ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ Χa ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ Χa ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΠΑΝΤΕΛΗΣ ΑΡΖΟΓΛΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΦΑΚΑ ΑΝΘΗ Α.Ε.Μ.:553 ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ 1

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωµατική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχηµείας του τµήµατος Χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή κυρίου Π. Αρζόγλου. Μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραγόντων στην κινητική της παραγωγής α) της θροµβίνης και β) του παράγοντα Xa. Σε αυτό το σηµείο, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους αναπληρωτές καθηγητές κυρίους Θ. Γιαννακούρο και Κ. Κοτίνη, που µαζί µε τον κύριο Π. Αρζόγλου αποτελούν την τριµελή επιτροπή, για τις γνώσεις και τη βοήθεια που µου προσφέρθηκε από αυτούς κατά τη διάρκεια του µεταπτυχιακού. Ακόµη, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως, τον διδάκτορα Salar Adnan και την πτυχιακή φοιτήτρια Ευαγγελία αραή για την άψογη συνεργασία και την πολύτιµη βοήθεια τους και τέλος τους γονείς µου και τα αδέρφια µου για την υλική και ηθική στήριξη που µου παρείχαν όλο αυτό το διάστηµα, αλλά και για την ανεξάντλητη υποµονή και αγάπη που µου δείχνουν. 2

3 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΟ ΑΙΜΑ Η ζωή σε έναν πολυκύτταρο οργανισµό είναι άρρηκτα συνδεδεµένη µε ένα καλά οργανωµένο σύστηµα µεταφοράς που συµβάλλει σηµαντικά στη διατήρηση της οµοιόστασης του οργανισµού και ονοµάζεται κυκλοφορικό. Αυτό αποτελείται από το αίµα, την καρδιά και ένα δίκτυο από αιµοφόρα αγγεία. Τα τελευταία αποτελούνται από τις αρτηρίες, οι οποίες µεταφέρουν το αίµα από την καρδιά στην περιφέρεια, τις φλέβες, οι οποίες µεταφέρουν το αίµα από την περιφέρεια πίσω στην καρδιά και τέλος τα τριχοειδή αγγεία, που επιτρέπουν την ανταλλαγή των ουσιών στους ιστούς και παρεµβάλλονται µεταξύ αρτηριών και φλεβών. Το αίµα είναι ο µοναδικός υγρός ιστός των πολυκύτταρων οργανισµών, το ειδικό του βάρος είναι 1,057 δηλαδή είναι λίγο βαρύτερο από ίσο όγκο νερού, αποτελείται από κύτταρα και πλάσµα και αντιπροσωπεύει το 7% του συνολικού βάρους του σώµατος. Εποµένως, στο ανθρώπινο σώµα, για έναν ενήλικα φτάνει περίπου τα 5 λίτρα. Χωρίς το αίµα ο οργανισµός δε θα µπορούσε να λειτουργήσει. Είναι ο ζωντανός ιστός που τα κύτταρά του ανανεώνονται συνεχώς από µητρικά κύτταρα του µυελού των οστών και των λεµφαδένων. Λόγω της αδιάκοπης ροής του στο κυκλοφορικό σύστηµα, το αίµα, σχετίζεται µε διάφορες λειτουργίες του οργανισµού. Εξυπηρετεί τόσο στην επικοινωνία µεταξύ των ιστών και των οργάνων ενός οργανισµού, όσο και στη διαρκή ανανέωση των εξωκυττάριων και επακόλουθα των ενδοκυττάριων συστατικών. Μέσω της αιµοσφαιρίνης, µεταφέρεται το οξυγόνο από τους πνεύµονες στους ιστούς, αλλά και το διοξείδιο του άνθρακα από τους ιστούς στους πνεύµονες, ενώ µέσω των λευκών αιµοσφαιρίων επιτελείται η άµυνα του οργανισµού έναντι των διαφόρων βλαπτικών παραγόντων. Με το πλάσµα του αίµατος διανέµονται από τα σηµεία παραγωγής τους, στα σηµεία δράσης τους ουσίες, όπως για παράδειγµα ορµόνες και πρωτεΐνες, καθώς και συστατικά που λαµβάνονται µέσω των τροφών από το πεπτικό σύστηµα, στους ιστούς. Επίσης, µέσω του αίµατος, ρυθµίζεται η κατανοµή του νερού, των διαλυµένων ουσιών και της θερµοκρασίας, οδηγούνται τα άχρηστα προϊόντα του µεταβολισµού 3

4 και άλλων κυτταρικών εκκριµάτων, στα νεφρά, και τέλος, µε τη βοήθεια των αιµοπεταλίων συντελείται η διαδικασία της πήξης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το αίµα αποτελείται από τα έµµορφα συστατικά του και το πλάσµα. Τα κύτταρα που απαρτίζουν αυτά τα έµµορφα συστατικά είναι τα ερυθρά αιµοσφαίρια ή ερυθροκύτταρα, που αποτελούν το 45% του όγκου του αίµατος και η κύρια λειτουργία τους είναι η µεταφορά του Ο 2 και του CO 2 µε τη βοήθεια της αιµοσφαιρίνης, τα λευκά αιµοσφαίρια ή λευκοκύτταρα που συµµετέχουν αποτελεσµατικά στην άµυνα του οργανισµού και τέλος τα αιµοπετάλια ή θροµβοκύτταρα που είναι εκείνα τα οποία φράζουν το σηµείο τραυµατισµού ενός αγγείου αρχικά, σχηµατίζοντας έναν αιµοστατικό αιµοπεταλιακό θρόµβο, ώστε να σταµατήσει η αιµορραγία. Το πλάσµα αποτελεί το 55% του όγκου του αίµατος, είναι διαφανές, ωχροκίτρινο υδατικό διάλυµα που περιέχει άλατα, λιποειδή, υδατάνθρακες, βιταµίνες, ορµόνες, αέρια (O 2, CO 2, N 2 ) και κυρίως πρωτεΐνες. Αποτελείται κατά 93 % από νερό στο οποίο είναι διαλυµένες οι παραπάνω ανόργανες και οργανικές ουσίες. Ο διαχωρισµός των συστατικών του αίµατος γίνεται µε φυγοκέντρηση. Το πλάσµα µεταφέρει µε την κυκλοφορία τις θρεπτικές ουσίες στα κύτταρα. Παίρνει από αυτά τα προϊόντα που πρέπει να αποβληθούν και τα µεταφέρει στα όργανα απέκκρισης (νεφρά, ήπαρ, πνεύµονες). Οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητα συστατικά για πάρα πολλές λειτουργίες π.χ. το ινωδογόνο και οι παράγοντες πήξης, που αποτελούν πρωτεΐνες του πλάσµατος, εξασφαλίζουν την πήξη του αίµατος όταν τραυµατιστεί κάποιο αγγείο και όχι µόνο µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία θρόµβου που σταµατάει οριστικά την αιµορραγία. Από τα παραπάνω φαίνεται πόσο πολύπλοκη είναι η σύνθεση του αίµατος και πόσες, αλλά και πόσο σηµαντικές λειτουργίες επιτελεί. Ο ορός, είναι το υγρό που παραµένει εάν αφαιρεθεί το ινωδογόνο (η πρωτεΐνη που µετατρέπεται σε θρόµβο), αλλά και κάποιοι άλλοι παράγοντες πήξης του αίµατος. Ο ορός του αίµατος είναι, δηλαδή, το πλάσµα στο οποίο έχει πραγµατοποιηθεί η διαδικασία της πήξης. Για να πάρουµε τον ορό του αίµατος, επιτρέπουµε στο ολικό αίµα να πήξει, και στη συνέχεια, αποµακρύνουµε µε φυγοκέντριση τον θρόµβο και όλα τα υπάρχοντα κύτταρα. Κάποιες από τις πρωτεΐνες της πήξης καταναλώνονται πλήρως κατά τη διάρκεια του σχηµατισµού του θρόµβου, κάποιες άλλες µειώνονται ενώ κάποιες άλλες µετατρέπονται στην ανενεργή τους µορφή. 4

5 Το πλάσµα, συνεπώς, είναι συγκριτικά πιο ασταθές. Εποµένως, αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο οι περισσότεροι εργαστηριακοί έλεγχοι πραγµατοποιούνται συνήθως στον ορό του αίµατος. Όσον αφορά, όµως, την πήξη του αίµατος, οι έλεγχοι γίνονται πάντα στο πλάσµα και όχι στον ορό. Αυτό ισχύει για το λόγο ότι, το πλάσµα όντας το υγρό, µη κυτταρικό µέρος του αίµατος, οι µηχανισµοί της πήξης έχουν παραµείνει ανέπαφοι. ΕΙΚΟΝΑ 1: Τα συστατικά του αίµατος Πηγή από το διαδίκτυο : ΑΙΜΟΣΤΑΣΗ Η αιµόσταση είναι ένας φυσιολογικός τρόπος άµυνας του οργανισµού που κατορθώνει να αναστέλλει την αιµορραγία των 5

6 αιµοφόρων αγγείων από βλάβες (µικρές ή µεγάλες) και να εξασφαλίζει την οµαλή λειτουργία σε αυτά (Π.Ε. Μακρής 1994). Η αιµόσταση, συνίσταται από µια σειρά αλληλοδιάδοχων ενζυµικών αντιδράσεων, µε αυτοκαταλυτικούς µηχανισµούς και µηχανισµούς ανάδρασης (feed back) που εξισορροπούνται από τη δράση ανασταλτικών µηχανισµών. Η ανεπάρκεια του µηχανισµού εκφράζεται κλινικά µε τα αιµορραγικά σύνδροµα που αργά ή γρήγορα εκδηλώνονται σε κάθε τραυµατισµό. Η εκτροπή του µηχανισµού προς την ενδοαγγειακή πυροδότησή του οδηγεί κλινικά σε θρόµβωση (τοπικό φαινόµενο) ή σε διάχυτη ενδοαγγειακή πήξη (γενικευµένο φαινόµενο). Το φαινόµενο της αιµόστασης περιλαµβάνει τρία στάδια, την αρχική αιµόσταση, την πήξη και την ινωδόλυση. ΑΡΧΙΚΗ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗ Αρχική αιµόσταση ονοµάζεται το πολύ αρχικό στάδιο της διαδικασίας και αναφέρεται στις ποσοτικές και δοµικές µεταβολές που υπόκεινται τα αιµοπετάλια κατά την επαφή τους µε το τοίχωµα των αγγείων που φέρουν τη βλάβη και έτσι πραγµατοποιούν την παροδική επίσχεση της αιµορραγίας. Το στάδιο αυτό περιλαµβάνει τη σύσπαση του αγγείου στο σηµείο της βλάβης και την συγκόλληση των αιµοπεταλίων. Η σύσπαση εξαναγκάζει τα χείλη του τραύµατος να προσεγγίσουν και διευκολύνεται µε τον τρόπο αυτό η επίσχεση της αιµορραγίας. Η απάντηση των αιµοπεταλίων στο ερέθισµα, προέρχεται από την επαφή τους µε το τραύµα. Τα αιµοπετάλια, συµβάλλουν αποφασιστικά στην αντιµετώπιση της αιµορραγίας, καθώς αποτελούν τα κυτταρικά στοιχεία εκείνα που προστρέχουν στο σηµείο της βλάβης πριν από όλα τα άλλα και ενεργοποιούνται κυρίως από το απογυµνωµένο (απενδοθηλιωµένο) τοίχωµα των αγγείων. 6

7 ΕΙΚΟΝΑ 2 : Αρχική αιµόσταση προσκόλληση των αιµοπεταλίων (1), τα οποία αλλάζουν σχήµα (2) και εκλύουν κοκκία (3), ακολουθεί η συγκόλληση (4) και τελικά η συσσώρευση των αιµοπεταλίων (5) µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό του αιµοπεταλιακού θρόµβου Πηγή από το διαδίκτυο ΠΗΞΗ Η πήξη αποτελεί το δεύτερο στάδιο ενεργοποίησης της αιµόστασης και πραγµατοποιείται από ένα σύνολο διαδοχικών αντιδράσεων ενεργοποίησης των πρωτεϊνών του πλάσµατος, ή διαφορετικά των παραγόντων πήξης, οι οποίες µε το σχηµατισµό των τριών κυρίων ενζυµικών συµπλεγµάτων FVIIa-TF (εξωγενής δεκάση), FIXa-FVIIIa (ενδογενής δεκάση) και FXa-FVa (προθροµβινάση) οδηγούν στην παραγωγή θροµβίνης και στο σχηµατισµό της ινικής ή διαφορετικά του ερυθρού θρόµβου. Η ινική µε τη σειρά της, αποφράσσοντας το αγγείο στο σηµείο της βλάβης, οδηγεί σε µόνιµη επίσχεση της αιµορραγίας. Η πήξη του αίµατος στην περίπτωση αυτή, δεν οδηγεί σε γενικευµένη διαταραχή, γιατί ως ενιαίο φαινόµενο αυτοελέγχεται από την παρουσία φυσιολογικών αναστολέων, που εµποδίζουν τη γενίκευση της πυροδότησης του µηχανισµού της πήξης. 7

8 ΕΙΚΟΝΑ 3 : Σχηµατισµός θρόµβου Πηγή από το διαδίκτυο : RQoFQ/s1600/%CE%95%CE%B9%CE%BA%CF%8C%CE%BD%CE%B19.jpg ΙΝΩ ΟΛΥΣΗ Η ινωδόλυση, είναι το τελευταίο από τα τρία βασικά στάδια της αιµόστασης και είναι αυτό το οποίο οδηγεί τελικά στην αποκατάσταση των βλαβών. Η αποκατάσταση αυτή, επιτυγχάνεται µε τη λύση του θρόµβου και την οµαλοποίηση του ενδοθηλιακού τοιχώµατος των αγγείων µε την παραγωγή του κύριου ενζύµου της διαδικασίας της ινωδόλυσης, που είναι η πλασµίνη. Η πλασµίνη σχηµατίζεται είτε τοπικά από τα τραυµατισµένα ενδοθηλιακά κύτταρα µε την απελευθέρωση ιστικών ενεργοποιητών του πλασµινογόνου, είτε από ενδογενείς παράγοντες. Η πλασµίνη ή διαφορετικά ινωδολυσίνη, διασπά το ινώδες σε πεπτίδια, που αποδοµούνται περαιτέρω από άλλες πεπτιδάσες του αίµατος. Η πλασµίνη προέρχεται από το ανενεργό πλασµινογόνο, το οποίο ενεργοποιείται είτε από παράγοντες ιστικής προέλευσης όπως είναι η θρυψίνη και η ουροκινάση και αποτελεί το εξωγενές σύστηµα, είτε 8

9 από παράγοντες αιµατικής προέλευσης όπως είναι η ίδια η θροµβίνη που αποτελεί το ενδογενές σύστηµα. Η ινωδόλυση µε τη σειρά της είναι και αυτή ένα από τα φαινόµενα που υπόκειται στον έλεγχο των φυσιολογικών αναστολέων της. Βασικό ρόλο σε αυτό παίζει το ότι η πλασµίνη δε δρα λυτικά µόνο στο ινώδες που έχει δηµιουργηθεί αλλά, επειδή είναι πρωτεολυτικό ένζυµο µε ευρύ φάσµα δράσης, ανταγωνίζεται και άλλους παράγοντες πήξης όπως για παράδειγµα το ινωδογόνο, τη προθροµβίνη, καθώς και τους παράγοντες V, VIII, IX και XII. ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΗΣ ΠΗΞΗΣ Η πήξη του αίµατος, έχει απασχολήσει τους επιστήµονεςερευνητές από πολύ νωρίς στην ιστορία της ανθρωπότητας. Θεωρίες για την πήξη έχουν αναπτυχθεί από την αρχαιότητα ακόµη. Πρώτος ο φυσιολόγος Johannes Müller ( ) περιγέγραψε αναλυτικότερα τη φιµπρίνη (το ινώδες), την ουσία δηλαδή, που αποτελεί τον θρόµβο. Το διαλυτό πρόδροµο µόριο του ινώδους, το ινωδογόνο, ονοµάστηκε έτσι από τον Rudolf Virchow ( ), και αποµονώθηκε χηµικά από τον Prosper Sylvain Denis ( ). Ο Alexander Shcmidt πρότεινε ότι η µετατροπή από το ινωδογόνο στη φιµπρίνη ήταν το αποτέλεσµα ενζυµατικής επεξεργασίας και ονόµασε το υποθετικό ένζυµο «θροµβίνη» και τον πρόδροµό του «προθροµβίνη». Ο Arthus το 1890 ανακάλυψε πως το ασβέστιο είναι απαραίτητο και παίζει πολύ σηµαντικό ρόλο στη διαδικασία της πήξης. Τα αιµοπετάλια προσδιορίστηκαν αρχικά το 1865 αλλά η λειτουργία τους και η συµβολή τους στην πήξη του αίµατος, διευκρινίστηκε κοντά στο 1882 από τον τότε ερευνητή Giulio Bizzozero. Η θεωρία ότι η θροµβίνη παράγεται µε την παρουσία ιστικού παράγοντα παγιώθηκε κοντά στο 1905 από τον Paul Morawitz. Σε αυτή τη φάση, ήταν γνωστό πως η θροµβοκινάση ή θροµβοπλαστίνη (παράγοντας ΙΙΙ) απελευθερώνεται από τους κατεστραµµένους ιστούς, και πως όταν αυτή αντιδρά µε την προθροµβίνη, σε συνδυασµό µε το ασβέστιο, προκύπτει η θροµβίνη, η οποία µετατρέπει το ινωδογόνο σε φιµπρίνη (ινώδες ), το συστατικό του θρόµβου. Το υπόλοιπο των βιοχηµικών παραγόντων της πήξης ανακαλύφθηκε κατά ένα µεγάλο µέρος στη διάρκεια του 20 ου αιώνα. 9

10 Μια πρώτη ένδειξη ως προς την πραγµατική πολυπλοκότητα του συστήµατος της πήξης ήταν η ανακάλυψη της προαξελερίνης (proaccelerin) ο πιο προσφάτως αποκαλούµενος παράγοντας Β από τον Paul Owren ( ) το Ο παράγοντας VII (επίσης γνωστός όπως επιταχυντής µετατροπής προθροµβίνης ορών ή προκονβερτίνη (proconvertin), ανακαλύφθηκε µε κατακρήµνιση, σε έναν νέο θηλυκό ασθενή το 1949 και το 1951 από διαφορετικές οµάδες ερευνητών. Ο παράγοντας VIII προσδιορίστηκε τη δεκαετία του '50 και καλείται εναλλακτικά αντιαιµορροφιλική σφαιρίνη Α λόγω της ικανότητάς του να «διορθώνει» την αιµοφιλία Α. Ο παράγοντας ΙΧ ανακαλύφθηκε το 1952 σε έναν νέο ασθενή µε αιµοφιλία Β που ονοµαζόταν Stephen Christmas ( ). Η ανεπάρκειά του περιγράφηκε από το ρ. Rosemary Biggs και τον καθηγητή R.G. MacFarlane στην Οξφόρδη. Ο παράγοντας ως εκ τούτου καλείται παράγοντας Χριστουγέννων ή παράγοντας Christmas. Ο Stephen Christmas έζησε στον Καναδά, και έκανε εκστρατείες για την ασφάλεια στον τοµέα της µετάγγισης αίµατος, µέχρι να καταλήξει λόγω προσβολής από τον ιό του AIDS κατά τη διαδικασία µετάγγισης στην ηλικία των 46 ετών. Ένα εναλλακτικό όνοµα για τον παράγοντα είναι συστατικό θροµβοπλαστίνης πλάσµατος, που δόθηκε από µια ανεξάρτητη οµάδα ερευνητών από την Καλιφόρνια. Ο παράγοντας Hageman, γνωστός πλέον ως παράγοντας ΧΙΙ, προσδιορίστηκε το 1955 και πήρε το όνοµά του από έναν ασυµπτωµατικό ασθενή που παρουσίασε παρατεταµένο χρόνο αιµορραγίας και ονοµαζόταν John Hageman. Ακολουθεί ο παράγοντας Χ ή παράγοντας Stuart-Prower, το Αυτή η πρωτεΐνη προσδιορίστηκε σε µια ασθενή, την Audrey Prower στο Λονδίνο, η οποία είχε µια ισόβια τάση αιµορραγίας. Το 1957, µια αµερικανική οµάδα προσδιόρισε τον ίδιο παράγοντα στον Rufus Stuart. Οι παράγοντες ΧΙ και ΧΙΙΙ προσδιορίστηκαν το 1953 και το 1961, αντίστοιχα. Η άποψη ότι η διαδικασία πήξης αποτελεί στην ουσία έναν «καταρράκτη» αντιδράσεων διατυπώθηκε σχεδόν ταυτόχρονα από τον MacFarlane στο Ηνωµένο Βασίλειο και από τους Davie και Ratnoff στις ΗΠΑ, αντίστοιχα. Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότεροι ερευνητές έχουν στρέψει το ενδιαφέρον τους στον προσδιορισµό των αντιδράσεων της διαδικασίας της πήξης και γενικότερα στο πεδίο της αιµόστασης, τόσο γιατί παρουσιάζει έντονο ενδιαφέρον η ίδια η διαδικασία, όσο και για 10

11 το λόγο ότι αποτελεί σηµαντικό κοµµάτι µελέτης για την κατανόηση και θεραπεία των αθηρωµατικών και καρδιαγγειακών νόσων. ΠΗΞΗ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO Όταν το αίµα έλθει σε επαφή µε κάποια άλλη επιφάνεια εκτός του ενδοθηλίου των αγγείων (in vitro), αµέσως πήζει. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα να αλλάζει η φυσική του κατάσταση και από ρευστό να µετατρέπεται σε πηκτό. Η παραπάνω διαδικασία συµβαίνει και στην καθηµερινή πράξη, όταν το αίµα ρέει εκτός αγγείου, όπως για παράδειγµα ισχύει και στις διαγνωστικές αιµοληψίες. Το φαινόµενο αυτό είναι µια σειρά από αλλεπάλληλα επιµέρους βήµατα, που καταλήγουν στην µετατροπή του διαλυτού ινωδογόνου σε αδιάλυτη ινική. Ύστερα από πολλά χρόνια µελέτης, έγινε κατανοητό ότι η in vivo ενεργοποίηση της πήξης δεν συµβαδίζει µε αυτή της in vitro. Το ίδιο ισχύει και για τους µηχανισµούς της πήξης. Ο ισχυρισµός αυτός στηρίζεται στην παρατήρηση διαφόρων κλινικών περιπτώσεων, όπως αυτών της απουσίας αιµορραγικών προβληµάτων σε ασθενείς µε έλλειψη του παράγοντα XII (ενώ η έλλειψη του συχνά συνδυάζεται µε θροµβωτικά επεισόδια) και αυτών της έλλειψης του παράγοντα VII ή του ΙΧ που προκαλεί µείζονα αιµορραγικά προβλήµατα στους ασθενείς που πάσχουν αντίστοιχα από αιµορροφιλία Α ή Β. Ο ρόλος όµως των παραγόντων αυτών στο κλασικό σχήµα είναι δευτερεύουσας σηµασίας. Η αδυναµία συνεπώς του κλασικού σχήµατος να ερµηνεύσει πλήρως το µηχανισµό της πήξης οδήγησε στην αντίληψη ότι η ενεργοποίηση και η ερµηνεία των µηχανισµών πήξης είναι διαφορετικό στις in vivo και στις in vitro καταστάσεις. In vivo, ο σχηµατισµός της θροµβίνης γίνεται εµφανής από την απόφραξη που επιτελείται στα αγγεία τα πρώτα δευτερόλεπτα µετά τον τραυµατισµό. Η ενεργοποίηση των παραγόντων V και VIII στο αίµα που τρέχει από την πληγή και ο σχηµατισµός της ινικής είναι ορατά στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Η δράση της θροµβίνης στα αιµοπετάλια, που προκαλεί την έντονη διέγερση και τη συσσώρευσή τους, επιβεβαιώνεται από τη συµµετοχή της στην απελευθέρωση και στην τοπική προσφορά του 3 ου αιµοπεταλιακού παράγοντα (από τα αιµοπετάλια), µε τον οποίο σχηµατίζονται τα µεγάλα ενζυµικά 11

12 συµπλέγµατα της πήξης. Ο σχηµατισµός αυτός µεγιστοποιεί την ταχύτητα και το ποσό της παραγόµενης θροµβίνης πάνω στα χείλη του τραύµατος. Με τον παραπάνω µηχανισµό, ο σχηµατισµός της θροµβίνης προστατεύεται και δεν αδρανοποιείται από τις κυκλοφορούσες αντιθροµβίνες και τους υπόλοιπους µηχανισµούς αναστολής. Στο τελικό στάδιο, ο σχηµατισµός του δικτύου της ινικής γίνεται σε στενή επαφή µε τα συσσωρευµένα αιµοπετάλια που είναι πλούσια σε παράγοντα ΧΙΙΙ, ο οποίος συµβάλλει στο σχηµατισµό γέφυρας µεταξύ των πολυµερών της ινικής και στην αιµοστατική αποτελεσµατικότητα του µηχανισµού. Ακόµη, οι αλληλεπιδράσεις των αιµοπεταλίων µε την ινική γίνονται εµφανής και από τη συστολή του θρόµβου, που είναι αποτέλεσµα της ενεργοποίησης των συσταλτών τους πρωτεϊνών. Όταν τοποθετηθεί σε γυάλινο σωληνάριο µέσα σε υδατόλουτρο στους 37 0 C, ποσότητα αίµατος 1-2ml και περιοδικά ελέγχεται µε ανακίνηση, παρατηρείται πως το αίµα θα πήξει σε 5-7 min. Αυτό είναι το ανώτερο φυσιολογικό όριο του χρόνου πήξης ολικού αίµατος, όταν προσδιορίζεται µε αυτό τον τρόπο. Μετά από επιπλέον χρόνο παραµονής του πήγµατος στο υδατόλουτρο παρατηρείται σύσπαση ή συστολή του θρόµβου, µε αποτέλεσµα την εµφάνισή του ορού του αίµατος. Στην περίπτωση που το γυάλινο σωληνάριο αντικατασταθεί από πλαστικό ή αν τα τοιχώµατα του γυάλινου σωληναρίου επαλειφθούν µε σιλικόνη, εποµένως από υδρόφιλα γίνονται υδρόφοβα, το αίµα θα πήξει σε min. Αντίθετα, αν µέσα στο σωληνάριο προστεθούν µερικά ίχνη ιστικού εκχυλίσµατος, τότε το αίµα που θα έλθει σε επαφή µαζί του θα πήξει πάρα πολύ γρήγορα, σε sec, όσο δηλαδή το φυσιολογικό όριο του χρόνου προθροµβίνης. Εποµένως, η ταχύτητα µε την οποία θα πυροδοτηθεί ο µηχανισµός πήξης in vitro καθορίζεται τόσο από την επιφάνεια, µε την οποία θα έρθει σε επαφή το αίµα, όσο και από την παρουσία ή όχι ιστικού παράγοντα, που την πυροδοτεί. Οι παρατηρήσεις αυτές οδήγησαν στον καθορισµό δύο πιθανών µονοπατιών ενεργοποίησης της πήξης in vitro, του ενδογενούς και του εξωγενούς. Το ενδογενές µονοπάτι πυροδοτείται τη στιγµή που οι ενδογενείς παράγοντες έρχονται σε επαφή µε κάποιον εξωτερικό παράγοντα, ενώ το εξωγενές, από έναν ιστικό παράγοντα, την ιστική θροµβοπλαστίνη. Χαρακτηριστικό είναι το γεγονός πως µε τον ενδογενή δρόµο ελέγχεται η επάρκεια όλων των παραγόντων της 12

13 πήξης (ΧΙΙ, ΧΙ, ΙΧ, VIII, X, V, II και Ι), εκτός από τον παράγοντα VII, του οποίου η επάρκεια ελέγχεται µέσω του εξωγενούς µονοπατιού. ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΗΞΗΣ Τα κύρια συστατικά του συστήµατος πήξης του αίµατος είναι τα µόρια των αιµοπεταλίων καθώς και οι παράγοντες πήξης, οι οποίοι αποτελούν πρωτεΐνες του πλάσµατος του αίµατος. Η ονοµατολογία των παραγόντων της πήξης βασίζεται στη λατινική αρίθµηση ξεκινώντας από το I έως και το XIII. Εξαίρεση αποτελεί ο αριθµός VI, ο οποίος δεν αντιστοιχεί σε κάποιον παράγοντα. Για κάποιους από τους παραπάνω παράγοντες χρησιµοποιούνται συνήθως οι εµπειρικές τους ονοµασίες (φαίνονται και στον ΠΙΝΑΚΑ 1). Αυτές είναι αντίστοιχα το ινωδογόνο (I), η προθροµβίνη (II), ο ιστικός παράγοντας ή TF (III), τα ιόντα Ca ++ (IV), η αντιαιµορροφιλική σφαιρίνη Α (VIII), η αντιαιµορροφιλική σφαιρίνη Β (IX), ο παράγοντας Hageman (XII), ο παράγοντας von Willebrand και τέλος, ο παράγοντας που σταθεροποιεί το ινώδες (XIII). Οι περισσότεροι παράγοντες πήξης, έχουν ως αρχικό σηµείο παραγωγής το ήπαρ. Εξαίρεση αποτελούν ο TF και ο παράγοντας von Willebrand, που παράγονται κατά κύριο λόγο στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι ποσότητες των παραγόντων πήξης που κυκλοφορούν στο αίµα είναι πολύ µικρές εώς και ελάχιστες και µετρώνται σε µg/ml. Μοναδική εξαίρεση,εδώ, αποτελεί το ινωδογόνο, που εντοπίζεται σε πολύ µεγαλύτερες ποσότητες και φτάνει συγκριτικά έως και 10 3 φορές την ποσότητα κάποιων από τους υπόλοιπους παράγοντες. Ο χρόνος ηµίσειας ζωής τους ποικίλει από λίγες ώρες (παράγοντας VII: 4-6 ώρες και πρωτεΐνη C: 3-10 ώρες ), έως λίγες ηµέρες (παράγοντας II: 3-4 ηµέρες και παράγοντας X: 1-3 ηµέρες ). Συνοπτικά, οι παράγοντες που ενέχονται στην διαδικασία της πήξης του αίµατος είναι οι εξής: 1. Οι βιταµινο-κ εξαρτώµενοι ( II, VII, IX, X, και η πρωτεΐνη C PC) 2. Οι συµπαράγοντες (I, V, VIII, XIII, ο παράγοντας von Willebrand, και η πρωτεΐνη S PS) 13

14 3. Οι παράγοντες επαφής (XI, XII, προκαλλικρεΐνη, ΜMΒK ή Μεγάλου ΜΒ Κινινογόνο) 4. Ακέραιες πρωτεΐνες, όπως ο ιστικός παράγοντας TF, το ινωδογόνο και η θροµβοµοδουλίνη, που δεν απαιτούν για την ενεργοποίησή τους τη συµµετοχή ενός άλλου παράγοντα ή συµπλέγµατος, αλλά ενεργοποιούνται αµέσως µετά την αποκάλυψή τους. I II III IV V VII VIII IX X XI XII XIII ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ Ινωδογόνο Προθροµβίνη ΟΝΟΜΑ Ιστικός παράγοντας ή θροµβοπλαστίνη Ασβέστιο Προαξελερίνη, Παράγοντας Β (ασταθής παράγοντας) Προκονβερτίνη (σταθερός παράγοντας) Αντιαιµορροφιλικός παράγοντας A, Αντιαιµορροφιλική σφαιρίνη Α Αντιαιµορροφιλικός παράγοντας B, Συστατικό θροµβοπλαστίνης πλάσµατος, Παράγοντας Christmas Παράγοντας Stuart-Prower Πρόγονος της θροµβοπλαστίνης του πλάσµατος, Αιµορροφιλικός παράγοντας C, σύνδροµο Rosenthal Παράγοντας Hageman Παράγοντας σταθεροποίησης της ινικής, Παράγοντας Laki- Lorand ΠΙΝΑΚΑΣ 1: Οι βασικότεροι παράγοντες πήξης και οι ονοµασίες τους. ΣΥΜΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΑΙ ΖΥΜΟΓΟΝΑ Οι παράγοντες πήξης διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, τα ζυµογόνα και τους συµπαράγοντες. Ζυµογόνο καλείται ένα πρόδροµο ανενεργό ένζυµο, που δεν διαθέτει βιολογική δραστικότητα και το οποίο, µετατρέπεται σε ενεργό ένζυµο µέσω της δράσης ενός άλλου ενζύµου. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι παράγοντες II, VII, IX, X, XI, XII, XIII και η προκαλλικρεΐνη. 14

15 Με τον όρο συµπαράγοντας, στην αιµόσταση, αναφερόµαστε στους παράγοντες εκείνους που είναι απαραίτητοι για τη δράση ενός ενζύµου. Οι παράγοντες αυτοί δεν είναι οι ίδιοι ένζυµα, αλλά, πρωτεϊνικοί υποδοχείς. Πιο συγκεκριµένα, οι υποδοχείς στη διαδικασία της πήξης είναι καθηλωµένοι σε µεµβράνες και η δράση τους προϋποθέτει την πρόσδεση άλλων πρωτεϊνών, στην περίπτωση αυτή, άλλων παραγόντων πήξης. Το αποτέλεσµα της αλληλεπίδρασης τους µπορεί να είναι είτε η ρύθµιση κάποιας ενζυµικής δραστικότητας µέσω παρεµπόδισης ή ενεργοποίησης ενός ζυµογόνου, ήδη υπάρχοντος στην επιφάνεια του κυττάρου, είτε στην επαγωγή της σύνθεσης ενός ενζύµου που δεν υπάρχει καθόλου ή βρίσκεται σε ελάχιστες συγκεντρώσεις. Σε αυτούς ανήκουν ο TF, η θροµβοµοντουλίνη, οι παράγοντες V και VIII, η Pr-C, η Pr-S και τα υψηλού µοριακού βάρους κινινογόνα (ή ΜΜΒΚ). ΒΙΤΑΜΙΝΟ-Κ ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Οι βιταµινο-κ εξαρτώµενοι παράγοντες, είναι εκείνοι οι οποίοι προκειµένου να ενεργοποιηθούν απαιτούν την καρβοξυλίωση γλουταµινικών οµάδων τους, που περιέχονται στην ανενεργή τους µορφή, από τη βιταµίνη Κ. Οι παράγοντες αυτοί, µεµονωµένοι, διαθέτουν εξαιρετικά χαµηλή καταλυτική ικανότητα. Η ύπαρξη φωσφολιπιδίων και Ca ++, µεγιστοποιεί αυτή την καταλυτική τους ικανότητα. Για το λόγο αυτό δρουν µε τη µορφή συµπλεγµάτων και όχι µεµονωµένα. Τα βιταµινο-κ εξαρτηµένα ζυµογόνα της πήξης είναι αδρανή πρόδροµα µόρια σερινικών πρωτεασών. ιαθέτουν παρόµοια πρωτεϊνική δοµή, τέτοια που τους επιτρέπει να εκφράσουν την ενζυµική τους δραστικότητα, µόνο στην περίπτωση που έχουν προηγουµένως ενεργοποιηθεί πρωτεολυτικά. Όλοι αυτοί οι παράγοντες έχουν στο καρβοξυ-τελικό τους άκρο το δραστικό κέντρο µιας πρωτεάσης σερίνης και στο αµινο-τελικό τους άκρο τη δοµή "Gla" η οποία περιέχει 9 µε 12 γ-καρβοξυγλουταµινικά οξέα. Η δοµή "Gla" είναι χαρακτηριστική αυτών των πρωτεϊνών και συµµετέχει στην αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης µε τα λιπίδια των κυτταρικών µεµβρανών. Η δοµή "Gla" πήρε το όνοµά της από τα γ-καρβοξυ-γλουταµινικά οξέα, τα οποία προκύπτουν µετά από 15

16 την καρβοξυλίωση των γλουταµινικών οξέων που βρίσκονται ανάµεσα στα 42 πρώτα αµινοξέα της πρωτεΐνης. Το γλουταµινικό οξύ µετά την καρβοξυλίωση έχει µεγαλύτερη αγχιστεία για το ιόν του Ca ++. Τα ιόντα ασβεστίου συνδέονται µε τη "Gla" δοµή των αντίστοιχων πρωτεϊνών και µεσολαβούν στη σύνδεση µε τα φωσφολιπίδια των µεµβρανών. Η καρβοξυλίωση των γλουταµινικών οξέων, όλων των βιταµινο-κ εξαρτηµένων παραγόντων, πρόκειται για µια µετα- µεταγραφική τροποποίηση η οποία εξαρτάται από τη βιταµίνη-κ και πραγµατοποιείται από µια ειδική γ-γλουταµυλ-καρβοξυλάση στο ενδοπλασµατικό δίκτυο των ηπατικών κυττάρων. Οι βιταµινο-κ εξαρτηµένοι παράγοντες ενεργοποιούνται µε περιορισµένη πρωτεόλυση, οπότε προκύπτουν οι ενεργοποιηµένοι παράγοντες, οι οποίοι έχουν µικρότερο µοριακό µέγεθος από τα αντίστοιχα ζυµογόνα από τα οποία προέρχονται. Εξαίρεση παρουσιάζει ο παράγοντας VII, ο οποίος κατά την ενεργοποίησή του δεν αποβάλλει κάποιο πρωτεϊνικό κοµµάτι µε αποτέλεσµα τόσο το ζυµογόνο µόριο όσο και το ενεργό ένζυµο να έχουν το ίδιο µοριακό µέγεθος. ΠΡΟΘΡΟΜΒΙΝΗ (II) / ΘΡΟΜΒΙΝΗ (IIa) Η προθροµβίνη παράγεται στα ηπατικά κύτταρα. Αποτελείται από µια απλή γλυκοπρωτεϊνική αλυσίδα µε 70 kda ΜΒ, η οποία υδρολύεται από τον Xa και µετατρέπεται σε θροµβίνη (την ενεργό µορφή της προθροµβίνης). Το µόριο της αποτελείται κατά 8,2% από υδατάνθρακες. Η συγκέντρωση της στο πλάσµα είναι περίπου 100 µg/ml και η διάρκεια ηµιζωής της είναι 5 µέρες. Η πρωτοταγής δοµή της είναι πλέον πλήρως γνωστή. Το µόριο της αποτελείται από 582 κατάλοιπα αµινοξέων και τρεις ολιγοσακχαριδικές αλυσίδες. Η δοµή του µορίου της αποτελείται από τέσσερις δοµικές περιοχές που είναι οι εξής : I. Την Gla-περιοχή στο Ν-τελικό άκρο της, που διαθέτει 10 γ-καρβόξυ-γλουταµινικά οξέα τα οποία βρίσκονται µεταξύ των 40 πρώτων αµινοξέων του µορίου 16

17 II. III. ύο περιοχές µε τη χαρακτηριστική δοµή kringle, που εκτείνονται µεταξύ των αµινοξέων 40 και 270 και αντικαθιστούν την περιοχή-egf των άλλων παραγόντων Tην καταλυτική περιοχή Η θροµβίνη δεν είναι ένα φυσιολογικό συστατικό του αίµατος. Σχηµατίζεται από τη µερική πρωτεόλυση του ζυµογόνου της, της προθροµβίνης (ΙΙ), από τον ενεργοποιηµένο παράγοντα Stuart (Xa), παρουσία του συµπαράγοντα Va. Είναι µια γλυκοπρωτεΐνη, που συντίθεται, όπως όλα τα βιταµινο-κ εξαρτηµένα ζυµογόνα της πήξης, κυρίως στο ήπαρ. Αποτελείται από δυο πεπτιδικές αλύσίδες, που συνδέονται µεταξύ τους µε δισουλφιδικούς δεσµούς. Η προθροµβίνη µε τη βοήθεια της Gla-περιοχής της συνδέεται µε ιόντα Ca ++ και στη συνέχεια µε τα αρνητικά φορτισµένα φωσφολιπίδια των µεµβρανών, όπου και υφίσταται υδρόλυση. του δεσµού Arg-273/Thr-274, από την οποία σχηµατίζεται η προθροµβίνη-2. Με ένα δεύτερο κόψιµο αυτής στο δεσµό Arg- 323/Ile-324, σχηµατίζονται η α και η β αλυσίδα της ώριµης και δραστικής πλέον θροµβίνης. Η δραστική θροµβίνη αντιστοιχεί στην α- θροµβίνη και αποτελείται από δύο αλυσίδες συνδεδεµένες µε έναν δισουλφιδικό δεσµό. Η α-θροµβίνη στη συνέχεια, µπορεί να υδρολυθεί σε άλλα ένζυµα, λιγότερα δραστικά, όπως είναι η β και η γ θροµβίνη. Αυτά τα προκύπτοντα ένζυµα συνεχίζουν να διατηρούν την ικανότητα που έχει η θροµβίνη και έτσι µπορούν να διασπούν µικρά συνθετικά χρωµογόνα τριπεπτίδια, αλλά και άλλους παράγοντες πήξης, όπως είναι ο ΧΙΙΙ και η προθροµβίνη. Η ικανότητα τους, όµως, να διασπούν το ινωδογόνο, ή την ενεργοποιηµένη πρωτεΐνη C έχει ελαττωθεί σηµαντικά. Η θροµβίνη είναι το κύριο ένζυµο της πήξης, χωρίς το οποίο είναι αδύνατος ο σχηµατισµός του θρόµβου. Η θροµβίνη είναι ένα ισχυρό πρωτεολυτικό ένζυµο που θα µπορούσαµε να πούµε πως έχει κάποιες ιδιότητες όµοιες µε εκείνες της θρυψίνης και της χυµοθρυψίνης. Οι σηµαντικότερες περιοχές του ενζύµου έχουν εντοπιστεί στην επιφάνειά του και είναι οι εξής τρείς: I. Η καταλυτική περιοχή, που προσφέρει στο µόριο τη δράση πρωτεάσης σερίνης II. Το exosite 1, που είναι υπεύθυνο για τη σύνδεση µε το υπόστρωµα (ινωδογόνο ή υποδοχέας θροµβίνης) 17

18 III. Το exosite 2, που είναι υπεύθυνο για τη δέσµευση µε τον αναστολέα αντιθροµβίνη III και την απενεργοποίηση της θροµβίνης. Η θροµβίνη µε τη σειρά της, ενεργοποιεί τους παράγοντες V, VIII, XI, καθώς και τα αιµοπετάλια, ενώ µετατρέπει το ινωδογόνο σε ινική. Αυτό το επιτυγχάνει, υδρολύοντας τους δεσµούς Arg-Gly του ινωδογόνου, απελευθερώνοντας µε αυτόν τον τρόπο µόρια ινωδοπεπτιδίου Α και Β. Με τον τρόπο αυτό, παρέχεται στο ινωδογόνο η ικανότητα αυτοπολυµερισµού, έτσι ώστε να σχηµατίσει το θρόµβο της ινικής. Επίσης, η θροµβίνη έχει την ικανότητα να ενεργοποιεί τον παράγοντα XIII. Η ενεργοποίηση του παράγοντα XΙΙΙ τον καθιστά ικανό να δράσει σαν τρανσαµινάση και να σχηµατίσει δεσµούς µεταξύ καρβόξυλο- και αµινοµάδων δυο διαφορετικών µονοµερών του ινώδους, ενισχύοντας µε τον τρόπο αυτό τη σταθερότητα του θρόµβου. Εκτός από την πηκτική της δράση, η θροµβίνη έχει και αντιπηκτικές ιδιότητες. Έτσι, όταν η θροµβίνη συνδεθεί µε τον συµπαράγοντα θροµβοµοντουλίνη, µπορεί και ενεργοποιεί την πρωτεΐνη C. Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης C συνεπάγεται την αδρανοποίηση, µέσω πρωτεόλυσης, των παραγόντων Va και VIIIa, καταστέλλοντας έτσι την µετατροπή της προθροµβίνης σε θροµβίνη. Η θροµβίνη δεν είναι απλά και µόνο ένα οποιοδήποτε ένζυµο του πλάσµατος. Έχει την ιδιαίτερη ικανότητα να διεγείρει τα αιµοπετάλια και να προκαλεί τη συσσώρευσή τους, αλλά επίσης, διαθέτει την ικανότητα να προκαλεί την απελευθέρωση ουσιών από τα α και δ κοκκία που βρίσκονται στα αιµοπετάλια. Επίσης, πολλές επιδράσεις της συναντώνται και σε άλλα κύτταρα όπως είναι τα ηπατικά και τα ενδοθηλιακά. Ο οργανισµός έχει τη δυνατότητα να εξουδετερώνει τη θροµβίνη µέσω πολλών αντιδράσεων, όπως για παράδειγµα µε τους φυσιολογικούς αναστολείς, που είναι η αντιθρυψίνη Ι, η Α 2 αντιπλασµίνη και η Α 2 µακροσφαιρίνη. Ο κύριος αναστολέας, όµως, της θροµβίνης στο πλάσµα, είναι η αντιθροµβίνη ΙΙΙ (ATIII). Η διαδικασία της αναστολής, όµως, δε σηµατοδοτεί απαραίτητα πως σε κάθε περίπτωση σχηµατισµού της θροµβίνης ο οργανισµός την αδρανοποιεί άµεσα, γιατί αυτό το γεγονός θα καθιστούσε την αιµόσταση ανεπιτυχή. Κάτι τέτοιο δεν ισχύει, εφόσον η ίδια η ζωή µαρτυράει την αποτελεσµατικότητα της αιµόστασης, αποδεικνύοντας πως η διαδικασία ενεργοποίησης και εξέλιξης της πήξης είναι ένα ταχύτατο φαινόµενο. 18

19 ΕΙΚΟΝΑ 4: Η δοµή της θροµβίνης Πηγή από το διαδίκτυο : ages/thrombin.jpg&sa=x&ei=adritz3fbssfoqslncij&ved=0caqq8wc4hw&usg= AFQjCNGKubEQBT40KAzwl2h7z6gkOxVNwg ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ VII / VIIa Η δοµή του παράγοντα VII είναι σχεδόν ταυτόσηµη µε αυτήν των άλλων βιταµινο-κ εξαρτηµένων παραγόντων της πήξης. Ο παράγοντας VII ή προκοµβερτίνη παράγεται αποκλειστικά στο ηπατοκύτταρο και αποτελεί µια απλή πρωτεϊνική αλυσίδα ζυµογόνου. Η ενεργοποίησή του πραγµατοποιείται αµέσως µετά τη σύνδεσή του µε τον ιστικό παράγοντα (TF). Όταν συνδεθεί µε τον ιστικό παράγοντα, αλλάζει η δοµή του µορίου και µετατρέπεται σε ένωση µε δυο αλυσίδες αποκαλύπτοντας τη σερίνη του ενεργού της κέντρου. 19

20 Ο παράγοντας VII ενεργοποιείται µε πρωτεόλυση από τους παράγοντες IXa, Xa, XIIa και µετατρέπεται στη σερινική πρωτεάση VIIa. Η ενεργοποίησή του επιτελείται γρηγορότερα από τον παράγοντα Xa σε σχέση µε τον παράγοντα ΙΧa. Σε αντίθεση µε την περίπτωση της προθροµβίνης, η καταλυτική δοµή του παράγοντα VII εξακολουθεί να συνδέεται µε το υπόλοιπο µόριο ακόµη και µετά την ενεργοποίηση του, µέσω ενός δισουλφιδικού δεσµού. Έτσι, δεν αποκόπτεται κάποιο µέρος του και το ενεργοποιηµένο µόριο VIIa διατηρεί το µοριακό µέγεθος που είχε και µέχρι πριν την ενεργοποίηση του. Είναι ένας από τους σηµαντικότερους παράγοντας πήξης, κυρίως στο στάδιο της έναρξης. Η ενδογενής πρωτεολυτική του δράση είναι πολύ µικρή, αλλά µετά από κάποιο ενδεχόµενο τραυµατισµό των ιστών ο VIIa, που κυκλοφορεί φυσιολογικά σε µικρές συγκεντρώσεις στο αίµα, δεσµεύεται ισχυρά στον TF. Το σύµπλοκο TF/VIIa ενεργοποιεί στη συνέχεια επιπλέον µόρια VII, τα οποία µε τη σειρά τους συνδέονται σε διαθέσιµες περιοχές του TF. Ο σχηµατισµός αυτού του συµπλόκου ενισχύει τη δραστικότητα του VIIa κατά 10 4 φορές. Στη συνέχεια το σύµπλοκο TF/VIIa ενεργοποιεί άµεσα ή έµµεσα (µέσω ενεργοποίησης του IX) τον παράγοντα X, έτσι ώστε να προκύψει τελικά ο Xa. Ο παράγοντας VIIa, αναστέλλεται από το σύµπλοκο του TFPI µε τον παράγοντα Χa. Επίσης, αναστέλλεται από την ATIII αλλά µόνο παρουσία ηπαρίνης. Αν και ο σχηµατισµός του συµπλόκου VIIa /TF είναι υποχρεωτικό βήµα για την ενεργοποίηση της δράσης του VIIa, έχει δειχθεί από αρκετές µελέτες, πως µπορεί να συµβεί ενεργοποίηση του X χωρίς την παρουσία TF. Αυτό ισχύει µόνο στην περίπτωση παροχής πολύ υψηλής δόσης του VIIa, σε συνδυασµό µε την παρουσία ιόντων Ca ή µε την ύπαρξη ιόντων Ca και φωσφολιπιδίων ταυτόχρονα. Από τις µελέτες που πραγµατοποιήθηκαν κατά καιρούς από τις διάφορες επιστηµονικές οµάδες, προκύπτει το πολύ ενδιαφέρον αποτέλεσµα, το οποίο καταδεικνύει πως στην περίπτωση που ο VIIa χρησιµοποιηθεί σε φαρµακολογικές δόσεις, έχει την ικανότητα να ενεργοποιήσει τον IX πάνω στα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια, απουσία του TF. Στη συνέχεια, ο IXa έχοντας µόλις ενεργοποιηθεί και µε την παρουσία του VIIIa, µπορεί να σχηµατίσει επιπλέον συµπλέγµατα δεκάσης και έτσι να ενισχύθεί η παραγωγή του Xa και διαδοχικά της θροµβίνης. 20

21 ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΙΧ Ο παράγοντας IX συντίθεται και αυτός στα ηπατοκύτταρα και κυκλοφορεί στο πλάσµα, ως απλή γλυκοπρωτεϊνική αλυσίδα ζυµογόνου. Το µόριο του παράγοντα ΙΧ είναι µια απλή βιταµινο-κ εξαρτηµένη πρωτεΐνη, η οποία αποτελείται από τέσσερις λειτουργικές περιοχές. Ο IX ενεργοποιείται κυρίως από τον παράγοντα XΙa, αλλά και µέσω του εναλλακτικού µονοπατιού, από το σύµπλοκο FVIIa-TF. Ο κύριος αναστολέας του παράγοντα ΙΧa είναι η ATIII. Αν και η αναστολή του παράγοντα ΙΧa από την ATIII είναι σχετικά περιορισµένη, ωστόσο, έχει παρατηρηθεί πως αυξάνει µε την παρουσία ηπαρίνης. ΕΙΚΟΝΑ 5: Η δοµή του παράγοντα ΙΧ Πηγή από το διαδίκτυο : ourses/molbio/molstudents/spring2003/woodc/coagixstructure.gif&sa=x&ei=2nvi TYTqH8aEOs353L8J&ved=0CAQQ8wc&usg=AFQjCNGQwEMP5dNvq3PbPfDho 8zghE66jQ 21

22 ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ Χ Ο παράγοντας X κυκλοφορεί ως ζυµογόνο και αποτελείται από δύο αλυσίδες, µια βαριά και µια ελαφριά µε 43 και 16 kda ΜΒ αντίστοιχα, που συνδέονται µε έναν δισουλφιδικό δεσµό. Η συγκέντρωσή του στο πλάσµα είναι 20µg/ml ενώ η διάρκεια ηµιζωής του είναι h. Το µόριο κωδικοποιείται από ένα γονίδιο που εντοπίζεται στο τµήµα q34 του χρωµοσώµατος 13. Το µόριο του παράγοντα Χ αποτελείται από πέντε δοµικές περιοχές που εντοπίζονται στις δυο αυτές αλυσίδες του. Περιέχει στο Ν-τελικό άκρο της ελαφριάς αλυσίδας µια Gla-περιοχή που αποτελείται από γ-καρβοξυ-γλουταµινικά οξέα. Στην πλευρά της ελαφριάς αλυσίδας υπάρχουν επίσης δύο οµόλογες EGF-περιοχές, ενώ στην πλευρά της βαρίας αλυσίδας εντοπίζεται η περιοχή του πεπτιδίου ενεργοποίησης και η καταλυτική περιοχή, όπου βρίσκεται και το δραστικό σερινικό κέντρο της πρωτεάσης. Στην ίδια αυτή αλυσίδα περιλαµβάνονται τα περισσότερα τµήµατα των υδατανθράκων. Η καρβοξυλίωση, όπως σε όλους τους βιταµινο-κ εξαρτηµένους παράγοντες πραγµατοποιείται ενδοηπατικά. Ο παράγοντας Χ ενεργοποιείται τόσο από το σύµπλοκο της ενδογενούς δεκάσης IXa-VIIIa µετά από υδρόλυση, όσο και από τον εναλλακτικό δρόµο µέσω του συµπλόκου VIIa/TF. Συνδέεται µε τον παράγοντα Va στην επιφάνεια των κυτταρικών φωσφολιπιδίων και έτσι δηµιουργείται η προθροµβινάση (Xa-Va), που αποτελεί το σύµπλοκο εκείνο το οποίο µετατρέπει την προθροµβίνη σε θροµβίνη καθώς επίσης και εκείνο που ενεργοποιεί τους παράγοντες VII, VIII, V. Η υδρόλυση του πεπτιδικού δεσµού που απαιτείται για την ενεργοποίηση, πραγµατοποιείται από οποιοδήποτε από τα δυο αυτά ενζυµικά συµπλέγµατα στοχεύοντας στο δεσµό Αrg-52 και Ιle-53 της βαριάς αλυσίδας προς την πλευρά του C-τελικού άκρου του µορίου. Αυτό οδηγεί στην ενεργοποίηση του παράγοντα Χ µε σύγχρονη αποκοπή ενός γλυκοπεπτιδικού τµήµατος αποτελούµενο από 52 αµινοξέα, ενώ τα υπόλοια 256 παραµένουν στο µόριο του Xa. Ενώ, κάθε µεµβρανική επιφάνεια που περιέχει φωσφολιπίδια µπορεί να συµβάλλει στη συγκρότηση της προθροµβινάσης, ωστόσο, η επιφάνεια των ενεργοποιηµένων αιµοπεταλίων φαίνεται να είναι η καταλληλότερη όλων. Αυτή η λειτουργία δεν σχετίζεται απόλυτα µε τα φωσφολιπίδια της µεµβράνης, αλλά συνδέεται κυρίως µε την ύπαρξη µιας ή περισσότερων ειδικών πρωτεϊνών, των λεγόµενων πρωτεϊνών σύνδεσης. 22

23 Ο κύριος αναστολέας του παράγοντα Χa είναι η ATIII, αλλά και ο TFPI. ΕΙΚΟΝΑ 5: Η δοµή του παράγοντα Χ Πηγή από το διαδίκτυο : kipedia/commons/f/f8/pdb_3cen_ebi.png&sa=x&ei=1tzitz_ig4zpof3apboj&ved =0CAQQ8wc4Hw&usg=AFQjCNHA5hMoGw5Bva-eQ86kzH4BpHOvWw ΠΡΩΤΕΪΝΗ C Σε αντίθεση µε τις άλλες βιταµινο-κ εξαρτώµενες πρωτεΐνες, η πρωτεΐνη C δεν συµµετέχει η ίδια στην διαδικασία της πήξης, αλλά αποτελεί ελεγκτικό µηχανισµό. Αυτό το επιτυγχάνει µέσω της απενεργοποίησης των παραγόντων Va και VIIIa. Κυκλοφορεί ως ζυµογόνο και αποτελείται από δύο αλυσίδες που βρίσκονται ενωµένες µε έναν δισουλφιδικό δεσµό. H πρωτεΐνη C ενεργοποιείται από το σύµπλοκο θροµβίνηθροµβοµοντουλίνη µετά από υδρόλυση. H ενεργή πρωτεΐνη C (APC) µαζί µε τον συµπαράγοντα PS δηµιουργεί το σύµπλοκο εκείνο που µέσω πρωτεόλυσης απενεργοποιεί τους ενεργούς παράγοντες Va και VIIIa. 23

24 ΣΥΜΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, µε τον όρο συµπαράγοντας, αναφερόµαστε στους παράγοντες εκείνους που είναι απαραίτητοι για τη δράση ενός ενζύµου. Οι παράγοντες αυτοί δεν είναι οι ίδιοι ένζυµα, αλλά πρωτεϊνικοί υποδοχείς. ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ V Ο παράγοντας V είναι µια γλυκοπρωτεΐνη µεγάλου µοριακού βάρους, που παρουσιάζει πολλές οµοιότητες µε τον παράγοντα VIII και παράγεται στα ηπατοκύτταρα. Βρίσκεται κυρίως στο πλάσµα και στα αιµοπετάλια αλλά µπορεί να εντοπιστεί επίσης στα µονοκύτταρα και στα λεµφοκύτταρα. Περίπου το 18-25% του ανθρώπινου παράγοντα V/Va απαντάται στα α-κοκκία των αιµοπεταλίων από όπου απελευθερώνεται κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησής του. Ο παράγοντας V ενεργοποιείται από την θροµβίνη και τον παράγοντα Xa µε µια υδρολυτική διαδικασία, η οποία αποτελείται από πολλά επιµέρους στάδια µε τελικό αποτέλεσµα τον σχηµατισµό ενός ετεροδιµερούς µορίου. Ο παράγοντας Va καταστρέφεται από την APC µε υδρόλυση και αποκοπή ενός κοµµατιού. ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ VΙΙΙ Ο παράγοντας VIII έχει οµόλογη δοµή µε τον παράγοντα V, αλλά συντίθεται τόσο στο ήπαρ, όσο και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ υπάρχει επίσης και στα αιµοπετάλια. Στο πλάσµα κυκλοφορεί ως σύµπλεγµα, που δηµιουργεί µε τον παράγοντα vwf, o οποίος τον σταθεροποιεί αφού απουσία του, η διάρκεια ηµιζωής του παράγοντα VIII µειώνεται στο 1/4. Ο παράγοντας VIII σε συνδυασµό µε τον vwf αποτελούν το λεγόµενο σύµπλεγµα του παράγοντα VIII και έτσι αναφορά στον παράγοντα VIII σηµαίνει αναφορά στο σύµπλεγµα των δυο πρωτεϊνικών συστατικών του τον VIII και του vwf. Η σούλφωση, η οποία παρατηρείται ως τροποποίηση στα έξι αµινοξέα τυροσίνης του αράγοντα VIII, είναι απαραίτητη για την 24

25 αποτελεσµατική ενεργοποίηση του παράγοντα VIII από τη θροµβίνη, τη µέγιστη συγγένεια για τον vwf, αλλά και τη µέγιστη δραστικότητα του συµπλόκου VIIIa/IXa. Η ενεργοποίηση του παράγοντα VIII πραγµατοποιείται τόσο από την θροµβίνη ή/και από τον παράγοντα Xa µε υδρόλυση συγκεκριµένων αµινοξέων σχηµατίζοντας πλέον ένα ετεροτριµερές µόριο. Το αποτέλεσµα της ενεργοποίησης αυτής είναι η απελευθέρωση του παράγοντα VIIIa από τον vwf και εποµένως η λύση του συµπλόκου. Τα µόρια του παράγοντα VIIIa είναι θερµοδυναµικά ασταθή. Ο παράγοντας VIIIa αναστέλλεται από το σύστηµα της APC µέσω επιπρόσθετης υδρόλυσης. ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ Von Willebrand Ο παράγοντας Von Willebrand είναι µια µεγάλη πολυµερής γλυκοπρωτεΐνη, η οποία απαντάται ως σύµπλοκο µε τον παράγοντα VIII. Ο παράγοντας αυτός είναι απαραίτητος για τη συγκόλληση των αιµοπεταλίων µε συστατικά των αγγειακών τοιχωµάτων. Εποµένως, η βασική λειτουργία του ενέχεται στη διαδικασία προσκόλλησης των αιµοπεταλίων πάνω στο τραυµατισµένο τοίχωµα των αγγείων, το οποίο απαντάται απογυµνωµένο από ενδοθηλιακά κύτταρα. Η προσκόλληση επιτελείται µε την συµβολή ειδικών υποδοχέων προσκόλλησης της µεµβράνης των αιµοπεταλίων και των ενδοθηλιακών κυττάρων. Επίσης, ο παράγοντας Von Willebrand συµβάλλει στη συσσώρευση των αιµοπεταλίων, µε έναν µηχανισµό, µέσω του οποίου συνδέεται µε υποδοχείς µεταξύ των αιµοπεταλίων. Για τον λόγο αυτό, ονοµάζεται επιπροσθέτως και συµπαράγοντας της συσσώρευσης των αιµοπεταλίων. ΠΡΩΤΕΪΝΗ S Η πρωτεΐνη S είναι µια απλή βιταµινο-κ εξαρτηµένη γλυκοπρωτεΐνη του πλάσµατος. Η δοµή της διαφέρει από τα υπόλοιπα 25

26 ζυµογόνα που φέρουν τη δοµή "Gla" και σε αντίθεση µε τις άλλες βιταµινο-κ εξαρτηµένες πρωτεΐνες δεν διαθέτει τη δοµή σερινικής πρωτεάσης, εποµένως, και δεν έχει την ικανότητα να καταλύει αντιδράσεις. Η πρωτεΐνη S ως συµπαράγοντας συνδέεται µε την πρωτεΐνη C και το σύµπλοκο που δηµιουργείται αναστέλλει τους παράγοντες Va και VIIIa από φορές περισσότερο. Σε αντίθεση µε τους άλλους συµπαράγοντες δεν απαιτεί πρωτεολυτική ενεργοποίηση. Η πρωτεΐνη S µόνη της παρουσιάζει περιορισµένη αντιπηκτική δράση µέσω της ικανότητάς της να συναγωνίζεται µε τον παράγοντα Xa στη σύνδεσή του µε τον παράγοντα Va. ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΠΑΦΗΣ Οι παράγοντες αυτοί έχουν ιδιότητες, που αποδίδονται κυρίως στην επαφή τους µε ηλεκτραρνητικές επιφάνειες. Στην περίπτωση, δηλαδή, που έρθουν σε επαφή, in-vitro, µε επιφάνειες υδρόφιλεςηλεκτραρνητικές, όπως για παράδειγµα, γυαλί, βαµβάκι, καολίνη και άλλα, προσκολλώνται αµέσως επάνω τους. Η επαφή αυτή επιφέρει µια σειρά από δοµικές µεταβολές µε τελικό αποτέλεσµα την ενεργοποίηση των παραπάνω παραγόντων. ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΧΙ Ο παράγοντας ΧΙ συντίθεται στο ήπαρ ως ζυµογόνο σερινικής πρωτεάσης. Αποτελείται από δυο όµοιες πολυπεπτιδικές αλυσίδες, που συνδέονται µε δισουλφιδικούς δεσµούς και στο πλάσµα απαντάται να κυκλοφορεί ως σύµπλοκο µε το ΜΜΒΚ. Ο παράγοντας ΧΙ µπορεί να ενεργοποιηθεί in-vitro από τον παράγοντα ΧΙΙa µε πρωτεολυτική υδρόλυση µόνο παρουσία του ΜΜΒΚ, ο οποίος συνδέεται στις αρνητικά φορτισµένες επιφάνειες. Σε κάποιες περιπτώσεις, όπως για παράδειγµα στην υγρή φάση και σε φορτισµένες επιφάνειες, η θροµβίνη µπορεί να ενεργοποιήσει τον παράγοντα ΧΙ ακόµη και απουσία των άλλων παραγόντων επαφής. Ο παράγοντας ΧΙ µπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί από τη θροµβίνη στην επιφάνεια των ενεργοποιηµένων αιµοπεταλίων. 26

27 Σε αντίθεση µε τους άλλους παράγοντες επαφής, η έλλειψη του παράγοντα ΧΙ µπορεί να οδηγήσει σε αιµορραγική διάθεση δείχνοντας το σηµαντικό ρόλο του παράγοντα ΧΙ στην όλη διαδικασία της αιµόστασης. ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΧΙΙ ΚΑΙ ΠΡΟΚΑΛΛΙΚΡΕΪΝΗ Ο παράγοντας ΧΙΙ και η προκαλλικρεΐνη είναι κι αυτά ζυµογόνα σερινικών πρωτεασών. Ο παράγοντας ΧΙΙ ενεργοποιείται από την καλλικρεΐνη και η προκαλλικρεΐνη από τον παράγοντα ΧΙΙ µε περιορισµένη πρωτεόλυση. ΜΜΒΚ (ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΒ ΚΟΝΙΝΟΓΟΝΟ) Το Μεγάλου ΜΒ Κινινογόνο ανήκει στα κινινογόνα του πλάσµατος που είναι πρόδροµες ουσίες βιολογικών δραστικών κινίνων, όπως η βραδυκινίνη. Το ΜΜΒΚ υδρολύεται σε δυο σηµεία από την καλλικρεΐνη οπότε και απελευθερώνεται η δραστική βραδυκινίνη. Άτοµα που εµφανίζουν έλλειψη του παράγοντα ΧΙΙ, της προκαλλικρεΐνης και του ΜΜΒΚ δεν εµφανίζουν αιµορραγική διάθεση ακόµη και µετά από σοβαρό τραυµατισµό ή χειρουργείο. ΑΛΛΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, στη διαδικασία της πήξης, φαίνεται να συµβάλλουν κάποιες πρωτεΐνες, όπως ο ιστικός παράγοντας TF, το ινωδογόνο και η θροµβοµοντουλίνη, που δεν απαιτούν για την ενεργοποίησή τους τη συµµετοχή ενός άλλου παράγοντα ή συµπλέγµατος, αλλά ενεργοποιούνται αµέσως µετά την αποκάλυψή τους. 27

28 ΙΣΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ (TF) Ο ιστικός παράγοντας ή θροµβοπλαστίνη είναι µια διαµεµβρανική θερµοευαίσθητη και υδρόφοβη γλυκοπρωτεΐνη, πλούσια σε υδατάνθρακες. Αντίθετα µε πολλούς παράγοντες της πήξης που εµφανίζουν υψηλό ποσοστό οµολογίας µεταξύ τους, η δοµή του ιστικού παράγοντα είναι µοναδική. Το µόριο του σχηµατίζεται από µια απλή πολυπεπτιδική αλυσίδα µε 263 αµινοξέα, η οποία διακρίνεται σε τρεις δοµικές περιοχές, µια εξωκυττάρια, µια διαµεµβρανική και µια ενδοκυττάρια. Πιο συγκεκριµένα: Η εξωκυττάρια περιοχή, αποτελούµενη από 219 αµινοξέα, µεταξύ των οποίων υπάρχει ένα κατάλοιπο µεθειονίνης και τέσσερα κυστεΐνης. Στην περιοχή αυτή υπάρχει πλευρά σύνδεσης µε τον παράγοντα VII, τον οποίο δεσµεύει µέσω αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης µεταξύ των δυο µορίων. Το εξωκυττάριο τµήµα του VIIa αποτελείται από διάφορες περιοχές. Μια από τις περιοχές αυτές, η καρβοξυλιωµένη Gla περιοχή, παρουσία ιόντων Ca, δεσµεύει αρνητικά φορτισµένα φωσφολιπίδια. Η δέσµευση των φωσφολιπιδίων στον VIIa ενισχύει τη σύνδεση αυτού µε τον TF. Η διαµεµβρανική περιοχή είναι αυτή που διαπερνά την υδρόφοβη λιπιδική διπλοστιβάδα της κυτταρικής µεµβράνης και αποτελεί το συνδετικό τµήµα ανάµεσε στις άλλες δύο περιοχές, αποτελούµενη από 23 ιδιαίτερα υδρόφοβα αµινοξέα. Η τρίτη περιοχή, η ενδοκυττάρια, είναι αυτή που σχετίζεται µε τη µετάδοση κάποιων συγκεκριµένων σηµάτων µέσα στο κύτταρο και αποτελεί τµήµα κάποιων µονοπατιών σηµατοδότησης. Είναι ένα βραχύ κυτταροπλασµατικό τµήµα, που φέρει 21 αµινοξέα και µια κυστεΐνη µεταξύ τους στο C- τελικό άκρο. Αυτή συνδέεται µε δισουλφιδικό δεσµό προς την εξωκυττάρια περιοχή. Η δράση ιστικού παράγοντα είναι η χαρακτηριστική µιας ειδικής πρωτεΐνης που βρίσκεται σε διάφορα ποσά στις µεµβράνες των κυττάρων όλων των ιστών. Υπό φυσιολογικές συνθήκες τα κύτταρα του αίµατος και τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων δεν εκφράζουν τον ιστικό παράγοντα. Αντιθέτως, ιστοί πλούσιοι σε TF είναι οι πνεύµονες, ο εγκέφαλος και ο πλακούντας. Εκχύλιση των 28

29 ιστών αυτών µε φυσιολογικό ορό, δίνει παρασκεύασµα θροµβοπλαστίνης µε ισχυρή ενεργότητα ιστικού παράγοντα. Μόνο σε περιπτώσεις αγγειακής βλάβης ο TF έρχεται σε επαφή µε τα συστατικά του αίµατος και εντοπίζεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα αιµοπετάλια, στα λευκά αιµοσφαίρια και σε κύτταρα που περιβάλλουν τα αγγεία, όπως για παράδειγµα οι ινοβλάστες, αλλά και στα µονοκύτταρα. Εποµένως, ένας τραυµατισµός αγγείου που σηµαίνει αυτοµάτως και τραυµατισµό των αντίστοιχων κυττάρων του ενδοθηλίου, αλλά και των γύρω ιστών, έχει ως αποτέλεσµα την έκλυση του ιστικού παράγοντα. Ο TF συνδέεται µε τον παράγοντα VII ή VIIa και σχηµατίζει το σύµπλοκο VIIa/TF συµβάλλοντας έτσι στην πυροδότηση της πήξης. Στη συνέχεια το σύµπλοκο TF/VIIa ενεργοποιεί τόσο µόρια VII,τα οποία συνδέονται σε διαθέσιµες περιοχές σύνδεσης µορίων TF όσο και τους παράγοντες IX και X. Συνεπώς, ο TF λειτουργεί ως υποδοχέας της µεµβράνης των ενδοθηλιακών κυττάρων αλλά και ως συµπαράγοντας των FVIΙ και FVΙΙa. Ο ιστικός παράγοντας δρώντας ως συµπαράγοντας έχει µοναδική συµπεριφορά µεταξύ των άλλων συµπαραγόντων κι αυτό γιατί σε αντίθεση µε τους υπόλοιπους, δεν απαιτεί για την ενεργοποίησή του άλλες επιπρόσθετες διαδικασίες, αλλά µπορεί να πυροδοτήσει την διαδικασία της πήξης µόνο µε τη φυσική σύνδεσή του µε τον παράγοντα VII ή VΙΙa. Ο TF σχετίζεται µε µια οικογένεια πρωτεϊνών, γνωστές µε την ονοµασία «οικογένεια υποδοχέων κυτταροκινών τύπου II». Οι κυτταροκίνες είναι µικρές πρωτεΐνες που µπορούν να επηρεάσουν τη συµπεριφορά των λευκών αιµοσφαιρίων του αίµατος. Η σύνδεση του TF µε τον VIIa έχει βρεθεί επίσης ότι µπορεί να δώσει ενδοκυττάριο σήµα για την έναρξη σχηµατισµού νέων αιµοφόρων αγγείων ή αλλιώς της αγγειογένεσης, αλλά και για την αναστολή της απόπτωσης των κυττάρων, δηλαδή του κυτταρικού θανάτου. 29

30 ΕΙΚΟΝΑ 5: Η δοµή του TF Πηγή από το διαδίκτυο : kipedia/en/b/b8/tissue_factor.png&sa=x&ei=lthitzt1j4ovoramrnej&ved=0caq Q8wc4Hg&usg=AFQjCNFco1FveEIgwigQaBryhO13L5V9zQ ΕΙΚΟΝΑ 6: Σύµπλοκο TF/VIIa Πηγή από το διαδίκτυο : thumb/0/01/tffviiacomplex.png/180px- 30

31 TFFVIIaComplex.png&sa=X&ei=RNliTbDwB4jsOZPdyMUJ&ved=0CAQQ8wc&us g=afqjcnhbf9dlegndqqp0qlerhoceox2nqa ΘΡΟΜΒΟΜΟΝΤΟΥΛΙΝΗ (ΤΜ) Η θροµβοµοντουλίνη είναι µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη που λειτουργεί ως υποδοχέας της θροµβίνης στην µεµβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων. Το µόριο της αποτελείται από πέντε δοµικές περιοχές που εντοπίζονται σε τρεις περιοχές µια εξωκυττάρια, µια διαµεµβρανική και µια ενδοκυττάρια. Το Ν-τελικό άκρο του µορίου εκτείνεται στην εξωκυττάρια περιοχή και το C-τελικό στην ενδοκυττάρια. Η θροµβίνη χωρίς τη συµµετοχή κάποιου συµπαράγοντα υδρολύει αρκετά υποστρώµατα, όπως για παράδειγµα το ινωδογόνο και τους παράγοντες V και VIII. Ωστόσο, όταν συνδεθεί µε τη ΤΜ στα ανέπαφα ενδοθηλιακά κύτταρα, αλλάζει η διαµόρφωσή της και µπορεί να ενεργοποιήσει την πρωτεΐνη C. H θροµβίνη που συνδέεται στη ΤΜ δεν µπορεί να ενεργοποιήσει πλέον ούτε τα αιµοπετάλια, ούτε το ινωδογόνο, ούτε τους παράγοντες V και VIII. Εποµένως, η θροµβοµοντουλίνη έχει την ιδιότητα να αλλάζει τη δράση της θροµβίνης από προπηκτική σε αντιπηκτική. ΙΝΩ ΟΓΟΝΟ Το ινωδογόνο είναι µια διµερής γλυκοπρωτεΐνη που συντίθεται στα ηπατικά κύτταρα και τα µεγακαρυοκύτταρα. Το µόριό του έχει επιµηκυσµένη µορφή µε σφαιροειδές κέντρο που συνδέεται µε δυο ραβδοειδή τµήµατα µε τα δυο επίσης σφαιροειδή του άκρα. Η συγκέντρωσή του στο πλάσµα είναι περίπου 7µM. Στη φυσική του µορφή, το ινωδογόνο χρησιµεύει για την κατασκευή γεφυρών ανάµεσα στα αιµοπετάλια, ενώνοντάς τα µέσω των πρωτεϊνών GpIIb/IIIa της επιφανείας τους, αν και η κύρια λειτουργία του ινωδογόνου είναι να δρα ως πρόδορµο µόριο του ινώδους. Όσον αφορά τη φυσιολογία του, το ινωδογόνο, η κύρια πρωτεϊνη του συστήµατος πήξης των σπονδυλωτών, είναι ένα εξαµερές που περιέχει δύο σετ τριών διαφορετικών αλυσίδων Αα, Ββ και γ είναι δηλαδή της µορφής (Αα Ββ γ) 2. Αυτές, ενώνονται µεταξύ 31

32 τους µε δισουλφιδικούς δεσµούς. Τα αµινοτελικά άκρα αυτών των τριών αλυσίδων είναι εξελικτικώς συγγενή και περιέχουν τις κυστεΐνες οι οποίες συµµετέχουν στη σταυροσύνδεση των αλυσίδων. Όµως, δεν υπάρχει οµοιότητα στο καρβοξυτελικό άκρο της α αλυσίδας σε σχέση µε τις β και γ αλυσίδες. Το καρβοξυτελικό άκρο των β και γ αλυσίδων σχηµατίζει ένα πρωτεϊνικό πεδίο περίπου 270 αµινοξέων. Αυτό το πεδίο περιέχει τέσσερεις διατηρηµένες θέσεις κυστεΐνης, που συµµετέχουν σε δύο δισουλφιδικούς δεσµούς. Στις α και β αλυσίδες, υπάρχει µια µικρή πεπτιδική αλληλουχία, που καλείται ινωδοπεπτίδιο. Αυτά τα µικρά πεπτίδια είναι που προλαµβάνουν τον αυθόρµητο αυτοπολυµερισµό του ινωδογόνου. Η θροµβίνη υδρολύει έναν πεπτιδικό δεσµό σε κάθε Αα και Ββ αλυσίδα. Μετά την υδρόλυση απελευθερώνονται τα ινωδοπεπτίδια Α και Β και δηµιουργούνται τα µονοµερή µόρια ινικής του τύπου (αβγ) 2 τα οποία συσσωµατώνονται και σχηµατίζουν τις αδιάλυτες ίνες της ινικής. Η τελική σταθεροποίηση και δηµιουργία του πλέγµατος ινικής πραγµατοποιείται από τον παράγοντα ΧΙΙΙa ο οποίος ενεργοποιείται από την θροµβίνη. Ο παράγοντας ΧΙΙΙa σταθεροποιεί την ινική και την προστατεύει από υπερβολική ινωδόλυση. Υπερβολική παραγωγή ινώδους λόγω ενεργοποίησης του καταρράκτη του µηχανισµού της πήξης, έχει ως αποτέλεσµα την ανάπτυξη θρόµβωσης, ενώ ελαττωµένη παραγωγή ινώδους έχει ως αποτέλεσµα την παρουσία αιµορραγιών. υσλειτουργία ή νόσηµα του ήπατος µπορεί να οδηγήσει σε ελάττωση της παραγωγής ινωδογόνου, ή στην παραγωγή µη φυσιολογικών µορίων ινωδογόνου, µε ελαττωµένη δραστικότητα (δυσινωδογοναιµία). Οι κληρονοµικές ανωµαλίες του ινωδογόνου (το γονίδιό του βρίσκεται στο χρωµόσωµα 4) είναι τόσο ποιοτικής, όσο και ποσοτικής φύσης και περιλαµβάνουν τις πιο κάτω καταστάσεις: ανινωδογοναιµία, υπινωδογοναιµία, δυσινωδογοναιµία και υποδυσινωδογοναιµία. 32

33 ΕΙΚΟΝΑ 7: Ινωδογόνο Πηγή από το διαδίκτυο : du/people/teller/fig1.gif&sa=x&ei=59pitdcxbombos7r5m8j&ved=0caqq8wc&u sg=afqjcnfxd-buyvws5ujevzkm-pka_fhtxg ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ Τα αιµοπετάλια είναι δισκοειδείς σχηµατισµοί και αποτελούν θραύσµατα της µεµβράνης των µεγακαρυοκυττάρων. Ένα µεγακαρυοκύτταρο έχει τη δυνατότητα παραγωγής αιµοπεταλίων, ενώ κάθε αιµοπετάλιο έχει διάρκεια ζωής 9-10 ηµέρες. Αποτελούνται από τη µεµβράνη, το επικάλυµµα της µεµβράνης που καλείται γλυκοκάλυκας, τον κυτταρικό σκελετό και το κυτταρόπλασµα. Τα αιµοπετάλια είναι εποµένως, µικρά απύρηνα κύτταρα µε δισκοειδή µορφή και µέγεθος περίπου 1x3 µm τα οποία παρέχουν την κατάλληλη επιφάνεια στην οποία πραγµατοποιούνται οι αντιδράσεις της πήξης µε τελικό αποτέλεσµα τη δηµιουργία θροµβίνης. Τα φωσφολιπίδια αποτελούν το κύριο δοµικό υλικό της µεµβράνης των αιµοπεταλίων. Αποτελούνται από µια υδρόφιλη κεφαλή και δυο υδρόφοβες ουρές. Τα φωσφολιπίδια και κυρίως η φωσφατιδυλοσερίνη, που συµµετέχουν στην πήξη του αίµατος 33

34 αλληλεπιδρούν µε τους παράγοντες της πήξης µόνο ύστερα από την ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες τα αιµοπετάλια δεν ενεργοποιούνται γεγονός το οποίο οφείλεται κυρίως στο εξωτερικό τους αρνητικό φορτίο και στο δισκοειδές σχήµα τους, που καθιστά τους υποδοχείς απρόσιτους στα διάφορα µόρια που ενέχονται στις διαδικασίες. Τα αιµοπετάλια είναι κύτταρα συσταλτά και εκκριτικά, και συµµετέχουν ενεργά στις σηµαντικές διαδικασίες της αιµόστασης µε τους εξής τρόπους: Προσκολλώνται και συσσωρεύονται στο σηµείο τραυµατισµού του αγγείου ιευκολύνουν και προάγουν την πήξη του αίµατος στη φωσφολιπιδική τους κυτταρική επιφάνεια Απελευθερώνουν από τα α και δ κοκκία του κυτταροπλάσµατος σηµαντικές για την αιµόσταση ουσίες Λαµβάνουν µέρος στη συστολή του θρόµβου Πιο συγκεκριµένα : η φιµπρονεκτίνη, η βιτρονεκτίνη, ο παράγοντας von Willebrand και η P-selectin προάγουν την προσκόλληση των αιµοπεταλίων ο αιµοπεταλιακός παράγοντας IV, η θροµβοσπονδίνη και το ινωδογόνο προάγουν τη συσσώρευση των αιµοπεταλίων το ινωδογόνο και οι παράγοντες V, XI, von Willebrand προάγουν την πήξη του αίµατος η θροµβοσθενίνη και ο παράγοντας XIII προάγουν το φαινόµενο της συστολής του θρόµβου και τη σταθεροποίηση του ινώδους αντίστοιχα η σεροτονίνη και η θροµβοξάνη προάγουν την αγγειοσύσπαση. Τα µη ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια περιέχουν τουλάχιστον τρεις πρωτεΐνες σύνδεσης για τη θροµβίνη. Ο παράγοντας Va δρα ως πρωτεΐνη σύνδεσης για τον παράγοντα Xa στην επιφάνεια των ενεργοποιηµένων αιµοπεταλίων, αλλά τα αιµοπετάλια διαθέτουν επίσης, πρωτεΐνη σύνδεσης για τον παράγοντα IXa. Η σύνδεση του ινωδογόνου µε τα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια γίνεται επίσης µέσω µιας πρωτεΐνης σύνδεσης και τέλος φαίνεται τα αιµοπετάλια να έχουν κατάλληλους υποδοχείς και για την προθροµβίνη που οδηγούν στη δηµιουργία προθροµβινάσης (FΧa-FVa) συµβάλλοντας µε αυτόν τον τρόπο στην αποτελεσµατικότερη ενεργοποίησή της. 34

35 Έχουν παρατηρηθεί διαταραχές των αιµοπεταλίων όσον αφορά τον αριθµό, τη µορφολογία και την ποιότητά τους. Στις αριθµητικές διαταραχές διακρίνουµε τη θροβοκυττάρωση (PLT > ) και τη θροµβοπενία (PLT< ), στις µορφολογικές τα µεγάλα και τα µικρά αιµοπετάλια, ενώ οι ποιοτικές διαταραχές αναφέρονται σε λειτουργικές ανωµαλίες, δηλαδή σε βλάβες της προσκόλλησης, της συσσώρευσης και της αντίδρασης απελευθέρωσης και ονοµάζονται θροµβοπάθειες. Από τις παραπάνω διαταραχές οι θροµβοπενίες αποτελούν σχετικά συχνό εύρηµα στην κλινική πράξη. Μπορεί να οφείλονται σε ανεπαρκή παραγωγή, αυξηµένη κατανάλωση ή καταστροφή των αιµοπεταλίων. Θεραπευτικά γίνεται προσπάθεια αντιµετώπισής τους και µόνο σε ακραίες περιπτώσεις γίνεται µετάγγιση αιµοπεταλίων. Αυτό συµβαίνει λόγω της δυσκολίας που παρουσιάζεται από την ανάπτυξη αντισωµάτων µετά από επαναλαµβανόµενη λήψη αιµοπεταλίων από τον πάσχοντα οργανισµό. ΕΙΚΟΝΑ 8: Συσσώρευση αιµοπεταλίων Πηγή από το διαδίκτυο : om/images/showfullwatermarked.html/p activated_platelets,_sem- SPL.jpg%3Fid%3D &sa=X&ei=fN5iTdioJsSCOoPzrKMJ&ved=0CA QQ8wc4dg&usg=AFQjCNGUXZa5mAP_S5xWn0i6zPYREWKixQ 35

36 ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΗΣ ΠΗΞΗΣ Το πόσο αποτελεσµατική µπορεί να είναι η διαδικασία της πήξης εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από την ταχύτητα σχηµατισµού της θροµβίνης. Το αποτέλεσµα που προκύπτει είναι πως κάθε βλάβη σε οποιοδήποτε από τα βήµατα του µονοπατιού στη διαδοχή των ενζυµικών αντιδράσεων, όπως για παράδειγµα η έλλειψη ενός ή περισσότερων παραγόντων της πήξης, η παρουσία ενός αναστολέα του σχηµατισµού ή της δραστηριότητας ενός ενζύµου, έχει ως αποτέλεσµα την ανεπάρκεια της αιµοστατικής λειτουργίας. Η πολυπλοκότητα του µηχανισµού πήξης, η οποία αρχίζει από το στάδιο της πυροδότησης και τελειώνει µε το σχηµατισµό του δικτύου της ινικής και στη συνέχεια της λύσης του, είναι πράγµατι η απόλυτη έκφραση ενός πολύ καλά οργανωµένου συστήµατος που µεγιστοποιεί ένα αρχικά ήπιο ερέθισµα µε µια ταχύτατη ποσοτικά και ποιοτικά παραγωγή θροµβίνης. Η ταχύτητα αυτή είναι ο µοναδικός δυνατός τρόπος για να µετατραπεί το ινωδογόνο σε ινική και να αντιµετωπιστεί η ανασταλτική δράση των πλασµατικών αντιθροµβινών. Ο κύριος ρυθµιστικός παράγοντας της κινητικής του σχηµατισµού της θροµβίνης, είναι το ίδιο το ένζυµο, η θροµβίνη. Ο µηχανισµός µέσω του οποίου καταφέρνει να επιτελέσει τη ρύθµιση αυτή, είναι το θετικό και το αρνητικό feed-back. Για παράδειγµα, ενεργοποιώντας τους παράγοντες VIII και V συµµετέχει αποφασιστικά στον ταχύτατο σχηµατισµό των ενζυµικών συµπλεγµάτων που προηγούνται του σχηµατισµού της προθροµβινάσης. Από την άλλη, µόνος ο παράγοντας Χα ακόµη και µε παρουσία φωσφολιπιδίων και Ca ++ δεν ενεργοποιεί την προθροµβίνη παρά µόνο µε πολύ αργό ρυθµό. Αντίθετα, µε την παρουσία του Va η ενεργοποίηση είναι εκρηκτική, έως και φορές παραπάνω. ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΠΗΞΗΣ Αναστολείς του συστήµατος της πήξης, είναι κάποιες πρωτεΐνες του αίµατος σε υψηλές συγκεντρώσεις. Οι πρωτεΐνες αυτές αποτελούν το 10% των πρωτεϊνών του πλάσµατος και δρουν ως αντιπηκτικές 36

37 αντιθροµβωτικές ουσίες, αναστέλλοντας τη δράση της θροµβίνης είτε άµεσα είτε έµµεσα. Οι τρόποι που µπορεί ένας από τους παράγοντες αυτούς να αναστείλει την διαδικασία της πήξης είναι οι εξής: δηµιουργία σταθερού συµπλέγµατος µε τη θροµβίνη, όπως για παράδειγµα η αντιθροµβίνη ΙΙΙ ή ATIII αποδόµηση κάποιων παραγόντων, όπως του Va και VIIIa ή του παράγοντα Xa από την ενεργοποιηµένη πρωτεΐνη C ή την πρωτεΐνη Z αντίστοιχα ενίσχυση της δράσης µιας πρωτεΐνης όπως συµβαίνει για την πρωτεΐνη C, που ενισχύεται από την πρωτεΐνη S απενεργοποίηση της συνδεδεµένης µε το ινώδες θροµβίνης, όπως η δράση της χιρουδίνης Οι σηµαντικότεροι αναστολείς φαίνονται παρακάτω: Η πρωτεΐνη C είναι µια βιταµινο-κ-εξαρτώµενη γλυκοπρωτεΐνη και παράγεται αποκλειστικά στα ηπατοκύτταρα. Αποτελεί έναν από τους αποτελεσµατικότερους µηχανισµούς αναστολής της πήξης. Σύµφωνα µε αυτόν το ζυµογόνο, δηλαδή η πρωτεΐνη C, ενεργοποιείται από το σύµπλεγµα θροµβίνης-θροµβοµοντουλίνης πάνω στην επιφάνεια των ανέπαφων ενδοθηλιακών κυττάρων του τοιχώµατος των αγγείων. Η ενεργοποιηµένη πρωτεΐνη C (activated protein C, APC) εµποδίζει την εξέλιξη της πήξης µέσω υδρόλυσης των ενεργοποιηµένων παραγόντων Va και VIIIa. Η δράση αυτή ενισχύεται από µε την παρουσία της πρωτεΐνης S, ιόντων Ca ++ και φωσφολιπιδίων. Συνεπώς το σύστηµα αυτό παρεµβαίνει εµποδίζοντας το σχηµατισµό των συµπλόκων (της ενδογενούς δεκάσης και της προθροµβινάσης), δηλαδή εµποδίζει το µηχανισµό µεγιστοποίησης της πήξης. Η αντιθροµβίνη III (ATIII) είναι ο κυριότερος εκπρόσωπος της οµάδας αναστολέων σερινών και σε αυτό το ένζυµο στηρίζεται η δράση µιας µεγάλης κατηγορίας αντιπηκτικών, των ηπαρονοειδών. Είναι µια γλυκοπρωτεΐνη που συντίθεται στο ήπαρ και τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων. ρα αναστέλλοντας τους παράγοντες XIIa, XIa,, IXa, το σύµπλοκο TF/VIIa και το ινωδολυτικό ένζυµο πλασµίνη, αλλά κυρίως τον παράγοντα Xa και τη θροµβίνη, σχηµατίζοντας σταθερά ανενεργά σύµπλοκα. Είναι ο µεγαλύτερος αναστολέας της θροµβίνης. Κύριo γνώρισµα της δράσης της ΑΤ-ΙΙΙ είναι η αργή ταχύτητα εξουδετέρωσης της θροµβίνης. Η ταχύτητα αυτή γίνεται φορές µεγαλύτερη µε τη παρουσία ηπαρίνης. 37

38 Ο συµπαράγοντας II της ηπαρίνης (HCII) αναστέλλει τη θροµβίνη, µε µηχανισµό παρόµοιο µε αυτό της ATIII, η δράση του επιταχύνεται από την ηπαρίνη, αλλά σε αντίθεση µε αυτή δεν αναστέλλει άλλους παράγοντες πήξης. Παρότι ο ακριβής ρόλος του HCII στη ρύθµιση της αιµόστασης δεν είναι τελείως γνωστός, έχει αναφερθεί σύνδεση µεταξύ έλλειψης του παράγοντα αυτού και θρόµβωσης. Ο TFPI (tissue factor pathway inhibitor) παράγεται κυρίως στο ενδοθήλιο και στα µεγακαρυοκύτταρα. Συνδέεται µε τον Xa δηµιουργώντας το σύµπλεγµα TFPI/Xa και στη συνέχεια αυτό, παρουσία ιόντων Ca ++, συνδέεται στο σύµπλεγµα TF/VIIa και το αναστέλλει. Η απουσία δράσης του TF στο φυσιολογικό-µη τραυµατισµένο ενδοθήλιο και στο πλάσµα αποδίδεται στην παρουσία του TFPI. Η α2-µακροσφαιρίνη, είναι γλυκοπρωτεΐνη µεγάλου µοριακού βάρους, που αναστέλλει την καλλικρεΐνη, αλλά έχει ταυτόχρονα ισχυρή αντιθροµβωτική δράση, µικρότερη όµως της ATIII. Η δράση της φτάνει το 25% της συνολικής αντιθροµβωτική δράσης του πλάσµατος, ενώ η ATIII εξουδετερώνει το 65% της θροµβίνης. Η α2-αντιπλασµίνη είναι ένας αναστολέας πρωτεάσης σερίνης και αναστέλλει την πλασµίνη, ένα σηµαντικό ένζυµο που συµµετέχει στην ινωδόλυση και στην αποδόµηση διάφορων άλλων πρωτεϊνών. Η α1-αντιθρυψίνη είναι σφαιρίνη που παράγεται στο ήπαρ και αναστέλλει ασθενώς τη θροµβίνη και πιθανώς άµεσα τον FXII. Η χιρουδίνη απενεργοποιεί τόσο την ελεύθερη όσο και τη συνδεδεµένη µε το ινώδες θροµβίνη και επηρεάζει όλες τις παραµέτρους της αιµόστασης εκτός από το ινωδογόνο, την πρωτεΐνη C και την ATIII. Η πρωτεΐνη Ζ είναι µία βιταµινο-κ-εξαρτώµενη γλυκοπρωτεΐνη και ο κύριος ρόλος της είναι η αποδόµηση του παράγοντα Χ, διαδικασία που µπορεί να γίνει από τις ZPI (protein Z-related protease inhibitor), αλλά η παρουσία της πρωτεΐνης Ζ επιταχύνει την αντίδραση κατά 1000 φορές. 38

39 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΗΞΗΣ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Ο καταρράκτης της πήξης της δευτερογενούς ή µόνιµης αιµόστασης αποτελείται από δυο µονοπάτια. Το πρώτο ονοµαζεται ενδογενές, ενδαγγειακό ή σύστηµα επαφής και συµµετέχουν στην κατάλυση µόνο παράγοντες του πλάσµατος και των κυττάρων του αίµατος. Το δεύτερο είναι το εξωγενές, εξωαγγειακό ή αλλιώς µονοπάτι του ιστικού παράγοντα στο οποίο τα ένζυµα της πήξεως ενεργοποιούνται από παράγοντες που απελευθερώνονται από τους τραυµατισµένους ιστούς. Αυτές οι δύο οδοί οδηγούν στον τελικό σχηµατισµό του ινώδους. Υπήρχε η άποψη ότι ο καταρράκτης της πήξης αποτελείται από δυο ισάξιους δρόµους, που ενώνονται σε ένα κοινό. Είναι, όµως, πλέον αποδεκτό ότι το βασικό µονοπάτι για την έναρξη της πήξης του αίµατος είναι το εξωγενές. Τα δυο αυτά µονοπάτια αποτελούν µια σειρά από αλληλένδετες αντιδράσεις, στις οποίες ένα ζυµογόνο µιας πρωτεάσης σερίνης και ο γλυκοπρωτεϊνικός συµπαράγοντάς του ενεργοποιούνται, έτσι ώστε για να καταφέρουν στη συνέχεια να καταλύσουν την επόµενη αντίδραση στον καταρράκτη, καταλήγοντας στο σχηµατισµό σταθερού ινώδους. Οι παράγοντες πήξης είναι γενικά πρωτεάσες της σερίνης, µε µερικές εξαιρέσεις όπως οι FV και ο FVIII, που είναι γλυκοπρωτεΐνες και ο FXIII, που είναι τρανσγλουταµινάση. Οι πρωτεάσες σερίνης δρουν σαν ένζυµα καταλύοντας άλλες πρωτεΐνες σε συγκεκριµένες θέσεις. Ο µηχανισµός της πήξης µπορεί να συνοψιστεί ως εξής : Εξωγενές µονοπάτι (tissue factor pathway) : Ο κύριος ρόλος του είναι η τελική παραγωγή θροµβίνης, η οποία είναι το πιο σηµαντικό µόριο του καταρράκτη της πήξης από την άποψη των αλληλεπιδράσεων που ασκεί σε πολλά µόρια που συµµετέχουν στη διαδικασία. Το εξωγενές µονοπάτι ενεργοποιείται πάνω στο αγγειακό τραύµα το οποίο έχει ως αποτέλεσµα την αποκάλυψη του TF και την αλληλεπίδραση του µε τον VIIa, ο οποίος κυκλοφορεί στο πλάσµα σε ποσότητα µεγαλύτερη από κάθε άλλο ενεργοποιηµένο παράγοντα πήξης. Στη συνέχεια, το σύµπλοκο TF/VIIa,µε τη βοήθεια των ιόντων ασβεστίου και τη συµβολή των αρνητικά φορτισµένων φωσφολιπιδίων, τα οποία ανήκουν στις µεµβράνες των ενεργοποιηµένων αιµοπεταλίων, σχηµατίζουν το σύµπλοκο της εξωγενούς δεκάσης. 39

40 Η εξωγενής δεκάση ενεργοποιεί µε περιορισµένη πρωτεόλυση τον παράγοντα X σε Xa. O Xa και ο συµπαράγοντάς του Va, παρουσία ιόντων Ca και φωσφολιπιδίων, σχηµατίζουν την προθροµβινάση, η οποία ενεργοποιεί την προθροµβίνη σε θροµβίνη. Στη συνέχεια η θροµβίνη ενεργοποιεί άλλα µόρια που συµµετέχουν στη διαδικασία της πήξης, συµπεριλαµβανοµένων των παραγόντων V και VII. Η αρχική ενεργοποίηση του VII γίνεται από τη θροµβίνη, τον XIa, την πλασµίνη, τον XII, τον και το σύµπλοκο TF/VIIa. Η ενεργοποίηση του X από το TF/VIIa αναστέλλεται σχεδόν αµέσως από τον TFPI (tissue factor pathway inhibitor). Επίσης, η θροµβίνη ενεργοποιεί και απελευθερώνει τον VIII από τον vwf. Ο VIIIa είναι ο συµπαράγοντας του IXa και µαζί σχηµατίζουν την ενδογενή δεκάση, παρουσία ιόντων Ca και φωσφολιπιδίων, που ενεργοποιεί τον X και έτσι ο κύκλος συνεχίζεται. Πρέπει να τονιστεί πως το εξωγενές µονοπάτι διαθέτει πολύ βραχύτερο δρόµο ενεργοποίησης, εποµένως, στην περίπτωση αυτή, η πήξη επιτελείται γρηγορότερα. Επίσης, υπάρχει η δυνατότητα ενεργοποίησης του in vitro από την προσθήκη ιστικού εκχυλίσµατος θροµβοπλαστίνης, το οποίο περιέχει ιστικό παράγοντα. Ενδογενές µονοπάτι ή σύστηµα επαφής (contact activation pathway): Το ενδογενές µονοπάτι ενεργοποιείται όταν εκτεθεί το κολλαγόνο, στο σηµείο του τραυµατισµού, που επικαλύπτει εσωτερικά τα αγγεία. Στο στάδιο αυτό, σχηµατίζεται το αρχικό σύµπλοκο πάνω στο κολλαγόνο από υψηλού µοριακού βάρους κινινογόνα (ΜMΒK),την προκαλλικρεΐνη και τον XII. Η προκαλλικρεΐνη µετατρέπεται σε καλλικρεϊνη, η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί τον XII σε XIIa. Ο XIIa µπορεί να υδρολύσει επιπλέον καλλικρεΐνη καθώς και να ενεργοποιήσει µε περιορισµένη πρωτεόλυση τον XI. Επίσης, απελευθερώνει τη βραδυκινίνη, που είναι αγγειοδιαστολέας, από τα ΜMΒK. Ο XIa που προκύπτει, ενεργοποιεί στη συνέχεια τον IX, παρουσία ιόντων Ca ++. Ο IXa µαζί µε τον συµπαράγοντά του VIIIa, παρουσία ιόντων Ca ++ και φωσφολιπιδίων, σχηµατίζουν την ενδογενή δεκάση, η οποία ενεργοποιεί τον X µε υδρόλυση. Ο ρόλος του VIIIa στη διαδικασία είναι να δρα ως υποδοχέας για τον IXa, ο οποίος βοηθά τη µετατροπή του Χ σε Xa. Η πρωτεολυτική δράση της 40

41 θροµβίνης µετατρέπει τον VIII σε VIIIa. Καθώς όµως αυξάνεται η συγκέντρωση της, ο VIIIa διασπάται από την ίδια και απενεργοποιείται. Αυτή η διπλή δράση της θροµβίνης στον VIIIa, επιδρά στον περιορισµό της έκτασης του σχηµατισµού της ενδογενούς δεκάσης και συνεπώς, της έκτασης της πήξης. Ενεργοποίηση του ενδογενούς δρόµου συµβαίνει όταν η προκαλλικρεΐνη, το ΜMΒK, ο XII και ο XI εκτεθούν σε αρνητικά φορτισµένη επιφάνεια. Αυτό αποτελεί τη φάση επαφής και µπορεί να συµβεί σαν αποτέλεσµα αλληλεπίδρασης µε φωσφολιπίδια (κυρίως φωσφατυδιλαιθανολαµίνη) των κυκλοφορούντων λιποπρωτεϊνών, όπως είναι τα χυλοµικρά και οι VLDL. Αυτό είναι το υπόβαθρο του ρόλου της υπερλιπιδαιµίας στη δηµιουργία µιας προθροµβωτικής κατάστασης. Η ενεργοποίηση του συστήµατος επαφής µπορεί επίσης να συµβεί και στην επιφάνεια βακτηρίων. Ο ενδογενής και ο εξωγενής µηχανισµός της πήξης συγκλίνουν στο σηµείο της ενεργοποίησης του παράγοντα X. Στη συνέχεια, ο Xa µαζί µε τον συµπαράγοντά του τον Va, παρουσία ιόντων Ca ++ και φωσφολιπιδίων,σχηµατίζουν το σύµπλοκο της προθροµβινάσης, το οποίο µετατρέπει την προθροµβίνη σε θροµβίνη. Η θροµβίνη που σχηµατίζεται, µπορεί να είναι να υδρολύσει δεσµούς Arg-Gly του ινωδογόνου, απελευθερώνοντας 2 µόρια ινωδοπεπτιδίου Α και Β, δίνοντας έτσι στο ινωδογόνο την ικανότητα αυτοπολυµερισµού. Το αποτέλεσµα είναι ο σχηµατισµός ασταθούς γέλης ( gel ) η οποία αναπτύσσεται µε µοναδική ακρίβεια πάνω στην πληγή φράσσοντας τον αυλό του αγγείου, η οποία µπορεί να διαλυθεί in vitro µε διάλυµα 5Μ ουρίας ή 1% µονοχλωρικού οξέος. Η σταθεροποίηση του ινώδους και άρα του θρόµβου, απαιτεί ιόντα Ca και την ενεργοποίηση του FXIII από τη θροµβίνη. Έτσι το ινώδες γίνεται σταθερό και περισσότερο ανθεκτικό στη δράση της πλασµίνης. Αξίζει να σηµειωθεί ότι τα ιόντα Ca και τα φωσφολιπίδια είναι απαραίτητα για τη λειτουργία των συµπλεγµάτων της ενδογενούς και της εξωγενούς δεκάσης, καθώς και της προθροµβινάσης. Τα ιόντα Ca εκτός των άλλων, µεσολαβούν στη σύνδεση αυτών των συµπλεγµάτων µέσω τελικών γ-καρβοξυ- καταλοίπων των παραγόντων Χα και IXa στη φωσφολιπιδική επιφάνεια των αιµοπεταλίων. 41

42 ΕΙΚΟΝΑ 8: Τα δυο µονοπάτια της πήξης Μοντέλο του καταρράκτη των ενζυµικών αντιδράσεων κατά τη διάρκεια της πήξης. Οι δύο ξεχωριστοί δρόµοι (ενδογενής και εξωγενής) ενώνονται σε ένα κοινό µονοπάτι που είναι η ενεργοποίηση του παράγοντα Χ. Στους δύο δρόµους πραγµατοποιούνται αλυσιδωτές αντιδράσεις περιορισµένης πρωτεόλυσης µε στόχο την ενεργοποίηση των ενζύµων-παραγόντων της πήξης του αίµατος. Στον εξωγενή δρόµο ο παράγοντας VIIa µε τη βοήθεια του συµπαράγοντα TF καταλύει την ενεργοποίηση του X σε Xa. Στον ενδογενή δρόµο ο παράγοντας XIIa ενεργοποιεί τον FXI, αυτός µε τη σειρά του τον FIX και στη συνέχεια ο παράγοντας IXa µε τη βοήθεια του συµπαράγοντα VIIIa καταλύει την ενεργοποίηση του FX σε FXa. Ο FXa µε τη βοήθεια του συµπαράγοντα Va και τη συµµετοχή φωσφολιπιδίων µετατρέπει την προθροµβίνη (ΙΙ) σε θροµβίνη (IIa). Η τελική αντίδραση που καταλύεται από τη θροµβίνη (IIa) έχει ως αποτέλεσµα τη µετατροπή του ινωδογόνου σε ινική, η οποία πολυµερίζεται και σχηµατίζει το θρόµβο. Πηγή από το διαδίκτυο : ved=0caqq8wc&usg=afqjcne7lj5jgirjlluvggeta36zl3nsaa 42

43 ΝΕΟΤΕΡΑ Ε ΟΜΕΝΑ ΓΙΑ ΤΟ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ ΤΗΣ ΠΗΞΗΣ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ O διαχωρισµός σε ενδογενές και εξωγενές µονοπάτι στο µοντέλο του καταρράκτη εξηγεί σε ικανοποιητικό βαθµό τις αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών και τη γενική διαδικασία της αιµόστασης in vitro, δεν µπορεί, όµως, να ανταποκριθεί στην δυναµική των αντιδράσεων in vivo. Π.χ. άτοµα µε έλλειψη της προκαλικρεΐνης, του υψηλού µοριακού βάρους κινινογόνο και του παράγοντα XII δεν εµφανίζουν αιµορραγικά επεισόδια. Επί πλέον, αν ο ενδογενής και ο εξωγενής δρόµος ήταν ξεχωριστοί, τότε η ενεργοποίηση του παράγοντα Χ από τον εξωγενή δρόµο θα έπρεπε να αναπληρώνει την έλλειψη των παραγόντων VIII (αιµορροφιλία Α) και IX (αιµορροφιλία Β). Ωστόσο, αυτοί οι παράγοντες είναι σηµαντικοί και η έλλειψη τους οδηγεί σε σοβαρά αιµορραγικά προβλήµατα που δεν αντισταθµίζονται από τον ανέπαφο εξωγενή δρόµο. Η παρατήρηση ότι το σύµπλοκο FVIIa-TF ενεργοποιεί και τον παράγοντα IX καταδεικνύει ότι οι δυο δρόµοι δεν είναι ανεξάρτητοι και ξεχωριστοί στη διάρκεια της πήξης του αίµατος. Στο ίδιο συµπέρασµα οδηγεί και η παρατήρηση ότι η θροµβίνη µπορεί να ενεργοποιήσει τον παράγοντα XI. Η έρευνα στον τοµέα της αιµόστασης τα τελευταία χρόνια έχει συµβάλει στην κατανόηση κάποιων από τους πολύπλοκους µηχανισµούς της βιοχηµείας των πρωτεϊνών που συµµετέχουν στην όλη διαδικασία της πήξης. Επίσης, η συσχέτιση της φυσιολογίας και της παθολογίας µε τις βιοχηµικές αντιδράσεις βοήθησε στην καλύτερη περιγραφή του µηχανισµού. Ωστόσο, δεν αρκεί µόνο η κατανόηση της ενζυµολογίας και της κινητικής των επιµέρους αντιδράσεων για να εξακριβωθούν εξολοκλήρου όλες οι παράµετροι αυτών των αντιδράσεων. Μετά από µελέτες που έχουν γίνει από διάφορες ερευνητικές και επιστηµονικές οµάδες, έχει φανεί πως το κλασικό µοντέλο της πήξης του αίµατος, µε δύο ξεχωριστούς µηχανισµούς, έναν ενδογενή και έναν εξωγενή, δεν ανταποκρίνεται σε αυτό που συµβαίνει στη φύση ή σε πραγµατικούς ασθενείς. Η Maureane Hoffman και οι συνεργάτες της υποστηρίζουν ότι τα σύµπλοκα που παίρνουν µέρος στη διαδικασία της πήξης «συναρµολογούνται» πάνω σε λιπιδικές επιφάνειες που περιέχουν φωσφατιδυλσερίνη. Αυτή η παρατήρηση 43

44 οδήγησε τους ερευνητές στο συµπέρασµα πως ο ρόλος των κυττάρων στην αιµόσταση έγκειται στο να προσφέρουν µια µεµβρανική επιφάνεια που να περιέχει φωσφατιδυλσερίνη για τον σχηµατισµό των διαφόρων συµπλόκων. Έχοντας ως βάση τον κεντρικό ρόλο των κυττάρων στη ρύθµιση των διαδικασιών της πήξης, δηµιουργήθηκε ένα µοντέλο που διακρίνεται σε τρεις φάσεις : τη φάση έναρξης (initiation phase), στην οποία µια µικρή ποσότητα προθροµβίνης ενεργοποιείται πάνω σε κύτταρα που φέρουν TF, τη φάση ενίσχυσης (amplification phase), στην οποία η διαδικασία της πήξης µεταφέρεται από τα κύτταρα που φέρουν TF πάνω στην αιµοπεταλιακή επιφάνεια και τέλος τη φάση πολλαπλασιασµού (propagation phase) όπου µεγάλες πλέον ποσότητες θροµβίνης παράγονται στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων. Σύµφωνα µε αυτό το µοντέλο, η έκθεση των παραγόντων της πήξης του πλάσµατος σε κύτταρα που φέρουν τον TF, επιτρέπει την αρχική ενεργοποίηση των παραγόντων X και IX. Όπως φαίνεται στην παραπάνω εικόνα ο παράγοντας Xa που ενεργοποιείται από το σύµπλοκο TF/VIIa, µπορεί στη συνέχεια να συνδεθεί µε µικρές ποσότητες παράγοντα Va, πάνω στην επιφάνεια κυττάρων που φέρουν τον TF. Τα σύµπλοκα της προθροµβινάσης (Xa/Va) µπορούν να ενεργοποιήσουν µικρές ποσότητες προθροµβίνης πάνω σε αυτά τα κύτταρα. Είναι γεγονός πως σχεδόν κάθε κύτταρο έχει έστω και µικρή ικανότητα να συµβάλλει στο σχηµατισµό προθροµβινάσης στην επιφάνειά του, µε κύριο εκπρόσωπο τα αιµοπετάλια. Ωστόσο, η µικρή ποσότητα θροµβίνης που παράγεται πάνω στα υπόλοιπα κύτταρα που φέρουν TF, είναι σηµαντική γιατί ενεργοποιεί τόσο τα αιµοπετάλια, όσο και τους συµπαράγοντες (V και VIII). Ο παράγοντας VIII αποκόπτεται από τον παράγοντα von Willebrand και ο VIIIa δεσµεύεται στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων. Τα αιµοπετάλια λειτουργούν επίσης και ως επιφάνεια ενεργοποίησης του FXI από τη θροµβίνη, καταργώντας ουσιαστικά την ανάγκη της ύπαρξης του FXII και των άλλων παραγόντων του συστήµατος επαφής. Μόλις ενεργοποιηθούν, καλύπτονται µε τους παράγοντες Va, VIIIa, XIa και είναι πλέον έτοιµα να συµβάλλουν στη µεγάλη παραγωγή θροµβίνης.ο παράγοντας IX που ενεργοποιήθηκε από το TF/VIIa διαχέεται στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων, κυρίως όταν αυτά είναι κοντά στα κύτταρα που φέρουν τον ιστικό παράγοντα. Το σύµπλοκο IXa / VIIIa ενεργοποιεί τον πάνω στα αιµοπετάλια. Στη συνέχεια, ο παράγοντας Xa συνδέεται µε Va, σχηµατίζοντας σύµπλοκα προθροµβινάσης, τα οποία οδηγούν στην έκρηξη 44

45 παραγωγής θροµβίνης που είναι απαραίτητη για το σχηµατισµό του ινώδους. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, η M. Hoffman και οι συνεργάτες της υποστηρίζουν ότι οι αιµορροφιλικοί ασθενείς, στους οποίους λείπει είτε ο FVIII είτε ο FIX, αιµορραγούν γιατί στερούνται της ικανότητας παραγωγής FXa πάνω στα αιµοπετάλια,εποµένως, δεν έχει σηµασία η συνολική ποσότητα FXa, αλλά κυρίως, ο τόπος παραγωγής του. Ο FXa που παράγεται από το σύµπλοκο TF/VIIa δε µπορεί να µεταφερθεί πάνω στα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια, επειδή στο πλάσµα κυκλοφορούν πολλοί αναστολείς του FXa, όπως ο TFPI και η ATIII. Αντίθετα, ο FIXa µπορεί εύκολα να διαχυθεί από το πλάσµα στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων, επειδή η ATIII είναι ασθενής αναστολέας του και ο TFPI δεν τον αναστέλλει καθόλου. Η M. Hoffman και οι συνεργάτες της επίσης υποστηρίζουν ότι η χορήγηση υψηλών δόσεων FVIIa στους αιµορροφιλικούς έχει ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση ενός ποσού FX πάνω στα αιµοπετάλια, οπότε και αποκαθίσταται κατά κάποιον τρόπο ο σχηµατισµός προθροµβινάσης πάνω στα αιµοπετάλια και άρα η τρίτη φάση. Επιπρόσθετα, επειδή το ποσό της παραγόµενης θροµβίνης επηρεάζει και την ποιότητα του θρόµβου, η χορήγηση υψηλών δόσεων FVIIa, εκτός από την µεγάλη παραγωγή θροµβίνης συµβάλλει ταυτόχρονα και στην καλή ποιότητα του σχηµατιζόµενου θρόµβου, κατασκευή που είναι ανθεκτική στη λύση από πλασµίνη. ΘΡΟΜΒΩΣΗ ΚΑΙ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΑΥΤΗ Συνήθως, η απόφραξη µιας αρτηρίας προκαλείται από έναν θρόµβο αίµατος. Θρόµβος είναι το πηγµένο αίµα που φράζει τον αυλό της αρτηρίας και διακόπτει έτσι την φυσιολογική ροή του αίµατος. Θρόµβωση ονοµάζεται η παθολογική ανάπτυξη των θρόµβων του αίµατος. Οι θρόµβοι σχηµατίζονται µέσα στις στεφανιαίες αρτηρίες λόγω ρήξης ενός σχηµατισµού που ονοµάζεται αθηρωµατική πλάκα. Η αθηρωµατική πλάκα δηµιουργείται από τη σταδιακή συσσώρευση λιπιδίων τα οποία επικάθονται στα τοιχώµατα της αρτηρίας. Η δηµιουργία της πλάκας είναι µια διεργασία που διαρκεί χρόνια και ονοµάζεται αθηροσκλήρυνση, η οποία στενεύει προοδευτικά την αρτηρία. Όταν ραγεί αυτή η πλάκα, σχηµατίζεται θρόµβος αίµατος 45

46 πάνω από τη ρήξη, ο οποίος µπορεί να προκαλέσει απόφραξη ολόκληρης της αρτηρίας. Η διαδικασία σχηµατισµού του θρόµβου πάνω στην πλάκα ονοµάζεται αθηροθρόµβωση. Εποµένως, η αθηροσκλήρυνση προκαλεί προοδευτική στένωση των αρτηριών, όπου η πλάκα επικάθεται στο αρτηριακό τοίχωµα, ενώ η αθηροθρόµβωση συµβαίνει όταν ραγεί η πλάκα και σχηµατιστούν θρόµβοι αίµατος, οι οποίοι προκαλούν αιφνίδια απόφραξη µιας αρτηρίας η οποία, µε τη σειρά της, προκαλεί το έµφραγµα του µυοκαρδίου. Πρέπει να σηµειωθεί ότι η ρήξη της αθηρωµατικής πλάκας µπορεί να συµβεί ξαφνικά και χωρίς προειδοποίηση, ακόµη και αν η στένωση της αρτηρίας δεν είναι µεγάλη. Σε σπάνιες περιπτώσεις, η απόφραξη µπορεί να προκληθεί και από άλλες αιτίες όπως η φλεγµονή, ο αυτόµατος διαχωρισµός σχίσιµο του αγγείου, από εµβολή µεταναστευτικού θρόµβου ή από µυικό σπασµό στην αρτηρία. Οι περισσότερες περιπτώσεις της θρόµβωσης οφείλονται σε επίκτητα εξωγενή προβλήµατα όπως χειρουργική επέµβαση, καρκίνος, ακινησία, παχυσαρκία και διάφορες άλλες σπανιότερες γενετικές διαταραχές. ΑΘΗΡΟΣΚΛΗΡΩΣΗ : ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΑΣΗ ΚΑΙ ΑΙΤΙΑ ΓΕΝΙΚΑ Η αθηροσκλήρωση θα µπορούσε να οριστεί ως «νόσος πάχυνσης του έσω χιτώνα του αρτηριακού τοιχώµατος, µε αποτέλεσµα τη στένωση του αυλού και την παρεµπόδιση της αιµατικής ροής». Στην πράξη, η αθηροσκλήρωση είναι η νόσος της ανθρώπινης συµπεριφοράς. Προσβάλλει άτοµα που τρώνε πολύ, καπνίζουν και κάνουν καθιστική ζωή. Αυτός ο τρόπος ζωής «βοηθάει» τη συγκέντρωση λιπιδίων και χοληστερίνης στο αίµα. Το µείγµα των λιπιδίων και της χοληστερίνης διηθεί το επένδυµα των αρτηριών, µε αποτέλεσµα τη στένωση και την καταστροφή τους, κατά τέτοιο τρόπο ώστε κάτω από το µικροσκόπιο να φαίνονται σαν αγωγοί θερµού νερού αποφραγµένοι από εναποθέσεις αλάτων. Άπαξ και στενωθούν, οι αρτηρίες είναι ευάλωτες στην πλήρη απόφραξη από 46

47 θρόµβο αίµατος. Η στένωση δεν προσβάλλει όλα τα αγγεία του σώµατος στον ίδιο βαθµό. Ο τρόπος προσβολής ποικίλλει από άτοµο σε άτοµο. Πιο συχνά, στενώνονται οι στεφανιαίες αρτηρίες που τροφοδοτούν µε αίµα την καρδιά, και τότε έχουµε ως αποτέλεσµα τη στεφανιαία ανεπάρκεια. Σε µερικούς ανθρώπους, µπορεί οι στεφανιαίες αρτηρίες να παραµένουν σε καλή κατάσταση, ενώ υπάρχει σοβαρή στένωση των αρτηριών που τροφοδοτούν µε αίµα τον εγκέφαλο (αιτία αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου). Σε άλλους, η στένωση µπορεί να προσβάλλει τις αρτηρίες που τροφοδοτούν µε αίµα τα κάτω άκρα, προκαλώντας πόνο στα κάτω άκρα κατά τη βάδιση και, ίσως, γάγγραινα στα πόδια. Εάν στενωθεί η νεφρική αρτηρία, µπορεί να παρατηρηθεί αύξηση στην αρτηριακή πίεση. Σε όλους τους ανθρώπους, το αθήρωµα αρχίζει να σχηµατίζεται κάτω από το επένδυµα των αρτηριών που καλείται ενδοθήλιο, από την παιδική ηλικία. Οι λιποπρωτείνες σωµατίδια τα οποία µεταφέρουν τη χοληστερίνη, την υπεύθυνη για το σχηµατισµό του αθηρώµατος διεισδύουν και εγκλωβίζονται κάτω από το ενδοθήλιο των αρτηριών και προκαλούν φλεγµονή και ανάπτυξη ουλώδους ιστού. Μεγάλοι σχηµατισµοί, γνωστοί ως αθηρωµατώδεις πλάκες, οικοδοµούνται στις πληγείσες περιοχές. Αιµατικοί θρόµβοι είναι δυνατόν να σχηµατιστούν πάνω στις αθηρωµατώδεις πλάκες, αν η επιφάνειά τους είναι ανώµαλη ή αν η αιµατική ροή είναι βραδεία. Επιπλέον, το ασβέστιο προκαλεί σκλήρυνση των πλακών, µε αποτέλεσµα τη σκλήρυνση των αρτηριών. Με την πάροδο των ετών, οι πλάκες αυξάνονται σε µέγεθος, ώσπου προοδευτικά η αρτηρία στενώνεται ή αποφράσσεται τελείως. Οι παθολογοανατόµοι του 19ου αιώνα, όταν εξέταζαν νεκροτοµικό υλικό, δεν έδιναν µεγάλη προσοχή στην αθηροσκλήρωση, αν και υπάρχουν αναφορές στα γραπτά τους. Το υλικό τους προερχόταν από άτοµα που είχαν πεθάνει νέοι ή µεσήλικοι. Η επιβίωση άνω της ηλικίας των 60 ετών δεν ήταν πολύ συνηθισµένο φαινόµενο κατά τον 19ο αιώνα. Όταν ο αριθµός των θανάτων από στεφανιαία ανεπάρκεια και αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια άρχισε ν' αυξάνεται στα τέλη της δεκαετίας του '30 και τη δεκαετία του '40, οι γιατροί είχαν πολύ µικρή γνώση της αιτίας που προκάλεσε αυτή την αλλαγή. Άρχισαν να έχουν τις πρώτες ενδείξεις, όταν έκαναν ανασκόπηση των στοιχείων από τις συχνότητες θανάτων σε διάφορες χώρες. Οι επιστήµονες παρατήρησαν ότι η καρδιοπάθεια ήταν πολύ συχνή σε µερικές προηγµένες χώρες, όπως οι ΗΠΑ, η Φινλανδία και η Μ. Βρετανία, ενώ ήταν πολύ λιγότερο συχνή σε άλλες σχεδόν εξίσου προηγµένες χώρες, όπως η Ιταλία και η Ιαπωνία. Παρατηρήθηκε όµως, ότι όταν οι Ιταλοί ή οι Γιαπωνέζοι µεταναστεύουν σε χώρες, 47

48 όπως π.χ. οι ΗΠΑ, µέσα στην επόµενη γενιά οι απόγονοί τους έχουν το ίδιο υψηλή συχνότητα καρδιοπάθειας, όπως οι Αµερικάνοι.Ευρήµατα σαν κι αυτό υποδηλούν ισχυρώς ότι οι µεγάλες διαφορές στη συχνότητα των καρδιοπαθειών οφείλονται κυρίως σε πολιτιστικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Αυτό σηµαίνει ότι υπάρχει κάτι στον τρόπο ζωής (ή κάτι περιβαλλοντικό) σε χώρες, όπως η Μ. Βρετανία, που προδιαθέτει σε καρδιακά νοσήµατα. Χωρίς αµφιβολία, οι συνήθειες διατροφής παίζουν σηµαντικό ρόλο.σε χώρες όπως οι ΗΠΑ και η Μ. Βρετανία, τα λίπη παρέχουν µέχρι το 40% της ενέργειας στη διατροφή ενός µέσου ανθρώπου. Στην Ιαπωνία, τα λίπη αποτελούν ένα πολύ µικρότερο ποσοστό της διατροφής και τα λίπη που καταναλώνονται είναι λιγότερο επιζήµια για την υγεία. Εκτός από τους παράγοντες, που φαίνεται ότι επηρεάζουν τη συχνότητα των καρδιακών νοσηµάτων σ' έναν ολόκληρο πληθυσµό, υπάρχουν ατοµικοί παράγοντες που έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την εµφάνιση καρδιακών νοσηµάτων. Η διατροφή του ατόµου είναι ένας παράγοντας το κάπνισµα είναι ένας άλλος σπουδαίος παράγοντας. Οι θάνατοι από καρδιακό νόσηµα είναι πολύ συχνότεροι στους καπνιστές απ' ό,τι στους µη καπνιστές. Ο κίνδυνος αυξάνει µε τον αριθµό των τσιγάρων που καπνίζει το άτοµο ηµερησίως και ελαττώνεται µε τη διακοπή του καπνίσµατος. Η υψηλή αρτηριακή πίεση, η έλλείψη σωµατικής άσκησης, ο σακχαρώδης διαβήτης και η παχυσαρκία φαίνεται επίσης ότι αυξάνουν το ενδεχόµενο νοσήσεως. ΑΤΟΜΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Ο παράγοντας φύλο Οι θάνατοι από στεφανιαία νόσο πριν από την ηλικία των 60 είναι περισσότερο συχνοί στους άντρες παρά στις γυναίκες: στις ηλικίες από 45 έως 50, οι άντρες έχουν πιθανότητες να πεθάνουν τέσσερις φορές περισσότερο απ' ό,τι οι γυναίκες. Οι διαφορές αυτές σχετίζο νται µε τον προστατευτικό ρόλο των οιστρογόνων προγεστερόνης (ορµόνες φύλου). Μετά την εµµηνόπαυση, οι γυναίκες γίνονται πε ρισσότερο ευάλωτες στη στεφανιαία νόσο στην ηλικία δε των 70, οι διαφορές µεταξύ των δυο φύλων έχουν εξαφανιστεί. Ο οικογενειακός παράγοντας Ορισµένα άτοµα κληρονοµούν µια προδιάθεση προς καρδιακά νοσήµατα. Αν ένας άντρας στην ηλικία των 40 είχε ένα καρδιακό επεισόδιο, οι αδελφοί του έχουν αυξηµένο κίνδυνο καρδιακού 48

49 επεισοδίου. Σ' αυτές τις οικογένειες, πολλές φορές ο µεταβολισµός των λιπών στον οργανισµό οδηγεί σε πολύ υψηλά επίπεδα χοληστερίνης και άλλων λιπιδίων στο αίµα. Για όλους αυτούς τους λόγους, τα ευάλωτα άτοµα, λόγω κληρονοµικότητας, πρέπει να παίρνουν αγωγή για την αντιµετώπιση των υψη λών επιπέδων χοληστερίνης. Οπωσδήποτε, πριν δο θεί αγωγή, πρέπει καταρχήν να διαπιστωθούν οι διαταραχές. Κάθε άνθρωπος πρέπει να υποβληθεί σε έλεγχο χοληστερίνης στην ηλικία των 20. Άτοµα που έχουν συγγενή εξ αίµατος που υπέστη έµφραγµα µυοκαρδίου πριν τα 50 έτη, πρέπει να απευθυνθούν στο γιατρό. Μειώνοντας τον κίνδυνο Κάποιοι παράγοντες κινδύνου µπορούν να αντιµετωπιστούν, κάποιοι όµως (όπως π.χ. το φύλο), όχι. Αλλά το κύριο µήνυµα είναι ότι η διακοπή του καπνίσµατος, η µειωµένη κατανάλωση λιπαρών, η καλή φυσική κατάσταση και η ρύθµιση της αρτηριακής πίεσης είναι ζωτικοί παράγοντες για την πρόληψη ή ακόµη και τη µη εµφάνιση της αθηροσκλήρωσης και της καρδιακής νόσου. 49

50 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΣΚΟΠΟΣ Η θροµβίνη αποτελεί το κεντρικό ένζυµο στη διαδικασίας της πήξης. Η µελέτη της κινητικής της παραγωγής της θεωρείται ένα από τα ισχυρότερα εργαλεία, από το οποίο µπορούµε να συνάγουµε συµπεράσµατα για τη διαδικασία της πήξης του αίµατος στο σύνολό της. Σκοπός των πειραµάτων που διεξάχθηκαν ήταν η βελτίωση - βελτιστοποίηση της φωτοµετρικής µεθόδου προσδιορισµού της δραστηριότητας της θροµβίνης, µε απώτερο σκοπό την καθιέρωση µιας γρήγορης και χρήσιµης για τον καθηµερινό έλεγχο στο εργαστήριο τεχνικής, που θα διευκολύνει τον ερευνητή προσφέροντάς του τη δυνατότητα να διεξάγει γρήγορα και πρακτικά, αλλά ταυτόχρονα αξιόπιστα αποτελέσµατα, µε τα οποία στη συνέχεια θα µπορεί να αξιολογήσει κάποιες δεδοµένες καταστάσεις, ανάλογα µε τα εκάστοτε ζητούµενα. Η µέθοδος που περιγράφεται, βασίζεται στην παρατήρηση ότι η πυροδότηση της παραγωγής θροµβίνης στο πλάσµα του αίµατος, επιτρέπει τον υπολογισµό της ταχύτητας µεταβολής του υποστρώµατος. Η ταχύτητα που παρατηρείται, είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της θροµβίνης, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της παραγωγής θροµβίνης από προθροµβίνη, ανεξάρτητα από την διαδικασία απενεργοποίησης της θροµβίνης. Η µέθοδός µας βασίστηκε στον συνεχή έλεγχο της θροµβίνης που απελευθερώνεται, παρουσία ενός συγκεκριµένου χρωµογόνου υποστρώµατος (S2238). Κατά τη διάρκεια διεξαγωγής των εργασιών, πραγµατοποιήθηκε βελτιστοποίηση των παραµέτρων της διαδικασίας, µε τέτοιο τρόπο ώστε να εξασφαλιστεί όσο το δυνατόν καλύτερος συνδυασµός αξιοπιστίας, αρτιότητας και ευαισθησίας. ΓΕΝΙΚΑ Οι µέθοδοι παραγωγής της θροµβίνης χρησιµοποιούνται από το 1950 ως ένα από τα ισχυρότερα εργαλεία για την µελέτη της πήξης του αίµατος. Συνεπώς, είναι φυσικό επόµενο, λόγω του σπουδαίου 50

51 ρόλου που επιτελεί η θροµβίνη στην πήξη του αίµατος, η διαδικασία της παραγωγής της στο πλάσµα, εκτός από πηγή πλήθους άλλων χρήσιµων πληροφοριών, να αποτελεί και το καταλληλότερο µέσο για τη µελέτη του ολικού προφίλ αιµόστασης ενός ασθενούς. Η µελέτη της παραγωγής της θροµβίνης δεν παρέχει µόνο µια ολική εκτίµηση της αιµόστασης, αλλά βοηθάει επίσης στον πιο ολοκληρωµένο και σφαιρικό έλεγχο της κατάστασης του ασθενούς. Αυτά τα δεδοµένα θα µπορούσαν να συµβάλλουν στην κλινική διάγνωση, µέσω του ελέγχου της δράσης των χορηγούµενων αντιπηκτικών στην επιδηµιολογία της θρόµβωσης και του κινδύνου αιµορραγίας. Επίσης, µας παρέχεται η δυνατότητα να παρατηρήσουµε την ενζυµική δραστικότητα της θροµβίνης, υπολογίζοντας το εύρος της συνολικής επίδρασης των πολλαπλών παραγόντων, ώστε να καθοριστούν η ικανότητα πήξης και η περιβαλλοντική επίδραση στους παράγοντες αυτούς. Οι παραπάνω πληροφορίες καθιστούν εξαιρετικά ενδιαφέρουσα την ανάπτυξη µεθόδων για την παρατήρηση και τον έλεγχο της παραγωγής θροµβίνης in vitro. Οι εργασίες για τον προσδιορισµό παραγωγής θροµβίνης έχουν αναπτυχθεί σε µια προσπάθεια αναπαράστασης και µελέτης φυσιολογικών αλλά και παθολογικών µηχανισµών πήξης. Αυτές οι δοκιµές χρησιµοποιούνται επίσης για προ-κλινική διαλογή και µελέτη νέων πηκτικών ή αντιπηκτικών θεραπευτικών µέσων. Σε πολλά κλινικά εργαστήρια έχουν ήδη αναπτυχθεί και χρησιµοποιούνται διάφορες µέθοδοι για την µέτρηση της παραγωγής θροµβίνης (Barrowcliffe et al., 2006; Matsumoto et al, 2005;Varadi et al, 2004; Hemker et al, 2002). Σε αυτές συµπεριλαµβάνονται οι χρωµατοµετρικές και φθοροµετρικές µέθοδοι (Devreese et al., 2007), η βαθµονοµηµένη αυτόµατη θροµβογραφία (Barrowcliffe, 2004), η κυµατοειδής ανάλυση (Barrowcliffe, 2004) καθώς επίσης και τεχνικές Western blot (Matsuda et al, 2002) Η χρωµατοµετρική µέθοδος, στην οποία και θα εστιάσουµε, για τον προσδιορισµό της παραγωγής θροµβίνης στηρίζεται στην διαφορά της απορρόφησης (οπτικής πυκνότητας) που παρατηρείται µεταξύ του σχηµατιζόµενου προϊόντος και του αρχικού υποστρώµατος. Ο ρυθµός του σχηµατισµού του προϊόντος είναι ανάλογος της ενζυµικής δραστικότητας της θροµβίνης και µπορεί εύκολα να προσδιορισθεί µε ένα φασµατοφωτόµετρο. Οι δοκιµές µε ποικίλα χρωµογόνα υποστρώµατα παρουσιάζουν το πλεονέκτηµα της ανίχνευσης της επίδρασης διάφορων ουσιών στην διαδικασία της πήξης, τα οποία δεν ανιχνεύεται µε κάποιον άλλον 51

52 τρόπο στα συνήθη τεστ πήξης, όπως είναι ο χρόνος προθροµβίνης (PT) και ο µερικός χρόνος θροµβοπλαστίνης (aptt). Επιπλέον, στα συνήθη τεστ πήξης µπορεί να παρατηρηθεί µόνο η αρχική παραγωγή θροµβίνης, συνεπώς οι χρόνοι που βλέπουµε αντιπροσωπεύουν µόνο τη φάση της αρχικής αιµόστασης, πριν την παραγωγή θροµβίνης, η οποία είναι στάσιµη. Εποµένως, οι πληροφορίες που παρέχονται από αυτά τα τεστ είναι ανεπαρκείς, επειδή είναι γνωστό ότι µετά το σχηµατισµό του θρόµβου αναµένεται η µεγαλύτερη δράση της θροµβίνης. Οι χρωµατοµετρικές δοκιµές για την παραγωγή θροµβίνης παρέχουν τη δυνατότητα να εκτιµηθεί όχι µόνο το ποσό της παραγόµενης θροµβίνης, αλλά επίσης και το χρονικό διάστηµα κατά το οποίο αυτή παραµένει ενεργή. Έτσι, η θροµβωτική ή αιµορραγική τάση του ασθενούς µπορεί να ελεγχθεί µε µεγαλύτερη ακρίβεια και ασφάλεια. Στις αρχές του 1970, η ανάπτυξη συνθετικών χρωµογόνων υποστρωµάτων για τη χρήση τους σε χρωµατοµετρικές µεθόδους, που εφαρµόζονται σε κλινικά και ερευνητικά εργαστήρια, αλλά και η µετέπειτα εισαγωγή τους στην αιµοστατική εξέταση, δηµιούργησε νέες προοπτικές πάνω στον τοµέα της µελέτης και εφαρµογής µεθόδων των παραγόντων της πήξης, των ινοδωλυτικών συστατικών και των αναστολέων (Budzynski, 2001). Σηµαντικά πλεονεκτήµατα των χρωµατικών υποστρωµάτων είναι η απλότητα, η ταχύτητα και η καταλληλότητα για κάθε χρήση. Χαρακτηριστικό παράδειγµα χρωµατοµετρικού υποστρώµατος ευρέως χρησιµοποιούµενο και εξειδικευµένο για τη θροµβίνη είναι το S Οι δύο κύριες χρωµατοµετρικές τεχνικές για την µέτρηση της παραγωγής θροµβίνης είναι η συνεχής µέθοδος και η µέθοδος υποδειγµατοληψίας. Ο Hemker και οι συνεργάτες του περιέγραψαν µια συνεχή µέθοδο εφαρµοσµένη σε ινωδολυµένο πλάσµα ή σε πλάσµα που περιέχει αναστολείς πολυµερισµού της ινικής, για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης της θροµβίνης κατά τη διάρκεια του χρόνου σε κάθε περίπτωση, ο οποίος επίσης επιτρέπει την κατασκευή µιας καµπύλης παραγωγής θροµβίνης σε συνάρτηση µε το χρόνο, δίνοντας πληροφορίες για την ενδογενή ικανότητα της θροµβίνης. Η παραπάνω διαδικασία αναπαριστά τις συνεχείς µεταβολές στην οπτική πυκνότητα του δείγµατος, λόγω της αργής µετατροπής του αντιδρώντος χρωµατοµετρικού υποστρώµατος από την θροµβίνη που παράγεται στο αντιδρών πλάσµα. εδοµένου ότι η µέθοδος δεν είναι εργαστηριακά απαιτητική, κουραστική, και υπάρχει η δυνατότητα να ελέγχεται µεγάλος αριθµός δειγµάτων συγχρόνως, 52

53 αυτή η τεχνική έχει πολλές δυνατότητες και προοπτικές για χρήση σε επίπεδο ρουτίνας σε οποιοδήποτε κλινικό εργαστήριο. Κατά συνέπεια, η µέθοδος Henker έχει κερδίσει ένα τεράστιο ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια συγκριτικά µε άλλες µεθόδους. Στην µέθοδο υποδειγµατοληψίας εφαρµόζεται µια τεχνική δύο σταδίων, κατά την οποία τα υπο-δείγµατα επιλέγονται από το ινωδολυµένο πλάσµα ή από ένα σύστηµα, που δεν περιέχει ινώδες, αλλά ένα χρωµατοµετρικό υπόστρωµα. Αυτή η τεχνική δύο σταδίων είναι χρονοβόρα και επίπονη και για αυτόν το λόγο δεν είναι κατάλληλη για επαναλαµβανόµενες δοκιµές. Στην παρούσα µελέτη, εφαρµόστηκε µία εξαιρετικά απλουστευµένη µέθοδο προσδιορισµού της παραγωγής θροµβίνης, η οποία µπορεί να αυτοµατοποιηθεί. Χρησιµοποιήθηκε το ευρύτατα χρησιµοποιούµενο χρωµογόνο υπόστρωµα S-2238 και κατά τη διεξαγωγή της εργασίας εξετάστηκαν και βελτιστοποιήθηκαν διάφορες παράµετροι που ενέχονται στην αντίδραση. Τα αρχικά βήµατα της ινωδόλυσης παραλείφθηκαν προκειµένου να βρεθούν οι βέλτιστες δυνατές συνθήκες για µια γρήγορη αλλά και αποτελεσµατική δοκιµή ρουτίνας. Επιπλέον, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση Western blot για την παραγωγή της θροµβίνης, η οποία δεν προτείνεται για καθηµερινή εφαρµογή επειδή είναι αρκετά χρονοβόρα. ΜΕΛΕΤΕΣ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ Η παραγωγή θροµβίνης που ενεργοποιείται από τον ιστικό παράγοντα, µπορεί να διαιρεθέι σε δύο φάσεις, σε όλα τα µοντέλα της πήξης του αίµατος. Η φάση έναρξης ακολουθεί την προσθήκη του ιστικού παράγοντα και χαρακτηρίζεται από την εµφάνιση νανοµοριακών ποσών θροµβίνης, η οποία παράγεται µε σχετικά χαµηλό ρυθµό, από µερική ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων και από ποσοτική πρωτεόλυση των συµπαραγόντων, του παράγοντα V και του παράγοντα VIII. Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης, παράγονται επίσης, φεµτο- µε πικοµοριακά ποσά των παραγόντων VIIa, IXa, Xa και Xia. Συνεπώς, παρουσία όλων των προ-πηκτικών πρωτεϊνών στις φυσιολογικές πλασµατικές τους συγκεντρώσεις, λαµβάνει χώρα η 53

54 δεύτερη φάση παραγωγής θροµβίνης, η φάση διάδοσης. Σε ολικό αίµα, ο θρόµβος σχηµατίζεται κατά την έναρξη αυτής της φάσης. Οι χαρακτηριστικές ιδιότητες αυτής της φάσης είναι η ποσοτική µετατροπή της προθροµβίνης σε θροµβίνη µε υψηλό βαθµό µετατροπής, η ολοκλήρωση της ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων και ο σχηµατισµός συµπαγούς θρόµβου. Τέλος, κατά τη φάση τερµατισµού, η παραγωγή θροµβίνης αναστέλλεται από το µονοπάτι της πρωτεϊνης C (πρωτεϊνη C, θροµβοµοντουλίνη και πρωτεϊνη S) και από τoν ΤFPI, ενώ οι υπόλοιπες πρωτεάσες σερίνης αναστέλλονται από την αντιθροµβίνη. Η διάρκεια της φάσης έναρξης, που αντιστοιχεί περίπου στο χρόνο σχηµατισµού του θρόµβου, επηρεάζεται κυρίως από την συγκέντρωση του συµπλέγµατος VIIa/TF, η οποία µε τη σειρά της, εξαρτάται κυρίως από την συγκέντρωση της πρωτεΐνης VIIa, όταν η διάθεση του ιστικού παράγοντα είναι περιορισµένη. O κύριος αναστολέας αυτής της φάσης είναι ο TFPI. Όταν η παραγωγή θροµβίνης µεταβεί στην φάση διάδοσης, ούτε το σύµπλεγµα VIIa/TF, ούτε ο TFPI έχουν κάποια έντονη επίδραση στην όλη διαδικασία. Αντίστοιχα, το σύστηµα της πρωτεϊνης C και η αντιθροµβίνη ΙΙΙ έχουν µικρή έως καθόλου επιρροή στην φάση έναρξης. ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Κατάλληλα προς εξέταση δείγµατα, θεωρούνται τα δείγµατα από πλάσµα αίµατος που είναι φτωχά σε αιµοπετάλια και δεν έχουν υποστεί ορατή αιµόλυση. Αυτό συµβαίνει επειδή τα αιµοπετάλια και/ή το στρώµα των ερυθρών αιµοσφαιρίων µπορούν να προκαλέσουν έναρξη της πήξης ή ενεργοποίηση κάποιων παραγόντων της πήξης πριν την εφαρµογή του πρωτοκόλλου, µε αποτέλεσµα τελικά να ληφθούν λανθασµένα αποτελέσµατα. Τα δείγµατα που χρησιµοποιούνται στην πειραµατική διαδικασία παραλαµβάνονται µε φλεβοκέντηση ως ολικό αίµα και τοποθετούνται σε σωλήνες vacutainer που περιέχουν ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικού νατρίου (0,109 Μ, 9 µέρη αίµατος και 1 µέρος κιτρικού διαλύµατος), ώστε µέσω της δέσµευσης των ιόντων ασβεστίου από αυτά, να αποφευχθεί η έναρξη της διαδικασίας της 54

55 πήξης. Τα δείγµατα ελέγχονται οπτικά µε σκοπό να αποκλειστούν από την περεταίρω ανάλυση αυτά τα οποία έχουν υποστεί αιµόλυση. Στη συνέχεια, φυγοκεντρούνται για 20 min στα 3000 rpm και σε θερµοκρασία δωµατίου και παραλαµβάνεται το υπερκείµενο που αποτελεί το λεγόµενο ppp (poor platelet plasma), δηλαδή πλάσµα αίµατος φτωχό σε αιµοπετάλια, το οποίο διατηρείται στους 4 oc για άµεση χρήση ( έως και 24h ) ή στους -20oC για αποθήκευση και µελλοντική χρήση και επεξεργασία. Το βιολογικό υλικό που χρησιµοποιήθηκε προέρχεται από καρδιαγγειακούς ασθενείς, αλλά και από φυσιολογικούς δότες. Οι διαδικασίες της αιµοληψίας και της φυγοκέντρησης πραγµατοποιήθηκαν στην κλινική «Άγιος Λουκάς» από τον κ. Κούρτογλου και τους συνεργάτες του. Το προαναφερθέν υλικό χρησιµοποιήθηκε τόσο για τον προσδιορισµό της κινητικής της θροµβίνης, όσο και για τη µελέτη προσδιορισµού των παραγόντων πήξης VIIa και Xa, καθώς και για την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση των χρωµατοµετρικών αυτών µεθόδων. ΧΗΜΙΚΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Υπόστρωµα S-2238 : (Χηµική ονοµασία: H-D-Phenylalanyl-L-pipecolyl-Larginine-pnitroaniline dihydrochloride, MΒ: 625.6). Η προµήθεια της ουσίας γίνεται σε µορφή σκόνης από την εταιρία Chromogenix Instrumentation Laboratory Company (Lexington, MA , USA). Για να πετύχουµε την επιθυµητή συγκέντρωση του υποστρώµατος 5.7 mmol/lκαι να το µετατρέψουµε σε υγρή µορφή προς χρήση, προσθέτουµε στα 25 mg του υποστρώµατος σε µορφή σκόνης, 7 ml απιονισµένο H 2 O. 55

56 S-2238 molecule Model of S-2238 (green) fitted into the active site of thrombin Ενεργοποιητές : 1. Thromborol S (TF ή Tissue factor ή ιστικός παράγοντας) προµηθεύτηκε από την εταιρεία Dade Behring (Marbay, Germany). Χρησιµοποιήθηκε σε συγκέντρωση Στην µελέτη µας ο ιστικός παράγοντας χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση ½. 2. ιάλυµα CaCl 2 σε συγκέντρωση 1Μ στο αρχικό διάλυµα. Ρυθµιστικό διάλυµα : Αποτελείται από τα παρακάτω συστατικά στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις 0.05M Tris-HCl, 0.1 M NaCl και 20 mm EDTA. 56

57 Παρατηρήσεις : Ο ιστικός παράγοντας προτιµήθηκε για την ενεργοποίηση της αντίδρασης, επειδή είναι φυσικός ενεργοποιητής. Η συγκέντρωση του ιστικού παράγοντα πρέπει πάντα ελέγχεται προσεκτικά. Μεγαλύτερη ποσότητα θα οδηγήσει στην υπερβολική παραγωγή θροµβίνης απουσία του FVII, µέσω του εξωγενούς δρόµου της πήξης, ενώ λιγότερη ποσότητα θα έχει ως αποτέλεσµα ελαττωµένη παραγωγή θροµβίνης, ακόµα και κάτω από φυσιολογικές συγκεντρώσεις FVII. Το Tris-HCl επιλέχθηκε ως διαλυτικό µέσο για την παρασκευή του ρυθµιστικού αυτού διαλύµατος, λόγω της pka του (8,1 στους 25 0 C), η οποία το καθιστά κατάλληλο για µετρήσεις σε ph 7,3-9,3, περιοχή στην οποία εµφανίζουν την µέγιστη δράση τους οι πρωτεάσες σερίνης που συµµετέχουν στην διαδικασία της πήξης. ΜΕΘΟ ΟΣ Φωτοµετρία Αντικείµενο της φασµατοφωτοµετρίας είναι ο προσδιορισµός της κατάλληλης ακτινοβολίας, η οποία είναι ικανή να προκαλέσει, σε ένα είδος µορίων ή ατόµων τη µετάβαση από µια ενεργειακή κατάσταση σε µια άλλη, καθώς επίσης και η µέτρηση του ποσοστού ακτινοβολίας ορισµένης συχνότητας(µήκους κύµατος ) που διέρχεται µέσα από µια ουσία ή ένα διάλυµα Ο όρος φωτοµετρία, αναφέρεται στη µέτρηση της έντασης του φωτός. Ως φως ορίζεται το τµήµα εκείνο της ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας που βλέπει το ανθρώπινο µάτι και που κυµαίνεται από nm, καθώς και τις γειτονικές περιοχές προς το υπεριώδες και το εγγύς υπέρυθρο που δεν βλέπει το ανθρώπινο και η έντασή τους µετράται µε κατάλληλα φωτοκύτταρα. Η βάση της φωτοµετρικής ανάλυσης είναι η ικανότητα της ύλης ν αλληλεπιδρά µε το φως µε αποτέλεσµα είτε να το απορροφά είτε να το σκεδάζει. Με βάση τα φαινόµενα αυτά έχουν αναπτυχθεί µέθοδοι και αντίστοιχα όργανα που µπορούν να µετρήσουν την ένταση του φωτός αφού τούτο αλληλεπιδράσει πρώτα µε την ύλη (Αρχές Κλινικής Χηµείας, Γεωργάτσου-Αρζόγλου 1993). 57

58 Η φασµατοφωτοµετρία είναι ένας από τους σπουδαιότερους κλάδους της αναλυτικής χηµείας και έχει µεγάλη ανάπτυξη στα τελευταία χρόνια, παράλληλα µε την κατασκευή και την τελειοποίηση των κατάλληλων οργάνων. Φωτοµετρία απορρόφησης Η καταγραφή του εκάστοτε ποσού ακτινοβολίας που απορροφάται από ένα σύστηµα για ένα ευρή φάσµα συχνοτήτων δίνει γραφική παράσταση η οποία αποτελεί το φάσµα απορροφήσεως του συστήµατος για την περιοχή των συχνοτήτων που χρησιµοποιήθηκε. Στη φωτοµετρία απορρόφησης χρησιµοποιούνται µόρια ή τµήµατα µορίων που µπορούν να διεγερθούν από την απορρόφηση του φωτός και ονοµάζονται χρωµοφόρα ή χρωµογόνα. Η βάση της χρησιµότητας της φωτοµετρίας απορρόφησης σαν αναλυτικής µεθόδου είναι ο νόµος του Beer (A=ecd) σύµφωνα µε τον οποίο η απορροφητικότητα είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση της ουσίας που απορροφά το φως. Φασµατοφωτόµετρα Τα όργανα που χρησιµοποιούνται για τη µέτρηση της έντασης της µονοχρωµατικής ακτινοβολίας που διαπερνά ένα υλικό (διάλυµα) σε συνάρτηση µε το µήκος κύµατος της προσπίπτουσας ακτινοβολίας ονοµάζονται φασµατοφωτόµετρα. Τα βασικά τµηµατα από τα οποία αποτελείται ένα φασµατοφωτόµετρο είναι τα εξής : Η φωτεινή πηγή ορατής ή υπεριώδους ακτινοβολίας, παραδείγµατος χάριν λυχνία βολφραµίου ή δευτερίου Ο µονοχρωµάτορας στον οποίο το φως της ακτινοβολίας αναλύεται µε τη βοήθεια πρίσµατος ή περιθλαστικής εσχάρας σε διάφορα µήκη κύµατος, από τα οποία γίνεται η διαλογή της ακτινοβολίας του επιθυµητού µήκους κύµατος µε τη βοήθεια του επιλογέα µήκους κύµατος Το σύστηµα υποδοχής του δείγµατος Τον ανιχνευτή, όπως για παράδειγµα µια φωτοδίοδος 58

59 Το σύστηµα µέτρησης το οποίο συνήθως είναι βαθµονοµηµένο, ώστε να δίνει τιµές διαπερατότητας και απορροφητικότητας. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν κατάλληλα χρωµογόνα υποστρώµατα τα οποία υδρολύονται από τη θροµβίνη ή τον παράγοντα Xa και απελευθερώνουν pna (π-νίτρο-ανιλίνη) οπότε και µετράται η αύξηση της απορροφητικότητας στα 405 nm. To φωτόµετρο που χρησιµοποιήθηκε ήταν το EOS 880 της εταιρίας CGA STRUMENTI SCINTIFICI. Φωτοµετρικός προσδιορισµός της δραστικότητας της θροµβίνης Η µέθοδος προσδιορισµού της ενεργότητας της θροµβίνης βασίζεται στην διαφορετική απορροφητικότητα ανάµεσα στο pna (πνίτρο-ανιλίνη) που δηµιουργείται και το αρχικό υπόστρωµα, το Η -D- Phenylalanyl-L-pipecolyl-Larginine-p-nitroaniline dihydrochloride (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA ). Ο αρχικός όγκος του δείγµατος πλάσµατος είναι 40 µl ενώ ο τελικός όγκος αντίδρασης 500 µl. Το σύνολο του δείγµατος τοποθετείται στο φωτόµετρο και µετράται η αύξηση της απορροφητικότητας στα 405 nm κάθε 30 s για 3 min στους 37 0 C. Ο ρυθµός του σχηµατισµού του pna και εποµένως η αύξηση της απορροφητικότητας ανα sec στα 405 nm είναι ανάλογη µε την ενζυµική δραστικότητα της θροµβίνης που σχηµατίζεται, η οποία υδρολύει το υπόστρωµα και απελευθερώνει pna, βάση της παρακάτω αντίδρασης : H-D-Phe-Pip-Arg-pNA H-D-Phe-Pip-Arg-OH + pna ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΟΥ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ Η κινητική παραγωγής της θροµβίνης µετράται σε σταθερή θερµοκρασία, στους 37 0 C. Σε 30 µl δείγµατος προσθέτονται 430 µl ρυθµιστικού διαλύµατος. Ακολουθεί η προσθήκη 10 µl Τhromborol S (ιστικός παραγοντας ½) και 35 µl του υποστρώµατος S-2238 (5,6 mm). Στη συνέχεια, η παραγωγή θροµβίνης ενεργοποιείται τη χρονική στιγµή t=0 µε την προσθήκη 25 µl CaCl 2. Το µήκος κύµατος 59

60 ρυθµίζεται στα 405 nm και καταγράφεται η οπτική πυκνότητα για κάθε 30 sec και για συνολικό χρονικό διάστηµα 3 min. Κατόπιν, κατασκευάζονται οι καµπύλες της κινητικής της παραγωγής θροµβίνης σε σχέση µε την οπτική πυκνότητα ως συνάρτηση του χρόνου. Οι περεταίρω υπολογισµοί γίνονται µε τη βοήθεια του προγράµµατος κινητικής του µηχανήµατος ανάλυσης και η εναλλαγή απορρόφησης ανά λεπτό υπολογίστηκε σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στην παρούσα µελέτη, η βελτιστοποίηση της µεθόδου βασίστηκε στην εφαρµογή διαφορετικών τιµών ph και στη χρήση διαφορετικών συγκεντρώσεων υποστρώµατος S-2238 και CaCl 2, Παρακάτω παρουσιάζονται αποτελέσµατα και καµπύλες από επιλεγµένα δείγµατα που θεωρήσαµε ότι αποτελούν τα πιο αντιπροσωπευτικά. 60

61 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ (S-2238) ΓΡΑΦΗΜΑ 1 : ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ Το γράφηµα 1 αναπαριστά την εκτίµηση της βέλτιστης συγκέντρωσης του υποστρώµατος στην αντίδραση παραγωγής θροµβίνης. Παρατηρούµε λοιπόν, ότι καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του υποστρώµατος, αυξάνεται αντίστοιχα και ο ρυθµός της αντίδρασης, δηλαδή η ενζυµική ενεργότητα. Εντούτοις, αυτό που περιορίζει την αντίδραση είναι ο κορεσµός του ενζύµου. Κορεσµός επέρχεται όταν τα ενεργά κέντρα όλων των µορίων βρίσκονται δεσµευµένα κατά τη διάρκεια µιας αντίδρασης. Στην παρούσα µελέτη βελτιστοποίησης, η βέλτιστη τιµή εντοπίστηκε µετά από διαφορετικές συγκεντρώσεις που δοκιµάστηκαν, οι οποίες είναι 0,37 mmol/l και αντιστοιχούν σε 35 µl υποστρώµατος από το διάλυµα που χρησιµοποιήθηκε αρχικά. 61

62 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ CaCl 2 ΓΡΑΦΗΜΑ 2 : ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ CaCl 2 ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ Είναι γνωστό και έχει αναφερθεί παραπάνω, πως η αντίδραση παραγωγής της θροµβίνης πυροδοτείται από την παρουσία του CaCl 2. Κατά τη διάρκεια βελτιστοποίησης της συγκεκριµένης µεθόδου, χρησιµοποιήθηκαν διάφορες συγκεντρώσεις CaCl 2, µε βέλτιστη τη συγκέντρωση των 4,7 mmol/l που αντιστοιχούν σε 25 µl CaCl 2. από το αρχικό διάλυµα που χρησιµοποιήθηκε. 62

63 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΤΙΜΗΣ ΤΟΥ ph ΓΡΑΦΗΜΑ 3 : ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΤΙΜΗΣ ΤΟΥ ph ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ Είναι ευρέως γνωστό, πως για κάθε αντίδραση, το ρυθµιστικό διάλυµα, επηρεάζει άµεσα και ισχυρά το αποτέλεσµα. Πιο συγκεκριµένα, η τιµή του ph είναι από τους βασικούς παράγοντες που επηρεάζουν την πορεία της αντίδρασης και ειδικότερα, το ph επιδρά ισχυρά στην πρωτεολυτική ενεργότητα των ενζύµων της αντίδρασης. Για τη θροµβίνη, έχει εντοπιστεί, πως είναι ενεργή στις τιµές ph 5 έως 10. Στη δική µας περίπτωση, µελετήθηκε η δράση της θροµβίνης σε διάφορες τιµές ph και από τις οποίες η βέλτιστη για τη θροµβίνη στην αντίδραση µας παρατηρήθηκε ότι είναι η τιµή 7,7. 63

64 ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΤΗΣ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΣΕ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ΕΙΓΜΑΤΑ ΓΡΑΦΗΜΑ 4 : ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΤΗΣ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΣΕ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ΕΙΓΜΑΤΑ Παρατηρούµε πως για κάθε άτοµο η παραγωγή της θροµβίνης µπορεί να διαφέρει σηµαντικά τόσο στην τελική ποσότητα που παράγεται, όσο και στην ταχύτητα µε την οποία εµφανίζεται. 64

65 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΘΗΚΗΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VIIα ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ Xα ΣΕ ΕΙΓΜΑΤΑ DIX ΓΡΑΦΗΜΑ 5 : ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΘΗΚΗΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VIIα ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ Xα ΣΕ ΕΙΓΜΑΤΑ DIX Στο παραπάνω γράφηµα παρατηρείται η επίδραση του παράγοντα VIIα στην παραγωγή του παράγοντα Xα στο ίδιο δείγµα, όταν ο πρώτος προστίθεται σε περίσσεια. Στο πλάσµα του δείγµατος δεν περιέχεται ο παράγοντας IX και για το λόγο αυτό ονοµάζεται deficient. Τελικά από τα αποτελέσµατα αυτών των µετρήσεων διεξάγεται το συµπέρασµα πως δεν παρατηρείται παραγωγή µεγαλύτερης ποσότητας δραστικού παράγοντα Xα µετά την προσθήκη του παράγοντα VIIα. Αυτό που µπορεί όµως να παρατηρηθεί είναι πως διαφέρει η αρχική παραγωγή του παράγοντα και µάλιστα στην περίπτωση της προσθήκης του VIIα, η παραγωγή του Xα είναι ταχύτερη. Κάτι τέτοιο έχει ως αποτέλεσµα τη µικρότερη πιθανότητα θρόµβωσης, εφόσον την παραγωγή του Xα, ακολουθεί η παραγωγή της θροµβίνης. 65