ΚΟΛΟΒΑΚΤΗΡΙΟΕΙΔΗ ΕΝΤΕΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΚΟΛΟΒΑΚΤΗΡΙΟΕΙΔΗ ESCHERICHIA COLI

Transcript

1 ΚΟΛΟΒΑΚΤΗΡΙΟΕΙΔΗ ΕΝΤΕΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΚΟΛΟΒΑΚΤΗΡΙΟΕΙΔΗ ESCHERICHIA COLI 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα κολοβακτηριοειδή (coliforms) συνιστούν μια ειδική ομάδα της οικογένειας των Eντεροβακτηριοειδών (Enterobacteriaceae). Είναι αερόβια και προαιρετικά αναερόβια Gram βακτήρια και χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να ζυμώνουν τη λακτόζη, με παραγωγή οξέος και αερίου. Η παρουσία τους στα τρόφιμα υποδηλώνει, ως ένα βαθμό, μόλυνση του τροφίμου, άμεσα ή έμμεσα, με το εντερικό περιεχόμενο ανθρώπου ή ζώων. Κατά συνέπεια, το τρόφιμο περιέχει, ενδεχομένως και άλλους μικροοργανισμούς εντερικής προέλευσης ίσως και παθογόνους (Salmonella, Shigella, ιούς εντερικής προέλευσης κ.λπ.). Επειδή καταστρέφονται με ήπια θερμική επεξεργασία, αφυδάτωση ή κατάψυξη, η παρουσία τους στα επεξεργασμένα τρόφιμα οφείλεται σε επιμόλυνση. Επομένως, τα κολοβακτηριοειδή αποτελούν δείκτη των συνθηκών υγιεινής, που επικρατούν στη διάρκεια της επεξεργασίας των τροφίμων και της εν γένει υγιεινής τους κατάστασης. Επίσης, τα κολοβακτηριοειδή, είναι δυνατόν να προκαλέσουν αλλοιώσεις στα τρόφιμα διότι : αναπτύσσονται σε μεγάλο αριθμό υποστρωμάτων, χρησιμοποιούν σαν πηγή ενέργειας μεγάλο αριθμό υδατανθράκων και άλλων οργανικών ενώσεων, συνθέτουν, αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες από 10 ο μέχρι 46 ο C, προκαλούν ζύμωση των σακχάρων και παράγουν μεγάλη ποσότητα οξέος και αερίου, παράγουν ανεπιθύμητες οσμές στα τρόφιμα. Οι αντιπρόσωποι των κολοβακτηριοειδών ανήκουν στα γένη Escherichia, Enterobacter, Citrobacter και Klebsiella. Το είδος Escherichia coli (τύπος Ι) προέρχεται σταθερά από τον εντερικό σωλήνα, όπου σαπροφυτεί και πολλαπλασιάζεται. Είναι ο πρώτος, σε σειρά συχνότητας, μικροοργανισμός, που βρίσκεται μέσα στα κόπρανα και αποτελεί δείκτη εντερικής μόλυνσης των τροφίμων, πολύ ευαίσθητο και ειδικό. Σχεδόν το 100% των στελεχών του προκαλούν ζύμωση της λακτόζης, με παραγωγή αερίου και ινδόλης στους 44,5 o +/- 0,2 o C. Το γένος Cloacae (Enterobacter) βρίσκεται σπάνια ή δεν βρίσκεται καθόλου στα κόπρανα, θεωρείται σαν φυσιολογικός φιλοξενούμενος των φυτών και γι αυτό η παρουσία του στα τρόφιμα και το νερό δεν σημαίνει, πάντοτε, μόλυνση από κόπρανα. Το γένος Citrobacter θεωρείται σαν φυσιολογική χλωρίδα του εδάφους. Οι Erwinia, Serratia, και Aeromonas δεν θεωρούνται εντερικής προέλευσης. Το γένος Klebsiella βρίσκεται στα κόπρανα σε αναλογία 45% και είναι ο δεύτερος, σε σειρά συχνότητας, μικροοργανισμός, που βρίσκεται στα

2 κόπρανα. Απομονώνεται επίσης από τα φυτά, όπου αποτελεί, άλλωστε, μέρος της μικροβιακής χλωρίδας τους. Ασφαλέστερα, βέβαια, η Escherichia coli ταξινομείται με της δοκιμές I M Vi C *, οπότε, εφ όσον ανταποκρίνεται στο αποτέλεσμα + + (τύπος E. coli I) και + (τύπος E. coli II), θεωρείται ως εντερικής προέλευσης. Γενικά και μετά από τα παραπάνω, εκτός από το κολοβακτηρίδιο του εντέρου (Escherichia coli), η παρουσία των υπόλοιπων κολοβακτηριοειδών στα τρόφιμα ή το νερό, δεν μπορεί να χρησιμεύσει σαν απόλυτη, αλλά μόνο σαν πιθανή ένδειξη εντερικής μόλυνσης, γιατί δεν έχει μελετηθεί εντελώς η οικολογία τους και δεν είναι γνωστή η ικανότητα πολλαπλασιασμού τους μέσα στο πεπτικό σύστημα του ανθρώπου και των ζώων και δεν είναι οι αποκλειστικοί φιλοξενούμενοι αυτού του συστήματος. 2. ΑΡΙΘΜΗΣΗ ΚΟΛΟΒΑΚΤΗΡΙΟΕΙΔΩΝ ΚΑΙ ESCHERICHIA COLI Η αρίθμηση των κολοβακτηριοειδών, καθώς και των εντερικής προέλευσης κολοβακτηριοειδών και της E. coli I, μπορεί να γίνει με περισσότερες από μία μεθόδους και με τη χρήση διαφορετικών συνδυασμών θρεπτικών υποστρωμάτων. Επειδή όμως μόνο η θετικότητα στη δοκιμή κολοβακτηριοειδών είναι δυνατόν να υποδηλώνει θετικότητα σε εντερικής προέλευσης κολοβακτηριοειδή και E. coli, η μεθοδολογία ανίχνευσης αρίθμησης εξελίσσεται σε συνεχόμενα στάδια. Για το λόγο αυτό, εφόσον επιδιώκεται η εξαγωγή αποτελεσμάτων, τόσο για κολοβακτηριοειδή όσο και για εντερικής προέλευσης κολοβακτηριοειδή ή E. coli, πρέπει να επιλέγεται η μέθοδος των πολλαπλών σωλήνων (μέθοδος MPN). 2.1.Απαιτούμενα υλικά για την εργαστηριακή άσκηση 1. Αραιωτικό υγρό 2. McConkey Broth * 3. Brilliant Green Lactose Bile Broth 2% (BGLB Broth) ** 4. E.C. Broth *** 5. Πεπτονούχος φυσιολογικός ορός (Peptone Water)**** * I = Indole test, M = Methyl red test, V = Voges Proskauer test, C = Citrate utilization test, (IMViC)

3 2.2. Μέθοδος Πολλαπλών Σωλήνων ή Μέθοδος MPN ( Most Probable Number Method) Το δείγμα που πρόκειται να εξεταστεί, προετοιμάζεται, όπως έχει ήδη αναφερθεί στο κεφάλαιο για την Ο.Μ.Χ Κολοβακτηριοειδή Α. Προκαταρκτική δοκιμή 1. Από τις δεκαδικές αραιώσεις που προετοιμάζονται, μέσα σε χρονικό διάστημα 15 min, ενοφθαλμίζεται τριπλή ή πενταπλή σειρά σωλήνων, που περιέχουν ένα από τα διαθέσιμα υγρά υποστρώματα ανάπτυξης (Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%). 2. Από κάθε αραίωση ενοφθαλμίζονται 3 ή 5 σωλήνες με 1,0 ml ο καθένας. Προκειμένου για υγρό τρόφιμο, ενοφθαλμίζονται σωλήνες και από το μη αραιωμένο δείγμα. Εάν εξετάζεται νερό, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί ενοφθάλμισμα 10,0 ml, αλλά ο ζωμός (BGLBB) πρέπει να είναι διπλής συγκέντρωσης. 3. Η επώαση γίνεται στους 35 +/- 0,5 o C, για 24 και 48 +/- 2h. 4. Θετικοί θεωρούνται οι σωλήνες που παρουσιάζουν ανάπτυξη και συλλογή αερίου στο σωληνίσκο durham. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι : α. η παρουσία φυσαλίδας αέρα μέσα στο σωληνίσκο συλλογής αερίων δεν πρέπει να συγχέεται με την παραγωγή αερίου και β. όταν ο όγκος του αερίου είναι μικρότερος από το 1/10 του όγκου του σωληνίσκου, η δοκιμή θεωρείται αμφίβολη. Κατόπιν, σημειώνονται οι θετικοί σωλήνες από κάθε αραίωση και υπολογίζεται ο προκαταρκτικός πληθυσμός ΜΡΝ κολοβακτηριοειδών,μεβάση τους πίνακες McCrady.

4

5

6 B. Επιβεβαιωτική δοκιμή 1. Από τους θετικούς σωλήνες της προκαταρκτικής δοκιμής γίνεται ο ενοφθαλμισμός νέων σωλήνων με ζωμό BGLB ή McConkey (προτιμότερο είναι να μη χρησιμοποιείται ο ίδιος ζωμός της προκαταρκτικής δοκιμής). 2. Οι σωλήνες επωάζονται στους 35 o +/- 0,5 ο C, για 24 +/- 2h. 3. Σημειώνονται οι θετικοί σωλήνες, συγκρίνονται με το αποτέλεσμα της προκαταρκτικής δοκιμής και με βάση του πίνακες McCrady υπολογίζεται ο αριθμός MPN κολοβακτηριοειδών ανά g ή ml τροφίμου Εντερικής προέλευσης κολοβακτηριοειδή (fecal coliforms) E. coli 1. Από κάθε θετικό σωλήνα της επιβεβαιωτικής ή της προκαταρκτικής δοκιμής ενοφθαλμίζονται σωλήνες, που περιέχουν E.C. Broth ή Peptone Water, αντίστοιχα. 2. Οι σωλήνες τοποθετούνται σε υδατόλουτρο με κυκλοφορητή, θερμοκρασίας : 44,5 o +/- 0,2 o C, αν το εξεταζόμενο δείγμα είναι νερό ή αλιεύματα ή 45,5 o +/- 0,2 ο C, για τα άλλα τρόφιμα και επωάζονται για 24 +/- 2h. Ο χρόνος αυτός μπορεί να παραταθεί σε 48 +/- 2h, όμως αυξάνεται έτσι ο αριθμός των προσδιοριζόμενων κολοβακτηριοειδών εντερικής προέλευσης. Η στάθμη του νερού στο υδατόλουτρο πρέπει να υπερκαλύπτει τη στάθμη του υποστρώματος εντός των σωλήνων, η δε θερμοκρασία του, είναι απαραίτητο να παραμείνει σταθερή σε όλη τη διάρκεια της επώασης. Αν εξετάζεται μεγάλος αριθμός δειγμάτων, ταυτόχρονα, από διαφορετικά τρόφιμα, τότε η επώαση μπορεί να πραγματοποιηθεί στους 45,0 o +/- 0,2 ο C. 2. Μετά την επώαση, ελέγχονται οι σωλήνες, που περιέχουν το E.C. Broth, για τυχόν ανάπτυξη και συλλογή αερίου. Σημειώνονται οι θετικοί σωλήνες και το αποτέλεσμα εκφράζεται, με βάση τους πίνακες McCrady, ως αριθμός MPN εντερικής προέλευσης κολοβακτηριοειδών. 3. Στους σωλήνες με Peptone Water πραγματοποιείται η δοκιμή ινδόλης. Θετικότητα στη δοκιμή ινδόλης και ανάπτυξη στο θρεπτικό υπόστρωμα E.C. Broth υποδηλώνει θετικότητα του αντίστοιχου σωλήνα στη δοκιμή κολοβακτηριοειδών για Ε. coli / g ή ml, με βάση τους πίνακες McCrady.

7 2.2.3 Υπολογισμός αριθμού MPN ( Most Probable Number) Ο υπολογισμός του αριθμού MPN κολοβακτηριοειδών γίνεται με τη βοήθεια των πινάκων McCrady. Οι πίνακες αυτοί δίνουν, με βάση των αριθμό των θετικών σωλήνων που προκύπτουν από τρεις διαδοχικές αραιώσεις, πενταπλής ή τριπλής σειράς σωλήνων, ένα πιθανό πληθυσμό κολοβακτηριοειδών, ο οποίος, στατιστικώς, είναι ο περισσότερο πιθανός αριθμός κολοβακτηριοειδών, που περιέχονται στο εξετασθέν δείγμα. Οι κυριότερες περιπτώσεις που μπορούν να παρουσιαστούν σε πενταπλή σειρά σωλήνων, δίνονται στον πίνακα 1, που ακολουθεί. Η ορθή χρήση των πινάκων είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τον υπολογισμό του πληθυσμού των κολοβακτηριοειδών ενός δείγματος. Για το σκοπό αυτό, έχουν θεσπισθεί ορισμένοι κανόνες, οι οποίοι και αναφέρονται πιο κάτω. ΠΙΝΑΚΑΣ 1: Παραδείγματα επιλογής θετικών σωλήνων για τον προσδιορισμό του αριθμού MPN, σε πενταπλή σειρά σωλήνων. α/α Ενοφθαλμισμός 10 ml 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml Κωδικός Αριθμός MPN/100 ml 1 5/5 * 3/5 * 1/5 * - - 5, 3, /5 * 3/5 * - * - - 4, 3, /5 5/5 * 2/5* 0/5* 0/5 5, 2, /5 * 2/5 * 1/5 * 1/5 * 0/5 5, 2, /5 5/5 5/5 * 5/5 * 5/5 * 5, 5, 5 > /5 * 1/5 * 0/5 * 0/5 0/5 0,1, /5 0/5 0/5 0/5 0/5 0, 0, 0 < 2 1. Εάν χρησιμοποιήθηκαν μόνο 3 αραιώσεις, τότε ο τριψήφιος αριθμός σχηματίζεται από τους θετικούς σωλήνες των τριών αραιώσεων (παράδειγμα 1, του πίνακα 1). 2. Εάν χρησιμοποιήθηκαν μόνο 2 αραιώσεις, τότε ο τρίτος αριθμός θεωρείται ως μηδέν. Αυτό όμως πρέπει να αποφεύγεται, γιατί οδηγεί σε σφάλμα υπολογισμού, εάν υπάρχουν θετικοί σωλήνες και από τις δύο αραιώσεις που χρησιμοποιήθηκαν (παράδειγμα 2, του πίνακα 1). 3. Όταν χρησιμοποιούνται περισσότερες από τρεις αραιώσεις, τότε πρέπει να επιλεγούν 3 συνεχείς αραιώσεις, που οι θετικοί τους σωλήνες θα σχηματίσουν τον κωδικό αριθμό. Η επιλογή γίνεται με

8 βάση την αρχή ότι, το πρώτο ψηφίο του αριθμού σχηματίζεται από τον αριθμό των θετικών σωλήνων, εκείνης της αραίωσης, στην οποία όλοι οι σωλήνες ή η πλειοψηφία τους είναι θετικοί, ενώ το τρίτο ψηφίο, σχηματίζεται από τους θετικούς σωλήνες της αραίωσης, στην οποία όλοι οι σωλήνες ή η πλειοψηφία τους είναι αρνητικοί (παράδειγμα 3, του πίνακα 1). 4. Εάν αντιμετωπίζεται η περίπτωση του παραδείγματος 4 του πίνακα 1, τότε ο θετικός σωλήνας της τελευταίας αραίωσης προστίθεται στο θετικό της προηγούμενης και ο κωδικός αριθμός σχηματίζεται ως 5, 2, 2. (5, 2, 1+1). 5. Εάν όλοι οι σωλήνες των τριών τελευταίων αραιώσεων είναι θετικοί, τότε το αποτέλεσμα εκφράζεται ως μεγαλύτερο από 1.600, επί το βαθμό της μεσαίας αραίωσης (παράδειγμα 5, του πίνακα 1). 6. Εφόσον ο κωδικός αριθμός σχηματίζεται από αραιώσεις μεγαλύτερες Από αυτές που δίνει ο πίνακας, τότε ο αριθμός MPN του πίνακα πολλαπλασιάζεται επί το συντελεστή της μεσαίας αραίωσης. Όταν χρησιμοποιούμε τριάδες σωλήνων, επιλέγονται τρεις διαδοχικές αραιώσεις και σχηματίζεται ένας τριψήφιος αριθμός, όπως στις πεντάδες. Χρησιμοποιώντας τον πίνακα McCrady για τις τριάδες σωλήνων, παίρνουμε έναν αριθμό, που είναι ο πλέον πιθανός αριθμός κολοβακτηριοειδών, με την προϋπόθεση ότι έχουμε χρησιμοποιήσει τις ίδιες αραιώσεις του πίνακα. ΠΙΝΑΚΑΣ 2: Παραδείγματα επιλογής θετικών σωλήνων για τον προσδιορισμό του αριθμού MPN, σε τριπλή σειρά σωλήνων. α/α Ενοφθαλμισμός 10 ml 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml Κωδικός Αριθμός MPN/100 ml 1 3/3 * 2/3 * 1/3 * - - 3, 2, /3 * 1/3 * - * - - 2, 1, /3 3/3 * 2/3* 0/3* 0/3 3, 2, /3 * 2/3 * 1/3 * 1/3 * 0/3 2, 1, /3 3/3 3/3 * 3/3 * 3/3 * 3, 3, 3 > /3 * 1/3 * 0/3 * 0/3 0/3 0, 1, /3 0/3 0/3 0/3 0/3 0, 0, 0 < 3

9 Επιλέγονται εκείνες οι τριάδες σωλήνων, από τις τρεις διαδοχικές αραιώσεις, ώστε να πληρούνται οι παρακάτω προϋποθέσεις: 1. Η μεγαλύτερη αραίωση να περιέχει ένα τουλάχιστον αρνητικό σωλήνα (χωρίς ανάπτυξη, αέριο και ινδόλη), η δε μικρότερη αραίωση να περιέχει όλους τους σωλήνες θετικούς. 1. Εάν χρησιμοποιήθηκαν μόνο τρείς αραιώσεις, τότε ο τριψήφιος αριθμός σχηματίζεται από τους θετικούς σωλήνες των τριών αραιώσεων ( παράδειγμα 1, του πίνακα 2 ). 2. Εάν χρησιμοποιήθηκαν μεγαλύτερες αραιώσεις, τότε λαμβάνουμε υπόψη ποιες διαδοχικές αραιώσεις έχουμε επιλέξει και στον αριθμό που προκύπτει από τον πίνακα, προσθέτουμε τόσα μηδενικά, όσα της προηγούμενης αραίωσης. Παράδειγμα Χρησιμοποιώντας τις αραιώσεις 10-1, 10-2 και 10-3, το αποτέλεσμα, στο του πίνακα 3, είναι 1100 μικρόβια / g ή ml. Αν έχουμε επιλέξει μεγαλύτερες αραιώσεις π.χ. 10-3, 10-4 και 10-5, το αποτέλεσμα είναι 1100Χ10 2.

10 ΠΙΝΑΚΑΣ 3. Πίνακας McCrady για τριάδες σωλήνων Θετικοί σωλήνες στους 3 1 η τριάδα 0,1 ml 2 η τριάδα 0,01mL 3 η τριάδα 0,001 ml M.P.N./ g ή ml Θετικοί σωλήνες στους 3 1 η τριάδα 0,1 ml 2 η τριάδα 0,01 ml 3 η τριάδα 0,001 ml M.P.N./ g ή ml >1100

11 ΠΙΝΑΚΑΣ 4. Πίνακας McCrady για πεντάδες σωλήνων Θετικοί σωλήνες στους 5 1 η πεντάδα 0,1mL 2 η πεντάδα 0,01 ml 3 η πεντάδα 0,001 ml M.P.N./ g ή ml Θετικοί σωλήνες στους 5 1 η πεντάδα 0,1 ml 2 η πεντάδα 0,01 ml 3 η πεντάδα 0,001 ml M.P.N./ g ή ml < >1600

12 * McConkey Broth Peptone 20,0 g Lactose 10,0 g Bile Salts 5,0 g Sodium Chloride 5,0 g Neutral Red ή 0,075g Bromocresol Purple 0,01 g D.W. q.s.p. 1000,0 ml ph 7,4 +/- 0,2 Αποστείρωση στους 121 o C, για 15 min. ** Brilliant Green Lactose Bile Broth 2% Peptone 10,0 g Lactose 10,0 g Ox Bile 20,0 g Brilliant Green 0,0133 g D.W. q.s.p. 1000,0 ml ph 7,2 +/- 0,2 Αποστείρωση στους 121 o C, για 10 min. *** E.C. Broth Tryptone Lactose Bile Salts Mono-potassium Phosphate Di-potassium Phosphate D.W. q.s.p. 20,0 g 5,0 g 1,5 g 4,0 g 1,5 g 1000,0 ml ph 6,9 +/- 0,2 Αποστείρωση στους 121 o C, για 15 min. **** Peptone Water Peptone Sodium Chloride D.W. q.s.p. 10,0 g 5,0 g 1000,0 ml ph 7,2 +/- 0,2 Αποστείρωση στους 121 o C, για 15 min.

13 ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Για την ανάλυση ενός μόνο δείγματος, που περιλαμβάνει μία μόνο κατηγορία μικροβίων, με την Μέθοδο των Πολλαπλών Σωλήνων (Μέθοδος του Περισσότερο Πιθανού Αριθμού - ΜPΝ ), απαιτούνται : 1. ένας ομογενοποιητής τύπου stomacher, για την κατάλληλη κατεργασία του δείγματος (μόνιμος εξοπλισμός) 2. μία αποστειρωμένη σακούλα, για τη ζύγιση και στη συνέχεια ομογενοποιήση του δείγματος (αναλώσιμο υλικό) 3. ένας ζυγός ακριβείας ( μόνιμος εξοπλισμός ) 4. λύχνοι εργαστηριακού τύπου (μόνιμος εξοπλισμός) 5. νυστέρι, σπάτουλα ή άλλα παρεμφερή σύνεργα, για την κοπή του δείγματος και στη συνέχεια τη μεταφορά του στη σακούλα του ομογενοποιητή (μόνιμος εξοπλισμός / αναλώσιμο υλικό) 6. φιάλες διαδοχικών αραιώσεων, με κοχλιωτό πώμα και κατάλληλο 1. αραιωτικό υγρό, για την προετοιμασία των αναγκαίων αραιώσεων, κατά περίπτωση, (μόνιμος εξοπλισμός / αναλώσιμο υλικό) 7. αποστειρωμένοι δοκιμαστικοί σωλήνες με πώμα, σε ανάλογο αριθμό προς τον βαθμό αραίωσης του δείγματος και την χρησιμοποιούμενη παραλλαγή στη μέθοδο (αναλώσιμο υλικό) 8. σωληνίσκοι durham, για την συλλογή του παραγόμενου αερίου, κατά περίπτωση (αναλώσιμο υλικό) 9. στατό, για την στήριξη των δοκιμαστικών σωλήνων (μόνιμος εξοπλισμός) 10. σιφώνια, κατάλληλα για την ανάπτυξη των αναγκαίων δεκαδικών και διαδοχικών αραιώσεων (αναλώσιμο υλικό) 11.σιφώνια, κατάλληλα για τον ενοφθαλμισμό των σωλήνων (αναλώσιμο υλικό) 12.αναγκαία ποσότητα από το κατάλληλο, κατά περίπτωση, θρεπτικό υπόστρωμα (αναλώσιμο υλικό)

14 Για την ανάλυση αυτή έχει προηγηθεί η αποστείρωση των θρεπτικών υποστρωμάτων, εντός των δοκιμαστικών σωλήνων και του αραιωτικού υγρού με υγρή θερμότητα, στον ατμοκλίβανο ( μόνιμος εξοπλισμός ). Νυστέρια, σπάτουλες και άλλα παρεμφερή σύνεργα, καθώς και το εν γένει γυάλινο υλικό, αποστειρώνονται με ξηρή θερμότητα, στον ξηροκλίβανο (μόνιμος εξοπλισμός). Οι δεκαδικές αραιώσεις του δείγματος καθώς και ο ενοφθαλμισμός των σωλήνων πραγματοποιούνται σε ειδικά αποστειρωμένο χώρο, τον θάλαμο νηματικής ροής laminar flow cabinet (μόνιμος εξοπλισμός ) ή παρουσία φλόγας λύχνου. Τα θρεπτικά υποστρώματα, πριν τον ενοφθαλμισμό τους, θερμοστατούνται εντός κατάλληλα ρυθμισμένου υδατόλουτρου ( μόνιμος εξοπλισμός ). Μετά τη ολοκλήρωση της όλης διαδικασίας οι σωλήνες επωάζονται σε κατάλληλα ρυθμισμένο επωαστικό κλίβανο ( μόνιμος εξοπλισμός ). Ο υπολογισμός του ΜPN γίνεται με τη βοήθεια των ειδικών πινάκων McCrady, αναλόγως της χρησιμοποιούμενης τριπλής ή πενταπλής σειράς σωλήνων (βλέπε σελ. 38 & 39) και με βάση των κωδικό αριθμό των ευρεθέντων θετικών σωλήνων.