FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A KIT

Transcript

1 FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A KIT REF Για χρήση µε το LightCycler 2.0 Όργανο Κιτ 32 αντιδράσεων για 30 δείγµατα το µέγιστο Για in Vitro ιαγνωστική Χρήση. ΣΗΜΑΝΤΙΚΗ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: ΟΙ ΕΙ ΙΚΕΣ ΓΙΑ ΚΑΘΕ ΠΑΡΤΙ Α ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΟ ΚΙΤ FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΠΙΣΩ ΜΕΡΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΟΝΤΟΣ ΕΝΘΕΤΟΥ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣ ΩΣ ΓΡΑΜΜΩΤΟΣ Ή ΑΛΦΑΡΙΘΜΗΤΙΚΟΣ ΚΩ ΙΚΑΣ. ΑΥΤΕΣ ΟΙ ΕΙ ΙΚΕΣ ΓΙΑ ΚΑΘΕ ΠΑΡΤΙ Α ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΙΣΑΓΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΛΟΓΙΣΜΙΚΟ ΤΟΥ LIGHTCYCLER 2.0 ΟΡΓΑΝΟΥ ΕΙΤΕ ΧΕΙΡΟΚΙΝΗΤΑ, ΕΙΤΕ ΜΕ ΣΑΡΩΣΗ ΤΟΥ ΓΡΑΜΜΩΤΟΥ ΚΩ ΙΚΑ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΡΟΗΣ ΕΡΓΑΣΙΩΝ. ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΩΝ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΩΝ, ΕΙΝΑΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ ΝΑ ΙΑΣΦΑΛΙΣΤΕΙ ΟΤΙ Ο ΑΡΙΘΜΟΣ ΠΑΡΤΙ ΑΣ ΠΟΥ ΑΝΑΓΡΑΦΕΤΑΙ ΣΤΟ ΠΙΣΩ ΜΕΡΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΟΝΤΟΣ ΕΝΘΕΤΟΥ ΕΙΝΑΙ Ι ΙΟΣ ΜΕ ΕΚΕΙΝΟΝ ΠΟΥ ΑΝΑΓΡΑΦΕΤΑΙ ΣΤΟ ΚΙΒΩΤΙΟ ΤΟΥ ΚΙΤ. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A επιτρέπει την ανίχνευση και τον προσδιορισµό του γονότυπου µιας σηµειακής µετάλλαξης (G σε A στη θέση 20210) του γονιδίου του ανθρώπινου παράγοντα II από το DNA που αποµονώνεται από το ολικό ανθρώπινο περιφερικό αίµα. Η εξέταση διεξάγεται στο LightCycler 2.0 Όργανο χρησιµοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) για την ενίσχυση του DNA του παράγοντα II που ανακτήθηκε από κλινικά δείγµατα και φθορίζοντα υβριδισµό, ειδικό για το στόχο, για την ανίχνευση και τον προσδιορισµό του γονότυπου του ενισχυµένου DNA του παράγοντα ΙΙ. To Factor II (Prothrombin) G20210A test είναι µια in Vitro ιαγνωστική εξέταση για την ανίχνευση και τον προσδιορισµό του γονότυπου της µετάλλαξης Factor II (Prothrombin) G20210A που αποτελεί διαγνωστικό βοήθηµα στην αξιολόγηση ασθενών µε υποψία θροµβοφιλίας. Η εξέταση προορίζεται για χρήση στο LightCycler 2.0 Όργανο χρησιµοποιώντας το LightCycler 4.05 Λογισµικό. Η προετοιµασία του δείγµατος πρέπει να γίνεται σύµφωνα µε τις διαδικασίες ροής εργασιών που περιγράφονται παρακάτω. ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Η κληρονοµική θροµβοφιλία συνιστά προδιάθεση για θροµβωτικά επεισόδια, όπως η φλεβική θρόµβωση, η οποία αποτελεί την τρίτη πιο συνηθισµένη καρδιοαγγειακή νόσο (1). Η αντίσταση στην ενεργοποιηµένη πρωτεΐνη C (APC) θεωρείται ως η κυριότερη ανωµαλία της πήξης του αίµατος που σχετίζεται µε τη φλεβική θρόµβωση (1,2). Οι ασθενείς που ήταν θετικοί στην εξέταση για αντίσταση στην APC ή τη µετάλλαξη του Factor V Leiden πρέπει να υποβληθούν σε εξέταση µοριακής γενετικής για τις άλλες πιο συχνές θροµβοφιλίες µε φαινότυπο επικάλυψης, για τις οποίες διατίθεται εξέταση [δηλαδή, παραλλαγή Factor II (Prothrombin) G20210A] (2). Παρουσιάζεται σε ποσοστό 1 2% του γενικού πληθυσµού και η συµβολή της στο φλεβικό θροµβοεµβολισµό είναι διαπιστωµένη (2). ΑΡΧΗ ΕΞΕΤΑΣΗΣ / ΣΥΝΟΨΗ Προετοιµασία είγµατος Η προετοιµασία του δείγµατος µπορεί να πραγµατοποιηθεί χειροκίνητα ή αυτόµατα µε χρήση του High Pure PCR Template Preparation Kit ή του MagNA Pure LC Οργάνου, χρησιµοποιώντας το MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I. Αυτές είναι οι µοναδικές µέθοδοι καθαρισµού που έχουν εγκριθεί για χρήση µε την εξέταση Factor II Prothrombin test. Ανίχνευση 1. Ενισχύεται ένα θραύσµα 165 bp του γονιδίου του παράγοντα ΙΙ από ανθρώπινο γενοµικό DNA µε χρήση ειδικών εκκινητών. 2. Η ανίχνευση του κλώνου (amplicon) γίνεται µε φθορισµό χρησιµοποιώντας ένα ειδικό ζεύγος H H. Οι ιχνηθέτες H αποτελούνται από δύο διαφορετικά ολιγονουκλεοτίδια που υβριδοποιούνται σε µια εσωτερική αλληλουχία του ενισχυµένου θραύσµατος κατά τη φάση υβριδισµού του κύκλου PCR. Ο ένας ιχνηθέτης επισηµαίνεται στο 5'-άκρο µε το LightCycler Red 640-Ν-υδροξυσουκινιµίδιο εστέρα (Red 640-NHS εστέρα), και για να αποφευχθεί η επιµήκυνση, τροποποιείται στο 3'-άκρο µε φωσφορυλίωση. Οάλλος ιχνηθέτης επισηµαίνεται στο 3'-άκρο µε φλουορεσκίνη. 3. Μόνο µετά τον υβριδισµό στην αλληλουχία DNA είναι δυνατή η στενή προσέγγιση των δύο ιχνηθετών µεταξύ τους, µε αποτέλεσµα τη µεταφορά συντονισµένης ενέργειας φθορισµού (FRET) µεταξύ των δύο φθορισµοφόρων. Κατά τη διάρκεια της FRET, η φλουορεσκίνη, που είναι ο φθορισµοφόρος δότης, διεγείρεται από την πηγή φωτός του LightCycler 2.0 Οργάνου και ένα µέρος της ενέργειας διέγερσης µεταφέρεται στο LightCycler Red 640-NHS εστέρα, που είναι ο φθορισµοφόρος δέκτης. 4. Στη συνέχεια, ο φθορισµός του LightCycler Red 640-NHS εστέρα που εκπέµπεται, µετράται µε το LightCycler 2.0 Όργανο. Προσδιορισµός Γονότυπου Οι ιχνηθέτες H χρησιµοποιούνται, επίσης, για τον προσδιορισµό του γονότυπου εκτελώντας ανάλυση της καµπύλης τήξης µετά την ολοκλήρωση των κύκλων ενίσχυσης και την παρουσία του κλώνου (amplicon) σε αυξηµένη συγκέντρωση. Ο ιχνηθέτης H που είναι επισηµασµένος µε το Red 640 υβριδοποιείται σε ένα θραύσµα της αλληλουχίας στόχου που δεν είναι µεταλλαγµένο και λειτουργεί ως σταθερός ιχνηθέτης. Ο ιχνηθέτης H που είναι επισηµασµένος µε Φλουορεσκίνη γεφυρώνει την τοποθεσία της µετάλλαξης (ιχνηθέτης µετάλλαξης). Κατά την ανάλυση της καµπύλης τήξης, η αύξηση της θερµοκρασίας προκαλεί τη µείωση του φθορισµού καθώς ο πιο µικρός από τους δύο ιχνηθέτες (ιχνηθέτης µετάλλαξης) διαχωρίζεται πρώτος και οι δύο χρωστικές φθορισµού δεν βρίσκονται πλέον σε κοντινή απόσταση. Αν υπάρχει µετάλλαξη του Factor II (Prothrombin) G20210A, η εσφαλµένη αντιστοίχιση (mismatch) του ιχνηθέτη µετάλλαξης µε το στόχο αποσταθεροποιεί το υβρίδιο και εποµένως η µείωση του φθορισµού θα πραγµατοποιηθεί σε χαµηλότερη θερµοκρασία. Με το γονότυπο άγριου τύπου (wild-type) δεν θα προκύψουν εσφαλµένες αντιστοιχίσεις (mismatches) και εποµένως το ετερόδιπλο µόριο DNA παρουσιάζει υψηλότερη θερµοκρασία τήξης (T m ). Ο ετερόζυγος γονότυπος παρουσιάζει ένα χαρακτηριστικό συνδυασµό ιδιοτήτων. 1

2 ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΙΑΛΥΜΑΤΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 1. FIIG20210A MD Mix [Μίγµα Ανίχνευσης Μετάλλαξης G20210A Παράγοντα II (Προθροµβίνη)] 1 78 µl 2. FIIG20210A R Mix [Μίγµα Αντίδρασης G20210A Παράγοντα II (Προθροµβίνη)] 1 78 µl 3. FIIG20210A CT [Πρότυπο Ορού Ελέγχου G20210A Παράγοντα II (Προθροµβίνη)] 1 50 µl 4. FIIG20210A DIL [Αραιωτικό G20210A Παράγοντα II (Προθροµβίνη)] 1 1 ml <0,01% FIIG20210A πρόσθιος και αντίστροφος εκκινητής <0,01% FIIG20210A ιχνηθέτης H Red 640 <0,01% FIIG20210A ιχνηθέτης H Φλουορεσκίνη Ρυθµιστικό διάλυµα Τris-HCI <0,01% Taq DNA πολυµεράση (wt) <0,07% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp <0,01% αλληλουχία DNA ορού ελέγχου περιέχει πλασµίδιο: pf2 WT και pf2 MUT Brij 35 MgCl 2 Brij 35 MgCl 2 H 2 O, τύπου PCR (χρησιµοποιείται επίσης και ως αρνητικός ορός ελέγχου για ενίσχυση) ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Πολυµορφισµός Στο γονίδιο Factor II, εκτός από τη µετάλλαξη FIIG20210A, υπάρχουν τέσσερις γνωστές µεταλλάξεις στις θέσεις 20209, 20207, και (δηλ. οι µεταλλάξεις C20209T, A20207C, A20218G και C20221T). Αυτές οι πρόσθετες µεταλλάξεις γεφυρώνονται από τον ιχνηθέτη µετάλλαξης. Αυτές οι σπάνιες µεταλλάξεις θα οδηγήσουν σε άγνωστο αποτέλεσµα µετά τον προσδιορισµό του γονότυπου. Απαιτήσεις Χειρισµού ΓΙΑ IN VITRO ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. Η χρήση αυτού του προϊόντος πρέπει να επιτρέπεται µόνο σε προσωπικό εκπαιδευµένο στις τεχνικές PCR. Λάβετε τις συνήθεις προφυλάξεις που απαιτούνται για το χειρισµό όλων των εργαστηριακών αντιδραστηρίων. Η παρούσα εξέταση προορίζεται αποκλειστικά για χρήση µε ανθρώπινο ολικό αίµα σε EDTA ή κιτρικά αντιπηκτικά. Η ηπαρίνη ενδέχεται να αλληλεπιδράσει µε την PCR και δεν πρέπει να χρησιµοποιείται στη συγκεκριµένη διαδικασία. Η ροή των εργασιών στο εργαστήριο πρέπει να συµφωνεί µε την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική (GLP), και επίσης, πρέπει να εκτελείται σε µονόδροµη κατεύθυνση (δηλαδή, η προετοιµασία δείγµατος, η ρύθµιση της PCR και η ανάλυση της PCR µε το LightCycler 2.0 Όργανο πρέπει να διαχωρίζονται). Μη συγκεντρώνετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικές φιάλες της ίδιας παρτίδας. Αµέσως µετά τη χρήση, κλείστε όλες τις φιάλες για αποφυγή διαρροής, µεταβολής των συγκεντρώσεων ή των συνθηκών των ρυθµιστικών διαλυµάτων. Μετά το άνοιγµα, φυλάσσετε όλες τις φιάλες και τα φιαλίδια σε όρθια θέση. Μη συνδυάζετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες. Μη χρησιµοποιείτε ένα κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης του. Αποφεύγετε την επαφή του δέρµατος, των µατιών και των βλεννογόνων µε το Ρυθµιστικό ιάλυµα Λύσης/ έσµευσης και το Ρυθµιστικό ιάλυµα Πλύσης Ι από το MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I ή το Ρυθµιστικό ιάλυµα έσµευσης και το Ρυθµιστικό ιάλυµα Αφαίρεσης Αναστολέα από το High Pure PCR Template Preparation Kit. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αµέσως µε άφθονη ποσότητα νερού. Εάν δεν υπάρξει άµεση αντιµετώπιση, µπορεί να προκληθούν εγκαύµατα. Εάν πέσουν σταγόνες από το αντιδραστήριο, αραιώστε µε νερό πριν τις σκουπίσετε. Μην επιτρέπετε την επαφή του Ρυθµιστικού ιαλύµατος Λύσης/ έσµευσης από το MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, το οποίο περιέχει θειοκυανική γουανιδίνη, µε διάλυµα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικού) ή µε ισχυρά όξινα διαλύµατα. Το µίγµα αυτό µπορεί να παράγει ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. Εργαστηριακές ιαδικασίες Όλα τα υλικά ανθρώπινης προέλευσης και όλα τα απορρίµµατα που δηµιουργούνται πρέπει να θεωρούνται δυνάµει µολυσµατικά. Καθαρίζετε καλά και απολυµαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας µε τα απολυµαντικά που συνιστούν οι τοπικές αρχές. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στο χώρο εργασίας του εργαστηρίου. Μην αναρροφάτε µε πιπέτα από το στόµα. Φοράτε προστατευτικά γάντια µιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγµατα και αντιδραστήρια από κιτ. Αποφεύγετε τη µόλυνση των αντιδραστηρίων από µικρόβια και νουκλεάση κατά την αφαίρεση κλασµάτων από τις φιάλες αντιδραστηρίων. Συνιστάται η χρήση στείρων πιπετών µίας χρήσης. Πλένετε καλά τα χέρια σας µετά το χειρισµό δειγµάτων και αντιδραστηρίων της εξέτασης. Χειρισµός Απορριµµάτων Η απόρριψη των αχρησιµοποίητων αντιδραστηρίων και των απορριµµάτων θα πρέπει να γίνεται σύµφωνα µε τους κρατικούς και τοπικούς κανονισµούς. ιατίθενται ελτία εδοµένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) κατόπιν αίτησης από τα τοπικά γραφεία της Roche. Προετοιµασία είγµατος Ανατρέξτε στις οδηγίες ασφάλειας στο ένθετο συσκευασίας του MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I ή του High Pure PCR Template Preparation Kit για πληροφορίες χειρισµού και απόρριψης. Το MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I ή το High Pure PCR Template Preparation Kit πρέπει να αποθηκεύονται σε θερµοκρασία δωµατίου (+15 C έως +25 C). Πριν από τη χρήση του Ρυθµιστικού ιαλύµατος Λύσης/ έσµευσης στο MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, ανακινήστε για να διαλυθούν οι κατακρηµνίσεις. Αποθηκεύετε µόνο σε χώρους µε θερµοκρασία δωµατίου. Χρησιµοποιείτε µόνο MagNA Pure LC Μεσαία Θήκη Αντιδραστηρίων 20 (Αρ. Κατ ) ή MagNA Pure LC Θήκη Αντιδραστηρίων (µεγάλη) (Αρ. Κατ ) στην αντίστοιχη θέση που υποδεικνύει το MagNA Pure LC Όργανο µε αυτήν τη διαδικασία. Ενίσχυση και Ανίχνευση Συµβουλευτείτε το Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου για χρήση IVD πριν χρησιµοποιήσετε το συγκεκριµένο κιτ. ηµιουργήστε µια καταγραφή που να αντιστοιχεί µε την Ταυτότητα του LightCycler Περιστρεφόµενου ίσκου. Η καταγραφή πρέπει να περιλαµβάνει τη θέση του LightCycler Περιστρεφόµενου ίσκου ειγµάτων, τον αριθµό τριχοειδών και το όνοµα κάθε σχετικού δείγµατος για να διασφαλίζεται η σωστή ταυτοποίηση του δείγµατος. Μην αγγίζετε την επιφάνεια των τριχοειδών. Φοράτε πάντα γάντια κατά το χειρισµό των τριχοειδών. 2

3 ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ 1. FIIG20210A MD Mix (κίτρινο πώµα, φιαλίδιο 1), έτοιµο προς χρήση Αποθηκεύστε στους -15 C έως -25 C. Προφυλάξτε το από το φως! 2. FIIG20210A R Mix (κόκκινο πώµα, φιαλίδιο 2), έτοιµο προς χρήση Αποθηκεύστε στους -15 C έως -25 C. 3. FIIG20210A CT (µοβ πώµα, φιαλίδιο 3), έτοιµο προς χρήση Αποθηκεύστε στους -15 C έως -25 C. 4. FIIG20210A DIL (άχρωµο πώµα, φιαλίδιο 4), έτοιµο προς χρήση Αποθηκεύστε στους -15 C έως -25 C. ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ / ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ (ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ) Το κλειστό κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους -15 C έως -25 C µέχρι την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. Προφυλάξτε το FIIG20210A MD Mix (φιαλίδιο 1, κίτρινο πώµα) από το φως! Αποψύξτε τα συστατικά του Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A, αναµίξτε ελαφρώς και αποθηκεύστε σε πάγο. Καταψύχετε αµέσως µετά τη χρήση. Τα αντιδραστήρια του κιτ µπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν έως και πέντε φορές. ΣΥΛΛΟΓΗ / ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Για την προετοιµασία γενοµικού DNA από ανθρώπινο αίµα, εκτελέστε τον καθαρισµό νουκλεϊκών οξέων χρησιµοποιώντας το High Pure PCR Template Preparation Kit (Αρ. Κατ ) ή το MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Αρ. Κατ ) σε συνδυασµό µε το MagNA Pure LC Όργανο (Αρ. Κατ ) όπως περιγράφεται παρακάτω. Το ανθρώπινο περιφερικό αίµα σε EDTA ή κιτρικό αντιπηκτικό παραµένει σταθερό για τουλάχιστον 7 ηµέρες σε θερµοκρασία +2 C έως +8 C. Μπορεί να αποθηκευτεί κατεψυγµένο στους -20 C έως και 12 µήνες και να αποψυχθεί µία φορά. Το DNA έκλουσης µπορεί να αποθηκευτεί σε σφραγισµένη Κασέτα ειγµάτων ή σε σωληνάρια µε βιδωτό πώµα Sarstedt σε θερµοκρασία +2 C µέχρι +8 C έως και 7 ηµέρες Παραµένει σταθερό για αποθήκευση µεγαλύτερης διάρκειας (περίπου 3 εβδοµάδες) σε θερµοκρασία -15 C έως -25 C. Το DNA έκλουσης µπορεί να καταψυχθεί και να αποψυχθεί έως και τρεις φορές. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Βλέπε ενότητα Αντιδραστήρια διαλύµατα εργασίας στη σελίδα 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΟΥΝΤΑΙ ΑΛΛΑ ΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ LightCycler 2.0 Όργανο (Αρ. Κατ ) Σηµείωση: Για τις ΗΠΑ, ισχύουν διαφορετικοί αριθµοί καταλόγου. Για λεπτοµέρειες επικοινωνήστε µε το γραφείο πωλήσεων στις ΗΠΑ. (Τα όργανα µε σειριακό αριθµό και άνω έχουν εγκριθεί για χρήση IVD καθώς και για χρήση µε το παρόν κιτ. Τα όργανα µε σειριακό αριθµό µικρότερο από έχουν επίσης εγκριθεί για χρήση µε το παρόν κιτ µετά την έγκρισή τους για χρήση IVD µέσω ειδικής διαδικασίας αναβάθµισης. Επικοινωνήστε µε το τοπικό κέντρο υποστήριξης πελατών για λεπτοµερείς πληροφορίες σχετικά µε τη διαδικασία αναβάθµισης). LightCycler 4.05 Λογισµικό (Αρ. Κατ ) LightCycler Τριχοειδή (20 µl) (Αρ. Κατ ) High Pure PCR Template Preparation Kit (Αρ. Κατ ) Σωληνάρια Μικροφυγόκεντρου, 1,5 ml, στείρα, ελεύθερα νουκλεάσης LightCycler Προσαρµογείς Φυγόκεντρου (Αρ. Κατ ) Συσκευή Ανάγνωσης Γραµµωτού Κώδικα (Αρ. Κατ ) Μακροεντολή Factor II (Prothrombin) G20210A (Αρ. Κατ ) Αιθανόλη p.a. Ισοπροπανόλη p.a. ΠΡΟΑΙΡΕΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ CD Πρωτοκόλλων Θροµβοφιλίας για Μετά την Έκλουση (Αρ. Κατ ) MagNA Pure LC Συσκευή Ανάγνωσης Γραµµωτού Κώδικα Quick Scan 1000 (Αρ. Κατ ) MagNA Pure LC Εκτυπωτής Γραµµωτού Κώδικα TLP 2844 (Αρ. Κατ ) ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ H 2 O, διπλής απόσταξης, στείρο, ελεύθερο νουκλεάσης MagNA Pure LC Όργανο (Αρ. Κατ ) MagNA Pure Λογισµικό ή νεότερο (Αρ. Κατ ) MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Αρ. Κατ ) Φυγόκεντρος Περιστρεφόµενου ίσκου LC 2.0 µε κάδους ρότορα [Αρ. Κατ (230 V) ή Αρ. Κατ (115 V)]. Αν έχετε ήδη αγοράσει µια Φυγόκεντρο Περιστρεφόµενου ίσκου LC [Αρ. Κατ (230 V) ή Αρ. Κατ (115 V)], απαιτείται επίσης ένα σετ ρότορα LightCycler 2.0 Περιστρεφόµενου ίσκου (Αρ. Κατ )*. Σωληνάρια µε βιδωτό πώµα Sarstedt, 1,5 ml, στείρα * Βλ. Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου, Έκδοση Λογισµικού 4.05 για in Vitro ιαγνωστική Χρήση ή επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υποστήριξη για φυγόκεντρο µε παρόµοιες προδιαγραφές, σε περίπτωση που η Φυγόκεντρος Περιστρεφόµενου ίσκου LC δεν διατίθεται. Στην περίπτωση αυτή, απαιτούνται LightCycler Προσαρµογείς Φυγόκεντρου (Αρ. Κατ ). MagNA Pure LC Ετικέτες Γραµµωτού Κώδικα (Αρ. Κατ ) MagNA Pure LC Ταινία Εκτυπωτή µε Γραµµωτό Κώδικα (Αρ. Κατ ) MagNA Pure LC Μονάδα Ψύξης, Περιστρεφόµενος ίσκος ειγµάτων LC (Αρ. Κατ ) LightCycler Εργαλείο Πωµατισµού (Capping Tool) (Αρ. Κατ ) Γενικός εργαστηριακός εξοπλισµός ΣΗΜΑΝΤΙΚΗ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: ΟΙ ΕΙ ΙΚΕΣ ΓΙΑ ΚΑΘΕ ΠΑΡΤΙ Α ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΟ ΚΙΤ FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΠΙΣΩ ΜΕΡΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΟΝΤΟΣ ΕΝΘΕΤΟΥ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣ ΩΣ ΓΡΑΜΜΩΤΟΣ Ή ΑΛΦΑΡΙΘΜΗΤΙΚΟΣ ΚΩ ΙΚΑΣ. ΑΥΤΕΣ ΟΙ ΕΙ ΙΚΕΣ ΓΙΑ ΚΑΘΕ ΠΑΡΤΙ Α ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΙΣΑΓΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΛΟΓΙΣΜΙΚΟ ΤΟΥ LIGHTCYCLER 2.0 ΟΡΓΑΝΟΥ ΕΙΤΕ ΧΕΙΡΟΚΙΝΗΤΑ, ΕΙΤΕ ΜΕ ΣΑΡΩΣΗ ΤΟΥ ΓΡΑΜΜΩΤΟΥ ΚΩ ΙΚΑ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΡΟΗΣ ΕΡΓΑΣΙΩΝ. ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΩΝ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΩΝ, ΕΙΝΑΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ ΝΑ ΙΑΣΦΑΛΙΣΤΕΙ ΟΤΙ Ο ΑΡΙΘΜΟΣ ΠΑΡΤΙ ΑΣ ΠΟΥ ΑΝΑΓΡΑΦΕΤΑΙ ΣΤΟ ΠΙΣΩ ΜΕΡΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΟΝΤΟΣ ΕΝΘΕΤΟΥ ΕΙΝΑΙ Ι ΙΟΣ ΜΕ ΕΚΕΙΝΟΝ ΠΟΥ ΑΝΑΓΡΑΦΕΤΑΙ ΣΤΟ ΚΙΒΩΤΙΟ ΤΟΥ ΚΙΤ. 3

4 ➀ Αυτοµατοποιηµένη διαδικασία προετοιµασίας δειγµάτων για 15 ή 30 δείγµατα µε χρήση του MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Αρ. Κατ ) σε συνδυασµό µε το MagNA Pure LC Όργανο (Αρ. Κατ ) A. ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ Πριν ξεκινήσετε Ξεκινήστε την πρόψυξη της MagNA Pure LC Μονάδας Ψύξης και του Περιστρεφόµενου ίσκου ειγµάτων LC (Αρ. Κατ ) στο ψυγείο στους +2 C έως +8 C (για τουλάχιστον 2 ώρες). Εκκίνηση του MagNA Pure LC Οργάνου και του Λογισµικού 1. Ενεργοποιήστε το MagNA Pure LC Όργανο και στη συνέχεια θέστε σε λειτουργία τον υπολογιστή. 2. Θέστε σε λειτουργία το MagNA Pure LC Λογισµικό και στη συνέχεια κάντε κλικ στο κουµπί Sample Ordering στην οθόνη Main Menu. 3. Στην οθόνη Sample Ordering, επιλέξτε το πρωτόκολλο µε τίτλο DNA I Blood Cells Fast Protocol και στη συνέχεια εισάγετε τους αριθµούς παρτίδας του MagNA Pure LC DNA Isolation Kit Ι (Αρ. Κατ ) και του Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A και εισάγετε την Ταυτότητα του LightCycler Περιστρεφόµενου ίσκου (µην αλλάξετε άλλες ρυθµίσεις). 4. Εισάγετε τον αρνητικό ορό ελέγχου (FIIG20210A DIL, φιαλίδιο 4, άχρωµο πώµα) στη σειρά 1 του πίνακα Εντολή είγµατος (θέση Α1), πληκτρολογώντας Negative Control. 5. Ξεκινώντας µε τη σειρά 1 (θέση B1), πληκτρολογήστε τα ονόµατα των δειγµάτων ή χρησιµοποιήστε τη MagNA Pure LC Συσκευή Ανάγνωσης Γραµµωτού Κώδικα (Προαιρετικό). Εισάγετε 50 µl ως Όγκο είγµατος και 0 µl ως Όγκο Αραίωσης (προκαθορισµένος). Ο όγκος Έκλουσης έχει προκαθοριστεί στα 100 µl. 6. Αποθηκεύστε και εκτυπώστε τις πληροφορίες του αρχείου Εντολή είγµατος. 7. Χρησιµοποιήστε τη λειτουργία Print Sample Names για να εκτυπώσετε τα ονόµατα των δειγµάτων και τη σωστή θέση τους στην Κασέτα ειγµάτων. (Προαιρετικό) 8. Εκτυπώστε τις ετικέτες Cartridge Barcode εις τριπλούν. (Προαιρετικό) 9. Τοποθετήστε τις ετικέτες γραµµωτού κώδικα στην Κασέτα ειγµάτων (για έκλουση) και στις Εκτυπώσεις. (Προαιρετικό) 10. Κάντε κλικ στο Stage Setup. Προετοιµασία του διαλύµατος εργασίας Πρωτεϊνάσης Κ (επαρκεί για 32 δείγµατα) 1. Προσθέστε 3 ml Ρυθµιστικού ιαλύµατος Έκλουσης (φιάλη 6, κίτρινο πώµα) σε ένα από τα φιαλίδια της Πρωτεϊνάσης K, λυοφιλοποιηµένη (φιαλίδιο 4, ροζ πώµα). Μόλις η Πρωτεϊνάση Κ διαλυθεί πλήρως, προσθέστε 2 ml επιπλέον Ρυθµιστικού ιαλύµατος Έκλουσης για να επιτευχθεί ο τελικός όγκος των 5 ml. 2. Κλείστε το φιαλίδιο και ανακινήστε καλά. Σηµείωση: Αν το ανασυσταµένο διάλυµα δεν χρησιµοποιηθεί την ίδια ηµέρα, αποθηκεύστε το στους +2 C έως +8 C στο φιαλίδιο 4 (έως και 4 εβδοµάδες). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια είναι έτοιµα προς χρήση. Φόρτωση αντιδραστηρίων και πλαστικών µίας χρήσης Σηµείωση: Μην χρησιµοποιείτε τη MagNA Pure LC Θήκη 30. Χρησιµοποιείτε µόνο τη MagNA Pure LC Μεσαία Θήκη Αντιδραστηρίων 20 (Αρ. Κατ ) ή τη MagNA Pure LC Θήκη Αντιδραστηρίων (µεγάλη) (Αρ. Κατ ) στις αντίστοιχες θέσεις που υποδεικνύει το MagNA Pure LC Όργανο µε την παρούσα διαδικασία. Η κατάσταση του Heat Unit και των Cool Units 1 & 2 πρέπει να εµφανίζεται ως PASS πριν από την πλήρωση των αντίστοιχων Θηκών Αντιδραστηρίων µε εναιώρηµα Μαγνητικών Σωµατιδίων Γυαλιού (MGP). 1. Γεµίστε χειροκίνητα τις Θήκες Αντιδραστηρίων (έξω από το MagNA Pure LC Όργανο) µε τους όγκους που υποδεικνύονται στην οθόνη Start Information (γραφικό Stage Layout) και στη συνέχεια κλείστε τις µε τα αντίστοιχα Καπάκια Θηκών Αντιδραστηρίων και τις Ασφάλειες στα Καπάκια των Θηκών. Τοποθετήστε τις γεµάτες Θήκες Αντιδραστηρίων στην Υποδοχή οχείου Αντιδραστηρίων στις θέσεις που υποδεικνύονται στην οθόνη Start Information (εκτός από το εναιώρηµα MGP, βλ. βήµα 4). 2. Τοποθετήστε τα πρόσθετα απαραίτητα πλαστικά µιας χρήσης (όπως υποδεικνύεται) και την Υποδοχή οχείου Αντιδραστηρίων που έχετε προετοιµάσει στη Βάση Αντιδραστηρίων/ ειγµάτων σύµφωνα µε τις πληροφορίες στην οθόνη Start Information. 3. Μεταφέρετε χειροκίνητα 50 µl δειγµάτων ανθρώπινου ολικού περιφερικού αίµατος σε EDTA ή κιτρικό αντιπηκτικό που έχει υποβληθεί σε επαναιώρηση απευθείας στην Κασέτα ειγµάτων (έξω από το MagNA Pure LC Όργανο) σύµφωνα µε τη λίστα εντολών δειγµάτων. 4. Αµέσως πριν από την έναρξη της ανάλυσης, στροβιλίστε το γυάλινο φιαλίδιο MGP εκτενώς, γεµίστε µία Θήκη Αντιδραστηρίων µε το εναιώρηµα MGP, κλείστε την µε το αντίστοιχο Καπάκι Θήκης Αντιδραστηρίων και τοποθετήστε τη στη Βάση Αντιδραστηρίων/ ειγµάτων του Οργάνου στη θέση που υποδεικνύεται στην οθόνη Start Information. 5. Τοποθετήστε την Κασέτα ειγµάτων στο MagNA Pure LC Όργανο. Ανάλυση Καθαρισµού 1. Επιβεβαιώστε κάθε φορτωµένη θέση στο MagNA Pure LC Όργανο κάνοντας κλικ µε το ποντίκι στην οθόνη (οθόνη Start Information). Μετά την επιβεβαίωση όλων των στοιχείων, θα εµφανιστεί το κουµπί OK. 2. Αφαιρέστε τις Ασφάλειες από τα Καπάκια των Θηκών και κλείστε τη ράβδο ασφάλειας και τη θύρα του MagNA Pure LC Οργάνου. 3. Κάντε κλικ στο κουµπί OK για να ξεκινήσετε την ανάλυση. Εµφανίζεται η οθόνη Batch Status και µια µοβ γραµµή που µετακινείται από τα αριστερά προς τα δεξιά υποδεικνύει την πρόοδο της διαδικασίας αποµόνωσης. 4. Μετά την ολοκλήρωση της ανάλυσης θα εµφανιστεί η οθόνη Result. 5. Αποθηκεύστε και εκτυπώστε την οθόνη Result (προαιρετικό). 6. Προαιρετικά, επιλέξτε τη λειτουργία Open Post-Elution από το µενού Action. ιαφορετικά, προχωρήστε στο βήµα Β του Κεφαλαίου 2 (χειροκίνητη προετοιµασία δείγµατος) στο παρόν ένθετο συσκευασίας. 7. Εάν η εκχύλιση µε το MagNA Pure αποτύχει για ένα µεµονωµένο δείγµα (επισηµαίνεται στην οθόνη Result) πρέπει να επαναληφθεί η εκχύλιση του δείγµατος αυτού. Εάν δεν είναι δυνατή η εκτέλεση της λειτουργίας Post-Elution, προχωρήστε στο βήµα Β του Κεφαλαίου 2 (χειροκίνητη προετοιµασία δείγµατος) στο παρόν ένθετο συσκευασίας χρησιµοποιώντας τα δείγµατα που προέκυψαν µετά από την αρχική ή τη µετέπειτα επιτυχή εκχύλιση. 4

5 B. ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΚΛΟΥΣΗ (Προαιρετικό) ιαδικασία Μετά την Έκλουση (Προαιρετική) 1. Βεβαιωθείτε ότι η MagNA Pure LC Μονάδα Ψύξης και ο Περιστρεφόµενος ίσκος ειγµάτων LC βρίσκονται στη θέση τους και έχουν προψυχθεί (π.χ., καταψύξτε στους +2 C έως +8 Cγια τουλάχιστον 2 ώρες). 2. Φορτώστε το Πρωτόκολλο για Μετά την Έκλουση µε τίτλο Thrombophilia 15 or 30 samples από το CD Πρωτοκόλλων Θροµβοφιλίας για Μετά την Έκλουση (Αρ. Κατ ). (Προαιρετικό) 3. Προετοιµασία Κύριου Μίγµατος (µόνο για διαδικασία Μετά την Έκλουση) Προετοιµάστε µόνο την απαιτούµενη ποσότητα αµέσως πριν από τη χρήση. Αποψύξτε τα συστατικά του Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A, αναµίξτε ελαφρώς και αποθηκεύστε σε πάγο. Τοποθετήστε ένα LightCycler Τριχοειδές ανά δείγµα DNA και ένα για κάθε ορό ελέγχου στον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο, δηλαδή, 17 τριχοειδή για 15 δείγµατα ή 32 τριχοειδή για 30 δείγµατα, αντίστοιχα. Προετοιµάστε το Κύριο Μίγµα: Βήµα Ενέργεια 1 Σε ένα σωληνάριο Sarstedt 1,5 ml µε βιδωτό πώµα σε πάγο, προσθέστε τα ακόλουθα συστατικά µε τη σειρά που παρατίθενται παρακάτω (Παρέχονται παραδείγµατα για 15 ή 30 δείγµατα): Αντιδραστήρια διαλύµατα εργασίας Όγκος* / 15 δείγµατα Όγκος* / 30 δείγµατα FIIG20210A DIL, φιαλίδιο µl 396 µl FIIG20210A MD Mix, φιαλίδιο 1 38 µl 72 µl FIIG20210A R Mix, φιαλίδιο 2 38 µl 72 µl Συνολικός όγκος 285 µl 540 µl * οι όγκοι που υποδεικνύονται περιλαµβάνουν ορούς ελέγχου και περιθώρια έγχυσης µε πιπέτα 2 Ανακατέψτε ελαφρώς. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα στο ακροφύσιο του σωληναρίου. 3 Τοποθετήστε το σωληνάριο που περιέχει το Κύριο Μίγµα στη θέση 1 της MagNA Pure LC µονάδας ψύξης. Αφαιρέστε τα καπάκια των θηκών. 4. Τοποθετήστε τον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο, συµπεριλαµβανοµένων των τριχοειδών που υποδεικνύει το Πρωτόκολλο για Μετά την Έκλουση, στη µονάδα ψύξης, καθώς επίσης και τον απαιτούµενο αριθµό ακροφυσίων πιπετών όπως υποδεικνύεται στην οθόνη στη βάση του MagNA Pure LC Οργάνου. 5. Ανοίξτε το FIIG20210A CT (φιαλίδιο 3, µοβ πώµα), αναρροφήστε µε πιπέτα 25 µl σε ένα νέο σωληνάριο Sarstedt 1,5 ml µε βιδωτό πώµα και στη συνέχεια τοποθετήστε το στη θέση 16 της MagNA Pure LC µονάδας ψύξης, όπως υποδεικνύει το Πρωτόκολλο για Μετά την Έκλουση. Σηµείωση: Φυγοκεντρίστε το φιαλίδιο που περιέχει το FIIG20210A CT για την καθίζηση του περιεχοµένου του πριν από το άνοιγµα. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα στο ακροφύσιο του σωληναρίου. Αλλάξτε τα γάντια µετά το χειρισµό του προτύπου του ορού ελέγχου. 6. Κλείστε το όργανο και κάντε κλικ στο Start και στο OK για να αρχίσει η αυτόµατη αναρρόφηση µε πιπέτα. Όταν ολοκληρωθεί το πρωτόκολλο για Μετά την Έκλουση, εµφανίζεται η οθόνη Post-Elution Result. 7. Εκτυπώστε το γραµµωτό κώδικα της Μονάδας Ψύξης εις τριπλούν. (Προαιρετικό) 8. Πατήστε Save και Print Post-Elution για τον πίνακα αποτελεσµάτων και στη συνέχεια τοποθετήστε στην εκτύπωση ένα γραµµωτό κώδικα της Μονάδας Ψύξης. (Προαιρετικό) 9. Τοποθετήστε µια ετικέτα σε µια κενή δισκέτα µε το όνοµα της ανάλυσης καθαρισµού ή ένα γραµµωτό κώδικα της Μονάδας Ψύξης. ηµιουργήστε ένα αρχείο LightCycler SAM (Αρχείο Μοντέλου ειγµάτων) στη δισκέτα. 10. Σφραγίστε κάθε τριχοειδές µε ένα πώµα χρησιµοποιώντας το Εργαλείο Πωµατισµού LC (Αρ. Κατ ). 11. Τοποθετήστε στον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο ένα γραµµωτό κωδικό της Μονάδας Ψύξης. (Προαιρετικό) 12. Τοποθετήστε τον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο στον κάδο ρότορα της Φυγόκεντρου Περιστρεφόµενου ίσκου LC. 13. Μεταφέρετε τον κάδο του ρότορα, συµπεριλαµβανοµένου του LightCycler Περιστρεφόµενου ίσκου, στη Φυγόκεντρο Περιστρεφόµενου ίσκου LC. Σηµείωση: Αν δεν διατίθεται Φυγόκεντρος Περιστρεφόµενου ίσκου, χρησιµοποιήστε µια επιτραπέζια φυγόκεντρο (όπως την Biofuge 13 από τα Heraeus Όργανα ή τα Kendro Εργαστηριακά Προϊόντα) µε LightCycler Προσαρµογείς Φυγόκεντρου και περιστρέψτε 735 g το µέγιστο για 30 s. 14. Πατήστε Start για έναρξη της ανάλυσης της Φυγόκεντρου Περιστρεφόµενου ίσκου LC. 15. Μετά τη φυγοκέντριση, µεταφέρετε τον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο στο LightCycler 2.0 Όργανο Σηµείωση: Αποθηκεύετε το DNA έκλουσης στους +2 C έως +8 C µέχρι επτά ηµέρες και στους -15 C έως -25 C για αποθήκευση µεγαλύτερης διάρκειας (περίπου 3 εβδοµάδες). Αν δεν χρησιµοποιείτε το Πρωτόκολλο για Μετά την Έκλουση µε το MagNAPure LC, προχωρήστε στο πρωτόκολλο που περιγράφεται στο βήµα Β του Κεφαλαίου 2 για την προετοιµασία Κύριου Μίγµατος για PCR. 16. Αν δεν πρόκειται να εκτελεστούν περαιτέρω αναλύσεις µε το MagNA Pure, τερµατίστε τον υπολογιστή του MagNA Pure LC και στη συνέχεια το MagNA Pure LC Όργανο. 5

6 C. ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ LightCycler 2.0 Όργανο Σηµείωση: Πριν εκκινήσετε την Μακροεντολή, συνδεθείτε στη Βάση εδοµένων Exor (DB) µε ίχνος ελέγχου. Αν έχετε συνδεθεί στη βάση δεδοµένων Exor DB µε ίχνος ελέγχου, η λέξη Traceable εµφανίζεται στη γραµµή Κατάστασης του λογισµικού. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τον τρόπο σύνδεσης στο λογισµικό, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου, Έκδοση Λογισµικού 4.05 για in Vitro ιαγνωστική Χρήση. 1. Αν έχει προηγουµένως τοποθετηθεί ετικέτα (βήµα Β.11), αφαιρέστε την ετικέτα µε το γραµµωτό κώδικα από τον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο. (Προαιρετικό) 2. Τοποθετήστε τον περιστρεφόµενο δίσκο στο LightCycler 2.0 Όργανο. 3. Βεβαιωθείτε ότι είναι εγκατεστηµένη η Μακροεντολή του Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A (Αρ. Κατ ). Η εγκατάσταση της Μακροεντολής αυτής γίνεται µόνο µία φορά κατά την πρώτη εκτέλεση της εξέτασης. 4. Εκκινήστε τη µακροεντολή πατώντας το κουµπί Roche και εισάγοντας τον Αρ. Κατ. του κιτ είτε χειροκίνητα είτε µε σάρωση του γραµµωτού κώδικα. Για τις ειδικές πληροφορίες γραµµωτού κώδικα του σωστού κιτ, ανατρέξτε στο πίσω µέρος του παρόντος ένθετου συσκευασίας. Σηµείωση: Το πλαίσιο Perform self test ενδέχεται να µην είναι ενεργό. 5. Ο οδηγός κιτ θα σας κατευθύνει σε ολόκληρη τη διαδικασία. 6. Εισάγετε τα ονόµατα των δειγµάτων στην οθόνη Capillary View είτε χειροκίνητα, είτε µε χρήση ενός αρχείου SAM, εφόσον έχει ήδη δηµιουργηθεί, πατώντας το Import SAM. Εισάγετε τον αριθµό παρτίδας του κιτ στο αντίστοιχο πεδίο στην οθόνη Capillary View. 7. Κάντε κλικ στο κουµπί Start Run που βρίσκεται στον οδηγό κιτ. 8. Μόλις ολοκληρωθεί η ανάλυση, το LightCycler 2.0 Όργανο προσδιορίζει αυτόµατα και εµφανίζει το γονότυπο, εκτελώντας ανάλυση της καµπύλης τήξης. Σηµείωση: Το σήµα φθορισµού µετράται στο κανάλι 640 nm. ➁ ιαδικασία χειροκίνητης προετοιµασίας δειγµάτων για ένα δείγµα µε χρήση του High Pure PCR Template Preparation Kit (Αρ. Κατ ) A. ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ Πριν ξεκινήσετε Ξεκινήστε την πρόψυξη των LightCycler Προσαρµογέων Φυγόκεντρου στο ψυγείο στους +2 C έως +8 C (για τουλάχιστον 2 ώρες). Προετοιµασία διαλυµάτων εργασίας Αντιδραστήριο Ανασύσταση/Προετοιµασία διαλύµατος εργασίας Αποθήκευση και σταθερότητα του διαλύµατος εργασίας Πρωτεϊνάση K ιαλύστε την Πρωτεϊνάση K σε 4,5 ml νερού διπλής Αποθηκεύστε στους -15 C έως -25 C. (φιαλίδιο 3, ροζ πώµα) απόσταξης, εκτελέστε κλασµατοποίηση του διαλύµατος. Παραµένει σταθερό για 12 µήνες. Ρυθµιστικό ιάλυµα Προσθέστε 20 ml αιθανόλης στο Ρυθµιστικό ιάλυµα Αποθηκεύστε στους +15 C έως +25 C. Αφαίρεσης Αναστολέα Αφαίρεσης Αναστολέα. Παραµένει σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία (φιαλίδιο 4a, µαύρο πώµα) Σηµείωση: Αφού προσθέσετε την αιθανόλη, επισηµάνετε και λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα του κιτ. σηµειώστε την ηµεροµηνία στη φιάλη. Ρυθµιστικό ιάλυµα Πλύσης (φιαλίδιο 4, µπλε πώµα) ιαδικασία καθαρισµού Προσθέστε 80 ml αιθανόλης στο Ρυθµιστικό ιάλυµα Πλύσης. Σηµείωση: Αφού προσθέσετε την αιθανόλη, επισηµάνετε και σηµειώστε την ηµεροµηνία στη φιάλη. Αποθηκεύστε στους +15 C έως +25 C. Παραµένει σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα του κιτ. Σηµείωση: Βεβαιωθείτε ότι ακολουθείτε ακριβώς τη διαδικασία που περιγράφεται παρακάτω και όχι τη διαδικασία που περιγράφεται στο ένθετο συσκευασίας του High Pure PCR Template Preparation Kit. 1. Κατανέµετε 200 µl Ρυθµιστικού ιαλύµατος Έκλουσης ανά δείγµα σε αποστειρωµένα σωληνάρια αντίδρασης 1,5 ml, κλείστε τα σωληνάρια και προθερµάνετε στους +70 C. 2. Σε 200 µl ανθρώπινου ολικού περιφερικού αίµατος σε EDTA ή κιτρικό αντιπηκτικό που έχει υποβληθεί σε επαναιώρηση προσθέστε: 200 µl Ρυθµιστικό ιάλυµα έσµευσης (πράσινο πώµα) 40 µl Πρωτεϊνάση K (ανασυσταµένη) Ανακατέψτε αµέσως στροβιλίζοντας και επωάστε στους +70 C για 10 λεπτά. 3. Προσθέστε 100 µl ισοπροπανόλη και ανακατέψτε καλά µε στροβιλισµό. 4. Αναρροφήστε το µίγµα δείγµατος µε πιπέτα στο άνω δοχείο ενός συνδυαστικού συγκροτήµατος σωληναρίου φίλτρου High Pure και σωληναρίου συλλογής. 5. Φυγοκεντρίστε για 1 λεπτό στα 6000 g σε συνήθη επιτραπέζια φυγόκεντρο. 6. Απορρίψτε το σωληνάριο ροής και συλλογής. 7. Συνδυάστε το σωληνάριο φίλτρου µε ένα νέο σωληνάριο συλλογής. 8. Προσθέστε 500 µl Ρυθµιστικού ιαλύµατος Αφαίρεσης Αναστολέα (µαύρο πώµα) στο άνω δοχείο. 9. Φυγοκεντρίστε για 1 λεπτό στα 6000 g. 10. Απορρίψτε το σωληνάριο ροής και συλλογής. 11. Συνδυάστε το σωληνάριο φίλτρου µε ένα νέο σωληνάριο συλλογής. 12. Προσθέστε 500 µl Ρυθµιστικού ιαλύµατος Πλύσης (µπλε πώµα) στο άνω δοχείο. 13. Φυγοκεντρίστε για 1 λεπτό στα 6000 g. 14. Απορρίψτε το σωληνάριο ροής και συλλογής. 15. Συνδυάστε το σωληνάριο φίλτρου µε ένα νέο σωληνάριο συλλογής. 16. Προσθέστε 500 µl Ρυθµιστικού ιαλύµατος Πλύσης (µπλε πώµα) στο άνω δοχείο. 17. Φυγοκεντρίστε για 1 λεπτό στα 6000 g. 18. Απορρίψτε το σωληνάριο ροής. 6

7 19. Συνδυάστε το σωληνάριο φίλτρου µε το ίδιο σωληνάριο συλλογής. 20. Φυγοκεντρίστε για 10 s σε µέγιστη ταχύτητα ( g ή µεγαλύτερη) για την αφαίρεση του υπόλοιπου Ρυθµιστικού ιαλύµατος Πλύσης. 21. Απορρίψτε το σωληνάριο συλλογής. 22. Εισάγετε το σωληνάριο φίλτρου σε ένα καθαρό σωληνάριο αντίδρασης 1,5 ml. 23. Προσθέστε τα 200 µl προθερµασµένου (+70 C) Ρυθµιστικού ιαλύµατος Έκλουσης στο σωληνάριο φίλτρου. 24. Φυγοκεντρίστε για 1 λεπτό στα 6000 g. Το σωληνάριο της µικροφυγόκεντρου περιέχει το DNA έκλουσης. B. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΥΡΙΟΥ ΜΙΓΜΑΤΟΣ 1. Αποψύξτε τα συστατικά του Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A, αναµίξτε ελαφρώς και αποθηκεύστε σε πάγο. 2. Τοποθετήστε ένα LightCycler Τριχοειδές ανά δείγµα DNA και ένα για κάθε ορό ελέγχου στους LightCycler Προσαρµογείς Φυγόκεντρου που έχουν προψυχθεί. 3. Προετοιµάστε το Κύριο Μίγµα πολλαπλασιάζοντας την ποσότητα στη στήλη Όγκος/αντίδραση µε τον αριθµό των αντιδράσεων που θα αναλυθούν (δηλ., DNA δειγµάτων, αρνητικοί και θετικοί οροί ελέγχου), συν µία πρόσθετη αντίδραση. Ακολουθήστε τη διαδικασία που περιγράφεται παρακάτω για µία τυπική αντίδραση 20 µl. Βήµα Ενέργεια 1 Σε ένα σωληνάριο αντίδρασης 1,5 ml σε πάγο, προσθέστε τα ακόλουθα συστατικά µε τη σειρά που αναφέρονται παρακάτω: Αντιδραστήρια διαλύµατα εργασίας Όγκος/αντίδραση FIIG20210A DIL, φιαλίδιο 4 11 µl FIIG20210A MD Mix, φιαλίδιο 1 2 µl FIIG20210A R Mix, φιαλίδιο 2 2 µl Συνολικός όγκος 15 µl 2 Ανακατέψτε ελαφρώς. Αναρροφήστε µε πιπέτα 15 µl Κύριου Μίγµατος σε κάθε LightCycler Τριχοειδές που έχει προψυχθεί. Επαληθεύστε την ταυτότητα της λίστας δειγµάτων (Κεφάλαιο 1, Α7, εκτύπωση) µε την αντίστοιχη Κασέτα ειγµάτων συγκρίνοντας τους αριθµούς γραµµωτού κώδικα (προαιρετικό). Προσθέστε 5 µl αποµονωµένου DNA δείγµατος ή 5 µl FIIG20210A CT (φιαλίδιο 3, µοβ πώµα), ως θετικό ορό ελέγχου ή 5 µl FIIG20210A DIL, (φιαλίδιο 4, άχρωµο πώµα), ως αρνητικό ορό ελέγχου. 3 Σφραγίστε κάθε τριχοειδές µε ένα πώµα χρησιµοποιώντας το Εργαλείο Πωµατισµού LC (Αρ. Κατ ). 4 Αν χρησιµοποιείτε τη Φυγόκεντρο Περιστρεφόµενου ίσκου LC, προχωρήστε στο βήµα 5. Αν χρησιµοποιείτε µια αντίστοιχη επιτραπέζια φυγόκεντρο (όπως την Biofuge 13 από τα Heraeus Όργανα ή τα Kendro Εργαστηριακά Προϊόντα), τοποθετήστε κάθε τριχοειδές στους αντίστοιχους LightCycler Προσαρµογείς Φυγόκεντρου που έχουν προψυχθεί και εκτελέστε τα ακόλουθα βήµατα: Τοποθετήστε τους προσαρµογείς στην επιτραπέζια φυγόκεντρο Φυγοκεντρίστε µε µέγιστη ταχύτητα 735 g για 30 s. Προχωρήστε στο βήµα 5. 5 Τοποθετήστε το τριχοειδές που περιέχει τον αρνητικό ορό ελέγχου στη θέση 1 και το τριχοειδές που περιέχει το θετικό ορό ελέγχου στη θέση 2 του LightCycler Περιστρεφόµενου ίσκου. 6 Ξεκινώντας από τη θέση 3, τοποθετήστε τα τριχοειδή που περιέχουν το DNA δείγµατος στον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο. 7 Μεταφέρετε τον κάδο του ρότορα, συµπεριλαµβανοµένου του LightCycler Περιστρεφόµενου ίσκου, στη Φυγόκεντρο Περιστρεφόµενου ίσκου LC 2.0 ή στη Φυγόκεντρο Περιστρεφόµενου ίσκου LC που είναι εξοπλισµένη µε ένα σετ ρότορα Φυγόκεντρου Περιστρεφόµενου ίσκου LC Πατήστε Start για έναρξη της ανάλυσης της Φυγόκεντρου Περιστρεφόµενου ίσκου LC. 9 Μετά τη φυγοκέντριση, µεταφέρετε τον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο στο LightCycler 2.0 Όργανο. C. ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ LightCycler 2.0 Όργανο Σηµείωση: Πριν εκκινήσετε την Μακροεντολή, συνδεθείτε στη Βάση εδοµένων Exor (DB) µε ίχνος ελέγχου. Αν έχετε συνδεθεί στη βάση δεδοµένων Exor DB µε ίχνος ελέγχου, η λέξη Traceable εµφανίζεται στη γραµµή Κατάστασης του λογισµικού. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τον τρόπο σύνδεσης στο λογισµικό, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου, Έκδοση Λογισµικού 4.05 για in Vitro ιαγνωστική Χρήση. 1. Τοποθετήστε τον περιστρεφόµενο δίσκο στο LightCycler 2.0 Όργανο. 2. Βεβαιωθείτε ότι είναι εγκατεστηµένη η Μακροεντολή του Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A (Αρ. Κατ ). Η εγκατάσταση της Μακροεντολής αυτής γίνεται µόνο µία φορά κατά την πρώτη εκτέλεση της εξέτασης. 3. Εκκινήστε τη µακροεντολή πατώντας το κουµπί Roche και εισάγοντας τον Αρ. Κατ. του κιτ είτε χειροκίνητα είτε µε σάρωση του γραµµωτού κώδικα. Για τις ειδικές πληροφορίες γραµµωτού κώδικα του σωστού κιτ, ανατρέξτε στο πίσω µέρος του παρόντος ένθετου συσκευασίας. Σηµείωση: Το πλαίσιο Perform self test ενδέχεται να µην είναι ενεργό. 4. Ο οδηγός κιτ θα σας κατευθύνει σε ολόκληρη τη διαδικασία. 5. Εισάγετε τον αριθµό δειγµάτων στο τµήµα µέτρησης δειγµάτων και τα ονόµατα δειγµάτων στην οθόνη Capillary View, σύµφωνα µε το σχέδιο φόρτωσης δειγµάτων. Εισάγετε τον αριθµό παρτίδας του κιτ στο αντίστοιχο πεδίο στην οθόνη Capillary View. 6. Κάντε κλικ στο κουµπί Start Run που βρίσκεται στον οδηγό κιτ. 7. Μόλις ολοκληρωθεί η ανάλυση, το LightCycler 2.0 Όργανο προσδιορίζει αυτόµατα και εµφανίζει το γονότυπο, εκτελώντας ανάλυση της καµπύλης τήξης. Σηµείωση: Το σήµα φθορισµού µετράται στο κανάλι 640 nm. 7

8 ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ ΟΡΓΑΝΟΥ εν είναι απαραίτητη η βαθµονόµηση του οργάνου. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Οι αρνητικοί και θετικοί οροί ελέγχου πρέπει να συµπεριλαµβάνονται σε κάθε ανάλυση PCR. Αρνητικός ορός ελέγχου: Το αποτέλεσµα της ανάλυσης για τον αρνητικό ορό ελέγχου FIIG20210A πρέπει να είναι πάντα negative. ιαφορετικά, όλη η ανάλυση επισηµαίνεται ως άκυρη. Όλη η διαδικασία (προετοιµασία δειγµάτων, ενίσχυση και ανίχνευση) πρέπει να επαναληφθεί. Αν ο αρνητικός ορός ελέγχου δίνει συνεχώς µη αρνητικό αποτέλεσµα, επικοινωνήστε µε τον αντιπρόσωπο της Roche της περιοχής σας για τεχνική υποστήριξη. Θετικός ορός ελέγχου: Το αποτέλεσµα της ανάλυσης για το FIIG20210A CT πρέπει να φέρει πάντα γονότυπο het. Στην αντίθετη περίπτωση, η ανάλυση δεν είναι έγκυρη και πρέπει να επαναληφθεί ολόκληρη η διαδικασία (προετοιµασία δείγµατος, ενίσχυση και ανίχνευση). Αν ο θετικός ορός ελέγχου αποτυγχάνει συνεχώς να δώσει ετερόζυγο γονότυπο, επικοινωνήστε µε τον αντιπρόσωπο της Roche της περιοχής σας για τεχνική υποστήριξη. Αποτέλεσµα δείγµατος: Το αποτέλεσµα της ανάλυσης για το DNA δείγµατος πρέπει πάντα να παρουσιάζει ένα προφίλ καµπύλης τήξης για τον οµόζυγο γονότυπο άγριου τύπου (wild-type), τον οµόζυγο µεταλλαγµένο γονότυπο ή τον ετερόζυγο γονότυπο. Στην αντίθετη περίπτωση, το αποτέλεσµα του συγκεκριµένου δείγµατος δεν είναι έγκυρο και πρέπει να επαναληφθεί ολόκληρη η διαδικασία (προετοιµασία δείγµατος, ενίσχυση και ανίχνευση). ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ Το FIIG20210A MD Mix (φιαλίδιο 1, κίτρινο πώµα) είναι ειδικό για την αλληλουχία για το γονίδιο του ανθρώπινου παράγοντα ΙΙ. Οι υψηλές συγκεντρώσεις ηπαρίνης ενδέχεται να αλληλεπιδράσουν µε την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης. εν είναι γνωστές άλλες πιθανές αλληλεπιδράσεις. ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ / ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1. Βεβαιωθείτε ότι τα αποτελέσµατα ορού ελέγχου για την ανάλυση είναι έγκυρα. Εάν η ανάλυση δεν είναι έγκυρη, επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση (προετοιµασία δείγµατος, ενίσχυση και ανίχνευση). 2. Για µια έγκυρη ανάλυση, τα αποτελέσµατα δειγµάτων εµφανίζονται από τη µονάδα ανάλυσης προσδιορισµού γονότυπου του LightCycler Λογισµικού, ως εξής: Εµφανιζόµενο αποτέλεσµα wt Ερµηνεία οµόζυγος γονότυπος άγριου τύπου (wild-type): το δείγµα είναι αρνητικό για τη µετάλλαξη του Factor II (Prothrombin) G20210A (δηλ. δεν υπάρχουν µεταλλαγµένα αλληλόµορφα) het ετερόζυγος γονότυπος: το δείγµα φέρει και τα δύο αλληλόµορφα, ένα άγριου τύπου (wild-type) και ένα µεταλλαγµένο (Factor II (Prothrombin) G20210A) mut οµόζυγος µεταλλαγµένος γονότυπος: το δείγµα είναι θετικό για τη µετάλλαξη του Factor II (Prothrombin) G20210A (δηλ. υπάρχουν δύο µεταλλαγµένα αλληλόµορφα) unknown Ο γονότυπος δεν µπορεί να ταξινοµηθεί σε κάποιο από τα προκαθορισµένα πρότυπα τήξης. Επαναλάβετε τη διαδικασία ανάλυσης, συµπεριλαµβανοµένης της προετοιµασίας δείγµατος, της ενίσχυσης και της ανίχνευσης. Αν το αποτέλεσµα είναι και πάλι unknown, επικοινωνήστε µε τον αντιπρόσωπο της Roche της περιοχής σας για τεχνική υποστήριξη. negative το δείγµα ταιριάζει µε τα κριτήρια του λογισµικού που προσδιορίζουν έναν αρνητικό ορό ελέγχου ΕΙ ΙΚΑ Ε ΟΜΕΝΑ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Αναλυτική ειδικότητα Με τη χρήση συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων ως εκκινητών και των ιχνηθετών H, αποδείχτηκε ότι το LightCycler 4.05 Λογισµικό (προσδιορισµός γονότυπου) ταυτοποιεί τη µετάλλαξη του Factor II (Prothrombin) G20210A. Εφαρµόζοντας ανάλυση αλληλουχίας αποδείχθηκε ότι τα επιλεγµένα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια που χρησιµοποιούνται ως εκκινητές, ενισχύουν ειδικά ένα θραύσµα 165 bp του γονιδίου του παράγοντα II που περιέχει την αλληλουχία Factor II (Prothrombin) G20210A. Αναλυτική ευαισθησία Το κεκαθαρµένο ανθρώπινο ετερόζυγο DNA για τη µετάλλαξη του Factor II (Prothrombin) G20210A αραιώθηκε σε τέσσερα διαδοχικά βήµατα αραίωσης. Κάθε αραίωση αναλύθηκε σε έξι αντίγραφα και εκτελέστηκε στατιστική ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Υπολογίστηκε ένα ελάχιστο επίπεδο ανίχνευσης 198 αντιγράφων ανά αντίδραση για το Factor II (Prothrombin) G20210A Kit. ιαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα Σε µια µελέτη πρόβλεψης µε δείγµατα ανθρώπινου DNA που µόλις έχουν συλλεχθεί και µε αποθηκευµένα, 522 δείγµατα από καυκάσιους ασθενείς µε υποψία θροµβοφιλίας αναλύθηκαν µε χρήση του Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A και µε ανάλυση µονόκλωνης ή δίκλωνης αλληλουχίας στο MegaBACE 500 Sequencing System, χρησιµοποιώντας το Cimarron Base Caller SW Και οι δύο πίνακες παρουσιάζουν όλα τα δείγµατα θροµβοφιλίας που συλλέχθηκαν από εσωτερικούς ασθενείς ενός πανεπιστηµιακού νοσοκοµείου κατά τη διάρκεια καθορισµένου χρονικού πλαισίου. Το επίπεδο συµφωνίας µεταξύ του Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A και της ανάλυσης αλληλουχίας ήταν 98,9% (516/522). Λεπτοµερή στοιχεία παρατίθενται στον παρακάτω πίνακα. -(d/dt) Φθορισµός (640) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Θερµοκρασία [ C] Ετερόζυγος Άγριου τύπου (οµόζυγος) Μεταλλαγµένος (οµόζυγος) FIIG20210A DIL 8

9 Πίνακας 1: Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A έναντι Ανάλυσης Αλληλουχίας Ανάλυση αλληλουχίας Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A άγριου τύπου (wt) ετερόζυγος (het) µεταλλαγµένος (mut) άγνωστο wt het 40 1 mut Σηµείωση: 41,0% των δειγµάτων ανθρώπινου DNA λήφθηκαν από ασθενείς µε υποψία επεισοδίων φλεβικής θροµβοεµβολής µε τις σύµφωνες δηλώσεις του American College of Medical Genetics (ACMG) ή του College of American Pathologists (CAP) ή και των δύο (2,4), 38,0% από ασθενείς µε διαταραχές αρτηριακής θρόµβωσης (π. χ. εγκεφαλικό), 18,0% από ασθενείς µε αναφερόµενη υποψία θροµβοφιλίας για άλλους λόγους και 3,0% για µη καταγραµµένους λόγους. Με το Κιτ Factor II (Prothrombin) G20210A δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισµός του γονότυπου έξι δειγµάτων. ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗ ΠΡΟΣ ΤΟΝ ΑΓΟΡΑΣΤΗ Η αγορά του παρόντος προϊόντος επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για ενίσχυση και ανίχνευση αλληλουχιών νουκλεϊκού οξέος για ανθρώπινη in Vitro ιαγνωστική. Με το παρόν δεν παρέχεται καµία ευρεσιτεχνία γενικού τύπου ή άλλη άδεια οποιουδήποτε είδους εκτός από το παρόν συγκεκριµένο δικαίωµα χρήσης από αγορά. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1 Ridker, PM, et al. (1997) Ethnic Distribution of Factor V Leiden in 4047 Men and Women: Implications for Venous Thromboembolism screening. JAMA, 277, Grody, WW. et al. (2001) American College of Medical Genetics Consensus Statement on Factor V Leiden Mutation Testing. Genetics in Medicine, 3, Vol.2, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN X). NCCLS 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pa , USA (1999). 4 Press, RD, et al. (2003) Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) Testing for the Diagnosis and Management of Thromboembolic Disorders. CAP Consensus Conference XXXVI: Diagnostic Issues in Thrombophilia. 9

10 2006 Roche Diagnostics Η τεχνολογία που χρησιµοποιείται για το LightCycler Όργανο έχει την άδεια της εταιρίας Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA. Οι ονοµασίεςroche, LIGHTCYCLER, HYBPROBE, MAGNA PURE, LC και HIGH PURE είναι σήµατα κατατεθέντα της Roche. Η ονοµασία Biofuge είναι σήµα κατατεθέν της Heraeus Instruments GmbH. Η ονοµασία Brij είναι σήµα κατατεθέν της ICI Americas, Inc., PA, USA. Η ονοµασία MegaBACE είναι σήµα κατατεθέν της GE Healthcare Bio-Sciences. Η ονοµασία Cimarron είναι σήµα κατατεθέν της Cimarron Software, Inc., Salt Lake City, UT, USA. Κατασκευάζεται στη Γερµανία για τη Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ USA Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Γερµανία, Για τις Η.Π.Α: ιανοµή στις Η.Π.Α. : Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA Τεχνική Υποστήριξη Πελατών Η.Π.Α.: /2006 ( EN)