ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 10

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 10 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΩΣΕΩΝ ΑΡΩΜΑΤΟΣ ΓΙΑΟΥΡΤΙΩΝ ΚΑΙ ΟΙΝΩΝ ΜΕ ΜΕΚΡΟΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ ΚΑΙ ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Ενώσεις Αρώματος Τροφίμων Ιωάννης Ρούσσης Ιωάννινα, Οργανοληπτική δοκιμασία τροφίμων είναι η αποτίμηση της ποιότητά στους με τα αισθητήρια όργανα του ανθρώπου. Χρησιμοποιούνται η όραση, η όσφρηση, και η γεύση και η αφή. Με την όραση αποτιμάται το χρώμα, η διαύγεια και η λαμπρότητα, όπως επίσης η ρευστότητα και το ιξώδες. Με την όσφρηση αποτιμάται η οσμή και το άρωμα των τροφίμων. Υπάρχει η άμεση όσφρηση (χρήση ρινικής κοιλότητας), όπως και η όσφρηση μέσω της στοματο-ρινικής κοιλότητας. Το δεύτερο είναι το γευστικό άρωμα (ή άρωμα του στόματος), δηλαδή μέρος της γεύσης είναι ουσιαστικά όσφρηση. Με την γεύση αποτιμώνται τα γευστικά χαρακτηριστικά, όπως η γλυκύτητα, η οξύτητα, η πικρότητα, το αλμυρό. Οι στοματικές εντυπώσεις αφορούν τις γεύσεις και τις εφαπτικές εντυπώσεις. Οι εφαπτικές εντυπώσεις αφορούν τη δομή, τη ρευστότητα και το ιξώδες και αποτιμώνται από όλο το στόμα. Το σύνολο των εντυπώσεων που λαμβάνονται με τη ρινική και τη στοματική κοιλότητα καλείται flavour. Συνήθως, θεωρείται το σύνολο της γεύσης και αρώματος (γευσάρωμα). Το flavour είναι αποτέλεσμα της ισορροπίας και συγκέντρωσης πολλών ενώσεων. Το περίπου 70 % της αίσθησης του flavour οφείλεται σε πτητικές ενώσεις. Πολλές πτητικές ενώσεις είναι οσμηρές ενώσεις. Χαρακτηριστικά των πτητικών ενώσεων flavour είναι: έχουν ΜΒ < 400 Da, βρίσκονται σε συγκεντρώσεις από < 1 ppb μέχρι 1000 ppm, έχουν κατώφλι οσμής από < 0,001 ppb μέχρι > 1000 ppb. Παράδειγμα, η πυραζίνη έχει 0,002 μg/l, η φουρανεόλη 0,16 μg/l, το διμεθυλοσουλφίδιο 0,33 μg/l, το διακετύλιο 7 μg/l. Διάφορες ενώσεις έχουν γεύση, όπως αμινοξέα, πεπτίδια, οργανικά οξέα, ζάχαρα, φαινολικές ενώσεις και άλλες. Η παράμετρος Δείκτης Αρώματος θεωρείται σημαντική, και ορίζεται ως ο λόγος της συγκέντρωσης της ένωσης προς το όριο ανίχνευσής της. Το όριο ανίχνευσης είναι η ελάχιστη συγκέντρωση της ένωσης σε υδατικό διάλυμα που μπορεί να γίνει αντιληπτή με την όσφρηση. Ανάλογα μπορεί να εφαρμόζονται και για τις ενώσεις γεύσης. Με τη χρήση του Δείκτη Αρώματος μπορεί να αποτιμάται η συνεισφορά κάθε ένωσης στο άρωμα. Επίσης, με τη χρήση του Δείκτη Αρώματος αναδεικνύονται οι ενώσεις 1

2 που προσδίνουν το ιδιαίτερο άρωμα σε διάφορα τρόφιμα. Στην αγγλική γλώσσα για τέτοιες ενώσεις χρησιμοποιείται ο όρος Character Impact Compounds (CIC). Flavour προϊόντων ζύμωσης γάλακτος Το γιαούρτι είναι προϊόν ζύμωσης του γάλακτος με χρήση της συμβιωτικής καλλιέργειας Streptococcus thermophilus και Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus σε αναλογία 1:1. Με ζύμωση της λακτόζης παράγεται γαλακτικό οξύ, μειώνεται το ph, συμβαίνει πήξη των πρωτεϊνών και δημιουργείται η χαρακτηριστική δομή. Το γιαούρτι είναι λευκό, χωρίς συστατικά που δεν προέρχονται από το γάλα. Επίσης, περιέχει υψηλούς πληθυσμούς γαλακτικών βακτηρίων που είναι ζωντανά κατά το χρόνο διατήρησής του. Η περιεκτικότητα του γιαουρτιού σε λίπος και ΣΥΑΛ (στερεό υπόλειμμα άνευ λίπους) είναι κατά περίπου 10 % μεγαλύτερη από την περιεκτικότητα του γάλακτος από το οποίο προέρχεται. Η οξύτητα του γιαουρτιού είναι μεγαλύτερη από 0,6 % σε γαλακτικό οξύ. Για την παρασκευή του γιαουρτιού το γάλα υφίσταται θερμική κατεργασία στους o C για 30-5 min. Η θερμική κατεργασία έχει ως σκοπούς την καταστροφή των βλαστικών κυττάρων των παθογόνων μικροοργανισμών, όπως και την συμπύκνωση του γάλακτος με εξάτμιση νερού για λήψη πιο συμπαγούς γιαουρτιού. Επίσης, με μετουσίωση πρωτεϊνών του ορού ευνοούνται αλληλεπιδράσεις καζεϊνών-πρωτεϊνών ορού. Έτσι, σχηματίζεται δίκτυο πρωτεϊνών, και με τη μείωση του ph στο ισοηλεκτρικό σημείο των καζεϊνών λαμβάνει χώρα η πήξη. Εάν εφαρμοστεί απευθείας θέρμανση μπορεί το γάλα να αποκτήσει άσχημη οσμή. Μετά τη θερμική κατεργασία το γάλα ψύχεται στους o C και προστίθεται η καλλιέργεια. Η καλλιέργεια μπορεί να είναι φρέσκο γιαούρτη, και προστίθεται σε αναλογία περίπου 3 %. Στη συνέχεια γίνεται επώαση στους περίπου 42 o C για λίγες ώρες, μέχρι το ph να μειωθεί στο 4,5. Ακολούθως, το γιαούρτι τοποθετείται στο ψυγείο. Το flavour του γιαουρτιού μπορεί να προέρχεται από το γάλα, να σχηματίζεται κατά τη θερμική κατεργασία, και κυρίως να σχηματίζεται με τη ζύμωση. Το γάλα έχει μάλλον ήπιο/αδύνατο flavour. Η προέλευση των συστατικών που συνεισφέρουν στο flavour του γάλακτος μπορούν να κατανεμηθούν σε τέσσερις κατηγορίες σύμφωνα με την προέλευσή τους. --Χημικές ενώσεις που προέρχονται από το μεταβολισμό του γαλακτοφόρου ζώου και/ ή τις ζωοτροφές. --Χημικές ενώσεις που παράγονται από χημικές αντιδράσεις, τις δράσεις των ενδογενών ενζύμων και/ ή τη μικροβιακή χλωρίδα πριν την επεξεργασίας του γάλακτος. --Χημικές ενώσεις που παράγονται από τη θερμική επεξεργασία του γάλακτος. --Χημικές ενώσεις που αναπτύσσονται κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Το είδος και ο αριθμός των πτητικών συστατικών που έχουν ταυτοποιηθεί στο γάλα και τα προϊόντα γάλακτος είναι μεγάλος. Ερευνητές ταυτοποίησαν στο γάλα 2

3 διαφόρων ειδών ζώων και επεξεργασίας (φρέσκο, αποστειρωμένο και συμπυκνωμένο) 32 υδρογονάνθακες, 23 αλκοόλες, 29 αλδεϋδες, 23 κετόνες, 19 οργανικά οξέα, 21 εστέρες, 12 λακτόνες, 15 θειοενώσεις, 1 ακετάλη, 6 αλογονοενώσεις, 4 φαινόλες, 8 φουράνια, συνολικά 206 ενώσεις. Τα δεδομένα αυτά είναι εντυπωσιακά ως αριθμοί, όμως δεν είναι επαρκή για αποτίμηση του flavour. Για να αξιοποιηθούν τα στοιχεία αυτά πρέπει να είναι γνωστά στοιχεία, όπως η συνεισφορά τους στο άρωμα, και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους. Η συνολική αποτίμηση μια πολύ δύσκολη εργασία, πόσο μάλλον για ένα σύνθετο τρόφιμο, όπως είναι το γάλα και τα προϊόντα του. Το νωπό γάλα καλής ποιότητας έχει ένα ήπιο αλλά χαρακτηριστικό flavour. Προκαλεί μία ευχάριστη εντύπωση στο στόμα με μία ελαφρά αλμυρή και γλυκιά γεύση που οφείλονται στην παρουσία αλάτων και λακτόζης. Λόγω της ουσιαστικά μη ύπαρξης αρώματος, το γάλα είναι ένα καλό μέσο για δυσάρεστες οσμές (off-flavours). Οι οσμηρές ενώσεις παράγονται με υδρόλυση, οξείδωση, ενζυμικές και μικροβιακές δράσεις. Σε ζυμούμενα προϊόντα γάλακτος, όπως το γιαούρτι, μπορεί να υπάρχουν επιπλέον ενώσεις flavour. Είναι πολύ σημαντικό να ταυτοποιούνται οι ενώσεις που συμβάλλουν καθοριστικά στην ποιότητά τους, δηλαδή είναι ενώσεις κλειδιά του flavour/αρώματός τους. Ο κύριος σκοπός της ζύμωσης στα τρόφιμα είναι η διασφάλιση σωστής συντήρησης του ζυμούμενου προϊόντος. Στο γιαούρτι και στο τυρί, η γρήγορη μετατροπή της λακτόζης του γάλακτος σε γαλακτικό οξύ είναι το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό των γαλακτικών βακτηρίων. Έτσι, με μείωση του ph και της λακτόζης, συμβαίνει αναστολή ανάπτυξης ανεπιθύμητων βακτηρίων. Εκτός από την παραγωγή γαλακτικού οξέος, οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται στις ζυμώσεις γαλακτοκομικών προϊόντων συνεισφέρουν ή καθορίζουν το flavour των προϊόντων. Το flavour του γιαουρτιού δεν είναι ιδιαίτερα σύνθετο και σχηματίζεται από συνδυασμό του γαλακτικού οξέος και διάφορων καρβονυλικών ενώσεων όπως η ακεταλδεύδη και το διακετύλιο. Στο γιαούρτι, τα βακτήρια της καλλιέργειας δρουν συνεργιστικά για απελευθέρωση αμινοξέων από τις πρωτεΐνες. Στο γιαούρτι συμβαίνει σχετικά χαμηλού επιπέδου λιπόλυση. 3

4 Ανάπτυξη starters (Streptococcus thermophillus, Lactobacillus bulgaricus), μείωση του ph και σχηματισμός ακεταλδεύδης κατά την παρασκευή γιαουρτιού. Η ανάπτυξη flavour στα τυριά που ωριμάζουν είναι σύνθετη και αργή διαδικασία, κατά την οποία συμβαίνουν χημικές και βιοχημικές μετατροπές συστατικών. Στα τυριά με δράση ενζύμων της πυτιάς και πρωτεολυτικών ενζύμων των γαλακτικών βακτηρίων σχηματίζονται μικρά πεπτίδια και ελεύθερα αμινοξέα από τις καζείνες. Τα μικρά πεπτίδια και αμινοξέα είναι υπεύθυνα για flavour σε ώριμα τυριά, όπως πικάντικο, ζωμού, γλυκό και αλμυρό, και επίσης ανεπιθύμητο πικρό. Επίσης, ανάπτυξη ιδιαίτερου flavour τυριών προκύπτει από αμινοξέα με σχηματισμό αλκοολών, αλδεϋδών, οξέων, εστέρων και θειούχων ενώσεων. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα είναι οι πιο σημαντικές ενώσεις flavour που προέρχονται από το λίπος με λιπόλυση. Τα γαλακτικά βακτήρια συνήθως έχουν ασθενείς λιπολυτικές δράσεις. Στο Cheddar και τυριά Ολανδικού τύπου (Gouda, Edam) συμβαίνει σχετικά χαμηλού βαθμού λιπόλυση. Σε τυριά Ιταλικού τύπου, μπλε τυριά και κάποια τυριά που ωριμάζουν με μύκητες και επιφανειακή ανάπτυξη βακτηρίων συμβαίνει εκτεταμένη λιπόλυση. Λιπαρά οξέα έχουν flavour όπως πικάντικο-οξύ, σαπωνώδες-ταγγό, κηρώδες, και μερικές φορές ακόμη και πικρό. Στα τυριά, ελεύθερα λιπαρά είναι πρόδρομες ενώσεις για πολλές ενώσεις flavour, όπως μεθυλοκετόνες, λακτόνες, εστέρες, αλδεύδες και δευτεροταγείς αλκοόλες. 4

5 Ενώσεις αρώματος οίνων Ο οίνος είναι προϊόν αλκοολικής ζύμωσης του γλεύκους (των ζαχάρων) με δράση ζυμομυκήτων, το οποίο υφίσταται κατεργασίες, οξειδωτική παλαίωση σε βαρέλι και αναγωγική παλαίωση στο μπουκάλι. Το άρωμα των οίνων διακρίνεται σε πρωτογενές, δευτερογενές και τριτογενές. Επίσης, υπάρχει διάκριση μεταξύ του αρώματος και του μπουκέτου του οίνου. Το άρωμα είναι σχετικά απλή σύνθεση, ενώ το μπουκέτο είναι μίξη πολλών αρωμάτων. Το πρωτογενές ή ποικιλιακό άρωμα οφείλεται σε ενώσεις αρώματος των σταφυλιών. Τέτοιες είναι τερπενικές αλκοόλες, εστέρες, ανώτερες αλκοόλες και πτητικά παράγωγα φαινολών. Επίσης, στα οσμηρά συστατικά του σταφυλιού είναι η εξανόλη και η εξενόλη, που προσδίνουν χορτώδη οσμή. Το δευτερογενές άρωμα ή άρωμα ζύμωσης οφείλεται σε ενώσεις που παράγονται κατά τη ζύμωση του γλεύκους. Τέτοιες είναι εστέρες, όπως ο οξικός αιθυλεστέρας, ο ισοαμυλικός αιθυλεστέρας, ο καπρονικός αιθυλεστέρας, ο καπρυλικός αιθυλεστέρας, ανώτερες αλκοόλες, όπως η προπανόλη, η ισοβουτανόλη, η ισοαμυλική αλκοόλη, λιπαρά οξέα και άλλες. Επίσης, κατά τη μηλογαλακτική ζύμωση παράγονται ενώσεις αρώματος, όπως ο γαλακτικός αιθυλεστέρας. Το τριτογενές άρωμα ή άρωμα παλαίωσης οφείλεται σε ενώσεις που δημιουργούνται κατά την ωρίμανση και παλαίωση του οίνου. Σε αναγωγικές συνθήκες δημιουργούνται οι ενώσεις του λεγόμενου μπουκέτου των οίνων. Επίσης, δημιουργούνται εστέρες των οξέων του οίνου με την αιθανόλη, όπως ηλεκτρικός και μηλικός αιθυλεστέρας. Πολλές ενώσεις με το χαρακτηριστικό τους άρωμα συμβάλλουν στο άρωμα του οίνου. Οι εστέρες συμβάλλουν στο φρουτώδες άρωμα. Ο καπρονικός αιθυλεστέρας έχει άρωμα βιολέτας και ο ισοαμυλικός αιθυλεστέρας μπανάνας. Από άλλες ενώσεις η φανυλο-2-αιθανόλη έχει άρωμα τριαντάφυλλου, η εξανόλη χόρτου, το διακετύλιο βουτύρου. Από την άλλη πλευρά, διάφορες ενώσεις έχουν αρνητική επίδραση στο άρωμα του οίνου. Παράδειγμα, με οξείδωση μετά την μείωση του φρουτώδους αρώματος παράγεται άρωμα οξείδωσης. Με οξείδωση της αιθανόλης παράγεται ακαταλδεΰδη, που έχει έντονο χαρακτηριστικό άρωμα. Οι εστέρες και οι ανώτερες αλκοόλες συμβάλλουν σημαντικά στο άρωμα των οίνων. Οι αιθυλεστέρες υπάρχουν σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες και μικρότερες από το κατώφλι αντίληψής τους. Μεταξύ των εστέρων είναι ο οξικός αιθυλεστέρας που έχει χαρακτηριστική οσμή. Σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις συμβάλλει στο σύνθετο του αρώματος των οίνων, ενώ σε υψηλές (παράδειγμα > 180 mg/l) έχει αρνητική επίδραση. Επίσης, οι ανώτερες αλκοόλες σε μικρές συγκεντρώσεις συμβάλλουν στο σύνθετο του αρώματος των οίνων, ενώ σε μεγαλύτερες (παράδειγμα > 300 ή mg/l) έχουν ανεπιθύμητη επίδραση, προσδίνουν πικάντικο και χορτώδη χαρακτήρα. Μέθοδοι προσδιορισμού ενώσεων αρώματος Οι ενώσεις αρώματος προσδιορίζονται κυρίως με αέριο χρωματογραφία με ανιχνευτή ανάλογα με τις ενώσεις που προσδιορίζονται. Πολύ επιτυχής είναι ο συνδυασμός αέριας χρωματογραφίας με φασματοσκοπία μάζας (GC-MS). Για κάθε συστατικό του δείγματος λαμβάνεται το φάσμα μάζας με την έκλουσή του από τον αέριο χρωματογράφο. Για την ταυτοποίηση των ενώσεων χρησιμοποιούνται αποθηκευμένα φάσματα που υπάρχουν στη βιβλιοθήκη του υπολογιστή. Επίσης, χρησιμοποιούνται φάσματα πρότυπων ενώσεων, υπό τις συνθήκες της ανάλυσης. 5

6 Για πτητικές ενώσεις σε σχετικά μεγάλες συγκεντρώσεις μπορεί να γίνει απευθείας έγχυση του δείγματος, ενώ συχνά προηγείται εκχύλιση. Εφαρμόζεται εκχύλιση υγρού-υγρού, εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE), όπως και μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (SPME). Γενικά για τη λήψη και στη συνέχεια προσδιορισμό πτητικών ενώσεων χρησιμοποιούνται πολλές μέθοδοι. Κλασσικές είναι οι τεχνικές της απόσταξης και της εκχύλισης με χρήση διαλυτών. Νεότερες είναι οι τεχνικές ανάλυσης υπερκείμενου χώρου (του αερίου πάνω από την επιφάνεια του δείγματος). Η μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (SPME) χρησιμοποιείται σήμερα ευρέως για την ανάλυση πτητικών συστατικών. Είναι γρήγορη και δεν χρησιμοποιεί διαλύτες. Μπορούν να αναλυθούν υγρά, στερεά και αέρια δείγματα. Η λήψη (εκχύλιση) γίνεται στην επιφάνεια μιας λεπτής ίνας από πυρίτιο που έχει μία επικάλυψη. Τα διάφορα συστατικά παρουσιάζουν διαφορετική συμπεριφορά, που εξαρτάται από παράγοντες, όπως η πολικότητα, η πτητικότητα, η θερμοκρασία, και άλλα χαρακτηριστικά του δείγματος και των συνθηκών εκχύλισης Η τεχνική SPME συνδυάζεται με την αέρια χρωματογραφία. Με την υψηλή θερμοκρασία του εισαγωγέα (χώρου εισαγωγής δείγματος) και το φέρον αέριο πετυχαίνεται η εκρόφηση των ενώσεων που έχουν προσροφηθεί στην ίνα. Η χειροκίνητη συσκευή SPME αποτελείται από έμβολο με ελατήριο που κινείται μέσα σε κύλινδρο. Έτσι, το έμβολο μπορεί να βρίσκεται σε εκτεταμένη θέση κατά την εκχύλιση και εκρόφηση. Στην άκρη του εμβόλου υπάρχει βελόνα από ατσάλι που φέρει λεπτό σωλήνα από ατσάλι στον οποίο βρίσκεται μικρό τμήμα ίνας από τετηγμένο πυρίτιο. Το ακραίο εκατοστό της ίνας είναι επικαλυμμένο από λεπτή μεμβράνη. Στη μεμβράνη αυτή γίνεται η λήψη (εκχύλιση) των πτητικών συστατικών. Υπάρχουν διάφορες επιστρώσεις ινών, με διαφορετικό πάχος και πολικότητα. Σχήμα. Χειροκίνητη συσκευή SPME. 6

7 Αέρια Χρωματογραφία- Φασματοσκοπία Μάζας (GC/MS) Η χρωματογραφία είναι κύρια τεχνική διαχωρισμού συγγενών χημικών ενώσεων. Επιπλέον, χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ενώσεων. Η χρωματογραφία αερίου-υγρού (gas-liquid chromatography, GLC) χρησιμοποιείται ευρύτατα, και συχνότερα αναφέρεται ως αέρια χρωματογραφία (gas chromatography, GC). Βασίζεται στην κατανομή του αναλύτη μεταξύ της αέριας κινητής και μιας υγρής στατικής φάσης. Το διάλυμα του δείγματος εγχύεται στον εισαγωγέα του χρωματογράφου, όπου εξατμίζεται. Η έκλουση πραγματοποιείται με ροή αδρανούς αερίου (όπως το ήλιο), το οποίο αποτελεί την κινητή φάση. Η συνηθέστερη τεχνική έγχυσης υγρού ή αερίου δείγματος είναι με μικροσύριγγα, μέσω ενός αυτοσφραγιζόμενου ελαστικού διαφράγματος σιλικόνης, γνωστού ως septum. Χρησιμοποιούνται πληρωμένες στήλες (packed) ή τριχοειδείς στήλες (capillary). Tα συστατικά του δείγματος συμπαρασύρονται από το φέρον αέριο κατά μήκος της στήλης και διαχωρίζονται. Ο διαχωρισμός πετυχαίνεται με βάση τη συγγένεια των ενώσεων με τη στατική φάση. H ταχύτητα και η ικανότητα του διαχωρισμού εξαρτώνται από τη θερμοκρασία. Έτσι, η στήλη βρίσκεται σε φούρνο, του οποίου η θερμοκρασία ελέγχεται. Από το χρωματογράφημα ως πληροφορία λαμβάνεται ο χρόνος κατακράτησης της κάθε ένωσης. Η ταυτοποίηση των ενώσεων γίνεται με φασματοσκοπική ή χημική εξέτασή τους. Το σήμα από τον ανιχνευτή αέριου χρωματογράφου χρησιμοποιείται για ποσοτικούς και ημιποσοτικούς προσδιορισμούς. Οι αναλύσεις βασίζονται στην επιφάνεια ή στο ύψος της κορυφής. Χρησιμοποιείται βαθμονόμηση και πρότυπα. Επίσης, χρησιμοποιείται η μέθοδος εσωτερικού προτύπου, που προστίθεται σε κάθε πρότυπο διάλυμα και σε κάθε δείγμα. Χρησιμοποιείται ο λόγος της επιφάνειας (ή ύψους) της κορυφής του αναλύτη προς την αντίστοιχη του εσωτερικού προτύπου. Με αέρια χρωματογραφία φασματοσκοπία μάζα; (GC/MS) πολύπλοκα μίγματα χημικών ενώσεων μπορεί να διαχωριστούν, ταυτοποιηθούν και ποσοτικοποιηθούν. Το έκλουσμα της στήλης παρακολουθείται με ανιχνευτή μάζας. Μέσω γραμμής μεταφοράς εισέρχεται σε θάλαμο ιοντισμού, όπου οι ενώσεις μετατρέπονται σε ιόντα. Τα φασματόμετρα μαζών αποτελούνται από α) το θάλαμο ιοντισμού, όπου μετατρέπεται η ένωση σε ιόντα, με απόσπαση ενός ηλεκτρονίου, β) τον αναλυτή μαζών, όπου γίνεται διαχωρισμός των ιόντων με βάση το λόγω m/z, γ) τoν ανιχνευτή. 7

8 Ο χώρος όπου δημιουργούνται και επιταχύνονται τα ιόντα διατηρείται σε κατάσταση υψηλού κενού. Με το υψηλό κενό δημιουργούνται σε χαμηλές θερμοκρασίες θέρμανσης ατμοί της προς προσδιορισμό ένωσης χωρίς τη διάσπασή της. Ο συνηθέστερος τρόπος ιοντισμού είναι με βομβαρδισμό των αερίων μορίων της ένωσης με δέσμη ηλεκτρονίων (ΕΙ) μεγάλης ενέργειας (συνήθως 70 ev), δημιουργείται με απώλεια ενός ηλεκτρονίου από μέρους της ένωσης μια κατιοντική ρίζα, που αντιστοιχεί στο μοριακό ιόν, που δίνει το μοριακό βάρος της ένωσης. Λόγω της υψηλής ενέργειας, το μοριακό ιόν συνήθως διασπάται και προκύπτουν περαιτέρω μικρά ιόντα που δίνουν αποτύπωμα (φάσμα μάζας) της ένωσης. Η πληροφορία αυτή χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση των ενώσεων. Το επόμενο τμήμα είναι ένας αναλυτής μάζας (φίλτρο). Συνήθης αναλυτής είναι ο τετραπολικός αναλυτής (quadrupole mass analyzer), συσκευή με την οποία τα ιόντα διαχωρίζονται με βάση τους λόγους m/z. Αποτελείται από τέσσερις μεταλλικές ράβδους, που συνδέονται ηλεκτρικά μεταξύ τους. Μόνο τα ιόντα δεδομένης μάζας μπορεί να περάσουν το τετράπολο φίλτρο μάζας. Μετά το διαχωρισμό τα ιόντα εισέρχονται σε ανιχνευτή, το σήμα ενισχύεται από πολλαπλασιαστή ηλεκτρονίων. Η πληροφορία πηγαίνει στον υπολογιστή, που καταγράφει τα δεδομένα. Ο υπολογιστής, επίσης, ελέγχει τη λειτουργία του φασματόμετρου μάζας. 8

9 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Προσδιορισμός ενώσεων αρώματος γιαουρτιών Ο προσδιορισμός των πτητικών ενώσεων γιαουρτιού γίνεται με μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (Solid Phase MicroExtraction, SPME) και αέρια χρωματογραφία με ανιχνευτή φασματογράφο μάζας (Gas Chromatography Mass Spectroscopy, GC-MS). Ποσότητα γιαουρτιού, 20 g, αναμιγνύεται / ομογενοποιείται με 10 g NaCl. 4,0/ 8,0 g του μίγματος τοποθετούνται σε μπουκαλάκι των 12 /15 ml με πώμα με septum (Supelco). Στο δείγμα προστίθενται 50 μl εσωτερικού προτύπου, 4-μεθυλο- 2-πεντανόλη, συγκέντρωσης 4 mg/l και μικρό μαγνητάκι. Το δείγμα θερμαίνεται στους 60 / 50 ο C, παραμένει για 15 / 20 min για σταθεροποίηση. Στη συνέχεια τοποθετείται η ίνα (Supelco 50/30 μm DVB/CAR/PDMS), στο μέσο του υπερκείμενου χώρου, για 60 / 20 min. Ακολούθως, η ίνα τοποθετείται στον εισαγωγέα του αέριου χρωματογράφου, και παραμένει για 5 min ώστε να γίνει θερμική εκρόφηση. Εικόνα. Κατεργασία δείγματος μέχρι την έγχυση στον εισαγωγέα του αέριου χρωματογράφου. Για την ανάλυση χρησιμοποιείται αέριος χρωματογράφος HP 6890 Series GC system με split/splitless εισαγωγέα συνδεμένο με ανιχνευτή συλλογής μαζών HP 5973 Mass Selective Detector. Η θερμοκρασία πηγής είναι 230 ο C, και του τετραπόλου 150 ο C. Η στήλη που χρησιμοποιείται είναι J & W DB-WAX, 60 m, 0,32 mm, 0,50μm. Εφαρμόζεται η τεχνική splitless για 3 min, και στη συνέχεια η τεχνική split με αναλογία 2:1. Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα ξεκινάει από τους 35 / 40 ο C με παραμονή για 4 / 5 min. Στη συνέχεια η αύξηση είναι με ρυθμό 4 / 3 ο C / min μέχρι τους ο C, και με ρυθμό 5 ο C / min μέχρι τους 235 ο C. Ακολουθεί παραμονή στους 235 ο C για 14,75 / 7 min. Η θερμοκρασία εισαγωγέα είναι 240 ο C και θερμοκρασία γραμμής μεταφοράς 220 ο C. Η ροή του ηλίου είναι 1,5 ml/min και η μέση ταχύτητα 31 / 4,4 cm/sec. Ο ανιχνευτής μάζας ρυθμίζεται για μάζες m/z και οι καταγραφές ανά λεπτό είναι 2,0 / 2,02 scan/sec. 9

10 Το όριο ανίχνευσης για τις κορυφές ορίζεται σε εμβαδό , και η ολοκλήρωση γίνεται αυτόματα. Η ταυτοποίηση των κορυφών γίνεται με τη βοήθεια των βιβλιοθηκών της Wiley 275 και της NIST 98. Ο προσδιορισμός είναι ημιποσοτικός και τα αποτελέσματα εκφράζονται σε mg/l εσωτερικού προτύπου, με σύγκριση των εμβαδών των ενώσεων και του εσωτερικού προτύπου (4-μεθυλο-2-πεντανόλη). Προσδιορισμός ενώσεων αρώματος οίνων Οι εστέρες, όπως και άλλα πτητικά των οίνων, μπορεί να προσδιοριστούν με αέρια χρωματογραφία με ανιχνευτή ιονισμού φλόγας. Οι εστέρες, μαζί με λιπαρά οξέα, προσδιορίζονται μετά από εκχύλιση. Σε 50 ml οίνου προστίθενται 2 ml οκτανόλης-3 40 mg/l (εσωτερικό πρότυπο), 2 ml επτανοικού οξέος 70 mg/l (εσωτερικό πρότυπο) και 0,3 ml φωσφορικού οξέος 30 %. Ακολουθούν διαδοχικές εκχυλίσεις με μίγμα αιθέρα:εξανίου 1:1, v/v. Οι εκχυλίσεις γίνονται με μαγνητικό αναδευτήρα και διαρκούν 5 min. Μετά το διαχωρισμό οι οργανικές φάσεις συγκεντρώνονται. Εναλλακτικά οι εστέρες, μαζί με άλλα πτητικά συστατικά που είναι σε μικρές συγκεντρώσεις, μπορεί να εκχυλιστούν με διχλωρομεθάνιο. Ανώτερες αλκοόλες, μαζί με άλλα συστατικά που βρίσκονται σε σχετικά μεγάλες συγκεντρώσεις, μπορούν να προσδιοριστούν με άμεση ανάλυση, χωρίς εκχύλιση. Η ανάλυση γίνεται με αέριο χρωματογράφο ιονισμού φλόγας με τριχοειδή στήλη. Οι συνθήκες ανάλυσης μπορεί να είναι όπως οι παρακάτω είτε ανάλογες. Χρησιμοποιείται στήλη Carbowax 20 M, 50 m, 0,22 mm, 0,2 μm. Γίνεται έγχυση 2 μl. Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα ξεκινάει από τους 40 o C, έχει ρυθμό ανόδου 3 o C / min μέχρι τους 200 o C. Η ταυτοποίηση γίνεται με πρότυπες ενώσεις και ο ποσοτικός προσδιορισμός με βάση τα εμβαδά των κορυφών. Στο εργαστήριο θα γίνει ημιποσοτικός προσδιορισμός πτητικών συστατικών οίνων θα γίνει με μικροεκχύλιση στερεάς φάσης και αέρια χρωματογραφία με ανιχνευτή μάζας. Σε φιαλίδιo προστίθεται οίνος και εσωτερικό πρότυπο, όπως 4-μεθυλο-2-πεντανόλη. Το φιαλίδιο τοποθετείται σε σύστημα μικροεκχύλισης στερεάς φάσης και η ίνα εκτίθεται στον υπερκείμενο χώρο. Μετά την εκχύλιση, η ίνα εισάγεται στον εισαγωγέα του αέριου χρωματογράφου, ώστε να γίνει θερμική εκρόφηση. Χρησιμοποιούνται διάφορες στήλες χρωματογραφίας, όπως παράδειγμα Innowax μήκους 30 m, εσωτερικής διαμέτρου 0,32 mm και πάχους πληρώσεως 0,5 μm. Επίσης, χρησιμοποιούνται διάφορα θερμοκρασιακά προγράμματα, όπως: 35 ο C για 5 min, αύξηση στους 60 ο C με ρυθμό 2 ο C / min, αύξηση στους 220 ο C με ρυθμό 5 ο C / min, αύξηση στους 250 ο C με ρυθμό 15 ο C / min και παραμονή στους 250 ο C για 5,5 min. Οι υπόλοιπες παράμετροι ρυθμίζονται. Η ταυτοποίηση των κορυφών γίνεται με τη χρήση βιβλιοθηκών ή και με πρότυπες ενώσεις. Η ολοκλήρωση των χρωματογραφημάτων γίνεται αυτόματα. Ο ημιποσοτικός προσδιορισμός των ενώσεων γίνεται με βάση το εμβαδό της κάθε ένωσης και της συγκέντρωσης του εμβαδού του εσωτερικού πρότυπου. 10

11 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 11 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΓΑΛΑ ΚΑΙ ΓΙΑΟΥΡΤΙ Ιωάννης Ρούσσης Προσδιορισμός αριθμού μικροοργανισμών Ιωάννινα, H μικροβιολογική εξέταση των τροφίμων περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του αριθμού και του τύπου των μικροοργανισμών όπως και προϊόντων τους σ' αυτά. O προσδιορισμός αριθμού μικροοργανισμών αφορά είτε τον ολικό αριθμό είτε τον αριθμό μιας κατηγορίας μικροοργανισμών. O όρος ολικός αριθμός αναφέρεται στα βακτήρια, ενώ οι μύκητες και οι ζυμομύκητες προσδιορίζονται σαν ξεχωριστή ομάδα. Όλες οι μέθοδοι προσδιορισμού αριθμού μικροοργανισμών, παρότι ορισμένες πλεονεκτούν έναντι άλλων, δεν δίνουν τον ακριβή αριθμό των μικροοργανισμών που υπάρχουν. Oι τέσσερις γενικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται κοινώς είναι: 1. Mέθοδος μετρήσεων με άμεση μικροσκόπηση (direct microscopic counts, DMC), 2. Mέθοδος πρότυπων αριθμήσεων σε τρυβλία (standard plate counts, SPC), 3. Mέθοδος πιο πιθανών αριθμών ή πολλαπλών σωλήνων (most probable numbers, MPN), 4. Mέθοδος αναγωγής χρωστικών (dye reductions). 1. Mέθοδος μετρήσεων με άμεση μικροσκόπηση. Kατ' αυτή, με την οποία προσδιορίζονται ζώντα και μη κύτταρα, παρασκευάζονται επαλήψεις δείγματος του τροφίμου ή αραίωσής του σε αντικειμενοφόρες πλάκες μικροσκοπίου και χρωματίζονται με κατάλληλο παρασκεύασμα χρωστικής. Aκολούθως, αριθμούντα, σε έναν αριθμό πεδίων μικροσκοπίου τα κύτταρα (μεμονωμένα ή συσσωματωμένα) και προσδιορίζεται ο αριθμός των οργανισμών ανά ml ή g τροφίμου με τη βοήθεια συντελεστών μικροσκοπίου. Mε τη μέθοδο αυτή, παράδειγμα, μετράται η ολική χλωρίδα του γάλακτος (μέθοδος Breed). 11

12 2. Mέθοδος πρότυπων αριθμήσεων σε τρυβλία. H μέθοδος αυτή είναι η πιο πλατιά χρησιμοποιούμενη και προσδιορίζει τον αριθμό των ζώντων κυττάρων σε ένα τρόφιμο. Kατ' αυτή τα δείγματα τροφίμων αραιώνονται με ένα κατάλληλο αραιωτικό, και τα υποπολλαπλάσια (κλάσματα) τοποθετούνται σε τρυβλία μαζί με το στερεό θρεπτικό υλικό, σε ρευστή μορφή. Tα τρυβλία επωάζονται σε μια κατάλληλη θερμοκρασία για ένα δεδομένο χρόνο και μετρούνται όλες οι ορατές αποικίες. H έκφραση των αποτελεσμάτων στηρίζεται στη συμβατική παραδοχή ότι κάθε ζωντανό κύτταρο δίνει μια ορατή αποικία. Aυτό, όμως, είναι μερικά μόνο αληθές γιατί ούτε όλα τα βακτήρια που υπάρχουν σε ένα δείγμα τροφίμου μπορούν να αναπτυχθούν ούτε όλες οι αποικίες που εμφανίζονται είναι βέβαιο ότι προέρχονται από ένα μόνο μικροβιακό κύτταρο. Για τους παραπάνω λόγους συχνά τα αποτελέσματα δίδονται σαν μονάδες που σχηματίζουν αποικία (colony forming units, cfu). H πιο συνήθης τεχνική της μεθόδου αυτής είναι αυτή της ενσωμάτωσης, ενώ χρησιμοποιείται και η τεχνική της επιφανειακής εξάπλωσης. Mε τη μέθοδο αυτή συνήθως προσδιορίζεται η ολική μεσόφιλη χλωρίδα (O.M.X.) δηλαδή ο πληθυσμός των αερόβιων μεσόφιλων βακτηρίων. Eπίσης, όμως, μπορεί να προσδιοριστεί και ο αριθμός διάφορων κατηγοριών μικροοργανισμών. Προσδιορισμός ολικής μεσόφιλης χλωρίδας (τεχνική ενσωμάτωσης) Aναμιγνύεται προσεκτικά το δείγμα και ετοιμάζονται οι ενδεδειγμένες κατά περίπτωση αραιώσεις με κατάλληλο αραιωτικό. Mεταφέρεται 1 ml (ή 0,1 ml) από κάθε αραίωση σε τρυβλία petri. Σε κάθε τρυβλίο προστίθενται 15 ml ρευστού υποστρώματος (45-46 C) και γίνεται ενσωμάτωση του δείγματος με κυκλικές και οριζόντιες κινήσεις. Tα τρυβλία επωάζονται αντεστραμμένα στους 32±1 C για 48±3 h. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται το Plate Count Agar. Σε κάθε ομάδα δειγμάτων πρέπει να τοποθετούνται και τρυβλία μάρτυρες, με τα οποία γίνεται ο έλεγχος της στειρότητας των υλικών (αραιωτικού, τρυβλίων, υποστρώματος). H επιλογή και αρίθμηση των αποικιών γίνεται βάσει κανόνων που θεσπίστηκαν από την APHA (American Public Health Association). Aριθμούνται μόνο τα τρυβλία που έχουν 30 έως 300 αποικίες. O αριθμός των αποικιών πολλαπλασιάζεται με τον αντίστοιχο συντελεστή αραίωσης και το αποτέλεσμα εκφράζει τον ολικό αριθμό αποικιών (ή τον ολικό αριθμό μεσόφιλων βακτηρίων ανά g ή ml δείγματος. Προσδιορισμός αριθμού κατηγοριών μικροοργανισμών Mύκητες και ζυμομύκητες O δείκτης των μυκήτων και ζυμομυκήτων δεν έχει πάντα την ίδια αξία με τον δείκτη της O.M.X., γιατί κάθε αποικία που αριθμείται είναι δυνατόν 12

13 να προέρχεται από ένα σπόριο, από άθροισμα σπορίων ή από τον κατακερματισμό του μυκηλίου, κατά την ομογενοποίηση του δείγματος. Λόγω του ότι τα βακτήρια αναπτύσσονται ταχύτερα από τους μύκητες και ζυμομύκητες, για τον προσδιορισμό των τελευταίων χρησιμοποιούνται υποστρώματα στα οποία δεν αναπτύσσονται τα βακτήρια (αναστολή ανάπτυξης). Συνήθως χρησιμοποιούνται υποστρώματα με χαμηλό PH (5,6-3,5) είτε υποστρώματα με ουδέτερο ph, τα οποία περιέχουν αντιβιοτικά όπως Chloramphenicol, Kanamycin, Oxytetracycline, Chlortetracycline. Tο μειονέκτημα των πρώτων είναι ότι η εκλεκτικότητά τους δεν είναι ικανή να αποτρέψει την ανάπτυξη όλων των βακτηρίων ενώ αναστέλλει την ανάπτυξη πολλών μυκήτων. Tα δεύτερα πλεονεκτούν καθόσον αναστέλλουν την ανάπτυξη των βακτηρίων χωρίς να επηρεάζουν ουσιαστικά την ανάπτυξη των μυκήτων και δίνουν υψηλότερο αριθμό μυκήτων. Συνήθη υποστρώματα είναι το potato dextrose Agar και το Rose Bengal Chloramphenicol Agar. H επώαση γίνεται στους C για 4-5 ημέρες. Για την αρίθμηση των ζυμών και των μυκήτων χρησιμοποιείται η τεχνική της ενσωμάτωσης, όπως επίσης και της επιφανειακής εξάπλωσης. Kαι για τις δύο η προετοιμασία των δεκαδικών αραιώσεων γίνεται όπως και για τον προσδιορισμό της O.M.X. Oι αποικίες των μυκήτων παρουσιάζουν τις χαρακτηριστικές τους υφές. Oι αποικίες των ζυμών, που μοιάζουν με των βακτηρίων, είναι σφαιρικές, υγρές-βουτυρώδεις, στιλπνές και έχουν χρώμα λευκό, κρεμ ή ανοικτό κόκκινο. Mε την πάροδο του χρόνου οι αποικίες παίρνουν χρώμα σταχτί και μετατρέπονται σε ξηρές ή κοκκώδεις. O αριθμός των αποικιών ζυμών ή/και μυκήτων εκφράζεται ανά g ή ml τροφίμου. Tα μυκήλια των μυκήτων μπορεί επίσης να προσδιοριστούν με τοποθέτηση αντιπροσωπευτικού δείγματος του τροφίμου σε πλάκα μικροσκοπίου, χρώση και παρατήρση στο μικροσκόπιο. Ψυχρότροφα βακτήρια Σαν ψυχρότροφοι χαρακτηρίζονται εκείνοι οι μικροοργανισμοί που ανεξάρτητα από την άριστη θερμοκρασία ανάπτυξής τους μπορούν και αναπτύσσονται και σε θερμοκρασίες ψύξης. O προσδιορισμός τους μπορεί να γίνει είτε με την τεχνική της ενσωμάτωσης (1 ml ενοφθάλμισμα) και επώαση στους 7±1 C για 10 ημέρες. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται το Plate Count Agar. Θερμοάντοχα βακτήρια Θερμοάντοχοι χαρακτηρίζονται οι μικροοργανισμοί που επιβιώνουν σε θερμοκρασίες πολύ μεγαλύτερες από το ανώτερο όριο ανάπτυξής τους. Στη βιομηχανία γάλακτος σαν θερμοάντοχοι χαρακτηρίζονται οι μικροοργανισμοί που επιβιώνουν κατά την LTLT παστερίωση (62,8 C/15 sec.) και σε αρκετό ποσοστό κατά την HTST παστερίωση (72 C/15 sec.). O προσδιορισμός των θερμοάντοχων γίνεται με την τεχνική της ενσωμάτωσης, όπως κατά τον προσδιορισμό της O.M.X., μετά παστερίωση 13

14 της 1:10 αραίωσης του δείγματος στους 62,8 C για 30 min. Σαν υπόστρωμα χρησιμοποιείται το Plate Count Agar και η επώαση γίνεται στους 32 C για 48 h. Θερμόφιλα βακτήρια Σαν θερμόφιλοι χαρακτηρίζονται οι μικροοργανισμοί οι οποίοι έχουν άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης μεταξύ 45 C και 55 C και ακραία όρια από 30 C έως 73 C. Eπειδή οι διάφοροι θερμόφιλοι μικροοργανισμοί ανήκουν σε ομάδες που διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τις απαιτήσεις τους σε οξυγόνο (αερόβιοιαναερόβιοι-προαιρετικά αναερόβιοι) όπως και σε θρεπτικές απαιτήσεις δεν είναι δυνατόν να αριθμηθούν όλοι με μόνο μια μέθοδο, γι' αυτό προσδιορίζονται κατά ομάδες. H αρίθμηση των θερμόφιλων αερόβιων βακτηρίων γίνεται με την τεχνική της ενσωμάτωσης, όπως για τον προσδιορισμό της O.M.X., σαν υπόστρωμα χρησιμοποιείται το Plate Count Agar και η επώαση γίνεται στους 55±1 C για 48 h. Kολοβακτηριοειδή Tα κολοβακτηριοειδή συνιστούν μία ομάδα βακτηρίων που χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να ζυμώνουν τη λακτόζη με παραγωγή οξέος και αερίων. H παρουσία τους στα τρόφιμα υποδηλώνει, ώς ένα βαθμό, μόλυνση του τροφίμου άμεσα ή έμμεσα με εντερικό περιεχόμενο ανθρώπου ή ζώων. Αυτό σημαίνει ότι το τρόφιμο πιθανόν να περιέχει και άλλους μικροοργανισμούς εντερικής προέλευσης (παθογόνα). Eπομένως, τα κολοβακτηριοειδή αποτελούν δείκτη της υγιεινής κατάστασης των τροφίμων. H προκαταρκτική δοκιμή αρίθμησης κολοβακτηριοειδών σε στερεό υπόστρωμα γίνεται με την τεχνική της ενσωμάτωσης. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται το Violet Red Bile Agar (αριθμούνται οι αποικίες σκοτεινού ερυθρού χρώματος) είτε το Desoxycholate Agar (αριθμούνται οι ερυθρές αποικίες). Kαι στις δύο περιπτώσεις η διάμετρος των αποικιών είναι τουλάχιστον 0,5 mm, όμως εάν υπάρχει μεγάλος αριθμός αποικιών το μέγεθός τους είναι μικρό. Γι' αυτό πρέπει να επιλέγονται τρυβλία που έχουν από 15 έως 150 αποικίες. H επώαση γίνεται στους 32 C για 24 ώρες. 3. Mέθοδος πιο πιθανού αριθμού Kατά την μέθοδο αυτή τα δείγματα των τροφίμων χειρίζονται όπως κατά την μέθοδο πρότυπων αριθμήσεων σε τρυβλία. Tο δείγμα ή αραιώσεις του ενοφθαλμίζονται συνήθως σε 9 ή 15 σωλήνες με κατάλληλο υγρό θρεπτικό υλικό, για την 3 ή 5 σωλήνων μέθοδο αντίστοιχα. O αριθμός των μικροοργανισμών στο δείγμα προσδιορίζεται με τη χρήση πινάκων πιο πιθανού αριθμού (most probable number, MPN). H μέθοδος αυτή είναι στατιστικής φύσης, προσδιορίζει τα ζώντα κύτταρα, και δίνει αριθμούς γενικά υψηλότερους από τη μέθοδο προτύπων αριθμήσεων σε τρυβλία. H προκαταρκτική δοκιμή αρίθμησης κολοβακτηριοειδών σε υγρό θρεπτικό υλικό γίνεται με τη μέθοδο του πιο πιθανού αριθμού (π.χ. στο νερό). 14

15 Xρησιμοποιούνται κωνική 200 ml, δοκιμαστικοί σωλήνες διαστάσεων 200X20 mm, δοκιμαστικοί σωλήνες διαστάσεων 160X15 mm και σωληνίσκοι ζυμώσεων Durham. Tοποθετούνται 50 ml ζωμού Mac-Conkey σε μία κωνική 50 ml και ανά 20 ml και 10ml σε 5 μεγάλους (200X20 ml) και 5 μικρούς (160X15 ml) δοκιμαστικούς σωλήνες αντίστοιχα. Στους 10 δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετούνται και σωληνίσκοι ζύμωσης Durham. Tα παραπάνω ενοφθαλμίζονται με 50 ml η κωνική και ανά 10 ml και 1 ml οι μεγάλοι και μικροί δοκιμαστικοί αντίστοιχα, του προς εξέταση νερού. H επώαση γίνεται στους 37 C για 48 h. H ύπαρξη κολοβακτηριοειδών έχει σαν αποτέλεσμα την διάσπαση της λακτόζης του θρεπτικού υλικού με παραγωγή οξέος και αερίου. H παραγωγή οξέος διαπιστώνεται από την αλλαγή του χρώματος του υποστρώματος και η παραγωγή αερίου από τη συλλογή αερίου στους σωληνίσκους Durham. Όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των κωλοβακτηριδιόμορφων στο νερό τόσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των σωλήνων που θα δώσει θετική την προκαταρκτική δοκιμή. Tο αποτέλεσμα εκφράζεται σε αριθμό κωλοβακτηρίδιων ανά 100 ml νερού, όπως προκύπτει από τον πίνακα πιθανοτήτων του Mc-Crady. 4. Mέθοδος αναγωγής χρωστικών Kατ' αυτή κατάλληλα παρασκευάσματα τροφίμων προστίθενται σε πρότυπα διαλύματα κυανού του μεθυλενίου ή ρεσαζουρίνης και παρατηρείται η αναγωγή των παραπάνω χρωστικών (το κυανού του μεθυλενίου από κυανό σε λευκό και η ρεσαζουρίνη από τεφροκύανο σε ροζ ή λευκό). H αιτία των μεταβολών είναι η αφαίρεση οξυγόνου και ο σχηματισμός αναγωγικών ουσιών κατά τον μεταβολισμό των βακτηρίων. Παρά το γεγονός ότι ορισμένα βακτήρια είναι πιο αναγωγικά από άλλα σε γενικές γραμμές γίνεται δεκτό ότι όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των βακτηρίων τόσο ταχύτερα αλλάζουν χρώμα οι χρωστικές. Mε τη μέθοδο αυτή, παράδειγμα, μπορεί να εκτιμηθεί το μικροβιακό φορτίο του γάλακτος με το κυανό του μεθυλενίου. Eκτός από τις παραπάνω κλασικές μεθόδους, στη μικροβιολογική εξέταση τροφίμων χρησιμοποιούνται επίσης διάφορες νεώτερες μέθοδοι. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Προσδιορισμός ολικής μεσόφιλης χλωρίδας γάλακτος Το δείγμα γάλακτος ανακινείται καλά, λαμβάνεται με στείρες συνθήκες 1 ml και προστίθεται σε 9 ml αραιωτικού (Ringer ή φυσιολογικό ορό 0, 9 % NaCl). Με τον ίδιο τρόπο, στη συνέχεια γίνονται περαιτέρω δεκαδικές αραιώσεις. Το διάλυμα Ringer διατηρεί την ωσμωτική ισορροπία των βακτηρίων. Αποτελείται, σε g/l, από χλωριούχο ασβέστιο 0,12, χλωριούχο κάλιο 0,105, όξινο ανθρακικό νάτριο 0,05, NaCl 2,25. 15

16 Ένα ml κάθε αραίωσης προστίθεται σε τρυβλίο Petri, στο οποίο στη συνέχεια προστίθεται θρεπτικό υλικό Plate Count Agar (τεχνική ενσωμάτωσης). Η επώαση γίνεται στους 30 o C για 72 ώρες. To Plate Count Agar αποτελείται, σε g/l, τρυπτόνη 5,0, εκχύλισμα ζύμης, 2,5, γλυκόζη 1,0, άγαρ 9,0, και έχει ph 7,0. Για την παρασκευή του θρεπτικού υλικού κατάλληλη ποσότητα (ανάλογα με τις οδηγίες, όπως 17,5 g) διαλύονται με θέρμανση και ανάδευση σε 1 L αποσταγμένο νερό, γίνεται διανομή σε περιέκτες, και ακολουθεί αποστείρωση στους 121 o C για 15 min. Διατηρείται στους περίπου 47 o C πριν την προσθήκη στα τρυβλία, Προσδιορισμός πληθυσμού ζυμών και μυκήτων σε γιαούρτι Με αποστειρωμένη πλαστική φούσκα (πιπέτα), υπό ασηπτικές συνθήκες ζυγίζονται 2 g δείγματος γιαουρτιού σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει 6 ml αραιωτικού διαλύματος. Ακολουθεί έντονη ανάδευση σε vortex. Η αραίωση του δείγματος που πετυχαίνεται είναι 1:4. Ακολουθούν περαιτέρω αραιώσεις. 2 ml από την αραίωση 1:4 προστίθενται σε 3 ml διαλύματος αραιωτικού, και ακολουθεί έντονη ανάδευση σε vortex. Η αραίωση του δείγματος που πετυχαίνεται είναι 1:10. Ακολούθως, περαιτέρω δεκαδικές αραιώσεις γίνονται με προσθήκη 0,5 ml από την αραίωση 1:10 κ.ο.κ. σε 4,5 ml διαλύματος αραιωτικού, και ακολουθεί έντονη ανάδευση σε vortex. Η αραίωση του δείγματος που πετυχαίνεται είναι 1:100, κ.ο.κ. Το αραιωτικό που χρησιμοποιείται είναι το Buffered Peptone Water. Αυτό αποτελείται, σε g/l, από πεπτόνη 10,0, NaCl 5,0, όξινο φωσφορικό νάτριο 3,5, δισόξινο φωσφορικό κάλιο 1,5, και έχει ph 7,2. Ένα ml κάθε αραίωσης προστίθεται σε τρυβλίο Petri, στο οποίο στη συνέχεια προστίθεται θρεπτικό υλικό Rose Bengal Chloramphenicol Agar (τεχνική ενσωμάτωσης). Επίσης, χρησιμοποιείται η τεχνική της επιφανειακής εξάπλωσης. Η επώαση γίνεται στους 25 o C για 5 ημέρες. To Rose Bengal Chloramphenicol Agar αποτελείται, σε g/l, πεπτόνη 5,0, γλυκόζη 10,0, όξινο φωσφορικό κάλιο 1,0, θειικό μαγνήσιο 0,5, Rose-Bengal, 0,05, άγαρ 15,5, και έχει ph 7,2. Η χλωραμφαινικόλη είναι ο παράγοντας (αντιβιοτικό) για αναστολή ανάπτυξης των βακτηρίων. Η χρωστική Rose-Bengal (ερυθρό της Βεγγάλης) ελέγχει την ανάπτυξη ταχέως αναπτυσσόμενων μυκήτων. Για την παρασκευή του θρεπτικού υλικού κατάλληλη ποσότητα, όπως 32 g, διαλύονται με θέρμανση και ανάδευση σε 1 L αποσταγμένο νερό, γίνεται διανομή σε περιέκτες, και ακολουθεί αποστείρωση στους 121 o C για 5 min. Διατηρείται στους περίπου 50 o C πριν την προσθήκη στα τρυβλία. 16

17 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 12 ΕΙΔΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΟΙΝΩΝ Ιωάννης Ρούσσης Ιωάννινα ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Προσδιορισμός ολικών εστέρων Οι εστέρες σχηματίζονται με αντίδραση αλκοόλης και οξέος, που είναι αμφίδρομη καθόσον συμβαίνει υδρόλυση των εστέρων. Υπάρχει μεγάλος αριθμός διαφορετικών αλκοολών και οξέων στον οίνο. Έτσι, ο αριθμός των πιθανών εστέρων είναι πολύ μεγάλος. Οι οξικοί αιθυλεστέρες είναι οι πιο κοινοί. Μόνο λίγοι εστέρες βρίσκονται στα σταφύλια, όπως ο ανθρανιλικός εστέρας που προσδίδει μια όξινη οσμή σε κάποιους οίνους. Οι εστέρες σχηματίζονται με ενζυμική εστεροποίηση κατά τη ζύμωση, και με χημική εστεροποίηση κατά την παλαίωση. Σχήμα. Ισορροπία εστεροποίησης αλκοόλης. Οι εστέρες που σχηματίζονται από οξέα με ένα καρβοξύλιο είναι ουδέτεροι, και οι εστέρες από οξέα με περισσότερα καρβοξύλια μπορεί να είναι όξινοι ή ουδέτεροι. Οι εστέρες παρουσιάζουν σημαντικό ενδιαφέρον λόγω των οργανοληπτικών τους χαρακτήρων. Εκτός από τον οξικό αιθυλεστέρα που έχει δυσάρεστη οσμή, οι εστέρες με μεγαλύτερο μοριακό βάρος έχουν άρωμα λουλουδιών ή φρούτων, και συμμετέχουν αποφασιστικά στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτήρων των οίνων. Ο γαλακτικός και ο προπιονικός αιθυλεστέρας έχουν ουδέτερη οσμή και υψηλό κατώφλι αντίληψης, και έτσι δεν φαίνεται να έχουν επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων. Οι αιθυλεστέρες των λιπαρών οξέων με ζυγό αριθμό ατόμων άνθρακα και ειδικότερα με 6, 8, 10 και 12 άτομα άνθρακα (εξανοικός, οκτανοικός, δεκανοικός και δωδεκανοικός) αποτελούν σπουδαία συστατικά του αρώματος και του μπουκέτου των οίνων. Επίσης, οξικοί εστέρες όπως ο οξικός ισοαμυλεστέρας, ο οξικός βενζυλεστέρας, ο οξικός φαυνυλ αιθυλεστέρας. Ο σχηματισμός εστέρων κατά την αλκοολική ζύμωση εξαρτάται από τον ζυμομύκητα ζύμωσης, τη θερμοκρασία, το ph, τον αερισμό, ακόμη και από το στάδιο της ζύμωσης. 17

18 Προσδιορισμός συνολικών πτητικών εστέρων φωτομετρικά - Αρχή μεθόδου Προσδιορισμός των συνολικών πτητικών εστέρων μπορεί να γίνει φωτομετρικά, μετά από απόσταξη του οίνου και αντίδραση με ειδικά αντιδραστήρια. Οι πτητικοί εστέρες αντιδρούν με υδροξυλαμίνη και δημιουργούν προϊόν που αντιδρά με τρισθενή σίδηρο και δημιουργεί έγχρωμο σύμπλοκο. Προσδιορισμός σορβικού οξέος Το σορβικό οξύ, CH 3 -CH=CH-CH=CH-COOH, έχει αντιμικροβιακή δράση. Δρα στους μύκητες, ενώ έχει πολύ μικρή δράση στα βακτήρια. Πρακτικά δεν έχει δράση στα γαλακτικά και στα οξικά βακτήρια. Είναι δραστικό έναντι όλων των ζυμομυκήτων, από τους οποίους πιο ευαίσθητοι είναι του γένους Kloeckera ή Hansieniaspora. Η αποτελεσματικότητά του εξαρτάται από την αλκοόλη και το ph. Σε υψηλότερα επίπεδα αλκοόλης απαιτείται μικρότερη συγκέντρωση σορβικού οξέος. Είναι πιο δραστικό σε χαμηλότερα ph. Σε ph 3,1 είναι δύο φορές πιο δραστικό από ότι σε ph 3,5. Ο συνδυασμός του σορβικού οξέος με τον θειώδη ανυδρίτη τον καθιστά πιο αποτελεσματικό. Σημειώνεται ότι το σορβικό οξύ δεν μπορεί να αντικαταστήσει τον θειώδη ανυδρίτη αλλά για μείωσή του, κυρίως στους γλυκούς οίνους. Επειδή το σορβικό οξύ είναι ελάχιστα διαλυτό στο νερό και στην αλκοόλη, χρησιμοποιείται το σορβικό κάλιο που είναι πιο διαλυτό. Το μέγιστο όριο χρησιμοποίησής του είναι 200 mg/l. Χρησιμοποιείται σε γλυκά κρασιά για αποφυγή επαναζύμωσης. Χρησιμοποιείται μαζί με mg/l SO 2 για προστασία από την οξείδωση και για αναστολή βακτηρίων. Το σορβικό οξύ είναι αφομοιώσιμο από τον οργανισμό και δεν είναι τοξικό. Είναι λευκό, με καυστική οσμή, πτητικό, και πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στον προσδιορισμό της πτητικής οξύτητας για διόρθωση του αποτελέσματος. 18

19 Η προσθήκη του σορβικού οξέος στους ερυθρούς οίνους πρέπει να αποφεύγεται διότι σχηματίζει δυσάρεστη οσμή και γεύση. Δεν είναι σταθερό και διασπάται από γαλακτικά βακτήρια και προσδίδει δυσάρεστη οσμή που δύσκολα απομακρύνεται. Προσδιορισμός σορβικού οξέος φωτομετρικά Αρχή μεθόδου Το σορβικό οξύ παρουσιάζει μέγιστη απορρόφηση στο υπεριώδες στα 256 nm. H μέτρηση γίνεται σε απόσταγμα του οίνου, δεδομένου ότι το σορβικό οξύ είναι πτητικό με υδρατμούς. Ενζυμικός προσδιορισμός μηλικού οξέος, και άλλων οξέων Τα οργανικά οξέα είτε προέρχονται από το σταφύλι είτε σχηματίζονται κατά τις ζυμώσεις του γλεύκους και τις μικροβιακές αλλοιώσεις του οίνου. Τα κυριότερα οξέα του σταφυλιού Τρυγικό (HO 2 CCH(OH)CH(OH)CO 2 H), μηλικό (HO 2 CCH 2 CHOHCO 2 H), κιτρικό (HOC(COOH)(CH 2 COOH) 2 ), οξαλικό (HO 2 CCO 2 H), ουρονικά οξέα (σακχαρικά οξέα), (εξουρονικό οξύ, L-ασκορβικό οξύ βιταμίνη C, C 6 H 8 O 6 ). Το γλυκονικό οξύ (γλουκονικό οξύ, HOCH 2 (CHOH) 4 COOH) και άλλα οξέα υπάρχουν όταν συμβαίνει φαιά σήψη. Κατά τη ζύμωση σχηματίζονται ηλεκτρικό οξύ (HOOC-(CH 2 ) 2 -COOH) και γαλακτικό οξύ (CH 3 CH(OH)COOH), και με εστεροποίηση προκύπτουν αιθυλικοί εστέρες που συμβάλλουν σημαντικά στο άρωμα. Άλλα οξέα ζυμώσεων και μικροβιακών αλλοιώσεων είναι το κιτρομηλικό, το διμεθυλογλυκερινικό, το πυροσταφυλλικό, το α-κετογλουταρικό. Τα οξέα, μηλικό, τρυγικό, κιτρικό και γαλακτικό (υδροξυοξέα), δεσμεύουν το σίδηρο και έτσι αποφεύγονται θολώματα σιδήρου. Το κιτρικό σχηματίζει πιο ισχυρά σύμπλοκα με το σίδηρο και χρησιμοποιείται για αποφυγή θολωμάτων σιδήρου. Τα οργανικά οξέα συμβάλλουν θετικά στην ποιότητα του οίνου. Ρυθμίζουν την ογκομετρούμενη και την ενεργό οξύτητα του γλεύκους και του οίνου. Ρυθμίζουν την όξινη γεύση του οίνου. Περιορίζουν την ανάπτυξη διάφορων μικροοργανισμών όπως βακτηρίων αλλοίωσης του οίνου, και έτσι συμβάλλουν στη συντήρησή του. Το χαμηλό ph ευνοεί τη ζωηρότητα του χρώματος των οίνων. Όμως, ορισμένα οξέα προσβάλλονται κάποιες φορές από μικροοργανισμούς και έτσι προκαλούνται αλλοιώσεις των οίνων. Τα οργανικά οξέα βρίσκονται είτε ως ελεύθερα οξέα είτε με τη μορφή αλάτων. Τα ελεύθερα οξέα μπορεί να βρίσκονται σε μερική διάσταση, ενώ τα άλατα βρίσκονται σε πλήρη διάσταση. 19

20 Η συνολική αποτίμηση των οργανικών οξέων στους οίνους προκύπτει από α) την ολική ή ογκομετρούμενη οξύτητα, που εκφράζει το σύνολο των καρβοξυλομάδων των οξέων είτε βρίσκονται σε διάσταση είτε όχι, β) την ενεργό οξύτητα ή ph, που εκφράζει το σύνολο των καρβοξυλομάδων που βρίσκονται σε διάσταση και που αντιστοιχεί στο σύνολο των κατιόντων υδρογόνου, και γ) την αλκαλικότητα της τέφρας, που εκφράζει το σύνολο των οργανικών οξέων που βρίσκονται υπό μορφή αλάτων και που μετατρέπονται σε ανθρακικά άλατα με αποτέφρωση. Τρυγικό οξύ (2-5 g/l): το φυσικό τρυγικό οξύ του οίνου είναι το D-τρυγικό οξύ. Είναι το σπουδαιότερο από τα σταθερά οξέα του οίνου. Είναι το πιο ισχυρό και επηρεάζει την ενεργό οξύτητα του οίνου. Από τα τρία κυριότερα οξέα του σταφυλιού (τρυγικό, μηλικό, κιτρικό) το τρυγικό οξύ είναι το πιο ανθεκτικό στις βακτηριακές προσβολές. Με βάση τα παραπάνω, είναι το οξύ που ενδείκνυται περισσότερο για την αύξηση της οξύτητας της σταφυλόμαζας. Όμως, σε υψηλές δόσεις δίνει στον οίνο μία σκληρότητα και στυφότητα. Η συγκέντρωση του τρυγικού οξέος στο πράσινο σταφύλι είναι περίπου 15 g/l, και στο ώριμο περίπου 7,5 g/l, λόγω καύσης και διάλυσης στο νερό του σταφυλιού. Κατά την αλκοολική ζύμωση καθιζάνει ποσότητα όξινου τρυγικού καλίου, λόγω μικρότερης διαλυτότητας στην αλκοόλη, και η οξύτητα είναι 2,5-4 g/l. Με τα κρύα του χειμώνα, καταβυθίζονται όξινο τρυγικό κάλιο και τρυγικό ασβέστιο (αρχικά το άλας καλίου και αργότερα το άλας του ασβεστίου) (τρυγία). Έτσι, η συγκέντρωση του τρυγικού οξέος είναι 1,5-2,5 g/l. Μερικές φορές το τρυγικό οξύ προσβάλλεται από γαλακτικά βακτήρια, και η συγκέντρωση του τρυγικού μηδενίζεται, ενώ αυξάνει η πτητική οξύτητα. Μηλικό οξύ (0-4 g/l): Το φυσικό μηλικό οξύ είναι το L (-) ισομερές. Έχει σημαντική επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων, και προσδίδει χορτώδη οσμή και γεύση και κάποια στυφάδα. Στα πράσινα σταφύλια η συγκέντρωσή του είναι g/l, στα ώριμα σταφύλια 2-5 g/l. Είναι ασταθές στους μικροργανισμούς. Οι συνήθεις ζύμες δεν μεταβάλλουν τη συγκέντρωση του μηλικού οξέος κατά την αλκοολική ζύμωση. Όμως, ο Schizosaccharomyces pombe μετατρέπει το μηλικό οξύ σε αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα (μηλοαλκοολική ζύμωση), και έτσι μειώνεται η οξύτητα των οίνων. Μερικές φορές λαμβάνει χώρα η μηλογαλακτική ζύμωση. Μηλογαλακτικά βακτήρια μετατρέπουν το μηλικό οξύ σε γαλακτικό οξύ και διοξείδιο του άνθρακα, και έτσι μειώνεται η οξύτητα. Η μηλογαλακτική ζύμωση ενδείκνυται για τους ερυθρούς οίνους και ιδιαίτερα οίνους με υψηλή οξύτητα, και βελτιώνει τα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά. Κιτρικό οξύ (0-1 g/l): στο σταφύλι βρίσκεται μέχρι 0,5 g/l, ενώ με την ευγενή σήψη μέχρι 0,8-1,0 g/l. 20

21 Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αύξηση της οξύτητας και τη γευστική βελτίωση των οίνων. Σημειώνεται ότι επιτρέπεται η προσθήκη κιτρικού στον οίνο, ενώ του τρυγικού οξέος μόνο στο γλεύκος. Όμως, είναι ευπρόσβλητο από γαλακτικά βακτήρια με αύξηση της πτητικής οξύτητας. Σωστό είναι αποφεύγεται η προσθήκη, και να προστίθεται μόνο στη δόση για προστασία από θολώματα σιδήρου και μόνο όταν είναι απαραίτητο. Επιτρεπόμενο όριο προσθήκης είναι 50 g/hl, ενώ g/hl είναι συνήθως επαρκή. Ασκορβικό οξύ (0 g/l): υπάρχει στο γλεύκος σε mg/l. Καταναλώνεται από τις ζύμες κατά τη ζύμωση, και έτσι δεν υπάρχει στους οίνους. Προστίθεται στους οίνους σε δόσεις μέχρι 100 mg/l. Δρά ως αντιοξειδωτικό, καθόσον οξειδώνεται το ίδιο γρήγορα. Εμποδίζει την οξείδωση του δισθενούς σιδήρου σε τρισθενή. Παρέχει κάποια προστασία σε ενώσεις αρώματος και διατηρεί τη φρεσκάδα του οίνου. Προστίθεται κατά την εμφιάλωση, σε οίνους με επαρκή ποσότητα θειώδη ανυδρίτη. Ηλεκτρικό οξύ (0,5-1,5 g/l): σχηματίζεται κατά τη ζύμωση των ζαχάρων, και γι αυτό είναι σε κάποια αναλογία με την αλκοόλη. Έχει σημαντική επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων, καθόσον η γεύση του συνδυάζει το ξινό, το αλμυρό και το πικρό. Το ηλεκτρικό οξύ είναι πολύ ανθεκτικό σε βακτηριακές προσβολές. Γαλακτικό οξύ. L (+) γαλακτικό οξύ (0,1-3 g/l) και D (-) γαλακτικό οξύ (0,1-0,5 g/l). Βρίσκεται στους οίνους αλλά όχι στα γλεύκη. Βρίσκεται και με τα δύο του ισομερή (το αριστερόστροφο (D-) ή/και το δεξιόστροφο (L+)). Προέρχεται από τη δράση των ζυμών κατά τη ζύμωση. Παράγεται το D (-) ισομερές σε 0,1-0,4 g/l, ενώ το L (+) ισομερές μόνο σε ίχνη. Επίσης, προέρχεται από τη δράση των μηλογαλακτικών βακτηρίων κατά τη μηλογαλακτική ζύμωση. Παράγεται μόνο το L (+) ισομερές, μέχρι 3 g/l. Έτσι, είναι δείκτης της μηλογαλακτικής ζύμωσης. Ακόμη, παράγεται από τη δράση γαλακτικών βακτηρίων με προσβολή ζαχάρων (εξόζες), της γλυκερίνης και του τρυγικού οξέος. Ανάλογα με το βακτήριο παράγεται το D (-) ισομερές είτε το L (+) ισομερές. Στις περιπτώσεις βακτηριακής αλλοίωσης η ολική συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος είναι υψηλή, ακόμη και μεγαλύτερη από 10 g/l. Όταν τα επίπεδα του γαλακτικού οξέος είναι υψηλά εξετάζονται τα επίπεδα του μηλικού οξέος (για μηλογαλακτική ζύμωση), των ζαχάρων (για βακτηριακή προσβολή ζαχάρων), και του τρυγικού οξέος (για βακτηριακή προσβολή του, εκτροπή). Το γαλακτικό οξύ είναι το πιο σταθερό οξύ του οίνου από χημική και βιολογική 21

22 άποψη. Έτσι, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για αύξηση της οξύτητας ορισμένων οίνων (το τρυγικό οξύ που χρησιμοποιείται συνήθως προσβάλλεται από βακτήρια). Eνζυμικές μέθοδοι H χρησιμοποίηση των ενζύμων στην ανάλυση των τροφίμων είναι σχετικά πρόσφατη. Tο κύριο πλεονέκτημα των ενζυμικών μεθόδων είναι η μεγάλη εξειδίκευση, όπως επίσης οι ήπιες συνθήκες ανάλυσης, η ευαισθησία, η ακρίβεια και η επαναληψιμότητά τους. Mειονεκτήματά τους είναι η ανασταλτική δράση διαφόρων συστατικών των τροφίμων, όπως και η αστάθεια των ενζύμων. Στις ενζυμικές μεθόδους ανάλυσης, το προσδιοριζόμενο συστατικό είναι, κατά κανόνα, το υπόστρωμα της αντίδρασης. Σύμφωνα με την εξίσωση Michaelis Menten E+S ES E+P, ενώ η αρχική ταχύτητα Uo = (Vmax [S]o)/(Km+[S]o). H συγκέντρωση του υποστρώματος μπορεί να προσδιοριστεί με δύο μεθόδους. 1. Mέθοδοι ολικής μεταβολής (total change) H αντίδραση αφήνεται να προχωρήσει το δυνατό και μετράται η ολική μεταβολή (κατανάλωση υποστρώματος ή δημιουργία προϊόντος). Όταν η ενζυμική αντίδραση δεν είναι ποσοτική υποβοηθείται με αύξηση της συγκέντρωσης αντιδραστηρίων (συνήθως των συνενζύμων), με δέσμευση κάποιου από τα προϊόντα ή με μεταβολή του ph. Oι μέθοδοι αυτές δεν απαιτούν αυστηρό έλεγχο των πολυάριθμων μεταβλητών. Eφαρμόζονται είτε άμεσες μετρήσεις είτε έμμεσες με την βοήθεια συζευγμένων αντιδράσεων. Παράδειγμα αν το υπόστρωμα έχει ένα χαρακτηριστικό φάσμα απορρόφησης μπορεί να μετρηθεί η μείωση της απορρόφησης σε ένα μήκος κύματος. H μεταφορά υδρογόνου απ' το υπόστρωμα στο NAD ή NADP και η μέτρηση της απορρόφησης στα 340nm, όπου απορροφά το αναγμένο συνένζυμο, είναι η βάση πολλών ενζυμικών προσδιορισμών, όπως του προσδιορισμού της αιθανόλης με αλκοολική δεϋδρογονάση. Στις μετρήσεις με συζευγμένες αντιδράσεις προϊόν της πρώτης αντίδρασης αντιδρά με χρωμογενές αντιδραστήριο προς δημιουργία χρώματος, όπως παράδειγμα στον προσδιορισμό γλυκόζης με οξειδάση γλυκόζης και υπεροξειδάση. 22

23 οξειδάση γλυκόζη γλυκόζη+h 2 O+O 2 γλουκονικό οξύ+h 2 O 2 υπεροξειδάση H 2 O 2 +λευκο-χρωστική H 2 O+χρώμα 2. Mέθοδοι μέτρησης αρχικής ταχύτητας Yπό ελεγχόμενες συνθήκες και σε μικρές συγκεντρώσεις υποστρώματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί η αρχική ταχύτητα για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του υποστρώματος. H περιοχή γραμμικότητας ισχύει για συγκεντρώσεις μικρότερες από 0,1 Km, και επειδή ο ρυθμός της αντίδρασης εξαρτάται από το ph, την θερμοκρασία και την ιονική ισχύ, οι συνθήκες πρέπει να κρατούνται αυστηρά σταθερές. Eκτός από την συγκέντρωση υποστρώματος, επίσης εφαρμόζεται και ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης αναστολέα. Aναστολέας είναι ένωση που προκαλεί μείωση του ρυθμού ενζυμικής αντίδρασης, με σχηματισμό συμπλόκου με το ένζυμο ή το υπόστρωμα. Γενικά η αρχική ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης θα μειώνεται γραμμικά με αύξηση της συγκέντρωσης του αναστολέα, σε χαμηλές συγκεντρώσεις, και θα μηδενίζεται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Παράδειγμα αποτελεί ο προσδιορισμός των οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων, που είναι αναστολείς χοληνεστεράσης. Mεγάλη πρόοδο αποτέλεσε η αυτοματοποίηση των ενζυμικών μεθόδων, που επιτρέπει την εξέταση μεγάλου αριθμού δειγμάτων και καλύτερη ακρίβεια και επαναληψιμότητα, κυρίως με την εφαρμογή τεχνικών συνεχούς ροής. Γίνονται μετρήσεις απορρόφησης στο ορατό ή το υπεριώδες, φθορισμού. Επίσης χρησιμοποιούνται και άλλες μέθοδοι όπως ηλεκτροχημικές, φυγοκεντρικές, μικροθερμιδομετρικές και άλλες. Oι μετρήσεις, με ηλεκτρονικούς υπολογιστές, μετατρέπονται σε μονάδες ενζυμικής δραστικότητας ή άλλη παράμετρο που εξαρτάται απ' αυτήν. Mε την χρήση των ακινητοποιημένων ενζύμων μπορούν να ξεπεραστούν ορισμένα προβλήματα των ενζυμικών μεθόδων. Aυτά, λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης, δεν είναι ευαίσθητα στους αναστολείς, έχουν μεγαλύτερη σταθερότητα και επιτρέπουν την ξαναχρησιμοποίησή τους. Tα ακινητοποιημένα ένζυμα, σε συνδυασμό με ηλεκτροχημικές τεχνικές, βρίσκουν ιδιαίτερη εφαρμογή στην αυτοματοποίηση των ενζυμικών 23