cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test BRAF

Transcript

1 cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test ΓΙΑ IN VITRO ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test BRAF 24 Tests P/N: ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η αγορά του παρόντος προϊόντος επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για ενίσχυση και ανίχνευση αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και σχετικές διαδικασίες για in vitro διάγνωση σε δείγματα ανθρώπινης προέλευσης, για την προβλεπόμενη χρήση που αναφέρεται στο παρόν Ένθετο Συσκευασίας. ιά του παρόντος δεν παρέχεται κανένα δικαίωμα ευρεσιτεχνίας γενικού τύπου ή άλλη άδεια οποιουδήποτε τύπου εκτός από το παρόν ειδικό δικαίωμα χρήσης από την αγορά του προϊόντος. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test χρησιμοποιείται κυρίως για ανίχνευση των μεταλλάξεων BRAF V600 σε DNA που εκχυλίστηκε από ανθρώπινο ιστό μελανώματος και ιστό θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς (PTC), μονιμοποιημένο σε φορμόλη και εγκλεισμένο σε παραφίνη. Στο μελάνωμα, προορίζεται για χρήση ως βοήθημα στην επιλογή ασθενών των οποίων οι όγκοι παρουσιάζουν μεταλλάξεις BRAF V600 για θεραπεία με Zelboraf (βεμουραφενίμπη). ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Ενεργοποίηση των μεταλλάξεων του πρωτο-ογκογονιδίου BRAF παρατηρείται σε πολλούς καρκίνους του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένου του κακοήθους μελανώματος, του ορθοκολικού καρκίνου, του καρκίνου των ωοθηκών και του θυρεοειδούς. 1,2 Μεταλλάξεις BRAF έχουν ταυτοποιηθεί σε ποσοστό 40%-60% των κακοηθών μελανωμάτων 3 και σε ποσοστό 36-46% των θηλωδών καρκινωμάτων του θυρεοειδούς. 11,12 Επίσης, μεταλλάξεις BRAF παρατηρούνται συχνά και σε καλοήθεις σπίλους, 4 υποδεικνύοντας ότι τέτοιου είδους μεταλλάξεις παρουσιάζονται σε πολύ μικρή ηλικία. Η ανακάλυψη τέτοιου είδους σωματικών μεταλλάξεων στο γονίδιο BRAF στο μελάνωμα, το PTC και σε άλλους ανθρώπινους όγκους έχει συμβάλλει στη διασαφήνιση του κύριου ρόλου της κινάσης BRAF στα σηματοδοτικά μονοπάτια που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και το θάνατο των κυττάρων. Στα φυσιολογικά κύτταρα, το BRAF είναι μέρος ενός εξαιρετικά ελεγχόμενου σηματοδοτικού μονοπατιού που επηρεάζει τις επιδράσεις των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα (όπως το EGFR) μέσω των RAS, RAF, MEK και ERK. Oι ογκογόνες μεταλλάξεις στο BRAF προκαλούν ενεργοποίηση της λειτουργίας της κινάσης, καθιστώντας το μονοπάτι RAF-MEK-ERK συνεχώς ενεργό, καθώς απουσιάζουν οι τυπικοί παράγοντες ανάπτυξης. Στην πλειοψηφία τους, οι μεταλλάξεις BRAF στο μελάνωμα, το PTC και σε άλλους ανθρώπινους όγκους παρατηρούνται στο κωδικόνιο Η βασική μετάλλαξη στο κωδικόνιο 600 είναι η μετάλλαξη V600E (GTG > GAG). Λιγότερο συχνά παρατηρούνται ορισμένες μεταλλάξεις δινουκλεοτιδίου που επηρεάζουν το κωδικόνιο 600 (V600K, [(GTG > AAG), V600R (GTG > AGG) V600E2 (GTG > GAA) και V600D (GTG > GAT)], κυρίως στο μελάνωμα και σπάνια σε άλλους καρκινικούς όγκους, όπως στον ορθοκολικό καρκίνο. Το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test είναι μια ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου, σχεδιασμένη για την ανίχνευση της παρουσίας της μετάλλαξης V600E (T1799A). ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test βασίζεται σε δύο κύριες διαδικασίες: (1) χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων για τη λήψη γονιδιωματικού DNA από μονιμοποιημένο σε φορμόλη και εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό (FFPET) και (2) ενίσχυση PCR του DNA-στόχου με χρήση ενός ζεύγους συμπληρωματικών εκκινητών και δύο ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών επισημασμένων με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές. Ένας ιχνηθέτης έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση της αλληλουχίας V600 άγριου τύπου (wild-type) του BRAF και ένας δεύτερος για την ανίχνευση της αλληλουχίας μετάλλαξης V600E. Παρέχονται δύο εξωτερικοί οροί ελέγχου ανάλυσης και το αλληλόμορφο άγριου τύπου (wild-type) λειτουργεί ως εσωτερικός ορός ελέγχου πλήρους επεξεργασίας. Προετοιμασία ειγμάτων Τα δείγματα FFPET υποβάλλονται σε επεξεργασία και το γονιδιωματικό DNA απομονώνεται χρησιμοποιώντας το cobas Κιτ Προετοιμασίας ειγμάτων DNA, για γενική χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων με βάση τη δέσμευση του νουκλεϊκού οξέος σε ίνες υάλου. Πραγματοποιείται λύση ενός αποπαραφινωμένου τμήματος 5μm δείγματος FFPET μέσω επώασης σε υψηλή θερμοκρασία με πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης/δέσμευσης που απελευθερώνει νουκλεϊκά οξέα και προστατεύει το απελευθερωμένο γονιδιωματικό DNA από DNase. Έπειτα, προστίθεται ισοπροπανόλη στο μίγμα λύσης, το οποίο στη συνέχεια υποβάλλεται σε φυγοκέντριση μέσω στήλης με ένθετο φίλτρο από ίνες υάλου. Κατά τη φυγοκέντριση, το γονιδιωματικό DNA δεσμεύεται στην επιφάνεια του φίλτρου από ίνες υάλου. Οι μη δεσμευμένες ουσίες, όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικές ακαθαρσίες, απομακρύνονται με τη φυγοκέντριση. Τα νουκλεϊκά οξέα που έχουν προσροφηθεί υποβάλλονται σε πλύση και, στη συνέχεια, σε έκλουση με υδατικό διάλυμα. Η ποσότητα γονιδιωματικού DNA προσδιορίζεται φασματοφωτομετρικά και προσαρμόζεται σε μια σταθερή συγκέντρωση για προσθήκη στο μίγμα ενίσχυσης/ανίχνευσης. Το DNA-στόχος υποβάλλεται, στη συνέχεια, σε ενίσχυση και ανίχνευση στον cobas z 480 αναλυτή χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια ενίσχυσης και ανίχνευσης που παρέχονται στο κιτ του cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. Η ενότητα «Πληροφορίες Αναθεώρησης Εγγράφου» βρίσκεται στο τέλος του παρόντος εγγράφου EL 1 Doc Rev. 7.0

2 Ενίσχυση και Ανίχνευση PCR Επιλογή Στόχου Στο cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test χρησιμοποιούνται εκκινητές που ορίζουν μια αλληλουχία 116 ζευγών βάσεων μιας περιοχής του ανθρώπινου γονιδιώματος που περιέχει τη μετάλλαξη V600E του BRAF στο εξώνιο 15. εν ενισχύεται ολόκληρο το γονίδιο BRAF. Το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση της αλλαγής νουκλεοτιδίου 1799 T>A στο γονίδιο BRAF που οδηγεί στην αντικατάσταση του γλουταμινικού οξέος με βαλίνη στο κωδικόνιο 600 (V600E). Οι ειδικοί για το στόχο και επισημασμένοι με φθορίζουσα χρωστική ιχνηθέτες TaqMan για BRAF άγριου τύπου (wild-type) και V600E, δεσμεύονται στις αλληλουχίες άγριου τύπου (wild-type) και V600E αντίστοιχα. Η αλληλουχία άγριου τύπου (wild-type) και η αλληλουχία V600E ανιχνεύονται από ειδικά οπτικά κανάλια για κάθε αλληλουχία. Ενίσχυση Στόχου Για την ενίσχυση στόχου χρησιμοποιείται η Thermus species Z05 DNA πολυμεράση. Αρχικά, το μίγμα αντίδρασης PCR θερμαίνεται για την αποδιάταξη του γονιδιωματικού DNA και την έκθεση των αλληλουχιών-στόχων του εκκινητή. Κατά την ψύξη του μίγματος, οι νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές υβριδίζονται στις αλληλουχίες DNA στόχου. Η Z05 DNA Πολυμεράση, παρουσία του δισθενούς μεταλλικού ιόντος και του πλεονάσματος dntp, επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές, συνθέτοντας με αυτόν τον τρόπο ένα δεύτερο κλώνο DNA. Έτσι ολοκληρώνεται ο πρώτος κύκλος της PCR, με τη δημιουργία ενός δίκλωνου αντιγράφου DNA της περιοχής στόχου 116 ζευγών βάσεων του γονιδίου BRAF. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για έναν αριθμό κύκλων, σε καθέναν από τους οποίους διπλασιάζεται ο αριθμός των DNA κλώνων (amplicon). Η ενίσχυση προκύπτει μόνο στην περιοχή του γονιδίου BRAF μεταξύ των εκκινητών. Αυτόματη Ανίχνευση Πραγματικού Χρόνου Το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test χρησιμοποιεί τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου. Κάθε ειδικός για το στόχο, ολιγονουκλεοτιδικός ιχνηθέτης στην αντίδραση επισημαίνεται με μια φθορίζουσα χρωστική, που χρησιμοποιείται ως χρωστική αναφοράς (reporter), και με ένα μόριο-παρεμποδιστή (quencher) που απορροφά (παρεμποδίζει) τη φθορίζουσα εκπομπή από τη χρωστική αναφοράς (reporter) σε έναν ανέπαφο ιχνηθέτη. Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου ενίσχυσης, ο συμπληρωματικός στην αλληλουχία μονόκλωνου DNA ιχνηθέτης στον κλώνο (amplicon) δεσμεύεται και, στη συνέχεια, διασπάται από την 5' έως 3' δραστηριότητα νουκλεάσης της Z05 DNA Πολυμεράσης. Όταν η χρωστική αναφοράς (reporter) διαχωριστεί από τον παρεμποδιστή (quencher) μέσω αυτής της δραστηριότητας νουκλεάσης, μπορεί να μετρηθεί φθορισμός με χαρακτηριστικό μήκος κύματος κατά τη διέγερση της χρωστικής αναφοράς (reporter) από το κατάλληλο φάσμα φωτός. ύο διαφορετικές χρωστικές αναφοράς (reporter) χρησιμοποιούνται για την επισήμανση του ειδικού για το στόχο ιχνηθέτη BRAF άγριου τύπου (wild-type) (WT, V600) και του ιχνηθέτη μετάλλαξης V600E του BRAF. Η ενίσχυση των δύο αλληλουχιών BRAF μπορεί να ανιχνευτεί ανεξάρτητα σε ένα μονό βύθισμα αντίδρασης με μέτρηση του φθορισμού στα δύο χαρακτηριστικά μήκη κύματος σε ειδικά οπτικά κανάλια. Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος-στόχου από το δείγμα επιτυγχάνεται στο cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp) 6. Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων του DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη, αλλά όχι του DNA που περιέχει θυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης dutp ως ενός από τα τριφωσφορικά νουκλεοτίδια στο αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος. Για το λόγο αυτό, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA στόχου. To ένζυμο AmpErase, που περιλαμβάνεται στο αντιδραστήριο Μίγματος Αντίδρασης, καταλύει την απομάκρυνση των καταλοίπων δεοξυουριδίνης από το DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης σε αλκαλικό ph, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase είναι αδρανές σε θερμοκρασίες πάνω από τους 55 C, δηλαδή σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης, και επομένως δεν διασπά τον κλώνο (amplicon)-στόχο EL 2 Doc Rev. 7.0

3 ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ cobas DNA Sample Preparation Kit Κιτ Προετοιμασίας ειγμάτων DNA cobas (P/N: ) DNA TLB (Ρυθμιστικό ιάλυμα Λύσης Ιστού DNA) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI Χλωριούχο Κάλιο 0,04% EDTA 0,1% Triton X-100 0,09% Αζίδιο του νατρίου PK (Πρωτεϊνάση K) Πρωτεϊνάση K (λυοφιλοποιημένη) Xn Πρωτεϊνάση K DNA SP 24 Εξετάσεις 1 x 10 ml 1 x 100 mg Επιβλαβές DNA PBB (Ρυθμιστικό ιάλυμα έσμευσης DNA σε Παραφίνη) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI 49,6% Υδροχλωρική γουανιδίνη 0,05% Ουρία 17,3% Triton X-100 Xn 49,6% (w/w) Υδροχλωρική Γουανιδίνη 1 x 10 ml Επιβλαβές WB I (Ρυθμιστικό ιάλυμα Πλύσης DNA Ι) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI 64% Υδροχλωρική γουανιδίνη Xn 64% (w/w) Υδροχλωρική Γουανιδίνη 1 x 25 ml Επιβλαβές WB II (Ρυθμιστικό ιάλυμα Πλύσης DNA ΙΙ) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI Χλωριούχο νάτριο DNA EB (Ρυθμιστικό ιάλυμα Έκλουσης DNA) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI 0,09% Αζίδιο του νατρίου FT (Σωληνάρια με φίλτρο και πώματα) CT (Σωληνάρια συλλογής) 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 1 x 25 τεμ. 3 x 25 τεμ EL 3 Doc Rev. 7.0

4 cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test BRAF (P/N: ) RXNMIX (Μίγμα Αντίδρασης) Ρυθμιστικό διάλυμα Tricine Οξικό κάλιο Υδροξείδιο του καλίου Γλυκερόλη Tween 20 EDTA 5% ιμεθυλοσουλφοξείδιο < 0,09% dntp < 0,10% Z05 DNA πολυμεράσης (μικροβιακό) < 0,10% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) < 0,003% Ολιγονουκλεοτιδικό απταμερές 0,08% Αζίδιο του νατρίου MGAC (Οξικό μαγνήσιο) Οξικό Μαγνήσιο 0,09% Αζίδιο του νατρίου BRAF OM (Μίγμα Ολιγονουκλεοτιδίων BRAF) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA 0,09% Αζίδιο του νατρίου Poly ra RNA (συνθετικό) < 0,01% Νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές BRAF < 0,01% Ιχνηθέτες BRAF με φθορίζουσα επισήμανση BRAF MUT (Ορός Ελέγχου Μετάλλαξης BRAF) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA Poly ra RNA (συνθετικό) 0,05% Αζίδιο του νατρίου < 0,001% πλασμίδιο DNA (μικροβιακό) που περιέχει αλληλουχία μετάλλαξης BRAF < 0,001% πλασμίδιο DNA (μικροβιακό) που περιέχει αλληλουχία άγριου τύπου (wild-type) του BRAF BRAF WT (Ορός Ελέγχου BRAF Άγριου Τύπου (Wild-Type)) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA Poly ra RNA (συνθετικό) 0,05% Αζίδιο του νατρίου < 0,001% πλασμίδιο DNA (μικροβιακό) που περιέχει αλληλουχία άγριου τύπου (wild-type) του BRAF DNA SD (Αραιωτικό είγματος DNA) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI 0,09% Αζίδιο του νατρίου 24 Εξετάσεις 3 x 0,16 ml 3 x 0,15 ml 3 x 0,13 ml 2 x 0,13 ml 2 x 0,13 ml 2 x 1 ml ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ A. ΓΙΑ IN VITRO ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. B. Η παρούσα εξέταση προορίζεται για χρήση με δείγματα μονιμοποιημένου σε φορμόλη και εγκλεισμένου σε παραφίνη ιστού. C. Μην εκτελείτε αναρρόφηση με πιπέτα από το στόμα. D. Απαγορεύεται η κατανάλωση τροφίμων και ποτών και το κάπνισμα στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. E. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια και DNA. F. Η απόρριψη μη χρησιμοποιημένων αντιδραστηρίων και απορριμμάτων πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. G. Μη χρησιμοποιείτε τα κιτ μετά την ημερομηνία λήξης τους. H. Μη συνδυάζετε αντιδραστήρια από διαφορετικά κιτ ή παρτίδες. I. ιατίθενται ελτία εδομένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) κατόπιν αίτησης από τα τοπικά γραφεία της Roche EL 4 Doc Rev. 7.0

5 J. Πρέπει να φοράτε γάντια και να τα αλλάζετε πριν από το χειρισμό δειγμάτων και cobas 4800 αντιδραστηρίων, ώστε να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση. K. Για να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση του κύριου μίγματος εργασίας με δείγματα DNA, η Ενίσχυση και η Ανίχνευση θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε ξεχωριστό χώρο από εκείνο στον οποίο πραγματοποιείται η Απομόνωση του DNA. Καθαρίζετε καλά το χώρο εργασίας για την ενίσχυση και ανίχνευση πριν από την προετοιμασία του κύριου μίγματος εργασίας. Για σωστό καθαρισμό, θα πρέπει να σκουπίζετε καλά όλες τις επιφάνειες, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων και των συσκευών πιπέτας, με διάλυμα υποχλωριώδους Νατρίου* 0,5% και, στη συνέχεια, με διάλυμα αιθανόλης 70%. L. Τα DNA PBB και WB I περιέχουν υδροχλωρική γουανιδίνη. Σε περίπτωση διαρροής του υγρού που περιέχει αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα, καθαρίστε με κατάλληλο εργαστηριακό απορρυπαντικό και νερό. Αν η διαρροή περιέχει δυνητικά μολυσματικούς παράγοντες, καθαρίστε αρχικά τη μολυσμένη περιοχή με εργαστηριακό απορρυπαντικό και νερό και, στη συνέχεια, με διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου*. Σε περίπτωση διαρροής πάνω στον cobas z 480 αναλυτή, ακολουθήστε τις οδηγίες στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas 4800 συστήματος. *ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα υγρά λευκαντικά οικιακής χρήσης που διατίθενται στο εμπόριο περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Με την αραίωση λευκαντικού για οικιακή χρήση σε αναλογία 1:10 παράγεται διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. M. Τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 7 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 8. N. Τα DNA TLB και DNA PBB περιέχουν Triton X-100, το οποίο είναι ερεθιστικό για τους βλεννογόνους. Αποφεύγετε την επαφή με τα μάτια, το δέρμα και τους βλεννογόνους. O. Τα DNA TLB, DNA EB, RXNMIX, MGAC, BRAF MUT, BRAF WT και DNA SD περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Κατά την απόρριψη διαλυμάτων που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα κρύου νερού για να αποφευχθεί η συσσώρευση αζιδίων. P. Η ξυλόλη είναι επικίνδυνη χημική ουσία και θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε απαγωγό εστία. Θα πρέπει να απορρίπτεται σε χημικά απόβλητα σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. Q. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης κατά το χειρισμό αντιδραστηρίων. Αποφεύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Αν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Σε περίπτωση διαρροής αντιδραστηρίου, αραιώστε με νερό πριν το σκουπίσετε. R. Όλα τα αναλώσιμα στοιχεία προορίζονται για μία χρήση. Μην τα επαναχρησιμοποιείτε. S. Μη χρησιμοποιείτε τα αναλώσιμα στοιχεία μετά την ημερομηνία λήξης τους. T. Μη χρησιμοποιείτε διάλυμα υποχλωριούχου νατρίου (λευκαντικό) για τον καθαρισμό του cobas z 480 αναλυτή. Καθαρίζετε τον cobas z 480 αναλυτή σύμφωνα με τις διαδικασίες που περιγράφονται στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas 4800 συστήματος. U. Για επιπλέον προειδοποιήσεις, προφυλάξεις και διαδικασίες σχετικά με τη μείωση του κινδύνου μόλυνσης για τον cobas z 480 αναλυτή, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas 4800 συστήματος. V. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών μιας χρήσης με ακροφύσια ελεύθερα από DNase. ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ A. Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια. B. Αποθηκεύετε τα DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, FT και CT στους C. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά για έως και 8 χρήσεις για 90 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. C. Αποθηκεύετε το PK στους C. Μετά την προσθήκη αποστειρωμένου νερού χωρίς νουκλεάση στο PK, αποθηκεύετε το ανασυσταμένο PK που δεν έχει χρησιμοποιηθεί σε μερίδες των 450 µl στους -20 C. Μετά την ανασύσταση, το PK πρέπει να χρησιμοποιηθεί εντός 90 ημερών ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. D. Μετά την προσθήκη απόλυτης αιθανόλης, αποθηκεύετε τα WB I και WB II στους C. Αυτά τα ιαλύματα Εργασίας παραμένουν σταθερά για έως και 8 χρήσεις για 90 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. E. Αποθηκεύετε τα RXNMIX, MGAC, BRAF OM, BRAF MUT, BRAF WT και DNA SD στους 2-8 C. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά για έως και 4 χρήσεις για 60 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. F. Το BRAF OM και το Κύριο Μίγμα Εργασίας (το οποίο προετοιμάζεται με προσθήκη BRAF OM και MGAC στο RXNMIX) θα πρέπει να προστατεύονται από την παρατεταμένη έκθεση στο φως. G. Το Κύριο Μίγμα Εργασίας (το οποίο προετοιμάζεται με την προσθήκη BRAF OM και MGAC στο RXNMIX) πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C σε σκοτεινό χώρο. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου που έχουν προετοιμαστεί πρέπει να προστίθενται εντός 1 ώρας από την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας EL 5 Doc Rev. 7.0

6 H. Τα επεξεργασμένα δείγματα (εκχυλισμένο DNA) παραμένουν σταθερά για έως 24 ώρες στους 15 C έως 30 C, για έως 14 ημέρες στους 2 C έως 8 C, για έως 60 ημέρες στους -15 C έως -25 C ή μετά από 3 καταψύξεις-αποψύξεις όταν αποθηκεύονται στους -15 C έως -25 C. Η ενίσχυση του εκχυλισμένου DNA πρέπει να γίνεται εντός των συνιστώμενων περιόδων αποθήκευσης ή πριν από την ημερομηνία λήξης του cobas Κιτ Προετοιμασίας ειγμάτων DNA που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση του DNA, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. I. Η ενίσχυση πρέπει να ξεκινήσει εντός 1 ώρας από την προσθήκη των επεξεργασμένων δειγμάτων και ορών ελέγχου στο Κύριο Μίγμα Εργασίας (το οποίο προετοιμάζεται με προσθήκη BRAF OM και MGAC στο RXNMIX). ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ A. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Εξετάσεις Κιτ Προετοιμασίας ειγμάτων DNA cobas (P/N: ) DNA TLB (Ρυθμιστικό ιάλυμα Λύσης Ιστού DNA) PK (Πρωτεϊνάση K) DNA PBB (Ρυθμιστικό ιάλυμα έσμευσης DNA σε Παραφίνη) WB I (Ρυθμιστικό ιάλυμα Πλύσης DNA Ι) WB II (Ρυθμιστικό ιάλυμα Πλύσης DNA ΙΙ) DNA EB (Ρυθμιστικό ιάλυμα Έκλουσης DNA) FT (Σωληνάρια με φίλτρο και πώματα) CT (Σωληνάρια συλλογής) B. cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test BRAF 24 Εξετάσεις (P/N: ) RXNMIX (Μίγμα Αντίδρασης) (Πώμα με Κουμπί σε Ουδέτερο Χρώμα) MGAC (Οξικό μαγνήσιο) (Πώμα με Κίτρινο Κουμπί) BRAF OM (Μίγμα Ολιγονουκλεοτιδίων BRAF) (Μαύρο Πώμα με Λευκό Κουμπί) BRAF MUT (Ορός ελέγχου Μετάλλαξης KRAS) (Πώμα με Κόκκινο Κουμπί) BRAF WT (Ορός Ελέγχου Άγριου Τύπου (Wild-Type) του BRAF) (Πώμα με Μπλε Κουμπί) DNA SD (Αραιωτικό είγματος DNA) (Πώμα με Μοβ Κουμπί) ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Ξυλόλη (ACS, 98,5% ξυλόλη) Απόλυτη Αιθανόλη (για Μοριακή Βιολογία) Ισοπροπανόλη (ACS, 99,5%) Αποστειρωμένο Νερό Χωρίς Νουκλεάση (για Μοριακή Βιολογία) Αποστειρωμένες ορολογικές πιπέτες μίας χρήσης: 5 και 25 ml Πλάκα Μικροβυθισμάτων (Πλάκα AD) και Μεμβράνη Σφράγισης cobas 4800 Συστήματος (Roche P/N ) Ρυθμιζόμενες Συσκευές Πιπέτας*: (χωρητικότητα 10 μl, 20 µl, 200 µl και 1000 µl) με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς DNase Βοήθημα Πιπέτας (Drummond P/N: ή αντίστοιχο) Επιτραπέζια μικροφυγόκεντρος με απόδοση x g ύο (2) Μονάδες Ξηρής Θερμότητας με δυνατότητα θέρμανσης των σωληναρίων μικροφυγόκεντρου στους 56 C και 90 C** EL 6 Doc Rev. 7.0

7 Safe-Lock σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 1,5 ml, αποστειρωμένα, χωρίς RNase/DNase, τύπου PCR (Eppendorf, Αρ. Κατ ) Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού (UV-Vis) Nanodrop (Thermo Scientific ND-1000 ή ND-2000)** Αναδευτήρας τύπου Vortex** Υποδοχείς σωληναρίων μικροφυγόκεντρου Γάντια μίας χρήσης, χωρίς πούδρα Βαθμονομημένα Θερμόμετρα για Μονάδα Ξηρής Θερμότητας** Υδατόλουτρο** με δυνατότητα διατήρησης της θερμοκρασίας στους 37 C Λεπίδα μονής κόψης ή παρόμοια * Οι συσκευές πιπέτας θα πρέπει να συντηρούνται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ακροφύσια με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση, χωρίς DNase, πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου ορίζεται, για την αποφυγή της αποδόμησης και της διασταυρούμενης μόλυνσης των δειγμάτων. **Όλα τα στοιχεία εξοπλισμού θα πρέπει να συντηρούνται κατάλληλα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όργανα και Λογισμικό cobas z 480 αναλυτής Μονάδα Ελέγχου cobas 4800 SR2 Συστήματος με προεγκατεστημένο λειτουργικό σύστημα Windows XP Λογισμικό cobas 4800 SR2 Συστήματος, έκδοση 2.0 ή νεότερη Λογισμικό Πακέτου Ανάλυσης BRAF, έκδοση 1.0 ή νεότερη Συσκευή Ανάγνωσης Γραμμωτού Κώδικα, εξωτερική με USB (Roche P/N ) Εκτυπωτής HP P2055d (Roche P/N ) ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα δείγματα πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να είναι ανάλογος. A. Συλλογή ειγμάτων Τα δείγματα FFPET έχουν εγκριθεί για χρήση με το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. B. Μεταφορά ειγμάτων Η μεταφορά των δειγμάτων FFPET πρέπει να πραγματοποιείται στους C και να πληροί τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς σχετικά με τη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων 9. Γ. Αποθήκευση ειγμάτων Έχει επιβεβαιωθεί η σταθερότητα των δειγμάτων FFPET που είναι αποθηκευμένα στους C για έως και 12 μήνες μετά την ημερομηνία συλλογής. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια εκτός από τα RXNMIX, MGAC και BRAF OM πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. Τα RXN MIX, MGAC και BRAF OM πρέπει να λαμβάνονται απευθείας από θερμοκρασία αποθήκευσης 2-8 C για την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Στο cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο τμήματα FFPET μελανώματος και PTC πάχους 5 µm με τουλάχιστον 50% καρκινικά κύτταρα. Οποιοδήποτε δείγμα διαθέτει κάτω από 50% καρκινικά κύτταρα θα πρέπει να υποβάλλεται σε μακροεκτομή πριν από την αποπαραφίνωση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας του cobas z 480 αναλυτή, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas 4800 συστήματος. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι μονάδες ξηρής θερμότητας με δυνατότητα θέρμανσης των σωληναρίων μικροφυγόκεντρου θα πρέπει να ενεργοποιούνται και να ρυθμίζονται σε θερμοκρασία 56 C και 90 C. Μέγεθος ανάλυσης Το κιτ του cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test έχει σχεδιαστεί για ανάλυση 3 δειγμάτων το λιγότερο συν τους ορούς ελέγχου έως 24 δειγμάτων το μέγιστο συν τους ορούς ελέγχου. Είναι δυνατή η ανάλυση λιγότερων από 3 δειγμάτων συν τους ορούς ελέγχου, ωστόσο, μπορεί ο όγκος των αντιδραστηρίων να μην είναι επαρκής για την ανάλυση συνολικά 24 δειγμάτων συν τους ορούς ελέγχου με το κιτ. Το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για 8 αναλύσεις 3 δειγμάτων συν τους ορούς ελέγχου. Για κάθε ανάλυση απαιτείται ένας Ορός Ελέγχου Μετάλλαξης για το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test [BRAF MUT] και ένας Ορός Ελέγχου Άγριου Τύπου (Wild-Type) για το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test [BRAF WT] (βλ. ενότητα "Ποιοτικός έλεγχος") EL 7 Doc Rev. 7.0

8 Ροή Εργασιών ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έως και 24 δείγματα σε μια ανάλυση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για μεγιστοποίηση της χρήσης των αντιδραστηρίων, κάθε ανάλυση εξέτασης θα πρέπει να περιλαμβάνει τουλάχιστον τρία (3) δείγματα ασθενή συν τους ορούς ελέγχου. Η διαδικασία εξέτασης με το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test περιλαμβάνει χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων χρησιμοποιώντας το cobas Κιτ Προετοιμασίας ειγμάτων DNA και, στη συνέχεια, ενίσχυση/ανίχνευση στον cobas z 480 αναλυτή χρησιμοποιώντας το κιτ του cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. Το μέγεθος της ανάλυσης μπορεί να κυμαίνεται από ένα δείγμα συν τους ορούς ελέγχου έως 24 δείγματα συν τους ορούς ελέγχου. Προετοιμασία Αντιδραστηρίων 1. Εκτελέστε ανασύσταση της Πρωτεϊνάσης K (PK) προσθέτοντας 4,5 ml αποστειρωμένου νερού (τύπου PCR) στο φιαλίδιο χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη ορολογική πιπέτα 5 ml μίας χρήσης. Αναμίξτε αναστρέφοντας το φιαλίδιο 5 έως 10 φορές. Κατανέμετε 450 µl ανασυσταμένου PK σε Safe-Lock σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 1,5 ml και αποθηκεύστε στους -20 C. Εάν η Πρωτεϊνάση Κ έχει ήδη ανασυσταθεί και καταψυχθεί, αποψύξτε όσες μερίδες απαιτούνται για την επεξεργασία των δειγμάτων που πρόκειται να υποβληθούν σε ανάλυση πριν από την αποπαραφίνωση (για κάθε δείγμα απαιτούνται 70 µl ανασυσταμένου PK). 2. Όλα τα διαλύματα που αποθηκεύονται στους C θα πρέπει να είναι διαυγή. Εάν υπάρχει κατακρήμνισμα σε κάποιο αντιδραστήριο, θερμάνετε το διάλυμα σε υδατόλουτρο στους 37 C μέχρι να διαλυθεί το κατακρήμνισμα. Μη χρησιμοποιήσετε το αντιδραστήριο εάν δεν έχει διαλυθεί εντελώς το κατακρήμνισμα. 3. Προετοιμάστε το Ρυθμιστικό ιάλυμα Πλύσης DNA I (WB I) προσθέτοντας 15 ml απόλυτης αιθανόλης στη φιάλη του WB I. Αναμίξτε αναστρέφοντας τη φιάλη 5 έως 10 φορές. Σημειώστε στη φιάλη ότι έχει προστεθεί αιθανόλη και την ημερομηνία. Αποθηκεύστε το διάλυμα εργασίας WB I στους 15 C έως 30 C. 4. Προετοιμάστε το Ρυθμιστικό ιάλυμα Πλύσης DNA IΙ (WB II) προσθέτοντας 50 ml απόλυτης αιθανόλης στη φιάλη του WB II. Αναμίξτε αναστρέφοντας τη φιάλη 5 έως 10 φορές. Σημειώστε στη φιάλη ότι έχει προστεθεί αιθανόλη και την ημερομηνία. Αποθηκεύστε το διάλυμα εργασίας WB II στους 15 C έως 30 C. Αποπαραφίνωση των Τμημάτων FFPET που έχουν Τοποθετηθεί σε Αντικειμενοφόρους Πλάκες Σημείωση: Η Ξυλόλη είναι επικίνδυνη χημική ουσία. Όλα τα βήματα αποπαραφίνωσης θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε απαγωγό εστία. Βλέπε «Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις». A. Τοποθετήστε μια αντικειμενοφόρο πλάκα με τμήμα FFPET 5 µm σε δοχείο με επαρκή ποσότητα ξυλόλης, ώστε να καλύπτει τον ιστό και αφήστε να εμποτιστεί για 5 λεπτά. B. Μεταφέρετε την αντικειμενοφόρο πλάκα σε δοχείο με επαρκή ποσότητα απόλυτης αιθανόλης ώστε να καλύπτει τον ιστό και αφήστε να εμποτιστεί για 5 λεπτά. C. Αφαιρέστε την αντικειμενοφόρο πλάκα και αφήστε το τμήμα να στεγνώσει εντελώς στον αέρα (5 έως 10 λεπτά). D. Εκτελέστε μακροεκτομή εάν το δείγμα περιέχει < 50% καρκινικά κύτταρα. E. Επικολλήστε μια ετικέτα με τα αναγνωριστικά στοιχεία δείγματος σε ένα Safe-Lock σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml για κάθε δείγμα. F. Προσθέστε 180 µl DNA TLB στο επισημασμένο Safe-Lock σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml. G. Προσθέστε 70 µl ανασυσταμένου PK στο Safe-Lock σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml που περιέχει DNA TLB. H. Αποξέστε τον ιστό από την αντικειμενοφόρο πλάκα και βυθίστε στο μίγμα DNA TLB και PK. I. Προχωρήστε στο Βήμα Α της διαδικασίας Απομόνωσης DNA. Αποπαραφίνωση των Τμημάτων FFPET που δεν έχουν Τοποθετηθεί σε Αντικειμενοφόρους Πλάκες Σημείωση: Η Ξυλόλη είναι επικίνδυνη χημική ουσία. Όλα τα βήματα αποπαραφίνωσης θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε απαγωγό εστία. Βλέπε «Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις». A. Για τα δείγματα που περιέχουν < 50% καρκινικό ιστό απαιτείται μακροεκτομή. Τοποθετήστε ένα τμήμα FFPET 5 μm σε ένα Safe-Lock σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml με ετικέτα με τα αναγνωριστικά στοιχεία για κάθε δείγμα. B. Προσθέστε 500 µl ξυλόλης στο Safe-Lock σωληνάριο μικροφυγόκεντρου που περιέχει το τμήμα FFPET. C. Αναμίξτε καλά στροβιλίζοντας για 10 δευτερόλεπτα. D. Αφήστε το σωληνάριο για 5 λεπτά στους 15 C-30 C. E. Προσθέστε 500 µl απόλυτης αιθανόλης και αναμίξτε στροβιλίζοντας για 10 δευτερόλεπτα. F. Αφήστε το σωληνάριο για 5 λεπτά στους 15 C-30 C. G. Φυγοκεντρίστε στα x g έως x g για 2 λεπτά και αφαιρέστε το υπερκείμενο υγρό χωρίς να διασπάσετε το ίζημα. Απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό σε χημικά απόβλητα. H. Προσθέστε 1 ml απόλυτης αιθανόλης και στροβιλίστε για 10 δευτερόλεπτα. I. Φυγοκεντρίστε στα x g έως x g για 2 λεπτά και αφαιρέστε το υπερκείμενο υγρό χωρίς να διασπάσετε το ίζημα. Απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό σε χημικά απόβλητα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το ίζημα επιπλέει στο υπολειπόμενο υπερκείμενο υγρό, περιστρέψτε ξανά για 1 λεπτό στα x g έως x g. Αφαιρέστε το υπολειπόμενο υπερκείμενο υγρό EL 8 Doc Rev. 7.0

9 J. Αποξηράνετε το ίζημα ιστού για 10 λεπτά στους 56 C σε μονάδα θέρμανσης με τα σωληνάρια ανοικτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Βεβαιωθείτε ότι η αιθανόλη έχει εξατμιστεί πλήρως και το ίζημα είναι στεγνό πριν προχωρήσετε στο επόμενο βήμα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν είναι απαραίτητο, τα αποξηραμένα ιζήματα μπορούν να αποθηκευτούν έως και 24 ώρες στους 2 C έως 8 C. K. Εκτελέστε επαναιώρηση του ιζήματος ιστού σε 180 µl Ρυθμιστικού ιαλύματος Λύσης Ιστού DNA (DNA TLB). L. Προσθέστε 70 µl ανασυσταμένου PK. M. Προχωρήστε στο Βήμα Α της διαδικασίας Απομόνωσης DNA. Απομόνωση DNA A. Στροβιλίστε το σωληνάριο με το μίγμα δείγματος/dna TLB/PK για 30 δευτερόλεπτα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο ιστός θα πρέπει να εμβαπτίζεται πλήρως στο μίγμα DNA TLB/PK. B. Τοποθετήστε το σωληνάριο στη μονάδα ξηρής θερμότητας 56 C και επωάστε για 60 λεπτά. C. Στροβιλίστε το σωληνάριο για 10 δευτερόλεπτα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο ιστός θα πρέπει να εμβαπτίζεται πλήρως στο μίγμα DNA TLB/PK. D. Τοποθετήστε το σωληνάριο στη μονάδα ξηρής θερμότητας 90 C και επωάστε για 60 λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά την επώαση, προετοιμάστε τον απαιτούμενο αριθμό σωληναρίων με φίλτρο (FT) με πώματα με μεντεσέ τοποθετώντας τα στα σωληνάρια συλλογής (CT) και επισημαίνοντας κάθε FT/CT με την κατάλληλη σήμανση στο πώμα κάθε FT. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για κάθε δείγμα απαιτούνται 1 FT, 3 CT και ένα σωληνάριο έκλουσης (σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά την επώαση, επισημάνετε τον απαιτούμενο αριθμό σωληναρίων έκλουσης (σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml) με την κατάλληλη σήμανση δείγματος. E. Αφήστε το σωληνάριο να κρυώσει σε θερμοκρασία 15 C έως 30 C. Μετά την ψύξη, εκτελέστε παλμική φυγοκέντριση των σωληναρίων για τη συλλογή περιττού υγρού από το πώμα. F. Προσθέστε 200 µl DNA PBB και αναμίξτε εκτελώντας αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα 3 φορές. G. Επωάστε το σωληνάριο στους 15 C έως 30 C για 10 λεπτά. H. Προσθέστε 100 µl ισοπροπανόλης σε κάθε σωληνάριο και αναμίξτε το προϊόν της λύσης εκτελώντας αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα 3 φορές. I. Μεταφέρετε όλα τα προϊόντα λύσης στην κατάλληλα επισημασμένη μονάδα FT/CT. J. Φυγοκεντρίστε τις μονάδες FT/CT στα x g για 1 λεπτό. K. Τοποθετήστε κάθε FT σε νέο CT. Απορρίψτε το επεξεργασμένο υγρό από το παλιό CT σε χημικά απόβλητα και απορρίψτε κατάλληλα το παλιό CT. L. Προσθέστε 500 µl WB I εργασίας στο FT. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η προετοιμασία του WB I εργασίας περιγράφεται στην ενότητα «Προετοιμασία Αντιδραστηρίων». M. Φυγοκεντρίστε τις μονάδες FT/CT στα x g για 1 λεπτό. N. Απορρίψτε το επεξεργασμένο υγρό σε κάθε CT σε χημικά απόβλητα. Τοποθετήστε το FT ξανά στο ίδιο CT. O. Προσθέστε 500 µl WB II εργασίας στο FT. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η προετοιμασία του WB II εργασίας περιγράφεται στην ενότητα «Προετοιμασία Αντιδραστηρίων». P. Φυγοκεντρίστε τις μονάδες FT/CT στα x g για 1 λεπτό. Q. Τοποθετήστε το FT σε νέο CT. Απορρίψτε το επεξεργασμένο υγρό από το παλιό CT σε χημικά απόβλητα και απορρίψτε κατάλληλα το χρησιμοποιημένο CT. R. Φυγοκεντρίστε τις μονάδες FT/CT στα x g έως x g για 1 λεπτό για να στεγνώσετε τη μεμβράνη φίλτρου. S. Τοποθετήστε κάθε σωληνάριο FT σε ένα σωληνάριο έκλουσης (σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml) το οποίο είναι ήδη επισημασμένο με την ταυτότητα δείγματος. Απορρίψτε το επεξεργασμένο υγρό από το παλιό CT σε χημικά απόβλητα και απορρίψτε κατάλληλα το χρησιμοποιημένο CT. T. Προσθέστε 100 µl DNA EB στο κέντρο της μεμβράνης FT χωρίς να αγγίξετε τη μεμβράνη FT. U. Επωάστε το FT με σωληνάριο έκλουσης στους 15 C έως 30 C για 5 λεπτά. V. Φυγοκεντρίστε το FT με σωληνάριο έκλουσης στα x g για 1 λεπτό, ώστε να συγκεντρωθεί το έκλουσμα στο σωληνάριο έκλουσης (ήδη επισημασμένο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml). Απορρίψτε κατάλληλα το χρησιμοποιημένο FT. Το έκλουσμα είναι το Αρχικό δείγμα DNA. W. Κλείστε τα πώματα στα σωληνάρια έκλουσης. Προχωρήστε στο Βήμα A στην ενότητα «Ποσοτικοποίηση DNA». ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ποσοτικοποίηση DNA θα πρέπει να πραγματοποιείται αμέσως μετά τη διαδικασία απομόνωσης DNA και πριν από την αποθήκευση EL 9 Doc Rev. 7.0

10 Ποσοτικοποίηση DNA: A. Αναμίξτε κάθε αρχικό δείγμα DNA στροβιλίζοντας για 5 δευτερόλεπτα πριν από την ποσοτικοποίηση. B. Εκτελέστε ποσοτικοποίηση DNA χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού Nanodrop (ND-1000 ή ND-2000) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Χρησιμοποιήστε DNA EB ως τυφλό για το όργανο. Απαιτείται ο μέσος όρος 2 τιμών. Η απόκλιση μεταξύ των δύο μετρήσεων δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ± 10% όταν οι τιμές συγκέντρωσης DNA είναι 20,0 ng/µl. Για τιμές συγκέντρωσης DNA < 20,0 ng/µl, η απόκλιση μεταξύ των δύο μετρήσεων δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα ± 2,0 ng/µl. C. Η συγκέντρωση στο αρχικό δείγμα DNA πρέπει να είναι 5 ng/µl για να είναι δυνατή η εκτέλεση του cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κάθε αρχικό δείγμα DNA πρέπει να διαθέτει ελάχιστη συγκέντρωση 5 ng/µl για να είναι δυνατή η εκτέλεση του cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. Εάν η συγκέντρωση σε ένα αρχικό δείγμα DNA είναι < 5 ng/µl, θα πρέπει να επαναλάβετε τη διαδικασία Απομόνωσης DNA για το δείγμα αυτό χρησιμοποιώντας δύο τμήματα FFPET 5 µm. Προχωρήστε στο Βήμα Α της ενότητας «Αποπαραφίνωση των Τμημάτων FFPET που έχουν Τοποθετηθεί σε Αντικειμενοφόρους Πλάκες» ή στο Βήμα Α της ενότητας «Αποπαραφίνωση των Τμημάτων FFPET που δεν έχουν Τοποθετηθεί σε Αντικειμενοφόρους Πλάκες» συνδυάζοντας τον ιστό και από τις δύο πλάκες/τμήματα σε ένα σωληνάριο. Προχωρήστε στη διαδικασία Απομόνωσης DNA. Εάν η συγκέντρωση στο αρχικό δείγμα DNA εξακολουθεί να είναι < 5 ng/µl, μπορεί να χρειαστεί να ζητήσετε ένα άλλο τμήμα δείγματος FFPET από το παραπέμπον κλινικό τμήμα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα επεξεργασμένα δείγματα (εκχυλισμένο DNA) παραμένουν σταθερά για έως 24 ώρες στους 15 C έως 30 C, για έως 14 ημέρες στους 2 C έως 8 C, για έως 60 ημέρες στους -15 C έως -25 C ή μετά από 3 καταψύξεις-αποψύξεις όταν αποθηκεύονται στους -15 C έως -25 C. Η ενίσχυση του εκχυλισμένου DNA πρέπει να γίνεται εντός των συνιστώμενων περιόδων αποθήκευσης ή πριν από την ημερομηνία λήξης του cobas Κιτ Προετοιμασίας ειγμάτων DNA που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση του DNA, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση του κύριου μίγματος εργασίας με δείγματα DNA, η Ενίσχυση και η Ανίχνευση θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε ξεχωριστό χώρο από εκείνο στον οποίο πραγματοποιείται η Απομόνωση του DNA. Καθαρίζετε καλά το χώρο εργασίας για την ενίσχυση και ανίχνευση πριν από την προετοιμασία του κύριου μίγματος εργασίας. Για σωστό καθαρισμό, θα πρέπει να σκουπίζετε καλά όλες τις επιφάνειες, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων και των συσκευών πιπέτας, με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5% και, στη συνέχεια, με διάλυμα αιθανόλης 70%. Τα υγρά λευκαντικά οικιακής χρήσης που διατίθενται στο εμπόριο περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Με την αραίωση λευκαντικού για οικιακή χρήση σε αναλογία 1:10 παράγεται διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. Ρύθμιση Οργάνου: Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas 4800 Οργάνου για λεπτομερείς οδηγίες σχετικά με τη ρύθμιση του cobas z 480 αναλυτή. Ρύθμιση Εντολής Εξέτασης: Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas 4800 Συστήματος για το cobas BRAF V600 Mutation Test (Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas BRAF) για λεπτομερείς οδηγίες σχετικά με τα βήματα της ροής εργασιών BRAF. Υπολογισμός Αραίωσης του Αρχικού είγματος DNA: Για κάθε δείγμα εκτελείται μόνο μία ενίσχυση/ανίχνευση, χρησιμοποιώντας 25 µl αραίωσης 5 ng/µl αρχικού δείγματος DNA (συνολικά 125 ng). Στις παρακάτω οδηγίες περιγράφεται ο τρόπος προετοιμασίας τουλάχιστον 35 µl αραιωμένου αρχικού δείγματος DNA στα 5 ng/µl, ανάλογα με την αρχική συγκέντρωση του αρχικού δείγματος DNA. Με τον τρόπο αυτό διασφαλίζεται ότι για κάθε δείγμα χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 5 µl αρχικού δείγματος DNA για την αποφυγή απόκλισης που μπορεί να προκύψει κατά την έγχυση με πιπέτα μικρότερων όγκων δείγματος. Υπολογισμός Αραίωσης για Συγκεντρώσεις Αρχικού είγματος DNA από 5 ng/µl έως 35 ng/µl ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αρχικά δείγματα DNA θα πρέπει να αραιώνονται αμέσως πριν από την ενίσχυση και ανίχνευση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για κάθε δείγμα εκτελείται μόνο μία ενίσχυση/ανίχνευση, χρησιμοποιώντας 25 µl αραίωσης 5 ng/µl αρχικού δείγματος DNA (συνολικά 125 ng). A. Για κάθε δείγμα, προσδιορίστε την ποσότητα αρχικού δείγματος DNA που απαιτείται χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: Απαιτούμενος όγκος αρχικού δείγματος DNA = (35 µl x 5 ng/µl) / συγκέντρωση αρχικού δείγματος DNA σε ng/µl B. Για κάθε δείγμα, προσδιορίστε την ποσότητα Αραιωτικού είγματος DNA (DNA SD) που απαιτείται χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: Όγκος απαιτούμενου DNA SD σε µl = (35 µl - Όγκος απαιτούμενου αρχικού δείγματος DNA σε µl). Παράδειγμα: Συγκέντρωση αρχικού δείγματος DNA = 21 ng/µl A. Όγκος απαιτούμενου αρχικού δείγματος DNA = (35 µl x 5 ng/µl) / 21 ng/µl = 8,3 µl B. Όγκος απαιτούμενου DNA SD σε µl = (35 µl 8,3 µl) = 26,7 µl EL 10 Doc Rev. 7.0

11 Υπολογισμός Αραίωσης για Συγκεντρώσεις Αρχικού είγματος DNA > 35 ng/µl ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αρχικά δείγματα DNA θα πρέπει να αραιώνονται αμέσως πριν από την ενίσχυση και ανίχνευση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για κάθε δείγμα εκτελείται μόνο μία ενίσχυση/ανίχνευση, χρησιμοποιώντας 25 µl αραίωσης 5 ng/µl αρχικού δείγματος DNA (συνολικά 125 ng). A. Για συγκεντρώσεις αρχικού δείγματος DNA > 35 ng/µl, χρησιμοποιήστε τον παρακάτω τύπο για να υπολογίσετε την ποσότητα του Αραιωτικού είγματος DNA (DNA SD) που απαιτείται για την προετοιμασία τουλάχιστον 35 µl αραιωμένου αρχικού δείγματος DNA. Με τον τρόπο αυτό διασφαλίζεται ότι για κάθε δείγμα χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 5 µl αρχικού δείγματος DNA. Όγκος DNA SD που απαιτείται σε µl = ((5 µl αρχικού δείγματος DNA x συγκέντρωση αρχικού δείγματος DNA σε ng/µl) / (5ng/µL)) 5 µl B. Χρησιμοποιήστε την υπολογισμένη τιμή όγκου DNA SD για να αραιώσετε 5 µl αρχικού δείγματος DNA. Παράδειγμα: Συγκέντρωση αρχικού δείγματος DNA = 42 ng/µl A. Όγκος DNA SD που απαιτείται σε µl = ((5 µl x 42 ng/µl) / 5 ng/µl) 5 µl = 37 µl B. Χρησιμοποιήστε την υπολογισμένη τιμή όγκου DNA SD για να αραιώσετε 5 µl αρχικού δείγματος DNA. Αραίωση ειγμάτων A. Προετοιμάστε τον κατάλληλο αριθμό Safe-Lock σωληναρίων μικροφυγόκεντρου 1,5 ml για αραιώσεις αρχικού δείγματος DNA επισημαίνοντάς τα με την κατάλληλη επισήμανση δείγματος στην περιοχή προσθήκης δείγματος. B. Χρησιμοποιώντας μια συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο ανθεκτικό στα αερολύματα, εκτελέστε έγχυση του υπολογισμένου όγκου Αραιωτικού είγματος DNA (DNA SD) σε κάθε επισημασμένο σωληνάριο δείγματος. C. Στροβιλίστε κάθε αρχικό δείγμα DNA για 10 δευτερόλεπτα. D. Χρησιμοποιώντας μια συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων, εκτελέστε προσεκτικά έγχυση του υπολογισμένου όγκου κάθε αρχικού δείγματος DNA στο κατάλληλα επισημασμένο σωληνάριο που περιέχει DNA SD. Χρησιμοποιείτε καινούριο ακροφύσιο πιπέτας για κάθε δείγμα. E. Πωματίστε και αναμίξτε κάθε αραιωμένο αρχικό δείγμα DNA στροβιλίζοντας για 10 δευτερόλεπτα. F. Αλλάξτε γάντια. Προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας (ΜΜΧ) ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Μίγμα Ολιγονουκλεοτιδίων BRAF και το Κύριο Μίγμα Εργασίας είναι ευαίσθητα στο φως. Όλα τα μίγματα BRAF OM και τα Κύρια Μίγματα Εργασίας, που έχουν ανοιχτεί, θα πρέπει να προστατεύονται από παρατεταμένη έκθεση στο φως. A. Υπολογίστε τον όγκο του RXNMIX που απαιτείται χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: Όγκος του RXNMIX που απαιτείται = (Αριθμός ειγμάτων + 2 Οροί Ελέγχου + 1) x 10 µl B. Υπολογίστε τον όγκο του BRAF OM που απαιτείται χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: Όγκος του BRAF OM που απαιτείται = (Αριθμός ειγμάτων + 2 Οροί Ελέγχου + 1) x 8 µl C. Υπολογίστε τον όγκο του MGAC που απαιτείται χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: Όγκος του MGAC που απαιτείται = (Αριθμός ειγμάτων + 2 Οροί Ελέγχου + 1) x 7 µl Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε τον Πίνακα 1 για να καθορίσετε τον όγκο κάθε αντιδραστηρίου που απαιτείται για την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας βάσει του αριθμού δειγμάτων που περιλαμβάνονται στην ανάλυση. Πίνακας 1 Όγκοι Αντιδραστηρίων που απαιτούνται για το Κύριο Μίγμα Εργασίας Αριθμός Δειγμάτων* RXN MIX 10 µl BRAF OM 8 µl MGAC 7 µl Συνολικός Όγκος σε μl * Αριθμός δειγμάτων + 2 Οροί ελέγχου + 1 D. Βγάλτε τον κατάλληλο αριθμό φιαλιδίων RXNMIX, BRAF OM και MGAC από το χώρο αποθήκευσης σε θερμοκρασία 2-8 C. Στροβιλίστε κάθε αντιδραστήριο για 5 δευτερόλεπτα, ώστε να συγκεντρωθεί το υγρό στον πυθμένα του σωληναρίου πριν από τη χρήση. Επισημάνετε ένα αποστειρωμένο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου για το κύριο μίγμα εργασίας (ΜΜΧ). E. Προσθέστε τον υπολογισμένο όγκο RXNMIX στο επισημασμένο σωληνάριο Κύριου Μίγματος Εργασίας. F. Προσθέστε τον υπολογισμένο όγκο BRAF OM στο επισημασμένο σωληνάριο Κύριου Μίγματος Εργασίας. G. Προσθέστε τον υπολογισμένο όγκο MGAC στο επισημασμένο σωληνάριο Κύριου Μίγματος Εργασίας EL 11 Doc Rev. 7.0

12 H. Στροβιλίστε το σωληνάριο για 5 δευτερόλεπτα για να διασφαλίσετε επαρκή ανάμιξη. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Χρησιμοποιείτε μόνο Πλάκα Μικροβυθισμάτων (Πλάκα AD) και Μεμβράνη Σφράγισης cobas 4800 Συστήματος (Roche P/N ). Θ. Προσθέστε προσεκτικά 25 µl Κύριου Μίγματος Εργασίας σε κάθε βύθισμα αντίδρασης της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD), το οποίο απαιτείται για την ανάλυση. Μην αφήνετε το ακροφύσιο της πιπέτας να έρθει σε επαφή με την πλάκα εκτός του βυθίσματος. Προσθήκη Ορών Ελέγχου και ειγμάτων: A. Προσθέστε 25 µl Ορού Ελέγχου BRAF MUT στο βύθισμα A01 της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) και αναμίξτε καλά χρησιμοποιώντας μια συσκευή πιπέτας για να εκτελέσετε αναρρόφηση και διοχέτευση εντός του βυθίσματος τουλάχιστον δύο φορές. B. Χρησιμοποιώντας ένα νέο ακροφύσιο πιπέτας, προσθέστε 25 µl Ορού Ελέγχου BRAF WT στο βύθισμα B01 της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) και αναμίξτε καλά χρησιμοποιώντας μια συσκευή πιπέτας για να εκτελέσετε αναρρόφηση και διοχέτευση εντός του βυθίσματος τουλάχιστον δύο φορές. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κάθε ανάλυση πρέπει να περιλαμβάνει έναν Ορό Ελέγχου BRAF MUT στη θέση A01 και έναν Ορό Ελέγχου BRAF WT στη θέση B01, διαφορετικά θα ακυρωθεί από τον cobas z 480 αναλυτή. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αλλάζετε γάντια, όπως απαιτείται, για προστασία έναντι της μόλυνσης από δείγμα σε δείγμα και της μόλυνσης από την εξωτερική πλευρά του σωληναρίου αντίδρασης PCR. C. Χρησιμοποιώντας μια συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο ανθεκτικό στα αερολύματα, προσθέστε 25 µl DNA αραιωμένου δείγματος στο κατάλληλο βύθισμα που περιέχει MMX εργασίας, ξεκινώντας από τη θέση C01 στην πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) ακολουθώντας το πρότυπο στο Σχήμα 1 που ακολουθεί. Αναμίξτε το περιεχόμενο του βυθίσματος αντίδρασης χρησιμοποιώντας τη συσκευή πιπέτας για να εκτελέσετε αναρρόφηση και διοχέτευση εντός του βυθίσματος τουλάχιστον δύο φορές. Βεβαιωθείτε ότι όλο το υγρό έχει συγκεντρωθεί στον πυθμένα του βυθίσματος. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το DNA των ειγμάτων και οι Οροί Ελέγχου θα πρέπει να προστίθενται στην πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) εντός 1 ώρας μετά την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας (MMX). Σχήμα 1 Ενδεικτική Διάταξη Πλάκας A B C D E F G H BRAF MUT BRAF WT Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα Δείγμα D. Συνεχίστε μέχρι να προστεθούν όλα τα δείγματα εξέτασης στην πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD). E. Καλύψτε την πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) με τη μεμβράνη σφράγισης (παρέχεται μαζί με τις πλάκες). Χρησιμοποιήστε τη συσκευή τοποθέτησης μεμβράνης σφράγισης για να διασφαλίσετε ότι έχει εφαρμόσει καλά στην πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD). F. Βεβαιωθείτε ότι όλο το υγρό έχει συγκεντρωθεί στον πυθμένα κάθε βυθίσματος πριν από την έναρξη της Ενίσχυσης και της Ανίχνευσης. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ενίσχυση και η ανίχνευση θα πρέπει να ξεκινήσουν εντός 1 ώρας μετά την προσθήκη του DNA είγματος και των Ορών Ελέγχου στο Κύριο Μίγμα Εργασίας EL 12 Doc Rev. 7.0

13 Έναρξη διαδικασίας PCR Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas 4800 Συστήματος για το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test για λεπτομερείς οδηγίες σχετικά με τα βήματα της ροής εργασιών BRAF. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η επαλήθευση όλων των αναλύσεων και δειγμάτων πραγματοποιείται από το cobas 4800 λογισμικό. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μια έγκυρη ανάλυση μπορεί να περιλαμβάνει έγκυρα και άκυρα αποτελέσματα δειγμάτων. Για μια έγκυρη ανάλυση, τα αποτελέσματα δειγμάτων ερμηνεύονται όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2 Ερμηνεία Αποτελεσμάτων του cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test Αποτέλεσμα του cobas 4800 Ερμηνεία BRAF V600 Mutation Test Mutation Detected Mutation Not Detected ή No Mutation Detected* Invalid Ανιχνεύτηκε Μετάλλαξη στη θέση του κωδικονίου 600 του BRAF στο εξώνιο 15 εν Ανιχνεύτηκε Μετάλλαξη στη θέση του κωδικονίου 600 του BRAF στο εξώνιο 15 Μη έγκυρο αποτέλεσμα. Επαναλάβετε την εξέταση των δειγμάτων με μη έγκυρα αποτελέσματα ακολουθώντας τις οδηγίες που παρατίθενται στην ενότητα Επανεξέταση ειγμάτων με Μη Έγκυρα Αποτελέσματα παρακάτω. Failed Η ανάλυση απέτυχε λόγω σφάλματος υλικού εξοπλισμού ή λογισμικού * Ένα αποτέλεσμα «Mutation Not Detected» ή «No Mutation Detected» δεν αποκλείει την παρουσία μετάλλαξης στη θέση του Κωδικονίου 600 του BRAF, καθώς τα αποτελέσματα εξαρτώνται από το ποσοστό μεταλλαγμένων αλληλουχιών, την επαρκή ακεραιότητα δείγματος, την απουσία αναστολέων και την επαρκή ποσότητα DNA για ανίχνευση. Επανεξέταση δειγμάτων με μη έγκυρα αποτελέσματα A. Επαναλάβετε την αραίωση του μη έγκυρου αρχικού δείγματος DNA ξεκινώντας από τις διαδικασίες Υπολογισμός Αραίωσης του Αρχικού είγματος DNA και Αραίωση ειγμάτων στην ενότητα ΕΝΙΣΧΥΣΗ και ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ. Σημείωση: Αν δεν έχει απομείνει αρκετό αρχικό δείγμα DNA για να εκτελεστεί νέα αραίωση του αρχικού δείγματος DNA, λάβετε ένα νέο τμήμα ιστού 5 µm και ξεκινήστε τη διαδικασία «Αποπαραφίνωση των Τμημάτων FFPET που έχουν Τοποθετηθεί σε Αντικειμενοφόρους Πλάκες» ή «Αποπαραφίνωση των Τμημάτων FFPET που δεν έχουν Τοποθετηθεί σε Αντικειμενοφόρους Πλάκες» και στη συνέχεια προχωρήστε στο Βήμα Β παρακάτω. B. Μετά την αραίωση του αρχικού δείγματος DNA σε 5 ng/µl που περιγράφηκε στην ενότητα Αραίωση ειγμάτων, εκτελέστε συμπληρωματική αραίωση 1:2 λαμβάνοντας 20 µl από το αραιωμένο αρχικό δείγμα DNA και προσθέτοντας 20 µl Αραιωτικού είγματος DNA (DNA SD). Γ. Συνεχίστε με την Προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας (MMX) και τα υπόλοιπα βήματα της διαδικασίας ενίσχυσης και ανίχνευσης. Σημείωση: Αν το δείγμα εξακολουθεί να μην είναι έγκυρο μετά την επανεξέταση σε αραίωση 1:2, επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία εξέτασης για το συγκεκριμένο δείγμα, ξεκινώντας με Αποπαραφίνωση και Απομόνωση DNA με χρήση ενός νέου τμήματος FFPET 5 μm. Η τυπική ποσότητα 25 µl DNA στα 5 ng/µl (χωρίς περαιτέρω αραίωση) θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση και την ανίχνευση. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Σε κάθε ανάλυση περιλαμβάνεται ο Ορός Ελέγχου Μετάλλαξης του cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test (BRAF MUT) και ο Ορός Ελέγχου Άγριου Τύπου (Wild-Type) (BRAF WT). Μια ανάλυση είναι έγκυρη εφόσον, τόσο το βύθισμα του Ορού Ελέγχου BRAF MUT (A01) όσο και το βύθισμα του Ορού Ελέγχου BRAF WT (B01) παρουσιάζουν κατάσταση έγκυρου ορού ελέγχου. Αν ο Ορός Ελέγχου BRAF MUT ή ο Ορός Ελέγχου BRAF WT είναι άκυρος, η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. Προετοιμάστε μια νέα αραίωση του αρχικού δείγματος DNA του δείγματος που έχει ήδη απομονωθεί, για να ετοιμάσετε μια νέα πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) με ορούς ελέγχου για ενίσχυση και ανίχνευση. Ορός Ελέγχου Μετάλλαξης BRAF Το αποτέλεσμα του Ορού Ελέγχου BRAF MUT πρέπει να είναι Valid. Αν τα αποτελέσματα του Ορού Ελέγχου BRAF MUT είναι διαρκώς μη έγκυρα, επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης. Ορός Ελέγχου BRAF Άγριου Τύπου (Wild-Type) Το αποτέλεσμα του Ορού Ελέγχου BRAF WT πρέπει να είναι Valid. Αν τα αποτελέσματα του Ορού Ελέγχου BRAF WT είναι διαρκώς μη έγκυρα, επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης EL 13 Doc Rev. 7.0

14 ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όπως συμβαίνει με όλες τις διαδικασίες εξέτασης, η ορθή εργαστηριακή πρακτική είναι απαραίτητη για τη σωστή εκτέλεση αυτής της ανάλυσης. Λόγω της υψηλής αναλυτικής ευαισθησίας της παρούσας εξέτασης, θα πρέπει να είστε ιδιαίτερα προσεκτικοί ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση των αντιδραστηρίων και των μιγμάτων ενίσχυσης. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ 1. Εξετάστε μόνο τους ενδεδειγμένους τύπους δειγμάτων. To cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test έχει εγκριθεί για χρήση μόνο με δείγματα FFPET μελανώματος και PTC. 2. Το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test έχει εγκριθεί μόνο χρησιμοποιώντας το cobas Κιτ Προετοιμασίας ειγμάτων DNA (Roche P/N: ) για εκχύλιση γονιδιωματικού DNA. 3. Η ανίχνευση μετάλλαξης εξαρτάται από τον αριθμό αντιγράφων μετάλλαξης στο δείγμα και μπορεί να επηρεαστεί από την ακεραιότητα του δείγματος, την ποσότητα απομονωμένου DNA και την ύπαρξη ουσιών που αλληλεπιδρούν. 4. Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων εξαρτάται από τις ορθές διαδικασίες σταθεροποίησης, μεταφοράς, αποθήκευσης και επεξεργασίας των δειγμάτων. Ακολουθήστε τις διαδικασίες του παρόντος Ένθετου Συσκευασίας και του Εγχειριδίου Χειριστή του cobas 4800 συστήματος. 5. Η προσθήκη του ενζύμου AmpErase στο Κύριο Μίγμα του cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test επιτρέπει την επιλεκτική ενίσχυση του DNA στόχου. Ωστόσο, για να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση των αντιδραστηρίων, απαιτούνται ορθές εργαστηριακές πρακτικές και προσεκτική τήρηση των διαδικασιών που καθορίζονται στο παρόν Ένθετο Συσκευασίας. 6. Το παρόν προϊόν πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο από προσωπικό εκπαιδευμένο στις τεχνικές PCR και στη χρήση του cobas 4800 συστήματος. 7. Μόνο το cobas 4800 σύστημα έχει εγκριθεί για χρήση με το προϊόν αυτό. Κανένα άλλο Σύστημα PCR δεν έχει εγκριθεί για χρήση με το προϊόν αυτό. 8. Λόγω εγγενών διαφορών μεταξύ των τεχνολογιών, πριν από τη μετάβαση στην επόμενη τεχνολογική μέθοδο, συνιστάται η πραγματοποίηση μελετών συσχετισμού μεθόδων από τους χειριστές στο εργαστήριο για την αξιολόγηση των τεχνολογικών διαφορών. 9. Οι επιδράσεις άλλων ενδεχόμενων μεταβλητών, όπως οι μεταβλητές σταθεροποίησης δείγματος, δεν έχουν αξιολογηθεί. 10. Σε σπάνιες περιπτώσεις, οι μεταλλάξεις και οι παραλλαγές στις περιοχές του γονιδίου BRAF που καλύπτονται από τους εκκινητές ή τους ιχνηθέτες, οι οποίοι χρησιμοποιούνται στο cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test, μπορεί να οδηγήσουν σε αποτυχία ενίσχυσης του αλληλόμορφου BRAF V600 ή σε αποτυχία ανίχνευσης της παρουσίας μετάλλαξης στο κωδικόνιο Η παρουσία αναστολέων PCR μπορεί να προκαλέσει ψευδώς αρνητικά ή άκυρα αποτελέσματα. 12. Το cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test παρουσιάζει περιορισμένη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με δείγματα με μεταλλάξεις εκτός V600E (V600K, V600D και V600E2). Για περισσότερες λεπτομέρειες, ανατρέξτε στην ενότητα «Μελανωμα, Αξιολόγηση Μη Κλινικής Απόδοσης». 13. Τα δείγματα FFPET που περιέχουν αποδομημένο DNA μπορεί να επηρεάσουν την ικανότητα ανίχνευσης μετάλλαξης της εξέτασης. 14. Το cobas 4800 BRAF Mutation Test είναι μια ποιοτική εξέταση. Η εξέταση δεν προορίζεται για ποσοτικές μετρήσεις μιας μετάλλαξης EL 14 Doc Rev. 7.0