Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΗ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΤΗΣ ΑΤΡΗΣΙΑΣ ΣΤΙΣ ΩΟΘΗΚΕΣ ΤΗΣ ΣΑΡΔΕΛΑΣ, Sardina pilchardus

Transcript

1 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΗ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΤΗΣ ΑΤΡΗΣΙΑΣ ΣΤΙΣ ΩΟΘΗΚΕΣ ΤΗΣ ΣΑΡΔΕΛΑΣ, Sardina pilchardus Τσιγγάνης Μ. 1, Γκάνιας Κ. 1, Nunes C. 2 1 Τμήμα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, mtsingan@bio.auth.gr 2 Inst.Nacional de Recursos Biologicos, INRB-IPIMAR, Lisboa, Portugal, cnunes@ipimar.pt Περίληψη Στην παρούσα εργασία εξετάζεται η επίδραση της θερμοκρασίας της θάλασσας στη συχνότητα εμφάνισης ατρησίας στις ωοθήκες τις σαρδέλας του Ατλαντικού, Sardina pilchardus. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα επιφανειακής θερμοκρασίας της θάλασσας, SST, προερχόμενα από ανάλυση δορυφορικών εικόνων, ενώ τα ιστολογικά δεδομένα της ατρησίας προήλθαν από 4 ετήσιες εκτιμήσεις της βιομάζας του αποθέματος της σαρδέλας του Β. Ατλαντικού με τη μέθοδο της ημερήσιας παραγωγής αβγών. Η επίδραση της SST τόσο στο ποσοστό των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών όσο και στο ποσοστό των θηλυκών με ατρησία διερευνήθηκε με τη χρήση της μεθόδου μονομεταβλητής ανάλυσης πηλίκου. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι η SST είχε παρόμοια επίδραση τόσο στο ποσοστό των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών, όσο και στο ποσοστό εμφάνισης της ατρησίας με τη μέγιστη και την ελάχιστη προτίμηση αντίστοιχα να παρουσιάζεται μεταξύ 14,3-15,5 0 C. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι εκτός του ρόλου της ως ρυθμιστή της αναπαραγωγικής περιόδου, η θερμοκρασία ελέγχει επίσης το αναπαραγωγικό δυναμικό του πληθυσμού μέσω της ρύθμισης της συχνότητας εμφάνισης της ατρησίας. Λέξεις κλειδιά: γονιμότητα, πολλαπλοί αποθέτες, δορυφορικές εικόνες, βιολογική ωκεανογραφία THE EFFECT OF TEMPERATURE ON THE PREVALENCE OF OVARIAN ATRESIA IN SARDINE, Sardina pilchardus Tsinganis M. 1, Ganias K. 1, Nunes C. 2 1 School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, mtsingan@bio.auth.gr 2 Inst.Nacional de Recursos Biologicos, INRB-IPIMAR, Lisboa, Portugal, cnunes@ipimar.pt Abstract The present study examines the effect of temperature on the prevalence of atresia in the ovaries of the Atlantic sardine, Sardina pilchardus. For that purpose the sea surface temperature, SST, was used according to data derived from the analysis of satellite imagery, whilst histological data on atresia derived from 4 annual daily egg production method surveys for the estimation of the spawning biomass of the N Atlantic sardine. The effect of SST on the fraction of reproductively active females and the prevalence of atresia within the reproductively active population was assessed by means of singleparameter quotient analysis. The analysis showed that SST had similar effect on both parameters whilst maximum quotient values of reproductive activity and minimum quotient values of atretic prevalence occurred between 14,3-15,5 0 C. These results suggest that besides the role of SST as trigger of the productive period, temperature also controls the reproductive potential of the population through regulating the prevalence of ovarian atresia. Keywords: fecundity, multiple spawners, satellite imagery, biological oceanography 1. Εισαγωγή Αν και η σχέση ανάμεσα στις ωκεανογραφικές παραμέτρους και τη δυναμική των πληθυσμών των ψαριών (π.χ. θνησιμότητα, μεταναστεύσεις, στρατολόγηση) έχει μελετηθεί ευρέως, λίγα είναι γνωστά για τον ακριβή τρόπο με τον οποίο οι παράμετροι αυτές επιδρούν στη δυναμική της αναπαραγωγής. Η αναπαραγωγική μεταβλητή της οποίας η σχέση με ωκεανογραφικούς παράγοντες έχει μελετηθεί περισσότερο είναι η περίοδος αναπαραγωγής [π.χ. η υπόθεση της σύμπτωσης (match-mismatch hypothesis) του Cushing κι επιβεβαίωση αυτής από τους Platt et al. (2003)]. Σε ότι αφορά όμως τις υπόλοιπες αναπαραγωγικές μεταβλητές, όπως η γονιμότητα και η συχνότητα ωοτοκίας, είναι ελάχιστα τα αποτελέσματα που τις συνδέουν με

2 ωκεανογραφικές παραμέτρους (π.χ. Ganias 2009), ενώ υπάρχουν μεταβλητές όπως η ατρησία για τις οποίες τα δεδομένα είναι σχεδόν ανύπαρκτα. Η ατρησία χαρακτηρίζεται από μία σειρά βιοχημικών, κυτταρικών και μορφολογικών διεργασιών που επάγονται όταν ένα ωοκύτταρο δεν ολοκληρώνει την ανάπτυξή του ως την ωοτοκία, οι οποίες οδηγούν σε αποδιοργάνωση και συρρίκνωση ολόκληρου των ωοθυλακίου. Αν και η ατρησία έχει μελετηθεί λεπτομερώς σε ιστομορφολογικό και σε φυσιολογικό επίπεδο (π.χ. Ganias et al. 2003, Corriero et al. 2011) λίγα είναι γνωστά για τη δυναμική της και τον τρόπο με τον οποίο δρα στη γονιμότητα των ψαριών. Η ατρησία έχει κυρίως μελετηθεί σε πληθυσμούς ψαριών με καθορισμένο πρότυπο γονιμότητας (determinate spawners, Kurita et al. 2003) διότι η ακριβής ποσοτικοποίησή της χρησιμοποιείται στη διόρθωση της δυνητικής ετήσιας γονιμότητας (potential annual fecundity) η οποία με τη σειρά της χρησιμοποιείται σε εκτιμήσεις αναπαραγόμενης βιομάζας. Από την άλλη, οι εκτιμήσεις της ατρησίας στους πληθυσμούς με ακαθόριστη γονιμότητα (indeterminate spawners) περιορίζονται μόνο στα φαινόμενα μαζικής ατρησίας κατά την παύση της περιόδου ωοτοκίας (Kjesbu 2009), ενώ υπάρχουν ελάχιστα δεδομένα για το ρόλο της και τους παράγοντες που την προκαλούν μέσα στον αναπαραγωγικά ενεργό πληθυσμό (Kjesbu 2009). Στην παρούσα εργασία εξετάζεται η επίδραση της θερμοκρασίας της θάλασσας στη συχνότητα της ατρησίας της σαρδέλας του Ατλαντικού, Sardina pilchardus. H ανάλυση περιορίζεται στο ενήλικο κι αναπαραγωγικά ενεργό κλάσμα του πληθυσμού με σκοπό να μελετηθεί αν η θερμοκρασία επηρεάζει μέσω της ατρησίας τη δυνητική γονιμότητα της αναπαραγόμενης βιομάζας. 2. Υλικά και Μέθοδοι Δείγματα ενηλίκων ατόμων σαρδέλας συλλέχθηκαν ανοιχτά της Πορτογαλίας και του κόλπου της Cadiz κατά τα έτη 1997, 1999, 2002 και 2005 στο πλαίσιο της εκτίμησης της αναπαραγόμενης βιομάζας του Ατλαντο-Ιβηρικού αποθέματος της σαρδέλας με τη μέθοδο ημερήσιας παραγωγής αβγών, DEPM (Πίνακας 1). Αμέσως μετά τη σύλληψη, οι ωοθήκες των θηλυκών αφαιρούνταν και τοποθετούνταν σε πλαστικά μπουκάλια με διάλυμα φορμαλίνης 4%. Στο εργαστήριο, οι ωοθήκες υποβάλλονταν σε ιστολογική ανάλυση, η οποία περιλάμβανε έγκλιση σε παραφίνη και χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Οι ιστολογικές τομές εξετάζονταν μικροσκοπικά και γίνονταν καταγραφή του σταδίου ανάπτυξης των ωοκυττάρων, της παρουσίας κενών ωοθυλακίων και ατρησίας. Στην παρούσα εργασία εξετάζεται μόνο η ατρησία των λεκιθικών ωοκυττάρων. Αναπαραγωγικά ενεργά θεωρούνταν τα άτομα τα οποία είχαν τουλάχιστον μία ομάδα υγιών λεκιθικών ωοκυττάρων στις ωοθήκες τους. Πιν. 1: Στις παρενθέσεις αναφέρονται τα τυπικά σφάλματα. Έτος Περίοδος δειγματοληψιών SST ( C) Αριθμός καλάδων Ποσοστό αναπαραγωγικά ενεργού πληθυσμού Ποσοστό πληθυσμού χωρίς ατρησία Μήκος (cm) Μαρτ. 16,8 (0.01) 15 75,10 92,09 17,91 (0.14) Ιαν.-5 Φεβρ. 15,1 (0.02) 18 95,29 89,68 18,01 (0.10) Ιαν.-17 Φεβρ. 15,8 (0.01) 51 84,44 79,63 18,28 (0.07) Ιαν.-25 Φεβρ. 14,2 (0.01) 39 90,31 85,73 19,26 (0.06) Δεδομένα από δορυφορικές εικόνες επιφανειακής θερμοκρασίας της θάλασσας (sea surface temperature, SST) ελήφθησαν ως μέσες τιμές οκταημέρου σε χωρική ανάλυση 4km από τη βάση

3 δεδομένων AVHRR Pathfinder SST Version 5.0 ( Για την επεξεργασία των δορυφορικών εικόνων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό ανάλυσης εικόνας SeaDAS 6.2 ( σε περιβάλλον Linux. Αρχικά, τα νέφη και άλλες πηγές σφάλματος αφαιρέθηκαν με βάση τις τιμές του δείκτη ποιότητας overall quality flag (Kilpatrick et al. 2001). Μόνο pixel με τιμή του δείκτη από 4 έως 7 ελήφθησαν υπόψιν στις επακόλουθες αναλύσεις. Στη συνέχεια, έγιναν προβλέψεις των τιμών SST στις γεωγραφικές θέσεις των δειγματοληψιών με τη μέθοδο παρεμβολής αντιστρόφου βαρύνουσας απόστασης (inverse distance weighted interpolation). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πακέτο gstat (Pebesma 2004) στο περιβάλλον στατιστικής επεξεργασίας R (version , R Development Core Team 2010) και χρησιμοποιήθηκε δύναμη στάθμισης (weighting power) ίση με 2,2. Σε κάθε θηλυκό αντιστοιχήθηκε μια τιμή SST ανάλογα με την καλάδα στην οποία συλλέχθηκε. Η επίδραση της SST τόσο στο ποσοστό των ώριμων και αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών όσο και στο ποσοστό των ενεργών θηλυκών χωρίς ατρησία, διερευνήθηκε με τη χρήση της μεθόδου μονομεταβλητής ανάλυσης πηλίκου (single-parameter quotient analysis, van der Lingen et al. 2001). Ως ώριμα ορίστηκαν τα θηλυκά άτομα με μήκος μεγαλύτερο από 14,3cm, που αποτελεί τη μέση τιμή του μήκους πρώτης αναπαραγωγής του είδους για τον βορειοανατολικό Ατλαντικό και τη δυτική Μεσόγειο (Silva et al. 2006). O λόγος για τον οποίο η ανάλυση περιορίστηκε μόνο στα ώριμα θηλυκά ήταν για να αποφευχθούν τα τυχόν σφάλματα τόσο στο ποσοστό των αναπαραγωγικά ενεργών, όσο και στη συχνότητα της ατρησίας από τη μηομοιόμορφη δειγματοληψία των κλάσεων ηλικίας/μεγέθους στα χωροχρονικά στρώματα της μελέτης. Αρχικά, τα δεδομένα της SST διαιρέθηκαν σε ισομεγέθεις κλάσεις και σε κάθε κλάση υπολογίστηκε ο αριθμός των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών. Στη συνέχεια, οι αριθμοί αυτοί εκφράστηκαν ως ποσοστό επί του συνόλου των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών της μελέτης. Τέλος, οι τιμές των πηλίκων (quotients) υπολογίστηκαν διαιρώντας τα ποσοστά αυτά με τα αντίστοιχα ποσοστά των ώριμων θηλυκών που είχαν συλλεχθεί σε κάθε κλάση θερμοκρασίας. Με τον ίδιο τρόπο αναλύθηκαν και τα δεδομένα που αφορούσαν στο ποσοστό των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών χωρίς ατρησία. Τιμές των πηλίκων μεγαλύτερες από 1 εκφράζουν προτίμηση για τη αντίστοιχη κλάση θερμοκρασίας, ενώ τιμές μικρότερες από 1 εκφράζουν αποφυγή. Για να εκτιμηθεί η στατιστική σημαντικότητα της απόκλισης των πηλίκων από την τιμή 1, υπολογίστηκαν διαστήματα εμπιστοσύνης () σύμφωνα με τους Bernal et al. (2007). Το εύρος ανοχής ορίζεται ως το εύρος μη σημαντικής αποφυγής, ενώ το εύρος προτίμησης είναι το εύρος της στατιστικά σημαντικής προτίμησης. Οι τιμές των πηλίκων εξομαλύνθηκαν με τη χρήση κυλιόμενης διαμέσου (τριών ή πέντε σημείων) και κατασκευάστηκαν οι καμπύλες των πηλίκων (quotient curves). Η ανάλυση έγινε με το πακέτο shachar του Bernal (2005) στο λογισμικό R. 3. Αποτελέσματα και Συζήτηση Η SST στα σημεία των δειγματοληψιών κυμάνθηκε από 13,1 έως 17,3 C. Το 1997 και 2005 ήταν αντίστοιχα το θερμότερο και το ψυχρότερο έτος για την περίοδο της μελέτης, ενώ τα έτη 1999 και 2002 είχαν ενδιάμεσες τιμές θερμοκρασίας (Εικ. 1, Πιν. 1).

4 Εικ. 1: Προβλέψεις επιφανειακής θαλάσσιας θερμοκρασίας (SST) που προέκυψαν με τη μέθοδο παρεμβολής αντιστρόφου βαρύνουσας απόστασης. Οι προβλέψεις αφορούν στις περιόδους κάθε έτους που φαίνονται στον Πιν. 1. Με μαύρο σταυρό σημειώνονται οι γεωγραφικές θέσεις στις οποίες πραγματοποιήθηκαν οι δειγματοληψίες. Τα αποτελέσματα της μονομεταβλητής ανάλυσης πηλίκου έδειξαν ότι η SST είχε επίδραση τόσο στο ποσοστό των ώριμων θηλυκών ατόμων σαρδέλας που ήταν αναπαραγωγικά ενεργά, όσο και στο ποσοστό των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών χωρίς ατρησία. Οι καμπύλες των πηλίκων που κατασκευάστηκαν εμφάνισαν συνολικά παρόμοια μορφή (Εικ. 2), η οποία μπορεί να αναλυθεί σε τρία τμήματα (τμήματα Α, Β και Γ στην Εικ. 2). Στο τμήμα Α, τα θηλυκά εμφάνισαν αποφυγή του αντίστοιχου εύρους θερμοκρασίας (τιμές πηλίκων < 1), με την αποφυγή να γίνεται στατιστικά σημαντική για θερμοκρασίες χαμηλότερες από 13,7 C. Στατιστικά σημαντική προτίμηση εμφανίστηκε στο εύρος θερμοκρασίας 14,3 έως 15,5 C (τμήμα Β). Στο τμήμα Γ, με τιμές SST από 15,5 C και πάνω, οι τιμές των πηλίκων διατηρήθηκαν πάνω από την κρίσιμη τιμή 1, αλλά κάτω από τα όρια του άνω διαστήματος εμπιστοσύνης, εκφράζοντας μια μη σημαντική προτίμηση. Εξαίρεση αποτελεί το εύρος 16,6-17 C στην καμπύλη που αφορά στο ποσοστό των ώριμων θηλυκών που είναι αναπαραγωγικά ενεργά, στο οποίο εμφανίζεται επίσης μια στατιστικά σημαντική προτίμηση.

5 Εικ. 2: Καμπύλες πηλίκων του ποσοστού των ώριμων θηλυκών που ήταν αναπαραγωγικά ενεργά (πάνω) και του ποσοστού των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών που δεν εμφάνιζαν ατρησία των λεκιθικών ωοκυττάρων (κάτω) σε σχέση με την επιφανειακή θερμοκρασίας της θάλασσας (SST). Οι συνεχείς γραμμές δείχνουν τα πηλίκα που εκτιμήθηκαν και οι κόκκινες διακεκομμένες γραμμές τα διαστήματα εμπιστοσύνης. Τα ιστογράμματα δείχνουν τον αριθμό των ατόμων που συλλέχθηκαν σε κάθε κλάση θερμοκρασίας. Για την εξομάλυνση των καμπύλων χρησιμοποιήθηκε κυλιόμενη διάμεσος τριών (πάνω) και πέντε σημείων (κάτω). Τα παραπάνω αποτελέσματα ενισχύονται και από την ισχυρή συσχέτιση ανάμεσα στα πηλίκα των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών και τα αντίστοιχα πηλίκα των θηλυκών χωρίς ατρησία (συντελεστής συσχέτισης Pearson=0,93, p<0,001, Εικ. 3). Με την αύξηση της SST, τα ποσοστά τόσο των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών, όσο και των θηλυκών χωρίς ατρησία μεταβαίνουν από χαμηλότερες προς υψηλότερες από το αναμενόμενο τιμές. Η μετάβαση φαίνεται να συμβαίνει στο εύρος 13,7-14,1 C, ενώ οι μέγιστες τιμές εμφανίζονται στο άνω όριο του εύρους προτίμησης, δηλαδή στους 15,1-15,5 C.

6 Εικ. 3: Διάγραμμα της σχέσης ανάμεσα στα πηλίκα των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών και τα αντίστοιχα πηλίκα των θηλυκών χωρίς ατρησία. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας δείχνουν ότι η θερμοκρασία της θάλασσας δρα όχι μόνο στο να καθορίζει αν τα ενήλικα θηλυκά θα είναι ή όχι αναπαραγωγικά ενεργά, αλλά και στο εάν τα τελευταία θα έχουν ή όχι ατρησία στις ωοθήκες τους. Όπως έχει ήδη αναφερθεί στην εισαγωγή, στους πληθυσμούς ψαριών με ακαθόριστη γονιμότητα η ατρησία θεωρείται ότι παίζει κυρίως ρόλο στην απορρόφηση της μάζας και της ενέργειας των ομάδων των ωοκυττάρων που δεν αποβάλλονται κατά το τέλος της περιόδου ωοτοκίας. Παρόλα αυτά, στην παρούσα έρευνα φαίνεται ότι ακόμη και σε έναν ακαθόριστο αποθέτη όπως η σαρδέλα η ατρησία εμφανίζεται στον αναπαραγωγικά ενεργό πληθυσμό με μία συχνότητα η οποία μπορεί να ξεπερνά το 20%. Η συχνότητα αυτή φαίνεται ότι σχετίζεται με τη θερμοκρασία της θάλασσας και μάλιστα με τον ίδιο ακριβώς τρόπο με τον οποίο η τελευταία σχετίζεται με το ποσοστό των ενεργών θηλυκών εφόσον τόσο το μέγιστο ποσοστό των ενεργών όσο και η μικρότερη συχνότητα ατρησίας εμφανίζονται μεταξύ 14,3 έως 15,5 C. Οι τιμές αυτές συμπίπτουν ακριβώς με τις τιμές των θερμοκρασιακών προτιμήσεων του ίδιου αποθέματος σαρδέλας που είχαν προταθεί από τους Stratoudakis et al. (2007). Με άλλα λόγια η θερμοκρασία φαίνεται να επηρεάζει μέσω της ατρησίας, τη δυναμική ωοτοκίας του αναπαραγωγικά ενεργού πληθυσμού μειώνοντας την παραγωγή αβγών στις περιοχές εκτός του θερμοκρασιακού εύρους προτίμησης της αναπαραγωγής. 4. Βιβλιογραφικές Αναφορές Bernal, M., Shachar (R-package), Bernal, M., Stratoudakis, Y., Coombs, S., Angelico, M.M., Lago de Lanzós, A., Porteiro, C., Sagarminaga, Y., Santos, M., Uriarte, A., Cunha, E., Valdés, L. & Borchers, D., Sardine spawning off the European Atlantic coast: characterization of and spatio-temporal variability in spawning habitat. Progress in Oceanography, 74 (2-3): Corriero, A., Zupa, R., Bello, G., Mylonas, C.C., Deflorio, M., Genovese, S., Basilone, G., Buscaino, G., Buffa, G., Pousis, C., De Metrio, G. & Santamaria, N., Evidence that severe acute stress and starvation induce rapid atresia of ovarian vitellogenic follicles in Atlantic bluefin tuna, Thunnus thynnus (L.) (Osteichthyes: Scombridae). Journal of Fish Diseases, 34: Ganias, Κ., Linking sardine spawning dynamics to environmental variability. Estuarine Coastal and Shelf Science, 84: Ganias, K., Somarakis, S., Koutsikopoulos, C., Machias, A. & Theodorou, A., Ovarian atresia in the Mediterranean sardine, Sardina pilchardus sardina. J. Mar. Biol. Ass. U.K., 83: Kilpatrick, K.A., Podesta, G.P. & Evans, R., Overview of the NOAA/NASA advanced very high resolution radiometer Pathfinder algorithm for sea surface temperature and associated matchup database. Journal of Geophysical Research, 106:

7 Kurita, Y., Meier, S. & Kjesbu, O.S., Oocyte growth and fecundity regulation by atresia of Atlantic herring (Clupea harengus) in relation to body condition throughout the maturation cycle. J. Sea Res. 49: Pebesma, E.J., Multivariable geostatistics in S: the gstat package. Computers & Geosciences, 30(7): Platt, T., Fuentes-Yaco, C., & Frank, K. T., Spring algal bloom and larval fish survival. Nature, 423: Silva, A., Santos, M., Caneco, B., Pestana, G., Porteiro, C., Carrera, P. & Stratoudakis, Y., Temporal and geographic variability of sardine maturity at length in the northeastern Atlantic and the western Mediterranean. ICES Journal of Marine Science 63: Stratoudakis, Y., Coombs, S., Lago de Lanzos, A., Halliday, N., Costas, G., Caneco, B., Franco, C., Conway, D., Santos, M. B., Silva, A. & Bernal, M., Sardine (Sardina pilchardus) spawning seasonality in European waters of the northeast Atlantic. Marine Biology 152: van der Lingen, C.D., Hutchings, L., Merkle, D., van der Westhuizen, J.J. & Nelson, J., Comparative spawning habitats of anchovy (Engraulis capensis) and sardine (Sardinops sagax) in the southern Benguela upwelling ecosystem. p In: Spatial processes and Management of Marine Populations, G.H. Kruse, N. Bez, T. Booth, M. Dorn, S. Hills, R.N. Lipcius, D. Pelletier, C. Roy, S.J. Smith & D. Witherell (Eds), University of Alaska Sea Grant, AK-SG , Fairbanks, USA.