ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007 ΤΕΥΧΟΣ 42 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ

Transcript

1 ΕΦΗΜΕΡΙΔΕΣ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ Χ + 7 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007 ΤΕΥΧΟΣ 42 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΚΩΔ ΠΛΗΡΩΜΕΝΟ ΤΕΛΟΣ Ταχ. Γραφείο Κ Ε Μ Π Α Θ Αριθμός Άδειας ΕΚΔΟΤΩΝ Ε Λ ΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙ Α ΚΛΙΝΙΚΗΣ Χ Η ΜΕΙ Α Σ - ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧ Η ΜΕΙ Α Σ Ακαδημίας Αθήνα - τηλ.:

2

3 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 42 Περιεχόμενα 4 Euromedlab Amsterdam Αντί για μικρά αλλά σημαντικά 8 Ulf Landegren Βραβείο IFCC/Abbot Εργαστηριακοί επιστήμονες ή χειριστές διαγνωστικής τεχνολογίας; 13 Ο γυμνός κόσμος 14 Οι βιοαισθητήρες στην Κλινική Χημεία 18 Προσδιορισμός της βιταμίνης D στο πλάσμα 20 Μελέτη μεθυλίωσης των γονιδιών RASSF1A και BRCA1 στον ορό ασθενών με πρώιμο καρκίνο μαστού 25 Καλοκαιρινό QUIZ Προσεχή Συνέδρια Ιδιοκτήτης: ΕΕΚΧ-ΚΒ Ακαδημίας Αθήνα Τηλ.: Fax: Εκδότρια & Δ/ντρια Σύνταξης Αικ. Ψαρρά Νοταρά 39, Αθήνα stps@hol.gr Επιτροπή Σύνταξης Μ. Βικεντίου, Μ. Γαροφαλάκη, Α. Γρηγοράτου, Ε. Κώνστα, Κ. Κωνσταντινάκου, Β. Λόη, Ν. Παπαγεωργάκης Δημιουργικός Σχεδιασμός Multimedia Trend ΕΠΕ Επιμέλεια - Παραγωγή Focus on Health ΕΠΕ Ιωάννου Γενναδίου 16, Αθήνα, Τηλ.: , Fax: info@focusonhealth.gr Editorial Αγαπητοί συνάδελφοι, Όταν θα λάβετε αυτό το τεύχος, σίγουρα δεν θα κάνει τόση ζέστη, θα έχουν περάσει οι καύσωνες, οι πυρκαγιές. Ό,τι χάθηκε δυστυχώς δεν θα ξαναγυρίσει Θα έχετε γυρίσει, ωστόσο, από τις διακοπές σας και θα είσαστε όλο όρεξη να απολαύσετε(!!!) αυτό το δελτίο, όπου θα βρείτε παρουσίαση του Πανευρωπαϊκού Συνεδρίου Κλινικής Χηµείας για όσους δεν ήταν, αλλά και για όσους ήταν εκεί Θα βρείτε ακόµη ενδιαφέρουσες σκέψεις για τη σηµερινή κατάσταση του επαγγέλµατος, τους βιοαισθητήρες και τις εφαρµογές τους από το παρόν και το µέλλον. Περιγράφεται, επίσης, µέθοδος προσδιορισµού της βιταµίνης D και παρουσιάζεται η βραβευµένη στο Πανελλήνιο Συνέδριο εργασία για τη µεθυλίωση του DNA. Τέλος, µην ξεχάσετε το φετινό quiz για το καλοκαίρι και αν σας προκληθούν κάποιες τύψεις, δεν έχετε παρά να επανορθώσετε Αν πάλι όχι Πρέπει πάντως να παραδεχθώ ότι όλο και περισσότεροι δείχνουν ανταπόκριση στο Δελτίο, επικοινωνούν µαζί µας, λένε τις απόψεις τους, προσφέρουν τη βοήθειά τους, στέλνουν τις εργασίες τους Αν το Δελτίο σας βρει µετά τις διακοπές σας, καλό φθινόπωρο και καλή δουλειά Με φιλικούς χαιρετισµούς, Κατερίνα Ψαρρά ΥΓ. Το ποίημα γραμμένο πριν από περισσότερα από 100 χρόνια, μιλάει για το επάγγελμα και είναι μελαγχολικό. Τι να σημαίνει πάλι αυτό; 3

4 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ EUROMEDLAB Amsterdam 2007 Κατερίνα Ψαρρά Γενικά Στις 3-7 Ιουνίου 2007 πραγματοποιήθηκε στο Άμστερνταμ της Ολλανδίας το EUROMEDLAB Amsterdam 2007, 17 th IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine και 60 th National Congress of the Netherlands Society for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, που διοργανώθηκε από την Ολλανδική Εταιρεία Κλινικής Χημείας υπό την αιγίδα της FESCC (Forum of the European Societies of Clinical Chemistry) και της IFCC (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine). Στη διάρκεια του Συνεδρίου σε συνέλευση των αντιπροσώπων όλων των Ευρωπαϊκών Εταιρειών εκλέχθηκε το πρώτο Διοικητικό Συμβούλιο της νέας Εταιρείας, της EFCC (European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine), που προέκυψε μόλις φέτος από τη συνένωση της EC4 (όπου ανήκαν οι εταιρείες των χωρών της Ευρωπαϊκής Ένωσης) και της FESCC (όπου ανήκαν οι εταιρείες όλων των Ευρωπαϊκών χωρών). Έτσι, πρώτος πρόεδρος θα είναι ο πρώην πρόεδρος της FESCC Prof Dr Vic Blaton (Belgium) και στη θητεία του ίδιου Διοικητικού Συμβουλίου μετά από ένα χρόνο θα τον διαδεχθεί ο πρώην πρόεδρος της EC4 Mr Mike Hallworth (UK). Ωστόσο, στο πλαίσιο της νέας Εταιρείας θα εξακολουθήσει η λειτουργία του Ευρωπαϊκού Μητρώου Κλινικών Χημικών με σκοπό την προώθηση των συμφερόντων των Κλινικών Χημικών σε ευρωπαϊκό επίπεδο. Στο Συνέδριο έλαβαν μέρος περίπου σύνεδροι από 59 χώρες (από όλο τον κόσμο), από τους οποίους περίπου 200 ήταν Έλληνες. Παρουσιάστηκαν εργασίες σε poster (34 περίπου προφορικές), από τις οποίες 47 προέρχονταν από την Ελλάδα. Οι ελληνικής προέλευσης εργασίες παρουσίαζαν ποικίλη θεματολογία, προέρχονταν από Νοσοκομεία και Πανεπιστημιακά Ιδρύματα όλης της χώρας (ενδεικτικά αναφέρω εκτός από την Αθήνα, τις Θεσσαλονίκη, Λάρισα, Ιωάννινα, Καρδίτσα, Καβάλα, Ηράκλειο), γεγονός πολύ ευχάριστο και ελπιδοφόρο. Το επιστημονικό μέρος του προγράμματος είχε ευρεία θεματολογία. Θα προσπαθήσουμε να αναφερθούμε με λίγα λόγια στις λεγόμενες plenary (κεντρικές) ομιλίες, αντί άλλων μικρών αλλά ενδιαφερόντων θεμάτων στο τεύχος αυτό. Αντίστοιχη ποικιλία παρουσίαζαν τα θέματα των συμποσίων και των workshops, τονίζοντας ότι σήμερα η Κλινική Χημεία δεν είναι μόνο κλασική αλλά και εναλλακτική. Δεν χάνουμε ευκαιρία να καταργούμε τα όρια. Στην τελετή έναρξης βραβεύθηκε από την FESCC και τη Roche ο Prof. Mathias M. Müller (Vienna), ο οποίος ως πρόεδρος της IFCC και πραγματικός Ευρωπαίος έπαιξε σημαντικό ρόλο στην ενσωμάτωση των Εθνικών Εταιρειών στην IFCC και τη FESCC. Επίσης, βραβεύθηκε από την IFCC και την Abbott ο Prof Ulf Landegren (περισσότερα για τη δουλειά του που οδήγησε στη βράβευσή του για τη συνεισφορά του στη Μοριακή Διαγνωστική μπορείτε να διαβάσετε στο σχετικό άρθρο της κ. Μ. Βικεντίου σε αυτό το τεύχος). Στη συνέχεια, ο Prof J. H. Ravesloot μίλησε για το νερό «Ένα σώμα από νερό», το σώμα αυτό είναι ο οργανισμός αλλά και η Ολλανδία Σ αυτήν την πολύ ενδιαφέρουσα ομιλία, έγινε δυνατός ο συνδυασμός της σημασίας του νερού στον οργανισμό μας και άρα, στην Κλινική Χημεία αλλά και σε μια χώρα, όπου αποτελεί κυρίαρχο στοιχείο, τη χώρα που φιλοξενούσε το συνέδριο. Το νερό παρουσιάστηκε και στη φλαμανδική τέχνη από τον καθηγητή ιστορίας της τέχνης Dr J. G. Schwartz στην επόμενη ομιλία και γέμισαν τα μάτια μας από το φως αυτής της τέχνης, που απεικονίζει το νερό σε όλες τις μορφές του, κυρίαρχο στοιχείο της καθημερινής ζωής αυτών των χωρών ανά τους αιώνες. Τα μπαλέτα και η μουσική που παρουσιάσθηκε είχαν κάτι από νερό: Ήταν διαυγή, έρρεαν, ήταν ζωηρά, χαρούμενα Την πρώτη plenary ομιλία τίμησε με την παρουσία της η Βασίλισσα Βεατρίκη της Ολλανδίας, η οποία, σημειωτέον, επισκέφθηκε και την εμπορική έκθεση και συνομίλησε με πολλούς εκθέτες για τη σημασία των μηχανημάτων και των αντίστοιχων προσδιορισμών, (υποθέτω χωρίς να γνωρίζω με ασφάλεια, διότι δυστυχώς αν και συντάκτης αυτού του φοβερού δελτίου και αν και παρούσα, δεν με κάλεσαν μπροστά-μπροστά να παρακολουθήσω τη ροή των γεγονότων). Και το πρόγραμμα έρρεε σαν νερό όλα στην ώρα τους, οι ομιλητές, τα poster, η έκθεση πλούσια, άλλα θέματα πιο ενδιαφέροντα, άλλα λιγότερο για τον καθένα από τους συμμετέχοντες. Το επίσημο party πραγματοποιήθηκε σε ένα υπέροχο κτίριο, το παλιό Χρηματιστήριο της πόλης, όπου παρουσιάσθηκε σε ταινία η Ολλανδία του εικοστού αιώνα, έγινε ζωντανή αναπαράσταση της «Νυχτερινής Περιπολίας» του Rembrandt και προσφέρθηκε άφθονο φαγητό, ποτά και μουσική και χορός. Οι οικοδεσπότες ανέδειξαν πραγματικά την ιστορία, την τέχνη και τη σημασία της χώρας τους με τον πλέον φιλόξενο τρόπο. 4

5 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 42 Σε όλη την πόλη, στις στάσεις των λεωφορείων και άλλων χώρων για διαφήμιση παρουσιάζονταν φωτογραφίες εργαστηριακών με την εργαστηριακή τους μπλούζα και λεζάντες του τύπου: «Έχω εξετάσει ορούς παιδιών για την τάδε κληρονομική ασθένεια», «έχω διδάξει σε φοιτητές την τάδε τεχνική», «έχω διαγνώσει την τάδε διαταραχή σε τόσα άτομα» κ.λπ. Η καμπάνια αυτή από εμπορική εταιρεία του χώρου ήθελε να δείξει σε όλη την πόλη τη σημασία αυτού του επαγγέλματος χαμηλού προφίλ, αλλά τόσο σημαντικού στην καθημερινή ζωή όλων, ήθελε να δείξει στην πόλη ποιους είχε την τιμή να φιλοξενεί από όλο τον κόσμο. Το επόμενο συνέδριο θα πραγματοποιηθεί στο Innsbruck της Αυστρίας το Μέχρι τότε, καλούνται οι συγγραφείς των ελληνικών εργασιών να παρουσιάσουν τις εργασίες τους στο περιοδικό μας (οι τελίτσες δείχνουν την επιθυμία και την ανυπομονησία μας Μην ξεχνάτε το δελτίο. Πρέπει να είναι χώρος παρουσίασης όλων μας). Σημείωση (1): Ευχαριστούμε τον Κώστα Μακρή για τα αριθμητικά στοιχεία (το στοιχείο του, τα στοιχεία) Σημείωση (2): Συγχωρήστε την παρουσία μου στις φωτογραφίες και μάλιστα ανάμεσα στα λουλούδια 5

6 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Αντί για μικρά αλλά σημαντικά ΠΕΡΙΛΗΨΕΙΣ ΤΩΝ ΚΥΡΙΩΝ ΔΙΑΛΕΞΕΩΝ (PLENARY) του EUROMEDLAB 2007 Η επίδραση της μοντέρνας γενετικής στην κοινωνία J.-J. Cassiman Οι γνώσεις μας για τη λειτουργία του ανθρώπινου DNA προοδεύουν όπως και η δυνατότητα εξέτασης και ελέγχου του πληθυσμού για γονίδια που συμμετέχουν σε κληρονομούμενες ασθένειες και σε ευαισθησία για εκδήλωση νόσου. Επίσης, ταυτοποιούνται επιγενετικές, επίκτητες και κληρονομούμενες τροποποιήσεις του DNA. Έτσι, οδηγηθήκαμε στη διαπίστωση ότι ακόμη και περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως τα συστατικά των τροφίμων, μπορούν να τροποποιήσουν δραματικά τη λειτουργία του DNA. Ως αποτέλεσμα, οι περισσότερες απλές εξετάσεις που γίνονται σήμερα θα πρέπει να συμπληρώνονται από εξετάσεις που θα επιτρέπουν πιο ακριβή πρόβλεψη των κινδύνων, της προόδου και των κλινικών χαρακτηριστικών κάθε νόσου. Η υψηλής απόδοσης ανάλυση της αλληλουχίας του DNA άνοιξε επίσης νέα σειρά προσεγγίσεων για την ταυτοποίηση μεμονωμένων χαρακτηριστικών ευαισθησίας ανάπτυξης νόσου ή ευαισθησίας σε φάρμακα, τομείς με ιδιαίτερο μέλλον στην κλινική εφαρμογή, αν και απαιτείται ακόμη πολλή έρευνα πριν την εφαρμογή στην καθημερινή πρακτική. Ρουτίνα έχει γίνει η σχετική εφαρμογή στην ιατροδικαστική. Είναι σαφές ότι ευρισκόμαστε μόλις στην αρχή της κατανόησης της λειτουργίας των τμημάτων του DNA, αλλά έχουμε ήδη αρκετά παραδείγματα για να προβλέψουμε την εξέλιξη αυτού του τομέα. Παλαιές και νέες φαρμακευτικές επιλογές για την αντιμετώπιση της παχυσαρκίας S. R. Bloom Η παχυσαρκία αποτελεί ένα άλυτο πρόβλημα. Δύο φάρμακα, τα Orlistat και Sibutramine είναι σε χρήση αλλά δεν έχουν αποδειχθεί και έχουν παρενέργειες. Ο ανταγωνιστής του CB-1, Rimonobant, άρχισε να χρησιμοποιείται με μεγαλύτερη επιτυχία αλλά έχει σημαντικές παρενέργειες (κατάθλιψη) και αποτελεί απλώς βοήθημα για την απώλεια βάρους. Τα κύρια φάρμακα είναι παράγοντες που βασίζονται στη σεροτονίνη και άλλοι τροποποιητές νευρομεταβιβαστών με σημαντικές παρενέργειες. Η μόνη αληθινά αποτελεσματική θεραπεία είναι η παράκαμψη (by-pass) του λεπτού-παχέος (jejunoileal) εντέρου που για άγνωστο λόγο προκαλεί ελάττωση της όρεξης. Προτείναμε πρώτοι τη χρήση των ορμονών του στομάχου ως φυσικό τρόπο απώλειας της όρεξης μετά το φαγητό. Οι ορμόνες του στομάχου έχει αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της όρεξης και αναπτύσσονται σήμερα ως εν δυνάμει φυσικές θεραπείες. Ανίχνευση βιοδεικτών, εκτινάσσοντας τα βιολογικά απόβλητα σε διαγνωστικό χρυσό E.F. Petricoin III et al. Η κλινική χρήση των βιοδεικτών έγκειται στην ικανότητά τους να προσδιορίζονται σε ένα εύκολα προσβάσιμο βιολογικό υγρό, όπως ο ορός/πλάσμα. Παρά την επείγουσα κλινική ανάγκη ανακάλυψης νέων δεικτών πρόγνωσης του καρκίνου, ο αριθμός τους είναι απαράδεκτα χαμηλός. Αυξανόμενες ενδείξεις υπάρχουν ότι κάθε κύτταρο, συμπεριλαμβανομένων αυτών με μικρές αρχικές βλάβες καρκίνου, αφήνει στοιχεία της φυσιολογικής του κατάστασης, που αντανακλώνται στα πρωτεωμικά και μεταβολωμικά προϊόντα που χύνει στο αίμα. Το πρωτέωμα του ορού είναι το πιο πολύπλοκο αρχείο πληροφοριών στη βιολογία και έχει δυναμικό εύρος, που εκτείνεται σε 10 τάξεις μεγέθους. Επιπρόσθετα, η πολύτιμη πληροφορία για παθολογικές καταστάσεις στον οργανισμό μπορεί να αποτελεί το 1% της συνολικής πρωτεΐνης. 6

7 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 42 Μέσα στο αρχείο των πρωτεϊνών χαμηλής ποσότητας στην κυκλοφορία υπάρχουν τμήματα μεγαλύτερων πρωτεϊνών χαμηλής ποσότητας, που μπορούν να διαχυθούν μέσω του μεσοκυττάριου χώρου στην κυκλοφορία λόγω ελαττωμένου μεγέθους. Αυτή η μοριακή δεξαμενή από χαμηλού μοριακού βάρους πρωτεΐνες (low molecular weight LMW) θεωρείται σήμερα ότι περιέχει μια τεράστια αποθήκη εν δυνάμει διαγνωστικής πληροφορίας. Η συγκέντρωση των LMW ανά πάσα στιγμή αντανακλά την παραγωγή και τη νεφρική τους κάθαρση. Η σύνδεση με πρωτεΐνες φορείς μπορεί να ελαττώσει το χρόνο ημιζωής τους, διότι οι συνδεδεμένοι δείκτες αποκτούν το χρόνο ημιζωής των φορέων τους, που απαρτίζουν μια δεξαμενή συσσώρευσης και ενίσχυσης των βιοδεικτών. Επομένως στρατηγικές και μέθοδοι που μπορούν να αναλύσουν αποτελεσματικά τους φορείς των βιοδεικτών LMW θα μπορούσαν να αποτελέσουν ένα ισχυρό σημείο εκκίνησης για την ανακάλυψη LMW βιοδεικτών μέσα στο ανθρώπινο «κλασμάτωμα» (fragmentome). Κυκλοφορούν RNA: Έγκαιρη ανίχνευση της προεκλαμψίας και άλλων διαταραχών C.B.M. Oudejans et al. The Netherlands Εισαγωγή: Επειγόντως αναζητούνται τρόποι έγκαιρης ανίχνευσης ασθενών σε κίνδυνο να αναπτύξουν προεκλαμψία και άλλες διαταραχές αφού αφορούν περισσότερες από 8 εκατομμύρια έγκυες γυναίκες το χρόνο. Καθώς η προεκλαμψία είναι καθορισμένη γενετικά, η προτιμώμενη και πιο αποτελεσματική στρατηγική πρόληψης αρχίζει με την κατανόηση της γενετικής της. Δεύτερον, αν και τα κλινικά συμπτώματα αργούν, η μητρική και συστηματική προεκλαμψία αρχίζει με τη δυσλειτουργία των εμβρυικών, δηλ. πλακουντιακών κυττάρων κατά το πρώτο τρίμηνο. Διαγνωστικά αυτό θέτει μια τεράστια πρόκληση: Η μέθοδος θα πρέπει να επιτρέπει την ταυτοποίηση των γυναικών σε κίνδυνο πριν την εκδήλωση κλινικών συμπτωμάτων. Δεύτερον, η μέθοδος θα πρέπει να δίνει πληροφορίες για το πρωταρχικό συμβάν: την πλακουντιακή δυσλειτουργία. Πραγματικά, ποικίλοι πρωτεϊνικοί βιοδείκτες πλακουντιακής προέλευσης (PIGF, sflft1, seng) δείχνουν τροποποιημένα επίπεδα στον ορό της μητέρας, αλλά δεν έχουν διαγνωστική και προγνωστική ισχύ σε μεμονωμένες ασθενείς. Αντίθετα, το πλακουντιακό RNA στο μητρικό πλάσμα επιτρέπει τον ταχύ έλεγχο νέων βιοδεικτών, συμπεριλαμβανομένων δεικτών (μεταγραφικοί παράγοντες, μη κωδικοποιούμενο RNA) και χαρακτηριστικών (επιγενετικές μεταβολές, αναλογίας αλληλίων) μη προσβάσιμων με συμβατικές μεθόδους βασισμένες σε αντισώματα. Μέθοδοι: Μελετήθηκαν γυναίκες με σχετικό ιστορικό, ακόμη και από 3 γενεές, από τις οποίες απομονώθηκε το κυκλοφορούν RNA. Αποτελέσματα: Χρησιμοποιήθηκε RT-PCR και άλλες μοριακές τεχνικές για την ανίχνευση και μελέτη του STOX1 mrna μαζί με 278 RNA βιοδείκτες, από τους οποίους 23 πληρούσαν τα κριτήρια ανιχνευσιμότητας στο πλάσμα πρώτου τριμήνου, χωρίς να ανιχνεύονται σε μη έγκυες γυναίκες. Συμπεράσματα: Η προεκλαμψία είναι κοινή νόσος που προκαλείται από κοινούς πολυμορφισμούς σε πολλαπλά γονίδια που αλληλεπιδρούν με τον πρώιμο πλακούντα. Προβλέπουμε ότι χρησιμοποιώντας πλακουντιακό RNA από το μητρικό πλάσμα, η ποσοτική ανάλυση των αλληλίων, που εκφράζονται από γονίδια ευαισθησίας στην προεκλαμψία, μαζί με ένα ή περισσότερους από τους 23 δείκτες, θα επιτρέψει την προσυμπτωματική διάγνωση της προεκλαμψίας σε κάθε ασθενή. Σημείωση: Όπως βλέπετε οι κεντρικές ομιλίες του συνεδρίου αποτελούσαν ελπιδοφόρες προβλέψεις διάγνωσης για το εργαστηριακό διαγνωστικό και προγνωστικό μέλλον, που προβλέπεται λαμπρό, αλλά δύσκολο και μάλλον όχι άμεσο. Όσο για το παρελθόν υπήρχε και συμπόσιο για την Ιστορία της Ολλανδικής Εταιρείας Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ιατρικής. Τα θέματα των συμποσίων ήταν μάλλον πιο σημερινά, αν και γενικά κοίταζαν με αισιοδοξία προς το μέλλον. 7

8 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Ulf Landegren Βραβείο IFCC/Abbott 2007 Μυροφόρα Βικεντίου Χημικός, MSc Κλινικής Βιοχημείας-Μοριακής Διαγνωστικής Στα πλαίσια των εργασιών του 17 ου IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (Ευρωπαϊκού Συνεδρίου Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ιατρικής) απονεμήθηκε στον Καθηγητή Ulf Landegren (Καθηγητή του Εργαστηρίου Rudbeck του Τμήματος Γενετικής και Παθολογίας/Μοριακής Ιατρικής του Πανεπιστημίου της Uppsala στη Σουηδία) το βραβείο 2007 IFCC/Abbot για τη σημαντική συνεισφορά του στη μοριακή διαγνωστική. Το βραβείο αυτό δίδεται στο πρόσωπο που συμβάλλει με ιδιαίτερο τρόπο στην προαγωγή και την κατανόηση της μοριακής βιολογίας και των εφαρμογών της στην κλινική χημεία και στην εργαστηριακή ιατρική σε όλο τον κόσμο. Ο Καθηγητής Landegren συνέβαλε στο νέο πεδίο της ανίχνευσης των μακρομορίων που εντάσσονται στο πεδίο της έρευνας του γονιδιώματος. Ο Καθηγητής Landegren με την ερευνητική του ομάδα συνέβαλε σημαντικά στην τεχνολογική ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων στη μοριακή βιολογία και στην πρωτεομική. Τα επιτεύγματά του έχουν εκτιμηθεί ευρέως και εργασίες του έχουν δημοσιευτεί σε σημαντικά περιοδικά όπως Nature και Science. Επίσης, έχει αναπτύξει σημαντικές εμπορικές εφαρμογές. Είναι επίσης ο εκδότης της σειράς των βιβλίων «Rapid Cycle Real-Time PCR». [1] Κάποια επιπλέον στοιχεία για την έρευνα του Καθηγητή Landegren Είναι γνωστό ότι απαιτούνται βελτιωμένες αναλυτικές τεχνικές για την αξιοποίηση του μεγάλου όγκου πληροφοριών που προκύπτει από τη διερεύνηση του γονιδιώματος για την καλύτερη κατανόηση της βιολογίας των οργανισμών. Η ομάδα Μοριακής Ιατρικής στο Εργαστήριο Rudbeck του Τμήματος Γενετικής και Παθολογίας, αναπτύσσει σημαντικές τεχνολογίες για ανάλυση σε γενετικό και πρωτεϊνικό επίπεδο. Οι τεχνολογίες εφαρμόζονται αφενός στην παρακολούθηση δειγμάτων ασθενών και αφετέρου στη βασική βιολογική έρευνα. Η έρευνα της ομάδας του Καθηγητή Landegren περιλαμβάνει δυο πεδία: τους ιχνηθέτες Padlock (Padlock probes) οι οποίοι επιτρέπουν υψηλής ειδικότητας ανίχνευση DNA ή RNA αλληλουχιών. Σημαντικοί στόχοι της ομάδας περιλαμβάνουν την αύξηση της ικανότητας παράλληλης ανάλυσης μέσω της εφαρμογής software για βοήθεια σύνθεσης του ιχνηθέτη και την βελτιωμένη σύνθεση των padlock ιχνηθετών αλλά και τη χρήση των ιχνηθετών padlock σε μεγάλο εύρος βιολογικών εφαρμογών. Η ανάλυση, σε επίπεδο πρωτεϊνών, μέσω της σύνδεσης εγγύτητας (proximity ligation) περιλαμβάνει την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών ή πρωτεϊνικών συμπλόκων μέσω της σύνδεσης δυο ή περισσοτέρων ιχνηθετών μεγάλης συγγένειας και ενίσχυσή τους με PCR. Η στρατηγική αυτή, έχει αποδειχτεί ότι προσφέρει σημαντική αύξηση ειδικότητας και ευαισθησίας, σε σύγκριση με άλλες μεθόδους. Επιπλέον, επιτρέπει την παράλληλη παρακολούθηση έκφρασης σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Στην παρούσα φάση, η ερευνητική ομάδα του Καθηγητή Landegren διερευνά πρωτόκολλα για την αύξηση ειδικότητας και ευαισθησίας της παρούσας μεθόδου η οποία χρησιμοποιείται για την in situ ανάλυση της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνικών μορίων.[2] Η ανάπτυξη μεθόδων και τεχνολογιών για ακριβείς και αξιόπιστες μετρήσεις αντιπροσωπεύει το θεμέλιο λίθο στην πρόοδο της έρευνας. Συγκεκριμένα, οι νέες μέθοδοι χρειάζονται για το χαρακτηρισμό των ιδιοτήτων όλων των μακρομορίων που ταυτοποιούνται και εντάσσονται στο πεδίο της έρευνας του γονιδιώματος και χρησιμοποιούνται σε μεγάλο εύρος βιολογικών εφαρμογών. Οι ιχνηθέτες αυτοί περιλαμβάνουν στοιχεία με συγγένεια προς εξειδικευμένα μόρια νουκλεϊνικών οξέων ή μόρια πρωτεΐνης καθώς και μοναδικό ανιχνευτή στοιχείων αλληλουχίας DNA που αποτελεί κωδικό για την αναγνώριση μορίων-στόχων. Η πληροφορία του περιεχόμενου των ελίκων DNA που συμμετέχουν σε αντιδράσεις ανίχνευσης καταγράφεται μετά την ενίσχυση με PCR ή μέσω του rolling circle διπλασιασμού για την ταυτοποίηση των αναγνωρισμένων μορίων-στόχων. Οι διαδικασίες αυτές επιτρέπουν υψηλή εξειδίκευση στο διάλυμα ή εντοπισμένες αναλύσεις (localized analyses) μεγάλων αριθμών 8

9 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 42 μορίων-στόχων, εκτεινόμενων μέχρι και στο επίπεδο του ενός αντιγράφου, όπως απαιτείται για μελλοντικές μοριακές αναλύσεις. [2] Όσον αφορά τους ιχνηθέτες Padlock (PLPs) (Σχήμα 1) είναι μακριά ολιγονουκλεοτίδια των οποίων τα άκρα είναι συμπληρωματικά με των γειτονικών αλληλουχιών-στόχων. Με τον υβριδισμό των δυο άκρων με την αλληλουχίαστόχο τα δυο άκρα συνδέονται μεταξύ τους με ligation επιτρέποντας την PLP κυκλοποίηση (circularization). Οι PLPs έχουν ιδιαίτερα ισχυρή ειδικότητα αναγνώρισης του στόχου, η οποία ακολουθείται από την ενίσχυση με PCR και την ανίχνευση με μικροσυστοιχίες. Τα PLPs μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανάλυση διαγνωστικών συστημάτων για διάφορους οργανισμούς. Για το σκοπό αυτό βελτιστοποιήθηκε η σχεδίασή τους έτσι ώστε να εξασφαλίζεται η υψηλή ειδικότητα και να εκμηδενίζεται η μη ειδική δέσμευση. Στην εργασία των Szemes και συν. [3] σχεδιάστηκαν και δοκιμάστηκαν 11 PLPs για την ανίχνευση διαφόρων παθογόνων μικροοργανισμών των φυτών σε επίπεδο γένους, είδους και υποείδους, ενώ σχεδιάστηκε μια πρωτότυπη μικροσυστοιχία «υγείας» φυτών βασισμένη σε PLPs. Μέσω αυτού αναδείχθηκε εξαιρετική ειδικότητα έναντι των οργανισμών-στόχων. O θόρυβος (background) της αντίδρασης καθορίστηκε σε κάθε υβριδισμό χρησιμοποιώντας ένα δείγμα αναφοράς χωρίς εξειδικευμένο στόχο και είχε σαν αποτέλεσμα την αξιόπιστη και ευαίσθητη ταυτοποίηση των θετικών δειγμάτων. Μέσω αυτών παρατηρήθηκε ευαισθησία ανίχνευσης μέχρι και 5 pg γενωμικού DNA. Το multiplex διαγνωστικό σύστημα αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε με τη χρήση του γενωμικού DNA από ήδη χρησιμοποιημένες απομονώσεις και τεχνητά μίγματα. Το multiplex σύστημα θεωρείται από τους κατασκευαστές του ως προσαρμόσιμο σε μεγάλο εύρος εφαρμογών από χειρισμό παθογόνων ξενιστών μέχρι την περιβαλλοντική μικροβιολογία. [3] Εκτός από τους PLPs ο Καθηγητής Landegren και η ομάδα του εφαρμόζουν την τεχνική Proximity Ligation Assay (PLA) σε πολλές εφαρμογές (Σχήμα 2, 3). [4,5] Συγκεκριμένα, μία άλλη εφαρμογή αφορά στην «Ανίχνευση παθογόνων μικροβίων μέσω proximity ligation. Η ενίσχυση των νουκλεϊνικών οξέων επιτρέπει την ανίχνευση μεμονωμένων μολυσματικών παραγόντων. Οι δοκιμασίες, όμως, που βασίζονται στις πρωτεΐνες ενώ παρέχουν πληροφορίες για την εξέλιξη της λοίμωξης παρουσιάζουν χαμηλή ευαισθησία ανίχνευσης. Για την βελτίωση των δοκιμασιών χρησιμοποιήθηκαν οι αντιδράσεις proximity ligation για την ανίχνευση πρωτεϊνών σε σωματίδια βακτηρίων και ιών μέσω της ενίσχυσης νουκλεϊνικών οξέων. Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν πρωτεΐνες επιφανείας βακτηρίων και ιών φέρουν αλυσίδες DNA οι οποίες μπορούν να συνδεθούν με ligation όταν διάφορα αντι- Σχήμα 1: Σχηματική απεικόνιση της σύνδεσης PLP και της Real time PCR για την ποσοτικοποίηση της διάκρισης mismatch ενός νουκλεοτιδίου. (Α) Οι PLPs περιέχουν συμπληρωματικές αλληλουχίες στο 5 και 3 άκρο (Τ1, Τ2) και βρίσκονται εκατέρωθεν των θέσεων universal εκκινητών P1, P2 και της μοναδικής αλληλουχίας ταυτοποίησης Zipcode. (Β) Οι Τ1 και Τ2 δεσμεύονται στην αλληλουχία-στόχο και στην περίπτωση τέλειας συμπληρωματικότητας ο ιχνηθέτης μπορεί να γίνει κυκλικός παρουσία λιγάσης (a). Μόρια που περιέχουν θέσεις μη συμπληρωματικές (mismatch) δεν θα δεσμευτούν και άρα μπορούν να διακριθούν (b). (C) Οι ιχνηθέτες που δε συμμετέχουν στην αντίδραση, απομακρύνονται παρουσία εξωνουκλεάσης. (D)Οι κυκλικοί ιχνηθέτες ενισχύονται με τη χρήση universal εκκινητών και η ενίσχυση ανιχνεύεται σε πραγματικό χρόνο με τη χρήση ανιχνευτή τύπου Taqman. (E) Η σύνδεση με διαφορετικά ολογινουκλεοτίδια στόχους μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με ακρίβεια χρησιμοποιώντας τη τιμή Ct (Cycle Threshold). σώματα συνδεθούν με πρωτεΐνες επιφανείας των μολυσματικών παραγόντων. Με τον τρόπο αυτό επιτεύχθηκαν υψηλές ευαισθησίες ανίχνευσης ανάλογες με αυτές των αντιδράσεων ανίχνευσης που βασίζονται στα νουκλεϊνικά οξέα. Αποτέλεσμα αυτών η ανίχνευση των μολυσματικών δειγμάτων για τους υπό μελέτη ιούς και βακτηρίων και η ανάπτυξη μεθόδου που επιτρέπει την υψηλής ευαισθησίας ανίχνευση των συνδεδεμένων αλυσίδων DNA μέσω της real-time PCR η οποία θεωρείται ότι μελλοντικά μπορεί να είναι πολύτιμη για τη διάγνωση λοιμώξεων και την άμυνα του οργανισμού. 9

10 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Σχήμα 2: Ομοιογενής φάση PLA σε τρία στάδια: (Α) Το μολυσματικό δείγμα επωάζεται με ζεύγος proximity probes. Οι proximity probes είναι αντισώματα τα οποία είναι συνδεδεμένα με ολιγονουκλεοτίδια τα οποία έχουν είτε το 5 (γκρίζα ταινία) ή το 3 άκρο (μαύρη ταινία) ελεύθερο. (Β) Προσθήκη κοινού μίγματος σύνδεσης (ligation) και ενίσχυσης (amplification). Τα ελεύθερα 5 και 3 άκρα των ιχνηθετών που έχουν συνδεθεί στο μικρόβιο-στόχο υβριδίζονται με ένα κοινό ολιγονουκλεοτιδικό συνδέτη και ενώνονται παρουσία της DNA λιγάσης. (Γ) Τα προϊόντα σύνδεσης ενισχύονται και ανιχνεύονται μέσω Real time PCR. Σχήμα 3: PLA στερεάς φάσης: (Α) Σύνδεση μικροβίουστόχου σε ένα ακινητοποιημένο αντίσωμα το οποίο βρίσκεται σε well-πλακίδιο και απομάκρυνση των μη συνδεδεμένων σωματιδίων με πλύσεις. (Β) Οι proximity probes προστίθενται στο πλακίδιο. Μετά την επώαση απομακρύνονται, με πλύση, οι ιχνηλάτες που δεν έχουν συνδεθεί στο στόχο. Ακολουθεί προσθήκη μίγματος σύνδεσης και ενίσχυσης. Οι ιχνηλάτες που έχουν συνδεθεί στο στόχο σε ζεύγη ενώνονται και στη συνέχεια ενισχύονται με Real time PCR. Βιβλιογραφία 1. J. Prins, C. Ruiter, Monday 4 June, 2007, Daily news, Euromedlab www. genpat.uu.se. (τελευταία επίσκεψη 11 Ιουνίου 2007). 3. M. Szemes, P. Bonants, M. de Weerdt, J. Baner, U. Landegren and C. D. Schoen, (2005) Diagnostic application of padlock probes multiplex detection of plant pathogens using universal microarrays, Nucleic Acids Research, 33(8); S. M. Gustafsdottir, J. Schlingemann, A. Rada-Iglesias, E. Schallmeiner, M. Kamali-Moghaddam, C. Wadelious and U. Landegren, (2007) In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation, PNAS, 104(9); S. Gustafsdotti, A. Nordengrahn, S. Fredriksonn, P/ Wallgren, E. Rivera, E. Schallmeiner, M. Merza and U. Landegren, (2006) Detection of Individual Microbial Pathogens by Proximity Ligation, Clinical Chemistry, 52(5); Σημείωση του εκδότη Ετοιμαστείτε συνάδελφοι για το βραβείο στο Συνέδριο του 2009 στο Innsbruck. Ψιλοπράγματα χρειάζεται. Ζητάμε συγνώμη για τυχόν παρεκτροπές στη μετάφραση των όρων. Κάθε πρόταση δεκτή. 10

11 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 42 Εργαστηριακοί επιστήμονες ή χειριστές διαγνωστικής τεχνολογίας; Χρύσανθος Μητρόπουλος Διευθυντής Τμ. Εξυπηρέτησης Πελατών Medicon Hellas AE Αφορμή για αυτό το σημείωμα μου έδωσαν τρία φαινομενικά ασύνδετα μεταξύ τους θέματα, που όμως δεν αρκεί παρά να τα δει κανείς στο πλαίσιο της τρέχουσας εργαστηριακής πραγματικότητας για να διαπιστώσει ότι συνδέονται στενότατα: 1 Η δημοσίευση του εκπληκτικού άρθρου του Mario Plebani στο τεύχος Απριλίου του CCLM, όπου ο συγγραφέας διερωτάται κατά πόσον οι προσπάθειες των εργαστηριακών για βελτίωση της αναλυτικής ποιότητας τελικά βελτιώνουν την κλινική διαχείριση των ασθενών και απευθύνει έκκληση για τη μείωση του χάσματος που χωρίζει το εργαστήριο από την κλινική πρακτική. Η ανάγνωση για μία ακόμη φορά του άρθρου της Diana Mass 2, που εκφράζει γλαφυρά την αποστροφή: «Έχουμε κάνει τη δουλειά στο κλινικό εργαστήριο να φαίνεται τόσο απλή και εύκολη, ώστε εκείνοι που παίρνουν τις αποφάσεις στις επιχειρήσεις και την κυβέρνηση πιστεύουν ότι το μόνο που έχουμε να κάνουμε είναι να πατάμε κουμπιά», κάτι που επιβεβαιώνεται όλο και πιο συχνά. Η θέση που εξέφρασε ο Πρόεδρος της ΔΥΠε Μακεδονίας, κ. Βαρτζόπουλος, σε πρόσφατη ημερίδα του ΣΕ- ΠΕΥ 3, ότι η επιτυχία της πολιτικής της ανάθεσης των υπηρεσιών καθαρισμού και φύλαξης των Νοσοκομείων σε εταιρείες - εξωτερικούς συνεργάτες (outsourcing) ήταν τόσο μεγάλη, που θα ήταν καλό να σχεδιαστεί πλέον και η αντίστοιχη ανάθεση των εργαστηριακών εξετάσεων! Η αποστροφή λοιπόν της Mass δυστυχώς λειτούργησε προφητικά! Ήδη πιστεύουν ότι πατάμε απλώς κουμπιά! Ο Plebani διατυπώνει και τεκμηριώνει - την άποψη ότι η φροντίδα των εργαστηριακών για τη βελτίωση της αναλυτικής ποιότητας είναι ένας ευγενής κατ αρχή στόχος, όμως δεν αρκεί για να επιβεβαιώσει την αντίστοιχη βελτίωση των υπηρεσιών που απολαμβάνει ο ασθενής, για δύο βασικούς λόγους: Αφενός οι τρέχοντες στόχοι ποιότητας βάσει της βιολογικής μεταβλητότητας έχουν υπολογιστεί θεωρώντας ότι δεν υπάρχει προαναλυτική διακύμανση, ενώ στην πραγματικότητα έχει καταδειχτεί ότι προαναλυτικοί παράγοντες (φυσικές μεταβλητές, που σχετίζονται με τον ασθενή, συλλογή και διαχείριση των δειγμάτων, ιχνηλασιμότητα των δευτεροταγών δειγμάτων, συνθήκες εναποθήκευσης κ.ά.) επηρεάζουν σημαντικά τη συνολική ποιότητα των αποτελεσμάτων. Αφετέρου, όσο και αν τα εργαστήρια φροντίζουν για την αναλυτική ποιότητα, δεν φροντίζουν να επικοινωνούν προς τους ενδιαφερόμενους κλινικούς ιατρούς και άλλους φορείς τις προδιαγραφές ποιότητας που προσφέρουν, ουσιαστικά χωρίζοντας το Νοσοκομείο σε ενδο-εργαστηριακό και εξω-εργαστηριακό χώρο, που συχνά λειτουργούν ασύνδετα και ανεξάρτητα, μη προσφέροντας έτσι την καλύτερη δυνατή διαχείριση στον ασθενή. Απλά αλλά θεμελιώδη ερωτήματα τίθενται από τον Plebani και απαντώνται με τον ιδιαίτερο τρόπο της παράθεσης απαντήσεων σε ερωτήσεις κριτικής προς τις θέσεις του, με εξαιρετική ευστοχία. Για παράδειγμα, ενώ οι τιμές και τα διαστήματα αναφοράς έχουν υπολογιστεί για δείγματα ασθενών μετά από νηστεία, είναι συχνό το φαινόμενο της ανάγκης για επείγουσα ανάλυση δειγμάτων μετά από ένα μεγάλο γεύμα, σε περίπτωση π.χ. ενός ατυχήματος. Κατά πόσο,λοιπόν,βοηθά τον κλινικό ιατρό ένα αριθμητικό αποτέλεσμα με ένα εύρος αναφοράς στο απαντητικό; Χρειάζεται ο ιατρός να γνωρίζει λεπτομέρειες για την αναλυτική ποιότητα και μπορεί να τις αξιοποιήσει, ή του αρκεί μία επισήμανση (flag) πιθανότατα του τύπου «Υψηλό Χαμηλό» ή «Αύξηση Μείωση»; Τι πρέπει να αναγράφουμε στα απαντητικά; Το εύρος αναφοράς, τη μεταβολή αναφοράς 4 (RCV), ή μήπως απαιτούνται και τα δύο παραπάνω ή και άλλα στοιχεία; Ο συγγραφέας δηλώνει ότι «αξιόπιστα, από αναλυτική άποψη αποτελέσματα, που έχουν ληφθεί από ακατάλληλα δείγματα είναι πηγή απογοήτευσης για τους εργαστηριακούς και πιθανών δυσμενών γεγονότων για τους ασθενείς» και αμφισβητεί με σοβαρά επιχειρήματα την άποψη ότι το εργαστήριο υπάρχει απλά για να αποδίδει αναλυτικά 11

12 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ αξιόπιστες υπηρεσίες. Αντίθετα, προτρέπει τους εργαστηριακούς επιστήμονες να εργαστούν για να εδραιώσουν σοβαρή και ισότιμη επικοινωνία με τους κλινικούς ιατρούς, ώστε τα εργαστηριακά αποτελέσματα να πάρουν τη θέση που τους αρμόζει στο συνολικό πλέγμα των υπηρεσιών που δικαιούται και απαιτεί ο τελικός αποδέκτης των υπηρεσιών, ο ασθενής. Η τελευταία παράγραφος στο άρθρο αποτελεί, πιστεύω, το βασικό σχέδιο για τη δημιουργία ενός χάρτη οδηγού για τη διασφάλιση του μέλλοντος των εργαστηρίων. Αναφέρει ο Plebani: «Οι εργαστηριακοί επαγγελματίες πρέπει να σκεφτούν την ανάγκη της πιο αποτελεσματικής ενημέρωσης των κλινικών ιατρών όσον αφορά εργαστηριακά δεδομένα και πληροφορίες, ειδικά προς τον σκοπό της επιβεβαίωσης καλύτερων κλινικών εκβάσεων για όλους τους ασθενείς. Αν οι εργαστηριακοί επαγγελματίες δεν εκτιμήσουν θέματα σχετικά με τον προσδιορισμό και τη γνωστοποίηση των προδιαγραφών ποιότητας, η γνώση που ήδη έχει συσσωρευτεί και κάποιες ενδιαφέρουσες πρόσφατες συνεισφορές αφιερωμένες στην αξιολόγηση της επίδρασης του διαστήματος αναφοράς στον υπολογισμό της κρίσιμης διαφοράς, σε διαφορετικές μεθόδους για τον υπολογισμό του ολικού σφάλματος και στην αναζήτηση αντικειμενικού προσδιορισμού των σωστών διαστημάτων αναφοράς πρέπει να θεωρηθούν χάσιμο χρόνου». Είναι, λοιπόν, σαφές ότι η εγκατάσταση συνεχούς και επιτυχούς επικοινωνίας με τους κλινικούς ιατρούς αποτελεί μονόδρομο για την παροχή των καλύτερων υπηρεσιών προς τους ασθενείς, αλλά και για να ξαναβρούμε τη θέση μας σαν επιστήμονες στο σύγχρονο νοσοκομείο. Μόνο αν δείξουμε ότι οι υπηρεσίες μας δεν περιορίζονται στο να εκδώσουμε το καλύτερο δυνατό αναλυτικό αποτέλεσμα στο δείγμα που παραλάβαμε, αλλά αν αναλάβουμε τη ευθύνη που μας αντιστοιχεί στο συνολικό πλέγμα της παροχής υπηρεσιών υγείας, δείχνοντας το ενδιαφέρον μας προς τον ασθενή και όχι προς το δείγμα, μόνο τότε υπάρχει πιθανότητα να αντιστρέψουμε την εικόνα που δίδουμε σήμερα και να πάψουμε να είμαστε οι «αναλώσιμοι» επιστήμονες και τεχνολόγοι που εργάζονται πατώντας κουμπιά και των οποίων οι υπηρεσίες έχουν την ίδια σημασία με τον καθαρισμό και τη φύλαξη. Ζούμε στην εποχή που η τεχνολογία παίζει σοβαρότατο ρόλο στη διαγνωστική επιστήμη, όπως και σε κάθε άλλη ιατρική πρακτική. Η τεχνολογία, όμως, είναι απλά το εργαλείο μας, δεν κάνει διάγνωση και δεν θεραπεύει από μόνη της, ούτε αποτελεί από μόνη της εγγύηση ποιότητας. Γεμίζουμε τα εργαστήρια μας με εξοπλισμό πολλαπλάσιας δυναμικότητας από αυτόν που χρειαζόμαστε, χωρίς μελέτη σκοπιμότητας και αδιαφορώντας για το κόστος προς το νοσοκομείο, τα αναλυτικά συστήματα μοιάζουν όλο και περισσότερο με «μαύρα κουτιά», όπου στη μία μεριά τοποθετούμε το σωληνάριο αιμοληψίας αν είναι δυνατόν κλειστό και από την άλλη βγαίνει το αποτέλεσμα, βασιζόμαστε στον Α ή Β τύπο αναλυτή που «βγάζει καλά αποτελέσματα», δεν αξιολογούμε τις επιπτώσεις (θετικές και αρνητικές) από την εγκατάσταση συνεχώς αυξανόμενης πολυπλοκότητας αυτοματισμού, κλεινόμαστε στον μικρόκοσμο του εργαστηρίου και δεν αξιολογούμε την ίδια μας την προσφορά στον ασθενή. Ελάχιστα εργαστήρια στη χώρα μας λαμβάνουν υπόψη τους για τον σχεδιασμό ποιότητας ακόμη και τους στόχους αναλυτικής ποιότητας - που θεωρεί ανεπαρκείς ο Plebani - πόσο μάλλον ασχολούνται με τις προαναλυτικές μεταβλητές και εκπαιδεύουν το εξω-εργαστηριακό προσωπικό στις σωστές πρακτικές, που θα επιβεβαιώσουν την ποιότητα του δείγματος. Ελάχιστα εργαστήρια μπορούν να υποστηρίξουν την εγκυρότητα των αποτελεσμάτων τους, βασίζονται προς τούτο μόνο στα αποτελέσματα της εξωτερικής αξιολόγησης, που την θεωρούν μάλιστα κάτι σαν... πρωτάθλημα, όπου η θέση ή βαθμολογία επαρκεί για το καλό ή κακό όνομα του εργαστηρίου! Ας θυμηθούμε ένα άλλο κείμενο του Plebani 5 : «Τα κλινικά εργαστήρια δεν είναι μόνο μία υπηρεσία μετρήσεων, αλλά επίσης μία υπηρεσία γνώσης, που χρησιμοποιεί όλα τα διαθέσιμα μέσα επικοινωνίας. Δεν δίνουν απλά αποτελέσματα εξετάσεων, αλλά επίσης προσφέρουν γνώση και εκπαίδευση. Οι εργαστηριακές εξετάσεις δεν μπορούν να εκχωρηθούν αν οι εργαστηριακοί επαγγελματίες λειτουργούν σαν αναπόσπαστο τμήμα του συστήματος υγείας, συνεργαζόμενοι στενά με τους κλινικούς και επιδεικνύοντας αποτελεσματικά αξιοπιστία και κύρος μέσα στις τοπικές τους κοινότητες». Κανείς δεν κατηγορεί τον καρδιολόγο ότι πατάει κουμπιά όταν παίρνει καρδιογράφημα, κανείς δεν λέει ότι οι χειρουργοί που χειρίζονται διατάξεις τηλεματικής χειρουργικής απλώς πατούν κουμπιά ή παίζουν με joystick. Οι εργαστηριακοί, όμως, παράγουν απλά νούμερα, η εγκυρότητα των οποίων βρίσκεται συνεχώς υπό αμφισβήτηση. Γιατί άραγε; Ας το σκεφτούμε πριν είναι αργά και πριν τα εργαστήρια μετατραπούν σε απλά εργοστάσια παραγωγής αριθμητικών δεδομένων, που θα απασχολούν το φθηνότερο δυνατό δυναμικό, μακριά από το φυσικό τους χώρο, στα νοσοκομεία. 12

13 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 42 Σημείωση Σε συζήτηση μου με εργαστηριακούς συναδέλφους από άλλες χώρες στη διάρκεια της Euromedlab 2007, άκουσα με ενδιαφέρον να εκφράζουν τον ίδιο ακριβώς προβληματισμό. Μία από τις λύσεις που πρότειναν ήταν να μελετήσουμε αν είναι δυνατό να αλλάξουμε ριζικά τα παραπεμπτικά, διαγράφοντας τα ονόματα των εξετάσεων και αντικαθιστώντας τα με ερωτήσεις σχετικά με το διαγνωστικό πρόβλημα. Έτσι, π.χ. αντί το παραπεμπτικό να αναγράφει CK, CK-MB, TnI να αναγράφει «Έλεγχος για ΟΕΜ» και το εργαστήριο να δίδει απάντηση σχετικά με το διαγνωστικό ερώτημα και όχι απλά αριθμητικά αποτελέσματα, σε εξετάσεις που έχει επιλέξει ο ιατρός. Κανείς δεν είχε σαφή άποψη για τη δυνατότητα πραγματοποίησης της ιδέας, ούτε για την αποτελεσματικότητα της. Η επιστήμη μας είναι, όμως, μία διαρκής ιστορία αναζήτησης της δυνατότητας εφαρμογής καλών ιδεών και προσδιορισμού της αποτελεσματικότητας τους, οπότε μήπως πρέπει να μελετήσουμε και βελτιώσουμε αυτήν την καλή ιδέα; Βιβλιογραφία 1. Mario Plebani, Quality specifications: Self pleasure for clinical laboratories or added value for patient management?, Clin Clem Lab Med 2007;45(4): Diana Mass, M.A., CLS(NCA), Clinical Professor and Director, CLS Program, Arizona State University, Tempe, «Victims of our own success!» The ASCLS Today, 6/00, Vol XIV, No η ημερίδα του Συνδέσμου Ελλήνων Προμηθευτών Επιστημών και Υγείας, με θέμα «Η σημασία της έγκαιρης πρόσβασης των ασθενών στις νέες διαγνωστικές και θεραπευτικές τεχνολογίες», Divani Caravel 11/5/ Harris, E.K. and Yasaka T., On the calculation of a Reference Change for comparing two consecutive measurements. Clin Chem, 29/1, (1983) 5. Mario Plebani, The future of clinical laboratories: more testing or knowledge services?, Clin Chem Lab Med 2005;43(9): Ο ΓΥΜΝΟΣ ΚΟΣΜΟΣ Rene Sully - Prudhomme ( ) Τριγυρισμένος από χημικά ποτήρια, παράξενα σπειράματα. Φούρνους και φιάλες με τριφτούς λαιμούς, Ο χημικός, εμβαθύνοντας στα καπρίτσια των έλξεων, Τους καθορίζει επιδέξια τις ακριβείς τους συναντήσεις. Ελέγχει τις αγάπες τους, ως τώρα κρυμμένες. Ανακαλύπτει και κατευθύνει τις κρυφές τους συγγένειες, Τις ενώνει και προκαλεί απότομα διαζύγια. Και αποφασιστικά οδηγεί τα τυφλά πεπρωμένα τους. Δίδαξέ με, λοιπόν, να διαβάζω ως τον πάτο του αποστακτήρα σου. Σοφέ εσύ, που κατανοείς αυτές τις ισχυρές δυνάμεις, Και το εσωτερικό του κόσμου, πέρα απ όλα τα χρώματα. Οδήγησέ με, σε παρακαλώ, σ αυτό το σκοτεινό βασίλειο. Είναι ενάντια σε εσωτερικές δυνάμεις που παλεύω. Οι εξωτερικές μορφές, υπερβολικά όμορφες, γεννούν μόνο θλίψεις. Προσφορά από τον Καθηγητή κ. Α. Δεσύπρη 13

14 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ ΟΙ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ Μετάφραση-Προσαρμογή: Ευγενία Κώνστα, Χημικός, Msc Κλινικής Χημείας Πρωτότυπος τίτλος: Biosensors in clinical chemistry Clinica Chimica Acta 2003; 334:41-69 Οι κλινικές αναλύσεις δεν διεκπεραιώνονται πλέον αποκλειστικά σε κλινικά εργαστήρια. Οι μετρήσεις των αναλυτών στα βιολογικά υγρά πραγματοποιούνται σε επίπεδο ρουτίνας σε ποικίλους χώρους, όπως σε διάφορα δορυφορικά εργαστήρια μέσα στο νοσοκομείο, σε διαγνωστικά κέντρα αναφοράς εκτός νοσοκομείου και στο σπίτι του ίδιου του αρρώστου. Οι βιοαισθητήρες (βιοαναλυτικοί αισθητήρες) είναι κατάλληλοι για τη μέτρηση των αναλυτών κλινικού ενδιαφέροντος. Ο όρος «βιοαισθητήρας» (biosensor) εμφανίστηκε στη βιβλιογραφία στα τέλη του Ο πρώτος βιοαισθητήρας, γνωστός ως «ενζυμικό ηλεκτρόδιο», παρουσιάστηκε από τους Clark και Lyons το 1962 όταν σύζευξαν το ένζυμο οξειδάση της γλυκόζης σε ένα αμπερομετρικό ηλεκτρόδιο po 2. Στη συνέχεια, εμφανίστηκαν πολλά ενζυμικά ηλεκτρόδια για τον προσδιορισμό σημαντικών κλινικών ουσιών με σύζευξη των κατάλληλων ενζύμων σε ηλεκτροχημικούς αισθητήρες. Το 1977, οι Rechnitz et al. ακινητοποίησαν ζωντανούς οργανισμούς στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου αερίου για μέτρηση αμμωνίας, ώστε να κατασκευάσουν ένα εκλεκτικό ηλεκτρόδιο για το αμινοξύ αργινίνη, το οποίο το περιέγραψαν ως «βιο-εκλεκτικό αισθητήρα». Ο βιο-εκλεκτικός αισθητήρας μετονομάστηκε αργότερα σε «βιοαισθητήρας». Η μετονομασία αυτή παρέμεινε ως ο δημοφιλέστερος όρος για το πάντρεμα ενός βιολογικού υλικού και ενός φυσικού μετασχηματιστή. Ο σχεδιασμός και οι εφαρμογές των βιοαισθητήρων έχουν συνεχίσει να αυξάνονται σε πολλούς τομείς της αναλυτικής χημείας. Σύμφωνα με πρόσφατο έγγραφο της IUPAC, ως βιοαισθητήρας ορίζεται ένας ειδικός τύπος χημικού αισθητήρα, ο οποίος αποτελείται από ένα βιομόριο αναγνώρισης και έναν φυσικό-χημικό μετασχηματιστή. Το βιομόριο είναι ικανό να αναγνωρίζει την παρουσία, την ενεργότητα ή τη συγκέντρωση ενός συγκεκριμένου αναλύτη σε διάλυμα. Η αναγνώριση μπορεί να περιλαμβάνει είτε μία διαδικασία δέσμευσης (βιοαισθητήρας συγγένειας, όπου το βιομόριο αναγνώρισης είναι ένα αντίσωμα, ένα τμήμα DNA ή ένας υποδοχέας κυττάρου, τα οποία αναγνωρίζουν και δεσμεύουν το συμπληρωματικό τους μόριο) είτε μία βιοκαταλυτική αντίδραση (βιοκαταλυτικός βιοαισθητήρας, όπου το βιομόριο αναγνώρισης είναι ένα ακινητοποιημένο ένζυμο και χρησιμοποιείται για την κατάλυση μιας αντίδρασης). Η αλληλεπίδραση του βιομορίου αναγνώρισης με τον αναλύτη-στόχο οδηγεί σε μεταβολή μίας μετρούμενης ιδιότητας του διαλύματος, όπως είναι ο σχηματισμός ενός προϊόντος. Ο μετασχηματιστής μετατρέπει τη μεταβολή της ιδιότητας του διαλύματος σε ποσοτικό ηλεκτρικό σήμα. Η μέθοδος μεταγωγής μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους, όπως ηλεκτροχημικά, οπτικά ή με μέτρηση μάζας ή θερμότητας. Στη συνέχεια, παρουσιάζονται οι εφαρμογές των βιοαισθητήρων στις κλινικές αναλύσεις, που παρατίθενται με βάση τον τύπο του βιομορίου αναγνώρισης (βιοκαταλυτικοί βιοαισθητήρες και βιοαισθητήρες συγγένειας). Ι. Βιοκαταλυτικοί βιοαισθητήρες 1. Αμπερομετρικοί και κουλομετρικοί βιοαισθητήρες Οι βιοαισθητήρες που συναντώνται πιο συχνά στη βιβλιογραφία είναι αυτοί που βασίζονται σε ηλεκτροχημικούς μεταλλάκτες και είναι οι πιο διαδεδομένοι για κλινικές αναλύσεις. Η αμπερομετρία είναι μία συγκεκριμένη ηλεκτροχημική τεχνική, η οποία βασίζεται στο γεγονός ότι συγκεκριμένα χημικά σωματίδια οξειδώνονται ή ανάγονται (οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις) πάνω σε αδρανή μεταλλικά ηλεκτρόδια, οδηγούμενα από ένα σταθερά εφαρμοζόμενο δυναμικό. Αυτά τα χημικά σωματίδια είναι γνωστά ως ηλεκτρενεργές ουσίες. Δύο ή τρία ηλεκτρόδια μπορούν να αποτελούν την αμπερομετρική κυψελίδα. Στην περίπτωση των βιοαισθητήρων, το ανοδικό ηλεκτρόδιο εργασίας παρακολουθεί τον σχηματισμό ενός προϊόντος ή τη μείωση ενός αντιδρώντος κοντά στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, που προκύπτει από μία βιοαντίδραση (π.χ. μία ενζυμοκαταλυόμενη αντίδραση), η οποία περιλαμβάνει τον αναλύτη που μας ενδιαφέρει. Οι ηλεκτρενεργές ουσίες που παρακολουθούνται διαχέονται στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, όπου πραγματοποιείται μία οξειδοαναγωγική αντίδραση. Το μετρούμενο ρεύμα της κυψελίδας (ρεύμα διαχύσεως) είναι μία ποσοτική ένδειξη του αναλύτη που μας ενδιαφέρει. 14

15 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 42 Οι περισσότεροι αμπερομετρικοί βιοαισθητήρες χρησιμοποιούν ένζυμα ως βιομόρια ανανώρισης. Η κουλομετρία είναι μία επίσης ηλεκτροχημική τεχνική, η οποία σχετίζεται με την αμπερομετρία, όπου μετράται η ποσότητα ηλεκτρικού φορτίου που διέρχεται μεταξύ δύο ηλεκτροδίων, η οποία είναι ευθέως ανάλογη με την οξείδωση ή την αναγωγή μιας ηλεκτρενεργούς ουσίας σε ένα από τα ηλεκτρόδια. Η ακινητοποίηση του ενζύμου στους πρώτους βιοαισθητήρες περιελάμβανε την παγίδευση αυτού σε μία μεμβράνη χαμηλού μοριακού βάρους και χρησιμοποιείται ακόμα σε κάποιες εμπορικές εφαρμογές. Σήμερα, υπάρχει μία εκτεταμένη βιβλιογραφία που αφορά τεχνικές ακινητοποίησης ενζύμου που εφαρμόζονται στους βιοαισθητήρες. Οι πιο συνηθισμένες είναι η διασταυρούμενη σύνδεση του ενζύμου με μία αδρανή πρωτεΐνη, όπως είναι η BSA χρησιμοποιώντας γλουταλδεΰδη, η προσρόφηση του ενζύμου στις επιφάνειες των ηλεκτροδίων ή η ομοιοπολική δέσμευση του ενζύμου σε αδιάλυτους φορείς, όπως νάιλον ή γυαλί. Τα ακινητοποιημένα ένζυμα με τους παραπάνω τρόπους δείχνουν συνήθως βελτιωμένη σταθερότητα σε σχέση με τα ένζυμα που βρίσκονται σε διάλυμα. Μία άλλη τεχνική ακινητοποίησης ενζύμου περιλαμβάνει την τροποποίηση του υλικού του ηλεκτροδίου, όπου το ένζυμο αναμιγνύεται με ένα υλικό, όπως πάστα άνθρακα, η οποία χρησιμεύει τόσο ως μήτρα ακινητοποίησης του ενζύμου όσο και ως ηλεκτρενεργή επιφάνεια. Η YSI (Yellow Springs Instruments) εμπορευματοποίησε έναν από τους πρώτους βιοαισθητήρες για τη μέτρηση της γλυκόζης στο αίμα το 1975 (Σχήμα 1), η οποία βασίζεται στην αμπερομετρική ανίχνευση του H 2 O 2 : Γλυκόζη + Ο 2 οξειδάση της γλυκόζης γλυκονικό οξύ + Η 2 Ο 2 (1) Η 2 Ο 2 2Η + + Ο 2 + 2e - (2) Σχήμα 1: Βιοαισθητήρας για τη μέτρηση γλυκόζης (YSI). Πολλές μεθοδολογίες εφαρμόστηκαν για την εξάλειψη ή μείωση κάποιων προβλημάτων, που ανακύπτουν στον παραπάνω τύπο βιοαισθητήρα, λόγω της εξάρτησης της μέτρησης από τη συγκέντρωση του οξυγόνου που υπάρχει στο δείγμα (αντίδραση 1) και της οξείδωσης του Η 2 Ο 2, η οποία συνήθως απαιτεί ένα επαρκώς υψηλό υπερδυναμικό οξείδωσης (αντίδραση 2). Αντικατάσταση της οξειδάσης της γλυκόζης στην αντίδραση (1) από άλλες οξειδοαναγωγάσες επέτρεψε την κατασκευή αμπερομετρικών βιοαισθητήρων για τη μέτρηση άλλων υποστρωμάτων κλινικού ενδιαφέροντος, όπως: γαλακτικό οξύ, χοληστερόλη, πυροσταφυλικό οξύ, ανιλίνη, γλουταμινικό οξύ και γλουταμίνη. Ένζυμα πέραν των οξειδοαναγωγασών, όπως είναι οι αφυδρογονάσες (που χρησιμοποιούν NAD ως συμπαράγοντα) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή βιοκαταλυτικών βιοαισθητήρων για τον προσδιορισμό π.χ. του γαλακτικού οξέος. Ένα μειονέκτημα αυτών είναι το υψηλό υπερδυναμικό που χρειάζεται για την οξείδωση του NADH που παράγεται στη βιοαντίδραση. 2. Ποτενσιομετρικοί και αγωγιμομετρικοί βιοαισθητήρες Στην ποτενσιομετρία μετράται η διαφορά δυναμικού μεταξύ δύο ηλεκτροδίων υπό συνθήκες μηδενικού ρεύματος. Τα δύο ηλεκτρόδια είναι γνωστά ως ενδεικτικό ηλεκτρόδιο και ηλεκτρόδιο αναφοράς. Το ηλεκτρόδιο αναφοράς συμπληρώνει το ηλεκτροχημικό στοιχείο με δυναμικό ανεξάρτητο της συστάσεως του διαλύματος. Το δυναμικό του ενδεικτικού ηλεκτροδίου εξαρτάται από την ενεργότητα ή τη συγκέντρωση του προσδιοριστέου αναλύτη στο διάλυμα. Η μεταβολή στο δυναμικό συνδέεται λογαριθμικά με τη συγκέντρωση του αναλύτη. Τα εκλεκτικά ηλεκτρόδια ιόντων (ion-selective electrode, ISE) χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση ηλεκτρολυτών σε επίπεδο ρουτίνας στην κλινική χημεία. Τα ISEs έχουν χρησιμοποιηθεί επίσης ως μεταλλάκτες σε ποτενσιομετρικούς βιοαισθητήρες. Ένα παράδειγμα είναι ο βιοαισθητήρας της ουρίας (blood urea nitrogen, BUN) που χρησιμοποιεί ένα ηλεκτρόδιο υάλου για τη μέτρηση του αμμωνίου. Όμως, υπάρχουν μειονεκτήματα όπως η μη γραμμική ανταπόκριση του αισθητήρα (ιδιαίτερα σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις υποστρώματος) και η παρεμβολή αμμωνίου από το υπόβαθρο του δείγματος. Στη βιβλιογραφία απαντώνται παραδείγματα απαμινασών και αποκαρβοξυλασών, τα οποία τοποθετούνται σε ηλεκτρόδια αερίων NH 3 και CO 2, αντίστοιχα, αλλά η πρακτική εφαρμογή τους είναι περιορισμένη. Οι εφαρμογές των αγωγιμομετρικών βιοαισθητήρων είναι περιορισμένες εξαιτίας του μεταβαλλόμενου ιοντικού υποβάθρου των κλινικών δειγμάτων και της απαίτησης της μέτρησης μικρών μεταβολών αγωγιμότητας σε μέσα που χαρακτηρίζονται από υψηλή ιοντική ισχύ. Ένα 15

16 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ σύστημα μέτρησης της ουρίας σε ορό, πλάσμα και ούρα είναι ο BUN αναλυτής (Beckman-Coulter), ο οποίος βασίζεται στο ένζυμο της ουρεάσης. 3. Οπτικοί βιοκαταλυτικοί βιοαισθητήρες/ Βιοκαταλυτικοί βιοαισθητήρες που χρησιμοποιούν οπτική ανίχνευση (Enzymebased biosensors using optical detection) Οι οπτικοί αισθητήρες βασίζονται στη μέτρηση φθορισμού, φωταύγειας και ανάκλασης και έχουν συζευχθεί με ενζυμοκαταλυόμενες αντιδράσεις για τη μέτρηση υποστρωμάτων κλινικού ενδιαφέροντος. Ίσως το πρώτο παράδειγμα οπτικού βιοαισθητήρα για κλινική εφαρμογή ήταν η ταινία δοκιμαστικού χάρτου για τη μέτρηση της γλυκόζης στα ούρα το 1957 (Clinistix, Miles Laboratories), όπου το ανθρώπινο μάτι ήταν ο ανιχνευτής του ανακλώμενου φωτός. Ο βιοαισθητήρας αυτός είναι ημιποσοτικός, ωστόσο αργότερα κατασκευάστηκαν και ποσοτικοί βιοαισθητήρες για τη γλυκόζη. Ανιχνευτές οπτικής ίνας που φέρουν ακινητοποιημένα ένζυμα και ενδεικτικές χρωστικές έχουν προταθεί για τη μέτρηση της γλυκόζης και άλλων υποστρωμάτων κλινικού ενδιαφέροντος. Η οπτική ανίχνευση βασίζεται σε χημεία που περιλαμβάνει το ph, αμμωνία, διοξείδιο του άνθρακα, οξυγόνο, υπεροξείδιο του υδρογόνου και NADH συζευγμένα με αντιδράσεις καταλυόμενες από οξειδάσες, απαμινάσες, αποκαρβοξυλάσες, υδρολάσες εστερικού δεσμού και αφυδρογενάσες. Ο οπτικός αισθητήρας λειτουργεί ως μετατροπέας για την ενζυμο-καταλυόμενη αντίδραση και συχνά αναφέρεται ως οπτρόδιο (optrode). Οπτρόδια για ph και PΟ 2 έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία και εκτός του ότι χρησιμοποιούνται ως αισθητήρες για ph και PΟ 2 σε αναλυτές αερίων αίματος, αποτελούν τη βάση πολλών οπτικών βιοκαταλυτικών βιοαισθητήρων. Σύμπλοκα ρουθηνίου χρησιμοποιούνται συχνά ως ευαίσθητοι δείκτες οξυγόνου. Σε ένα παράδειγμα βιοαισθητήρα οπτικής ίνας για τη μέτρηση της γλυκόζης, μία κατιοντική ευαίσθητη στο οξυγόνο χρωστική, το Ru(phen) 3 2+ ακινητοποιείται μαζί με την οξειδάση της γλυκόζης στην επιφάνεια μιας οπτικής ίνας (Σχήμα 2). Η αρχή της μέτρησης βασίζεται στην απόσβεση της φωταύγειας της χρωστικής από το οξυγόνο. Παρόμοιο σκεπτικό ακολουθείται και σε έναν βιοαισθητήρα για τη μέτρηση της χοληστερόλης, όπου η απόσβεση του φωσφορισμού μιας ευαίσθητης στο οξυγόνο χρωστικής συνδέεται με την κατανάλωση του οξυγόνου που προκύπτει από την ενζυμο-καταλυόμενη οξείδωση της χοληστερόλης από την οξειδάση της χοληστερόλης. Η μεταβολή του ph που προκύπτει από την ενζυμο-καταλυόμενη οξείδωση της γλυκόζης έχει επίσης μετρηθεί οπτικά. Σχήμα 2: Βιοαισθητήρας οπτικής ίνας για τη μέτρηση γλυκόζης με χρήση ευαίσθητου στο οξυγόνο ιχνηθέτη. Η χρωστική φλουοροσκεΐνη χρησιμοποιείται συνήθως ως ευαίσθητη στο ph χρωστική. Ένα μειονέκτημα των οπτικών αισθητήρων που βασίζονται στις μεταβολές του ph είναι ότι εξαρτώνται ισχυρά από το ph και από τη ρυθμιστική χωρητικότητα του διαλύματος του αναλύτη. Επίσης, το εύρος εργασίας του αισθητήρα καθορίζεται από το pk a του δείκτη, που εξαρτάται από την ιοντική ισχύ της μήτρας του δείγματος. Ένας ευαίσθητος στο ph δείκτης μπορεί ακόμη να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση ενζυμικών αντιδράσεων που παράγουν αμμωνία. Αισθητήρες για την ουρία και την κρεατινίνη, που βασίζονται σε απαμινάσες, έχουν αναφερθεί με σύζευξη του κατάλληλου ενζύμου σε έναν μετασχηματιστή αμμωνίας. Οπτικοί αισθητήρες, που βασίζονται σε αφυδρογονάσες, προσφέρουν το πλεονέκτημα ότι οι ιδιότητες φθορισμού του NADH μπορούν να παρακολουθηθούν άμεσα, εξαλείφοντας την ανάγκη για έναν πρόσθετο δείκτη. Ένα παράδειγμα είναι ένας βιοαισθητήρας για τη μέτρηση του γαλακτικού οξέος (lactate) βασισμένος στη γαλακτική αφυδρογονάση (LDH). Οπτικοί βιοαισθητήρες που βασίζονται στις ιδιότητες του φθορισμού του NADH έχουν το μειονέκτημα να απαιτούν προσθήκη NAD + ή NADH στο δείγμα, μειώνοντας με αυτόν τον τρόπο τις εφαρμογές τους. Πρακτικές εφαρμογές των βιοκαταλυτικών βιοαισθητήρων Οι βιοαισθητήρες για τη μέτρηση της γλυκόζης σε πλήρες αίμα, ορό, πλάσμα και ούρα είναι αυτοί που έχουν μελετηθεί και εμπορευματοποιηθεί πιο πολύ από όλους, λόγω του παγκόσμιου προβλήματος των διαβητικών. Χρησιμοποιούνται σε ποικίλους χώρους, από τα κλασικά κλινικά εργαστήρια μέχρι και από τους ίδιους τους ασθενείς. Οι βιοαισθητήρες μίας χρήσης για τη μέτρηση της γλυκόζης χρησιμοποιούν οπτικούς (ανάκλασης) και ηλεκτροχημι- 16

17 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 42 κούς (αμπερομετρικούς, κουλομετρικούς) μετασχηματιστές. Οι αναλυτικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στις εμπορικά διαθέσιμες χρωματομετρικές ταινίες δοκιμαστικού χάρτη περιλαμβάνουν ενζυμικές αντιδράσεις με χημικά υποστρώματα βασισμένα σε χρωστικές, που είναι ακινητοποιημένα στην ταινία δοκιμαστικού χάρτη. Οι ταινίες δοκιμαστικού χάρτη αποτελούνται από αρκετές ζώνες για το διαχωρισμό του πλάσματος από τα ερυθρά κύτταρα, απλώνοντας το δείγμα ομοιόμορφα κατά μήκος του αναλυτικού στοιχείου του δοκιμαστικού χάρτη. Το κυριότερο πλεονέκτημα μιας ταινίας ηλεκτοχημικού δοκιμαστικού χάρτη για την παρακολούθηση της γλυκόζης στο αίμα είναι το γεγονός ότι το ενεργό μέρος της ταινίας, όπου τοποθετείται το δείγμα δεν χρειάζεται να είναι σε επαφή με τον μετρητή, μειώνοντας έτσι την ανάγκη καθαρισμού της συσκευής και την πιθανότητα μόλυνσης του μετρητή από μολυσμένα είδη αίματος. Οι περισσότεροι ηλεκτροχημικοί δοκιμαστικοί χάρτες βασίζονται στην αρχή της αμπερομετρίας. Τα ένζυμα και οι διαμεσολαβητές είναι μαζί ακινητοποιημένα στην ενεργή ζώνη δοκιμασίας της ταινίας δοκιμαστικού χάρτη. Μία εφαρμογή της ηλεκτροχημικής τεχνικής της κουλομετρίας είναι η εμπορική συσκευή μιας χρήσης μέτρησης της γλυκόζης (FreeStyle, TheraSense) σε δείγμα αίματος όγκου 0,3 μl. Στην κουλομετρία όλη η ποσότητα της γλυκόζης στο δείγμα αντιδρά και ολόκληρο το φορτίο που παράγεται από την αντίδραση μετράται. Το σήμα είναι μεγαλύτερο από το σήμα που λαμβάνεται χρησιμοποιώντας αμπερομετρία. Η ανάπτυξη ηλεκτροχημικών δοκιμαστικών ταινιών μιας χρήσης για τη μέτρηση της γλυκόζης στο αίμα οδήγησε στην ανάγκη δημιουργίας φθηνών τεχνικών μαζικής παραγωγής αισθητήρων, όπως είναι η screen printing, με την οποία είναι δυνατή η εναπόθεση των αγωγών, των μονωτών και των ευαίσθητων υλικών των ηλεκτροδίων σε επίπεδα υποστρώματα από κεραμικό ή γυαλί, ενώ τα ένζυμα, οι διαμεσολαβητές και οι σταθεροποιητές ενζύμων προστίθενται σε συνθήκες χαμηλής αλατότητας. Με αυτή την τεχνική είναι επίσης δυνατή η εφαρμογή εξωτερικών μεμβρανών για μείωση της διάχυσης του υποστρώματος. Τα ενεργά στοιχεία της συσκευής μπορούν να συρρικνωθούν/μικρύνουν και να φτιαχτούν με τέτοιον τρόπο ώστε να μειωθεί η ποσότητα αίματος που χρειάζεται για την ανάλυση. Το κόστος του εργοστασίου είναι χαμηλό (μικρότερο από $0,10 ο αισθητήρας), ενώ η ομοιομορφία μεταξύ αισθητήρων έχει βελτιωθεί. Έχουν δημιουργηθεί βιοαισθητήρες πολλαπλής χρήσης για τη μέτρηση της γλυκόζης για την ταυτόχρονη μέτρηση των αερίων αίματος, του ph, του αιματοκρίτη και των ηλεκτρολυτών από ένα δείγμα πλήρους αίματος, καθώς επίσης και βιοαισθητήρες για την ταυτόχρονη μέτρηση του γαλακτικού οξέος, της ουρίας και της κρεατινίνης σε δείγμα πλήρους αίματος. Τις τελευταίες τρεις δεκαετίες, έναν ενεργό τομέα έρευνας αποτελούν οι βιοαισθητήρες εμφύτευσης για τη μέτρηση της γλυκόζης στο αίμα ή στον ιστό, οι οποίοι έχουν προταθεί για την ανάπτυξη ενός αυτοματοποιημένου συστήματος ενέσιμης ινσουλίνης για τη διατήρηση της επιθυμητής ομοιόστασης της γλυκόζης στους διαβητικούς ασθενείς. Οι απαιτήσεις ενός αισθητήρα για τη μέτρηση της γλυκόζης in vivo περιλαμβάνουν τη σμίκρυνση της συσκευής, τη σταθερότητα μακράς διάρκειας, την εξάλειψη της εξάρτησης από το οξυγόνο, την ευκολία στη χρήση και τη βιοσυμβατότητα. (Συνεχίζεται) Σημείωση: Το παραπάνω άρθρο παρουσιάζεται στο πλαίσιο αφιερώματος στο μέλλον της Κλινικής Χημείας, όπως αναλυτικά παρουσιάσθηκε στο προηγούμενο τεύχος. Στο επόμενο τεύχος θα προσπαθήσουμε να παρουσιάσουμε τη σημαντική στον τομέα αυτό συνεισφορά Ελλήνων ερευνητών, οι εργασίες των οποίων έχουν παρουσιασθεί και βραβευθεί στα Πανελλήνια Συνέδρια Κλινικής Χημείας. ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΣΥΝΕΧΙΖΟΜΕΝΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ: ΑΝΔΡΙΚΟ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Σάββατο 6/10/2007, Χαροκόπειο Πανεπιστήμιο Συντονιστής: Πέτρος Καρκαλούσος 17

18 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ D ΣΤΟ ΠΛΑΣΜΑ Λόη Βασιλική Χημικός, EurClinChem Ενδοκρινολογικό Τμήμα ΝΕΕΣ Ο ρόλος της βιταμίνης D στη ρύθμιση του οστικού μεταβολισμού είναι σημαντικός. Το μόριο της 7-δεϋδροχοληστερόλης μετατρέπεται από την υπεριώδη ακτινοβολία του ήλιου στο δέρμα σε προβιταμίνη D 3, η οποία ισομερίζεται αργά σε βιταμίνη D 3 (χοληκαλσιφερόλη). Η βιταμίνη D 3 και η βιταμίνη D 2 (εργοκαλσιφερόλη, που χορηγείται με συμπληρώματα διατροφής) αποτελούν τη βιταμίνη D. Η βιταμίνη D εισέρχεται στην κυκλοφορία συνδεδεμένη με τη δεσμευτική της πρωτεΐνη (Vitamin D Binding Protein/VDBP). Υδροξυλιώνεται στο ήπαρ (Σχήμα 1) και ένα μικρότερο ποσοστό υδροξυλιώνεται περαιτέρω στους νεφρούς - σε βαθμό που εξαρτάται από τα επίπεδα της παραθορμόνης και του ιονισμένου ασβεστίου - σε 1,25 διϋδρόξυ-βιταμίνη D. Σχήμα 1: Οι δομές των υδροξυλιωμένων μορίων της βιταμίνης D 2 και της βιταμίνης D 3. Η μέτρηση των υδροξυλιωμένων μορφών της βιταμίνης D στο πλάσμα (25-OH-Vitamin D), γίνεται τόσο για την εκτίμηση των βασικών επιπέδων της βιταμίνης D όσο και για την εκτίμηση των επιπέδων όταν γίνεται θεραπεία υποκατάστασης με εξωγενώς χορηγούμενη βιταμίνη D. Μια μικρή ιστορική αναδρομή, που εκθέτει τα προβλήματα και τις δυσκολίες μέτρησης παρουσιάζεται σε άρθρο που δημοσιεύτηκε στο Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2004,89(7): Η πρώτη μέθοδος προσδιορισμού των υδροξυλιωμένων μορφών της βιταμίνης D (25-OH-Vitamin D) αναπτύχθηκε το 1971 από τους Haddad et al. και ήταν μια ανταγωνιστικού τύπου, ισοτοπική μέθοδος με δέσμευση σε πρωτεΐνη (Competitive protein binding assay; CPBA). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιούσε δεσμευτική πρωτεΐνη της βιταμίνης D και σαν ιχνηθέτη τριτιωμένη υδροξυλιωμένη βιταμίνη D 3 ( 3 Η-25-Hydroxy Vitamin D 3 ). Η μέθοδος ήταν εξαιρετικά δύσκολη και χρονοβόρα για να εφαρμοστεί στην καθημερινή κλινική πρακτική αφού απαιτούσε εκχύλιση του δείγματος με οργανικό διαλύτη, εξάτμιση υπό ρεύμα αζώτου, καθαρισμό με χρωματογραφία στήλης και υπολογισμό ανάκτησης σε κάθε δείγμα ώστε να εκτιμηθούν τυχόν απώλειες από την εκχύλιση. Οι προσπάθειες απλούστευσης της μεθόδου αρχικά από τους Belsey et al. το 1974 και αργότερα έως το 1978 από άλλους ερευνητές, στόχευαν στην αποφυγή του σταδίου της εκχύλισης ή στην αποφυγή της χρήσης χρωματογραφίας στήλης. Ωστόσο, και οι προσπάθειες αυτές βασίσθηκαν στη χρήση της δεσμευτικής πρωτεΐνης της βιταμίνης D. 18

19 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 42 Η 25-OH-Vitamin D είναι ίσως το πιο υδρόφοβο μόριο που ο προσδιορισμός του στο πλάσμα βασίσθηκε σε δέσμευση πρωτεΐνης. Το γεγονός ότι στο πλάσμα υπάρχει σε δύο μορφές (Σχήμα1) καθώς και το ότι είναι λιπόφιλο μόριο, άρα ευάλωτο σε παρεμβολές από οποιαδήποτε ουσία που πιθανόν να υπάρχει στο δείγμα (matrix effects) δυσκολεύει ακόμη περισσότερο την απλούστευση της ανάλυσης. Τα προβλήματα που δημιουργούνται στη μέθοδο από τα matrix effects δεν αφορούν μόνο στον προσδιορισμό της 25-OH-Vitamin D. Είναι συνήθη προβλήματα των μεθόδων προσδιορισμού στεροειδών (Οιστραδιόλης/Ε2, Τεστοστερόνης/Testosterone) και δυστυχώς συνεχίζουν να υπάρχουν σε όλες τις απλουστευμένες (άμεσες-direct) μεθόδους προσδιορισμού στεροειδών, όπου το στάδιο της εκχύλισης ή της χρωματογραφίας στήλης έχει παραληφθεί. Το 1978 οι Dorantes et al. απέδειξαν οριστικά ότι άγνωστης δομής ουσίες αντιδρούν με τη δεσμευτική πρωτεΐνη της βιταμίνης D, προκαλώντας προβλήματα σε όλες τις CPBA που δεν είχαν στάδιο εκχύλισης ή χρωματογραφίας στήλης. Έτσι, οι επιλογές ανάλυσης περιορίζονταν είτε στην αρχική μέθοδο την προτεινόμενη από τους Haddad et al., είτε στην τότε καινούργια HPLC UV μέθοδο που προτάθηκε από τους Eisman JA et al. (1977). Παρόλα αυτά και οι δύο μέθοδοι συνέχιζαν να είναι χρονοβόρες, δύσκολης τεχνικής και ακριβού κόστους. Η λύση αρχίζει να δίνεται στη δεκαετία του 1980 με ανάπτυξη αντισώματος έναντι των 25 Hydroxy Vitamin D 2 και 25 Hydroxy Vitamin D 3 και ανάπτυξη ανοσοχημικής μεθόδου με προηγούμενη εκχύλιση του δείγματος. Η μέθοδος αυτή βελτιστοποιήθηκε το 1992 από τους Hollis et al. Μετά το 2001 επήλθαν κι άλλες αλλαγές όσον αφορά στο μέσο διάλυσης των προτύπων και έτσι τρεις-τέσσερις εταιρείες διέθεσαν εμπορικά Kits προσδιορισμού 25-ΟΗ Βιταμίνης D μετά το Παρά την πληθώρα των Kits που διατέθηκαν στην αγορά για τον προσδιορισμό της Βιταμίνης D, τα προβλήματα δεν λύθηκαν. Σημαντική διακύμανση των αποτελεσμάτων τόσο μεταξύ σειρών, όσο και στην ίδια σειρά μετρήσεων (inter & intra assay variation) έχουν εντοπισθεί στις μετρήσεις της 25-ΟΗ βιταμίνης D από τo Σχήμα Εξωτερικού Ελέγχου ποιότητας (D E Q A S Vitamin D External Quality Assessment Scheme; Επίσης, ο προσδιορισμός με τα υπάρχοντα Kits οδηγεί σε υποεκτίμηση ή υπερεκτίμηση των επιπέδων που μετρούνται στο πλάσμα έναντι των τιμών που παίρνουμε με τη σημερινή μέθοδο αναφοράς (GC-MS). Σε μελέτη που δημοσιεύθηκε N. Binkley et al. στο Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2004;89(7): γίνεται σαφές ότι ελλείψει προτυποποίησης της μεθόδου τα αποτελέσματα (με τη χρήση Kits) μεταξύ εργαστηρίων μπορεί να διαφέρουν έως και δύο φορές. Όταν οι διαφορές από μέθοδο σε μέθοδο και μεταξύ εργαστηρίων είναι τόσο μεγάλες καθίσταται εξαιρετικά δύσκολο να καθοριστεί η βέλτιστη τιμή της 25-OH-Vitamin D στο αίμα καθώς και η κρίσιμη τιμή κάτω από την οποία κάποιος χαρακτηρίζεται ότι έχει ανεπάρκεια βιταμίνης D. Παρόλα αυτά, σε κάποιες μελέτες (Heany RP et al., 2000 και Chapuy MC et al., 1997) ως βέλτιστη τιμή έχει προταθεί η τιμή των 80 nmol/l; 32 ng/ ml. Στη μελέτη των Binkley et al., όταν εξετάστηκαν 62 μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, ηλικίας 65±1,1 (Mean ±SEM) με διαπιστωμένη οστεοπόρωση (T-score -2,7 SD, όταν από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας το κριτήριο διάγνωσης οστεοπόρωσης είναι T-score<-2,5 SD [όπου SD η τυπική απόκλιση της μέσης τιμής οστικής πυκνότητας των φυσιολογικών ατόμων]) 42 από αυτές μετρήθηκαν σε εργαστήριο Α και είχαν μέση τιμή υδροξυλιωμένων μορφών βιταμίνης D 46±2,1 ng/ml, ενώ 20 μετρήθηκαν σε εργαστήριο Β και είχαν μέση τιμή υδροξυλιωμένων μορφών βιταμίνης D 21±2,3 ng/ml. Το σημαντικότερο, όμως, εύρημα ήταν ότι μόλις το 17% που μετρήθηκαν στο εργαστήριο Α είχε τιμή < των 32 ng/ml, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό στο εργαστήριο Β ήταν 90%. Στην ίδια εργασία συγκρίνονται όλες οι χρησιμοποιούμενες μέθοδοι και διαπιστώνεται ότι άλλες αναγνωρίζουν στον ίδιο βαθμό τις δύο μορφές της 25ΟΗ Vitamin D, ενώ σε άλλες υπάρχει υποεκτίμηση της υδροξυλιωμένης μορφής της βιταμίνης D 2. Έτσι, είναι πολύ δύσκολο να εκτιμηθεί η επιτυχία θεραπείας υποκατάστασης με εξωγενώς χορηγούμενη βιταμίνη D. Η ανάγκη προτυποποίησης της μεθόδου και καθορισμού αναμενόμενων τιμών ανά πληθυσμό, φύλο και ηλικία είναι προφανής. 2ος ΚΥΚΛΟΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΩΝ ΣΕΜΙΝΑΡΙΩΝ: ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ Οκτώβριος 2007, Ινστιτούτο Παστέρ Συντονίστρια: Φωτεινή Καράμπαμπα 19

20 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ RASSF1A ΚΑΙ BRCA1 ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΠΡΩΙΜΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ Γιαννικόπουλος Βασίλης 1, Ντούλια Μαρία 1, Μαλάμος Νίκος 2, Γεωργούλιας Βασίλης 3, Λιανίδου Εύη 1 1. Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, Αθήνα 2. Τμήμα Παθολογίας-Ογκολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Ηρακλείου, Ηράκλειο Κρήτης 3. Μονάδα Γυναικολογικού καρκίνου, Νοσοκομείο Έλενα Βενιζέλου, Αθήνα ( lianidou@chem.uoa.gr) 1. Εισαγωγή Η σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και του καρκίνου φάνηκε για πρώτη φορά το 1983, όταν βρέθηκε ότι το γενετικό υλικό των καρκινικών κυττάρων ήταν υπομεθυλιωμένο σε σχέση με το φυσιολογικό επίπεδο μεθυλίωσης των φυσιολογικών κυττάρων (1). Η υπομεθυλίωση σε καρκινικά κύτταρα οφείλεται κατά πρώτο λόγο στην απώλεια μεθυλίωσης επαναλαμβανόμενων περιοχών του γονιδιώματος (2) και η επακόλουθη αστάθεια του γονιδιώματος είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Η επαναδιάταξη που αφορά το μεγάλο τμήμα της περικεντρικής ετεροχρωματίνης στο χρωμόσωμα 1, για παράδειγμα, είναι μία από τις πιο συχνές αστάθειες του γονιδιώματος σε πολλούς τύπους νεοπλασμάτων (3). Η επανενεργοποίηση των υποκκινητών διαφόρων γονιδίων που προκύπτει λόγω απομεθυλίωσης πιθανότατα συνεισφέρει στη μη φυσιολογική ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου στον καρκίνο (4). Η απώλεια της μεθυλίωσης του γονιδιώματος είναι ένα συχνό και πρόωρο φαινόμενο στον καρκίνο και συσχετίζεται με τη σοβαρότητα της νόσου και την πιθανότητα μετάστασης σε πολλά είδη καρκίνου (5). Η μεθυλίωση του DNA είναι μια χημική μετατροπή που οδηγεί στην προσθήκη μιας μεθυλομάδας στην 5 καρβόξυ θέση της κυτοσίνης. Παρότι οι περισσότερες μεθυλιώσεις της κυτοσίνης συμβαίνουν στην περιοχή της αλληλουχίας 5 CG 3 (που καλούνται CpG δινουκλεοτίδια) κάποιες αφορούν CpA και CpT δινουκλεοτίδια (6). Το DNA αποτελείται από τέσσερις βάσεις, επομένως υπάρχουν 16 δυνατοί συνδυασμοί. Επομένως, τα CpG δινουκλεοτίδια εμφανίζονται με συχνότητα περίπου 6%. Όμως, εμφανίζονται με μια συχνότητα 5%-10% της θεωρητικής συχνότητας (7). Αυτή η μείωση της συχνότητας των CpG δινουκλεοτιδίων ίσως σχετίζεται με την υπερμεταλλαξιμότητα της μεθυλιωμένης κυτοσίνης. Το ανθρώπινο γονιδίωμα δεν είναι μεθυλιωμένο με κάποιο μοτίβο και περιέχει κάποιες περιοχές μη μεθυλιωμένες που ελέγχονται από μεθυλιωμένες περιοχές. Σε αντίθεση με το υπόλοιπο γονιδίωμα, μικρότερες περιοχές του DNA, που καλούνται CpG νησίδες που κυμαίνονται από 0,5 με 5 kb και εμφανίζονται κάθε 100kb έχουν χαρακτηριστικές ιδιότητες (8). Αυτές οι περιοχές είναι μη μεθυλιωμένες, πλούσιες σε GC (60 με 70%), έχουν αναλογία CpG με GpC τουλάχιστον 0,6 και επομένως, δεν φαίνεται κάποια μείωση της συχνότητας των δινουκλεοτιδίων (9,10). Γενικά, τα μισά από τα γονίδια του ανθρώπου έχουν CpG νησίδες και αυτά βρίσκονται αμφότερα σε housekeeping γονίδια και γονίδια με ιστοειδικά μοτίβα έκφρασης (11). Η μεθυλίωση του DNA γίνεται από ειδικά ένζυμα τις DNA μεθυλοτρανσφεράσες (DNMT). Οι γνωστότερες μέχρι σήμερα είναι οι DNMT1, 1b, 1o, 1p, 2, 3A, 3b και 3L (12). Η σημασία αυτών των ενζύμων έχει δειχθεί από πειράματα που έγιναν σε ποντίκια, όπου τα ποντίκια με έλλειψη των γονιδίων των μεθυλοτρανσφερασών πέθαναν κατά την ανάπτυξη ή κατά τη γέννηση (12). Εκτός από τις μεθυλοτρανσφεράσες υπάρχουν και άλλοι μηχανισμοί που ελέγχουν τα επίπεδα μεθυλίωσης. Είναι οι απομεθυλάσες, κέντρα μεθυλίωσης που προκαλούν μεθυλίωση και κέντρα προστασίας από τη μεθυλίωση (13,14). Τα μοτίβα μεθυλίωσης εμφανίζονται στο στάδιο της εμβρυογένεσης και ρυθμίζονται κατά την ανάπτυξη. Παλαιότερα πιστευόταν ότι τα φυσιολογικά κύτταρα μετατρέπονταν σταδιακά σε καρκινικά κύτταρα ως αποτέλεσμα της καταστροφής των γονιδίων, που μπορούσε να είναι μια αλλαγή, μια απώλεια ή μια αλλαγή της γενετικής πληροφορίας. Αυτά προκαλούσαν σημαντικές αλλαγές στη δραστικότητα του γονιδίου και τελικά στην προδιάθεσή του στον καρκίνο. Η μεθυλίωση του DNA μπορεί να αλλάξει τη δραστικότητα των γονιδίων χωρίς να μεταβάλλει την αλληλουχία των γονιδίων και προτάθηκε ως ένα από τα δύο στάδια της θεωρίας των δύο σταδίων του Knudson (15). Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, η μεθυλίωση του DNA στον καρκίνο έχει γίνει το κέντρο του ενδι- 20