσε υψηλή ένταση σηµάτων αν και ελαφρώς µειωµένη σε σύγκριση µε υβριδισµό 90 και 120 λεπτών. εν παρατηρήθηκε σηµαντική διαφορά σε αποτελέσµατα στους άλλους συνδυασµούς χρόνου/ θερµοκρασίας. Η διαδικασία χρώσης για το HER2 IQFISH pharmdx προσφέρει µεταβλητές πρωτοκόλλου για θερµική προκατεργασία, χώνευση πεψίνης και χρόνο υβριδισµού. Κάθε µοναδική επιλογή συνδυασµού επικυρώθηκε αναφορικά µε την κατάσταση του γονιδίου HER2. Η επικύρωση διεξήχθη σε 10 δείγµατα FFPE καρκινώµατος ανθρώπινου µαστού για καθεµία από τις 12 πιθανές επιλογές συνδυασµών. Το HER2 FISH pharmdx Kit (K5331) χρησιµοποιήθηκε ως αναφορά. Η αναλογία HER2/CEN-17 για κάθε µεµονωµένο δείγµα παρουσιάζεται στην Εικόνα 1. Οι διασταυρώσεις µεταβλητών µεταξύ των 12 δοκιµών και της χρώσης αναφοράς έδειξαν συνολική συµφωνία 100% (10/10) για την κατάσταση του γονιδίου HER2 µε το χαµηλότερο και ανώτερο όριο εµπιστοσύνης 95% του αµφίπλευρου ελέγχου στα 78,3% και 100%, αντίστοιχα. Η τιµή κ ήταν 1,00 και η δοκιµή McNemars έδειξε απουσία µεροληψία; (αµφίπλευρη τιµή p 1,00). ( ) P04090GR_01_K / σελ. 21/68

22 Καρκίνος του µαστού Εικόνα 1 Μεµονωµένες αναλογίες HER2/CEN-17 για 10 δείγµατα καρκινώµατος ανθρώπινου µαστού κεχρωσµένα µε χρήση των 12 πιθανών παραλλαγών συνδυαστικών πρωτοκόλλων µε το HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731) ( οκιµή 1-12) και το κιτ αναφοράς (R) HER2 FISH pharmdx Kit (Κωδικός K5331). Η οριζόντια γραµµή απεικονίζει την τιµή αποκλεισµού 2,0. Επαναληψιµότητα Η επαναληψιµότητα της αναλογίας HER2/CEN-17 διερευνήθηκε µε τον προσδιορισµό HER2 IQFISH pharmdx µε χρήση διαδοχικών τοµών από εννέα δείγµατα καρκινώµατος ανθρώπινου µαστού µε κατάσταση γονιδίου HER2 είτε ενισχυµένη είτε µη ενισχυµένη. Οι τοµές κάθε δείγµατος εξετάστηκαν εις τριπλούν στον ίδιο κύκλο. Ο µέσος συντελεστής διακύµανσης ήταν 5,2% για µη ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 1% έως 8%) και 14% για ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 7% έως 20%). Εξετάστηκαν συνολικά πέντε διαδοχικές τοµές τεσσάρων δειγµάτων καρκινώµατος ανθρώπινου µαστού µε διαφορετικά πάχη (3, 4, 5, 6, και 7 µm) µε το HER2 IQFISH pharmdx. Ο µέσος συντελεστής διακύµανσης της αναλογίας HER2/CEN-17 ήταν 7% (εύρος από 6% έως 9%). Αναπαραγωγιµότητα Ο προσδιορισµός HER2 IQFISH pharmdx εξετάστηκε αναφορικά µε την αναπαραγωγιµότητα µεταξύ παρτίδων και παρατηρητών µε χρήση τριών παρτίδων HER2 IQFISH pharmdx και τριών παρατηρητών. Η αναπαραγωγιµότητα εξατάστηκε σε εννέα διαφορετικά δείγµατα καρκινώµατος ανθρώπινου µαστού µε κατάσταση γονιδίου HER2 είτε ενισχυµένη είτε µη ενισχυµένη. Ο µέσος συντελεστής διακύµανσης για την αναπαραγωγιµότητα µεταξύ παρτίδων ήταν 5% για µη ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 2% έως 8%) και 7,8% για ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 5% έως 11%). Ο µέσος συντελεστής διακύµανσης για την αναπαραγωγιµότητα µεταξύ παρατηρητών ήταν 3,2% για µη ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 0,2% έως 6%) και 2,8% για ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 2% έως 4%). Κλινική χρησιµότητα Η κλινική χρησιµότητα του κιτ HER2 FISH pharmdx Kit (Κωδικός K5331) της Dako διερευνήθηκε σε µια συγκριτική µελέτη µε το κιτ ιχνηθετών HER-2 DNA Vysis PathVysion. Η µελέτη περιελάµβανε 150 αρχειοθετηµένα δείγµατα από ασθενείς που ( ) P04090GR_01_K / σελ. 22/68

23 Καρκίνος του µαστού είχαν καρκίνο του µαστού, είτε θετικών λεµφαδένων είτε αρνητικών λεµφαδένων, σταδίου II-III. Ο κύριος σκοπός της µελέτης ήταν η διερεύνηση του βαθµού συµφωνίας µεταξύ των αναλογιών HER2/κεντροµεριδίου του χρωµοσώµατος 17 για τα 150 δείγµατα κατά την εξέταση µε τα κιτ Dako και Vysis, τόσο όσον αφορά τη γενική συµφωνία των αναλογιών όσο και τη συµφωνία των διχοτοµηµένων αποτελεσµάτων FISH (+/- οµάδες). Υβριδιοποιήθηκαν µε επιτυχία και βαθµολογήθηκαν συνολικά 145 δείγµατα και εποµένως ήταν κατάλληλα για στατιστική ανάλυση. Στον πίνακα 1 παρουσιάζεται µια διασταύρωση µεταβλητών 2 x 2 των αποτελεσµάτων. Πίνακας 1. ιχοτοµηµένα αποτελέσµατα από 145 δείγµατα καρκίνου του µαστού που εξετάστηκαν µε το Dako HER2 FISH pharmdx Kit και το κιτ ιχνηθετών HER-2 DNA Vysis PathVysion. 60 πυρήνες σε κάθε δείγµα βαθµολογήθηκαν µε καθένα από τα δύο κιτ. Κιτ Vysis (-) ενισχυµένο Κιτ Vysis (+) ενισχυµένο Κιτ Dako (-) ενισχυµένο Κιτ Dako (+) ενισχυµένο Άθροισµα Άθροισµα Η συµφωνία µεταξύ των εξετάσεων Dako και Vysis ήταν 95% µε διάστηµα εµπιστοσύνης 92 99%. Η τιµή κ ήταν 0,89. Ο έλεγχος McNemars για συστηµατική µεροληψία µεταξύ των δύο εξετάσεων δεν ήταν σηµαντικός (p=0,22). Στην Εικόνα 2 παρουσιάζεται ένα στικτόγραµµα των παρατηρήσεων κατά ζεύγη για τα 145 δείγµατα. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 23/68

24 Καρκίνος του µαστού Scatter Στικτόγραµµα plot of των paired παρατηρήσεων observations κατά ζεύγη 12,00 10,00 DakoCytomation HER2 FISH pharmdx Kit Dako HER2 FISH pharmdx Kit 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Κιτ Vysis ιχνηθετών PathVysion Vysis PathVysion HER-2 DNA HER-2 Probe DNA Kit Εικόνα δείγµατα καρκίνου του µαστού που εξετάστηκαν για την ενίσχυση γονιδίου HER2 µε χρήση του Dako HER2 FISH pharmdx Kit και του κιτ ιχνηθετών HER-2 DNA Vysis PathVysion. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως αναλογίες HER2/κεντροµεριδίου χρωµοσώµατος πυρήνες σε κάθε δείγµα βαθµολογήθηκαν µε καθένα από τα δύο κιτ. Η γενική συµφωνία µεταξύ των εξετάσεων Dako HER2 FISH pharmdx και του Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe διερευνήθηκε µε χρήση ανάλυσης της διαφοράς µεταξύ παρατηρήσεων κατά ζεύγη λογαριθµικά (αναλογία) και µιας ανάλυσης γραµµικής παλινδρόµησης λογαριθµικά (αναλογία) των δύο εξετάσεων. Το συµπέρασµα ήταν ότι η διαφορά µεταξύ των παρατηρήσεων κατά ζεύγη λογαριθµικά (αναλογία) αυξάνεται συστηµατικά σύµφωνα µε το άθροισµα των αναλογιών του HER2/κεντροµεριδίου χρωµοσώµατος 17 και ότι για υψηλότερες αναλογίες, η µετρούµενη αναλογία είναι υψηλότερη στην εξέταση Dako από ό,τι στην εξέταση Vysis. Η υψηλότερη αναλογία HER2/κεντροµεριδίου χρωµοσώµατος 17 που παρατηρήθηκε µε το Dako HER2 FISH pharmdx Kit είναι δυνατό να σχετιστεί µε µια αληθή διαφορά µεταξύ των δύο εξετάσεων, π.χ. ότι µια υψηλότερη ανάλυση του Dako HER2 FISH pharmdx Kit έχει ως αποτέλεσµα υψηλότερες αναλογίες για περιπτώσεις υψηλής ενίσχυσης του γονιδίου HER2. Ωστόσο, η εξέταση των κιτ εκτελέστηκε σε 2 διαφορετικά κέντρα και αναµένεται διακύµανση µεταξύ των εργαστηρίων. Επιπλέον, στη βιβλιογραφία έχει αναφερθεί υψηλότερη διακύµανση για ιδιαίτερα ενισχυµένες περιπτώσεις, αλλά δεν θεωρείται ότι έχει κλινική σηµασία (18). Η τρέχουσα µελέτη δεν επιτρέπει τη διερεύνηση µιας συστηµατικής διαφοράς µεταξύ των δύο εξετάσεων σε πολλαπλά εργαστήρια. Πρέπει να προστεθεί ότι η παρατηρούµενη διακύµανση µεταξύ των δύο εξετάσεων είναι παρόµοιου µεγέθους, όπως η διακύµανση µεταξύ κέντρων που παρατηρήθηκε στη µελέτη φορητότητας. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 24/68

25 Καρκίνος του µαστού Το Dako HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731) συγκρίθηκε µε το Dako HER2 FISH pharmdx Kit (Κωδικός K5331) σε µια συγκριτική µελέτη 78 δειγµάτων ιστού καρκινώµατος ανθρώπινου µαστού. Η διασταύρωση µεταβλητών της κατάστασης του HER2 που έγινε από τους δυο προσδιορισµούς κατέληξε σε γενική συµφωνία 98,7% µε χαµηλότερο και ανώτερο όριο για το διάστηµα εµπιστοσύνης 95% στα 94,2% και 99,9%. Η τιµή κ ήταν 0,96 µε χαµηλότερο και ανώτερο όριο για το διάστηµα εµπιστοσύνης 95% στα 0,89 και 1,00. Η τιµή p για τη δοκιµή McNemars ήταν 1,00 υποδεικνύοντας απουσία µεροληψίας µεταξύ των δύο προσδιορισµών. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 25/68

26 Καρκίνος του µαστού Αντιµετώπιση προβληµάτων - Μαστός Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. εν παρουσιάζονται σήµατα ή είναι ασθενή 1α. Το κιτ έχει εκτεθεί σε υψηλές θερµοκρασίες κατά τη διάρκεια της µεταφοράς ή της φύλαξης 1β. Το µικροσκόπιο δεν λειτουργεί σωστά - Ακατάλληλο σετ φίλτρου - Εσφαλµένος λαµπτήρας - Ο λαµπτήρας υδραργύρου είναι πάρα πολύ παλιός - Ακάθαρτοι ή/και ραγισµένοι φακοί συλλέκτες - Ακατάλληλο έλαιο κατάδυσης 1α. Ελέγξτε τις συνθήκες φύλαξης. Βεβαιωθείτε ότι υπήρχε ξηρός πάγος κατά την παραλαβή της αποστολής. Βεβαιωθείτε ότι το φιαλίδιο 3 αποθηκεύτηκε στους -18 C στο σκοτάδι. Βεβαιωθείτε ότι τα φιαλίδια 2A και 5 αποθηκεύτηκαν στους 2 8 C κατά µέγιστο στο σκοτάδι. 1β. Ελέγξτε το µικροσκόπιο και βεβαιωθείτε ότι τα χρησιµοποιηµένα φίλτρα είναι κατάλληλα για χρήση µε τα φθορισµοχρώµατα του κιτ και ότι ο λαµπτήρας υδραργύρου είναι σωστός και δεν έχει χρησιµοποιηθεί πέρα από την αναµενόµενη διάρκεια ζωής του. ( είτε το παράρτηµα 3). Σε περίπτωση αµφιβολίας, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε τον τοπικό προµηθευτή του µικροσκοπίου σας. 1γ. Εξασθενηµένα σήµατα 1γ. Αποφύγετε τη µικροσκοπική εξέταση µακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρές πηγές φωτός. 1δ. Εσφαλµένες συνθήκες προκατεργασίας 1ε. Εξάτµιση του µίγµατος ιχνηθετών κατά τη διάρκεια του υβριδισµού 1δ. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόµενη θερµοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόµενο χρόνο 1ε. ιασφαλίστε επαρκή υγρασία στο θάλαµο υβριδισµού 2. Απουσία πράσινων σηµάτων 2α. Εσφαλµένες συνθήκες ισχυρής πλύσης 2α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιούνται οι συνιστώµενες τιµές θερµοκρασίας και χρόνου ισχυρής πλύσης και ότι οι καλυπτρίδες αφαιρούνται πριν από την εκτέλεση της ισχυρής πλύσης ( ) P04090GR_01_K / σελ. 26/68

27 Καρκίνος του µαστού Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 3. εν υπάρχουν ερυθρά σήµατα 3α. Εσφαλµένες συνθήκες προκατεργασίας 3α. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόµενη θερµοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόµενο χρόνο 4. Περιοχές χωρίς σήµα 5. Υπερβολική χρώση υποβάθρου 6. Πενιχρή µορφολογία ιστού 4α. Ο όγκος του ιχνηθέτη είναι πάρα πολύ µικρός 4β. Έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα κατά τη διάρκεια της εφαρµογής ή της επικάλυψης του µίγµατος ιχνηθετών 5α. Ακατάλληλη µονιµοποίηση ιστού 5β. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς 5γ. Η θερµοκρασία ισχυρής πλύσης είναι πάρα πολύ χαµηλή 5δ. Παρατεταµένη έκθεση της υβριδιωµένης τοµής σε ισχυρό φως 6α. Εσφαλµένη επεξεργασία µε πεψίνη 4α. Βεβαιωθείτε ότι ο όγκος του ιχνηθέτη είναι αρκετά µεγάλος για την κάλυψη της περιοχής κάτω από την καλυπτρίδα 4β. Αποφύγετε το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα. Εάν παρατηρηθούν, κτυπήστε ελαφρά µε χρήση λαβίδας για να τις αφαιρέσετε 5α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιούνται µόνον τοµές ιστών µονιµοποιηµένες µε φορµαλίνη και εγκλεισµένες σε παραφίνη 5β. Ακολουθήστε τις διαδικασίες αποπαραφίνωσης και επανενυδάτωσης που περιγράφονται στην ενότητα B.2 5γ. Βεβαιωθείτε ότι θερµοκρασία ισχυρής πλύσης είναι 63 (±2) C 5δ. Αποφύγετε τη µικροσκοπική εξέταση µακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρό φως 6α. Τηρείτε τους συνιστώµενους χρόνους επώασης της πεψίνης. είτε την ενότητα B.3, βήµα 2. Βεβαιωθείτε ότι η πεψίνη υποβάλλεται σε χειρισµό στη σωστή θερµοκρασία. είτε την ενότητα B.1 ( ) P04090GR_01_K / σελ. 27/68

28 Καρκίνος του µαστού Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 7. Υψηλό επίπεδο πράσινου αυτοφθορισµού στην αντικειµενοφόρο συµπεριλαµβανοµέ νων περιοχών χωρίς ιστό FFPE 6β. Εσφαλµένες συνθήκες προκατεργασίας ενδέχεται να έχουν ως αποτέλεσµα ασαφή ή νεφελώδη εµφάνιση 6γ. Πάρα πολύ µακρά επεξεργασία µε πεψίνη ή πάρα πολύ λεπτό πάχος τοµής ενδέχεται να προκαλέσει την εµφάνιση ιχνών κυττάρων ή κυττάρων σχήµατος κουλούρας. 7. Χρήση ληγµένων ή µη συνιστώµενων γυάλινων αντικειµενοφόρων 6β. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόµενη θερµοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόµενο χρόνο 6γ. Μειώστε το χρόνο επώασης της πεψίνης. είτε την ενότητα B.3, βήµα 2. Βεβαιωθείτε ότι το πάχος της τοµής είναι 4 6 µm. 7. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχει παρέλθει η ηµεροµηνία λήξης για την επιστρωµένη γυάλινη αντικειµενοφόρο (Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003, ή αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-lλυσίνη). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το πρόβληµα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες ή εάν η προτεινόµενη διορθωτική ενέργεια δεν επιτυγχάνει την επίλυση του προβλήµατος, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako για περαιτέρω βοήθεια. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 28/68

29 Καρκίνος του µαστού Παράρτηµα 1 - Μαστός HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός K5731 Λίστα ελέγχου του πρωτοκόλλου Ηµεροµηνία της εκτέλεσης: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Παρτίδα: Κωδ. αριθµός δείγµατος: Κωδ. αριθµός εξοπλισµού: Κωδ. αριθµός ηµερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Ηµεροµηνία αραίωσης/λήξης του 1 x Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωµένο 1:20): / Ιστός µονιµοποιηµένος µε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης Ναι Όχι Βήµα 1: Προκατεργασία Ηµεροµηνία αραίωσης/λήξης του διαλύµατος προκατεργασίας (Φιαλίδιο 1 αραιωµένο 1:20) / Μετρηµένη θερµοκρασία του διαλύµατος προκατεργασίας (95 99 C) αν χρησιµοποιείται υδατόλουτρο για θέρµανση C Προκατεργασία (10 λεπτά) και ψύξη (15 λεπτά) Πλύση σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωµένο 1:20) (2 x 3 λεπτά) Βήµα 2: Πεψίνη ιάρκεια της επεξεργασίας µε Πεψίνη (Φιαλίδιο 2) στους 37 ºC ή ιάρκεια της επεξεργασίας µε Πεψίνη (Φιαλίδιο 2) σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) ή ιάρκεια της εµβάπτισης σε πεψίνη στους 37 (±2) C Πλύση σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωµένο 1:20) (2 x 3 λεπτά) Αφυδάτωση αντικειµενοφόρων πλακών (3 x 2 λεπτά) σε διαβαθµισµένη σειρά αιθανόλης και στέγνωµα µε αέρα Βήµα 3: Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 Εφαρµογή του µίγµατος ιχνηθετών (Φιαλίδιο 3), κάλυψη µε καλυπτρίδα και στεγανοποίηση µε στεγανοποιητικό καλυπτρίδων Μετρηµένη θερµοκρασία µετουσίωσης (66 (±1) C) C Μετουσίωση επί 10 λεπτά Μετρηµένη θερµοκρασία υβριδισµού (45 (±2) C) C Λεπτά Λεπτά Λεπτά Χρόνος υβριδισµού ( λεπτά) Λεπτά ( ) P04090GR_01_K / σελ. 29/68

30 Καρκίνος του µαστού Βήµα 4: Ισχυρή πλύση Ηµεροµηνία αραίωσης/λήξης του ισχυρού ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης (Φιαλίδιο 4 αραιωµένο 1:20) / Μετρηµένη θερµοκρασία του ισχυρού ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης (63 (±2) C) Ισχυρή πλύση (10 λεπτά) µετά την αφαίρεση των καλυπτρίδων Πλύση σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωµένο 1:20) (2 x 3 λεπτά) Αφυδάτωση αντικειµενοφόρων πλακών (3 x 2 λεπτά) σε διαβαθµισµένη σειρά αιθανόλης και στέγνωµα µε αέρα Βήµα 5: Επικάλυψη Εφαρµογή 15 µl του µέσου επικάλυψης φθορισµού (Φιαλίδιο 5) και κάλυψη µε καλυπτρίδα C C Λεπτά Σχόλια: Ηµεροµηνία και υπογραφή, Τεχνικός: ( ) P04090GR_01_K / σελ. 30/68

31 Καρκίνος του µαστού Παράρτηµα 2 - Μαστός HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός K5731 Σχήµα βαθµολόγησης Κωδ. αριθµός ηµερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Ηµεροµηνία της εκτέλεσης: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Παρτίδα: Κωδ. αριθµός δείγµατος: Καταµέτρηση σηµάτων σε 20 πυρήνες Πυρήνας Αρ. HER2 βαθµολόγηση (ερυθρό) CEN-17 βαθµολόγηση (πράσινο) Πυρήνας Αρ Σύνολο (1-10) Σύνολο (11-20) HER2 βαθµολόγηση (ερυθρό) CEN-17 βαθµολόγηση (πράσινο) Για τον προσδιορισµό της αναλογίας HER2/CEN-17, καταµετρήστε τον αριθµό σηµάτων HER2 και τον αριθµό σηµάτων CEN-17 στους ίδιους 20 πυρήνες και διαιρέστε το συνολικό αριθµό των σηµάτων HER2 δια του συνολικού αριθµού των σηµάτων CEN-17. Εάν η αναλογία HER2/CEN-17 είναι οριακή (1,8 2,2), καταµετρήστε 20 πυρήνες επιπλέον και επανυπολογίστε την αναλογία. Αναλογία ίση ή πλησίον στην τιµή αποκλεισµού (1,8 2,2) πρέπει να ερµηνεύεται µε προσοχή (δείτε τον οδηγό καταµέτρησης). Σύνολο βαθµολογίας (1-20) HER2 CEN-17 Αναλογία HER2/CEN-17 Αναλογία < 2: εν παρατηρήθηκε ενίσχυση γονιδίου HER2 Αναλογία 2: Παρατηρήθηκε ενίσχυση γονιδίου HER2 Ηµεροµηνία και υπογραφή, Τεχνικός: Ηµεροµηνία και υπογραφή, Παθολογοανατόµος: Για κατευθυντήριες οδηγίες βαθµολόγησης: δείτε την ενότητα Ερµηνεία της χρώσης. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 31/68

32 Καρκίνος του µαστού Παράρτηµα 3 - Μαστός HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός K5731 Προδιαγραφές µικροσκοπίου φθορισµού Η Dako συνιστά τον ακόλουθο εξοπλισµό για χρήση µε το κιτ HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Τύπος µικροσκοπίου Μικροσκόπιο επιφθορισµού. 2. Λαµπτήρας Λαµπτήρας υδραργύρου 100 W (διατηρείτε αρχείο του χρόνου λειτουργίας του λαµπτήρα). 3. Αντικειµενικοί φακοί Για διερεύνηση του ιστού, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν ξηροί αντικειµενικοί φακοί φθορισµού 10X ή ελαιοκαταδυτικοί φακοί φθορισµού 16X. Για µεγέθυνση υψηλής ισχύος και βαθµολόγηση των σηµάτων, συνιστώνται µόνον ελαιοκαταδυτικοί αντικειµενικοί φακοί φθορισµού, π.χ. 100X. 4. Φίλτρα Τα φίλτρα έχουν σχεδιαστεί ατοµικά για ειδικά φθορισµοχρώµατα και πρέπει να επιλέγονται αναλόγως. Η Dako συνιστά τη χρήση ειδικού φίλτρου DAPI σε συνδυασµό µε διπλό φίλτρο Texas Red/FITC υψηλής ποιότητας. Φίλτρο DAPI, π.χ. φίλτρο Chroma αρ ιπλό φίλτρο Texas Red/FITC, π.χ. φίλτρο Chroma αρ Για επιβεβαίωση είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν µονά φίλτρα Texas Red και FITC. Φθορισµόχρωµα Μήκος κύµατος διέγερσης Μήκος κύµατος εκποµπής FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Τα φίλτρα είναι ειδικά για κάθε τύπο µικροσκοπίου και η χρήση κατάλληλων φίλτρων είναι κρίσιµης σηµασίας για την ερµηνεία. Εάν θέλετε λεπτοµερείς πληροφορίες, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε τον προµηθευτή του µικροσκοπίου σας ή µε τον αντιπρόσωπο της Dako. 5. Έλαιο Μη φθορίζον έλαιο. Προφυλάξεις εν συνιστάται χρήση λαµπτήρα υδραργύρου 50 W. εν είναι δυνατή η χρήση φίλτρων ροδαµίνης. ε συνιστώνται τριπλά φίλτρα. Ένα µη βελτιστοποιηµένο µικροσκόπιο είναι δυνατό να προκαλέσει προβλήµατα κατά την ανάγνωση των σηµάτων φθορισµού. Είναι σηµαντικό να µην έχει λήξει η φωτεινή πηγή και να έχει ευθυγραµµιστεί και εστιαστεί σωστά. Οι πελάτες πρέπει να παρακολουθούν και να ακολουθούν τις συστάσεις του κατασκευαστή για το λαµπτήρα υδραργύρου. Το µικροσκόπιο πρέπει να συντηρείται και ο λαµπτήρας υδραργύρου πρέπει να είναι σε ευθυγράµµιση πριν από την ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Πρέπει να καταβάλλεται προσπάθεια έκθεσης του δείγµατος σε όσο το δυνατόν λιγότερο φως διέγερσης προκειµένου να ελαχιστοποιηθεί η εξασθένηση του φθορισµού. Συνιστούµε τη συζήτηση της εγκατάστασης του συγκεκριµένου µικροσκοπίου σας µε τον κατασκευαστή πριν από την έναρξη του in situ υβριδισµού µε φθορισµό ή να ανατρέξετε στη βιβλιογραφία. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 32/68

33 Καρκίνος του στοµάχου Περίληψη και επεξήγηση - Στόµαχος Το ανθρώπινο γονίδιο HER2 (γνωστό και ως ERBB2 ή NEU) βρίσκεται στο χρωµόσωµα 17 και κωδικοποιεί την πρωτεΐνη HER2 ή p185 HER2. Η πρωτεΐνη HER2 είναι µια κινάση τυροσίνης µεµβρανικού υποδοχέα µε οµολογία για τον επιδερµικό υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (EGFR ή HER1) (1-2). Το γονίδιο HER2 υπάρχει σε 2 αντίγραφα σε όλα τα φυσιολογικά διπλοειδή κύτταρα. Πολλές µελέτες έδειξαν ότι υπάρχει υπερέκθεση της πρωτεΐνης HER2 και ενίσχυση του γονιδίου HER2 στις περιπτώσεις καρκίνου του στοµάχου (ανασκόπησή τους στο (20)). Η θετικότητα του HER2 µπορεί να ανιχνευθεί σε περίπου 20% των ασθενών είτε µε IHC ή FISH (20). Οι προκλινικές µελέτες in vitro και in vivo έδειξαν ότι η τραστουζουµάβη (Herceptin ) είναι αποτελεσµατική σε διάφορους τύπους καρκίνου του στοµάχου, δίνοντας έτσι αφορµή για την έναρξη πολλών κλινικών µελετών (20-24). Σε µια µελέτη BO18255 φάσης ΙΙΙ, τη δοκιµή ToGA, οι ασθενείς που παρουσίασαν θετικό HER2 µε µη εγχειρίσιµο, τοπικά προχωρηµένο, υποτροπιάζον ή/και µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής, τυχαιοποιήθηκαν για να λάβουν 5-FU ή καπεσιταβίνη και σισπλατίνη είτε µεµονωµένα είτε σε συνδυασµό µε την τραστουζουµάβη. Ένα στατιστικά σηµαντικό κέρδος στη συνολική βιωσιµότητα (OS) παρατηρήθηκε στους ασθενείς που έλαβαν συνδυασµένη θεραπεία µε τραστουζουµάβη και χηµειοθεραπεία (25). Η τραστουζουµάβη είναι ένα ανθρωποποιηµένο µονοκλωνικό αντίσωµα που συνδέεται µε υψηλή συγγένεια µε την πρωτεΐνη HER2 και έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό των ανθρώπινων νεοπλασµατικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη HER2 τόσο in vitro όσο και in vivo (21-24). Αρχή της διαδικασίας - Στόµαχος Το HER2 IQFISH pharmdx περιέχει όλα τα βασικά αντιδραστήρια που απαιτούνται για την ολοκλήρωση µιας διαδικασίας FISH για µονιµοποιηµένα µε φορµαλίνη, εγκλεισµένα σε παραφίνη δείγµατα τοµών ιστού. Μετά την αποπαραφίνωση και την επανενυδάτωση, τα δείγµατα θερµαίνονται σε ιάλυµα προκατεργασίας και ακολουθεί πρωτεολυτική χώνευση µε Πεψίνη.Μετά από τα βήµατα θέρµανσης και πρωτεολυτικής προκατεργασίας, το κιτ αυτό χρησιµοποιεί ένα µη τοξικό, έτοιµο προς χρήση Μίγµα ιχνηθετών IQISH µε βάση ένα συνδυασµό PNA (πεπτιδικού νουκλεϊκού οξέος) (12) και τεχνολογίας DNA. Αυτό το Μίγµα ιχνηθετών αποτελείται από ένα µίγµα σηµασµένων µε Texas Red ιχνηθετών DNA, που καλύπτουν µια περιοχή 218 kb η οποία περιλαµβάνει το γονίδιο HER2 στο χρωµόσωµα 17, και ένα µίγµα σηµασµένων µε φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών PNA που στοχεύουν στην κεντροµεριδιακή περιοχή του χρωµοσώµατος 17 (CEN-17). Ο ειδικός υβριδισµός στους δύο στόχους έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός διακριτού ερυθρού φθορίζοντος σήµατος σε κάθε θέση γονιδίου HER2 και ενός διακριτού πράσινου φθορίζοντος σήµατος σε κάθε κεντροµερίδιο του χρωµοσώµατος 17. Μετά από ισχυρή πλύση, τα δείγµατα στερεώνονται µε υλικό στερέωσης φθορισµού που περιέχει DAPI και καλύπτονται µε καλυπτρίδα. Με χρήση µικροσκοπίου φθορισµού που διαθέτει κατάλληλα φίλτρα (δείτε το Παράρτηµα 3), εντοπίζονται καρκινικά κύτταρα και διεξάγεται απαρίθµηση των ερυθρών (HER2) και των πράσινων (CEN-17) σηµάτων. Κατόπιν, υπολογίζεται η αναλογία HER2/CEN-17. Τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τοµή ιστού χρησιµεύουν ως εσωτερικός θετικός µάρτυρας της αποτελεσµατικότητας της προεπεξεργασίας και του υβριδισµού. Για λεπτοµέρειες, δείτε την ενότητα Ερµηνεία της χρώσης. Για διαδραστικά ηλεκτρονικά µαθήµατα, χρησιµοποιήστε το πρόγραµµα ηλεκτρονικής εκµάθησης HER2 IQFISH pharmdx που έχει σχεδιαστεί ώστε να παρέχει στους τεχνικούς του εργαστηρίου, τους παθολογοανατόµους και τους επιστήµονες ταχεία γνώση µε ακρίβεια του τρόπου επίτευξης βέλτιστων αποτελεσµάτων µε τη χρήση του HER2 IQFISH pharmdx : ( ) P04090GR_01_K / σελ. 33/68

34 Καρκίνος του στοµάχου Αντιδραστήρια - Στόµαχος Παρεχόµενα υλικά Τα υλικά που παρατίθενται παρακάτω επαρκούν για 20 εξετάσεις (µια εξέταση ορίζεται ως µία περιοχή στόχος διαστάσεων 22 mm x 22 mm). Ο αριθµός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 250 µl ανά αντικειµενοφόρο πλάκα του Φιαλιδίου 2A (5 8 σταγόνες), 10 µl ανά αντικειµενοφόρο πλάκα του Φιαλιδίου 3, και 15 µl ανά αντικειµενοφόρο πλάκα του Φιαλιδίου 5. Τα διαλύµατα στο Φιαλίδιο 3 και στο Φιαλίδιο 5 είναι ιξώδη και ενδέχεται να χρειαστεί σύντοµη φυγοκέντρησή τους σε µικροφυγόκεντρο για να συλλεγεί το σύνολο του παρεχόµενου αντιδραστηρίου. Το κιτ παρέχει υλικά που επαρκούν για 10 ατοµικούς κύκλους χρώσης (τέσσερεις ξεχωριστοί κύκλοι, όταν χρησιµοποιείται η µέθοδος εµβάπτισης σε πεψίνη). Το HER2 IQFISH pharmdx αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Για να διασφαλιστεί ότι τα συστατικά του κιτ δεν έχουν εκτεθεί σε υψηλές θερµοκρασίες κατά τη διάρκεια της µεταφοράς, κατά την παραλαβή πρέπει να υπάρχει ακόµα ξηρός πάγος. Σηµειωτέον ότι µερικά συστατικά του κιτ ενδέχεται να παραµείνουν µη κατεψυγµένα. Αυτό δεν επηρεάζει την απόδοση του HER2 IQFISH pharmdx. Φιαλίδιο 1 Φιαλίδιο 2A Φιαλίδιο 2B Φιαλίδιο 3 Φιαλίδιο 4 Φιαλίδιο 5 ιάλυµα προκατεργασίας (20x) 150 ml, συµπυκνωµένο 20x Ρυθµιστικό διάλυµα MES (2-[N- µορφολινο]αιθανοσουλφονικό οξύ). Πεψίνη 4 x 6,0 ml, έτοιµο προς χρήση ιάλυµα πεψίνης, ph 2,0, περιέχει σταθεροποιητή και αντιµικροβιακό παράγοντα. Αραιωτικό πεψίνης (10x) 24 ml, συµπυκνωµένο 10x Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης, ph 2,0. Περιέχει αντιµικροβιακό παράγοντα. Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH 0,2 ml, έτοιµο προς χρήση Μίγµα σηµασµένων µε Texas Red ιχνηθετών HER2 DNA και σηµασµένων µε φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών CEN-17 PNA. Παρέχονται σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού IQISH. Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (20x) 150 ml, συµπυκνωµένο 20x Ρυθµιστικό διάλυµα SSC (αλατούχο διάλυµα-κιτρικό νάτριο) µε απορρυπαντικό (Tween-20). Μέσο επικάλυψης φθορισµού 0,4 ml, έτοιµο προς χρήση Μέσο επικάλυψης φθορισµού µε 500 µg/l DAPI (4,6-διαµιδίνη-2-φαινυλινδόλη). Φιαλίδιο 6 ( ) P04090GR_01_K / σελ. 34/68

35 Καρκίνος του στοµάχου Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (20x) 500 ml, συµπυκνωµένο 20x Ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl. Στεγανοποιητικό καλυπτρίδας 1 σωληνάριο, έτοιµο προς χρήση ιάλυµα για αφαιρούµενο στεγανωτικό καλυπτρίδων. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα παρακάτω αντιδραστήρια του κιτ: ιάλυµα προκατεργασίας (20x), Πεψίνη, Αραιωτικό πεψίνης (10x), Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (20x), Μέσο επικάλυψης φθορισµού, Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (20x) και Στεγανοποιητικό καλυπτρίδας µπορούν να αντικατασταθούν µε τα αντίστοιχα αντιδραστήρια του κιτ Dako Histology FISH Accessory Kit, Κωδικός K5799. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Εργαστηριακά αντιδραστήρια Απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό Αιθανόλη, 96% Ξυλένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Εργαστηριακός εξοπλισµός Απορροφητικά µαντηλάκια Ρυθµιζόµενες πιπέτες Βαθµονοµηµένο θερµόµετρο µερικής εµβάπτισης (εύρος C) Βαθµονοµηµένο θερµόµετρο επιφανείας (εύρος C) Καλυπτρίδες (22 mm x 22 mm) Λαβίδα Απαγωγός αναθυµιάσεων Dako Hybridizer (Κωδικός S2450 ή S2451)* Θερµαντική πλάκα ή κλίβανος υβριδισµού* Υγρός θάλαµος υβριδισµού* Μικροφυγόκεντρος Αντικειµενοφόρες πλάκες, Dako Silanized Slides, κωδικός S3003 ή αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη (δείτε την ενότητα Παρασκευή δειγµάτων) οχεία ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (µε ικανότητα χρονοµέτρησης διαστηµάτων 2-15 λεπτών) Αναδευτήρας περιδίνησης Υδατόλουτρο µε καπάκι (ικανό να διατηρεί θερµοκρασία 37(±2) C, 63 (±2) C και από 95 C έως 99 C) Φούρνος µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης εάν η προκατεργασία διεξάγεται µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων (δείτε B3. Πρωτόκολλο χρώσης. Βήµα 1: Προκατεργασία, Μέθοδος B) * Θερµαντική πλάκα ή κλίβανος υβριδισµού για τη µετουσίωση (66 (±1) C) και τον υβριδισµό (45 (±2) C) σε συνδυασµό µε υγρό θάλαµο υβριδισµού µπορούν να χρησιµοποιηθούν εναλλακτικά αντί για τον Dako Hybridizer. Εξοπλισµός και παρελκόµενα µικροσκοπίου Φίλτρα για µικροσκόπιο φθορισµού: DAPI και διπλό φίλτρο FITC/Texas Red ή µονά φίλτρα FITC και Texas Red δείτε το Παράρτηµα 3 για λεπτοµέρειες ( ) P04090GR_01_K / σελ. 35/68

36 Καρκίνος του στοµάχου Ως πηγή φωτός πρέπει να χρησιµοποιηθεί µικροσκόπιο φθορισµού µε λαµπτήρα υδραργύρου 100 Watt. εν συνιστώνται άλλες πηγές φωτός µε τα φίλτρα αυτά. Θήκη αντικειµενοφόρων πλακών µικροσκοπίου (χαρτονένιος δίσκος για 20 αντικειµενοφόρες πλάκες µε αρθρωτό κάλυµµα ή παρόµοιος δίσκος) Προφυλάξεις - Στόµαχος 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελµατίες χρήστες. 3. εν απαιτείται σήµανση κινδύνου για το φιαλίδιο 1, Pre-Treatment Solution (20x). Το Φύλλο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελµατίες χρήστες κατόπιν αίτησης. 4. Φιαλίδιο 2Α, Pepsin, περιέχει 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A, και <0.1% 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one και 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Φιαλίδιο 2A είναι σηµασµένο: Κίνδυνος H314 Προκαλεί σοβαρά δερµατικά εγκαύµατα και οφθαλµικές βλάβες. H317 Μπορεί να προκαλέσει αλλεργική δερµατική αντίδραση. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. P304 + P340 + P310 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ: Μεταφέρετε τον παθόντα στον καθαρό αέρα και αφήστε τον να ξεκουραστεί σε στάση που διευκολύνει την αναπνοή. Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. P301 + P310 + P331 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. ΜΗΝ προκαλέσετε εµετό. P303 + P361 + P353 + ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): P310 Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερµίδα µε νερό/στο ντους. Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. P305 + P310 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. P405 Φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 5. Φιαλίδιο 2B, Pepsin Diluent (10x), περιέχει 50-<75% propan-2-ol, και 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Φιαλίδιο 2B είναι σηµασµένο: Danger H225 H319 H336 P280 P210 Υγρό και ατµοί πολύ εύφλεκτα. Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Μπορεί να προκαλέσει υπνηλία ή ζάλη. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Μακριά από θερµότητα, θερµές επιφάνειες, σπινθήρες, ( ) P04090GR_01_K / σελ. 36/68

37 Καρκίνος του στοµάχου γυµνές φλόγες και άλλες πηγές ανάφλεξης. Μην καπνίζετε. P241 Να χρησιµοποιείται αντιεκρηκτικός ηλεκτρολογικός, εξαερισµού, φωτιστικός και για χειρισµό όλων των υλικών εξοπλισµός. P304 + P340 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ: Μεταφέρετε τον παθόντα στον καθαρό αέρα και αφήστε τον να ξεκουραστεί σε στάση που διευκολύνει την αναπνοή. P303 + P361 + P353 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. P235 Να διατηρείται δροσερό. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 6. Φιαλίδιο 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, περιέχει 10-<25% ethylene carbonate και 3- <5% sodium chloride. Φιαλίδιο 3 είναι σηµασµένο: H319 P280 Προσοχή P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. 7. Φιαλίδιο 4, Stringent Wash Buffer (20x), περιέχει 10-<25% sodium chloride και 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Φιαλίδιο 4 είναι σηµασµένο: H319 H315 P280 Προσοχή P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Προκαλεί ερεθισµό του δέρµατος. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. 8. Φιαλίδιο 6, Wash Buffer (20x), περιέχει 10-<25% sodium chloride και 10-<20% trometamol. Φιαλίδιο 6 είναι σηµασµένο: Προσοχή H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Προκαλεί ερεθισµό του δέρµατος. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί ( ) P04090GR_01_K / σελ. 37/68

38 Καρκίνος του στοµάχου επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. 9. Coverslip Sealant, περιέχει 100% ελαφρά υδρογονοκατεργασµένη νάφθα (πετρέλαιο), µε τη σήµανση: Κίνδυνος H225 Υγρό και ατµοί πολύ εύφλεκτα. H304 Μπορεί να προκαλέσει θάνατο σε περίπτωση κατάποσης και διείσδυσης στις αναπνευστικές οδούς. H411 Τοξικό για τους υδρόβιους οργανισµούς, µε µακροχρόνιες επιπτώσεις. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. P210 Μακριά από θερµότητα, θερµές επιφάνειες, σπινθήρες, γυµνές φλόγες και άλλες πηγές ανάφλεξης. Μην καπνίζετε. P241 Να χρησιµοποιείται αντιεκρηκτικός ηλεκτρολογικός, εξαερισµού, φωτιστικός και για χειρισµό όλων των υλικών εξοπλισµός. P273 Avoid release to the environment. P301 + P310 + P331 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. ΜΗΝ προκαλέσετε εµετό. P303 + P361 + P353 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερµίδα µε νερό/στο ντους. P235 Να διατηρείται δροσερό. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 10. Τα δείγµατα, πριν και µετά τη µονιµοποίηση, καθώς και όλα τα υλικά που εκτίθενται σε αυτά, πρέπει να υποβάλλονται σε χειρισµό ως δυνητικά µετάδοσης λοίµωξης και πρέπει να απορρίπτονται µε κατάλληλες προφυλάξεις (16). Μην αναρροφάτε µε πιπέτα τα αντιδραστήρια µε το στόµα και αποφεύγετε την επαφή του δέρµατος και των βλεννογόνων µε αντιδραστήρια και δείγµατα. Εάν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή µε ευαίσθητες περιοχές, πλύνετε µε άφθονο νερό. 11. Ελαχιστοποιήστε τη µικροβιακή µόλυνση των αντιδραστηρίων ώστε να αποφύγετε εσφαλµένα αποτελέσµατα. 12. Χρόνοι και θερµοκρασίες επώασης ή µέθοδοι διαφορετικές από εκείνες που καθορίζονται, ενδέχεται να δώσουν εσφαλµένα αποτελέσµατα. 13. Μέθοδοι µονιµοποίησης ιστών και πάχη δειγµάτων διαφορετικά από εκείνα που καθορίζονται ενδέχεται να επηρεάσουν τη µορφολογία των ιστών ή/και την ένταση του σήµατος. 14. Αποφεύγετε την εξάτµιση του µίγµατος ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH κατά τη διάρκεια του υβριδισµού διασφαλίζοντας επαρκή υγρασία στο θάλαµο υβριδισµού. 15. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα απώλεια της απόδοσης. 16. Φοράτε κατάλληλο ατοµικό προστατευτικό εξοπλισµό, έτσι ώστε να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. Παρακαλούµε ανατρέξτε στο δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (SDS) για επιπλέον πληροφορίες. 17. Εξαιτίας της ετερογενούς φύσης των δειγµάτων του καρκίνου του στοµάχου, είναι σηµαντικό να εκτελείται λεπτοµερής σάρωση ολόκληρου του δείγµατος για να εκτιµάται η κατανοµή του σήµατος πριν επιλεγεί η περιοχή για την απαρίθµηση των σηµάτων. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 38/68

39 Καρκίνος του στοµάχου 18. εν συνίσταται η εκτίµηση πολύ µικρών δειγµάτων (δηλαδή τα δείγµατα πρέπει να έχουν άθικτη µορφολογία και επαρκείς πυρήνες για την απαρίθµηση). 19. Αν γίνει ανάλυση HER2 FISH σε ένα δείγµα βιοψίας, πρέπει να αναλυθούν πολλαπλές βιοψίες (7-8) µε δυνατότητα αξιολόγησης από διαφορετικές περιοχές του όγκου για να διασφαλιστεί ο αξιόπιστος προσδιορισµός της κατάστασης του HER Για την αναγνώριση όλων των πυρήνων ιστού σε δείγµα βιοψίας, είναι σηµαντική η εξέταση της κεχρωσµένης µε H&E αντικειµενοφόρου πλάκας. 21. Μόνο καθαρά δοχεία χρώσης πρέπει να χρησιµοποιούνται για τη µέθοδο εµβάπτισης σε πεψίνη (Βήµα 2, µέθοδος Γ). Αποθήκευση - Στόµαχος Αποθηκεύστε το Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH (Φιαλίδιο 3) στους -18 C στο σκοτάδι. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια µπορούν να αποθηκευτούν στους 2 8 C στο σκοτάδι. Όλα τα αντιδραστήρια ανέχονται φύλαξη στην κατάψυξη. Η κατάψυξη και η απόψυξη των αντιδραστηρίων για έως και 10 φορές δεν επηρεάζει την απόδοση. Η Πεψίνη, το Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH, και το Μέσο επικάλυψης φθορισµού (Φιαλίδια 2Α, 3 και 5) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσµενώς εάν εκτεθούν σε θερµότητα. Μην αφήνετε τα συστατικά αυτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Το Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH και το Μέσο επικάλυψης φθορισµού (Φιαλίδια 3 και 5) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσµενώς εάν εκτεθούν σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μη φυλάσσετε τα συστατικά αυτά και µην εκτελείτε ανάλυση σε έντονο φως, όπως το άµεσο ηλιακό φως. Μη χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στο κουτί του κιτ. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό συνθήκες διαφορετικές από εκείνες που καθορίζονται σε αυτό το ένθετο συσκευασίας, ο χρήστης πρέπει να επικυρώσει την απόδοση του αντιδραστηρίου (13). εν υπάρχουν εµφανή σηµεία που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Εποµένως, είναι σηµαντικό να αξιολογείτε τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τοµή ιστού. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενο πρότυπο φθορισµού που δεν είναι δυνατό να εξηγηθεί από διακυµάνσεις στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το HER2 IQFISH pharmdx, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako. Παρασκευή δείγµατος - Στόµαχος είγµατα αδενοκαρκινώµατος του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, από βιοψίες, εκτοµές ή εξαιρέσεις πρέπει να υποβάλλονται σε χειρισµό έτσι ώστε να διατηρείται ο ιστός για ανάλυση FISH. Για όλα τα δείγµατα πρέπει να χρησιµοποιούνται πρότυπες µέθοδοι επεξεργασίας ιστού για ανοσοκυτταροχηµική χρώση (14). Για την εξέταση µικρών δειγµάτων βιοψίας, βεβαιωθείτε ότι η µορφολογία του όγκου είναι άθικτη και ότι υπάρχουν αρκετοί πυρήνες για απαρίθµηση των σηµάτων. Αν γίνει ανάλυση HER2 FISH σε ένα δείγµα βιοψίας, πρέπει να αναλυθούν πολλαπλές βιοψίες (7-8) µε δυνατότητα αξιολόγησης από διαφορετικές περιοχές του όγκου για να διασφαλιστεί ο αξιόπιστος προσδιορισµός της κατάστασης του HER2. Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη Κατάλληλοι για χρήση είναι µόνον ιστοί που διατηρoύνται σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης και εγκλεισµένοι σε παραφίνη. Τα δείγµατα πρέπει π.χ. να τεµαχίζονται σε πάχος 3 ή 4 mm και να µονιµοποιούνται επί ώρες σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης. είγµατα βιοψίας µονιµοποιήθηκαν επί 6 8 ώρες στη δοκιµή ToGA (για παραποµπή στη µελέτη, ανατρέξτε στο (25)). Οι ιστοί κατόπιν αφυδατώνονται σε διαβαθµισµένη σειρά αιθανόλης και ξυλενίου, και ακολουθεί διήθηση από τηγµένη παραφίνη που διατηρείται σε θερµοκρασία όχι µεγαλύτερη των 60 C. Κατάλληλα µονιµοποιηµένοι και εγκλεισµένοι ιστοί θα διατηρούνται επ ( ) P04090GR_01_K / σελ. 39/68

40 Καρκίνος του στοµάχου αόριστον πριν από την εκτέλεση τοµών και τη στερέωση σε αντικειµενοφόρο πλάκα, εφόσον φυλάσσονται σε δροσερό χώρο (15 25 C) (14, 15). Άλλα µονιµοποιητικά δεν είναι κατάλληλα. Τα δείγµατα ιστού πρέπει να κόβονται σε τοµές 3 6 µm. Οι αντικειµενοφόρες πλάκες που απαιτούνται για την ανάλυση ενίσχυσης γονιδίου HER2 και την επαλήθευση της παρουσίας όγκου πρέπει να παρασκευάζονται ταυτόχρονα. Συνιστώνται τουλάχιστον 2 διαδοχικές τοµές, 1 τοµή για παρουσία όγκου κεχρωσµένη µε αιµατοξυλίνη και ηωσίνη (χρώση H&E) και 1 τοµή για την ανάλυση ενίσχυσης γονιδίου HER2. Συνιστάται η στερέωση των τοµών ιστού σε Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003 ή σε αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη. Τα δείγµατα πρέπει να αναλύονται εντός 4 6 µηνών από την εκτέλεση της τοµής, όταν φυλάσσονται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). ( ) P04090GR_01_K / σελ. 40/68

41 Καρκίνος του στοµάχου Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Στόµαχος Α. Παρασκευή αντιδραστηρίων - Στόµαχος Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση: A.1 ιάλυµα προκατεργασίας Στο Φιαλίδιο 1 ενδέχεται να σχηµατιστούν κρύσταλλοι, αλλά θα διαλυθούν σε θερµοκρασία δωµατίου. Βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχουν κρύσταλλοι πριν από την παρασκευή του αντιδραστηρίου. Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 1 ( ιάλυµα προκατεργασίας 20x) µε αραίωση του συµπυκνώµατος 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.2 Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 4 (Ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης 20x) µε αραίωση του συµπυκνώµατος 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.3 Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 6 (Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης 20x) µε αραίωση του συµπυκνώµατος 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.4 Σειρά αιθανόλης Από ένα διάλυµα αιθανόλης 96%, παρασκευάστε 3 δοχεία µε αιθανόλη 70%, 85% και 96%, αντίστοιχα. Φυλάσσετε τα καλυµµένα δοχεία σε θερµοκρασία δωµατίου ή στους 2 8 C και χρησιµοποιήστε για 200 αντικειµενοφόρες πλάκες κατά µέγιστο. Απορρίψτε τα διαλύµατα εάν έχουν νεφελώδη εµφάνιση. A.5 ιάλυµα πεψίνης ιάλυµα πεψίνης χρειάζεται µόνο όταν χρησιµοποιείται η µέθοδος εµβάπτισης σε πεψίνη (Μέθοδος Γ). Παρασκευάστε το διάλυµα πεψίνης ως εξής: Για δοχείο χωρητικότητας έξι αντικειµενοφόρων, παρασκευάστε διάλυµα πεψίνης 60 ml: Προσθέστε 48 ml απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) στο δοχείο. Προσθέστε 6 ml κρύο (2 8 C) Αραιωτικό πεψίνης (10x) (Φιαλίδιο 2B) στο δοχείο. Προσθέστε 6 ml κρύα (2 8 C) Πεψίνη (Φιαλίδιο 2A) στο δοχείο. Τοποθετήστε καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Για δοχείο χωρητικότητας 24 αντικειµενοφόρων, παρασκευάστε διάλυµα πεψίνης 240 ml: Προσθέστε 192 ml απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) στο δοχείο. Προσθέστε 24 ml κρύο (2 8 C) Αραιωτικό πεψίνης (10x) (Φιαλίδιο 2B) στο δοχείο. Προσθέστε 24 ml κρύα (2 8 C) Πεψίνη (Φιαλίδιο 2A) στο δοχείο. Τοποθετήστε καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 41/68

42 Καρκίνος του στοµάχου ιάλυµα πεψίνης που έχει ισορροπήσει πρέπει να χρησιµοποιείται εντός 5 ωρών. B. ιαδικασία χρώσης - Στόµαχος B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Ο χρήστης πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα συστατικά πριν από τη χρήση (δείτε την ενότητα Προφυλάξεις ). Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να εξισορροπούνται στη σχετική θερµοκρασία πριν από τη χρήση ως εξής: Φιαλίδιο 1: Το αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας πρέπει να εξισορροπείται στους C αν χρησιµοποιείται υδατόλουτρο για την προκατεργασία (B3. Πρωτόκολλο χρώσης, Βήµα 1: Προεπεξεργασία, Μέθοδος Α). Αν χρησιµοποιείται φούρνος µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης για την προκατεργασία (B3. Πρωτόκολλο χρώσης, Βήµα 1: Προκατεργασία, Μέθοδος B) το αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας πρέπει να εξισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου στους C. Φιαλίδιο 2A: Η πεψίνη πρέπει να εφαρµόζεται στους 2 8 C (B3, Πρωτόκολλο χρώσης. Βήµα 2 Μέθοδος A και B) και να διατηρείται ψυχρό συνεχώς. Φιαλίδιο 2B: Το αραιωτικό πεψίνης (10x) πρέπει να εφαρµόζεται στους 2 8 C (B3, Πρωτόκολο χρώσης, Βήµα 2 Μέθοδος Γ). Φιαλίδιο 3: Το Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH διαχωρίζεται σε δύο φάσεις ενώ φυλάσσεται στους -18 C. Πριν χρησιµοποιήσετε το Φιαλίδιο 3, βεβαιωθείτε ότι υπάρχει µόνο µία φάση εξισορροπώντας το µίγµα ιχνηθετών σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C ) και αναµιγνύοντας στη συνέχεια. Αποψύχτε το Φιαλίδιο 3 σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) για 30 λεπτά κατά µέγιστο (προστατεύοντας από δυνατό φως), και κατόπιν περιδινήστε ενδελεχώς το φιαλίδιο για 15 δευτερόλεπτα στις 2500 rpm χρησιµοποιώντας αναδευτήρα περιδίνησης. Αποθηκεύστε το Φιαλίδιο 3 στους -18 C αµέσως µετά τη χρήση. Φιαλίδιο 4: Αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης. Ένα δοχείο πρέπει να ισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου, ένα άλλο στους 63 (±2) C πριν από τη χρήση. Φιαλίδιο 5: Μέσο επικάλυψης φθορισµού. Μπορεί να εφαρµοστεί σε οποιαδήποτε θερµοκρασία από 2 25 C. Φιαλίδιο 6: Το Αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης πρέπει να ισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου C. Το Στεγανοποιητικό καλυπτρίδας µπορεί να εφαρµοστεί σε οποιαδήποτε θερµοκρασία από 2 25 C. Όλα τα βήµατα πρέπει να εκτελούνται στη θερµοκρασία που καθορίζεται. Η διαδικασία περιλαµβάνει διάφορες αφυδατώσεις ακολουθούµενες από το στέγνωµα των τοµών ιστών. Βεβαιωθείτε ότι οι τοµές ιστών είναι εντελώς στεγνές πριν προχωρήσετε στο επόµενο βήµα. Μην αφήνετε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν κατά τη διάρκεια των άλλων βηµάτων της διαδικασίας. Εάν η διαδικασία χρώσης πρέπει να διακοπεί, οι αντικειµενοφόρες πλάκες είναι δυνατό να διατηρηθούν σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης µετά το βήµα αποπαραφίνωσης επί έως 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεάζονται τα αποτελέσµατα. B.2 Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση Αποπαραφίνωση και επανενυδάτωση: Πριν από την εκτέλεση της ανάλυσης, οι αντικειµενοφόρες πλάκες µε τον ιστό πρέπει να υποβάλλονται σε αποπαραφίνωση για την αφαίρεση του µέσου έγκλεισης και να επανενυδατώνονται. Αποφεύγετε την ατελή αφαίρεση της παραφίνης. Υπολειµµατικό µέσο έγκλεισης έχει ως αποτέλεσµα αυξηµένη µη ειδική χρώση. Το βήµα αυτό πρέπει να εκτελείται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). ( ) P04090GR_01_K / σελ. 42/68

43 Καρκίνος του στοµάχου 1. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε λουτρό ξυλενίου και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 2. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε αιθανόλη 96% επί 2 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 3. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε αιθανόλη 70% επί 2 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 4. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια υγρού και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 2 λεπτά τουλάχιστον. Αρχίστε τη διαδικασία χρώσης όπως παρουσιάζεται στην ενότητα B.3, Βήµα 1, Προκατεργασία. Τα διαλύµατα ξυλενίου και αλκοόλης πρέπει να αλλάζουν µετά από 200 αντικειµενοφόρες πλάκες ή λιγότερες. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν υποκατάστατα ξυλενίου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο κιτ αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή µεταβολή των θερµοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα ή ασύµφωνα αποτελέσµατα. Τυχόν διαφορές στην επεξεργασία των ιστών και τις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να ακυρώσουν τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού. B.3 Πρωτόκολλο χρώσης Βήµα 1: Προκατεργασία Η προκατεργασία µπορεί να διεξαχθεί είτε µε χρήση υδατόλουτρου όπως περιγράφεται στη µέθοδο Α) είτε, εναλλακτικά, µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης όπως περιγράφεται στη µέθοδο Β). Μέθοδος A: Προκατεργασία µε χρήση υδατόλουτρου Γεµίστε δοχεία χρώσης, π.χ. δοχεία Coplin, µε το αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.1). Τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το διάλυµα προκατεργασίας στους C. Μετρήστε τη θερµοκρασία εντός του δοχείου µε ένα βαθµονοµηµένο θερµόµετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερµοκρασίας. Καλύψτε τα δοχεία µε καπάκια προκειµένου να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφευχθεί τυχόν εξάτµιση. Εµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές σε θερµοκρασία δωµατίου στο προθερµασµένο διάλυµα προκατεργασίας στα δοχεία χρώσης. Επανελέγξτε τη θερµοκρασία και επωάστε επί 10 (±1) λεπτά στους C. Αφαιρέστε ολόκληρο το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρες πλάκες από το υδατόλουτρο. Αφαιρέστε το καπάκι και αφήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες να ψυχθούν στο διάλυµα προκατεργασίας επί 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε ένα δοχείο µε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το ιάλυµα προκατεργασίας έχει σχεδιαστεί για χρήση για µία µόνο εφαρµογή. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Μέθοδος Β: Προκατεργασία µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης Γεµίστε ένα πλαστικό δοχείο µε αραιωµένο διάλυµα προκατεργασίας σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Εµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές στο διάλυµα προκατεργασίας, καλύψτε το δοχείο µε τρυπηµένο καπάκι και τοποθετήστε το στο φούρνο µικροκυµάτων. Επιλέξτε τη λειτουργία αισθητήρα βρασµού και πρόγραµµα που λειτουργεί επί 10 λεπτά µετά την επίτευξη της θερµοκρασίας βρασµού*. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 43/68

44 Καρκίνος του στοµάχου Ύστερα από τα 10 λεπτά επώασης, βγάλτε το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρες από το φούρνο, αφαιρέστε το καπάκι και αφήστε να κρυώσει επί 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες σε δοχείο µε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. * Η χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης σηµαίνει ότι ο φούρνος πρέπει να διαθέτει αισθητήρα και προγράµµατα τα οποία αρχικά θερµαίνουν το διάλυµα προκατεργασίας ως το σηµείο βρασµού και εν συνεχεία διατηρούν την απαιτούµενη θερµοκρασία προκατεργασίας (άνω των 95 ºC) ενώ κάνουν αντίστροφη µέτρηση του προκαθορισµένου χρόνου (10 (±1) λεπτά). Ορισµένα µοντέλα φούρνων µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης ενδέχεται να µην διαθέτουν δυνατότητα ελεύθερης ρύθµισης χρόνου αντίστροφης µέτρησης. Αν το µοντέλο διαθέτει µόνο προκαθορισµένα προγράµµατα, βεβαιωθείτε ότι επιλέξατε πρόγραµµα που διατηρεί την απαιτούµενη θερµοκρασία προκατεργασίας (άνω των 95 ºC) επί τουλάχιστον 10 (±1) λεπτά και σταµατήστε διά χειρός το πρόγραµµα µετά από 10 (±1) λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το διάλυµα προκατεργασίας έχει σχεδιαστεί για χρήση για µία µόνο εφαρµογή. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Βήµα 2: Πεψίνη, έτοιµη προς χρήση (RTU) ή διάλυµα πεψίνης Η επώαση πεψίνης µπορεί να διεξαχθεί µε απευθείας εφαρµογή σταγόνων πεψίνης RTU στις αντικειµενοφόρες είτε σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (Μέθοδος A) είτε στους 37 C (Μέθοδος B). Εναλλακτικά, οι αντικειµενοφόρες µπορούν να εµβαπτιστούν σε διάλυµα πεψίνης και να επωαστούν στους 37 (±2) C (Μέθοδος Γ). Μέθοδος Α και Μέθοδος Β: Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρεθεί η περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος. Με χρήση απορροφητικού υφάσµατος που δεν αφήνει χνούδι (όπως απορροφητικό ταµπόν ή τεµάχιο γάζας), σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα για την αφαίρεση τυχόν υγρού που αποµένει και για να διατηρήσετε τα αντιδραστήρια εντός της καθορισµένης περιοχής. Εφαρµόστε 5 8 σταγόνες (250 µl) ψυχρής (2 8 C) πεψίνης (Φιαλίδιο 2Α) για την κάλυψη του δείγµατος. Φυλάσσετε πάντοτε την πεψίνη στους 2 8 C. Μέθοδος A: Πεψίνη, RTU - Επώαση στους C Επωάστε επί 5 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Χρόνος επώασης 5 15 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε περίσσεια πεψίνης και εµβαπτίστε τις τοµές στο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Συνεχίστε µε την αφυδάτωση. Μέθοδος Β: Πεψίνη, RTU - Επώαση στους 37 C Τοποθετήστε δείγµα µε πεψίνη σε θερµαντική πλάκα στους 37 C π.χ. Dako Hybridizer και επωάστε επί 3 5 λεπτά. Χρόνος επώασης 3 5 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να φύγει η περίσσεια πεψίνης και εµβαπτίστε τις τοµές σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε την αφυδάτωση. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 44/68

45 Καρκίνος του στοµάχου Μέθοδος Γ: ιάλυµα πεψίνης - Εµβάπτιση αντικειµενοφόρων σε διάλυµα πεψίνης στους 37 C Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για τέσσερεις ξεχωριστούς κύκλους (60 ml διάλυµα πεψίνης, µικρό δοχείο για έξι αντικειµενοφόρες) ή ένας µόνο κύκλος (240 ml διάλυµα πεψίνης, µεγάλο δοχείο για 24 αντικειµενοφόρες). Παρασκευάστε το διάλυµα πεψίνης όπως περιγράφεται στην ενότητα A.5. Τοποθετήστε καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Μετρήστε τη θερµοκρασία µέσα στο δοχείο µε βαθµονοµηµένο θερµόµετρο και βεβαιωθείτε ότι είναι η σωστή θερµοκρασία. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρεθεί η περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης. Βυθίστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες στο διάλυµα πεψίνης στους 37 (±2) C και επωάστε για λεπτά. Χρόνος επώασης λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να φύγει η περίσσεια πεψίνης και εµβαπτίστε τις τοµές σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε την αφυδάτωση. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. Βήµα 3: Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH Το Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH διαχωρίζεται σε δύο φάσεις ενώ φυλάσσεται στους -18 C. Πριν χρησιµοποιήσετε το Φιαλίδιο 3, βεβαιωθείτε ότι υπάρχει µόνο µία φάση εξισορροπώντας το µίγµα ιχνηθετών σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C ) και αναµιγνύοντας στη συνέχεια. Αποψύχτε το Φιαλίδιο 3 σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) για 30 λεπτά κατά µέγιστο (προστατεύοντας από δυνατό φως), και κατόπιν περιδινήστε ενδελεχώς το φιαλίδιο για 15 δευτερόλεπτα στις 2500 rpm χρησιµοποιώντας αναδευτήρα περιδίνησης. Αποθηκεύστε το Φιαλίδιο 3 στους -18 C αµέσως µετά τη χρήση. Απλώστε 10 µl του Μίγµατος ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH (Φιαλίδιο 3) στο κέντρο της τοµής ιστού. Τοποθετήστε αµέσως µια γυάλινη καλυπτρίδα 22 mm x 22 mm πάνω από το µίγµα ιχνηθετών και αφήστε το να εξαπλωθεί οµοιόµορφα κάτω από την καλυπτρίδα. Αποφύγετε το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα. Εάν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα, κτυπήστε απαλά µε χρήση λαβίδας για να τις αποµακρύνετε από τον ιστό. Θυµηθείτε να αποθηκεύσετε το Φιαλίδιο 3 στους -18 C αµέσως µετά τη χρήση. Στεγανοποιήστε την καλυπτρίδα µε το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων εξωθώντας το στεγανοποιητικό γύρω από την περιφέρεια της καλυπτρίδας. Αφήστε το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων να επικαλύψει την καλυπτρίδα και την αντικειµενοφόρο πλάκα, σχηµατίζοντας έτσι στεγανοποίηση γύρω από την καλυπτρίδα. Βεβαιωθείτε ότι το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων καλύπτει ολόκληρο το χείλος της καλυπτρίδας. Προετοιµάστε το Dako Hybridizer* (κωδικός S2450 ή S2451) για κύκλο υβριδισµού. Βεβαιωθείτε ότι τα Humidity Control Strips (Κωδικός S2452) έχουν κορεστεί και βελτιστοποιηθεί για χρήση. Ξεκινήστε το Hybridizer και επιλέξτε πρόγραµµα που θα εκτελέσει τα εξής: Μετουσίωση στους 66 C επί 10 λεπτά και στη συνέχεια υβριδισµός στους 45 C επί λεπτά. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες στο Hybridizer, βεβαιωθείτε ότι το καπάκι έχει κλείσει καλά και ξεκινήστε το πρόγραµµα. Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο οδηγιών του Dako Hybridizer για λεπτοµέρειες. * Για τη µετουσίωση και τον υβριδισµό, µπορεί να χρησιµοποιηθεί εξοπλισµός οργάνων που επιτρέπει τη δηµιουργία συνθηκών πανοµοιότυπων µε εκείνες που περιγράφηκαν παραπάνω: ( ) P04090GR_01_K / σελ. 45/68

46 Καρκίνος του στοµάχου Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες σε µια επίπεδη µεταλλική ή πέτρινη επιφάνεια (θερµαντική πλάκα ή πλάκα κλιβάνου υβριδισµού) που έχετε προθερµάνει στους 66 (±1) C. Μετουσιώστε για ακριβώς 10 λεπτά. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε προθερµασµένο υγροποιηµένο θάλαµο υβριδισµού. Καλύψτε το θάλαµο µε καπάκι και επωάστε στους 45 (±2) C για λεπτά. Παρακαλούµε σηµειώστε ότι θερµοκρασία υβριδισµού 37 C δεν είναι κατάλληλη για χρήση µε τους ιχνηθέτες που περιέχονται στο κιτ αυτό. Βήµα 4: Ισχυρή πλύση Γεµίστε δύο δοχεία χρώσης, π.χ. δοχεία Coplin, µε το αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2). Συνιστάται ελάχιστος όγκος 100 ml ή 15 ml ανά αντικειµενοφόρο πλάκα σε κάθε δοχείο. Τοποθετήστε ένα από τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης σε θερµοκρασία δωµατίου σε απαγωγό αναθυµιάσεων και το άλλο σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης στους 63 (±2) C. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Καλύψτε το δοχείο µε καπάκι προκειµένου να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφύγετε την εξάτµιση. Μετρήστε τη θερµοκρασία εντός του δοχείου υδατόλουτρου µε ένα βαθµονοµηµένο θερµόµετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερµοκρασίας. Το ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης περιέχει απορρυπαντικό και ενδέχεται να καταστεί θολερό στους 63 C. Αυτό δεν θα επηρεάσει την απόδοση. Με χρήση λαβίδας ή γαντιών, πάρτε τις αντικειµενοφόρες πλάκες από το θάλαµο υβριδισµού και αφαιρέστε απαλά το στεγανοποιητικό καλυπτρίδων καθώς και την καλυπτρίδα, και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες στο δοχείο πρόπλυσης, σε θερµοκρασία δωµατίου, µία κάθε φορά. Μόλις αφαιρεθούν όλες οι καλυπτρίδες, µεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες πλάκες από το δοχείο πρόπλυσης που βρίσκεται σε θερµοκρασία δωµατίου στο δοχείο που βρίσκεται µέσα σε υδατόλουτρο θερµοκρασίας 63 (±2) C. Αµέσως µετά τη µεταφορά των αντικειµενοφόρων στο αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης των 63 (±2) C στο υδατόλουτρο, πρέπει να ξεκινήσει το χρονόµετρο. Πραγµατοποιήστε ισχυρή πλύση επί 10 ακριβώς λεπτά. Αφαιρέστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες από το αραιωµένο ισχυρό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµποτίστε τις τοµές σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αλλάξτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης και εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν εντελώς. Βήµα 5: Επικάλυψη Εφαρµόστε 15 µl του µέσου επικάλυψης φθορισµού που περιέχει DAPI (Φιαλίδιο 5) στην περιοχή στόχο της αντικειµενοφόρου και εφαρµόστε µια γυάλινη καλυπτρίδα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι αντικειµενοφόρες πλάκες είναι δυνατό να αναγνωστούν µετά από 15 λεπτά ή εντός 7 ηµερών µετά την επικάλυψη. Ωστόσο, εάν οι αντικειµενοφόρες πλάκες εκτεθούν σε φως ή σε υψηλές θερµοκρασίες θα παρουσιαστεί εξασθένηση. Για την ελαχιστοποίηση της εξασθένησης, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο σκοτάδι στους C. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 46/68

47 Καρκίνος του στοµάχου Έλεγχος Ποιότητας - Στόµαχος 1. Τα σήµατα πρέπει να είναι έντονα, διακριτά και εύκολα στην αξιολόγηση. 2. Τα φυσιολογικά κύτταρα επιτρέπουν τον εσωτερικό έλεγχο της εκτέλεσης χρώσης. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν 1-2 σαφώς ορατά πράσινα σήµατα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης CEN-17 PNA έχει υβριδιώσει µε επιτυχία την κεντροµεριδιακή περιοχή του χρωµοσώµατος 17. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν επίσης 1-2 σαφώς ορατά ερυθρά σήµατα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης HER2 DNA έχει υβριδιώσει µε επιτυχία το αµπλικόνιο HER2. Λόγω της τοµής ιστού, µερικά φυσιολογικά κύτταρα θα εξακολουθούν να έχουν λιγότερα από τα αναµενόµενα 2 σήµατα κάθε χρώµατος. Εάν δεν ανιχνευτούν σήµατα σε φυσιολογικά κύτταρα, υποδηλώνεται αποτυχία του προσδιορισµού και τα αποτελέσµατα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 3. Κατά την αξιολόγηση µε χρήση φίλτρου DAPI, η πυρηνική µορφολογία πρέπει να είναι άθικτη. Πολυάριθµα ίχνη κυττάρων και µια γενική πενιχρή πυρηνική µορφολογία υποδηλώνουν υπερβολική πέψη του δείγµατος, µε αποτέλεσµα απώλεια ή κατατεµαχισµό των σηµάτων. Τέτοια δείγµατα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 4. Ο ελάχιστος αριθµός κυττάρων του όγκου που µπορούν να αξιολογηθούν είναι Τυχόν διαφορές στη µονιµοποίηση, την επεξεργασία και την έγκλειση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σηµαντική µεταβλητότητα στα αποτελέσµατα, καθιστώντας αναγκαία την τακτική αξιολόγηση των εσωτερικών µαρτύρων. Ερµηνεία της χρώσης - Στόµαχος Ιστός κατάλληλος για εκτίµηση Εντοπίστε τον όγκο εντός του πλαισίου της κεχρωσµένης µε HE αντικειµενοφόρου πλάκας και αξιολογήστε την ίδια περιοχή στην κεχρωσµένη µε FISH αντικειµενοφόρο πλάκα (στο φίλτρο DAPI). Μόνο δείγµατα από ασθενείς που πάσχουν από αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, πρέπει να αναλύονται. Σε περιπτώσεις εντερικής µεταπλασίας in situ και γαστρικού αδενοκαρκινώµατος στο ίδιο δείγµα, µόνον το συστατικό του καρκινώµατος πρέπει να βαθµολογείται. Αποφεύγετε περιοχές βαριάς φλεγµονής και περιοχές όπου τα πυρηνικά όρια είναι αµφίβολα. Μη συµπεριλαµβάνετε πυρήνες που απαιτούν υποκειµενική κρίση. Μην συµπεριλαµβάνετε πυρήνες µε ασθενή ένταση σήµατος και µη ειδικό ή υψηλό υπόβαθρο. Ξεκινήστε µε την εκτίµηση µικροσκοπικά της πλήρους κεχρωσµένης πλάκας FISH και της περοχής που έχει οριστεί στην τοµή ΗΕ, αντίστοιχα. Πριν την απαρίθµηση της κεχρωσµένης πλάκας FISH, σηµειώστε τη συνολική κατανοµή σηµάτων (οµοιογενής ή ετερογενής) στο φύλλο απαρίθµησης σηµάτων. Σε περίπτωση ετερογενούς κατανοµής, σηµειώστε αν υπάρχει εστιακή ενίσχυση ή µεµονωµένη κυτταρική ενίσχυση (µωσαϊκό). 1) Οµοιογενής κατανοµή σήµατος Σε περίπτωση που η κατανοµή του σήµατος είναι οµοιογενής, σηµειώστε τον αριθµό των κεντροµεριδίων χρωµοσώµατος (πράσινα σήµατα) και τον αριθµό των γονιδίων HER2 (ερυθρά σήµατα) αντίστιοχα, από 20 κύτταρα σε 1-2 αντιπροσωπευτικές περιοχές του όγκου. 2) Ετερογενής κατανοµή σήµατος Σε περίπτωση που η κατανοµή του σήµατος είναι ετερογενής, απαριθµήστε 20 κύτταρα συνολικά από επιλεγµένες περιοχές όπως προσδιορίζεται παρακάτω: Α) Αν υπάρχει εστιακή ενίσχυση, πρέπει να επιλεχθούν περιοχές µε ενισχυµένα κύτταρα. Β) Αν υπάρχει διανοµή µωσαϊκού ή ενισχυµένα, πολυσωµατικά ή δισωµατικά κύτταρα, µετρήστε τις περιοχές µε ενισχυµένα κύτταρα. Σε αυτές τις περιοχές, δεν πρέπει να µετρούνται µόνο τα ενισχυµένα κύτταρα, αλλά πρέπει να µετρούνται και όλα τα γειτονικά, µη ενισχυµένα κύτταρα για σύνολο 20 κυττάρων. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 47/68

48 Καρκίνος του στοµάχου Αν είναι δυνατόν, µην επιλέγετε περιοχές που καλύπτουν η µία την άλλη. Αγνοήστε τη χρώση του βακτηριακού DNA Ένας αριθµός εξειδικευµένων κυττάρων (ιστιοκύτταρα και µακροφάγα), που είναι διάχυτα στο γαστρικό ιστό, παρουσιάζουν υψηλό επίπεδο χρώσης από τον ιχνηθέτη HER2 εξαιτίας της παρουσίας του βακτηριακού DNA. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την παρουσία έντονα ερυθρών φθορίζοντων κυττάρων που διακρίνονται ξεκάθαρα από τα κύτταρα του όγκου µε υψηλή ενίσχυση γονιδίων HER2. Απαρίθµηση σήµατος Όταν µια περιοχή έχει επιλεγεί για εκτίµηση σήµατος, ξεκινήστε ανάλυση σε έναν από τους 20 γειτονικούς, επιλεγµένους πυρήνες και έπειτα µετρήστε κύτταρο προς κύτταρο, αγνοώντας µόνο τους πυρήνες που δεν πληρούν τα κριτήρια ποιότητας. Μετρήστε τον αριθµό των σηµάτων εντός του πυρηνικού ορίου κάθε εκτιµηµένου πυρήνα σύµφωνα µε τις ακόλουθες οδηγίες (βλ. επίσης Παράρτηµα 7). - Εστιάστε προς τα πάνω και προς τα κάτω ώστε να εντοπίσετε όλα τα σήµατα στο µεµονωµένο πυρήνα. - Καταµετρήστε δύο σήµατα που έχουν το ίδιο µέγεθος και διαχωρίζονται κατά απόσταση (ίση ή) µικρότερη από τη διάµετρο του σήµατος, ως µόνον ένα σήµα. Η απόσταση πρέπει να είναι τουλάχιστον ίση µε τη διάµετρο ενός σήµατος κανονικού µεγέθους ια να µετρηθούν δύο ξεχωριστά σήµατα. Όταν η απόσταση µεταξύ δύο σηµάτων είναι µικρότερη από τη διάµετρο ενός σήµατος, πρέπει να µετρηθεί ως ένα. - Σε πυρήνες µε υψηλά επίπεδα ενίσχυσης του γονιδίου HER2, τα σήµατα HER2 είναι δυνατό να βρίσκονται πολύ κοντά µεταξύ τους, σχηµατίζοντας µια συστάδα σηµάτων. Στις περιπτώσεις αυτές, ο αριθµός των σηµάτων HER2 δεν είναι δυνατό να καταµετρηθεί, αλλά πρέπει να υπολογιστεί κατά προσέγγιση. Πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στα πράσινα σήµατα, καθώς είναι δυνατό να καλυφθούν από συστάδες ερυθρών σηµάτων HER2 καθιστώντας αδύνατη την παρατήρησή τους. Σε περίπτωση αµφιβολίας, παρακαλούµε ελέγξτε τα πράσινα σήµατα µε χρήση ειδικού φίλτρου FITC. Μη βαθµολογείτε πυρήνες χωρίς σήµατα ή µε σήµατα ενός µόνο χρώµατος. Βαθµολογείτε µόνον εκείνους τους πυρήνες µε ένα ή περισσότερα σήµατα FISH κάθε χρώµατος. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 48/68

49 Καρκίνος του στοµάχου Οδηγός καταµέτρησης σηµάτων 1 Μην καταµετράτε. Οι πυρήνες επικαλύπτονται µεταξύ τους, δεν είναι ορατές όλες οι περιοχές των πυρήνων. 2 ύο πράσινα σήµατα, µη βαθµολογείτε τους πυρήνες µε σήµατα ενός µόνο χρώµατος. 3 Καταµετρήστε ως 3 πράσινα και 12 ερυθρά σήµατα (εκτίµηση συστάδων). 4 Καταµετρήστε ως 1 πράσινο και 1 ερυθρό σήµα. ύο σήµατα του ιδίου µεγέθους και διαχωρισµένα κατά απόσταση ίση ή µικρότερη από τη διάµετρο του ενός σήµατος καταµετρούνται ως ένα. 5 Μην καταµετράτε (πυρήνες που έχουν υποστεί ή υπερβολικά υψηλή ή υπερβολικά χαµηλή πέψη). Ελλείποντα σήµατα στο κέντρο των πυρήνων (εµφάνιση τύπου donut). 6 Καταµετρήστε ως 2 πράσινα και 3 ερυθρά σήµατα. ύο σήµατα του ιδίου µεγέθους και διαχωρισµένα κατά απόσταση ίση ή µικρότερη από τη διάµετρο του ενός σήµατος καταµετρούνται ως ένα. 7 Καταµετρήστε ως 1 πράσινο και 5 ερυθρά σήµατα. 8 Καταµετρήστε ως 3 πράσινα (1 πράσινο εκτός εστίασης) και 3 ερυθρά σήµατα. 9 Συστάδα ερυθρών σηµάτων που αποκρύπτουν πράσινα σήµατα. Ελέγξτε τα πράσινα σήµατα µε ειδικό φίλτρο FITC ή µην καταµετράτε. Καταγράψτε τις καταµετρήσεις σε έναν πίνακα όπως παρουσιάζεται στο παράρτηµα 5 και 6. Καταµετρήστε 20 πυρήνες ανά δείγµα ιστού, όταν είναι δυνατό από διακριτές περιοχές όγκων. Υπολογίστε την αναλογία HER2/CEN-17 διαιρώντας το συνολικό αριθµό ερυθρών σηµάτων HER2 δια του συνολικού αριθµού πράσινων σηµάτων CEN-17. είγµατα µε αναλογία HER2/CEN-17 µεγαλύτερη ή ίση µε 2 πρέπει να θεωρούνται ότι φέρουν ενισχυµένο γονίδιο HER2 (26). Αποτελέσµατα ίσα ή πλησίον της τιµής αποκλεισµού (1,8 2,2) πρέπει να ερµηνεύονται µε προσοχή. Εάν η αναλογία είναι οριακή (1,8 2,2), καταµετρήστε 40 πυρήνες επιπλέον και υπολογίστε την αναλογία για τους 40 πυρήνες. Αν η απαρίθµηση συνεχίσει να κινείται στα όρια, το αποτέλεσµα της δεύτερης απαρίθµησης θα θεωρείται έγκυρο. Αν είναι διαθέσιµη, πρέπει να συµπεριλαµβάνεται µια ανοσοιστοχηµική χρώση HER2 για καλύτερο προσανατολισµό κατά τη δεύτερη απαρίθµηση. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 49/68

50 Καρκίνος του στοµάχου Σε περίπτωση αµφιβολίας, η αντικειµενοφόρος πλάκα του δείγµατος πρέπει να επαναβαθµολογείται. Για οριακές περιπτώσεις, είναι απαραίτητη διαβούλευση µεταξύ του παθολογοανατόµου και του θεράποντος ιατρού. Περιορισµοί - Στόµαχος 1. Η µέθοδος FISH είναι µια διεργασία πολλαπλών βηµάτων, η οποία απαιτεί ειδικευµένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, καθώς και στην επιλογή, µονιµοποίηση και επεξεργασία ιστού, παρασκευή της αντικειµενοφόρου πλάκας FISH και ερµηνεία των αποτελεσµάτων της χρώσης. 2. Τα αποτελέσµατα της µεθόδου FISH εξαρτώνται από το χειρισµό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλµένη µονιµοποίηση, πλύση, στέγνωµα, θέρµανση, σχηµατισµός τοµών ή µόλυνση µε άλλους ιστούς ή υγρά ενδέχεται να επηρεάσει τον υβριδισµό των ιχνηθετών. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσµατα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των µεθόδων µονιµοποίησης και έγκλεισης ή σε εγγενείς ανωµαλίες εντός του ιστού. 3. Για βέλτιστα και αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα, οι αντικειµενοφόρες πλάκες µε τον ιστό πρέπει να αποπαραφινώνονται εντελώς. Η αφαίρεση της παραφίνης χρειάζεται να ολοκληρωθεί κατά την έναρξη της διαδικασίας χρώσης. ( είτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα B.2). 4. Πρέπει να χρησιµοποιείται µόνον υδατόλουτρο βαθµονοµηµένης θερµοκρασίας, θερµαντική πλάκα και φούρνος υβριδισµού. Η χρήση άλλων τύπων εξοπλισµού ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα την εξάτµιση του Μίγµατος ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH κατά τη διάρκεια του υβριδισµού και πρέπει να επικυρώνεται από το χρήστη. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 50/68

51 Καρκίνος του στοµάχου Χαρακτηριστικά απόδοσης - Στόµαχος Ιστορικό Η ασφάλεια και η αποτελεσµατικότητα της τραστουζουµάβης (Herceptin ) αποδείχθηκε σε κλινική µελέτη (τη δοκιµή ToGA) (25). Η µελέτη σχεδιάστηκε ως µελέτη ανοιχτής επισήµανσης, φάσης III, τυχαιοποιηµένη, πολυκεντρική, σε ασθενείς που ανιχνεύθηκαν µε θετικό HER2 µε µη εγχειρίσιµο, τοπικά προχωρηµένο, υποτροπιάζον ή/και µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Στη δοκιµή ToGA η θετικότητα σε HER2 ορίστηκε είτε ως θετική µε IHC (3+) (HercepTest, Dako) ή/και θετική µε HER2 FISH (HER2/CEN-17 2,0)(HER2 FISH pharmdx Kit, Dako (Κωδικός K5331)). Αφού συµπεριλήφθηκαν στη µελέτη, οι ασθενείς τυχαιοποιήθηκαν για να υποβληθούν σε χηµειοθεραπεία (5-FU ή καπεσιταβίνη και σισπλατίνη) ή χηµειοθεραπεία σε συνδυασµό µε τραστουζουµάβη. Το βασικό τελικό σηµείο στη µελέτη ήταν η συνολική βιωσιµότητα (OS). Στη µελέτη, τυχαιοποιήθηκε ένα σύνολο 594 ασθενών και 584 ασθενείς έλαβαν τη φαρµακευτική αγωγή της µελέτης και συµπεριλήφθηκαν στο πλήρες σύνολο αναλύσεων (FAS). Για το βασικό τελικό σηµείο, ο συνδυασµός χηµειοθεραπείας και τραστουζουµάβη απεδείχθη στατιστικά ανώτερος από τη χηµειοθεραπεία από µόνη της. Η µέση συνολική βιωσιµότητα OS αυξήθηκε από 11,1 σε 13,8 µήνες (p=0,0046) µε αναλογία κινδύνου 0,74 (95% CI: 0,60 0,91). Οι καµπύλες Kaplan-Meier για την OS φαίνονται στην Εικόνα 3. Πιθανότητα επιβίωσης 1,0 0,9 0,8 0,7 Τεστ λογαριθµικής κατάταξης P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Χρόνος (µήνες) ΑΡ. Αριστερά Φθορο/Σισπ Τρασ/Φθορο/Σισπ Οµάδα αγωγής Φθορο/Σισπ Τρασ/Φθορο/Σισπ Βήµα 3. Καµπύλη Kaplan-Meier για την OS (n=584). Προκαθορισµένες ερευνητικές αναλύσεις υποοµάδων ως προς την κατάσταση HER2 διενεργήθηκαν µόλις τα δεδοµένα έγιναν διαθέσιµα. Επίσης, δύο νέες υποοµάδες HER2 καθορίστηκαν post hoc µε βάση τη βαθµολογία IHC: Οµάδα 1 ("οµάδα χαµηλής έκφρασης HER2"): Οµάδα 2 ("οµάδα υψηλής έκφρασης IHC 0/FISH+ και IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ και IHC 3+ (FISH+ ή ( ) P04090GR_01_K / σελ. 51/68

52 Καρκίνος του στοµάχου HER2"): FISH- ή FISH κανένα αποτέλεσµα (n=446) Όταν έγινε επανάληψη post hoc της βασικής ανάλυσης της OS για την οµάδα υψηλής έκφρασης HER2 (n=446), το όφελος υπέρ της συνδυασµένης θεραπείας ήταν ακόµα µεγαλύτερο. Η µέση OS για την οµάδα των ασθενών που είχαν υποβληθεί σε χηµειοθεραπεία σε συνδυασµό µε την τραστουζουµάβη παρουσίασε αύξηση 16,0 µηνών σε σύγκριση µε τους 11,8 µήνες που ίσχυε για τους ασθενείς που υποβλήθηκαν µόνο σε χηµειοθεραπεία. Η αναλογία κινδύνου για αυτή την ανάλυση µειώθηκε στο 0,65 (95% CI: 0,51 0,83). Οι καµπύλες Kaplan-Meier για την OS για την "οµάδα υψηλής έκφρασης HER2" φαίνονται στην Εικόνα 4. Πιθανότητα επιβίωσης 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16.,0 Χρόνος (µήνες) ΑΡ. Αριστερά Φθορο/Σισπ Τρασ/Φθορο/Σισπ Οµάδα αγωγής Φθορο/Σισπ Τρασ/Φθορο/Σισπ Βήµα 4. Καµπύλη Kaplan-Meier για την OS για την "οµάδα υψηλής έκφρασης HER2" (n=446). Η µελέτη BO18255 απέδειξε την κλινική χρησιµότητα τόσο του HercepTest όσο και του HER2 FISH pharmdx Kit σε σχέση µε την αξιολόγηση της κατάστασης του HER2 σε ασθενείς µε µη εγχειρίσιµο, τοπικά προχωρηµένο, υποτροπιάζον ή/και µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Αναλυτική ευαισθησία Η αναλυτική ευαισθησία του Μίγµατος ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH µελετήθηκε χρησιµοποιώντας 18 δείγµατα αδενοκαρκινώµατος καρκίνου του στοµάχου. Η αναλογία µεταξύ του αριθµού των σηµάτων HER2 και των σηµάτων CEN-17 υπολογίστηκε µε βάση µια καταµέτρηση 20 πυρήνων από φυσιολογικά κύτταρα που περιέβαλαν τον όγκο. Η αναλογία HER2/CEN-17 για τα 18 δείγµατα αδενοκαρκινώµατος καρκίνου του στοµάχου ήταν µεταξύ 0,95 και 1,06. Αναλυτική ειδικότητα Οι ιχνηθέτες HER2 DNA στο µίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH έχουν υποβληθεί σε προσδιορισµό της αλληλουχίας του άκρου τους και χαρτογραφηθεί ώστε να επιβεβαιώνουν µια συνολική κάλυψη 218 kb, συµπεριλαµβανοµένου του γονιδίου HER2. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 52/68

53 Καρκίνος του στοµάχου Οι ιχνηθέτες CEN-17 PNA στο µίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 IQISH έχουν εξεταστεί µεµονωµένα και σε συνδυασµό για την επιβεβαίωση του ειδικού υβριδισµού τους στην κεντροµεριδιακή περιοχή του χρωµοσώµατος 17. Για να µετρηθεί η ικανότητα του προσδιορισµού να αναγνωρίζει µόνο τις ουσίες-στόχο HER2 και CEN-17 χωρίς παρεµβολές από άλλες ουσίες, διεξήχθησαν µελέτες σε δείγµατα αδενοκαρκινώµατος καρκίνου του στοµάχου µε χρήση του Φιαλιδίου 3 που περιείχε το ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού αλλά χωρίς το µίγµα ιχνηθετών. Αξιολογήθηκε ένα σύνολο 18 δειγµάτων αναφορικά µε την παρουσία σηµάτων που δεν σχετίζονταν µε το µίγµα ιχνηθετών. εν εντοπίστηκαν άλλα χρωµοσώµατα-στόχοι ούτε παρατηρήθηκε παρεµβολή µε στενά σχετιζόµενες ουσίες σε οποιοδήποτε εκ των 18 δειγµάτων. Μελέτες ισχύος Η ισχύς του προσδιορισµού HER2 IQFISH pharmdx εξετάστηκε µε µεταβολή του χρόνου προκατεργασίας, της θερµοκρασίας, καθώς των µεθόδων θέρµανσης του ρυθµιστικού διαλύµατος προκατεργασίας (φούρνος µικροκυµάτων ή υδατόλουτρο), του χρόνου και της µεθόδου επώασης της πεψίνης (πεψίνη RTU ή εµβάπτιση), του χρόνου και της θερµοκρασίας µετουσίωσης, του χρόνου υβριδισµού, καθώς και του χρόνου και της θερµοκρασίας ισχυρής πλύσης. εν παρατηρήθηκε καµία σηµαντική διαφορά σε αποτελέσµατα στις ακόλουθες πειραµατικές συνθήκες: Προκατεργασία, Μέθοδος A). Υδατόλουτρο επί 10 λεπτά σε συνδυασµό µε καθεµία από τις θερµοκρασίες 95 C, C, και 99 C και συγχρόνως 9, 10 και 11 λεπτά στους C Προκατεργασία, Μέθοδος B). Φούρνος µικροκυµάτων για 9, 10, και 11 λεπτά στους >95 C. Χώνευση πεψίνης, Μέθοδος A), µε χρόνους επώασης 5, 10, και 15 λεπτών σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Χώνευση πεψίνης, Μέθοδος Β), µε χρόνους επώασης 3, 4, και 5 λεπτών στους 37 C. Χώνευση πεψίνης, Μέθοδος Γ), µε χρόνους επώασης 20, 25, και 30 λεπτών σε συνδυασµό µε καθεµία από τις θερµοκρασίες των 35, 37, και 39 C. Μετουσίωση επί 10 λεπτά σε συνδυασµό µε καθεµία από τις θερµοκρασίες των 65, 66, και 67 C και συγχρόνως 9, 10, και 11 λεπτά στους 66 C. Χρόνοι υβριδισµού των 60, 90, και 120 λεπτών στους 45 C. Ισχυρή πλύση επί 10 λεπτά σε συνδυασµό µε καθεµία από τις θερµοκρασίες των 61, 63, και 65 C και συγχρόνως 9, 10, και 11 λεπτά στους 63 C. Σηµείωση: Για όλες τις δοκιµές ισχύος µόνο µία παράµετρος της διαδικασίας χρώσης άλλαζε κάθε φορά, ενώ όλες οι άλλες παράµετροι παρέµεναν σταθερές. Συνίσταται να τηρείτε τους χρόνους και τις θερµοκρασίες που υποδεικνύονται για τη διαδικασία χρώσης. Η διαδικασία χρώσης για το HER2 IQFISH pharmdx προσφέρει µεταβλητές πρωτοκόλλου για θερµική προκατεργασία, χώνευση πεψίνης και χρόνο υβριδισµού. Κάθε µοναδική επιλογή συνδυασµού επικυρώθηκε αναφορικά µε την κατάσταση του γονιδίου HER2. Η επικύρωση διεξήχθη σε 10 δείγµατα FFPE αδενοκαρκινώµατος ανθρώπινου στοµάχου και γαστροοισοφαγικής συµβολής για καθεµία από τις 12 πιθανές επιλογές συνδυασµών. Το HER2 FISH pharmdx Kit (K5331) χρησιµοποιήθηκε ως αναφορά. Η αναλογία HER2/CEN-17 για κάθε µεµονωµένο δείγµα παρουσιάζεται στην Εικόνα 5. Οι διασταυρώσεις µεταβλητών µεταξύ των 12 δοκιµών και της χρώσης αναφοράς έδειξαν συνολική συµφωνία 100% (10/10) για την κατάσταση του γονιδίου HER2 µε το ( ) P04090GR_01_K / σελ. 53/68

54 Καρκίνος του στοµάχου χαµηλότερο και ανώτερο όριο εµπιστοσύνης 95% του αµφίπλευρου ελέγχου στα 78,3% και 100%, αντίστοιχα. Η τιµή κ ήταν 1,00 και η δοκιµή McNemars έδειξε απουσία µεροληψία; (αµφίπλευρη τιµή p 1,00). Εικόνα 5. Μεµονωµένες αναλογίες HER2/CEN-17 για 10 δείγµατα αδενοκαρκινώµατος ανθρώπινου στοµάχου κεχρωσµένα µε χρήση των 12 πιθανών παραλλαγών συνδυαστικών πρωτοκόλλων µε το HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731) ( οκιµή 1-12) και το κιτ αναφοράς (R) HER2 FISH pharmdx Kit (Κωδικός K5331). Η οριζόντια γραµµή απεικονίζει την τιµή αποκλεισµού 2,0. Επαναληψιµότητα Η επαναληψιµότητα της αναλογίας HER2/CEN-17 διερευνήθηκε µε τον προσδιορισµό HER2 IQFISH pharmdx µε χρήση διαδοχικών τοµών από εννέα διαφορετικά δείγµατα αδενοκαρκινώµατος στοµάχου µε κατάσταση γονιδίου HER2 είτε ενισχυµένη είτε µη ενισχυµένη. Οι τοµές κάθε δείγµατος εξετάστηκαν εις τριπλούν στον ίδιο κύκλο. Ο µέσος συντελεστής διακύµανσης ήταν 3,5% για µη ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 1% έως 5%) και 2,8% για ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 1% έως 5%). Η επαναληψιµότητα στις διαδοχικές τοµές των δειγµάτων αδενοκαρκινώµατος στοµάχου µε διαφορετικό πάχος (2, 3, 4, 5, 6, και 7 µm) εξετάστηκε µε το κιτ HER2 IQFISH pharmdx. Ο µέσος συντελεστής διακύµανσης της αναλογίας HER2/CEN-17 ήταν 4,5% (εύρος από 3% έως 6%), δηλ. στο ίδιο εύρος µε εκείνο ιστού ίσου πάχους και εντός των προκαθορισµένων κριτηρίων αποδοχής. Αναπαραγωγιµότητα Ο προσδιορισµός HER2 IQFISH pharmdx εξετάστηκε αναφορικά µε την αναπαραγωγιµότητα µεταξύ παρτίδων και παρατηρητών µε χρήση τριών παρτίδων HER2 IQFISH pharmdx και τριών παρατηρητών. Η αναπαραγωγιµότητα εξατάστηκε σε εννέα διαφορετικά δείγµατα αδενοκαρκινώµατος του στοµάχου µε κατάσταση γονιδίου HER2 είτε ενισχυµένη είτε µη ενισχυµένη. Ο µέσος συντελεστής διακύµανσης για την αναπαραγωγιµότητα µεταξύ παρτίδων ήταν 3,8% για µη ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 2% έως 7%) και 1,8% για ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 1% έως 3%). ( ) P04090GR_01_K / σελ. 54/68

55 Καρκίνος του στοµάχου Ο µέσος συντελεστής διακύµανσης για την αναπαραγωγιµότητα µεταξύ παρατηρητών ήταν 4,3% για µη ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 3% έως 5%) και 4,4% για ενισχυµένα δείγµατα (εύρος από 2% έως 7%). Τα δείγµατα αδενοκαρκινώµατος του στοµάχου ήταν κατά 78,8% δείγµατα εκτοµής και κατά 22,2% δείγµατα βιοψίας. 55,6% των δειγµάτων ελήφθησαν από το στόµαχο και 44,4% προήλθαν από τη γαστροοισοφαγική συµβολή. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 55/68

56 Καρκίνος του στοµάχου Κλινική χρησιµότητα Η κλινική χρησιµότητα του Dako HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731) διερευνήθηκε σε µια συγκριτική µελέτη µε το Dako HER2 FISH pharmdx Kit (Κωδικός K5331). Η µελέτη συµπεριέλαβε 79 δείγµατα καρκίνου του στοµάχου µεταξύ των οποίων διαφορετικοί τύποι ιστών αδενοκαρκινώµατος του στοµάχου, δηλ. αδενοκαρκινώµατα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής, και εκτοµές ή βιοψίες µε οµοιογενή ή ετερογενή (εστιακή ή µωσαϊκό) κατανοµή σηµάτων. Όλοι οι όγκοι είχαν αξιολογηθεί για την κατάσταση της έκφρασης της πρωτεΐνης HER2 µε χρήση του Dako HercepTest (Κωδικός K5207). Η µελέτη συµπεριέλαβε δείγµατα για καθεµία από τις τέσσερεις οµάδες βαθµολόγησης IHC (0, 1+, 2+, 3+). Η διασταύρωση µεταβλητών της κατάστασης του HER2 που έγινε από τους δυο προσδιορισµούς κατέληξε σε γενική συµφωνία 98,7% µε χαµηλότερο και ανώτερο όριο για το διάστηµα εµπιστοσύνης 95% στα 94,2% και 99,9%. Η τιµή κ ήταν 0,97 µε χαµηλότερο και ανώτερο όριο για το διάστηµα εµπιστοσύνης 95% στα 0,92 και 1,00. Η τιµή p για τη δοκιµή McNemars ήταν 1,00 υποδεικνύοντας απουσία µεροληψίας µεταξύ των δύο προσδιορισµών. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 56/68

57 Καρκίνος του στοµάχου Αντιµετώπιση προβληµάτων - Στόµαχος Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. εν παρουσιάζονται σήµατα ή είναι ασθενή 1α. Το κιτ έχει εκτεθεί σε υψηλές θερµοκρασίες κατά τη διάρκεια της µεταφοράς ή της φύλαξης 1β. Το µικροσκόπιο δεν λειτουργεί σωστά - Ακατάλληλο σετ φίλτρου - Εσφαλµένος λαµπτήρας - Ο λαµπτήρας υδραργύρου είναι πάρα πολύ παλιός - Ακάθαρτοι ή/και ραγισµένοι φακοί συλλέκτες - Ακατάλληλο έλαιο κατάδυσης 1α. Ελέγξτε τις συνθήκες φύλαξης. Βεβαιωθείτε ότι υπήρχε ξηρός πάγος κατά την παραλαβή της αποστολής. Βεβαιωθείτε ότι το φιαλίδιο 3 αποθηκεύτηκε στους -18 C στο σκοτάδι. Βεβαιωθείτε ότι τα φιαλίδια 2A και 5 αποθηκεύτηκαν στους 2 8 C κατά µέγιστο στο σκοτάδι. 1β. Ελέγξτε το µικροσκόπιο και βεβαιωθείτε ότι τα χρησιµοποιηµένα φίλτρα είναι κατάλληλα για χρήση µε τα φθορισµοχρώµατα του κιτ και ότι ο λαµπτήρας υδραργύρου είναι σωστός και δεν έχει χρησιµοποιηθεί πέρα από την αναµενόµενη διάρκεια ζωής του. ( είτε το παράρτηµα 7). Σε περίπτωση αµφιβολίας, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε τον τοπικό προµηθευτή του µικροσκοπίου σας. 1γ. Εξασθενηµένα σήµατα 1γ. Αποφύγετε τη µικροσκοπική εξέταση µακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρές πηγές φωτός. 1δ. Εσφαλµένες συνθήκες προκατεργασίας 1δ. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόµενη θερµοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόµενο χρόνο 2. Απουσία πράσινων σηµάτων 3. εν υπάρχουν ερυθρά σήµατα 1ε. Εξάτµιση του µίγµατος ιχνηθετών κατά τη διάρκεια του υβριδισµού 2α. Εσφαλµένες συνθήκες ισχυρής πλύσης 3α. Εσφαλµένες συνθήκες προκατεργασίας 1ε. ιασφαλίστε επαρκή υγρασία στο θάλαµο υβριδισµού 2α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιούνται οι συνιστώµενες τιµές θερµοκρασίας και χρόνου ισχυρής πλύσης και ότι οι καλυπτρίδες αφαιρούνται πριν από την εκτέλεση της ισχυρής πλύσης 3α. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόµενη θερµοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόµενο χρόνο ( ) P04090GR_01_K / σελ. 57/68

58 Καρκίνος του στοµάχου Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 4. Περιοχές χωρίς σήµα 4α. Ο όγκος του ιχνηθέτη είναι πάρα πολύ µικρός 4α. Βεβαιωθείτε ότι ο όγκος του ιχνηθέτη είναι αρκετά µεγάλος για την κάλυψη της περιοχής κάτω από την καλυπτρίδα 5. Υπερβολική χρώση υποβάθρου 6. Πενιχρή µορφολογία ιστού 4β. Έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα κατά τη διάρκεια της εφαρµογής ή της επικάλυψης του µίγµατος ιχνηθετών 5α. Ακατάλληλη µονιµοποίηση ιστού 5β. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς 5γ. Η θερµοκρασία ισχυρής πλύσης είναι πάρα πολύ χαµηλή 5δ. Παρατεταµένη έκθεση της υβριδιωµένης τοµής σε ισχυρό φως 6α. Εσφαλµένη επεξεργασία µε πεψίνη 6β. Εσφαλµένες συνθήκες προκατεργασίας ενδέχεται να έχουν ως αποτέλεσµα ασαφή ή νεφελώδη εµφάνιση 6γ. Πάρα πολύ µακρά επεξεργασία µε Πεψίνη ή πάρα πολύ λεπτό πάχος τοµής ενδέχεται να προκαλέσει την εµφάνιση ιχνών κυττάρων ή κυττάρων σχήµατος κουλούρας. 4β. Αποφύγετε το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα. Εάν παρατηρηθούν, κτυπήστε ελαφρά µε χρήση λαβίδας για να τις αφαιρέσετε 5α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιούνται µόνον τοµές ιστών µονιµοποιηµένες µε φορµαλίνη και εγκλεισµένες σε παραφίνη 5β. Ακολουθήστε τις διαδικασίες αποπαραφίνωσης και επανενυδάτωσης που περιγράφονται στην ενότητα B.2 5γ. Βεβαιωθείτε ότι θερµοκρασία ισχυρής πλύσης είναι 63 (±2) C 5δ. Αποφύγετε τη µικροσκοπική εξέταση µακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρό φως 6α. Τηρείτε τους συνιστώµενους χρόνους επώασης της Πεψίνης. είτε την ενότητα B.3, βήµα 2. Βεβαιωθείτε ότι η πεψίνη υποβάλλεται σε χειρισµό στη σωστή θερµοκρασία. είτε την ενότητα B.1 6β. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόµενη θερµοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόµενο χρόνο 6γ. Μειώστε το χρόνο επώασης της πεψίνης. είτε την ενότητα B.3, βήµα 2. Βεβαιωθείτε ότι το πάχος της τοµής είναι 3 6 µm. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 58/68

59 Καρκίνος του στοµάχου Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 7. Υψηλό επίπεδο πράσινου αυτοφθορισµού στην αντικειµενοφόρο συµπεριλαµβανοµέ νων περιοχών χωρίς ιστό FFPE 7. Χρήση ληγµένων ή µη συνιστώµενων γυάλινων αντικειµενοφόρων 7. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχει παρέλθει η ηµεροµηνία λήξης για την επιστρωµένη γυάλινη αντικειµενοφόρο (Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003, ή αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-lλυσίνη). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το πρόβληµα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες ή εάν η προτεινόµενη διορθωτική ενέργεια δεν επιτυγχάνει την επίλυση του προβλήµατος, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako για περαιτέρω βοήθεια. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 59/68

60 Παράρτηµα 4 - Στόµαχος HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός K5731 Λίστα ελέγχου του πρωτοκόλλου Ηµεροµηνία της εκτέλεσης: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Παρτίδα: Κωδ. αριθµός δείγµατος: Κωδ. αριθµός εξοπλισµού: Καρκίνος του στοµάχου Κωδ. αριθµός ηµερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Ηµεροµηνία αραίωσης/λήξης του 1 x Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωµένο 1:20): / Ιστός µονιµοποιηµένος µε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης Ναι Όχι Βήµα 1: Προκατεργασία Ηµεροµηνία αραίωσης/λήξης του διαλύµατος προκατεργασίας (Φιαλίδιο 1 αραιωµένο 1:20) Μετρηµένη θερµοκρασία του διαλύµατος προκατεργασίας (95 99 C) αν χρησιµοποιείται υδατόλουτρο για θέρµανση Προκατεργασία (10 λεπτά) και ψύξη (15 λεπτά) Πλύση σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωµένο 1:20) (2 x 3 λεπτά) Βήµα 2: Πεψίνη ιάρκεια της επεξεργασίας µε Πεψίνη (Φιαλίδιο 2) στους 37 ºC ή ιάρκεια της επεξεργασίας µε πεψίνη (Φιαλίδιο 2) σε θερµοκρασία δωµατίου ή ιάρκεια της εµβάπτισης σε πεψίνη στους 37 (±2) C Πλύση σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωµένο 1:20) (2 x 3 λεπτά) Αφυδάτωση αντικειµενοφόρων πλακών (3 x 2 λεπτά) σε διαβαθµισµένη σειρά αιθανόλης και στέγνωµα µε αέρα Βήµα 3: Μίγµα ιχνηθετών HER2/CEN-17 Εφαρµογή του µίγµατος ιχνηθετών (Φιαλίδιο 3), κάλυψη µε καλυπτρίδα και στεγανοποίηση µε στεγανοποιητικό καλυπτρίδων / C Λεπτά Λεπτά Λεπτά Μετρηµένη θερµοκρασία µετουσίωσης (66 (±1) C) C Μετουσίωση επί 10 λεπτά Μετρηµένη θερµοκρασία υβριδισµού (45 (±2) C) C Χρόνος υβριδισµού (60 έως 120 λεπτά) Λεπτά Βήµα 4: Ισχυρή πλύση Ηµεροµηνία αραίωσης/λήξης του ισχυρού ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης (Φιαλίδιο 4 αραιωµένο 1:20) Μετρηµένη θερµοκρασία του ισχυρού ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης (63 (±2) C) Ισχυρή πλύση (10 λεπτά) µετά την αφαίρεση των καλυπτρίδων Πλύση σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (Φιαλίδιο 6 αραιωµένο 1:20) (2 x 3 λεπτά) Αφυδάτωση αντικειµενοφόρων πλακών (3 x 2 λεπτά) σε διαβαθµισµένη σειρά αιθανόλης και στέγνωµα µε αέρα Βήµα 5: Επικάλυψη Εφαρµογή 15 µl του µέσου επικάλυψης φθορισµού (Φιαλίδιο 5) και κάλυψη µε καλυπτρίδα Σχόλια: / C C Λεπτά ( ) P04090GR_01_K / σελ. 60/68

61 Καρκίνος του στοµάχου Ηµεροµηνία και υπογραφή, Τεχνικός: ( ) P04090GR_01_K / σελ. 61/68

62 Καρκίνος του στοµάχου Παράρτηµα 5 - Στόµαχος HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός K5731 Σχήµα βαθµολόγησης HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Παρτίδα: Κωδ. αριθµός ηµερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Ηµεροµηνία της εκτέλεσης: Κωδ. αριθµός δείγµατος: Χαρακτηρισµός κατανοµής σήµατος στον ιστό: Οµοιογενής: Ετερογενής Με εστίαση: ή Ετερογενής Μωσαϊκό: Καταµέτρηση σηµάτων σε 20 πυρήνες Κόκκινο Πράσινο Κόκκινο Αρ. πυρήνων Αρ. πυρήνων (HER2) (CEN-17) (HER2) Σύνολο 1-10 Σύνολο Πράσινο (CEN-17) Για τον προσδιορισµό της αναλογίας HER2/CEN-17, καταµετρήστε τον αριθµό σηµάτων HER2 και τον αριθµό σηµάτων CEN-17 στους ίδιους 20 πυρήνες και διαιρέστε το συνολικό αριθµό των σηµάτων HER2 δια του συνολικού αριθµού των σηµάτων CEN-17. Εάν η αναλογία HER2/CEN-17 είναι οριακή (1,8 2,2), καταµετρήστε 40 πυρήνες επιπλέον και επανυπολογίστε την αναλογία (ανατρέξτε στο σχήµα επαναµέτρησης βαθµολόγησης). Αναλογία ίση ή πλησίον στην τιµή αποκλεισµού (1,8 2,2) πρέπει να ερµηνεύεται µε προσοχή (δείτε τον οδηγό καταµέτρησης). ( ) P04090GR_01_K / σελ. 62/68

63 Καρκίνος του στοµάχου HER2 FISH HER2 CEN-17 Αναλογία HER2/CEN-17 ΣΥΝΟΛΟ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑΣ (1-20) Αναλογία < 2: εν παρατηρήθηκε ενίσχυση γονιδίου HER2 Αναλογία 2: Παρατηρήθηκε ενίσχυση γονιδίου HER2 Ηµεροµηνία και υπογραφή, Τεχνικός: Ηµεροµηνία και υπογραφή, Παθολογοανατόµος: Για κατευθυντήριες οδηγίες βαθµολόγησης: δείτε την ενότητα Ερµηνεία της χρώσης. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 63/68

64 Καρκίνος του στοµάχου Παράρτηµα 6 - Στόµαχος HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός K5731 Αναµέτρηση σχήµατος βαθµολόγησης HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Παρτίδα: Κωδ. αριθµός ηµερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Ηµεροµηνία της εκτέλεσης: Κωδ. αριθµός δείγµατος: Σήµατα σε 40 επιπρόσθετους πυρήνες (1-40) Αρ. Κόκκινο Πράσινο Αρ. Κόκκινο Πράσινο Αρ. Κόκκινο Πράσινο Αρ. πυρήνων HER2 CEN-17 πυρήνων HER2 CEN-17 πυρήνων HER2 CEN-17 πυρήνων Σύνολο Σύνολο Σύνολο Σύνολο Κόκκινο HER2 Πράσινο CEN-17 Για τον προσδιορισµό της αναλογίας HER2/CEN-17, καταµετρήστε τον αριθµό σηµάτων HER2 και τον αριθµό σηµάτων CEN-17 στους ίδιους 40 πυρήνες και διαιρέστε το συνολικό αριθµό των σηµάτων HER2 δια του συνολικού αριθµού των σηµάτων CEN-17. Βλ. Συνολική Βαθµολόγηση από τους 1-40 πυρήνες στον ακόλουθο πίνακα. HER2 FISH HER2 CEN-17 Αναλογία HER2/CEN-17 ΣΥΝΟΛΟ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑΣ (1-40) Αναλογία < 2: εν παρατηρήθηκε ενίσχυση γονιδίου HER2 Αναλογία 2: Παρατηρήθηκε ενίσχυση γονιδίου HER2 Ηµεροµηνία και υπογραφή, Τεχνικός: Ηµεροµηνία και υπογραφή, Παθολογοανατόµος: Για κατευθυντήριες οδηγίες βαθµολόγησης: δείτε την ενότητα Ερµηνεία της χρώσης. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 64/68

65 Καρκίνος του στοµάχου Παράρτηµα 7 - Στόµαχος HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός K5731 Προδιαγραφές µικροσκοπίου φθορισµού Η Dako συνιστά τον ακόλουθο εξοπλισµό για χρήση µε το κιτ HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Τύπος µικροσκοπίου Μικροσκόπιο επιφθορισµού. 2. Λαµπτήρας Λαµπτήρας υδραργύρου 100 W (διατηρείτε αρχείο του χρόνου λειτουργίας του λαµπτήρα). 3. Αντικειµενικοί φακοί Για διερεύνηση του ιστού, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν ξηροί αντικειµενικοί φακοί φθορισµού 10X ή ελαιοκαταδυτικοί φακοί φθορισµού 16X. Για µεγέθυνση υψηλής ισχύος και βαθµολόγηση των σηµάτων, συνιστώνται µόνον ελαιοκαταδυτικοί αντικειµενικοί φακοί φθορισµού, π.χ. 100X. 4. Φίλτρα Τα φίλτρα έχουν σχεδιαστεί ατοµικά για ειδικά φθορισµοχρώµατα και πρέπει να επιλέγονται αναλόγως. Η Dako συνιστά τη χρήση ειδικού φίλτρου DAPI σε συνδυασµό µε διπλό φίλτρο Texas Red/FITC υψηλής ποιότητας. Φίλτρο DAPI, π.χ. φίλτρο Chroma αρ ιπλό φίλτρο Texas Red/FITC, π.χ. φίλτρο Chroma αρ Για επιβεβαίωση είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν µονά φίλτρα Texas Red και FITC. Φθορισµόχρωµα Μήκος κύµατος διέγερσης Μήκος κύµατος εκποµπής FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Τα φίλτρα είναι ειδικά για κάθε τύπο µικροσκοπίου και η χρήση κατάλληλων φίλτρων είναι κρίσιµης σηµασίας για την ερµηνεία. Εάν θέλετε λεπτοµερείς πληροφορίες, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε τον προµηθευτή του µικροσκοπίου σας ή µε τον αντιπρόσωπο της Dako. 5. Έλαιο Μη φθορίζον έλαιο. Προφυλάξεις εν συνιστάται χρήση λαµπτήρα υδραργύρου 50 W. εν είναι δυνατή η χρήση φίλτρων ροδαµίνης. ε συνιστώνται τριπλά φίλτρα. Ένα µη βελτιστοποιηµένο µικροσκόπιο είναι δυνατό να προκαλέσει προβλήµατα κατά την ανάγνωση των σηµάτων φθορισµού. Είναι σηµαντικό να µην έχει λήξει η φωτεινή πηγή και να έχει ευθυγραµµιστεί και εστιαστεί σωστά. Οι πελάτες πρέπει να παρακολουθούν και να ακολουθούν τις συστάσεις του κατασκευαστή για το λαµπτήρα υδραργύρου. Το µικροσκόπιο πρέπει να συντηρείται και ο λαµπτήρας υδραργύρου πρέπει να είναι σε ευθυγράµµιση πριν από την ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Πρέπει να καταβάλλεται προσπάθεια έκθεσης του δείγµατος σε όσο το δυνατόν λιγότερο φως διέγερσης προκειµένου να ελαχιστοποιηθεί η εξασθένηση του φθορισµού. Συνιστούµε τη συζήτηση της εγκατάστασης του συγκεκριµένου µικροσκοπίου σας µε τον κατασκευαστή πριν από την έναρξη του in situ υβριδισµού µε φθορισµό ή να ανατρέξετε στη βιβλιογραφία. ( ) P04090GR_01_K / σελ. 65/68

66 Παραποµπές 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76(1-2): Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230(4730): King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229(4717): Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(4): Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89(12): Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30(1): Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785): Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61(3): Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990;50(14): Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32(1): Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16(2): Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA: NCCLS Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER- 2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92(12): Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53(12): Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78(1): Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59(6): Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32(1): ( ) P04090GR_01_K / σελ. 66/68

67 23. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27(3): Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16(2): Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008;52(7): ( ) P04090GR_01_K / σελ. 67/68

68 Επεξήγηση συµβόλων Αριθµός καταλόγου/ κωδικός αριθµός Περιορισµοί θερµοκρασίας Αριθµός παρτίδας In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Συµβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης ιατηρείτε µακριά από τον ήλιο (συµβουλευτείτε το τµήµα "Αποθήκευση") Περιεχόµενο επαρκές για "ν" εξετάσεις Ηµεροµηνία λήξης Κατασκευαστής Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Κατασκευάζεται από την: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Τηλ Φαξ ( ) P04090GR_01_K / σελ. 68/68