ΣΟΦΙΑ Σ. ΜΠΟΥΛΕΚΟΥ Διπλωματούχος Χημικός Μηχανικός

Transcript

1 Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Πολυτεχνική Σχολή Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Εργαστήριο Τεχνολογίας Βιομηχανιών Τροφίμων και Αγροτικών Βιομηχανιών ΣΟΦΙΑ Σ. ΜΠΟΥΛΕΚΟΥ Διπλωματούχος Χημικός Μηχανικός ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΤΗΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΠΕΡΥΨΗΛΗΣ ΥΔΡΟΣΤΑΤΙΚΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΣΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΤΗΣ ΤΟΜΑΤΑΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΕΠΙΘΥΜΗΤΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβληθείσα στο Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης Εξεταστική Επιτροπή Μ. Λιακοπούλου-Κυριακίδου, Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Επιβλέπουσα Ν. Στοφόρος, Αν. Καθηγητής Γ.Π.Α. Μέλος τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής Π. Ταούκης, Αν. Καθηγητής Ε.Μ.Π. Μέλος τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής Κ. Αδαμόπουλος, Επίκουρος Καθηγητής Α.Π.Θ. Χ. Λαζαρίδης, Καθηγητής Α.Π.Θ. Κ. Μαλλίδης, Διευθυντής Ινστιτούτου Τεχνολογίας Γεωργικών Προϊόντων ΕΘΙΑΓΕ Γ. Σακελαρόπουλος, Καθηγητής Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2010

2 Σοφία Σ. Μπουλέκου Α.Π.Θ Μελέτη της επίδρασης των παραμέτρων της διεργασίας Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης στα ένζυμα της τομάτας και εφαρμογή για την παραγωγή προϊόντων με επιθυμητά χαρακτηριστικά. ISBN «Η έγκριση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Νόμος 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2).

3 Η παρούσα διδακτορική διατριβή χρηματοδοτήθηκε από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας-Υπουργείο Ανάπτυξης (25%), την Ευρωπαϊκή Ένωση- Ευρωπαϊκό Κοινοτικό Ταμείο (75%) και τον ιδιωτικό τομέα στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης (ΠΕΝΕΔ-03ΕΔ876).

4

5 Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο τη μελέτη της κινητικής απενεργοποίησης των πηκτινολυτικών ενζύμων (Πηκτινομεθυλεστεράση και Πολυγαλακτουρονάση) προερχόμενων από διαφορετικές ποικιλίες βιομηχανικής τομάτας, σημαντικών για την ελληνική βιομηχανία, κατά την επεξεργασία τους με Υπερυψηλή Υδροστατική Πίεση (ΥΥΠ). Εφαρμογή μιας τέτοιας μελέτης αποτέλεσε ο βέλτιστος σχεδιασμός διεργασιών ΥΥΠ για την παραγωγή προϊόντων τομάτας με επιθυμητά χαρακτηριστικά. Η αξιολόγηση των βασικών ποιοτικών χαρακτηριστικών ενός προϊόντος τομάτας επεξεργασμένου με ΥΥΠ σε σύγκριση με την ποιότητα αντίστοιχου προϊόντος παραγόμενου με τη συμβατική θερμική επεξεργασία, ανέδειξε τις δυνατότητες και τα πλεονεκτήματα που προσφέρει η νέα αυτή τεχνολογία στην ποιότητα των προϊόντων τομάτας. Η παρούσα διατριβή διαρθρώνεται σε 6 κεφάλαια. Στο πρώτο κεφάλαιο περιγράφονται κάποια βασικά στοιχεία για την τομάτα και τα προϊόντα της, καθώς και η μεθοδολογία παραγωγής τοματοπολτού που ακολουθείται στη βιομηχανική πρακτική. Στο δεύτερο κεφάλαιο πραγματοποιείται εκτενής ανασκόπηση της βιβλιογραφίας, σχετικής με τα πηκτινικά υποστρώματα και τα πηκτινολυτικά ένζυμα των τροφίμων, δίνοντας έμφαση στην περίπτωση της τομάτας και το ρόλο τους στην ποιότητα των προϊόντων της. Στο τρίτο κεφάλαιο περιγράφεται αναλυτικά η τεχνολογία της ΥΥΠ, που αποτελεί βασικό αντικείμενο μελέτης της διατριβής. Στο ίδιο κεφάλαιο γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση όσον αφορά στην επίδραση της ΥΥΠ στα ένζυμα και τους μηχανισμούς απενεργοποίησής τους. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στα πηκτινολυτικά ένζυμα, ενώ εξετάζεται λεπτομερώς η μεθοδολογία μοντελοποίησης των δεδομένων κινητικών απενεργοποίησης. Ο σχεδιασμός των πειραμάτων καθώς και τα υλικά και μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν περιγράφονται στο τέταρτο κεφάλαιο της διατριβής. Στο πέμπτο κεφάλαιο ακολουθεί η περιγραφή και ο σχολιασμός των αποτελεσμάτων, ενώ στο έκτο κεφάλαιο παρουσιάζονται τα βασικά συμπεράσματα και οι ανάγκες για μελλοντική έρευνα που προέκυψαν από την παρούσα διατριβή. i

6 Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας Γεωργικών Προϊόντων του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. στη Λυκόβρυση Αττικής, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Τεχνολογίας Βιομηχανιών Τροφίμων και Αγροτικών Βιομηχανιών του τμήματος Χημικών Μηχανικών του Α.Π.Θ. και το Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων της σχολής Χημικών Μηχανικών του Ε.Μ.Π. Σε αυτό το σημείο θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Νικόλαο Στοφόρο για την επίβλεψη της παρούσας διατριβής. Αν και η απόσταση έκανε τη συνεργασία μας λίγο πιο δύσκολη, η θέληση, η καλή διάθεση και η αγάπη του για την επιστήμη κατάφερε να εκμηδενίσει κάθε εμπόδιο. Τον ευχαριστώ για τον πολύτιμο χρόνο που μου αφιέρωσε τα τελευταία τέσσερα χρόνια προσφέροντάς μου σημαντικές γνώσεις και συμβουλές τόσο σε επιστημονικό όσο και σε προσωπικό επίπεδο. Ευχαριστώ θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Ε.Μ.Π. κ. Πέτρο Ταούκη για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, τη στήριξη που μου παρείχε κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής και τις συμβουλές του. Περισσότερο όμως τον ευχαριστώ γιατί μου έδωσε την ευκαιρία να βιώσω καταστάσεις που με έκαναν πιο δυνατή και να γνωρίσω ανθρώπους που σήμερα βρίσκομαι στην ευχάριστη θέση να αναφέρω και να ευχαριστώ. Ευχαριστώ το Διευθυντή του Ινστιτούτου Τεχνολογίας Αγροτικών Προϊόντων του ΕΘΙΑΓΕ κ. Κωνσταντίνο Μαλλίδη για τη συμμετοχή του στη συμβουλευτική επιτροπή, τη φιλοξενία του στο χώρο του Ινστιτούτου, τις συμβουλές του και την υποστήριξή του στην εκπόνηση της διατριβής μου. Επίσης, ευχαριστώ τους κ. Φώτη Σαμαρά και κ. Γιάννη Κουμπέτσο, η βοήθεια των οποίων στην επίλυση τεχνικών προβλημάτων της μονάδας Υπερυψηλής Πίεσης ήταν πολύ σημαντική στις κρίσιμες στιγμές της πειραματικής διαδικασίας της διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την καθηγήτρια κ. Μαρία Λιακοπούλου- Κυριακίδου, η οποία δέχθηκε να αναλάβει την επίβλεψη της παρούσας διατριβής τους τελευταίους μήνες εκπόνησής της. Επίσης ευχαριστώ τον καθηγητή κ. Γ. Σακελλαρόπουλο, τον επίκουρο καθηγητή κ. Κ. Αδαμόπουλο και τον καθηγητή Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ κ. Χ. Λαζαρίδη για τη συμμετοχή τους στην επταμελή εξεταστική επιτροπή. ii

7 Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στη βιομηχανία επεξεργασίας τομάτας Δ. Νομικός ΑΒΕΚ. Εκτός από τη συνεισφορά της στο έργο ΠΕΝΕΔ, ως φορέας συγχρηματοδότησης, αποτέλεσε την πηγή της απαραίτητης πρώτης ύλης για τη διεξαγωγή των πειραμάτων, ενώ παράλληλα με εμπιστεύτηκε και με ενσωμάτωσε στο δυναμικό της από τα πρώτα κιόλας βήματά μου ως υποψήφια Διδάκτωρ. Το επιστημονικό και τεχνικό προσωπικό της εταιρείας μου προσέφεραν απλόχερα την τεχνογνωσία στη μεταποίηση της τομάτας, αλλά και πολύτιμες συμβουλές και πληροφορίες. Ιδιαιτέρως και εκ βαθέων θα ήθελα να ευχαριστήσω το συνάδελφο και φίλο Βαγγέλη Καϊμακάμη για την εμπιστοσύνη που έδειξε προς το πρόσωπό μου και με μύησε στον ενδιαφέροντα κόσμο της τομάτας. Η αμέριστη συμπαράστασή του και οι συμβουλές του κατά τη διάρκεια εκπόνησης αλλά κυρίως της συγγραφής της παρούσας διατριβής ήταν καταλυτικές. Ένα μεγάλο ευχαριστώ σε όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Ε.Μ.Π. για τη φιλοξενία τους, το φιλικό και ευχάριστο κλίμα που δημιούργησαν όλα αυτά τα χρόνια. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τους πολύ καλούς μου φίλους Βιργινία Γιάννου, Έφη Δερμεσονλούογλου, Δημήτρη Τσιμογιάννη, Μαρία Τσεβδού και Φανή Τσιρώνη, για την καθημερινή τους βοήθεια, τις συμβουλές τους και τη συμπαράστασή τους σε όλες τις δύσκολες και ευχάριστες στιγμές. Ευχαριστώ τον Υποψήφιο Διδάκτορα του Εργαστηρίου Τεχνολογίας Βιομηχανιών Τροφίμων και Αγροτικών Βιομηχανιών του τμήματος Χημικών Μηχανικών του Α.Π.Θ, Νίκο Τυροβούζη για την πολύτιμη βοήθειά του κατά την παραμονή μου αλλά και απουσία μου από τη Θεσσαλονίκη, τις συμβουλές του και την υποστήριξή του όποτε μου ήταν απαραίτητη. Δε θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιάς μου την πολύτιμη φίλη και συνάδελφο Ελένη Γώγου, η οποία αποτέλεσε το άλλο μου μισό ΠΕΝΕΔ. Με την Ελένη βιώσαμε και μοιραστήκαμε πολύ δύσκολες και έντονες στιγμές κατά την παράλληλη διεξαγωγή των διατριβών μας. Όταν ο εξοπλισμός της Υπερυψηλής Πίεσης προέβαλε απειλητικός στα βήματά μας, η φιλία μας και η αλληλοϋποστήριξη κατάφεραν να εκμηδενίσουν κάθε εμπόδιο. iii

8 Τέλος, το πιο μεγάλο ευχαριστώ ανήκει στους γονείς μου Σπύρο και Γεωργία, την αδερφή μου Νατάσσα και τον Άρη, που είναι συνεχώς στο πλευρό μου, μου συμπαραστέκονται και με στηρίζουν σε κάθε βήμα της ζωής μου, δίνοντάς μου ενέργεια και δύναμη να προχωρώ!!! Σοφία Μπουλέκου Θεσσαλονίκη, 2010 iv

9 Περιπλανώμενη από πόλη σε πόλη και ξεπερνώντας εμπόδια υπερυψηλών πιέσεων έφτασα ως εδώ v

10 vi

11 Περίληψη Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτελεί η μελέτη της δυνατότητας εφαρμογής της τεχνολογίας της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης (ΥΥΠ) στην παραγωγή προϊόντων τομάτας ανώτερης ποιότητας. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στα ένζυμα της τομάτας Πηκτινομεθυλεστεράση (PME) και Πολυγαλακτουρονάση (PG), η δράση των οποίων καθορίζει σε μεγάλο βαθμό τα ρεολογικά χαρακτηριστικά των προϊόντων τομάτας. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε η τομάτα Σαντορίνης ποικιλίας Cherrelino, η οποία παρουσιάζει ιδιαίτερο εμπορικό ενδιαφέρον καθώς και τα υβρίδια Oval Red και Red Sea, σημαντικά για την ελληνική βιομηχανία τομάτας. Αρχικά πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της επίδρασης της επεξεργασίας με ΥΥΠ (0,1 800 MPa) σε συνδυασμό με θερμοκρασίες 40 έως 80 C στην απενεργοποίηση των ενζύμων PME και PG χυμού τομάτας Σαντορίνης (ποικιλία Cherrelino). Η απενεργοποίηση και των δύο ενζύμων ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης σε όλες τις συνθήκες επεξεργασίας. Όσον αφορά την PME, το ένζυμο εμφανίστηκε ιδιαίτερα ανθεκτικό στην εφαρμογή πίεσης, με την πίεση και τη θερμοκρασία να έχουν ανταγωνιστική δράση. Αντιθέτως, η PG παρουσιάστηκε περισσότερο ευαίσθητη στην εφαρμογή πίεσης. Η πίεση και η θερμοκρασία έδρασαν συνεργιστικά στην απενεργοποίηση της PG σχεδόν σε όλες τις συνθήκες επεξεργασίας, εκτός από την περιοχή χαμηλών πιέσεων ( MPa) και υψηλών θερμοκρασιών (80 C), όπου παρατηρήθηκε ανταγωνιστική δράση των δύο παραμέτρων. Ακολούθως, ο χυμός επεξεργάστηκε σε επιλεγμένες συνθήκες (0,1 MPa και 80 C για 10 min, 400 MPa και 40 C για 5 min, 400 MPa και 80 C για 1 min, 800 MPa και 80 C για 1 min) και ακολούθησε μελέτη της επίδρασης των συνθηκών αυτών στα ποιοτικά του χαρακτηριστικά. Η επεξεργασία με ΥΥΠ είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του χρώματος και της περιεκτικότητας σε λυκοπένιο του χυμού. Με την επεξεργασία με ΥΥΠ επιτεύχθηκε ολική απενεργοποίηση της PG με ταυτόχρονη διατήρηση της ενεργότητας της PME. Αυτή η επιλεκτική απενεργοποίηση οδήγησε σε προϊόν με μεγαλύτερο ιξώδες. vii

12 Στη συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας με ΥΥΠ στα υπο μελέτη ένζυμα των υβριδίων βιομηχανικής χρήσης Oval Red και Red Sea. Για την κινητική μελέτη της απενεργοποίησης της PG, χυμός τομάτας επεξεργάστηκε σε διάφορες συνθήκες ΥΥΠ ( MPa) σε συνδυασμό με θερμοκρασίες C, καθώς επίσης και σε θερμοκρασίες C σε ατμοσφαιρική πίεση. Η απενεργοποίηση της PG βρέθηκε ότι ακολουθεί κινητική αντίδρασης νιοστής τάξης τόσο κατά τη θερμική επεξεργασία όσο και κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ, και για τα δύο υβρίδια βιομηχανικής τομάτας. Στην περίπτωση του υβριδίου Oval Red η τάξης της αντίδρασης υπολογίστηκε ίση με 1,48, ενώ η απενεργοποίηση της PG υβριδίου Red Sea ακολούθησε κινητική 1,82 τάξης. Η PG εμφανίστηκε ιδιαίτερα ανθεκτική στη θερμική επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση. Θερμοκρασίες έως και 70 C δεν επέφεραν μείωση στην ενεργότητα της PG προερχόμενης από το υβρίδιο Oval Red, ενώ στη θερμοκρασία των 80 C απαιτήθηκε επεξεργασία διάρκειας μιας ώρας για την απενεργοποίηση της PG σε ποσοστό περίπου 60%. Αντιθέτως η PG προερχόμενη από το υβρίδιο Red Sea εμφανίστηκε περισσότερο ευαίσθητη στη θερμική επεξεργασία. Σε αντίθεση με τη θερμική επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση, η PG εμφανίστηκε ιδιαίτερα ευαίσθητη στη συνδυασμένη εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας. Σχεδόν πλήρης απενεργοποίηση της PG παρατηρήθηκε μετά από επεξεργασία στα 400 MPa και 70 C. Αύξηση της πίεσης είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης της PG προερχόμενης από το υβρίδιο Oval Red, υποδηλώνοντας συνεργιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση του ενζύμου. Αντιθέτως, στην περίπτωση του υβριδίου Red Sea αύξηση της πίεσης από την ατμοσφαιρική στα 200 MPa και σε υψηλή θερμοκρασία επεξεργασίας (70 C) οδήγησε σε μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου, υποδηλώνοντας ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας. Η απενεργοποίηση της PME των βιομηχανικών υβριδίων μελετήθηκε σε διάφορους συνδυασμούς ΥΥΠ 100 έως 800 MPa και θερμοκρασίας C, καθώς επίσης και σε θερμοκρασίες C σε ατμοσφαιρική πίεση. Η απενεργοποίηση της PME βρέθηκε ότι ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης σε όλες τις συνθήκες επεξεργασίας και για τα δύο υβρίδια βιομηχανικής τομάτας. Η PME εμφανίστηκε viii

13 ευαίσθητη στην εφαρμογή θερμοκρασίας. Η PME υβριδίου Red Sea εμφάνισε μεγαλύτερους ρυθμούς απενεργοποίησης από την PME υβριδίου Oval Red, υποδηλώνοντας ένα πιο ευαίσθητο στη θερμική επεξεργασία ένζυμο. Σε αντίθεση με τη θερμική επεξεργασία, η PME εμφανίστηκε ιδιαίτερα ανθεκτική κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ. Ιδιαίτερα έντονες συνθήκες επεξεργασίας (800 MPa και 90 C για 12,5 min) απαιτήθηκαν για τη μερική μόνο απενεργοποίηση του ενζύμου (σε ποσοστό περίπου 70%). Αύξηση της πίεσης από την ατμοσφαιρική στα 100 MPa είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης της PME και των δύο υβριδίων, υποδεικνύοντας ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση του ενζύμου. Η PME υβριδίου Oval Red εμφάνισε μεγαλύτερους ρυθμούς απενεργοποίησης από την PME υβριδίου Red Sea. Οι κινητικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν έδειξαν ότι το ίδιο ένζυμο αλλά από διαφορετική πηγή προέλευσης παρουσίασε διαφορετική συμπεριφορά κατά την επεξεργασία. Έτσι, η PME και PG τομάτας διαφορετικών ποικιλιών επηρεάστηκαν με διαφορετικό τρόπο και σε διαφορετικό βαθμό από τις συνθήκες επεξεργασίας. Η παρατήρηση αυτή ενισχύει την ανάγκη διεξαγωγής ανάλογων μελετών σε ένα εύρος ποικιλιών τομάτας, προκειμένου να επιλεγούν οι κατάλληλες συνθήκες επεξεργασίας και να σχεδιαστεί σωστά μια διεργασία ΥΥΠ που θα επιφέρει το επιθυμητό αποτέλεσμα. Με βάση τη τεχνογνωσία που αποκτήθηκε κατά την κινητική μελέτη απενεργοποίησης των ενζύμων της τομάτας, παρήχθη ελαφρά συμπυκνωμένος χυμός τομάτας επεξεργασμένος με ΥΥΠ σε πιέσεις 250, 400, 500 και 600 MPa στους 50 C για 10 min. Η επεξεργασία πραγματοποιήθηκε σε ολόκληρο καρπό της τομάτας, πριν τη θραύση του, κάτι το οποίο δεν έχει αναφερθεί στη μέχρι τώρα βιβλιογραφία. Την παραγωγή του προϊόντος ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στα ποιοτικά του χαρακτηριστικά. Τα χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν ήταν το ιξώδες το χρώμα και η συνεκτικότητα του προϊόντος, τα οποία συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα χαρακτηριστικά ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού τομάτας που παρήχθη σύμφωνα με τη συμβατική διεργασία της θερμής και της ψυχρής θραύσης. Η επεξεργασία με ΥΥΠ δεν επηρέασε το χρώμα του παραγόμενου χυμού, σε αντίθεση με τη διεργασία της θερμής θραύσης, όπου ix

14 παρατηρήθηκε υποβάθμιση του χρώματος. Με την εφαρμογή πίεσης επιτεύχθηκε επιλεκτική απενεργοποίηση των ενζύμων PME και PG, η οποία οδήγησε σε προϊόν με μεγαλύτερο ιξώδες και συνεκτικότητα. Ωστόσο, τα αποτελέσματα του ιξώδους δε μπόρεσαν να αποδοθούν αποκλειστικά και μόνο στη δράση των ενζύμων, εφόσον ίδια ποσοστά απενεργοποίησης οδήγησαν σε μεγάλες διαφορές της συνεκτικότητας των προϊόντων, γεγονός που χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Λαμβάνοντας υπόψη τις δυνατότητες και τα πλεονεκτήματα που προσφέρει η τεχνολογία της ΥΥΠ σε σχέση με τη συμβατική θερμική διεργασία της θερμής και της ψυχρής θραύσης, όπως προέκυψαν από την παρούσα διατριβή, η ΥΥΠ προβάλει ως μια εναλλακτική μέθοδος επεξεργασίας των προϊόντων τομάτας. x

15 Aristotle University of Thessaloniki Faculty of Engineering Department of Chemical Engineering EFFECT OF HIGH PRESSURE PROCESSING ON TOMATO ENZYMES AND APPLICATION FOR THE PRODUCTION OF TOMATO PRODUCTS WITH SUPERIOR QUALITY CHARACTERISTICS Ph.D. Thesis By Sofia S. Boulekou Abstract The objective of this work was to study the application of High Hydrostatic Pressure (HHP) on quality attributes of tomato products. Textural properties of tomato fruit play an important role to the overall quality in both fresh market and processed tomatoes and can be attributed to the activity of the pectinolytic enzymes such as pectin methylestarase (PME) and polygalactouronase (PG). The effect of high hydrostatic pressure processing on the endogenous tomato enzymes, PME and PG, was kinetically studied. The enzyme inactivation kinetic study was performed using three different tomato varieties: Cherry tomatoes (Lycopersicon esculentum variety Cherrelino) and two industrial hybrids namely Oval Red and Red Sea. The inactivation of PME and PG in freshly squeezed Cherry tomato juice was studied in the pressure range of 0,1-800 MPa combined with temperatures ranging from 40 to 80 C. The decrease of enzyme activity during thermal and pressure inactivation for both PME and PG followed first-order kinetics. PME in Cherry xi

16 tomato juice was found to be pressure-stable and an antagonistic effect of pressure and temperature was observed. On the other hand, PG was more sensitive to pressure than PME. The PG inactivation rate constant increased with increasing pressure at all temperatures tested indicating a synergistic effect of pressure and temperature. The effect of HP processing on cherry tomato juice quality attributes were studied at selected processing conditions. The HP processing conditions did not significantly affect the color and lycopene content of tomato juice. Furthermore HP processing allowed total PG inactivation with concurrent remaining PME activity leading to high quality products in terms of viscosity and textural properties. The inactivation of PME and PG in tomato juice from Oval Red and Red Sea hybrids, was kinetically studied in the pressure range of 0,1-400 MPa combined with temperatures ranging from 40 to 80 C. PG inactivation in both thermal and high pressure processing deviated from 1 st order kinetics and was described by an n th order model for both tomato hybrids. PG was found to be extremely thermotolerant, 60% Oval Red PG inactivation was observed only when tomato juice was thermally treated at 80 C for one hour. Red Sea PG was found to be more temperature sensitive than Oval Red PG. On the other hand PG activity was extremely sensitive when thermal treatment was combined with pressure. HP treatment at 400 MPa combined with temperature of 70 C led to total PG inactivation. In the case of Oval Red juice a synergistic effect of pressure and temperature was observed on PG inactivation. However, according to the results an antagonistic effect of pressure and temperature was observed in pressures lower than 200 MPa combined with high temperatures (70 C) in Red Sea tomato juice. PME inactivation was kinetically studied in thermally and HP treated Oval Red and Red Sea tomato juice. Tomato juice was thermally treated in the temperature range of C. High pressure processing from 100 to 800 MPa was combined with temperature in the range of C. PME inactivation followed first order kinetics in all tested process conditions. Red Sea PME inactivation was more temperature sensitive than the PME in Oval Red tomato juice. xii

17 PME in both tomato varieties was found to be extremely pressure stable. Enzyme activity was reduced approximately to 70% only when the applied pressure reached 800 MPa and was combined with 90 C for both tomato varieties. An antagonistic effect of pressure and temperature was observed in the pressure of 0,1-100 MPa. From the overall results, it was concluded that the effect of pressure and temperature on the activity of PME and PG is strongly dependent on the tomato variety. Therefor, in order to apply HP processing in tomato products the kinetic characteristics of the specific endogenous pectinolytic enzymes for each particular product must be taken into account. Quality characteristics of slightly concentrated tomato juice produced under high pressure conditions were evaluated. Process conditions were selected according to the kinetic results of the pectinolytic enzymes. HP processing was applied to whole tomatoes at 250, 400, 500 or 600 MPa and 50 C for 10 min. The processed tomatoes were thereafter used to produce slightly concentrated tomato juice. The viscosity, consistency and color of the concentrated juice was measured and compared to the corresponding properties of tomato juice at the same concentration produced under the traditional methods of both cold and hot break. Cold break treatment and high pressure processing, at all pressure levels tested, did not affect the color of tomato juice, while during hot break a color deterioration was observed. Pressure treatment at 400, 500 and 600 MPa led to products of higher viscosity. Increase in applied pressure resulted in an increase in product viscosity and improved consistency. High pressure processing can be used for the selective inactivation of PME and PG leading to products with improved quality characteristics such as viscosity, colour and lycopene content. According to the overall results of this work HP processing could be used in order to replace the traditional industrial tomato processing methods leading to products with superior quality characteristics. xiii

18 xiv

19 Περιεχόμενα Εισαγωγή...1 Κεφάλαιο 1 Η τομάτα και τα προϊόντα της Ιστορική αναδρομή Ο καρπός της τομάτας Σύσταση της τομάτας Προϊόντα τομάτας Βιομηχανική τομάτα Παραγωγή τοματοπολτού Πλύση των τοματών Διαλογή Θραύση-Προθέρμανση Αποχύμωση Συμπύκνωση Θερμική επεξεργασία- συσκευασία Αποθήκευση Παραγωγή προϊόντων τομάτας παγκοσμίως Κεφάλαιο 2 Πηκτίνη και Πηκτινολυτικά ένζυμα Δομή και ρόλος των πηκτινών στα φρούτα και λαχανικά Αντιδράσεις διάσπασης των πηκτινών Μη ενζυμική αποικοδόμηση των πηκτινών Ενζυμική αποικοδόμηση των πηκτινών xv

20 2.3 Πηκτινολυτικά ένζυμα Πηκτινομεθυλεστεράση (PME) Πολυγαλακτουρονάση (PG) Επίδραση της θερμοκρασίας στα ένζυμα PME και PG Κινητική απενεργοποίησης ενζύμων Κινητικό μοντέλο ης n τάξης Κινητικό μοντέλο 1ης τάξης Κινητικό μοντέλο μερικής μετατροπής 1 ης τάξης Διφασικό κινητικό μοντέλο Θερμοκρασιακή εξάρτηση της σταθεράς ρυθμού απενεργοποίησης Η αρχή του χρόνου θερμικού θανάτου Τα ένζυμα της τομάτας Χαρακτηριστικά ποιότητας προϊόντων τομάτας Κεφάλαιο 3 Η Τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Εισαγωγή Περιγραφή της διεργασίας Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης (ΥΥΠ) Εξοπλισμός ΥΥΠ Εμπορικά διαθέσιμα τρόφιμα επεξεργασμένα με ΥΥΠ Βιομηχανικός εξοπλισμός ΥΥΠ Επίδραση της ΥΥΠ στις πρωτεΐνες και τα ένζυμα Γενικές αρχές για την πρωτεϊνική δομή και τα ένζυμα Επίδραση της πίεσης στα ένζυμα Μηχανισμοί απενεργοποίησης των ενζύμων με εφαρμογή πίεσης Επίδραση της πίεσης σε ένζυμα σημαντικά για τη βιομηχανία τροφίμων Επίδραση της πίεσης στα πηκτινολυτικά ένζυμα PME και PG xvi

21 3.6 Κινητική αντιδράσεων απενεργοποίησης με ΥΥΠ Μοντελοποίηση της επίδρασης της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση ενζύμων Εμπειρική προσέγγιση Θερμοδυναμική προσέγγιση Άλλες μαθηματικές προσεγγίσεις...84 Κεφάλαιο 4 Υλικά και μέθοδοι Σχεδιασμός πειραμάτων Μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας με θέρμανση και ΥΥΠ στην απενεργοποίηση των ενζύμων PME και PG και στα χαρακτηριστικά ποιότητας χυμού επιτραπέζιας τομάτας Κινητική μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας με θέρμανση και ΥΥΠ στην απενεργοποίηση των ενζύμων PME και PG διαφορετικών υβριδίων βιομηχανικής τομάτας Παραγωγή ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού από τομάτες βιομηχανικής χρήσης επεξεργασμένες τόσο με την τεχνολογία της υπερυψηλής πίεσης όσο και με τη συμβατική θερμική επεξεργασία και αξιολόγηση των ποιοτικών του χαρακτηριστικών Υλικά Πειραματική διαδικασία Θερμική επεξεργασία χυμού τομάτας Επεξεργασία με ΥΥΠ Παραγωγή ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού από τομάτες επεξεργασμένες με ΥΥΠ Αναλυτικές μέθοδοι Μέτρηση ενεργότητας της πηκτινομεθυλεστεράσης (PME) xvii

22 4.4.2 Μέτρηση ενεργότητας της πολυγαλακτουρονάσης (PG) Εκχύλιση Πολυγαλακτουρονάσης Δοκιμή ενεργότητας της πολυγαλακτουρονάσης Εναλλακτική μέθοδος μέτρησης της ενεργότητας της PG Μέτρηση ιξώδους Μέτρηση συνεκτικότητας κατά Bostwick Μέτρηση χρώματος Προσδιορισμός περιεκτικότητας σε λυκοπένιο Μέτρηση διαλυτών στερεών ( Brix) Ανάλυση δεδομένων Κεφάλαιο 5 Αποτελέσματα και Σχολιασμός Μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας με ΥΥΠ στα ένζυμα και ποιοτικά χαρακτηριστικά χυμού επιτραπέζιας τομάτας Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στα ένζυμα χυμού τομάτας Σαντορίνης Κινητική απενεργοποίησης της PME ποικιλίας Cherrelino Κινητική απενεργοποίησης της PG ποικιλίας Cherrelino Επίδραση των συνθηκών επεξεργασία στην ποιότητα χυμού τομάτας Σαντορίνης Μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στην απενεργοποίηση των ενζύμων βιομηχανικής τομάτας Κινητική μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στην PG βιομηχανικής τομάτας Θερμική απενεργοποίηση της PG βιομηχανικής τομάτας σε ατμοσφαιρική πίεση Απενεργοποίηση της PG βιομηχανικής τομάτας σε συνθήκες ΥΥΠ Κινητική μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στην PME βιομηχανικής τομάτας xviii

23 Θερμική απενεργοποίηση της PME βιομηχανικής τομάτας σε ατμοσφαιρική πίεση Απενεργοποίηση της PME βιομηχανικής τομάτας σε συνθήκες ΥΥΠ Συγκριτική μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στα ένζυμα των διαφορετικών υβριδίων τομάτας Συγκριτκά αποτελέσματα κατά τη θερμική επεξεργασία Συγκριτκά αποτελέσματα κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ Εκτίμηση της ποιότητας ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού τομάτας παραγόμενου από τομάτες επεξεργασμένες με ΥΥΠ Κεφάλαιο 6 Γενικά Συμπεράσματα και Προτάσεις Έρευνας Ονοματολογία Βιβλιογραφία xix

24 xx

25 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 1.1 Περιεκτικότητα των κυριότερων συστατικών σύνθεσης της τομάτας Πίνακας 1.2 Περιεκτικότητα καροτενοειδών στη τομάτα (mg/100 g νωπού βάρους) Πίνακας 1.3 Σημαντικότερα υβρίδια βιομηχανικής τομάτας που χρησιμοποιούνται στην ελληνική βιομηχανία μεταποίησης Πίνακας 1.4 Επεξεργασθείσα ποσότητα βιομηχανικής τομάτας (τόννοι) διεθνώς, την τετραετία Πίνακας 2.1 Κατηγορίες πηκτινασών ανάλογα με το μηχανισμό δράσης τους 32 Πίνακας 2.2 Βιοχημικές και βιοφυσικές ιδιότητες της PME φυτικής προέλευσης 35 Πίνακας 2.3 Κινητικές παράμετροι της θερμικής απενεργοποίησης της PME προερχόμενης από διάφορα φρούτα και λαχανικά Πίνακας 2.4 Δεδομένα θερμικής σταθερότητας της PG διαφόρων φρούτων και λαχανικών Πίνακας 2.5 Κινητικά δεδομένα θερμικής απενεργοποίησης της PME τομάτας 48 Πίνακας 2.6 Κινητικά δεδομένα θερμικής απενεργοποίησης της PG τομάτας Πίνακας 3.1 Εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα επεξεργασμένα με ΥΥΠ Πίνακας 3.2 Εταιρείες κατασκευής εξοπλισμού ΥΥΠ Πίνακας 3.3 Κινητικά δεδομένα απενεργοποίησης PME και PG τομάτας κατά τη συνδυασμένη εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας Πίνακας 4.1 Πειραματικές συνθήκες επεξεργασίας για την κινητική μελέτη απενεργοποίησης της PME χυμού τομάτας Πίνακας 4.2 Πειραματικές συνθήκες επεξεργασίας για την κινητική μελέτη απενεργοποίησης της PG χυμού τομάτας Πίνακας 5.1 Κινητικές παράμετροι απενεργοποίησης της PME κατά τη θερμική επεξεργασία χυμού ποικιλίας Cherrelino Πίνακας 5.2 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.3) για την απενεργοποίηση της PME ποικιλίας Cherrelino σε συνθήκες πίεσης xxi

26 0,1 800 MPa και θερμοκρασίας C για Τ ref =343,16 K (70 C) και P ref =300 MPa, (R 2 =0,870) Πίνακας 5.3 Πίνακας 5.4 Πίνακας 5.5 Πίνακας 5.6 Πίνακας 5.7 Πίνακας 5.8 Σταθερά ρυθμού απενεργοποίησης της PG ποικιλίας Cherrelino κατά τη θερμική επεξεργασία Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.7) για τη θερμική απενεργοποίηση της PG ποικιλίας Cherrelino για Τ ref =343,16 K (70 C) (R 2 =0,922) Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.8) για την απενεργοποίηση της PG χυμού τομάτας ποικιλίας Cherrelino σε συνθήκες πίεσης 0,1 600 MPa και θερμοκρασία C για Τ ref =343,16 K (70 C) και P ref =300 MPa (R 2 =0,870) Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο χρώμα και την περιεκτικότητα σε λυκοπένιο του χυμού τομάτας Σαντορίνης Εναπομένουσα δραστικότητα των PME και PG μετά από κάθε συνθήκη επεξεργασίας, εκφρασμένη σε % του ανεπεξέργαστου χυμού Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης 5.11 για τη θερμική απενεργοποίησης σε ατμοσφαιρική πίεση της PG υβριδίου Red Sea για T ref =343,16Κ (70 C). R 2 (πειραματικών σε σχέση με τις προβλεπόμενες τιμές)=0, Πίνακας 5.9 Πίνακας 5.10 Πίνακας 5.11 Κινητικές παράμετροι θερμικής απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea για n = 1,65 και T ref =343,16Κ (70 C) Μέση θερμοκρασία για κάθε χρόνο δειγματοληψίας κατά την επεξεργασία χυμού τομάτας σε πίεση 400 MPa και επιδιωκόμενη θερμοκρασία 50 C Τιμές των Ε α (kj/mol) και k T ref (x10-3 min -1 ) όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.11) για n = 1,35 και T ref = 328,16 K σε κάθε πίεση επεξεργασίας Πίνακας 5.12 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.22) για την απενεργοποίηση της PG (Oval Red) σε διάφορες συνθήκες πίεσης xxii

27 ( MPa) και θερμοκρασίας (41-75 C) για Τ ref = 333,16 K και P ref = 250 MPa. R 2 (πειραματικών σε σχέση με τις προβλεπόμενες τιμές) = 0, Πίνακας 5.13 Πίνακας 5.14 Σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Oval Red, k, (x10-3 min -1 ) όπως υπολογίστηκε από την Εξίσωση (5.10) για n =1,48 και τους διορθωμένους χρόνους διεργασιών Τιμές των Εα (kj/mol) και k T ref (x10-4 min -1 ) όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.11) για n = 1,48 και T ref = 333,16 K σε κάθε πίεση επεξεργασίας Πίνακας 5.15 Επιδιωκόμενες και μέσες τιμές θερμοκρασίας επεξεργασίας υβριδίου Red Sea σε κάθε πίεση Πίνακας 5.16 Τιμές των Ε α (kj/mol) και k Tref Πίνακας 5.17 (x10-3 min -1 ) όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.11) για n =2,42 και T ref = 343,16 K σε κάθε πίεση επεξεργασίας Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.28) για την απενεργοποίηση της PG υβριδίου Red Sea σε διάφορες συνθήκες πίεσης ( MPa) και θερμοκρασίας (41-75 C) για Τ ref =343,16 K (70 C) και P ref =300 MPa. (R 2 =0,955) Πίνακας 5.18 Σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea, k, (x10-5 min -1 ) όπως υπολογίστηκε από την Εξίσωση (5.10) για n=2,49 και τους διορθωμένους χρόνους διεργασιών Πίνακας 5.19 Τιμές των Ε α (kj/mol) και k T ref (x10-3 min -1 ) για την απενεργοποίηση της PG υβριδίου Red Sea όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.11) για n =2,49 και T ref = 343,16 K σε κάθε πίεση επεξεργασίας Πίνακας 5.20 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.28) για την απενεργοποίηση της PG υβριδίου Red Sea σε συνθήκες πίεσης 0,1 400 MPa και θερμοκρασία C για Τ ref =333,16 K (65 C) και P ref =250 MPa. R 2 =0, xxiii

28 Πίνακας 5.21 Πίνακας 5.22 Πίνακας 5.23 Πίνακας 5.24 Κινητικές παράμετροι απενεργοποίησης της PME υβριδίου Oval Red και Red Sea κατά τη θερμική επεξεργασία χυμού τομάτας για T ref =343,16 Κ (70 C) Επιδιωκόμενη και μέση τιμή θερμοκρασίας επεξεργασίας του χυμού τομάτας υβριδίων Oval Red και Red Sea σε κάθε πίεση Σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης, k (x10-2 min -1 ), της PME υβριδίου Oval Red κατά την επεξεργασία σε συνθήκες ΥΥΠ, όπως υπολογίστηκαν με προσαρμογή της Εξίσωσης (5.1) στα πειραματικά δεδομένα και τους διορθωμένους χρόνους διεργασιών Τιμές των Ε α (kj/mol) και k T ref ( x10-2 min -1 ) για την Πίνακας 5.25 Πίνακας 5.26 απενεργοποίηση της PME υβριδίου Oval Red όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.30) για T ref =343,16 K (70 C) σε κάθε πίεση επεξεργασίας Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.30) για την απενεργοποίηση της PΜΕ υβριδίου Oval Red σε διάφορες συνθήκες πίεσης (0,1 800 MPa) και θερμοκρασίας (50-91 C) για Τ ref =358,16 K (85 C) και P ref =100 MPa. R 2 (πειραματικών σε σχέση με τις προβλεπόμενες τιμές) = 0, Σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης, k (x10-2 min -1 ), της PME υβριδίου Red Sea κατά την επεξεργασία σε συνθήκες ΥΥΠ, όπως υπολογίστηκαν με προσαρμογή της Εξίσωσης (5.1) στα πειραματικά δεδομένα και τους διορθωμένους χρόνους διεργασιών Πίνακας 5.27 Τιμές των Ε α (kj/mol) και k T ref (x10-2 min -1 ) για την απενεργοποίηση της PME υβριδίου Red Sea όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.30) για T ref =343,16 K (70 C) σε κάθε πίεση επεξεργασίας Πίνακας 5.28 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.3) για την απενεργοποίηση της PΜΕ υβριδίου Red Sea σε διάφορες συνθήκες πίεσης (0,1 800 MPa) και θερμοκρασίας (50-90 C) για Τ ref =358,16 K (85 C) και P ref =100 MPa. R 2 (πειραματικών σε σχέση με τις προβλεπόμενες τιμές) = 0, xxiv

29 Πίνακας 5.29 Πίνακας 5.30 Εναπομένουσα δραστικότητα των PME και PG μετά από κάθε επεξεργασία, εκφρασμένη σε ποσοστό (%) του ανεπεξέργαστου χυμού Συνεκτικότητα κατά Bostwick και χρώμα των δειγμάτων μετά από αποθήκευσή τους σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 20 C για 5 μήνες xxv

30 xxvi

31 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 1.1 Ο καρπός της τομάτας... 8 Σχήμα 1.2 Διάγραμμα ροής παραγωγής τοματοπολτού Σχήμα 2.1 Δομή HGA όπου φαίνονται οι διαμοριακοί δεσμοί ιόντων ασβεστίου Σχήμα 2.2 Δομή RG I Σχήμα 2.3 Σχηματική παρουσίαση των πιθανών αντιδράσεων μετατροπής της πηκτίνης σε φυτικά τρόφιμα και πιθανά μονοπάτια επίδρασης στα ποιοτικά χαρακτηριστικά Σχήμα 2.4 Δράση της PME και PG στην πηκτίνη. Η PME καταλύει την απομάκρυνση μεθυλεστερικών ομάδων του γαλακτουρονικού οξέος (GalUA) της πηκτίνης. Η Endo-PG υδρολύει γλυκοζιδικούς δεσμούς στις από-μεθυλεστεροποιημένες περιοχές του HGA Σχήμα 2.5 Τρισδιάστατη δομή φυτικής πηκτινομεθυλεστεράσης όπου φαίνονται οι β-έλικες και τα β-πτυχωτά φύλλα Σχήμα 2.6 Τρισδιάστατη δομή πολυγαλακτουρονάσης Σχήμα 3.1 Σχηματική απεικόνιση της Ισοστατικής Αρχής Σχήμα 3.2 α) Άμεση και β) Έμμεση μέθοδος συμπίεσης Σχήμα 3.3 Συνολικός χρησιμοποιούμενος όγκος δοχείων πίεσης ανά βιομηχανία τροφίμων Σχήμα 3.4 Αυτοματοποιημένη μονάδα ΥΥΠ σε οριζόντια διάταξη., με μέγιστη πίεση λειτουργίας 600 MPa. Διαθέτει 2 δοχεία πίεσης όγκου 300 L το καθένα και 8 ενισχυτές πίεσης με τη δυνατότητα ανεξάρτητης λειτουργίας. Ένας κύκλος συμπίεσης, χωρίς το χρόνο αναμονής, διαρκεί περίπου 5,5 min (NC Hyperbaric, Burgos, Spain) Σχήμα 3.5 Αυτοματοποιημένη μονάδα ΥΥΠ σε κάθετη διάταξη με μέγιστη πίεση λειτουργίας 600 MPa. Διαθέτει ένα δοχείο πίεσης όγκου 215 L και έχει τη δυνατότητα επεξεργασίας έως 150 kg προϊόντος ανά κύκλο συμπίεσης. Ένας κύκλος συμπίεσης, εξαιρώντας το χρόνο xxvii

32 αναμονής, διαρκεί περίπου 4,5 min (Avure Technologies, Washington, USA) Σχήμα 3.6 Σχηματική απεικόνιση της συνεργιστικής και ανταγωνιστικής δράσης της πίεσης και της θερμοκρασίας στο ρυθμό απενεργοποίησης των PG (60 C) και PME (70 C) τομάτας Σχήμα 3.7 Κινητική απενεργοποίησης E. coli με υπερυψηλή πίεση (200 MPa, 25 C) Σχήμα 3.8 Σχηματική απεικόνιση της απενεργοποίησης της PME τομάτας όπως περιγράφεται από δύο παράλληλους μηχανισμούς, ο καθένας ακολουθώντας κινητική πρώτης τάξης με τις δικές του κινητικές παραμέτρους Σχήμα 4.1 (α) Τομάτα Σαντορίνης, ποικιλία Cherrelino, (β) υβρίδιο Red Sea και (γ) υβρίδιο Oval Red Σχήμα 4.2 Μονάδα Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Σχήμα 4.3 Συστοιχία κατακόρυφων κυλινδρικών μικροθαλάμων υπερυψηλής πίεσης όγκου 42 ml ο καθένας, που χρησιμοποιείται για κινητικές μελέτες Σχήμα 4.4 Κυλινδρικός θάλαμος υπερυψηλής πίεσης όγκου 1,5 L σε κατακόρυφη διάταξη Σχήμα 4.5 Λογισμικό μονάδας ΥΥΠ Σχήμα 4.6 Διάγραμμα ροής πειραματικής διαδικασίας παραγωγής τοματοπολτού Σχήμα 4.7 Συσκευή μέτρησης και υπολογισμός της δραστικότητας της PME (κατανάλωση NaOH 0,02 Ν συναρτήσει του χρόνου τιτλοδότησης) Σχήμα 4.8 Ηλεκτρονικό ιξωδόμετρο RHEOTEST RC1 (Medingen GmbH, Radeburg, Germany) Σχήμα 4.9 Σχηματική απεικόνιση μέτρησης της συνεκτικότητας κατά Bostwick Σχήμα 4.10 Χρωματόμετρο HunterLab Colorflex και συντεταγμένες L, a, b σε κλίμακα Hunter xxviii

33 Σχήμα 4.11 Διαθλασίμετρο χειρός Σχήμα 5.1 Απενεργοποίηση της PME ποικιλίας Cherrelino κατά την Σχήμα 5.2 επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση και διάφορες ισοθερμοκρασιακές συνθήκες ( ) 40 C, ( ) 50 C, ( ) 60 C, ( ) 65 C και ( ) 80 C. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της Εξίσωσης 5.1 σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση μεταξύ των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού θερμικής απενεργοποίησης της PME ποικιλίας Cherrelino από τη θερμοκρασία επεξεργασίας (T ref =343,16 Κ) Σχήμα 5.3 Απενεργοποίηση της PME ποικιλίας Cherrelino κατά την επεξεργασία σε σταθερή θερμοκρασία (α) 40 C και (β) 60 C και διάφορες ισοβαρείς συνθήκες Σχήμα 5.4 Απενεργοποίηση της PME ποικιλίας Cherrelino κατά την Σχήμα 5.5 επεξεργασία στους 60 C και διάφορες ισοβαρείς συνθήκες (0,1-800 MPa). Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της εξίσωσης 5.1 σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME ποικιλίας Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας, όπως προσδιορίστηκε από την Εξίσωση (5.3) Σχήμα 5.6 (α) Ιξώδες και (β) κανονικοποιημένο ιξώδες ( n / no ) μίγματος πηκτίνης-ενζύμου συναρτήσει του χρόνου μέτρησης Σχήμα 5.7 Σχήμα 5.8 Επιφάνεια που περικλείεται κάτω από τη καμπύλη μείωση του ιξώδους συναρτήσει του χρόνου μέτρησης Καμπύλη βαθμονόμησης με εμπορική PG (σε άξονες, ενεργότητα ενζύμου, Α (U/mL) και εμβαδό επιφάνειας (Area) κάτω από την καμπύλη μείωσης του ιξώδους με το χρόνο μέτρησης, R 2 =0,998) 125 xxix

34 Σχήμα 5.9 Απενεργοποίηση της PG ποικιλίας Cherrelino κατά την επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση και διάφορες ισοθερμοκρασιακές συνθήκες ( ) 40 C, ( ) 60 C, ( ) 65 C και ( ) 80 C. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της Εξίσωσης 5.1 σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου Σχήμα 5.10 Απενεργοποίηση της PG ποικιλίας Cherrelino κατά την επεξεργασία σε θερμοκρασία (α) 40 C, (β) 60 C και (γ) 80 C και διάφορες ισοβαρείς συνθήκες (0,1-400 MPa) Σχήμα 5.11 Σχήμα 5.12 Σχήμα 5.13 Σχήμα 5.14 Σχήμα 5.15 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG ποικιλίας Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας, όπως προσδιορίστηκε από την Εξίσωση (5.9) και τις τιμές του Πίνακα Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο φαινόμενο ιξώδες χυμού ποικιλίας Cherrelino (α) αμέσως μετά την επεξεργασία και (β) μετά από 90 min ενζυμικής δράσης Προσαρμογή κινητικής πρώτης τάξης (R 2 =0,872), νιοστής τάξης (R 2 =0,969) και μερικής μετατροπής (R 2 =0,924) στα πειραματικά δεδομένα απενεργοποίησης της PG σε διεργασία υπερυψηλής πίεσης Μείωση της ενεργότητας της PG υβριδίου (α) Oval Red και (β) Red Sea, συναρτήσει του χρόνου επεξεργασίας σε θερμοκρασία ( ) 50 C, ( ) 60 C, ( ) 70 C και ( ) 80 C. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της εξισωσης 5.10 σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea από τη θερμοκρασία επεξεργασίας σε ατμοσφαιρική πίεση xxx

35 Σχήμα 5.16 Σχήμα 5.17 Σχήμα 5.18 Σχήμα 5.19 Εξάρτηση της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας της PG υβριδίου Oval Red από τη θερμοκρασία και το χρόνο διεργασίας σε συνθήκες σταθερής πίεσης επεξεργασίας (α) 100 MPa, (β) 200 MPa, (γ) 300 MPa και (δ) 400 MPa Τυπικό διάγραμμα μεταβολής της πίεσης του συστήματος ΥΥΠ που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή και της θερμοκρασίας του υγρού μεταφοράς της πίεσης κατά τη συμπίεση χυμού τομάτας στα 400 MPa και ονομαστική (επιδιωκόμενη) θερμοκρασία 50 C για 6 min Θερμοκρασιακό προφίλ χυμού τομάτας κατά την επεξεργασία σε πίεση 400 MPa και επιδιωκόμενη θερμοκρασία 50 C σε χρόνο δειγματοληψίας (α) 1 min, (β) 2 min, (γ) 3 min και (δ) 6 min Η μεταβολή της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας σε μια διεργασία ΥΥΠ σε σχέση με το χρόνο διεργασίας. Στο διάγραμμα οι χρόνοι t 1 -t 4 είναι οι χρόνοι δειγματοληψίας (δηλ. οι χρόνοι παραμονής των δειγμάτων στο θάλαμο πίεσης) και οι χρόνοι t 1* -t 4 * είναι οι διορθωμένοι χρόνοι που προέκυψαν από την Εξίσωση Σχήμα 5.20 Σχήμα 5.21 Σχήμα 5.22 Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας διόρθωσης του χρόνου επεξεργασίας Σύγκριση των πειραματικών και προβλεπόμενων τιμών της ενεργότητας της PG κατά τη διάρκεια επεξεργασίας χυμού τομάτας υβριδίου Oval Red σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων ( MPa) και θερμοκρασιών (41-75 C) Εξάρτηση της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας της PG Oval Red από το διορθωμένο χρόνο διεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία και πίεση επεξεργασίας (α) 100 MPa, (β) 200 MPa, (γ) 300 MPa και (δ) 400 MPa. Οι καμπύλες αντιπροσωπεύουν την προσαρμογή της Εξ στα πειραματικά δεδομένα και οι θερμοκρασίες τη μέση τιμή της θερμοκρασίας επεξεργασίας κάθε πειράματος xxxi

36 Σχήμα 5.23 Σχήμα 5.24 Σχήμα 5.25 Σχήμα 5.26 Σχήμα 5.27 Σχήμα 5.28 Σχήμα 5.29 Σχήμα 5.30 Σχήμα 5.31 Εξάρτηση της ενέργειας ενεργοποίησης από την πίεση επεξεργασίας για την PG υβριδίου Oval Red Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Oval Red από την πίεση επεξεργασίας σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας Μείωση της εργότητας της PG υβριδίου Red Sea συναρτήσει του χρόνου κατά την επεξεργασία σε θερμοκρασίες C πίεσεις (α) 100 MPa, (β) 200 MPa, (γ) 300 MPa και (δ) 400 MPa Σύγκριση των πειραματικών και προβλεπόμενων τιμών της ενεργότητας της PG κατά την επεξεργασία χυμού τομάτας υβριδίου Red Sea σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων ( MPa) και θερμοκρασιών (41-75 C) Εξάρτηση της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας της PG Red Sea από το διορθωμένο χρόνο διεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία ίση με τη μέση τιμή της θερμοκρασίας εκτέλεσης των πειραμάτων και πίεση επεξεργασίας (α) 100 MPa, (β) 200 MPa, (γ) 300 MPa και (δ) 400 MPa. Οι καμπύλες αντιπροσωπεύουν την προσαρμογή της Εξίσωσης (5.10) στα πειραματικά δεδομένα Εξάρτηση της ενέργειας ενεργοποίησης από την πίεση επεξεργασίας για την PG υβριδίου Red Sea Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea από την πίεση επεξεργασίας σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας, όπως προσδιορίστηκε από την Εξίσωση (5.29) και τις τιμές του Πίνακα Μείωση της ενεργότητας της PME υβριδίου (α) Oval Red και (β) Red Sea, συναρτήσει του χρόνου επεξεργασίας σε θερμοκρασία ( ) 50 C, ( ) 60 C, ( ) 70 C και ( ) 80 C Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PΜΕ υβριδίου ( ) Oval Red και ( ) Red Sea από τη θερμοκρασία επεξεργασίας σε ατμοσφαιρική πίεση xxxii

37 Σχήμα 5.32 Σχήμα 5.33 Σχήμα 5.34 Σχήμα 5.35 Σχήμα 5.36 Σχήμα 5.37 Σχήμα 5.38 Σχήμα 5.39 Μείωση της ενεργότητας της PME υβριδίου Oval Red συναρτήσει του διορθωμένου χρόνου επεξεργασίας σε σταθερό χρονοθερμοκρασιακό προφίλ και πιέσεις (α) 100 MPa, (β) 600 MPa, (γ) 700 MPa και (δ) 800 MPa. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της εξίσωσης (5.1) σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου Σύγκριση των πειραματικών και προβλεπόμενων τιμών Α/Α ο της PME κατά τη διάρκεια επεξεργασίας χυμού τομάτας υβριδίου Oval Red σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων (0,1-800 MPa) και θερμοκρασιών (50-91 C) Επίδραση της πίεσης στη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PME υβριδίου Oval Red σε διαφορετικές θερμοκρασίες, όπως περιγράφηκε από την Εξίσωση (5.3) Μείωση της ενεργότητας της PME υβριδίου Red Sea συναρτήσει του διορθωμένου χρόνου επεξεργασίας σε σταθερό χρονοθερμοκρασιακό προφίλ και πιέσεις (α) 100 MPa, (β) 600 MPa, (γ) 700 MPa και (δ) 800 MPa Σύγκριση των πειραματικών και προβλεπόμενων τιμών Α/Α ο της PME κατά τη διάρκεια επεξεργασίας χυμού τομάτας υβριδίου Red Sea σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων (0,1-800 MPa) και θερμοκρασιών (50-90 C) Επίδραση της πίεσης στη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PME υβριδίου Red Sea σε διαφορετικές θερμοκρασίες, όπως περιγράφηκε από την Εξίσωση (5.33) Σύγκριση των ρυθμών απενεργοποίησης της PME κατά τη θερμική επεξεργασία χυμού τομάτας των διαφορετικών υβριδίων στους (α) 60 C και (β) 80 C Εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης της PME από τη θερμοκρασία κατά τη θερμική επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση, χυμού τομάτας των τριών υβριδίων xxxiii

38 Σχήμα 5.40 Σχήμα 5.41 Σχήμα 5.42 Σχήμα 5.43 Σχήμα 5.44 Σχήμα 5.45 Σχήμα 5.46 Σχήμα 5.47 Σχήμα 5.48 Σύγκριση των ρυθμών απενεργοποίησης της PG των τριών μελετούμενων υβριδίων κατά την επεξεργασία στους 60 C σε ατμοσφαιρική πίεση Σύγκριση των ρυθμών απενεργοποίησης των PME και PG κατά τη θερμική επεξεργασία χυμού τομάτας (α) υβριδίου Red Sea στους 70 C, (β) υβριδίου Oval Red στους 80 C και (γ) ποικιλίας Cherrelino στους 80 C Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME υβριδίου Oval Red, Red Sea και ποικιλίας Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία επεξεργασίας (α) 65 C και (β) 80 C Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Oval Red, Red Sea και ποικιλίας Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία επεξεργασίας (α) 40 C, (β) 50 C, (γ) 60 C και (δ) 70 C Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME και PG υβριδίου (α) Oval Red, (β) Red Sea και (γ) Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία Φωτογραφία υβριδίου Red Sea (α,γ) πριν την επεξεργασία και (β,δ) μετά από επεξεργασία στα 600 MPa και 50 C για 10 min Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο λόγο a/b του χρώματος του χυμού τομάτας Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο φαινόμενο ιξώδες χυμού τομάτας αμέσως μετά την επεξεργασία ( ) CB, ( ) HB, ( ) 250 MPa_50 C _10 min, ( ) 400 MPa_50 C _10 min, ( ) 500 MPa_50 C _10 min, ( ) 600 MPa_50 C _10 min Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στη συνεκτικότητα κατά Bostwick χυμού τομάτας αμέσως μετά από επεξεργασία CB, HB, (HP1) 250 MPa_50 C _10 min, (HP2) 400 MPa_50 C _10 min, (HP3) 500 MPa_50 C _10 min και (HP4) 600 MPa_50 C _10 min xxxiv

39 Σχήμα 5.49 Σύγκριση της συνεκτικότητας κατά Bostwick και της συναίρεσης ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού τομάτας επεξεργασμένου (α) στα 600 MPa και 50 C για 10 min και (β) στους 65 C για 2 min xxxv

40

41 Εισαγωγή Εισαγωγή Η τομάτα αποτελεί ένα ευρέως διαδομένο τρόφιμο, το οποίο, πέρα από τις γαστρονομικές του ιδιότητες, αποτελεί σημαντική πηγή θρεπτικών συστατικών. Μεταξύ των φρούτων και λαχανικών η τομάτα καταναλώνεται σε σημαντικές ποσότητες είτε σε νωπή μορφή είτε ως επεξεργασμένο προϊόν. Η σχετική ευκολία που παρουσιάζει ο καρπός της τομάτας στη σύνθλιψη και τη συμπύκνωση επέτρεψε την ανάπτυξη πολλών διεργασιών επεξεργασίας της, προσφέροντας στην κατανάλωση πληθώρα προϊόντων τομάτας. Έτσι, η τομάτα καταναλώνεται με τη μορφή διαφόρων προϊόντων όπως ο χυμός, ο πολτός, η σάλτσα για πίτσες και ζυμαρικά, το κέτσαπ, η αποφλοιωμένη ψιλοκομμένη τομάτα και η σκόνη τομάτας. Η αποδοχή των προϊόντων τομάτας από το καταναλωτικό κοινό σχετίζεται άμεσα με τα ποιοτικά τους χαρακτηριστικά, όπως η γεύση, το άρωμα, το χρώμα, η συνεκτικότητα και το ιξώδες. Ένα από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά ποιότητας των προϊόντων τομάτας αποτελεί το ιξώδες. Το δομικό στοιχείο που διαμορφώνει το ιξώδες είναι το κυτταρικό τοίχωμα και συγκεκριμένα η μικροδομή του. Οποιαδήποτε μεταβολή στη μικροδομή του κυτταρικού τοιχώματος αντικατοπτρίζεται σε μεταβολές του ιξώδους των προϊόντων τομάτας. Ένα από τα σημαντικότερα δομικά συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος αποτελούν οι πηκτίνες. Πρόκειται για ένα πολύπλοκο δίκτυο ένυδρων πολυσακχαριτών, το οποίο αποικοδομείται κατά την ωρίμανση και την επεξεργασία της τομάτας. Υπεύθυνα για την αποικοδόμηση του πηκτινικού δικτύου είναι τα ενδογενή ένζυμα Πηκτινομεθυλεστεράση (PME) και Πολυγαλακτουρονάση (PG). Η PME υδρολύει τις μεθυλιωμένες καρβοξυλικές ομάδες των πηκτινών παράγοντας πολυγαλακτουρονικό οξύ, το οποίο στη συνέχεια διασπάται από τη δράση της PG. Η PG υδρολύει τη διάσπαση των α-1,4 γλυκοζιδικών δεσμών του πολυγαλακτουρονικού οξέος των πηκτινών. Η συνεργιστική δράση των δύο ενζύμων έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του ιξώδους και συνεπώς την υποβάθμιση της ποιότητας των προϊόντων τομάτας. Η απενεργοποίηση των ενζύμων αυτών -1-

42 Εισαγωγή κατά την επεξεργασία της τομάτας είναι καθοριστικής σημασίας για την παραγωγή προϊόντων υψηλού ιξώδους. Ωστόσο, η μερική διατήρηση της ενεργότητας της PME μπορεί να είναι επιθυμητή, διότι τα προϊόντα δράσης της μπορούν να συνδεθούν με δισθενή ιόντα ασβεστίου και να σχηματίσουν πήγματα (gels), αυξάνοντας τη συνεκτικότητα των προϊόντων τομάτας. Σύμφωνα με τα παραπάνω, η διατήρηση της ενεργότητας της PME με ταυτόχρονη απενεργοποίησης της PG θα οδηγούσε σε παραγωγή προϊόντων τομάτας με υψηλότερο ιξώδες. Αυτή η επιλεκτική απενεργοποίηση της PG δεν μπορεί να επιτευχθεί με τις κλασικές μεθόδους θερμικής επεξεργασίας, καθώς η PME απενεργοποιείται σχετικά εύκολα με θέρμανση σε ατμοσφαιρική πίεση, σε αντίθεση με την PG, για την πλήρη απενεργοποίηση της οποίας απαιτούνται εντονότερες συνθήκες θερμικής επεξεργασίας. Σε μια τυπική βιομηχανική παραγωγή τοματοπολτού, οι ακατέργαστες τομάτες, αφού πλυθούν και απομακρυνθούν οι εμφανώς ελαττωματικοί καρποί, τεμαχίζονται. Στη συνέχεια οι τεμαχισμένοι καρποί είτε θερμαίνονται αμέσως σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 85 C, μέθοδος που είναι γνωστή ως θερμή θραύση (Hot Break), είτε θερμαίνονται σε ήπιες θερμοκρασίες (μικρότερες των 65 C), μέθοδος γνωστή ως ψυχρή θραύση (Cold Break). Κατά τη θερμή θραύση επιδιώκεται και επιτυγχάνεται πλήρης απενεργοποίηση των πηκτινολυτικών ενζύμων με αποτέλεσμα την παραγωγή συνεκτικών προϊόντων με μεγάλο ιξώδες. Αντίθετα κατά την ψυχρή θραύση, οι εφαρμοζόμενες θερμοκρασίες δεν είναι ικανές να προκαλέσουν απενεργοποίηση των ενζύμων, δίνοντας προϊόντα λιγότερο συνεκτικά και με χαμηλό ιξώδες. Ωστόσο κατά την ψυχρή θραύση παράγεται προϊόν με χρώμα και άρωμα πιο κοντά στο φυσικό χυμό. Η επιστημονική κοινότητα έχει στραφεί προς την κατεύθυνση ανάπτυξης νέων τεχνολογιών που να επιτρέπουν την επιλεκτική απενεργοποίηση των πηκτινολυτικών ενζύμων της τομάτας, διατηρώντας ταυτόχρονα αναλλοίωτα τα ποιοτικά τους χαρακτηριστικά. Η επιλεκτική αυτή αδρανοποίηση μπορεί να επιτευχθεί είτε µε καταστολή της δράσης της PG µέσω γενετικής μηχανικής του καρπού είτε µε εφαρμογή ενός συνδυασμού θέρμανσης και υψηλής υδροστατικής πίεσης (ΥΥΠ). -2-

43 Εισαγωγή Η ΥΥΠ αποτελεί μια ήπια μη θερμική τεχνολογία η οποία βρίσκει εφαρμογή τα τελευταία χρόνια σε βιομηχανική κλίμακα. Πρόκειται για μία φυσική διεργασία, η οποία βασίζεται στη στιγμιαία και ομοιόμορφη μεταφορά της πίεσης σε όλα τα σημεία του τροφίμου μέσω κάποιου υγρού μεταφοράς της πίεσης. Η χρήση υπερυψηλών πιέσεων (έως 1000 MPa) έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί απενεργοποίηση μικροοργανισμών και ενζύμων που σχετίζονται με την ποιότητα των τροφίμων, διατηρώντας ταυτόχρονα αναλλοίωτα τα ποιοτικά χαρακτηριστικά των τροφίμων, όπως το χρώμα, το άρωμα, τη γεύση και τα θρεπτικά τους συστατικά. Ο συνδυασμός της ΥΥΠ με θέρμανση (Τ< 80 C) θεωρείται ως ο πιο πιθανός τρόπος εφαρμογής της από τη βιομηχανία τροφίμων. Ένα παράδειγμα πιθανής εφαρμογής της νέας αυτής τεχνολογίας αποτελεί και η βιομηχανία τομάτας. Αντικείμενο μελέτης αρκετών ερευνητών έχει αποτελέσει η επίδραση των παραμέτρων της διεργασίας της Υπερυψηλής Πίεσης στην απενεργοποίηση των ενζύμων της τομάτας. Σύμφωνα με τα βιβλιογραφικά δεδομένα, η εφαρμογή υπερυψηλής πίεσης σε συνδυασμό με ήπια θερμική κατεργασία μπορεί να προκαλέσει απενεργοποίηση της PG, με ταυτόχρονη διατηρήρηση της ενεργότητας της PME. Οι μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί αφορούν είτε συστήματα μοντέλα είτε πραγματικό τρόφιμο, υποδεικνύοντας ένζυμα με διαφορετική εκάστοτε συμπεριφορά κατά την επεξεργασία. Ωστόσο είναι περιορισμένα τα στοιχεία που περιλαμβάνουν ένα εύρος εξεταζόμενων ποικιλιών τομάτας βιομηχανικής χρήσης. Επιπλέον, ελλιπή είναι τα βιβλιογραφικά δεδομένα που να σχετίζονται με την ποιότητα προϊόντων τομάτας επεξεργασμένων με τη τεχνολογία της ΥΥΠ. Με βάση τις ανάγκες που προκύπτουν από τα παραπάνω, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη συστηματική μελέτη της κινητικής απενεργοποίησης των ενζύμων διαφόρων ποικιλιών βιομηχανικής τομάτας, σημαντικών για την ελληνική βιομηχανία, έχοντας ως στόχο το βέλτιστο σχεδιασμό μιας διεργασίας ΥΥΠ. Η τεχνογνωσία που αποκτήθηκε από μια τέτοια μελέτη αποτέλεσε βάση για την παραγωγή τοματοπολτού επεξεργασμένου με την τεχνολογία της ΥΥΠ. Έχοντας ως στόχο την ανάδειξη των δυνατοτήτων και των πλεονεκτημάτων που προσφέρει η νέα αυτή τεχνολογία στην ποιότητα των -3-

44 Εισαγωγή προϊόντων τομάτας, έγινε αξιολόγηση των βασικών ποιοτικών χαρακτηριστικών ενός προϊόντος επεξεργασμένου με ΥΥΠ, συγκριτικά με την αντίστοιχη ποιότητα τοματοπολτού παραγόμενου με τη συμβατική θερμική επεξεργασία (Hot και Cold Break). -4-

45 Κεφάλαιο 1 Η τομάτα και τα προϊόντα της Ταξιδεύοντας από ήπειρο σε ήπειρο και ξεπερνώντας πληθώρα εθνικών προκαταλήψεων και εμποδίων, η τομάτα κατάφερε να καθιερωθεί παγκοσμίως ως κυρίαρχο λαχανικό. Σε όρους βοτανικής η τομάτα είναι φρούτο, λόγω όμως του τρόπου που χρησιμοποιείται συγκαταλέγεται στα λαχανικά, όπως συμβαίνει με το κολοκύθι, το αγγούρι, τη μελιτζάνα και την πιπεριά. Μεταξύ των λαχανικών, η τομάτα καταναλώνεται σήμερα σε τέτοιες ποσότητες που κατέχει τη δεύτερη θέση σε κατανάλωση με μόνο ανταγωνιστή της την πατάτα, ενώ υπάρχουν και χώρες όπου η τομάτα κατέχει την πρώτη θέση σε κατανάλωση (Govinden, 2001). 1.1 Ιστορική αναδρομή Η τομάτα μπήκε στη ζωή του ανθρώπου μάλλον πρόσφατα. Μέχρι τα τέλη του 18 ου αιώνα ήταν άγνωστη για πολλούς λαούς ή τη θεωρούσαν δηλητηριώδη και την είχαν στους κήπους ως καλλωπιστικό φυτό. Ο τόπος καταγωγής της τομάτας πιστεύεται ότι είναι η Νότια Αμερική, πιθανόν το Περού, όπου ακόμη και σήμερα αυτοφύονται διάφορες παραλλαγές της άγριας τομάτας (Denny, 1997). Από το Περού η άγρια τομάτα μεταφέρθηκε, μάλλον ως ζιζάνιο με σπόρους καλαμποκιού, στην Κεντρική Αμερική, ιδιαίτερα στο Μεξικό, όπου άρχισε η καλλιέργεια και η χρήση της από τους Ινδιάνους και τους Αζτέκους πριν πάρα πολλά χρόνια. Εξάλλου η ονομασία της (tomato) προέρχεται είτε από τις λέξεις xitomate ή zitotomate της γλώσσας των Αζτέκων, είτε από τη λέξη tomati της διαλέκτου Nahalt του Μεξικό (Bachau, 1981). Πιθανότατα ο τύπος τομάτας που ανέπτυξαν οι Ινδιάνοι στην Κεντρική Αμερική ήταν η μικρόκαρπη τομάτα (cherry tomato), η οποία θεωρείται και ο άμεσος πρόγονος της καλλιεργούμενης σήμερα τομάτας (Uyeshiro, 1977). -5-

46 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της Από το Μεξικό η τομάτα ήρθε στην Ευρώπη μέσω των Ισπανών εξερευνητών στις αρχές του 16 ου αιώνα. Η πρώτη βιβλιογραφική της αναφορά έγινε στο βιβλίο βοτανικής Herbal του Ιταλού Pierto Andrea Matthiolus (1554) με το όνομα pomi d oro (χρυσό μήλο). Για δύο περίπου αιώνες θεωρείτο περίεργο και επικίνδυνο είδος και την χρησιμοποιούσαν ελάχιστα μόνο στην Ισπανία, την Ιταλία και τη Γαλλία όπου έγινε δημοφιλής με το όνομα pomme d amour (μήλο της αγάπης). Οι Βόρειοι Ευρωπαίοι αντιμετώπισαν την τομάτα με πολύ σκεπτικισμό μέχρι το 18 ο αιώνα, οπότε και έγινε αναφορά για εμπορία τομάτας κυρίως σε χώρες της μεσογείου. Παρόμοια στάση και επιφυλακτικότητα υπήρξε και στη Βόρεια Αμερική, όπου η τομάτα έφτασε με τους ευρωπαίους εποίκους στα μέσα του 17 ου αιώνα. Ωστόσο η καλλιέργεια και η ευρεία χρήση της έγινε μόλις μετά τα μέσα του 18 ου αιώνα (Leoni, 1993). Μετά από μακροχρόνια περιήγησή της στο γεωγραφικό χάρτη, η τομάτα διαδόθηκε και καλλιεργήθηκε στην Ελλάδα ως κηπευτικό φυτό το 1818 (Καραουλάνης, 1991). Βοτανικά η τομάτα ανήκει στην οικογένεια των Σολανωδών (Solanaceae), τα μέλη της οποίας περιέχουν (κυρίως στα φύλλα τους) το αλκαλοειδές σολανίνη, τοξικό τόσο για τον άνθρωπο όσο και για τα ζώα. Η τομάτα περιέχει στα φύλλα της σολανίνη, στον ίδιο βαθμό που περιέχουν και τα φύλλα του καπνού, της πατάτας και άλλων φυτών της ίδιας οικογένειας. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τις άγνωστες ιδιότητες των καρπών ενός «εξωτικού» είδους, όπως θεωρείτο τότε η τομάτα, αποτέλεσαν ένα λόγο για την αντιμετώπισή της με επιφυλακτικότητα. Τον κυριότερο όμως λόγο αποτέλεσε η μεγάλη ομοιότητα της τομάτας με το φυτό Άτροπος (Atropus belladona) της ίδιας οικογένειας, το οποίο ήταν γνωστό από την αρχαιότητα για τις φαρμακευτικές και δηλητηριώδεις ιδιότητές του. Το όνομα του φυτού αυτού παραπέμπει στη Μοίρα Άτροπο των αρχαίων Ελλήνων, εκείνη που κόβει το νήμα της ζωής. Το φυτό που οφείλει τις τοξικές ιδιότητές του στην ατροπίνη, την οποία περιέχει σε όλα του τα μέρη, ήταν γνωστό στους περισσότερους λαούς και συνδεδεμένο με δηλητηριάσεις και άλλες περίεργες επιδράσεις στον άνθρωπο. Έτσι η ομοιότητα του φυτού της τομάτας με την Άτροπο στάθηκε σημαντικό εμπόδιο στην αξιοποίησή της για περίπου τρεις αιώνες. Λόγω της επιφυλακτικότητας αυτής, η τομάτα ονομάστηκε στη Γερμανία «ροδάκινο του -6-

47 Ιστορική αναδρομή λύκου», κάτι που κατέγραψε ο Λινναίος τον 18 ο αιώνα, όταν έδωσε στην τομάτα το επιστημονικό όνομα Lycopersicon esculentum, που σημαίνει εδώδιμο ροδάκινο του λύκου (Leoni, 1993). Κατά καιρούς ήρθαν στην Ευρώπη διάφοροι τύποι τομάτας, οι οποίοι αποτέλεσαν τη βάση για τη δημιουργία βελτιωμένων ποικιλιών με άριστα χαρακτηριστικά, κατάλληλων για διάφορες χρήσεις. Προς την κατεύθυνση αυτή υπήρχε μεγάλο ενδιαφέρον και έγιναν εντατικές προσπάθειες το 19 ο αιώνα αρχικά στην Ευρώπη και λίγο αργότερα στη Β. Αμερική. Ουσιαστικά δημιουργήθηκαν ποικιλίες διαφόρων σχημάτων, μεγέθους και χρώματος καρπού που ικανοποιούσαν όλες τις επιθυμίες. Αρκετές από τις ποικιλίες αυτές είχαν τέτοια επιτυχία που καλλιεργήθηκαν για περισσότερο από 100 χρόνια, ενώ ορισμένες καλλιεργούνται ακόμα και σήμερα. Είναι ποικιλίες που ξεχώρισαν για τις γευστικές τους ιδιότητες. Η διατήρηση και η μεγάλη επιτυχία αυτών των ποικιλιών διευκολύνθηκε από το σημαντικό χαρακτηριστικό που έχουν τα άνθη της τομάτας να είναι αυτογονιμοποιούμενα. Λόγω του γεγονότος αυτού, στην τομάτα αυξάνει η ομοζυγωτία από γενεά σε γενεά και η ποικιλία αποκτά μεγάλη σταθερότητα στα χαρακτηριστικά της. Η ύπαρξη ομόζυγων σειρών στην τομάτα διευκόλυνε επίσης πάρα πολύ την περαιτέρω βελτίωση με υβριδισμό. Με τη διασταύρωση δηλαδή ομόζυγων σειρών, από τις παραπάνω καλλιεργούμενες ποικιλίες ή και από τις άγριες σειρές που υπήρχαν στην περιοχή καταγωγής της τομάτας, παρήχθησαν από τις αρχές του 20 ου αιώνα, υβρίδια που ήταν ανώτερα και από τους δύο γονείς. Έτσι, αρχικά, παρήχθησαν υβρίδια που είχαν επιθυμητό μέγεθος και ομοιομορφία καρπού, πολύ μεγαλύτερη απόδοση, επιθυμητό τρόπο ανάπτυξης του φυτού, κ.τ.λ. Σε επόμενο στάδιο επιχειρήθηκε στα υβρίδια να προσδοθεί και ανθεκτικότητα σε διάφορες ασθένειες, πράγμα που συνεχίζεται μέχρι και σήμερα με επιτυχία. Από το 1920 περίπου, στις ανεπτυγμένες χώρες της Ευρώπης και της Αμερικής, άρχισε η βιομηχανική επεξεργασία και η κονσερβοποίηση της τομάτας, η οποία τα επόμενα χρόνια έδωσε μεγάλη ώθηση στην επέκταση της καλλιέργειας, δημιουργώντας συνεχώς νέες ποικιλίες και υβρίδια κατάλληλα για τη βιομηχανία και πολλά και διάφορα προϊόντα βιομηχανικής επεξεργασίας, με την τομάτα να βρίσκει συνεχώς νέες χρήσεις. Παράλληλα έγινε εκτενώς κατανοητή η υψηλή -7-

48 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της διατροφική αξία της τομάτας, καθώς αποδείχθηκε ότι αποτελεί για τον άνθρωπο μία εξαιρετική πηγή κάλυψης των αναγκών του σε βιταμίνες και ιχνοστοιχεία. 1.2 Ο καρπός της τομάτας Το σχήμα της τομάτας καθορίζεται γενετικά, ενώ ελάχιστα επηρεάζεται από τις περιβαλλοντικές και καλλιεργητικές συνθήκες. Το σχήμα του καρπού της διαφέρει ανάλογα με την ποικιλία και μπορεί να είναι σφαιρικό ή επίμηκες (Barrett, 1998). Ο καρπός της τομάτας (Σχήμα 1.1) είναι χυμώδης ρόγα, ή σε όρους βοτανικής, μια διογκωμένη ωοθήκη. Το σώμα του καρπού είναι γνωστό ως περικάρπιο, σχηματίζεται από το τοίχωμα της ωοθήκης, η οποία περιβάλει και περικλείει τους σπόρους, και αποτελείται από εξωτερικά, ακτινικά και εσωτερικά τοιχώματα. Η συνέχεια του περικαρπίου διακόπτεται από μικρές κοιλότητες, στις οποίες βρίσκονται οι σπόροι εγκλεισμένοι σε ένα ζελατινώδη παρεγχυματικό ιστό (Hulme, 1971). Ακτινικό τοίχωμα του περικάρπιου Εξωτερικό τοίχωμα του περικάρπιου Κοιλότητες με ζελώδη παρεγχυματικό ιστό γύρω από τα σπόρια σπόροι Επιδερμίδα Εσωτερικό τοίχωμα του περικάρπιου Σχήμα 1.1 Ο καρπός της τομάτας. -8-

49 Ο καρπός της τομάτας Ο αριθμός των κοιλοτήτων ποικίλει από δύο και πάνω και είναι ιδιαίτερο χαρακτηριστικό κάθε ποικιλίας (Hulme, 1971). Η ωρίμανση του καρπού της τομάτας περιλαμβάνει μια σειρά αλλαγών αναφορικά με το χρώμα, την υφή, το άρωμα, τη γεύση και τη σύστασή της. Κατά την έναρξη της ωρίμανσης παρατηρούνται οι πρώτες αλλαγές στο χρώμα στην περιοχή των κοιλοτήτων. Καθώς το φρούτο αναπνέει, παρατηρείται απώλεια χλωροφύλλης, ενώ συντίθενται χρωστικές ουσίες όπως τα καροτενοειδή (Davies & Hobson, 1981). Σημαντικές αλλαγές συμβαίνουν και στα κυτταρικά τοιχώματα, τα οποία διαλυτοποιούνται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης, καταλήγοντας στα εύθραυστα τοιχώματα του υπερώριμου φρούτου. Επιπλέον, κατά την ωρίμανση, παράγονται συστατικά αρώματος και γεύσης, με περισσότερες από 200 πτητικές ουσίες να έχουν ήδη ταυτοποιηθεί. Σημαντικό παράγοντα γεύσης της τομάτας αποτελούν τα σάκχαρα, κυρίως η γλυκόζη και φρουκτόζη, που παράγονται κατά την αποικοδόμηση του αμύλου, καθώς και η παρουσία οργανικών οξέων (Grierson & Kader, 1986). 1.3 Σύσταση της τομάτας Η νωπή τομάτα αποτελείται κατά μέσο όρο από 97% χυμό, 1% φλοιό και 2% σπόρους. Ο χυμός της τομάτας αποτελείται κατά % από νερό. Η διακύμανση αυτή εξηγείται εν μέρει από τα χαρακτηριστικά της εκάστοτε ποικιλίας καθώς και από τις κλιματολογικές συνθήκες και τις χρησιμοποιούμενες τεχνικές καλλιέργειας, κυρίως την άρδευση (Leoni, 2004). Ο φλοιός της τομάτας αποτελείται από κυτταρίνη και δεν παρουσιάζει καμία απολύτως θρεπτική αξία, ενώ οι σπόροι περιέχουν % υγρασία και λιπαρά σε ποσοστό περίπου 22 % επί ξηρής βάσης (Gould, 1974; Atherton, 1986). Στον Πίνακα 1.1 παρατίθεται η περιεκτικότητα στα κυριότερα συστατικά της τομάτας. -9-

50 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της Πίνακας 1.1 Περιεκτικότητα των κυριότερων συστατικών σύνθεσης της τομάτας (Gould, 1992) Συστατικό % Περιεκτικότητα Ολικά στερεά 7,0-8,5 Αδιάλυτα στερεά < 1,0 Διαλυτά στερεά 4,0-6,0 Σάκχαρα 2,0-3,0 Οξέα 0,3-0,5 Πρωτεΐνες και αμινοξέα 0,8-1,2 Ανόργανα άλατα 0,3-0,6 Άλατα (χλωριούχο νάτριο) 0,05-0,1 Στερεά Η τομάτα περιέχει συνήθως 7,0 8,5% ολικά στερεά, εκ των οποίων περίπου το 1% είναι φλοιός και σπόροι. Η ποσοστιαία σύσταση των στερεών στην τομάτα ποικίλει ανάλογα με την ποικιλία, τα χαρακτηριστικά του εδάφους στο οποίο καλλιεργείται και κυρίως τις κλιματολογικές συνθήκες που επικρατούν κατά την περίοδο ανάπτυξής της (Gould, 1992). Υδατάνθρακες Τα ελεύθερα σάκχαρα που υπάρχουν στην τομάτα είναι κατά κύριο λόγο αναγωγικά σάκχαρα (Miladi et al., 1969). Καθώς αντιπροσωπεύουν το 1,5 4,5 % του καρπού και το % των ολικών στερεών του, τα σάκχαρα επηρεάζουν σημαντικά τη γεύση της τομάτας. Τα σάκχαρα αυτά είναι η γλυκόζη και η φρουκτόζη σε ίσες περίπου ποσότητες, με επικρατέστερη την φρουκτόζη. Η σακχαρόζη περιέχεται στη τομάτα σε ποσοστό που δεν ξεπερνά το 0,1 % του καρπού (Goose & Binsted, 1964). -10-

51 Σύσταση της τομάτας Πρωτεΐνες και αμινοξέα Στο φρέσκο χυμό τομάτας υπάρχουν περίπου 19 διαλυτά αμινοξέα. Το κυριότερο από αυτά είναι το γλουταμικό οξύ, το οποίο αποτελεί το 48,5% του συνολικού βάρους των αμινοξέων που απαντώνται στο χυμό τομάτας (Miladi et al., 1969). Το αμέσως σημαντικότερο αμινοξύ είναι το ασπαρτικό, του οποίου η συγκέντρωση σε φρέσκο χυμό τομάτας ανέρχεται σε 5,5 mg/100 g χυμού. Κατά την επεξεργασία φρέσκου χυμού τομάτας, η περιεκτικότητα σε ελεύθερα αμινοξέα μεταβάλλεται λόγω της αποικοδόμησης και μερικής υδρόλυσης των πρωτεϊνών (Belitz et al., 2006). Οργανικά Οξέα Τα οξέα αποτελούν σημαντικό παράγοντα γεύσης της τομάτας, ενώ η ολική οξύτητα αποτελεί δείκτη ικανοποιητικής επεξεργασίας των προϊόντων της (Lambeth et al., 1964). Επικρατέστερο οξύ στο φρούτο της τομάτας είναι το κιτρικό οξύ (ενδεικτική τιμή 328 mg/100 g νωπού βάρους), με αμέσως επόμενο το μηλικό οξύ (51 mg/100 g νωπού βάρους) (Belitz et al., 2006), ενώ έχουν βρεθεί και ίχνη τρυγικού, ηλεκτρικού, οξικού και οξαλικού οξέος. Η επεξεργασία του χυμού τομάτας έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ολικής οξύτητας στο τελικό προϊόν. Στη διεθνή βιβλιογραφία έχει αναφερθεί αύξηση της περιεκτικότητας σε οξικό οξύ σε ποσοστό 32% και αποδόθηκε στην οξείδωση αλδεϋδών και αλκοολών χυμού τομάτας κατά την επεξεργασία (Crean, 1966). Μεταλλικά στοιχεία Η περιεκτικότητα της τομάτας σε μεταλλικά στοιχεία εξαρτάται μερικώς από τη φύση του εδάφους και τις τεχνικές καλλιέργειας, ενώ είναι σταθερή υποδηλώνοντας ότι το φυτό είναι επιλεκτικό στην απορρόφηση μεταλλικών ιόντων από το έδαφος (Leoni, 1993). Τα μεταλλικά στοιχεία απαντώνται στην τομάτα σε ποσοστό που κυμαίνεται από 0,3 έως 0,6 %. Τα κυριότερα από αυτά είναι το κάλιο, το μαγνήσιο, ο φώσφορος, το ασβέστιο και το νάτριο (Belitz et al., 2006) και παίζουν δευτερεύοντα ρόλο στην ποιότητα των προϊόντων τομάτας (Gould, 1992). -11-

52 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της Πηκτίνες Η χαρακτηριστική σαρκώδης υφή της τομάτας οφείλεται στην παρουσία πηκτινών που αποτελούν φυσικό συστατικό της ώριμης τομάτας. Οι πηκτίνες είναι πολυμερή α-β γαλακτουρονικού οξέος που συνδέονται μεταξύ τους με 1,4 δεσμούς. Όπως συμβαίνει με τους περισσότερους πολυσακχαρίτες, οι πηκτίνες διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μήκος της αλυσίδας και συνεπώς το μοριακό τους βάρος. Επίσης, μπορούν να εστεροποιηθούν σε διάφορους βαθμούς με ομάδες μεθυλεστέρων. Οι πηκτίνες μικρού βαθμού εστεροποίησης ονομάζονται πηκτικά οξέα, ενώ οι πηκτίνες μεγαλύτερου βαθμού εστεροποίησης είναι γνωστές ως πηκτινικά οξέα. Το αναπτυσσόμενο φυτό σχηματίζει αρχικά ένα αδιάλυτο συστατικό που ονομάζεται πρωτοπηκτίνη, και το οποίο συνδέει τα κύτταρα μεταξύ τους. Καθώς το φρούτο ωριμάζει η πρωτοπηκτίνη μετατρέπεται σε πηκτίνη, η οποία εξακολουθεί να ενώνει τα κύτταρα μεταξύ τους, όχι όμως τόσο σταθερά, με αποτέλεσμα το φρούτο να μην είναι πλέον τόσο σκληρό. Περαιτέρω ανάπτυξη της τομάτας έχει ως αποτέλεσμα την αποικοδόμηση της πηκτίνης σε διαλυτά συστατικά, τα οποία έχουν μικρότερη συνδετική δύναμη με συνέπεια το υπερώριμο φρούτο να είναι αρκετά μαλακό. Αυτές οι μετατροπές των πηκτινών που συμβαίνουν στην τομάτα, είναι αποτέλεσμα της δράσης ενζύμων που σχηματίζονται στα κύτταρα του φυτού καθώς αυτό αναπτύσσεται. Καθώς τα ένζυμα αυτά υπάρχουν στο ώριμο φρούτο, η δράση τους δε σταματά κατά τη συγκομιδή και την επεξεργασία της τομάτας, με αποτέλεσμα να παίζουν σημαντικό ρόλο στην υφή των προϊόντων τομάτας (Gould, 1992). Η δράση τους και ο ρόλος τους στην ποιότητα των προϊόντων τομάτας θα μελετηθεί εκτενέστερα σε επόμενο κεφάλαιο. Λιπαρά συστατικά Το λιπιδικό περιεχόμενο της τομάτας είναι γενικά χαμηλό, αποτελεί το 0,2 % του συνολικού βάρους της τομάτας και απαντάται κυρίως στα σπόρια, ενώ τα καροτενοειδή περιέχονται σε μεγάλες ποσότητες (Leoni, 1993). Στον Πίνακα 1.2 παρέχονται στοιχεία σχετικά με τις καροτενοειδείς ενώσεις που απαντώνται στην τομάτα (Belitz, 2006). -12-

53 Σύσταση της τομάτας Πίνακας 1.2 Περιεκτικότητα καροτενοειδών στη τομάτα (mg/100 g νωπού βάρους) (Belitz, 2006) Καροτενοειδή Περιεκτικότητα Ολικά καροτενοειδή 5,1-8,5 Φυτοένιο 1,3 Φυτοφλουένιο 0,7 β-καροτένιο 0,59 ζ-καροτένιο 0.84 Λυκοπένιο 4,7 α, β-κρυπτοξανθίνη 0,5 Λουτεΐνη 0,12 Το κυρίαρχο καροτενοειδές της τομάτας είναι το λυκοπένιο, το οποίο είναι υπεύθυνο για το κόκκινο χρώμα του καρπού της. Τα τελευταία χρόνια το λυκοπένιο έχει αποτελέσει αντικείμενο πολλών ερευνών, καθώς εκτός από το χρώμα που προσδίδει στα προϊόντα στα οποία περιέχεται θεωρείται ότι έχει και ευεργετική επίδραση στον ανθρώπινο οργανισμό. Αποτελεί φυσικό αντιοξειδωτικό που εξουδετερώνει τη δράση των ελευθέρων ριζών, ουσίες που παράγονται στον οργανισμό και σχετίζονται με την ανάπτυξη καρδιαγγειακών νοσημάτων και πολλών μορφών καρκίνου. Έτσι η πρόσληψη λυκοπενίου μέσω της διατροφής συνδέεται με την πρόληψη εμφάνισης διαφόρων μορφών καρκίνου αλλά και με περιορισμό του κινδύνου εμφάνισης εμφράγματος. Βιταμίνες Οι φρέσκιες τομάτες, ο χυμός τομάτας καθώς και άλλα προϊόντα τομάτας συνεισφέρουν σημαντικά στη διατροφή του ανθρώπου λόγω της περιεκτικότητας και της διαθεσιμότητας τους σε θρεπτικά συστατικά (Gould, 1992). Η σπουδαιότητα των καρπών της τομάτας και των προϊόντων της έγκειται στο ότι αποτελούν μία από τις κυριότερες πηγές βιταμίνης C, η οποία εμφανίζεται υπό τη μορφή ασκορβικού οξέος. Η μέση περιεκτικότητα ασκορβικού οξέος στον καρπό της τομάτας είναι περίπου 23 mg/100 g νωπού βάρους. Η τομάτα αποτελεί -13-

54 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της επίσης σημαντική πηγή βιταμίνης Α (1000 IU/100 g), η οποία απαντάται με τη μορφή καροτενίου. Άλλες βιταμίνες που απαντώνται στο φρούτο της τομάτας είναι κάποια είδη βιταμίνης Β, όπως η θειαμίνη (0,06 mg/100 g), η νιασίνη και η ριβοφλαβίνη (0,04 mg/100 g) (Gould, 1992; Belitz, 2006). 1.4 Προϊόντα τομάτας Ο καρπός της τομάτας εμφανίζει σχετική ευκολία στη σύνθλιψη και τη συμπύκνωση, με αποτέλεσμα να έχουν αναπτυχθεί πολλές διεργασίες επεξεργασίας της, παρέχοντας στην κατανάλωση πληθώρα προϊόντων τομάτας. Οι ολόκληρες τομάτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν νωπές ή αποφλοιωμένες σε κονσέρβες, αφού υποστούν θερμική επεξεργασία. Με σύνθλιψη δίνουν χυμό, ο οποίος μπορεί να καταψυχθεί, να κονσερβοποιηθεί ή να επεξεργαστεί περαιτέρω δίνοντας συμπυκνωμένο πολτό, πάστα ή ακόμα και σκόνη τομάτας. Η τομάτα καταναλώνεται κυρίως µε τη μορφή διαφόρων προϊόντων επεξεργασίας της, όπως ο χυμός, η πάστα, η σάλτσα πίτσας και ζυμαρικών ή διάφορα προϊόντα κύβων τομάτας. Τα περισσότερα από τα προϊόντα αυτά παράγονται µε συμπύκνωση διαφόρων βαθμών και αποθηκεύονται στη συμπυκνωμένη τους μορφή μέχρι την κατανάλωσή τους, οπότε και αραιώνονται έτσι ώστε να προκύψει το τελικό προϊόν µε την επιθυμητή σύσταση (Bachau, 1981; Denny, 1997; Goose et al., 1964; Gould, 1974). Τα σημαντικότερα προϊόντα τομάτας είναι τα εξής: Φυσικός χυμός τομάτας Συμπυκνωμένος χυμός τομάτας Τοματοπολτός Αποφλοιωμένες τομάτες ολόκληρες ή σε μορφή τεμαχίων ή φετών, κονσερβοποιημένες Κέτσαπ Αφυδατωμένη τομάτα Από τα προϊόντα αυτά το πλέον διαδεδομένο στην παγκόσμια αγορά είναι ο τοματοπολτός. Σύμφωνα με των Κώδικα Τροφίμων και Ποτών ως τοματοπολτός ορίζεται το προϊόν το οποίο προέρχεται από την εν κενώ συμπύκνωση του -14-

55 Βιομηχανική τομάτα σαρκώδους χυμού των νωπών καρπών τομάτας στον επιθυμητό βαθμό. Ανάλογα με το βαθμό συμπύκνωσης διακρίνονται τα εξής είδη τοματοπολτού: Ημισυμπυκνωμένος τοματοπολτός με περιεκτικότητα σε στερεά συστατικά τουλάχιστον 16 % Τοματοπολτός απλής συμπύκνωσης με περιεκτικότητα σε στερεά συστατικά τουλάχιστον 22 % Τοματοπολτός διπλής συμπύκνωσης με περιεκτικότητα σε στερεά συστατικά τουλάχιστον 28 % και Τοματοπολτός τριπλής συμπύκνωσης με περιεκτικότητα σε στερεά συστατικά τουλάχιστον 36 %. 1.5 Βιομηχανική τομάτα Όπως προαναφέρθηκε, στις ανεπτυγμένες χώρες της Ευρώπης και στις ΗΠΑ η βιομηχανική επεξεργασία και μεταποίηση της τομάτας ξεκίνησε από το Τα επόμενα χρόνια δόθηκε μεγάλη ώθηση στην επέκταση της καλλιέργειας της τομάτας, δημιουργήθηκαν νέες ποικιλίες και υβρίδια για τη βιομηχανία και πολλά και διάφορα προϊόντα βιομηχανικής επεξεργασίας, με τη τομάτα να βρίσκει συνεχώς νέες χρήσεις. Σήμερα υπάρχει μεγάλος αριθμός ποικιλιών και υβριδίων τομάτας που ευδοκιμούν σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες και είναι κατάλληλα για βιομηχανική χρήση. Οι ποικιλίες αυτές είναι μικρόκαρπες, σφαιρικές ή ελλειψοειδείς, και διακρίνονται σε πρώιμες, μεσοπρώιμες ή όψιμες ανάλογα με το βιολογικό τους κύκλο (από τη μεταφύτευση έως και την ωρίμανση). Συνήθως ο βιολογικός κύκλος κυμαίνεται από 90 έως 115 μέρες, εξυπηρετώντας έτσι τη σταδιακή παράδοσή τους στις βιομηχανίες μεταποίησης. Γενικά, μία ποικιλία τομάτας που προορίζεται για βιομηχανική χρήση πρέπει να συγκεντρώνει κάποια ποιοτικά χαρακτηριστικά, όπως υψηλή περιεκτικότητα σε ολικά στερεά, υψηλή περιεκτικότητα σε σάκχαρα, έντονο κόκκινο χρώμα, χαμηλή οξύτητα, λεία επιφάνεια χωρίς πτυχώσεις, αντοχή στη μεταφορά και τις ασθένειες, υψηλή παραγωγικότητα και υψηλό ποσοστό καρπών πρώτης κατηγορίας (Goose & Binsted, 1964). -15-

56 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της Οι απαιτήσεις αυτές καθορίζουν τις κατάλληλες για βιομηχανική χρήση ποικιλίες τομάτας, αν και η ποιότητα της πρώτης ύλης εξαρτάται και από άλλους παράγοντες, όπως για παράδειγμα τις εδαφολογικές και κλιματολογικές συνθήκες, τον τρόπο καλλιέργειας και την εποχή της συλλογής. Στον Πίνακα 1.3 παρουσιάζονται οι κυριότερες ποικιλίες-υβρίδια βιομηχανικής τομάτας που προορίζονται για μεταποίηση και χρησιμοποιούνται από την ελληνική βιομηχανία τομάτας. Πίνακας 1.3 Σημαντικότερα υβρίδια βιομηχανικής τομάτας που χρησιμοποιούνται στην ελληνική βιομηχανία μεταποίησης Υβρίδιο Πρωιμότητα Καταλληλότητα Heinz 9780 Όψιμο Τοματοχυμός, Τοματοπολτός Heinz 9036 Όψιμο Τοματοχυμός, Τοματοπολτός Heinz 9888 Μεσοόψιμο Τοματοχυμός, Τοματοπολτός Heinz 8204 Μεσοόψιμο Κύβος τομάτας Spunta Πρώιμο Τοματοπολτός Campbell 206 Πρώιμο Τοματοπολτός Red Sea Όψιμο Τοματοπολτός Wally Red Μεσοπρώιμο Τοματοπολτός, Κύβος τομάτας Vulkan Μεσοπρώιμο Τοματοπολτός, Κύβος τομάτας All Flesh Μεσοόψιμο Κύβος τομάτας Gibson Όψιμο Κύβος τομάτας Η συλλογή της βιομηχανικής τομάτας πραγματοποιείται με αυτόματες μηχανές και σπανιότερα χειρονακτικά. Για το λόγο αυτό έχουν αναπτυχθεί ποικιλίες που αντέχουν στη μηχανική καταπόνηση. Η συγκομιδή της τομάτας ξεκινά από τις Ιουλίου για τις πρώιμες ποικιλίες, ενώ τον Αύγουστο και το Σεπτέμβριο συγκομίζεται ο κύριος όγκος της παραγωγής που προέρχεται από τις μεσοπρώιμες ποικιλίες. Ανάλογα με τις καιρικές και εδαφολογικές συνθήκες η συγκομιδή μπορεί να συνεχιστεί μέχρι τα -16-

57 Βιομηχανική τομάτα μέσα Οκτωβρίου με τις όψιμες ποικιλίες. Τη συγκομιδή της τομάτας ακολουθεί η μεταφορά της στις βιομηχανικές εγκαταστάσεις και η μεταποίησή της. 1.6 Παραγωγή τοματοπολτού Η παραγωγή τοματοπολτού αποτελεί μια ενδιαφέρουσα διεργασία, η οποία περιλαμβάνει διάφορα στάδια, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.2. Στη συνέχεια περιγράφονται αναλυτικά τα στάδια παραγωγής τοματοπολτού και η σημαντικότητα τους στην ποιότητα του τελικού προϊόντος. Σχήμα 1.2 Διάγραμμα ροής παραγωγής τοματοπολτού -17-

58 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της Πλύση των τοματών Ένα από τα σημαντικότερα στάδια στη μεταποίηση της τομάτας αποτελεί η επιμελημένη πλύση των λαμβανόμενων τοματών, η οποία είναι απαραίτητη για την απομάκρυνση των ακαθαρσιών από την επιφάνειά τους καθώς και των ξένων υλών. Η πλύση των τοματών ξεκινά ουσιαστικά από τη στιγμή της υδρομεταφοράς τους προς τα πλυντήρια. Τα πλυντήρια είναι δεξαμενές στον πυθμένα των οποίων διοχετεύεται αέρας υπό πίεση, με αποτέλεσμα να γίνεται έντονη ανάδευση του νερού και συνεπώς να απομακρύνονται οι ακαθαρσίες από την επιφάνεια των τοματών. Μέσα στα πλυντήρια διέρχεται το χαμηλότερο άκρο μίας κεκλιμένης μεταφορικής ταινίας, η οποία αποτελείται από περιστρεφόμενα ράουλα και παραλαμβάνει και μεταφέρει τις τομάτες προς την τράπεζα διαλογής. Κατά τη μεταφορά αυτή ολοκληρώνεται η πλύση των καρπών με εκτόξευση νερού πίεσης 3-4 bar, από ακροφύσια που βρίσκονται πάνω από τη μεταφορική ταινία (Goose & Binsted, 1964). Για την πλύση των τοματών χρησιμοποιείται πόσιμο νερό, η ποιότητα του οποίου καθορίζεται από την Οδηγία 93/83/ΕΚ της Ευρωπαϊκής Ένωσης Διαλογή Μετά την πλύση τους στην κεκλιμένη μεταφορική ταινία, οι τομάτες έρχονται σε οριζόντιο μεταφορέα με περιστρεφόμενα ράουλα, που αποτελεί την τράπεζα διαλογής. Η διαλογή γίνεται χειρονακτικά και διευκολύνεται καθώς οι μεταφερόμενες τομάτες περιστρέφονται. Κατά τη διαλογή απομακρύνονται οι ακατάλληλοι καρποί και απορρίπτονται σε αγωγούς κατά μήκος της τράπεζας διαλογής. Ως ακατάλληλοι καρποί χαρακτηρίζονται οι άγουροι, οι σπασμένοι, οι φέροντες στίγματα και οι αλλοιωμένοι. Σκοπός της διαλογής είναι να παραμείνουν προς επεξεργασία καθαροί και υγιείς καρποί έτσι ώστε να παραχθεί προϊόν υψηλών προδιαγραφών (Goose & Binsted, 1964; Θωμόπουλος, 1981) -18-

59 Παραγωγή τοματοπολτού Θραύση-Προθέρμανση Μετά τη διαλογή, ακολουθεί θραύση των κατάλληλων προς επεξεργασία τοματών, κατά την οποία οι τομάτες τεμαχίζονται σε ακανόνιστο σχήμα. Για τον τεμαχισμό των τοματών χρησιμοποιούνται είτε συστοιχίες περιστρεφόμενων οδοντωτών κυκλικών μαχαιριών είτε κοπτικές αντλίες. Στη συνέχεια οι θραυσμένοι καρποί μεταφέρονται σε εναλλάκτες θερμότητας όπου προθερμαίνονται. Στη βιομηχανική πρακτική εφαρμόζονται δύο τεχνικές προθέρμανσης των τοματών, η Ψυχρή θραύση (Cold Break) και η Θερμή θραύση (Hot Break). Κατά την ψυχρή θραύση οι τομάτες θραύονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και στη συνέχεια προθερμαίνονται σε θερμοκρασίες C. Σε αυτό το εύρος θερμοκρασιών τα πηκτινολυτικά ένζυμα πηκτινομεθυλεστεράση (PME) και πολυγαλακτουρονάση (PG) που είναι παρόντα στον καρπό της τομάτας διατηρούν τη δραστικότητά τους προκαλώντας αποικοδόμηση των πηκτινικών ουσιών, με αποτέλεσμα την παραγωγή προϊόντων χαμηλού ιξώδους και στα οποία παρατηρείται εύκολα διαχωρισμός ορού κατά την παραμονή τους. Επιπλέον, λόγω των χαμηλών θερμοκρασιών διατηρείται το χρώμα, η γεύση και το άρωμα φρέσκιας τομάτας, ενώ παραμένουν αναλλοίωτα τα θρεπτικά της συστατικά. Αντίθετα, κατά τη θερμή θραύση οι τομάτες προθερμαίνονται σε μεγαλύτερες θερμοκρασίες ( C). Σε αυτές τις συνθήκες πραγματοποιείται θερμική αδρανοποίηση των πηκτινολυτικών ενζύμων με αποτέλεσμα να αποφεύγεται η αποικοδόμηση των πηκτινικών ουσιών, οπότε λαμβάνεται προϊόν που διατηρεί μεγαλύτερο ιξώδες. Ωστόσο, λόγω των υψηλών θερμοκρασιών, προκαλείται υποβάθμιση του χρώματος, πράγμα που είναι ιδιαίτερα ανεπιθύμητο, καθώς το χρώμα αποτελεί σημαντικό κριτήριο της ποιότητας των προϊόντων τομάτας Αποχύμωση Αφού ολοκληρωθεί η θραύση και η προθέρμανση, ανεξάρτητα από τον τρόπο με τον οποίο έγιναν, η μάζα των τοματών οδηγείται σε σύστημα εξαγωγής του χυμού, τους λεγόμενους διαχωριστήρες (ραφινέζες), όπου ολοκληρώνεται η κατάτμηση και ο διαχωρισμός της σάρκας και πραγματοποιείται η απομάκρυνση -19-

60 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της του φλοιού και των σπόρων. Οι διαχωριστήρες αποτελούνται από κυλινδρικά κόσκινα τα οποία φέρουν στο εσωτερικό τους και κατά τον άξονά τους περιστρεφόμενο σύστημα αναδεύσεως και προωθήσεως της τοματόμαζας. Η διάμετρος οπών του κόσκινου κυμαίνεται από 0,5 έως 5 mm. Κατά την εξαγωγή του χυμού η ποιότητα του λαμβανόμενου προϊόντος επηρεάζεται σημαντικά από τη διάμετρο οπής του κόσκινου καθώς και από την ταχύτητα περιστροφής των αναδευτήρων του. Μεγάλη διάμετρος οπής όπως επίσης και μεγάλη ταχύτητα περιστροφής συντελούν στην παραλαβή χυμού μεγαλύτερου ιξώδους (Goose & Binsted, 1964). Τα στερεά υπολείμματα της τομάτας (φλοιοί, σπόρια και ίνες) που συγκρατούνται από τα κόσκινα των διαχωριστήρων, αποτελούν περίπου το 3 % των επεξεργαζόμενων τοματών και μπορούν με κατεργασία τους σε πιεστήρια να αποδώσουν συμπληρωματικό ποσό χυμού τομάτας ανάλογης ποιότητας με αυτό που παραλαμβάνεται κατά την κύρια επεξεργασία. Ο λαμβανόμενος από τους διαχωριστήρες χυμός, περιεκτικότητας σε διαλυτά στερεά περίπου 5% (5 Brix), συλλέγεται σε ανοξείδωτες δεξαμενές, και στη συνέχεια αποστέλλεται στο τμήμα συμπύκνωσης (Goose & Binsted, 1964) Συμπύκνωση Ο παραγόμενος χυμός τομάτας μεταφέρεται με αντλίες στο σύστημα συμπύκνωσης, όπου πραγματοποιείται εξάτμιση του περιεχόμενου νερού και λαμβάνεται τοματοπολτός επιθυμητής περιεκτικότητας σε διαλυτά στερεά. Η συμπύκνωση πραγματοποιείται σε εξατμιστήρες αναγκαστικής κυκλοφορίας, οι οποίοι λειτουργούν υπό ελαττωμένη πίεση (κενό). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ταπείνωση του σημείου ζέσεως του νερού, το οποίο πλέον εξατμίζεται σε χαμηλές θερμοκρασίες (55-85 C) με αποτέλεσμα το τελικό προϊόν να διατηρεί σε μεγάλο βαθμό το χρώμα, τη γεύση, το άρωμα και τη διατροφική αξία της νωπής τομάτας. Οι συμπυκνωτές που χρησιμοποιούνται είναι συνεχούς ροής και διακρίνονται σε απλής, διπλής, τριπλής και τετραπλής ενέργειας. Ο διαχωρισμός αυτός αφορά στα στάδια στα οποία πραγματοποιείται η συμπύκνωση. Έτσι, σε -20-

61 Παραγωγή τοματοπολτού συμπυκνωτές απλής ενέργειας, η συμπύκνωση πραγματοποιείται σε ένα στάδιο, σε διπλής ενέργειας σε δύο στάδια, στους τριπλής ενέργειας σε τρία στάδια και σε τετραπλής ενέργειας σε τέσσερα στάδια. Σε όσο περισσότερα στάδια πραγματοποιείται η συμπύκνωση τόσο αυξάνει η παραγωγή ενώ ταυτόχρονα οι απαιτήσεις σε ενέργεια είναι μικρότερες. Σε ένα συμπυκνωτή τριπλής ενέργειας ο χυμός τομάτας αποστέλλεται στο πρώτο στάδιο συμπύκνωσης, όπου σε χαμηλή θερμοκρασία πραγματοποιείται προσυμπύκνωση του εισερχόμενου χυμού, στη συνέχεια στο δεύτερο στάδιο, όπου συνεχίζεται η συμπύκνωση και από εκεί στο τρίτο, το οποίο τροφοδοτείται με υπέρθερμο ατμό και ολοκληρώνεται η συμπύκνωση του προϊόντος. Όλα τα στάδια λειτουργούν υπό κενό, με την πίεση να μειώνεται από το πρώτο προς το τρίτο στάδιο. Όπως προαναφέρθηκε, ατμός εισέρχεται στο τρίτο στάδιο συμπύκνωσης όπου συμπυκνώνεται το προϊόν και οι υδρατμοί που παράγονται οδηγούνται στο επόμενο στάδιο και συνεχίζουν τη συμπύκνωση. Στη συνέχεια ένα μέρος από αυτούς και όσοι παρήχθησαν στο δεύτερο στάδιο συμπύκνωσης πηγαίνουν στο πρώτο στάδιο όπου πραγματοποιείται η προσυμπύκνωση του εισερχόμενου χυμού. Αντίστοιχα λειτουργούν και οι συμπυκνωτές απλής, διπλής και τετραπλής ενέργειας Θερμική επεξεργασία- συσκευασία Μετά τη συμπύκνωση ακολουθεί θερμική επεξεργασία του προϊόντος, η οποία, ανάλογα με την έντασή της, διακρίνεται σε παστερίωση και εμπορική αποστείρωση. Για την παστερίωση του τοματοπολτού χρησιμοποιούνται κυρίως παστεριωτές αποξεόμενης επιφάνειας ή πλακοειδείς παστεριωτές, όπου ο τοματοπολτός θερμαίνεται σε θερμοκρασία 95 C και ακολουθεί πλήρωση των περιεκτών εν θερμώ (Hot Fill). Σε αυτή την περίπτωση η θερμοκρασία του προϊόντος κατά την πλήρωση των περιεκτών πρέπει να είναι τουλάχιστον 93,3 C, ενώ οι περιέκτες προηγουμένως έχουν ατμιστεί με ζεστό ατμό. Με τον τρόπο αυτό παρεμποδίζεται η επιβίωση μικροοργανισμών οι οποίοι μπορούν να προκαλέσουν -21-

62 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της αλλοίωση του προϊόντος. Στη συνέχεια οι περιέκτες κλείνονται και οδηγούνται σε ψύκτες όπου, με καταιονισμό κρύου νερού από ακροφύσια, πραγματοποιείται σταδιακή ψύξη του προϊόντος. Τόσο η πλήρωση εν θερμώ όσο και η ακόλουθη ψύξη του συσκευασμένου προϊόντος αποτελούν κρίσιμα σημεία της εν θερμώ συσκευασίας (Goose & Binsted, 1964). Η εμπορική αποστείρωση πραγματοποιείται σε υψηλότερες θερμοκρασίες, C, ανάλογα με το είδος του προϊόντος, και χρησιμοποιείται στην περίπτωση ασηπτικής συσκευασίας σε μεγάλους περιέκτες ( kg). Για την αποστείρωση χρησιμοποιούνται σωληνωτοί εναλλάκτες θερμότητας με θερμαντικό μέσο υπέρθερμο νερό. Η κυκλοφορία του τοματοπολτού στους εναλλάκτες είναι βεβιασμένη και ταχεία, ώστε να επιτυγχάνονται μικροί χρόνοι παραμονής και να διατηρούνται αναλλοίωτα τα οργανοληπτικά του χαρακτηριστικά (Goose & Binsted, 1964). Οι εναλλάκτες αποτελούνται από τρεις ομόκεντρους σωλήνες (tube in tube in tube), στον εσωτερικό και εξωτερικό σωλήνα κυκλοφορεί το θερμαντικό μέσο, ενώ ενδιάμεσα και σε δακτύλιο κυκλοφορεί το προϊόν. Οι σωλήνες φέρουν στατικούς αναμείκτες για την ανάμειξη του προϊόντος κατά την κυκλοφορία του σε αυτούς. Η εμπορική αποστείρωση πραγματοποιείται σε τρεις φάσεις: αρχικά το προϊόν θερμαίνεται στην επιθυμητή θερμοκρασία, στη συνέχεια παραμένει στη θερμοκρασία αποστείρωσης για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα και τέλος ακολουθεί ψύξη του προϊόντος σε θερμοκρασία C. Μετά την ψύξη ακολουθεί συσκευασία του προϊόντος σε ασηπτικούς σάκους υπό συνθήκες στείρου περιβάλλοντος Αποθήκευση Μετά τη συσκευασία του παραγόμενου τοματοπολτού, οι περιέκτες τοποθετούνται σε παλέτες και στη συνέχεια αποθηκεύονται στις αποθήκες, όπου παραμένουν μέχρι τη διανομή τους και την τελική τους χρήση. -22-

63 Παραγωγή προϊόντων τομάτας 1.7 Παραγωγή προϊόντων τομάτας παγκοσμίως Ο κλάδος της τομάτας αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς της ελληνικής οικονομίας, καθώς κατατάσσει την Ελλάδα στις πρώτες θέσεις διεθνώς βάσει της παραγωγής της (Πίνακας 1.4) και παρουσιάζει έντονο εξαγωγικό προσανατολισμό. Πίνακας 1.4 Επεξεργασθείσα ποσότητα βιομηχανικής τομάτας (τόννοι) διεθνώς, την τετραετία ( Αμερική Ευρώπη Ασία Χώρα Καλιφόρνια Χιλή Καναδάς Αργεντινή Ιταλία Ισπανία Πορτογαλία Ελλάδα Κίνα Τουρκία Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1.4, ο σημαντικότερος παραγωγός προϊόντων τομάτας παγκοσμίως είναι η Καλιφόρνια, με επεξεργασθείσα ποσότητα που ξεπερνά τα 10 εκ. τόννους τα τελευταία τρία χρόνια. Δεύτερη μεγαλύτερη χώρα είναι η Κίνα και ακολουθεί η Ιταλία με επεξεργασθείσα ποσότητα περίπου 2 εκ. τόννους. Η Ελλάδα κατέχει την τέταρτη θέση στην Ευρωπαϊκή Ένωση βάσει της επεξεργασθείσας ποσότητας νωπής τομάτας κατά τη μεταποιητική περίοδο , ενώ κατέχει την έβδομη θέση στην παραγωγή προϊόντων τομάτας παγκοσμίως. Η Ελλάδα παρουσιάζει αξιόλογη παραγωγή κυρίως σε τοματοπολτό και σε ολόκληρη ή ψιλοκομμένη τομάτα. Ο τοματοπολτός αποτελεί το κυριότερο -23-

64 Κεφάλαιο 1-Η τομάτα και τα προϊόντα της εξαγόμενο προϊόν, ενώ σημαντικό μέρος της παραγωγής αποφλοιωμένης τομάτας κατευθύνεται επίσης στο εξωτερικό. Ο χυμός τομάτας, οι σάλτσες και η κέτσαπ διατίθενται κυρίως στην εγχώρια αγορά. -24-

65 Κεφάλαιο 2 Πηκτίνη και Πηκτινολυτικά ένζυμα Τα πηκτινολυτικά ένζυμα απαντώνται κυρίως στα ανώτερα φυτά, παράγονται όμως και από μικροοργανισμούς. Δρουν στις πηκτίνες, μια ομάδα πολυσακχαριτών που αποτελούν δομικές μονάδες του κοιταρικού τοιχώματος και του middle lamella των φυτικών κυττάρων. Τα πηκτινολυτικά ένζυμα των φρούτων και λαχανικών παίζουν σημαντικό ρόλο στη διεργασία της ωρίμανσής τους και προκαλούν σημαντικές αλλαγές στην υφή τους κατά τη διάρκεια της συντήρησής τους. Η αναγκαιότητα απενεργοποίησης ή ενεργοποίησης των ενζύμων αυτών είναι καθοριστικής σημασίας στην παραγωγή προϊόντων φρούτων και λαχανικών (Pilnic & Voragen, 1993). 2.1 Δομή και ρόλος των πηκτινών στα φρούτα και λαχανικά Τα φυτικά κυτταρικά τοιχώματα παίζουν σημαντικό ρόλο στη δομή και τη φυσιολογία των φυτικών κυττάρων. Αποτελούνται κυρίως από νερό, κυτταρίνη, ημικυτταρίνη και πηκτίνη, ενώ περιέχουν σε μικρότερο βαθμό δομικές πρωτεΐνες, φαινολικούς εστέρες, ανόργανα συστατικά και ένζυμα. Στα φρούτα, τα λαχανικά και τα επεξεργασμένα προϊόντα τους παρατηρούνται αλλαγές στις λειτουργικές τους ιδιότητες όπως η υφή, τα ρεολογικά χαρακτηριστικά και η εκχυλισιμότητα χυμού, οι οποίες συνδέονται άμεσα με δομικές αλλαγές των πολυμερών των κυτταρικών τοιχωμάτων και κυρίως της πηκτίνης. Η πηκτίνη αποτελεί ένα πολύπλοκο δίκτυο ένυδρων πολυσακχαριτών των φυτικών κυτταρικών τοιχωμάτων παίζοντας σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και ωρίμανση των φυτών (Bacic et al., 1988) καθώς και στην επεξεργασία τρόφιμων φυτικής προέλευσης (Schols & Voragen, 1996; Willats et al., 2006). Η ετερογενής φύση της πηκτίνης εξαρτάται από την προέλευσή της (Huisman, 2000), το στάδιο -25-

66 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα ανάπτυξης του φυτού (Huyskens-Keil et al., 2006; Van Linden et al., 2008) αλλά και από την ακριβή της θέση στο κυτταρικό τοίχωμα (Libermans et al. 1999). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία η πηκτίνη μπορεί να κατηγοριοποιηθεί σε τέσσερις μεγάλες ομάδες: Ομογαλακτουρονάνη (homogalacturonan, HGA), ραμνογαλακτουρονάνη Ι (rhamnogalacturonan I, RGI), ραμνογαλακτουρονάνη ΙΙ (rhamnogalacturonan II, RGII) και ξυλογαλακτουρονάνη (xylogalacturonan, XGA) (Mohnen, 2008). Η ομογαλακτουρονάνη αποτελείται από μόρια γαλακτουρονικού οξέος ενωμένα μεταξύ τους με (1 4) α-d-δεσμούς (Σχήμα 2.1). Οι ελεύθερες καρβοξυλικές ομάδες του γαλακτουρονικού οξέος μπορούν να εστεροποιηθούν με μεθανόλη. Ο βαθμός εστεροποίησης των πηκτινών ποικίλει ανάλογα με την προέλευσή τους και προσδιορίζει τη συμπεριφορά τους στις διάφορες εφαρμογές στη τεχνολογία τροφίμων (Belitz et al., 2006). Οι μη εστεροποιημένες περιοχές του HGA μπορούν να συνδεθούν μεταξύ τους με ιοντικές αλληλεπιδράσεις μέσω γεφυρών ιόντων ασβεστίου όπως φαίνεται στο Σχήμα 2.1. Προκειμένου να δημιουργηθεί ένας σταθερός δεσμός μεταξύ των αλυσίδων HGA, απαιτούνται τουλάχιστον 10 γειτονικά μη εστεροποιημένα γαλακτουρονικά οξέα (Liners et al., 1992). Η RGI αποτελείται από επαναλαμβανόμενες μονάδες δισακχαριτών, οι οποίοι αποτελούνται από (1 2) α-d-ραμνόζη (1 4) α-d-γαλακτουρονικό οξύ. Τα μόρια ραμνόζης της κύριας αλυσίδας του πολυμερούς (Rhamnosyl residues) μπορούν να υποκατασταθούν περαιτέρω με πλευρικές αλυσίδες πλούσιες σε β-dγαλακτόζη και α-l-αραβινόζη, δημιουργώντας διακλαδώσεις (Σχήμα 2.2). Η RGII είναι σπανιότερο συστατικό των κυτταρικών τοιχωμάτων (περίπου 10% της πηκτίνης) και αποτελείται από HGA ως κύρια αλυσίδα, η οποία παρουσιάζει υποκαταστάσεις με διάφορα σάκχαρα, τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με περισσότερους από 20 δεσμούς. Η RGII εμφανίζεται στο κυτταρικό τοίχωμα συνήθως με τη μορφή διμερών, διασταυρωμένων μέσω βορικών διεστέρων (Ishii et al., 1999). Μία ακόμα πλευρική αλυσίδα των πηκτινών αποτελεί η ξυλογαλακτουρονάνη, η οποία αποτελείται από γαλακτουρονάνη, ως κύρια αλυσίδα, υποκατεστημένη με πλευρικές μονάδες χυλόζης στο Ο-3 (Willats et al., 2004). -26-

67 Δομή και ρόλος των πηκτινών Σχήμα 2.1 Δομή HGA όπου φαίνονται οι διαμοριακοί δεσμοί ιόντων ασβεστίου (Buchanan et al., 2000) Σχήμα 2.2 Δομή RG I (Buchanan et al., 2000) -27-

68 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα Οι πηκτίνες μπορούν να συνδεθούν μεταξύ τους με ομοιοπολικούς δεσμούς, εν μέρει μέσω διφερουλικών οξέων, ενώ συνδέονται και με άλλα πολυμερή των κυτταρικών τοιχωμάτων, όπως η κυτταρίνη και οι γλυκάνες (Thompson & Fry, 2000; Zykwinska et al., 2005; Coenen et al., 2007). Η σχετική αφθονία και κατανομή των πολυμερών αυτών στο ανώτερο κοιτταρικό τοίχωμα δεν είναι σταθερή. Διαφορές στη δομή τους εμφανίζονται τόσο μεταξύ των διαφορετικών μορφών του κυττάρου και του είδους του φυτού, όσο εντός του κυτταρικού τοιχώματος του ίδιου κυττάρου (Knox, 2008; Jarvis, 2009). Καθώς οι πηκτίνες αποτελούν συνήθως το 50 % του κυτταρικού τοιχώματος των φρούτων, οποιαδήποτε μεταβολή στη δομή τους προκαλεί αλλαγές κυρίως στη δομή των τροφίμων στα οποία περιέχονται (Blumer et al., 2000). 2.2 Αντιδράσεις διάσπασης των πηκτινών Κατά την ωρίμανση, την επεξεργασία και αποθήκευση των φρούτων, λαχανικών και των προϊόντων τους λαμβάνουν χώρα ενζυμικές και μη ενζυμικές αντιδράσεις, οι οποίες προκαλούν διάσπαση ή/και μεταβολές στη δομή των πηκτινών (Sila et al., 2009). Στο Σχήμα 2.3 απεικονίζεται μια σειρά δομικών μεταβολών των πηκτινών που οφείλονται είτε στη δράση ενζύμων είτε σε μη ενζυμικές αντιδράσεις Μη ενζυμική αποικοδόμηση των πηκτινών Αρκετές αντιδράσεις μη ενζυμικής φύσης είναι υπεύθυνες για την αποικοδόμηση των πηκτινών. Η πιο σημαντική είναι η διάσπαση β-θέσης (βelimination). Πρόκειται για μια διεργασία, η οποία συμβαίνει σε υψηλές θερμοκρασίες και συνθήκες ελαφρώς όξινου ή ουδέτερου ph. Κατά την αντίδραση αυτή η πηκτινική αλυσίδα διασπάται μόνο στη β- θέση μιας εστερικής ομάδας. Ο γλυκοζιδικός δεσμός σπάει και σχηματίζεται ένας διπλός δεσμός μεταξύ του C 4 και C 5 του σχηματιζόμενου μη αναγωγικού τμήματος. Η αντίδραση αυτή ενισχύεται με αύξηση του βαθμού μεθυλεστεροποίησης, της θερμοκρασίας και του ph (Keijbets & -28-

69 Αντιδράσεις διάσπασης των πηκτινών Pilnik, 1974). Καθώς τα περισσότερα φυτικής προέλευσης τρόφιμα έχουν ph μεγαλύτερο του 4,5 και υφίστανται επεξεργασία σε θερμοκρασία 80 C ή και μεγαλύτερη, είναι επιρρεπή στην αντίδραση αυτή (Sila et al., 2005). Ένας δεύτερος μηχανισμός που οδηγεί σε διάσπαση της πηκτίνης κατά τη θερμική επεξεργασία είναι η όξινη υδρόλυση (ph<3,0). Σε όξινες συνθήκες, οι πηκτίνες με μικρό βαθμό μεθοξυλίωσης υδρολύονται ταχύτερα και η αντίδραση ενισχύεται με την ταυτόχρονη χημική απομεθοξυλίωση του πολυμερούς υπό αυτές τις συνθήκες (Krall & McFeeters, 1998; Van Buren, 1979). Ca +2 Βελτίωση υφής Αύξηση ιξώδους Όξινη υδρόλυση Υποβάθμιση υφής Μείωση ιξώδους Υποβάθμιση υφής/ μείωση ιξώδους Βελτίωση εκχύλισης χυμού Απώλεια θολώματος Σχήμα 2.3 Σχηματική παρουσίαση των πιθανών αντιδράσεων μετατροπής της πηκτίνης σε φυτικά τρόφιμα και πιθανά μονοπάτια επίδρασης στα ποιοτικά χαρακτηριστικά (Sila et al., 2009) -29-

70 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα Ενζυμική αποικοδόμηση των πηκτινών Η συνεργιστική δράση ενδογενών και εξωγενών ενζύμων οδηγεί στη μετατροπή και αποικοδόμηση των ομαλών και διακλαδισμένων περιοχών των πηκτινών. Τα ένζυμα που δρουν στην ομαλή περιοχή μπορεί να είναι εστεράσες ή αποπολυμεράσες. Οι εστεράσες καταλύουν την απομεθυλίωση του HGA των κυτταρικών τοιχωμάτων, απελευθερώνοντας μεθανόλη και πρωτόνια δημιουργώντας αρνητικά φορτισμένες καρβοξυλικές ομάδες. Το αποεστεροποιημένο HGA μπορεί να συνδεθεί με δισθενή ιόντα (όπως Ca +2 και Mg +2 ) σχηματίζοντας υπερμοριακούς δεσμούς και/ή gels (πηκτές). Οι σχηματισμοί αυτοί δρουν ως μεσοκυτταρική κόλλα προσδίδοντας σταθερότητα στους ιστούς (Bartolome & Hoff, 1972). Παράλληλα οι ελεύθερες καρβοξυλικές ομάδες αποτελούν υπόστρωμα για τη δράση των ενζύμων που είναι υπεύθυνα για τον αποπολυμερισμό των πηκτινών. Κατά τον αποπολυμερισμό τα πολυμερή των πηκτινών διασπώνται προς σχηματισμό μικρότερων μορίων, γεγονός που συνδέεται άμεσα με απώλειες της υφής και του ιξώδους, ενώ παράλληλα είναι χρήσιμα στην αύξηση της εκχυλισιμότητας των χυμών και τον έλεγχο της σταθερότητας του θολώματος. 2.3 Πηκτινολυτικά ένζυμα Τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για τις αντιδράσεις αποικοδόμησης των πηκτινών ονομάζονται πηκτινολυτικά ένζυμα ή πηκτινάσες. Πρόκειται για πολύπλοκα μακρομόρια, τα οποία, όπως και οι πηκτίνες, παίζουν σημαντικό ρόλο στις μηχανικές ιδιότητες των φυτικών ιστών και των επεξεργασμένων τροφίμων φυτικής προέλευσης (Waldron et al., 2003). Τα ένζυμα αυτά απαντώνται στα ανώτερα φυτά ενώ μπορούν να παραχθούν και από μικροοργανισμούς (βακτήρια και μύκητες) (Whitaker, 1990; Jayani et al., 2005). Οι τεχνολογικές εφαρμογές των πηκτινολυτικών ενζύμων ποικίλουν και καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα βιομηχανιών όπως η βιομηχανία τροφίμων, φαρμάκων και τροφοφαρμάκων. Στη βιομηχανία τροφίμων οι πηκτινάσες βρίσκουν εφαρμογή στην εκχύλιση και την αύξηση της απόδοσης χυμών φρούτων και λαχανικών, στην ενζυμική αποφλοίωση φρούτων, -30-

71 Πηκτινολυτικά ένζυμα στον έλεγχο των ρεολογικών ιδιοτήτων πουρέ και πολτών φρούτων και λαχανικών, στη βελτίωση της υφής φρούτων και λαχανικών καθώς και προϊόντων τους, στη βιομηχανία κρασιού κ.α (Duvetter et al., 2009). Η κατηγοριοποίηση των πηκτινασών γίνεται είτε ανάλογα με το υπόστρωμα πάνω στο οποίο δρουν, είτε σύμφωνα με το μηχανισμό δράσης τους (Rexova-Bankova & Marcovich, 1976; Rombouts & Pilnik, 1980), όπως φαίνεται στον Πίνακα 2.1. Έτσι, ανάλογα με τον τύπο του δεσμού τον οποίο διασπούν, οι πηκτινάσες διακρίνονται σε εστεράσες και αποπολυμεράσες. Οι εστεράσες υδρολύουν τους μεθυλικούς, οξικούς και φερουολικούς εστέρες των πηκτινών. Στην κατηγορία αυτή ανήκει η Πηκτινομεθυλεστεράση (PME). Οι αποπολυμεράσες διασπούν δεσμούς μεταξύ μονοσακχαριτών (Voragen et al., 2003; Whitaker et al., 2003) και διακρίνονται σε υδρολάσες (πολυγαλακτουρονάσες, PG) και λυάσες (pectin lyase και pectate lyase, PL). Οι υδρολάσες καταλύουν τη διάσπαση γλυκοζιδικών δεσμών, ενώ οι λυάσες διασπούν τα πολυμερή μέσω της διάσπασης β-θέσης σχηματίζοντας κορεσμένα μη αναγωγικά άκρα. Τα ένζυμα των αποπολυμερασών μπορεί να είναι ενδο- ή εξωένζυμα. Τα ενδο-ένζυμα διασπούν το υπόστρωμα σε τυχαίες θέσεις, ενώ τα εξωένζυμα ξεκινούν τη διάσπαση από το μη αναγωγικό άκρο του υποστρώματος (Pilnic & Voragen, 1993). Οι πηκτινικές λυάσες (pectin lyases) δρουν κατά προτίμηση σε υψηλά μεθοξυλιωμένες πηκτινικές αλυσίδες σε αντίθεση με τις λυάσες του πηκτινικού οξέος (pectate lyases). Η PL πιστεύεται ότι είναι ένζυμο εξωγενούς προέλευσης και δεν απαντάται στα φυτά. Πρόσφατες όμως έρευνες κάνουν λόγο για ύπαρξη PL- τύπου αλληλουχιών στα γονιδιώματα αρκετών φυτών (Rodriguez et al., 2002; Owino et al., 2005). Από τα πηκτινολυτικά ένζυμα τα πλέον διαδεδομένα στους φυτικούς ιστούς είναι η πηκτινομεθυλεστεράση (PME) και η πολυγαλακτουρονάση (PG). -31-

72 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα Πίνακας 2.1 Κατηγορίες πηκτινασών ανάλογα με το μηχανισμό δράσης τους (Duvetter et al. 2009) Ένζυμο Υπόστρωμα Μηχανισμός δράσης Προϊόντα Πηκτινομεθυλεστεράση PME Πηκτίνη Υδρόλυση Πηκτικό οξύ + μεθανόλη Πολυγαλακτουρονάση PG Ένδο-PG Πηκτικό οξύ Υδρόλυση Ολιγογαλακτουρονικό οξύ Έξω-PG Πηκτικό οξύ Υδρόλυση μονογαλακτουρονικό οξύ Πηκτινική Λυάση Πηκτίνη Διάσπαση β-θέσης Ακόρεστο γαλακτουρονικό οξύ Πηκτική Λυάση (PL) Ένδο-PL Πηκτικό οξύ Διάσπαση β-θέσης Ακόρεστο γαλακτουρονικό οξύ Έξω-PL Πηκτικό οξύ Διάσπαση β-θέσης Ακόρεστο γαλακτουρονικό οξύ Ραμνογαλακτουρονάση Πηκτίνη Υδρόλυση α-(1,2) L-Rha, α-(1,4) D -Gal Rhamnogalacturonan acetyl esterase Πηκτίνη Υδρόλυση Πηκτίνη + οξικό οξύ α-l-αραβινο-φουρανοσιδάση Αραβινάνες Υδρόλυση α-l-αραβινόζη Ένδο αραβινονάση (1,5)-α-αραβινάνες Υδρόλυση Αραβινόζη, ολιγοσακχαρίτες β-d-γαλακτανάση γαλακτάνες Υδρόλυση β-d-γαλακτόζη -32-

73 Πηκτινολυτικά ένζυμα Πηκτινομεθυλεστεράση (PME) Η Πηκτινομεθυλεστεράση, PME (EC ), υδρολύει τις μεθυλεστερικές ομάδες των πηκτινών δίνοντας ως προϊόν πηκτίνη με μικρότερο βαθμό εστεροποίησης, πηκτινικό οξύ και μεθανόλη (Σχήμα 2.4). Η PME απαντάται σε πολλά ανώτερα φυτά ενώ μπορεί να παραχθεί και από διάφορους μύκητες και βακτήρια, κυρίως από μύκητες του γένους Aspergillus. Η PME είναι δεσμευμένη στο κυτταρικό τοίχωμα και εμφανίζεται ως σύμπλοκο με την πηκτίνη μέσω ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης (Macmillan & Sheman, 1974; Basak & Ramaswamy, 1996). Από μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί αναφορικά με τη δομή της PME, έχει αποδειχθεί ότι το ένζυμο σχηματίζεται από ένα απλό και μικρού μοριακού βάρους πολυπεπτίδιο (Markovic & Jörnvall, 1986; Pressey & Woods, 1992). Ανάλογα με το φυτό απ όπου προέρχεται, το πολυπεπτίδιο αυτό μπορεί να παρουσιάζει κάποιο βαθμό γλυκοζυλίωσης. Πρόκειται για μία πρωτεΐνη δομής β- έλικας που χαρακτηρίζεται από την παρουσία παράλληλων β-πτυχωτών φύλων (Σχήμα 2.5) (Micheli, 2001; Johansson et al., 2002). PME PME PG PG Me Me Me Me Me Me Me O O O O O O O -GalUA-GalUA-GalUA-GalUA-GalUA-GalUA- GalUA-GalUA-GalUA-GalUA-GalUA-GalUA-GalUA- Me Me Me O O O -GalUA-GalUA-GalUA-GalUA- MeOH MeOH Me Me GalUA-GalUA-GalUA-GalUA- O O GalUA-GalUA-GalUA-GalUA-GalUA- Σχήμα 2.4 Δράση της PME και PG στην πηκτίνη. Η PME καταλύει την απομάκρυνση μεθυλεστερικών ομάδων του γαλακτουρονικού οξέος (GalUA) της πηκτίνης. Η Endo-PG υδρολύει γλυκοζιδικούς δεσμούς στις απόμεθυλεστεροποιημένες περιοχές του HGA -33-

74 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα Η ενεργότητα της PME προσδιορίζεται συνήθως μέσω του ποσοτικού προσδιορισμού του οξέος ή της μεθανόλης που παράγεται κατά τη δράση της στην πηκτίνη. Το ποσό του οξέος προσδιορίζεται είτε με τιτλοδοτική ή φασματοφωτομετρική μέθοδο, ενώ η μεθανόλη προσδιορίζεται κυρίως φασματοφωτομετρικά. Στη διεθνή βιβλιογραφία αρκετές έρευνες έχουν επικεντρωθεί στην απομόνωση της από διάφορα φρούτα και λαχανικά όπως για παράδειγμα στο μήλο (Denes et al., 2000), τη μπανάνα (Ly Nguyen et al., 2002a), το καρότο (Ly Nguyen et al., 2002b; Alonso et al., 2003; Sila et al., 2007), η πράσινη πιπεριά (Castro et al., 2006), το πορτοκάλι (Van den Broeck et al., 2000a), την παπάγια (Fayyaz et al., 1995), το ροδάκινο (Javeri & Wicker, 1991), το λωτό (Alonso et al., 1997), το δαμάσκηνο (Nunes et al., 2006), τη φράουλα (Ly Nguyen et al., 2002c), το κεράσι (Alonso et al., 1996) και την τομάτα (Giovane et al., 1994; Fachin et al., 2002a). Σύμφωνα με τις έρευνες αυτές η PME προερχόμενη από διαφορετική πηγή προέλευσης παρουσιάζει και διαφορετικές βιοχημικές και βιοφυσικές ιδιότητες (Πίνακας 2.2), ενώ έχουν ταυτοποιηθεί και ισοένζυμα. Σχήμα 2.5 Τρισδιάστατη δομή φυτικής πηκτινομεθυλεστεράσης όπου φαίνονται οι β-έλικες και τα β-πτυχωτά φύλλα -34-

75 Πηκτινολυτικά ένζυμα Πίνακας 2.2 Βιοχημικές και βιοφυσικές ιδιότητες της PME φυτικής προέλευσης Προέλευση PME Μοριακή μάζα (kda) pi Βέλτιστη θερμοκρασία ( C) Βέλτιστο ph Αναφορά Μπανάνα 38,0-45, ,0-8,0 LyNguyen et al., 2002a Καρότο 32,0 > 9,3 50 8,0 Sila et al., 2007 Πορτοκάλι 36,2 10,5 7,6 Versteeg et al., 1978 Πιπεριά 33,0-37,0 6,0-9,3 52,5-55,0 7,5 Castro et al., 2006 Λωτός 51,0 8,4 7,4 Alonso et al., 1997 Δαμάσκηνo 31,0 6,8-7,0 65 7,5 Nunes et al., 2006 Φράουλα 33,5-43,0 > 9, ,9-7,0 LyNguyen et al., 2002c Τομάτα 33,6 > 9,0 55 8,0 Fachin et al., 2002a Γενικά οι PME είναι ένζυμα με μοριακή μάζα που κυμαίνεται από 25 έως 54 kda, το ισοηλεκτρικό τους σημείο ποικίλει από 3,1 για προερχόμενες από μύκητες έως 11 για την PME τομάτας (Bordenave, 1996), ενώ η βέλτιστη θερμοκρασία και το βέλτιστο ph είναι διαφορετικό ανάλογα με την πηγή προέλευσης. Οι Ly Nguyen et al. (2003b) απομόνωσαν και ταυτοποίησαν PME προερχόμενη από μπανάνα, η οποία παρουσίασε βέλτιστη ενεργότητα σε ph 6,9 7,0 και θερμοκρασία C, ενώ σύμφωνα με τους Fachin et al. (2002a), η PME τομάτας παρουσίασε βέλτιστη δράση σε ph 8,0 και θερμοκρασία 55 C. Το γεγονός ότι η PME είναι ευρέως διαδεδομένη στα φυτά εξηγεί τη βιολογική και τεχνολογική της σημασία. Η PME έχει προταθεί ως βιοτεχνολογικό εργαλείο για την αντιμετώπιση της τροποποίησης της υφής φρούτων και λαχανικών -35-

76 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα κατά τη θερμική τους επεξεργασία. Οι Anastasakis et al. (1987) και Multu et al. (1999) χρησιμοποίησαν PME σε συνδυασμό με άλλες πηκτινάσες για την αύξηση της απόδοσης στην εκχύλιση χυμών φρούτων και λαχανικών. Ωστόσο η ύπαρξη του ενζύμου παρουσιάζει αρνητική επίδραση στη σταθερότητα των πηκτινικών ουσιών σε χυμούς φρούτων και συμπυκνώματα αυτών, προκαλώντας απώλεια θολώματος (π.χ. χυμός πορτοκάλι). Λαμβάνοντας, λοιπόν υπόψη το λειτουργικό ρόλο της PME θα πρέπει να είναι ενεργή ή να απενεργοποιείται ανάλογα με το επιθυμητό αποτέλεσμα κάθε διεργασίας στην οποία λαμβάνει μέρος Πολυγαλακτουρονάση (PG) Η Πολυγαλακτουρονάση (PG) υδρολύει τη διάσπαση των α-1,4 γλυκοζιδικών δεσμών του πολυγαλακτουρονικού οξέος των πηκτινών. Προτιμά μη εστεροποιημένα υποστρώματα και η ενεργότητά της μειώνεται με αύξηση του βαθμού εστεροποίησης των πηκτινών. Η exo-pg (EC ) απομακρύνει μόρια γαλακτουρονικού οξέος από το μη αναγωγικό άκρο του HGA. Η endo-pg [poly(1,4-α-d-galacturonide) glycanohydrolase, EC ] είναι υπεύθυνη για τον αποπολυμερισμό της πηκτίνης, υδρολύοντας τους γλυκοζιδικούς δεσμούς των αποεστεροποιημένων περιοχών του HGA (Σχήμα 2.3). Η ενεργότητα της PG προσδιορίζεται συνήθως μέσω των σακχάρων που παράγονται κατά τη δράση της στην πηκτίνη συναρτήσει του χρόνου. Το ποσό των αναγωγικών σακχάρων που απελευθερώνεται κατά την υδρόλυση της πηκτίνης προσδιορίζεται συνήθως φασματοφωτομετρικά (Miller, 1959; Collmer et al., 1988; Gross, 1982). Η πολυγαλακτουρονάση αποτελεί μία πρωτεΐνη με δομή β-έλικας που χαρακτηρίζεται από την παρουσία τριών παράλληλων β-πτυχωτών επιφανειών (Σχήμα 2.6). Το ένζυμο της PG έχει ανιχνευθεί σε ορισμένα βακτήρια, ζύμες, μύκητες (Luh & Phaff, 1951) και ανώτερα φυτά όπως μήλο (Wu et al., 1993), αβοκάντο (Wakabayashi & Huber, 2001), μπανάνα (Pathak & Sanwal, 1998), αγγούρι (Pressey -36-

77 Πηκτινολυτικά ένζυμα & Avants, 1975; MacFeeters et al., 1980), κεράσι (Gayathri et al., 2007), μάνγκο (Chaimanee, 1992; Ketsa et al., 1998; Prasanna et al., 2006; Singh & Dwivedi, 2008), παπάγια (Chan & Tam, 1982), αχλάδι (Pressey & Avants, 1976), ροδάκινο (Pressey et al., 1971a), φράουλα (Nogata et al., 1993) και τομάτα (Pressey & Avants, 1971b; Ali & Brady, 1982; Moshrefi & Luh, 1984; Pressey, 1987). Σχήμα 2.6 Τρισδιάστατη δομή πολυγαλακτουρονάσης Οι περισσότερες PG που υπάρχουν στα ανώτερα φυτά είναι ενδο-ένζυμα. Στα φυτά η PG απαντάται με τη μορφή ισοενζύμων, των οποίων η δομή και η μοριακή μάζα (23,2 έως 120 kda) διαφέρουν ανάλογα με την πηγή προέλευσης (Duvetter et al., 2009). Οι PG ως βασικές πρωτεΐνες εμφανίζουν υψηλό ισοηλεκτρικό σημείο, γεγονός που υποδηλώνει ότι συνδέονται με το κυτταρικό τοίχωμα του υποστρώματος με ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση. Σε αυτό το συμπέρασμα οδηγεί και το γεγονός ότι για την εκχύλιση του ενζύμου από τα κύτταρα των φυτών απαιτείται, είτε υψηλό ph, είτε υψηλή συγκέντρωση άλατος σε χαμηλό ph (Ali & Brady, 1982). Όπως συμβαίνει και με τις PME, το βέλτιστο ph για τη δράση της PG εξαρτάται τόσο από την πηγή προέλευσης του ενζύμου, όσο και από τη μορφή του ισοενζύμου στην ίδια πηγή. Για τις διάφορες μορφές ισοενζύμου PG στο αβοκάντο, το μάνγκο, το αγγούρι, το ροδάκινο, το αχλάδι, τη φράουλα, το κεράσι και την τομάτα, το βέλτιστο ph κυμαίνεται μεταξύ 4 και 6. Xαμηλότερες τιμές έχουν -37-

78 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα αναφερθεί στη βιβλιογραφία αναφορικά με το βέλτιστο ph δράσης της PG μπανάνας και μάνγκο ποικιλίας Alfonso (3,2 3,9 και 3,3-4,3, αντίστοιχα) (Duvetter et al., 2009). Ο ρυθμός αποικοδόμησης των πηκτινών καθώς και το μαλάκωμα των φρούτων και λαχανικών σχετίζεται με την εμφάνιση της PG στα διάφορα ανώτερα φυτά, με αποτέλεσμα να πιστεύεται ότι η δράση του ενζύμου είναι υπεύθυνη για το μαλάκωμα των φρούτων κατά την ωρίμανση. Σύμφωνα όμως με πρόσφατες βιοχημικές έρευνες και μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε γενετικά τροποποιημένα, στα οποία είχε κατασταλεί η παραγωγή της PG με γενετική μηχανική, το μαλάκωμα των φρούτων δεν είναι φαινόμενο εξαρτώμενο αποκλειστικά και μόνο στη δράση της PG (Arancibia & Motsenbocker, 2006; Almeida & Huber, 2007; Smith et al., 1990; Speirs & Brady, 1991). H PG παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην επεξεργασία φρούτων και λαχανικών. Δεδομένα σταθερότητας και ενεργότητας της PG χρήζουν εξαιρετικής σημασίας εφόσον, ανάλογα με το επιδιωκόμενο αποτέλεσμα του τελικού προϊόντος, μεταβολές που προκαλούνται από τη δράση της PG πρέπει είτε να παρεμποδίζονται, διασφαλίζοντας έτσι, την παραγωγή προϊόντων υψηλού ιξώδους ή περιορίζοντας τις απώλειες συνεκτικότητας των φυτικών ιστών, είτε να ενισχύονται για την παραγωγή προϊόντων μειωμένου ιξώδους, την αύξηση της εκχυλισιμότητας ή την καλύτερη διαλεύκανση των χυμών φρούτων και λαχανικών. 2.4 Επίδραση της θερμοκρασίας στα ένζυμα PME και PG Η τεχνολογική σπουδαιότητα των πηκτινασών προκαλεί ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην επεξεργασία φρούτων και λαχανικών. Παραδοσιακές τεχνολογίες, όπως η θερμική επεξεργασία, αλλά και καινοτόμες τεχνολογίες, όπως η υπερυψηλή υδροστατική πίεση, επηρεάζουν σημαντικά τις αντιδράσεις ενζυμικής μετατροπής των πηκτινών (Duvetter et al., 2009). Κατά την επεξεργασία μπορεί να προκληθεί μετουσίωση και μερική ή ολική και αναντίστρεπτη απενεργοποίηση των πηκτινολυτικών ενζύμων με αποτέλεσμα τη μειωμένη αποικοδόμηση της πηκτίνης, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις η καταλυτική τους ικανότητα ενισχύεται -38-

79 Πηκτινολυτικά ένζυμα προκαλώντας εκτεταμένες δομικές αλλαγές των πηκτινών. Σε ορισμένες διεργασίες είναι επιθυμητή η ολική απενεργοποίηση των ενζύμων, ενώ σε κάποιες άλλες η καταλυτική τους ικανότητα θα πρέπει να διατηρείται ή να ενισχύεται ακόμα και υπό έντονες συνθήκες διεργασιών. Συνεπώς για το σχεδιασμό διεργασιών με βέλτιστο αποτέλεσμα απαιτείται η γνώση της καταλυτικής ικανότητας και των μηχανισμών απενεργοποίησης των ενζύμων. Τα περισσότερα ένζυμα παρουσιάζουν βέλτιστη ενεργότητα σε θερμοκρασία C περίπου, ενώ η μετουσίωσή τους ξεκινά σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 45 C. Κατά τη θερμική επεξεργασία τόσο οι μη ομοιοπολικοί όσο και οι ομοιοπολικοί δεσμοί των ενζύμων (σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 70 C) μεταβάλλονται προκαλώντας αναδιαμόρφωση της πρωτεϊνικής αλυσίδας και χημικές μεταβολές των ενζύμων, αντίστοιχα. Το πρώτο και σημαντικό στάδιο στη θερμική απενεργοποίηση των ενζύμων αποτελεί το μερικό ξεδίπλωμα του μορίου της πρωτεΐνης. Πάνω από κάποια θερμοκρασία όλες οι ισορροπίες μεταξύ διαφορετικών μη ομοιοπολικών δυνάμεων όπως οι δεσμοί υδρογόνου, οι υδροφοβικές, ιονικές και van der Waals αλληλεπιδράσεις αποδυναμώνονται καταλήγοντας σε λιγότερο συγκροτημένες διαμορφώσεις των πρωτεϊνών. Αν η μετουσίωση της πρωτεΐνης επηρεάσει την τρισδιάστατη δομή του ενεργού κέντρου του, τότε μπορεί να προκληθεί απενεργοποίηση του ενζύμου (Indrawati, 2000). Η θερμική απενεργοποίηση της πηκτινομεθυλεστεράσης διαφόρων φρούτων και λαχανικών έχει αποτελέσει αντικείμενο μελέτης πολλών ερευνητών (Ly Nguyen et al., 2002a; Ly Nguyen et al., 2002b; Ly Nguyen et al., 2002c; Ly Nguyen et al., 2003; Balogh et al., 2004; Polydera et al., 2004; Boulekou et al., 2008; Castro et al., 2006; Crelier et al., 2001; Nienaber & Shellhammer, 2001, Stoforos et al., 2002; Fachin et al,. 2003; Riahi et al., 2003; Guiavarc h et al., 2005). Βιβλιογραφικές αναφορές δείχνουν ότι ανάλογα με την πηγή προέλευσης και την ύπαρξη ή όχι διαφόρων μορφών του ενζύμου (ισοένζυμα), η PME παρουσιάζει διαφορετική ανθεκτικότητα και συμπεριφορά κατά τη θερμική επεξεργασία. Σύμφωνα με τους Boulekou et al. (2008), οι οποίοι μελέτησαν την κινητική απενεργοποίησης της PME σε πούλπα ροδάκινου κατά τη θερμική επεξεργασία (45-70 C), η PME ροδάκινου εμφανίστηκε περισσότερο ανθεκτική στη θερμοκρασία σε -39-

80 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα σύγκριση με τις PME που εκχυλίστηκαν από καρότο (Balogh et al., 2004), φράουλα (Ly Nguyen et al., 2002c), grapefruit (Guiavarc h et al., 2005) και πιπεριά (Castro et al., 2006) και περισσότερο ευαίσθητη από την PME μπανάνας (Ly Nguyen et al., 2003b). Οι Balogh et al. (2004) μελέτησαν την επίδραση της θερμοκρασίας στην PME καρότου τόσο σε καθαρή μορφή όσο και στο ίδιο το τρόφιμο (χυμός και κομμάτια καρότου). Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι για να επιτευχθεί μείωση της ενεργότητας του ενζύμου, σε κομμάτια καρότου, κατά μία λογαριθμική μονάδα απαιτήθηκε θερμική επεξεργασία στους 73 C για 18 min, ενώ μόνο 10 min στους 58 C απαιτήθηκαν για την επίτευξη του ίδιου αποτελέσματος για την PME σε χυμό καρότου ή σε καθαρή μορφή. Εκτεταμένες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί, από πολλούς ερευνητές, που αφορούν στην ανθεκτικότητα της PME διαφόρων φρούτων και λαχανικών κατά τη θερμική επεξεργασία. Οι πιο πρόσφατες δημοσιεύσεις στην κινητική μελέτη της θερμικής απενεργοποίησης της PME συνοψίζονται στον Πίνακα 2.3. Σύμφωνα με τις εν λόγω μελέτες, αύξηση της θερμοκρασίας έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης της PME. Στις περισσότερες περιπτώσεις η απενεργοποίηση της PME περιγράφηκε από κινητική πρώτης τάξης. Ωστόσο στη βιβλιογραφία αναφέρονται και άλλα κινητικά μοντέλα, τα οποία περιγράφονται στη συνέχεια λεπτομερώς. Όσον αφορά τη PG, παρά τη σημασία της στις θερμικές διεργασίες, οι έρευνες σχετικά με τη θερμοανθεκτικότητά της είναι περιορισμένες. Γενικότερα έχουν αναφερθεί διαφορές στη ανθεκτικότητα μεταξύ των διαφόρων μορφών του ενζύμου κατά τη θερμική επεξεργασία ορισμένων φρούτων, όπως παρουσιάζεται στον Πίνακα 2.4. Οι Pathak & Sanwal (1998) απομόνωσαν τρεις μορφές PG από ώριμη μπανάνα (ποικιλία Musa acuminata), PG1, PG2 και PG3, οι οποίες διαφέρουν ως προς τη θερμοανθεκτικότητά τους. Πλήρης απενεργοποίηση των PG2 και PG1 επιτεύχθηκε κατά τη θέρμανση στους 60 και 70 C, ενώ η PG3 διατήρησε το 60 και 50% της ενεργότητάς της, αντίστοιχα. Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε και από τους Singh & Dwivedi (2008) για τη θερμική σταθερότητα των τριών μορφών της PG προερχόμενης από μάνγκο. -40-

81 Πηκτινολυτικά ένζυμα Πίνακας 2.3 Κινητικές παράμετροι της θερμικής απενεργοποίησης της PME προερχόμενης από διάφορα φρούτα και λαχανικά Πηγή Σύστημα Κινητικό μοντέλο T ( C) Τιμές z/ea Βιβλιογραφική Αναφορά Citrate Μήλο phosphate ph 4,0 1 ης τάξης z = 9,2 C Denes et al., 2000 Μπανάνα Tris buffer ph 7,0 1 ης τάξης 65-72,5 Ea = 379 kj/mol z = 5.89 C Ly Nguyen et al., 2002a Καρότο Tris buffer ph 7,0 Μερικής μετατροπής Ea = 289 kj/mol Ly Nguyen et al., 2002b κομμάτια 1 ης τάξης z = 4,13 C Καρότο Χυμός ph 6 1 ης τάξης z = 5,73 C Balogh et al., 2004 Citrate ph 5,5, 6,0 1 ης τάξης z ph=5,5 = 6,05 C z ph=6,0 = 5,37 C Πορτοκάλι Χυμός πορτοκάλι Μερικής μετατροπής Ea = 104 kj/mol Polydera et al., 2004 Ροδάκινο Χυμός 1 ης τάξης Ea = 289 kj/mol Boulekou et al., 2008 Grapefruit Tris buffer ph 7,0 Μερικής μετατροπής Ea = 329 kj/mol Guiavarc h et al., 2005 Citrate Πιπερία buffer ph 5,6 Διφασικό Ea L = 372 kj/mol Castro et al., 2006 Φράουλα Tris HCl ph 7,0 Μερικής μετατροπής Ea = 206,7 kj/mol Ly Nguyen et al., 2002c Χυμός πορτοκάλιγάλα Citrate ph 3,2-4,2 Διφασικό Ea L =532603kJ/mol Ea S =605955kJ/mol Sampedro et al., 2008 Ωστόσο, στο αβοκάντο, η PG απομονώθηκε σε δύο μορφές, PG1 και PG2, οι οποίες παρουσίασαν τα ίδια επίπεδα ενζυμικής ενεργότητας μετά από θέρμανση στους 65 C για 5 min (Wakabayashi & Huber, 2001). -41-

82 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα Πίνακας 2.4 Δεδομένα θερμικής σταθερότητας της PG διαφόρων φρούτων και λαχανικών Πηγή Ισοένζυμο Μείωση ενεργότητας (%) 5 min σε T ( C) Βιβλιογραφική Αναφορά Αβοκάντο Μάνγκο Μπανάνα PG PG PG PG PG PG PG PG Wakabayashi & Huber, 2001 Singh & Dwivedi, 2008 Pathak & Sanwal, Κινητική απενεργοποίησης ενζύμων Η κινητική της ενζυμικής απενεργοποίησης περιγράφει ποσοτικά τη μείωση της ενζυμικής ενεργότητας με το χρόνο της θερμικής διεργασίας. Ο τρόπος με τον οποίο εξελίσσεται η απενεργοποίηση συναρτήσει του χρόνου εκφράζεται με τη μαθηματική μορφή του κινητικού μοντέλου. Ο ρυθμός απενεργοποίησης εκφράζεται με τις αριθμητικές τιμές των κινητικών παραμέτρων. Οι τιμές των παραμέτρων είναι απαραίτητες για το σχεδιασμό και τη βελτιστοποίηση των διεργασιών επεξεργασίας των τροφίμων Κινητικό μοντέλο ης n τάξης Γενικά η μείωση της ενζυμικής ενεργότητας, Α, ως συνάρτηση του χρόνου επεξεργασίας, t, μπορεί να εκφραστεί από n τάξης κινητικό μοντέλο (Εξ. 2.1) ης -42-

83 Κινητική απενεργοποίησης ενζύμων da n = k A (2.1) dt όπου, k είναι η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης και ο εκθέτης n συμβολίζει την τάξη της αντίδρασης. Για σταθερούς εξωγενείς (π.χ. θερμοκρασία, πίεση) και ενδογενείς παράγοντες η ολοκλήρωση της Eξίσωσης (2.1) μεταξύ των αρχικών και τελικών συνθηκών οδηγεί στην ακόλουθη έκφραση της ενζυμικής ενεργότητας συναρτήσει του χρόνου. 1 n 1 n A = Ao + ( n 1) k t (2.2) Όπου A o είναι η αρχική ενζυμική ενεργότητα (στο χρόνο μηδέν της διεργασίας) Κινητικό μοντέλο 1ης τάξης Το γενικό ης n τάξης κινητικό μοντέλο μπορεί να απλοποιηθεί στην περίπτωση αντιδράσεων ης 1 τάξης ( n = 1 ). Σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας και πίεσης η μείωση της ενζυμικής ενεργότητας συναρτήσει του χρόνου περιγράφεται από την Eξίσωση (2.3): k t A = A o e (2.3) όπου, A είναι η ενεργότητα του ενζύμου σε χρόνο t, A o είναι η αρχική ενζυμική ενεργότητα, t είναι ο χρόνος επεξεργασίας και k είναι η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης Κινητικό μοντέλο μερικής μετατροπής 1 ης τάξης Το μοντέλο μερικής μετατροπής αποτελεί μια ειδική περίπτωση του μοντέλου 1 ης τάξης. Το μοντέλο αυτό λαμβάνει υπόψη μια μη μηδενική εναπομένουσα ενζυμική ενεργότητα μετά από παρατεταμένη επεξεργασία και περιγράφεται από την Eξίσωση (2.4). k t A = A f + ( Ao A f ) e (2.4) -43-

84 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα όπου, A f είναι η εναπομένουσα ενεργότητα του ενζύμου μετά από παρατεταμένη επεξεργασία. Η τιμή της εναπομένουσας αυτής ενεργότητας ενδέχεται να εξαρτάται ή όχι από τις συνθήκες επεξεργασίας Διφασικό κινητικό μοντέλο Ένζυμα τα οποία χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη δύο ισοενζύμων, όπως για παράδειγμα η PME πορτοκαλιού (Versteeg et al., 1980) μπορούν να υποδιαιρεθούν σε δύο κλάσματα, το ένα περισσότερο ανθεκτικό από το άλλο. Θεωρώντας σταθερούς τους ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες και υποθέτοντας ότι η απενεργοποίηση των δύο κλασμάτων του ενζύμου είναι πρώτης τάξης και ανεξάρτητη η μία από την άλλη, η απενεργοποίηση μπορεί να εκφραστεί από την Eξίσωση (2.5) (Chen & Wu, 1998). kl t ( 1 a) e ) ks t A = A ( a e + (2.5) o όπου, a είναι π.χ. το ανθεκτικό κλάσμα του ενζύμου, ( 1 a ) είναι π.χ. το ευαίσθητο κλάσμα του ενζύμου και k s και k l είναι η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης του σταθερού και ευαίσθητου κλάσματος ενζύμου, αντίστοιχα Θερμοκρασιακή εξάρτηση της σταθεράς ρυθμού απενεργοποίησης Η εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης, k T, από τη θερμοκρασία εκφράζεται μέσω της ενέργειας ενεργοποίησης ( E α ), όπως δίνεται από την εξίσωση (2.6) (Arrhenius, 1889). Η σχέση αυτή ισχύει σε συνθήκες σταθερής πίεσης. k T = k Tref e E a 1 1 R T T ref (2.6) -44-

85 Κινητική απενεργοποίησης ενζύμων Όπου,T (Κ) είναι η θερμοκρασία επεξεργασίας, T ref είναι μια θερμοκρασία αναφοράς k T ref είναι η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης στην T ref και R (8,314 J/mol K) η παγκόσμια σταθερά των αερίων Η αρχή του χρόνου θερμικού θανάτου Στην επεξεργασία τροφίμων είναι σύνηθες οι αντιδράσεις πρώτης τάξης να χαρακτηρίζονται από τις τιμές D και z (αρχή του θερμικού θανάτου). Στην περίπτωση των ενζύμων, ως χρόνος υποδεκαπλασιασμού (D-value) ορίζεται ο χρόνος που απαιτείται για τη μείωση της ενεργότητας τους κατά 90% σε σχέση με την αρχική ενεργότητα, σε δεδομένες συνθήκες θερμοκρασίας. Η σχέση μεταξύ του χρόνου D και της πιο γενικής σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης k δίνεται από την Εξίσωση (2.7). ln(10) D = (2.7) k Η θερμοκρασιακή εξάρτηση του D δίνεται από την τιμή z T (Εξ. 2.8). Η τιμή z T ισοδυναμεί με την αύξηση της θερμοκρασίας που απαιτείται ώστε να επιτευχθεί δεκαδική μείωση του χρόνου D. Tref T log( DT ) = log( DT ) + (2.8) ref zt όπου, D T ο χρόνος υποδεκαπλασιασμού σε θερμορασία Τ και DT ref ο χρόνος υποδεκαπλασιασμού σε σταθερή θερμοκρασία αναφοράς, T ref (Bigelow, 1921). -45-

86 Πηκτινολυτικά ένζυμα 2.6 Τα ένζυμα της τομάτας Ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την επιστημονική κοινότητα έχει αποτελέσει η μελέτη της επίδρασης της θερμικής επεξεργασίας στα πηκτινολυτικά ένζυμα, PME και PG, της τομάτας. Μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί αφορούν τόσο εκχυλισμένα ένζυμα όσο και ένζυμα στο φυσικό τους περιβάλλον. Οι De Sio et al. (1995) μελέτησαν τη θερμική απενεργοποίηση της PME από 5 διαφορετικές ποικιλίες τομάτας. Οι ποικιλίες που μελετήθηκαν παρουσίασαν αξιοσημείωτη διαφορά στην περιεχόμενη ενεργότητα του ενζύμου (14,5 43,6 Units/mL), ενώ δεν παρουσιάστηκε σημαντική διαφοροποίηση στη θερμοανθεκτικότητά τους. Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε και από τους Rodrigo et al. (2005), οι οποίοι μελέτησαν τη θερμική σταθερότητα της PME από τέσσερις ποικιλίες τομάτας. Και σε αυτή τη μελέτη, η ενεργότητα της PME που περιέχονταν στις διαφορετικές ποικιλίες τομάτας διέφερε (72,8 208,6 Units/500 g τομάτας), ενώ επιτεύχθηκε σχεδόν πλήρης απενεργοποίηση της PME μετά από επεξεργασία στους 70 C για 5 min για όλες τις ποικιλίες. Οι Fachin et al. (2002a) παρατήρησαν ότι η PME σε χυμό τομάτας ήταν λιγότερο θερμοάντοχη σε σύγκριση με την PME σε καθαρή μορφή. Για να επιτευχθεί μείωση της ενεργότητας του ενζύμου κατά 90% σε θερμοκρασίες επεξεργασίας C απαιτήθηκαν 175,8-3,1 min για την περίπτωση της PME σε εκχυλισμένη μορφή και 50-5,3 min για την PME χυμού τομάτας. Όπως συμβαίνει στις περισσότερες ενζυμικές αντιδράσεις, ο ρυθμός απομεθοξυλίωσης της πηκτίνης από την PME ενισχύεται με την αύξηση της θερμοκρασίας, μέχρις ότου προκληθεί απενεργοποίηση του ενζύμου. Η βέλτιστη θερμοκρασία για την καταλυτική ικανότητα της PME ποικίλει από C ανάλογα με την προέλευση του ενζύμου και το περιβάλλον δράσης του. Για παράδειγμα, στα προϊόντα τομάτας μέγιστα πλεονεκτήματα από την ενεργότητα της PME επιτυγχάνονται σε ph 7,2 και θερμοκρασία 55 C (Van den Broeck et al., 2000b). Οι Verlent et al. (2007) παρατήρησαν ότι η μέγιστη καταλυτική δράση της PME, που είχε εκχυλιστεί από τομάτα, σε μίγμα πηκτίνης (Βαθμός Εστεροποίησης, 80%) και καθαρής PG τομάτας, επιτεύχθηκε σε ph 4,4 και θερμοκρασία 60 C. Οι ίδιες βέλτιστες συνθήκες δράσης ίσχυσαν και στην περίπτωση απουσίας της PG από το μίγμα. -46-

87 Τα ένζυμα της τομάτας Η βέλτιστη θερμοκρασία για τη δράση της PG από τομάτα παρουσία πολυγαλακουρονικού οξέος (PGA) κυμάνθηκε μεταξύ 55 και 60 C σε ph 4,4 (Verlent et al., 2004). Αντίθετα ο αποπολυμερισμός ενός πιο σύνθετου υποστρώματος, όπως είναι η πηκτίνη, καταλύθηκε από την PG τομάτας εφόσον στο σύστημα περιεχόταν και PME τομάτας. Η βέλτιστη θερμοκρασία για αυτή την αντίδραση βρέθηκε ίση με 50 C στο φυσικό ph (4,4) των προϊόντων τομάτας (Verlent et al., 2007). Οι Rodrigo et al. (2005) απομόνωσαν και μελέτησαν τη θερμική σταθερότητα της PG από τέσσερις ποικιλίες βιομηχανικής τομάτας. Το ένζυμο απομονώθηκε σε δύο ισομορφές, την PG1 και PG2. Παρατήρησαν δύο φάσεις απενεργοποίησης του ενζύμου και για τις τέσσερις ποικιλίες, η μία ξεκινά από τους 55 C και αφορά την PG2, ενώ η δεύτερη ξεκινά στους 80 C και αφορά την PG1. Σχεδόν πλήρης απενεργοποίηση και των δύο ισοενζύμων παρατηρήθηκε μετά από θέρμανση για 5 min σε θερμοκρασία 90 C. Επιπλέον παρατήρησαν ότι οι διαφορετικές ποικιλίες περιείχαν PG1 και PG2 σε διαφορετικά ποσοστά με την PG1 να υπερτερεί στις δύο από τις μελετώμενες ποικιλίες. Η διαφορετική θερμική σταθερότητα μεταξύ της PG1 και PG2 τομάτας έχει μελετηθεί εκτεταμένα και αποδόθηκε στην ύπαρξη μιας θερμο-σταθερής γλυκοπρωτεΐνης με μοριακό βάρος 38 kda, η οποία ονομάστηκε β-υπομονάδα. Η γλυκοπρωτεΐνη αυτή έχει τη δυνατότητα να μετατρέπει το ισοένζυμο PG2 της τομάτας στο σύμπλοκο PG1 in vitro, το οποία διατηρεί το 50% της ενεργότητάς του μετά από θέρμανση στους 86 C για 5 min (Tucker et al., 1981; Pressey, 1984; Moore & Bennett, 1994; Tomassen et al., 2007). Ωστόσο, υπάρχουν αντικρουόμενα δεδομένα στη βιβλιογραφία αναφορικά με την παρουσία ή απουσία της PG1 in vivo. Ορισμένοι ερευνητές υποστηρίζουν ότι δεν υπάρχει PG1 in vivo στην τομάτα και ότι αυτή σχηματίζεται in vitro κατά τη διαδικασία της εκχύλισης, με το σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ της PG2 και της β-υπομονάδας. Άλλοι ερευνητές ισχυρίζονται ότι η PG1 είναι ένα ενεργό μόριο in vivo. Σύμφωνα με τους Peeters et al. (2004) η ποσότητα της PG1 που βρέθηκε σε χυμό τομάτας ήταν σημαντική και διαφορετική από αυτή που βρέθηκε σε κομμάτια νωπής τομάτας, ενισχύοντας την -47-

88 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα άποψη ότι η PG1 δεν υπάρχει στις ώριμες τομάτες και ότι αυτή δημιουργείται κατά την επεξεργασία του φρούτου. Τα πιο πρόσφατα διαθέσιμα κινητικά δεδομένα απενεργοποίησης της PME και PG στην τομάτα και τα προϊόντα της συνοψίζονται στους Πίνακες 2.5 και 2.6, αντίστοιχα. Πίνακας 2.5 Κινητικά δεδομένα θερμικής απενεργοποίησης της PME τομάτας Σύστημα Κινητικό μοντέλο T ( C) Τιμές z/ea Βιβλιογραφική Αναφορά Χυμός (var. CBX 199) 1 ης τάξης Ea = 477 kj/mol Χυμός (var. BOS 3155) 1 ης τάξης Ea = 440 kj/mol Χυμός (Nema 1401) 1 ης τάξης Ea = 350 kj/mol Εμπορική PME σε νερό 1 ης τάξης Ea = 267 kj/mol Εμπορική PME σε νερό 1 ης τάξης z = 6,5 C Χυμός (Flandria Prince) 1 ης τάξης z = 6,2 C Citrate buffer ph 4,4 1 ης τάξης z = 4,6 C Anthon et al., 2002 Crelier et al., 2001 Van den Broeck et al., 2000b Fachin et al., 2002 Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2.5 η θερμική απενεργοποίηση της PME τομάτας σε ατμοσφαιρική πίεση ακολούθησε κινητική 1ης τάξης σε όλες τις μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί. Οι τιμές των Ea και z που έχουν αναφερθεί είναι αρκετά υψηλότερες και χαμηλότερες, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας μεγαλύτερη εξάρτηση της απενεργοποίησης του ενζύμου από τις θερμοκρασιακές μεταβολές. Κατά αντιστοιχία, η απενεργοποίηση της PG τομάτας έχει βρεθεί ότι ακολουθεί κινητική 1 ης τάξης η οποία όμως υποδηλώνει είτε την ύπαρξη δύο ισοενζύμων, είτε μια εναπομένουσα δράση της PG μετά την επεξεργασία. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2.6, η μελέτη της θερμικής απενεργοποίησης της PG έχει πραγματοποιηθεί σε υψηλότερες θερμοκρασίες σε σχέση με την PME, υποδεικνύοντας ότι το ένζυμο της PG είναι περισσότερο ανθεκτικό στη θερμική επεξεργασία. Επιπλέον, για την PG έχουν αναφερθεί χαμηλότερες τιμές των Ea και -48-

89 Τα ένζυμα της τομάτας z, υποδηλώνοντας μικρή εξάρτηση της απενεργοποίησης του ενζύμου από τη θερμοκρασία επεξεργασίας. Πίνακας 2.6 Κινητικά δεδομένα θερμικής απενεργοποίησης της PG τομάτας Σύστημα Κινητικό μοντέλο T ( C) Τιμές z/ea Βιβλιογραφική Αναφορά Καθαρή PG ,5 z =5,6 C 1 ης τάξης Καθαρή PG z = 9,4 C Lopez et al., 1997 Χυμός τομάτας 1 ης τάξης Ea = 134,5 kj/mol Crelier et al., 2001 Χυμός τομάτας Ανεπεξέργαστο εκχύλισμα Καθαρή PG1 z = 10,4-10,8 C Ea = kj/mol 1 ης τάξης z = 7,1-7,7 C Ea = kj/mol Μερικής μετατροπής Ea = 457 kj/mol Διφασικό Ea = 104 kj/mol Ea S = 238 kj/mol Anthon et al., 2002 Fachin et al., 2002a Καθαρή PG2 1 ης τάξης z = 7,75 C Χυμός τομάτας Μερικής Ea = 228,3 kj/mol μετατροπής Fachin et al., Χαρακτηριστικά ποιότητας προϊόντων τομάτας Τα ρεολογικά χαρακτηριστικά της τομάτας συμβάλλουν σημαντικά στην ποιότητα τόσο του νωπού φρούτου όσο και των επεξεργασμένων προϊόντων του (Barrett et al., 1998). Στα επεξεργασμένα προϊόντα, η πιο σημαντική ποιοτική παράμετρος είναι το ιξώδες (Alviar & Reid, 1990). Όπως έχει ήδη αναφερθεί η δομή του κυτταρικού τοιχώματος της τομάτας έχει άμεση σχέση με το ιξώδες των προϊόντων της. Τόσο η συγκέντρωση όσο και ο τύπος των πολυμερών του κυτταρικού τοιχώματος στον ορό και στη σωματιδιακή φάση συμβάλλουν σημαντικά στο ιξώδες. Η ποσότητα και το μέγεθος των διαλυτών πολυμερών του κυτταρικού τοιχώματος που βρίσκονται στον ορό επηρεάζουν το ιξώδες του ορού, -49-

90 Κεφάλαιο 2-Πηκτίνη και πηκτινολυτικά ένζυμα ενώ η κατανομή του μεγέθους, το σχήμα και ο βαθμός παραμόρφωσης των κλασμάτων του κυτταρικού τοιχώματος στη σωαμτιδιακή φάση, επηρεάζουν το ιξώδες (Beresovsky et al., 1995; Den Ouden & Van Vliet, 1997). Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι το ιξώδες των προϊόντων τομάτας επηρεάζεται μερικώς από την ποικιλία του φρούτου, τις συνθήκες καλλιέργειας και το επίπεδο ωρίμανσης τους κατά το στάδιο της συγκομιδής, παράμετροι οι οποίες επηρεάζουν τη χημική σύσταση του φρούτου και κατά συνέπεια τις φυσικοχημικές ιδιότητες του χυμού. Επιπλέον παράμετροι επεξεργασίας, όπως η θερμοκρασία θραύσης του φρούτου, το μέγεθος οπής των διαχωριστήρων, η μηχανική διάτμηση κατά την επεξεργασία και ο βαθμός συμπύκνωσης, μπορούν επίσης να συμβάλλουν στο ιξώδες του τελικού προϊόντος. Οι διεργασίες αυτές προκαλούν αλλαγές στη μικροδομή των κυτταρικών τοιχωμάτων, οι οποίες μεταφράζονται σε μεταβολές του ιξώδους (Xu et al., 1986, Den Ouden & Van Vliet, 1997; Marsh et al., 1978). Εφόσον η διατήρηση της ακεραιότητας των πολυμερών του κυτταρικού τοιχώματος του χυμού είναι κρίσιμη, τα πηκτινολυτικά ένζυμα συνήθως πρέπει να απενεργοποιούνται προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η ενεργότητά τους και να αποφευχθεί η αποικοδόμηση της πηκτίνης κατά την αποθήκευση του προϊόντος. Λόγω της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας στα προϊόντα τομάτας, τα οποία είναι επεξεργασμένα σε σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες (περίπου 65 C, διεργασία Cold Break), το ιξώδες των προϊόντων είναι μικρό ενώ εμφανίζουν και χαμηλή συνεκτικότητα. Ένα προϊόν τομάτας με χαμηλή συνεκτικότητα δε διατηρεί τα στερεά του σε εναιώρημα με αποτέλεσμα να δημιουργείται συναίρεση του προϊόντος. Προκειμένου να αντιμετωπιστούν τα προβλήματα συναίρεσης, στη βιομηχανία τομάτας εφαρμόζεται η διεργασία της θερμής θραύσης (Hot Break, θερμοκρασία > 80 C), κατά την οποία επιτυγχάνεται πλήρης απενεργοποίηση και των δύο ενζύμων, PME και PG. Ωστόσο σε αυτές τις θερμοκρασίες παρατηρείται υποβάθμιση παραμέτρων ποιότητας των προϊόντων, όπως το χρώμα, η γεύση και η διατροφική τους αξία. Η βέλτιστη διεργασία θα απαιτούσε αφενός μεν την προστασία των πηκτινικών συστατικών από τη δράση της PG, η οποία θα μπορούσε να επιτευχθεί με την επιλεκτική απενεργοποίησή της, αφετέρου δε τη διατήρηση της ενεργότητας της PME. Όπως προκύπτει από τη βιβλιογραφική ανασκόπηση, τα δύο αυτά ένζυμα -50-

91 Τα ένζυμα της τομάτας παρουσιάζουν διαφορετική θερμοανθεκτικότητα, με την PG να απαιτεί εντονότερες συνθήκες θερμικής επεξεργασίας από την PME για την πλήρη απενεργοποίησή της. Συνεπώς κατά τη συμβατική θερμική επεξεργασία δεν είναι εφικτή η επιλεκτική απενεργοποίηση της PG. Ένας τρόπος να επιτευχθεί αυτό είναι η γενετική τροποποίηση του φρούτου της τομάτας σε φρούτο με μειωμένη ενεργότητα σε PG. Οι Porreta et al. (1998) χρησιμοποίησαν γενετικά τροποποιημένες τομάτες προς παραγωγή προϊόντων τομάτας. Οι τομάτες αυτές περιείχαν λιγότερο από 5% PG σε σχέση με τους μάρτυρες. Τα παραγόμενα προϊόντα παρουσίασαν καλύτερο ιξώδες και συνεκτικότητα συγκριτικά με τα προϊόντα μάρτυρες. Ωστόσο επιλεκτική απενεργοποίηση της PG θα μπορούσε εναλλακτικά να επιτευχθεί με τη χρήση νέων τεχνολογιών. Μία από αυτές αποτελεί η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης. Κάνοντας χρήση κατάλληλων συνδυασμών πίεσης και θερμοκρασίας η ενδογενής PG της τομάτας μπορεί να απενεργοποιηθεί ενώ ταυτόχρονα η PME να παραμείνει ενεργή. Προκειμένου όμως να επιτευχθούν επιθυμητά ρεολογικά χαρακτηριστικά των προϊόντων τομάτας, θα πρέπει η ένταση και οι συμθήκες της επεξεργασία με Υπερυψηλή Πίεση να επιλεγούν προσεκτικά. Στο επόμενο κεφάλαιο γίνεται λεπτομερής ανασκόπηση της βιβλιογραφίας που αφορά την τεχνολογία της Υπερυψηλής Πίεσης καθώς και της χρήσης της στην απενεργοποίηση ενζύμων και την επίδρασή της στα ποιοτικά χαρακτηριστικά προϊόντων τομάτας, αντικείμενο στο οποίο εστίασε η παρούσα διατριβή. -51-

92 -52- Πηκτινολυτικά ένζυμα

93 Κεφάλαιο 3 Η Τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης 3.1 Εισαγωγή Τα τρόφιμα αποτελούν πολύπλοκα βιολογικά συστήματα τα οποία υφίστανται συνεχείς μεταβολές από την παραγωγή μέχρι και την κατανάλωσή τους. Οι μεταβολές αυτές οφείλονται στη δράση μικροοργανισμών, ενδογενών ενζύμων, σε χημικές δράσεις των συστατικών τους, ενώ παράλληλα μπορεί να εξελίσσονται φυσικές ή φυσικοχημικές μεταβολές. Αποτέλεσμα αυτών των μεταβολών είναι η αλλοίωση και η ποιοτική υποβάθμιση των τροφίμων τα οποία καθίστανται ακατάλληλα προς κατανάλωση. Η θερμική επεξεργασία αποτελεί την πιο διαδεδομένη μέθοδο επεξεργασίας των τροφίμων, η οποία κάνοντας χρήση υψηλών θερμοκρασιών για μικρό χρονικό διάστημα αποσκοπεί στη συντήρηση των τροφίμων, καταστρέφοντας τους παράγοντες αλλοίωσής τους. Ωστόσο κατά τη θερμική επεξεργασία εξελίσσονται και αντιδράσεις υποβάθμισης της ποιότητας των τροφίμων. Σήμερα οι καταναλωτές απαιτούν τρόφιμα ελάχιστα επεξεργασμένα, ανώτερης ποιότητας που να προσομοιάζουν τα φρέσκα και παράλληλα να έχουν αυξημένη διάρκεια ζωής. Βασικό λοιπόν στόχο των βιομηχανιών τροφίμων αποτελεί η αναζήτηση νέων ήπιων μεθόδων επεξεργασίας των τροφίμων, έναντι της συμβατικής θερμικής επεξεργασίας, που να επιτρέπουν την παραγωγή ασφαλών και υψηλής ποιότητας προϊόντων. Μέθοδοι όπως η ακτινοβόληση, η χρήση παλλόμενων ηλεκτρικών πεδίων, η υπεριώδης ακτινοβολία και η Υπερυψηλή Πίεση έχουν προταθεί ως εναλλακτικές της θερμικής επεξεργασίας και αποτελούν αντικείμενο μελέτης πολλών ερευνητών (Barbosa-Canovas et al., 1998). Πρόκειται για φυσικές διεργασίες που αποσκοπούν στη συντήρηση των τροφίμων και έχουν τη δυνατότητα παραγωγής προϊόντων που καλύπτουν πολλές από τις απαιτήσεις των καταναλωτών. Είναι διεργασίες που στοχεύουν στην -53-

94 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης απενεργοποίηση μικροοργανισμών, δεν κάνουν χρήση προσθέτων, είναι συνήθως μη θερμικές ή περιλαμβάνουν ήπιες θερμικές κατεργασίες και επηρεάζουν ελάχιστα την ποιότητα των προϊόντων (Farr, 1990; Mertens, 1992). Η σημαντικότερη από τις προαναφερόμενες μη θερμικές τεχνολογίες είναι η Υπερυψηλή Υδροστατική πίεση καλύπτοντας ένα ευρύ πεδίο εφαρμογών στην τεχνολογία τροφίμων. Η δυνατότητα απενεργοποίησης μικροοργανισμών και ενζύμων και τα πλεονεκτήματα που προκύπτουν από την ενσωμάτωσή της στην παραγωγική διαδικασία διαφόρων προϊόντων, έχει αποτελέσει αντικείμενο μελέτης πολλών ερευνητικών εργαστηρίων και βιομηχανιών. 3.2 Περιγραφή της διεργασίας Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης (ΥΥΠ) Η Υπερυψηλή Υδροστατική Πίεση (ΥΥΠ) αποτελεί μια νέα μέθοδο συντήρησης των τροφίμων, εναλλακτική της θερμικής επεξεργασίας και μπορεί να εφαρμοστεί σε στερεά ή υγρά, συσκευασμένα ή μη συσκευασμένα τρόφιμα (Farkas & Hoover, 2001). Η ΥΥΠ διέπεται από την Ισοστατική Αρχή, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3.1. Το τρόφιμο συμπιέζεται με ομοιόμορφη πίεση από κάθε κατεύθυνση και επανέρχεται στην αρχική του κατάσταση όταν η πίεση πάψει να εφαρμόζεται (Olsson, 1995). Σχήμα 3.1 Σχηματική απεικόνιση της Ισοστατικής Αρχής (Olsson, 1995) -54-

95 Περιγραφή της διεργασίας Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Επεξεργασία με υπερυψηλές πιέσεις από 100 έως 1000 MPa ( atm), έχει σαν αποτέλεσμα την απενεργοποίηση μικροοργανισμών ή μείωση του μικροβιακού φορτίου και την απενεργοποίηση ενδογενών ενζύμων, αυξάνοντας τη διάρκεια ζωής των τροφίμων ενώ μπορεί να προκαλέσει και επιθυμητές μεταβολές στην ποιότητα διαφόρων προϊόντων (Farr 1990). Οι πιέσεις που εφαρμόζονται κατά την επεξεργασία των τροφίμων με ΥΥΠ φαίνεται να έχουν μικρή επίδραση στους ομοιοπολικούς δεσμούς. Συνεπώς τα χαμηλού μοριακού βάρους συστατικά των τροφίμων (π.χ. βιταμίνες, χρωστικές, αρωματικές και γευστικές ενώσεις) που είναι υπεύθυνα για τα οργανοληπτικά και διατροφικά χαρακτηριστικά τους διατηρούνται σχεδόν αναλλοίωτα (Hoover, 1993; Knorr, 1993; San Martin et al., 2002). Προκειμένου να σχεδιαστεί μια διεργασία ΥΥΠ θα πρέπει να ληφθούν υπόψη αρκετές παράμετροι όπως η εφαρμοζόμενη πίεση, ο χρόνος που απαιτείται για την επίτευξη της επιθυμητής πίεσης, ο χρόνος παραμονής του τροφίμου στην επιθυμητή πίεση, η θερμοκρασία της διεργασίας, οι φυσικοχημικές ιδιότητες του προς επεξεργασία τροφίμου καθώς και το επιθυμητό αποτέλεσμα-στόχος της διεργασίας (Farkas & Hoover, 2001). Εδώ αξίζει να σημειωθεί ότι σε αντίθεση με τη θερμική επεξεργασία, η επεξεργασία με ΥΥΠ είναι ανεξάρτητη από το μέγεθος και το σχήμα του τροφίμου, εφόσον σύμφωνα με την αρχή του Pascal η πίεση μεταδίδεται ομοιόμορφα και στιγμιαία μέσω ενός μέσου μεταφοράς πίεσης σε όλη τη μάζα του τροφίμου (Knorr, 1993) Εξοπλισμός ΥΥΠ Ένα ολοκληρωμένο σύστημα υπερυψηλής πίεσης αποτελείται από το δοχείο πίεσης και το κάλυμμά του, ένα σύστημα παραγωγής της πίεσης και ένα σύστημα ελέγχου του όλου συστήματος με κατάλληλα όργανα και συσκευές (Mertens, 1995). Αφού το δοχείο πληρωθεί με το προς επεξεργασία τρόφιμο και σφραγιστεί, γεμίζεται με το μέσο μεταφοράς της πίεσης και στη συνέχεια δημιουργείται η υπερυψηλή πίεση. Υπάρχουν δύο τρόποι συμπίεσης που χρησιμοποιούνται συνήθως, η άμεση και η έμμεση συμπίεση (Deplace & Mertens, 1992). Κατά την -55-

96 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροσταικής Πίεσης άμεση συμπίεση το υγρό της πίεσης στο δοχείο συμπιέζεται από ένα έμβολο μικρής διαμέτρου, το οποίο κινείται με τη βοήθεια μιας αντλίας χαμηλής πίεσης (Σχήμα 3.2α). Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τη γρήγορη συμπίεση. Ωστόσο επειδή πρέπει να επιτευχθεί δυναμικό σφράγισμα του εμβόλου και της εσωτερικής διαμέτρου του δοχείου, η άμεση συμπίεση εφαρμόζεται κυρίως σε μικρής διαμέτρου εργαστηριακής ή πιλοτικής κλίμακας συστήματα. Κατά την έμμεση συμπίεση το υγρό μεταφοράς της πίεσης αντλείται από μία δεξαμενή σε κλειστό δοχείο πίεσης με τη βοήθεια ενός ενισχυτή πίεσης, μέχρις ότου επιτευχθεί η επιθυμητή πίεση (Σχήμα 3.2β). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται στα περισσότερα βιομηχανικά συστήματα ισοστατικής πίεσης. α) β) Σχήμα 3.2 α) Άμεση και β) Έμμεση μέθοδος συμπίεσης (Mertens, 1995) Τα τρόφιμα μπορούν να υποστούν επεξεργασία με υπερυψηλή πίεση είτε σε περιέκτες είτε μη συσκευασμένα (χύμα) και κατόπιν να συσκευάζονται. Όταν τα τρόφιμα επεξεργάζονται σε περιέκτες θα πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στο υλικό συσκευασίας τους. Λόγω των υψηλών πιέσεων που εφαρμόζονται τα υλικά αυτά θα πρέπει να είναι ανθεκτικά και να διατηρούν την ακεραιότητά τους (Ludikhuyze et al., 2002). Επειδή κατά τη συμπίεση ο όγκος των τροφίμων υφίσταται μια μικρή μείωση (ανάλογη της συμπιεστότητας του νερού), ενώ κατά την αποσυμπίεσή του επανέρχεται στην αρχική του τιμή, τα υλικά συσκευασίας θα πρέπει να είναι εύκαμπτα. Σύμφωνα με τους Masuda et al. (1992) κατάλληλα υλικά -56-

97 Περιγραφή της διεργασίας Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης συσκευασίας για τη χρήση τους σε διεργασίες υπερυψηλής πίεσης αποτελούν τα φιλμ αιθυλενικής βυνιλικής αλκοόλης (EVOH) και πολυβυνιλικής αλκοόλης (PVOH). Ωστόσο έχουν χρησιμοποιηθεί και πολυστρωματικά πλαστικά ή συσκευασίες αλουμινίου. Για οικονομικούς λόγους το σχήμα του υλικού συσκευασίας θα πρέπει να είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε να καλύπτεται όλος ο ωφέλιμος όγκος του δοχείου πίεσης (Palou et al., 2007). Από την άλλη πλευρά η μαζική παραγωγή είναι απλούστερη διότι απαιτούνται μόνο αντλίες, σωληνώσεις και βαλβίδες. (Ludikhuyze et al., 2002). Τα περισσότερα συστήματα υπερυψηλής πίεσης που χρησιμοποιούνται σήμερα στη βιομηχανία τροφίμων είναι ασυνεχούς λειτουργίας. Κατά την ασυνεχή διεργασία ΥΥΠ, το ήδη συσκευασμένο τρόφιμο τοποθετείται στο δοχείο πίεσης, το οποίο σφραγίζεται και στη συνέχεια γεμίζεται με το υγρό μεταφοράς της πίεσης, ώστε να εκτοπιστεί ο αέρας. Ως μέσο μεταφοράς της πίεσης χρησιμοποιείται συνήθως το νερό ή νερό που περιέχει μικρή ποσότητα λιπαντικού, εξυπηρετώντας έτσι και στη λίπανση των μηχανικών μερών του εξοπλισμού (Ludikhuyze et al., 2002). Η απομάκρυνση του αέρα έχει σκοπό τη μείωση του κόστους άντλησης, αποφεύγοντας τη συμπίεση του αέρα. Στη συνέχεια, μέσω μιας αντλίας το υγρό του συστήματος μεταφέρεται στο δοχείο μέχρι να επιτευχθεί η επιθυμητή πίεση, οπότε απομονώνεται το δοχείο κλείνοντας τη βαλβίδα εκτόνωσης της πίεσης. Όταν ολοκληρωθεί ο χρόνος της διεργασίας ανοίγεται η βαλβίδα και εκτονώνεται η πίεση στο δοχείο. Η αποσυμπίεση πραγματοποιείται σε δύο στάδια για να αποφευχθεί ξαφνική απελευθέρωση του συμπιεσμένου νερού (Hori et al., 1992). Τέλος το δοχείο ανοίγεται και απομακρύνεται το επεξεργασμένο προϊόν, ενώ μια επόμενη παρτίδα προϊόντων τοποθετείται στο δοχείο πίεσης και ξεκινά ο επόμενος κύκλος συμπίεσης. Η δυναμικότητα ενός συστήματος διακοπτόμενης λειτουργίας εξαρτάται από τρεις παράγοντες: τον αριθμό των κύκλων συμπίεσης που μπορούν να επιτευχθούν σε συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, τον ωφέλιμο όγκο του δοχείου πίεσης και τον αριθμό των διαθέσιμων δοχείων πίεσης. Ως κύκλος συμπίεσης ορίζεται ο χρόνος που απαιτείται για τη διαχείριση του προϊόντος συμπεριλαμβάνοντας το άνοιγμα, γέμισμα και κλείσιμο του δοχείου πίεσης, το χρόνο συμπίεσης, το χρόνο αναμονής στην επιθυμητή πίεση, το χρόνο αποσυμπίεσης και το άδειασμα του δοχείου πίεσης. -57-

98 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροσταικής Πίεσης Η παραγωγικότητα ενός συστήματος ασυνεχούς διεργασίας μπορεί να αυξηθεί μειώνοντας τον κύκλο συμπίεσης-αποσυμπίεσης. Ο χρόνος συμπίεσης μπορεί να μειωθεί με αύξηση της δυναμικότητας των αντλιών που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πίεσης (Barbosa-Canovas et al., 1997). Εκτός από τα συστήματα διακοπτόμενης λειτουργίας χρησιμοποιούνται και συστήματα ημι-συνεχούς λειτουργίας, ιδανικά για την επεξεργασία υγρών τροφίμων (π.χ. χυμοί ή σάλτσες). Σε αυτή την περίπτωση το δοχείο πίεσης περιέχει ένα ελεύθερο έμβολο συμπίεσης. Το δοχείο πίεσης γεμίζεται με το υγρό τρόφιμο με τη βοήθεια μιας αντλίας χαμηλής πίεσης. Καθώς το δοχείο γεμίζει το έμβολο εκτοπίζεται και όταν είναι πλέον γεμάτο η οπή εισόδου κλείνει, ενώ υψηλής πίεσης υγρό διοχετεύεται πίσω από το ελεύθερο έμβολο και το υγρό τρόφιμο συμπιέζεται. Αφού ολοκληρωθεί ο χρόνος διεργασίας το σύστημα αποσυμπιέζεται, ελευθερώνοντας την πίεση του υγρού του συστήματος. Το επεξεργασμένο τρόφιμο μεταφέρεται μέσω οπής του δοχείου πίεσης σε αποστειρωμένη δεξαμενή αποθήκευσης και ακολουθεί ασηπτικό γέμισμα των περιεκτών. Στην περίπτωση επεξεργασίας μη συσκευασμένων υγρών τροφίμων, θα μπορούσαν τα τρόφιμα αυτά να χρησιμοποιηθούν και ως υγρά μεταφοράς της πίεσης με απευθείας άντλησή τους με αντλίες υψηλής πίεσης. Με αυτό τον τρόπο μπορεί να μειωθεί το κόστος κεφαλαίου, ενώ παράλληλα απλοποιείται και ο χειρισμός του συστήματος Εμπορικά διαθέσιμα τρόφιμα επεξεργασμένα με ΥΥΠ Η επεξεργασία των τροφίμων με υπερυψηλή υδροστατική πίεση χρονολογείται από τις αρχές του 20 ου αιώνα, όταν ο Hite (1899) προσπάθησε να επεκτείνει τη διάρκεια ζωής γάλακτος υποβάλλοντας το σε επεξεργασία με ΥΥΠ. Παρά τα ενθαρρυντικά του ευρήματα, η τεχνολογία αυτή παραμερίστηκε μέχρι το 1970, οπότε εφαρμόστηκε από Αυστραλιανούς επιστήμονες για τη βελτίωση της τρυφεροποίησης του κρέατος. Ωστόσο τα πρώτα επεξεργασμένα με ΥΥΠ προϊόντα που εμφανίστηκαν στην αγορά ήταν μαρμελάδες φράουλας, ακτινιδίου και μήλου από την εταιρεία Meidiya Food Co. τον Απρίλιο του 1990 στην Ιαπωνία. Τα προϊόντα αυτά -58-

99 Περιγραφή της διεργασίας Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης επεξεργάστηκαν με υπερυψηλή πίεση (400 MPa) χωρίς την εφαρμογή θέρμανσης (20ºC) και για χρόνο min. Οι μαρμελάδες παρουσίαζαν έντονο και φυσικό χρώμα και γεύση. Τα επόμενα χρόνια άρχισαν να κυκλοφορούν στην Ιαπωνική αγορά μια σειρά προϊόντων επεξεργασμένα με υπερυψηλή πίεση. Ανάμεσα στα άλλα συμπεριλαμβάνονται σάλτσες φρούτων και επιδόρπια (Meidi-ya Food Co.), χυμός μανταρίνι ( MPa, 20ºC για 2-3 min) (Wakayama Co.) και grapefruit ( MPa, 20ºC για 2-20 min) (Pokka Co.) (Cheftel, 1995; Knorr, 1995a,b), και κρασί ακατέργαστου ρυζιού, το λεγόμενο «nigori-sake» (Hayashi, 1995). Το νέο αυτό προϊόν είχε λευκό χρώμα και γεύση φρέσκου, έναντι του σκούρου χρώματος και τη μυρωδιά καμένου. Αλλάζοντας ήπειρο, στη Γαλλία το 1996 η εταιρεία Ulti εφάρμοσε την τεχνολογία της υπερυψηλής πίεσης για την παραγωγή πορτοκαλοχυμού. Η εταιρεία αυτή είναι σήμερα γνωστή με την ονομασία Pampryl και εξακολουθεί να παράγει χυμούς φρούτων χρησιμοποιώντας την τεχνολογία αυτή, ενώ παράλληλα στις ετικέτες των προϊόντων της αναγράφεται η χρήση της τεχνολογίας υπερυψηλής πίεσης (Rovere, 2001). Η πρώτη εταιρεία στη νότιο Αμερική (Μεξικό) η οποία εφάρμοσε τη νέα αυτή τεχνολογία ήταν η Avomex, όταν το 1996 ξεκίνησε να εμπορεύεται διάφορα προϊόντα αβοκάντο. Μέσα σε λίγα χρόνια ο πουρές αβοκάντο (guacamole) αποτέλεσε το πρώτο προϊόν επεξεργασμένο με υπερυψηλή πίεση, το οποίο παρουσίασε ανώτερη ποιότητα σε σχέση με το συμβατικά επεξεργασμένο προϊόν. Η διάρκεια ζωής του σε συνθήκες ψύξης είναι 45 μέρες ενώ δεν παρατηρούνται σημαντικές απώλειες στην ποιότητά του (Rovere, 2001). Το 1999 στην Ισπανία η εταιρεία Espuna χρησιμοποίησε την υπερυψηλή πίεση για την επεξεργασία καπνιστού ζαμπόν. Η χρήση της διεργασίας συμβάλει στη μείωση του κινδύνου επαναμόλυνσης κατά τον τεμαχισμό του ζαμπόν και επιμηκύνει τη διάρκεια ζωής του προϊόντος σε οκτώ εβδομάδες (Rovere, 2001). Από το 2000 και μετά όλο και περισσότερα προϊόντα εμφανίζονται στη διεθνή αγορά. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.1 τα προϊόντα αυτά περιλαμβάνουν προϊόντα κρέατος, πουλερικά, ψάρια, θαλασσινά, φρούτα, λαχανικά και προϊόντα τους ( -59-

100 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροσταικής Πίεσης Πίνακας 3.1 Εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα επεξεργασμένα με ΥΥΠ Χώρα Προϊόν (Χρονολογία) Μεξικό Χυμοί εσπεριδοειδών, smoothies (2000) Λίβανος Χυμοί φρούτων (2000) (54 διαφορετικές ποικιλίες) Ιαπωνία Προμαγειρεμένο ρύζι, (2000) Υποαλλεργικό ρύζι Χυμός βιολογικού μήλου Στρείδια ΗΠΑ Έτοιμα προς κατανάλωση (2001) προϊόντα πουλερικών Ζαμπόν, χοιρινό κρέας Πορτογαλία Χυμός μήλου/ (2001) μήλου-εσπεριδοειδών Χυμοί φρούτων: μήλο, αχλάδι, Ιταλία φράουλα, καρότο (2001) Επιδόρπια φρούτων: μήλο, αχλάδι, φράουλα Μαγειρεμένο ζαμπόν σε φέτες, προϊόντα από χοιρινό και ΗΠΑ ζαμπόν Πάρμας (2001) Προϊόντα πουλερικών έτοιμα προς κατανάλωση Ιταλία (2001) Συνθήκες επεξεργασίας 500 MPa 500 MPa 400 MPa 240 MPa, 90 s 450 MPa, s, 12 C 600 MPa, 3-5 min, 17 C 600 MPa, 3-5 min, 17 C Επιδόρπια φρούτων: Μήλο, αχλάδι και φράουλα 600 MPa, 3-5min, 17ºC ΗΠΑ Στρείδια (2001) Χυμός πορτοκάλι, λεμονάδα ΗΠΑ Προϊόντα με βάση το αβοκάντο (2002) Πικάντικα προ-μαγειρεμένα κομμάτια κοτόπουλου ΗΠΑ Προμαγειρεμένο πικάντικο (2002) κοτόπουλο και μπιφτέκι για fajitas Χονδρο-κομμένο ζαμπόν, προϊόντα από κοτόπουλο και Ισπανία γαλοπούλα. Μαγειρεμένο και (2002) Serrano ζαμπόν, Chorizo (τύπος λουκάνικου) ΗΠΑ (2002) Προϊόντα με βάση το αβοκάντο 240 MPa, 90 s 2 min 500 MPa, 4-10 min, 8ºC -60-

101 Περιγραφή της διεργασίας Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης (συνέχεια Πίνακα 3.1) Χώρα (Χρονολογία) Μεξικό (2002) Ιταλία (2003) Ιταλία (2003) ΗΠΑ (2003) Καναδάς (2003) Ισπανία (2004) Τσεχία (2004) ΗΠΑ (2004) Καναδάς (2004) Ισπανία (2004) Ιταλία (2004) Ισπανία (2005) Ιαπωνία (2005) Γερμανία (2005) Ιαπωνία (2005) Γερμανία (2005) Ισπανία (2005) Ν. Κορέα (2006) Ελλάδα (2009) Προϊόν Προϊόντα με βάση το αβοκάντο Συνθήκες επεξεργασίας Προσούτο, σαλάμι, μορταδέλα 600 MPa, 10 min, 7 C Ζαμπόν Πάρμας (Prosciutto), σαλάμι, μορταδέλα Κομμένο κρεμμύδι Σάλτσα και πουρές με βάση το μήλο Σολομός, μπακαλιάρος Χυμός μήλο-μπρόκολο Προϊόντα σόγιας, tofu (μαλακό τυρί από σόγια) Θαλασσινά Προϊόντα ψαριού έτοιμα προς κατανάλωση: σολομός, βακαλάος Ατλαντικού Ξαρμυρισμένος βακαλάος 600 MPa, 10 min, 7ºC 500 MPa 500 MPa 600 MPa Πιάτα λαχανικών έτοιμα για κατανάλωση 500 MPa Ζαμπόν, μπέικον, λουκάνικα 600 MPa, 5 min, 5 C Καπνιστό ζαμπόν 600 MPa, 2 min, 5 C Μαγειρεμένα προϊόντα χοιρινού κρέατος χωρίς νιτρώδη άλατα: ζαμπόν, λουκάνικα και μπέικον Καπνιστό ζαμπόν Γερμανίας: προϊόντα ολόκληρα, σε φέτες ή κύβους Πιάτα λαχανικών έτοιμα προς κατανάλωση Στρείδια Αλλαντικά 600 MPa, 5 min, 5ºC 600 MPa, 2 min, 5ºC 500 MPa 600 MPa, 3 min, 20ºC -61-

102 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Την άνοιξη του 2009 η τεχνολογία της ΥΥΠ έκανε την εμφάνισή της και στην ελληνική αγορά. Βιομηχανία κρέατος χρησιμοποιεί την τεχνολογία αυτή για την παραγωγή αλλαντικών με μεγαλύτερη (σχεδόν διπλάσια) διάρκεια ζωής. Η διεργασία της ΥΥΠ δεν μπορεί να θεωρηθεί ως μια διεργασία με την οποία μπορεί να μειωθεί το κόστος παραγωγής ενός υπάρχοντος προϊόντος το οποίο παράγεται με συμβατικές μεθόδους όπως είναι η παστερίωση. Στην περίπτωση όμως υψηλής ποιότητας προϊόντων ή καινοτόμων προϊόντων το κόστος μπορεί να είναι οικονομικά αποδεκτό. Το κόστος παραγωγής με χρήση της διεργασίας ΥΥΠ μπορεί να κυμανθεί από 0,07 έως 0,18 /kg και εξαρτάται από το είδος του εξοπλισμού, το βαθμό αυτοματοποίησης, το ποσοστό πλήρωσης του θαλάμου συμπίεσης και τις συνθήκες πίεσης-θερμοκρασίας-χρόνου οι οποίες χρησιμοποιούνται. Το μεγαλύτερο κόστος είναι το πάγιο αφού περίπου το 60% του κόστους παραγωγής είναι η απόσβεση του εξοπλισμού. Γενικότερα το κόστος του εξοπλισμού μπορεί να κυμανθεί από 500,000 έως 2,000,000, ποσό το οποίο εξαρτάται από τον όγκο του δοχείου πίεσης και τη μέγιστη πίεση λειτουργίας (Tonello, 2007). Το κόστος των ανταλλακτικών και το ενεργειακό κόστος συμβάλλουν περίπου κατά 36% και 4%, αντίστοιχα. Το κόστος που αφορά στην κατανάλωση νερού θεωρείται αμελητέο. Τέλος, το κόστος θα πρέπει να προσαυξηθεί κατά 10-40% ώστε να συμπεριληφθεί το εργατικό κόστος που και αυτό εξαρτάται από το βαθμό αυτοματοποίησης της διεργασίας (Hernando Saiz et al., 2008). Από ενεργειακή άποψη, η εφαρμογή της ΥΥΠ αντί των συμβατικών θερμικών διεργασιών μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της απαιτούμενης ενέργειας κατά 20 % (Toepfl et al., 2006) Βιομηχανικός εξοπλισμός ΥΥΠ Οι δύο πρώτοι βιομηχανικοί εξοπλισμοί για επεξεργασία τροφίμων με υπερυψηλή πίεση εγκαταστάθηκαν στην Ιαπωνία από την Mitsubishi Heavy Industries Ltd. το 1990 στο εργοστάσιο της εταιρείας Meidi-ya Food Co και το 1991 στην εταιρεία Pokka (Hori et al., 1992). Για την κατασκευή του εξοπλισμού εμπνεύστηκαν από τον αντίστοιχο εξοπλισμό που χρησιμοποιείται στην ψυχρή ισοστατική πίεση (Cold Isostatic Pressure, CIP) για την δημιουργία σκόνης. Στο τέλος του 2007, περίπου 110 συστήματα ΥΥΠ βρίσκονταν σε παραγωγή -62-

103 Περιγραφή της διεργασίας Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης παγκοσμίως, με όγκο δοχείων που κυμαίνεται από 35 έως 420 L και ετήσια παραγωγή περίπου τόνους. Το 80 % των συστημάτων αυτών εγκαταστάθηκε μετά το 2000, ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό τους χρησιμοποιείται από βιομηχανίες κρέατος και φρούτων λαχανικών (Σχήμα 3.3). Η καθυστέρηση της εφαρμογής της ΥΥΠ σε βιομηχανική κλίμακα αποδίδεται στον καινοτόμο χαρακτήρα της τεχνολογίας αυτής, τα οφέλη της οποίας καθυστέρησαν να γίνουν γνωστά από τους καταναλωτές, αλλά και από την ανεπάρκεια του μηχανολογικού εξοπλισμού (Hernando Saiz et al., 2008). Παγκοσμίως υπάρχουν αρκετές κατασκευαστικές εταιρείες που ασχολούνται με τη τεχνολογία της ΥΥΠ (Πίνακας 3.2), έχοντας ως στόχο την κατασκευή ενός αξιόπιστου, ασφαλούς και παραγωγικού εξοπλισμού και αποβλέποντας στη συνεχή βελτίωσή του. Ορισμένες από τις εταιρείες αυτές ασχολούνται με την ανάπτυξη μονάδων εργαστηριακής ή πιλοτικής κλίμακας που χρησιμοποιούνται σε ερευνητικά ινστιτούτα και πανεπιστήμια (π.χ. Resato International BV, Stansted Fluid Power). Ωστόσο μεγαλύτερες εταιρείες όπως οι Avure Technologies, NC Hyperbaric και Mitsubishi Heavy Industries, δραστηριοποιούνται στην κατασκευή εξοπλισμού βιομηχανικής κλίμακας. Τα δοχεία πίεσης που είναι διαθέσιμα ως εργαστηριακές μονάδες έχουν όγκους από 0,1 έως 2 L ενώ τα πιλοτικής κλίμακας συστήματα είναι χωρητικότητας L. Η μέγιστη πίεση λειτουργίας των συστημάτων αυτών είναι της τάξεως των 1000 MPa. άλλα προϊόντα 6% προϊόντα λαχανικών 30% προϊόντα κρέατος 40% ψάρια και θαλασσινά 12% χυμοί 12% Σχήμα 3.3 Συνολικός χρησιμοποιούμενος όγκος δοχείων πίεσης ανά βιομηχανία τροφίμων (Mathys, 2008) -63-

104 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Πίνακας 3.2 Εταιρείες κατασκευής εξοπλισμού ΥΥΠ Κατασκευαστική εταιρεία Avure Technologies (Flow International Corporation) Resato International BV NC Hyperbaric Mitsubishi Heavy Industries Ltd. Elmhurst Research Inc Kobelco Engineered Pressure Systems Inc Uhde Hockdrucktechnik Stansted Fluid Power Χώρα / Ηλεκτρονική διεύθυνση ΗΠΑ, Ολλανδία, Ισπανία, Ιαπωνία, ΗΠΑ, Ιαπωνία, Βέλγιο, Γερμανία, Αγγλία, Ο όγκος των δοχείων πίεσης για συστήματα ασυνεχούς λειτουργίας βιομηχανικής κλίμακας κυμαίνεται από L και προδιαγράφουν μέγιστη πίεση λειτουργίας τα 600 MPa. Τα δοχεία πίεσης βιομηχανικής κλίμακας μπορούν να λειτουργούν σε οριζόντια (Σχήμα 3.4) ή κάθετη διάταξη (Σχήμα 3.5). Μέχρι το 1998 τα δοχεία πίεσης που ήταν εγκατεστημένα στις διάφορες βιομηχανίες λειτουργούσαν σε κάθετη διάταξη. Το πρώτο σύστημα οριζόντιας διάταξης, όπως περιγράφηκε από τους Bignon & Lebas (1997) κατασκευάστηκε από την εταιρεία GEC-ACB-Alstom και εγκαταστάθηκε το 1998 σε ένα εργοστάσιο της εταιρείας Espuna στην Ισπανία (Hernando Saiz et al., 2008). Η οριζόντια διάταξη παρουσιάζει τρία βασικά πλεονεκτήματα έναντι της κάθετης διάταξης. Βοηθάει στο διαχωρισμό των επεξεργασμένων ή μη των προϊόντων, εφόσον τα προϊόντα εισέρχονται στο δοχείο πίεσης από τη μία πλευρά και εξέρχονται από την απέναντι, Αντίθετα, στην περίπτωση της κάθετης διάταξης η είσοδος και η έξοδος των προϊόντων πραγματοποιείται από την ίδια πλευρά του δοχείου συμπίεσης αυξάνοντας έτσι τον κίνδυνο σύγχυσης μεταξύ των επεξεργασμένων και των προς επεξεργασία προϊόντων. Δεύτερον, οι διαστάσεις ενός εξοπλισμού οριζόντιας διάταξης ευνοούν τη μεταφορά και εγκατάσταση του στο εργοστάσιο, καθιστώντας -64-

105 Περιγραφή της διεργασίας Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης την πιο εύκολη, πρακτική και λιγότερο δαπανηρή. Τέλος δίνει τη δυνατότητα αυτόματης φόρτωσης/εκφόρτωσης των προϊόντων ελαχιστοποιώντας έτσι τον χρόνο φόρτωσης και εκφόρτωσης. Με αυτό τον τρόπο παρέχεται η δυνατότητα συνεχούς εργασίας, αφού την ώρα που τα επεξεργασμένα προϊόντα εξέρχονται από το θάλαμο συμπίεσης από τη μία πλευρά, ταυτόχρονα μπορεί να γίνεται η φόρτωση των προς επεξεργασία προϊόντων από την άλλη πλευρά αυτού (Hernando Saiz et al., 2008). Σχήμα 3.4 Αυτοματοποιημένη μονάδα ΥΥΠ σε οριζόντια διάταξη με μέγιστη πίεση λειτουργίας 600 MPa. Διαθέτει 2 δοχεία πίεσης όγκου 300 L το καθένα και 8 ενισχυτές πίεσης με τη δυνατότητα ανεξάρτητης λειτουργίας. Ένας κύκλος συμπίεσης, χωρίς το χρόνο αναμονής, διαρκεί περίπου 5,5 min (NC Hyperbaric, Burgos, Spain) -65-

106 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Σχήμα 3.5 Αυτοματοποιημένη μονάδα ΥΥΠ σε κάθετη διάταξη με μέγιστη πίεση λειτουργίας 600 MPa. Διαθέτει ένα δοχείο πίεσης όγκου 215 L και έχει τη δυνατότητα επεξεργασίας έως 150 kg προϊόντος ανά κύκλο συμπίεσης. Ένας κύκλος συμπίεσης, εξαιρώντας το χρόνο αναμονής, διαρκεί περίπου 4,5 min (Avure Technologies, Washington DC, USA) -66-

107 Επίδραση της ΥΥΠ στις πρωτείνες και τα ένζυμα 3.3 Επίδραση της ΥΥΠ στις πρωτεΐνες και τα ένζυμα Γενικές αρχές για την πρωτεϊνική δομή και τα ένζυμα Οι δομές των πρωτεϊνών διακρίνονται σε τέσσερις κατηγορίες. Η πρωτοταγής δομή, η οποία ορίζεται ως η αλληλουχία των αμινοξέων και η θέση των δισουλφιδικών δεσμών αν υπάρχουν, δίνει μια πλήρη περιγραφή των ομοιοπολικών δεσμών μιας πρωτεΐνης. Η δευτεροταγής δομή αναφέρεται στον τρόπο με τον οποίο η πολυπεπτιδική αλυσίδα σχηματίζει α-έλικες ή β-φύλλα μέσω ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου. Η τριτοταγής δομή περιγράφει τον τρόπο με τον οποίο η δευτεροταγής δομή διαμορφώνεται σε τρεις διαστάσεις ως αποτέλεσμα μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πλευρικών αλυσίδων αμινοξέων. Η τεταρτοταγής δομή αναφέρεται στη διάταξη στο χώρο δύο ή περισσοτέρων πολυπεπτιδίων ενωμένα μεταξύ τους με μη ομοιοπολικούς δεσμούς (πολυμερείς πρωτεΐνες) (Hendrickx et al., 1998). Οι πρωτεΐνες αποτελούν ευαίσθητες δομές που διατηρούνται με αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αμινοξέων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και με αλληλεπιδράσεις με το διαλύτη που τις περιβάλλει (Jaenicke, 1991). Αλλαγές του εξωτερικού περιβάλλοντος, όπως η πίεση και η θερμοκρασία, είναι δυνατό να διαταράξουν τη λεπτή ισορροπία των προαναφερόμενων αλληλεπιδράσεων, με αποτέλεσμα να προκαλείται ξεδίπλωμα/μετουσίωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (Van den Broeck, 2000). Τα ένζυμα αποτελούν μια ειδική κατηγορία πρωτεϊνών που χαρακτηρίζονται από δύο ιδιότητες: την έντονη καταλυτική τους ικανότητα και την εξειδίκευσή τους ως προς το υπόστρωμα πάνω στο οποίο δρουν. Η βιολογική δραστηριότητα των ενζύμων προέρχεται από ένα ενεργό κέντρο και σχετίζεται με την τρισδιάστατη διαμόρφωση του μορίου. Ακόμα και μικρές αλλαγές στο ενεργό κέντρο του ενζύμου μπορούν να οδηγήσουν σε απώλεια της καταλυτικής του ικανότητας (Tsou, 1986). Εφόσον η μετουσίωση των πρωτεϊνών συνοδεύεται με δομικές μεταβολές, μπορεί να μεταβάλει και τη λειτουργικότητα του ενζύμου, όπως π.χ. αύξηση ή μείωση της βιολογικής του δραστηριότητας ή μεταβολή της εξειδίκευσης ως προς το υπόστρωμα (Van den Broeck, 2000). -67-

108 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Επίδραση της πίεσης στα ένζυμα Τα ένζυμα επηρεάζονται από την πίεση με διάφορους τρόπους. Συμπίεση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μπορεί να προκαλέσει αντιστρεπτή ή μη αντιστρεπτή, ολική ή μερική απενεργοποίηση των ενζύμων, η οποία προέρχεται από αλλαγές στη διαμόρφωση των πρωτεϊνικών δομών. Οι αλλαγές αυτές εξαρτώνται από τον τύπο του ενζύμου, τις περιβαλλοντικές συνθήκες, την πίεση, τη θερμοκρασία και το χρόνο επεξεργασίας. Οι ενζυμικές αντιδράσεις μπορεί να ενισχυθούν ή να παρεμποδιστούν από την πίεση, ανάλογα με τις αλλαγές στον όγκο (θετική ή αρνητική) που σχετίζονται με την εκάστοτε αντίδραση. Μεταβολές στο ρυθμό κατάλυσης που προκαλεί η επιβολή πίεσης μπορεί να οφείλονται σε μεταβολές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ ενζύμου-υποστρώματος ή μεταβολές στο μηχανισμό της αντίδρασης. Η εφαρμογή πίεσης έχει ως αποτέλεσμα τη μετουσίωση των πρωτεϊνών, καθιστώντας ένα μακρομοριακό υπόστρωμα περισσότερο ευαίσθητο στην ενζυμική δράση. Υποθέτοντας ότι η κυτταρική μεμβράνη ή η μεμβράνη ενδοκυτταρικών οργανιδίων μεταβάλλεται με τη εφαρμογή πίεσης, είναι δυνατό να απελευθερωθούν ενδοκυτταρικά ένζυμα από εξωκυτταρικά υγρά ή το κυτταρικό κυτόπλασμα, συμβάλλοντας στη διευκόλυνση αλληλεπιδράσεων μεταξύ ενζύμου και υποστρώματος (Cheftel, 1992) Μηχανισμοί απενεργοποίησης των ενζύμων με εφαρμογή πίεσης Σύμφωνα με την αρχή του Le Chatelier η πίεση ευνοεί οποιοδήποτε φαινόμενο βρίσκεται σε ισορροπία και συνοδεύεται από μείωση του όγκου, ενώ φαινόμενα που οδηγούν σε αύξηση του όγκου παρεμποδίζονται με αύξηση της πίεσης. Η μείωση του όγκου που πραγματοποιείται κατά τη μετουσίωση των πρωτεϊνών (~ ml/mol, Silva & Weber, 1993) προκύπτει από το σχηματισμό ή ρήξη των ομοιοπολικών δεσμών (αλλαγές στον όγκο διαμόρφωσης) και από ανακατατάξεις των μορίων του διαλύτη (αλλαγές στον όγκο διάλυσης) (Hendrickx et al., 1998; Van den Broeck, 2000). Αναφορικά με τις αλλαγές στον όγκο διαμόρφωσης, σε σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες οι ομοιοπολικοί δεσμοί δεν επηρεάζονται από την εφαρμογή πίεσης, -68-

109 Επίδραση της ΥΥΠ στις πρωτείνες και τα ένζυμα με αποτέλεσμα η πρωτοταγής δομή του ενζύμου να παραμένει άθικτη κατά την επεξεργασία με υπερυψηλή πίεση (Cheftel, 1991; Hayashi, 1989). Μεταβολές στη δευτεροταγή δομή συμβαίνουν μόνο σε υψηλές πιέσεις και οδηγούν σε μη αντιστρεπτή μετουσίωση (Masson, 1992; Balny & Masson, 1993). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι δεσμοί υδρογόνου, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη διατήρηση της ελικοειδούς μορφής των πρωτεϊνών, είναι ιδιαίτερα ανθεκτικοί στην πίεση. Η δημιουργία δεσμών υδρογόνου προκαλεί μείωση στον μοριακό όγκο που οφείλεται σε μείωση των αποστάσεων μεταξύ των ατόμων που συνδέονται. Ωστόσο, οι δεσμοί αυτοί ενδέχεται να δημιουργήσουν μια αρκετά ανοιχτή δομή οδηγώντας σε μεταβολή του ολικού όγκου από 1 έως -3 ml/mol (Morild, 1981; Balny & Masson, 1993). Συνεπώς οι δεσμοί υδρογόνου σταθεροποιούνται ή αποσταθεροποιούνται από την πίεση ανάλογα με το υπό μελέτη σύστημα (Gross & Jaenicke, 1994). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, να συμβαίνουν αλλαγές στη δευτεροταγή δομή των ενζύμων μόνο σε υψηλές πιέσεις, συνήθως μεγαλύτερες των 700MPa. Η καλά οργανωμένη τριτοταγής δομή του ενζύμου επηρεάζεται με την εφαρμογή πιέσεων μεγαλύτερων από MPa (Heremans, 1993; Mozhaev et al., 1994). Αλλαγές στις αλληλεπιδράσεις ηλεκτροστατικής και υδρόφοβης φύσης, οι οποίες αποτελούν τις σημαντικότερες δυνάμεις που συγκροτούν την τριτοταγή δομή, συνοδεύονται από μείωση του όγκου με αποτέλεσμα να ευνοούνται από την πίεση (Mozhaev et al., 1994; Barbosa-Canovas et al., 1997). Η διατάραξη των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση φορτισμένων ομάδων, οι οποίες προκαλούν αναδιάταξη των μορίων νερού και οδηγούν σε ξεδίπλωμα της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Η διεργασία αυτή συνοδεύεται από μείωση του όγκου (-30 έως -10 ml/mol) και ευνοείται από την εφαρμογή πίεσης (Weale, 1967; Morild, 1981). Επιπλέον, η διατάραξη των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων οδηγεί στην έκθεση των μη πολικών πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων στο νερό με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός ενυδατωμένου στρώματος. Η μεταβολή του όγκου η οποία οφείλεται στη διατάραξη των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων είναι αρνητική (από -20 έως -10 ml/mol) (Weale, 1967; Morild, 1981) και επομένως ευνοείται από αύξηση της πίεσης. Συμπερασματικά, η απενεργοποίηση μονομερών ενζύμων κατά την εφαρμογή -69-

110 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης πίεσης οφείλεται στη διατάραξη των υδρόφοβων και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Τέλος, ιδιαίτερα ευαίσθητη στην εφαρμογή πίεσης είναι η τεταρτοταγής δομή των πρωτεϊνών. Ολιγομερή ένζυμα διαχωρίζονται στα επιμέρους τμήματα που στοιχειοθετούν την τεταρτοταγή τους δομή με εφαρμογή πίεσης MPa (Hendrickx et al., 1998). Σε υψηλότερες πιέσεις μπορεί να παρατηρηθεί ξεδίπλωμα ή επανασύνδεση των επιμέρους τμημάτων τους (Silva & Weber, 1993). Οι αλλαγές στον όγκο διάλυσης οφείλονται κυρίως στον ιονισμό που προκαλείται από την πίεση, σε αλλαγές αναφορικά με την έκθεση των πλευρικών αλυσίδων αμινοξέων και των πεπτιδικών δεσμών στο νερό, αλλά και στη διάχυση του νερού σε κοιλότητες που βρίσκονται στον υδροφοβικό πυρήνα των πρωτεϊνών (Carter et al., 1978). Συνεπώς, η μείωση του όγκου προκύπτει από τη σύνδεση του νερού γύρω από φορτισμένες ομάδες, την τοποθέτηση του νερού γύρω από νέες εκτεθειμένες στο διαλύτη άπολες ομάδες και τη διάλυση πολικών ομάδων μέσω δεσμών υδρογόνου (Heremans et al., 1989). Η έκθεση των υδροφοβικών ομάδων στο νερό μπορεί να οδηγήσει και σε αύξηση ή μείωση του όγκου ανάλογα με τον τύπο και τη συγκέντρωση των γειτονικών υδροφοβικών ομάδων (Low & Somero, 1975). Τοπικό ξεδίπλωμα της αλυσίδας και διαχωρισμός σε μικρότερα τμήματα μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση κρυμμένων ομάδων, οι οποίες μπορούν να σχηματίσουν δεσμό με άλλες εκτεθειμένες ομάδες. Η διαδικασία αυτή μπορεί να οδηγήσει σε συσσωμάτωση της πρωτεΐνης (Masson, 1992). Η επίδραση της υπερυψηλής πίεσης στα ένζυμα μπορεί να κατηγοριοποιηθεί σε δύο ομάδες. Σε σχετικά χαμηλές πιέσεις (~100 MPa) έχει παρατηρηθεί σταθεροποίηση, ακόμα και αύξηση, της δραστικότητας μερικών ενζύμων (Eisenmenger & Reyes De Corcuera, 2009a,b). Η εφαρμογή πιέσεων είναι ικανή να οδηγήσει στη σταθεροποίηση ή την ενεργοποίηση των ενζύμων όταν η μεταβολή του όγκου μεταξύ της φυσικής (native state) και της μετουσιωμένης (unfolded state) διαμόρφωσης των ενζύμων είναι θετική. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στην παρατήρηση ότι η πίεση ευνοεί τους δεσμούς υδρογόνου και τις ηλεκτροστατικές δυνάμεις Van der Waals οι οποίοι συνδέονται με μεταβολές του όγκου του πολυπεπτιδίου. Αυτό το είδος δυνάμεων μειώνουν τις διαμοριακές αποστάσεις -70-

111 Επίδραση της ΥΥΠ στις πρωτείνες και τα ένζυμα προκαλώντας μείωση του όγκου της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (Gross & Jaenicke, 1994; Boonyaratanakornkit et al., 2002). Η ενεργοποίηση των ενζύμων με την εφαρμογή πίεσης μπορεί να προκληθεί και λόγω αποδιαμερισματοποίησης. Στους ανέπαφους ιστούς, τα ένζυμα και το υπόστρωμα είναι συνήθως διαμερισματοποιημένα, με εφαρμογή όμως χαμηλής πίεσης μπορεί να διευκολυνθούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ του ενζύμου και του υποστρώματος, μεταβάλλοντας τις μεμβράνες εσωκυτταρικών οργανιδίων και επιτρέποντας έτσι την επαφή ενζύμου υποστρώματος. Η ενζυμική αντίδραση που προκύπτει από αυτή την επαφή μπορεί να επιταχυνθεί ή να επιβραδυνθεί από την εφαρμογή της πίεσης ανάλογα με τον όγκο της ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης. Ωστόσο, τόσο η ενεργοποίηση όσο και η απενεργοποίηση των ενζύμων, σχετίζονται άμεσα με την ποιότητα και τη λειτουργικότητα των τροφίμων. Το γεγονός αυτό αποτελεί βάση για την ανάπτυξη νέων διεργασιών συντήρησης των τροφίμων ή δυνατότητα τροποποίησης του προϊόντος, όπως για παράδειγμα αλλαγές στην υφή ή τη γεύση του τροφίμου (Van den Broeck, 2000). Αντιθέτως, σε πολύ πιο υψηλές πιέσεις πραγματοποιείται απενεργοποίηση των ενζύμων. Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί τέσσερις κατηγορίες ενζύμων σύμφωνα με τη απώλεια ή ανάκτηση της ενεργότητάς τους. Έτσι διακρίνονται σε ένζυμα τα οποία υφίστανται (i) πλήρη και αναντίστρεπτη, (ii) πλήρη και αντιστρεπτή, (iii) μερική και αντιστρεπτή και (iv) μερική και αναντίστρεπτη απενεργοποίηση (Miyagawa et al., 1964). 3.4 Επίδραση της πίεσης σε ένζυμα σημαντικά για τη βιομηχανία τροφίμων Στη συνέχεια γίνεται ανασκόπηση της βιβλιογραφίας όσον αφορά την επίδραση της διεργασίας ΥΥΠ στη δραστικότητα ενδογενών και εξωγενών ενζύμων, σημαντικών για τη βιομηχανία τροφίμων. Τα ένζυμα που έχουν μελετηθεί περισσότερο είναι η αμυλάση, η πολυφαινολική οξειδάση, η περοξειδάση, η λιποξυγενάση και τα πηκτινολυτικά ένζυμα. Τα αμυλολυτικά ένζυμα παράγονται κυρίως από βακτήρια και μύκητες και χρησιμοποιούνται στην παραγωγή σιροπιών. Οι Weemaes et al. (1996) μελέτησαν -71-

112 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης την επίδραση της πίεσης και της θερμοκρασίας στη σταθερότητα τριών διαφορετικών ενζύμων α-αμυλάσης παραγόμενων από τους μικροοργανισμούς Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens και Bacillus licheniformis. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα συγκεκριμένα ένζυμα προερχόμενα και από τους τρείς μικροοργανισμούς υπέστησαν μεταβολές στη δομή τους υπό την επίδραση πίεσης 650 ΜPa, 750 ΜΡa και 1100 ΜΡa. Σε πιέσεις επεξεργασίας 350, 450 και 550 ΜΡa σε συνδυασμό με θερμοκρασίες 50, 55 και 70 C το ένζυμο του μικροοργανισμού Bacillus licheniformis βρέθηκε πιο σταθερό σε σχέση με αυτό των μικροοργανισμών Bacillus amyloliquefaciens και Bacillus subtilis, τα οποία εμφάνισαν περίπου την ίδια σταθερότητα (Weemaes et al., 1999). Η επεξεργασία με ΥΥΠ σε διάλυμα κριθαρένιου αλευριού προκάλεσε αύξηση της δράσης της α- και β-αμυλάσης για πιέσεις μεγαλύτερες από 300 MPa, κυρίως εξαιτίας της ζελατινοποίησης του αμύλου (Gomes et al., 1998). Οι Raabe και Knorr (1996), παρατήρησαν ότι η ενζυμική υδρόλυση του αμύλου από την α- αμυλάση προερχόμενη από Bacillus amyloliquefaciens ήταν πιο αργή για πιέσεις μέχρι 400 MPa στους 25 C. Οι Tanaka et al. (2001), μελέτησαν την επίδραση της ΥΥΠ σε β- αμυλάση πατάτας, η οποία περιέχει έξι κυστεϊνικές ομάδες που δεν αντιδρούν σε συγκεκριμένα σουλφιδρυλικά αντιδραστήρια. Η ΥΥΠ ευνόησε την αντίδραση μιας από τις έξι κυστεϊνικές ομάδες και υπέθεσαν ότι μεταβολές στη δομή της συγκεκριμένης ομάδας προκάλεσαν αυτή την επίδραση. Η πολυφαινολική οξειδάση (PPO) απαντάται στα περισσότερα φρούτα και λαχανικά και είναι υπεύθυνη για την οξείδωση των φαινολικών ενώσεών τους που οδηγεί στο ενζυμικό μαύρισμα. Το φαινόμενο του ενζυμικού μαυρίσματος θεωρείται μία από τις σημαντικότερες αιτίες υποβάθμισης της ποιότητας των φυτικών τροφίμων κατά την επεξεργασία και αποθήκευσή τους. Το ενζυμικό μαύρισμα αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα στη βιομηχανία τροφίμων (Ferrar & Walker, 1996) και συνεπώς η απενεργοποίηση του ενζύμου που το προκαλεί κρίνεται αναγκαία. Παρόλο που έχουν διεξαχθεί αρκετές έρευνες που αφορούν την επίδραση της ΥΥΠ στην PPO, τα αποτελέσματα είναι συγκεχυμένα, ενώ ελάχιστες είναι οι αναφορές που περιγράφουν την κινητική απενεργοποίησης του ενζύμου. Έρευνες -72-

113 Επίδραση της ΥΥΠ σε ένζυμα σημαντικά για τη βιομηχανία τροφίμων έχουν δείξει ότι η PPO υπό πίεση, μπορεί να υποστεί ενεργοποίηση (Anese et al., 1995; Cano et al., 1997) ή απενεργοποίηση (σύνθετη καταλυτική δραστικότητα). Τα επίπεδα πίεσης που απαιτούνται για την απενεργοποίηση του ενζύμου σε θερμοκρασία περιβάλλοντος εξαρτώνται ισχυρά από την προέλευση του ενζύμου και το ph του μέσου στο οποίο βρίσκεται. Επιπλέον, η παρουσία αλάτων, σακχάρων και άλλων προσθέτων επηρεάζει τη σταθερότητα της PPO στην πίεση. Γενικά η PPO αναφέρεται ως ένα ένζυμο αρκετά ανθεκτικό στην εφαρμογή πίεσης (Knorr, 1995b; Cano et al., 1997; Weemaes et al., 1998a,b; Lopez-Malo et al., 1999; Palou et al., 1999). Αξιοσημείωτη μείωση της δραστικότητας αναφέρεται σε μελέτες, όπου χρησιμοποιείται η ΥΥΠ σε συνδυασμό με σχετικά υψηλές θερμοκρασίες ή ιδιαίτερα χαμηλές τιμές ph (3,9-4,3) (Knorr, 1993; Lopez-Malo et al., 1999). Η Περοξειδάση (POD) προκαλεί ανεπιθύμητες μεταβολές στη γεύση φρούτων και λαχανικών κατά την αποθήκευσή τους. Επιπλέον, χρησιμοποιείται ως δείκτης της αποτελεσματικότητας ζεματίσματος των λαχανικών, διότι είναι το πιο θερμοανθεκτικό ένζυμο που βρίσκεται σε αυτά. Επομένως, η απενεργοποίηση της POD υποδηλώνει θερμική απενεργοποίηση και όλων των άλλων ενζύμων που απαντώνται στα λαχανικά (Richardson & Hyslop, 1985; Quaglia et al., 1996). Η POD είναι πολύ ανθεκτική και στην πίεση και η απενεργοποίησή της απαιτεί έντονες συνθήκες επεξεργασίας. Οι Anese et al. (1995), παρατήρησαν ότι αναντίστρεπτη και πλήρης απενεργοποίηση της POD από καρότο μπορεί να επιτευχθεί σε πίεση 900 MPa και θερμοκρασία 20 C, για χρόνο κατεργασίας 1 min. Σύμφωνα με τους Seyderhelm et al. (1996) η POD από χυμό μανταρινιού απενεργοποιήθηκε σε ποσοστό περίπου 30% μετά από επεξεργασία στα 600 MPa και 23 С για 10 min. Στην POD από φασόλι σημειώθηκε μείωση στη δραστικότητα του ενζύμου κατά 88% όταν αυτό επεξεργάστηκε σε πίεση 900 MPa και θερμοκρασία περιβάλλοντος για 10 min. Ο συνδυασμός πίεσης MPa και θερμοκρασίας 60 С ενίσχυσε την απενεργοποίηση του ενζύμου (Quaglia et al., 1996). Οι Rovere et al. (1996), μελέτησαν την επίδραση της πίεσης στην POD από μήλα. Απενεργοποίηση του ενζύμου επιτεύχθηκε ύστερα από επεξεργασία σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και πίεση μεγαλύτερη από 1000 MPa για 5 min. Σύμφωνα με τους Crelier et al. (1998), η δραστικότητα της POD από τομάτα δεν -73-

114 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης επηρεάστηκε από την επεξεργασία στα 500 MPa και σε θερμοκρασία 60 С. Μικρότερη ανθεκτικότητα της POD στην πίεση αναφέρεται στη μελέτη των Cano et al. (1997), οι οποίοι μελέτησαν την επίδραση της ΥΥΠ ( MPa) σε συνδυασμό με θερμοκρασίες 20 έως 60 С στην απενεργοποίηση της POD από πουρέ φράουλας. Η δραστικότητα του ενζύμου μειώθηκε με αύξηση της πίεσης ως 300 MPa, σε θερμοκρασία δωματίου και για διάρκεια επεξεργασίας 15 min. Αντιθέτως, σε μεγαλύτερες πιέσεις η δραστικότητα του ενζύμου διατηρήθηκε σταθερή. Μικρότερη τιμή δραστικότητας παρατηρήθηκε μετά από επεξεργασία σε πίεση 270 MPa και θερμοκρασία 45 С. Η λιποξυγενάση (LOX) καταλύει την οξυγόνωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων προς τα αντίστοιχα υδροϋπεροξείδια και προκαλεί είτε άμεσα είτε έμμεσα, ένα πλήθος μεταβολών στο χρώμα, τη γεύση, την υφή και τη θρεπτικότητα των τροφίμων. Για το λόγο αυτό η απενεργοποίησή της κρίνεται αναγκαία (Richardson & Hyslop, 1985; Kermasha et al., 1993). Μια από τις μελέτες αφορά την απενεργοποίηση της LOX σε πουρέ τομάτας με εφαρμογή ΥΥΠ. Η απενεργοποίηση της πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή πιέσεων μεταξύ 400 και 800 MPa, σε συνδυασμό με θερμοκρασίες μεταξύ С και για χρόνους επεξεργασίας 1, 3 και 5 min. Παρατηρήθηκε ότι με αύξηση της πίεσης η απενεργοποίηση του ενζύμου ήταν εντονότερη, ενώ για πίεση επεξεργασίας 800 MPa το ένζυμο απενεργοποιήθηκε πλήρως μετά από 1 min επεξεργασίας (Shook et al., 2001). Η Indrawati (2000) μελέτησε την απενεργοποίηση της LOX από εκχύλισμα φασολιού καθώς και από ακατέργαστο φασόλι. Το ένζυμο και στις δύο περιπτώσεις, υπέστη επεξεργασία με πίεση στην περιοχή από 0,1 έως 700 MPa σε συνδυασμό με θερμοκρασίες από -10 С έως 60 С. Στην περίπτωση του ακατέργαστου φασολιού παρατηρήθηκε απενεργοποίηση του ενζύμου σε μικρότερες πιέσεις συγκριτικά με το αντίστοιχο ένζυμο από εκχύλισμα φασολιού. -74-

115 Επίδραση πίεσης στα πηκτινολυτικά ένζυμα PME και PG 3.5 Επίδραση της πίεσης στα πηκτινολυτικά ένζυμα PME και PG Όπως αναφέρθηκε στο προηγούμενο κεφάλαιο, για το βέλτιστο σχεδιασμό διεργασιών επεξεργασίας τροφίμων φυτικής προέλευσης, είναι απαραίτητη η γνώση της καταλυτικής ικανότητας και της απενεργοποίησης των ενζύμων που επηρεάζουν τα ποιοτικά χαρακτηριστικά των τελικών προϊόντων. Η επίδραση της πίεσης στις πρωτεΐνες και τα ένζυμα σχετίζεται με αλλαγές (αντιστρεπτές ή αναντίστρεπτες) στη φυσική τους δομή (Heremans, 1982; Cheftel, 1992). Σε αντίθεση με τη θερμική ευαισθησία, οι περισσότερες PME είναι ιδιαίτερα ανθεκτικές στην εφαρμογή πίεσης. Σε ισοθερμοκρασιακές συνθήκες η σταθερότητα της PME στην πίεση ποικίλει ανάλογα με την προέλευσή της. Μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί κατά καιρούς έδειξαν ότι η PME μπανάνας (Ly Nguyen et al., 2003b) εμφανίστηκε περισσότερο ανθεκτική στην πίεση σε σύγκριση με την PME πορτοκαλιού (Van den Broeck et al., 2000a), αλλά περισσότερο ευαίσθητη από την PME φράουλας (Ly Nguyen et al., 2002c). Η PME τομάτας δεν έχασε την ενεργότητά της κατά την επεξεργασία σε πίεση 800 MPa και θερμοκρασία 30 C, ακόμα και μετά την εφαρμογή αρκετών κύκλων συμπίεσης (Crelier et al., 1995). Ο Shook και οι συνεργάτες του (2001) παρατήρησαν ότι η PME σε κομμάτια τομάτας ήταν πολύ ανθεκτική στην εφαρμογή πιέσεων 400, 600 και 800 MPa στους 25 C και 45 C. Σύμφωνα με τους Rodrigo et al. (2005) σε πιέσεις μέχρι 700 MPa δεν παρατηρήθηκε μείωση της ενεργότητας της PME διαφορετικών ποικιλιών τομάτας, ενώ μόλις το 50% της ενεργότητας του ενζύμου απενεργοποιήθηκε μετά από 15 min επεξεργασίας στα 850 MPa. Ωστόσο πρόσφατα αναφέρθηκε η ύπαρξη ενός ευαίσθητου στην πίεση ισοενζύμου PME τομάτας (Plaza et al., 2007). Για διάφορους τύπους PME ο ρυθμός μετατροπής του υποστρώματος αυξάνεται σε συγκεκριμένο εύρος συνδυασμών πίεσης και θερμοκρασίας. Ενίσχυση της καταλυτική δράσης της PME έχει παρατηρηθεί στην περίπτωση καρότου (Sila et al., 2007; Jolie et al., 2009), πορτοκαλιού (Cano et al., 1997), πιπεριάς (Castro et al., 2006) και τομάτας (Van den Broeck et al., 2000b; Krebbers et al., 2003; Verlent et al. 2004). Σύμφωνα με τους Van den Broeck et al. (2000) και Verlent et al. (2004) η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της PME τομάτας μετατοπίστηκε από τους 55 C σε ατμοσφαιρική πίεση στους 60, 65 και 70 C σε πιέσεις 100, 200 και 300 MPa -75-

116 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης αντίστοιχα, σε ph 7,2. Η καταλυτική δράση του ενζύμου ενισχύθηκε σε υψηλές πιέσεις σε σύγκριση με την ατμοσφαιρική πίεση, ωστόσο η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης μειώθηκε παρουσία της PG (Verlent et al., 2007). Παρόμοια συμπεριφορά αναφέρθηκε για καθαρή PME πιπεριάς, με τη βέλτιστη δράση να παρατηρείται στους 55 C σε συνδυασμό με 200 MPa, ενώ μειώθηκε με αύξηση της πίεσης (Castro et al., 2006). Στην περίπτωση της PME καρότου, σε σύστημα μοντέλο, βέλτιστες συνθήκες για τη δράση του ενζύμου ήταν οι 50 C σε συνδυασμό με πιέσεις από 300 έως 500 MPa, ενώ στην περίπτωση πραγματικού τροφίμου βέλτιστη δράση της PME παρατηρήθηκε στους 60 C σε συνδυασμό με πιέσεις από 200 έως 400 MPa (Sila et al., 2007). Σε αντίθεση με την PME, η PG παρουσιάζει μεγαλύτερη ευαισθησία στην πίεση. Σε πιέσεις περίπου 500 MPa, η PG τομάτας μπορεί να απενεργοποιηθεί χωρίς να είναι απαραίτητος ο συνδυασμός υψηλής θερμοκρασίας (Tangwongchai et al., 2000). Στην πίεση των 400 MPa, παρατηρήθηκε μείωση της ενεργότητας του ενζύμου κατά 50% σε λιγότερο από 30 min στους 45 C (Crelier et al., 2001). Μελέτες που αφορούν στην επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στην καταλυτική δράση της PG δεν εμφανίζονται συχνά στη βιβλιογραφία (Duvetter et al., 2009). Από τις λίγες έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί έχει παρατηρηθεί ότι η βέλτιστη θερμοκρασία για την καταλυόμενη από την PG υδρόλυση της πηκτίνης (βαθμός εστεροποίησης 80 %) είναι οι 50 C τόσο σε ατμοσφαιρική πίεση όσο και σε υψηλότερες πιέσεις (Verlent et al., 2007). Οι ίδιοι ερευνητές παρατήρησαν ότι ο αποπολυμερισμός της πηκτίνης παρουσία PME επιταχύνθηκε με αύξηση της πίεσης μέχρι τα 200 MPa, ενώ σε μεγαλύτερες πιέσεις ο ρυθμός αποπολυμερισμού μειώθηκε. Ωστόσο τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε αντίθεση με τα αντίστοιχα των Verlent et al. (2004), οι οποίοι παρατήρησαν μείωση της βέλτιστης θερμοκρασίας δράσης της PG σε υπόστρωμα πολυγαλακτουρονικού οξέος (PGA), απουσία της PME, με αύξηση της εφαρμοζόμενης πίεσης (60 C σε ατμοσφαιρική πίεση, 40 C στα 400 MPa). Η ενίσχυση της δραστικότητας της PG έως ένα επίπεδο εφαρμοζόμενης πίεσης μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι η παρουσία της PME δημιουργεί ένα καλύτερο υπόστρωμα για την PG (πηκτίνη μικρότερου βαθμού εστεροποίησης) και συνεπώς ο ρυθμός ενζυματικού αποπολυμερισμού της πηκτίνης -76-

117 Επίδραση πίεσης στα πηκτινολυτικά ένζυμα PME και PG ενισχύεται (Verlent et al., 2004; Verlent et al., 2007). Μια άλλη πιθανή εξήγηση δόθηκε από τους Hilz et al. (2006), οι οποίοι μελέτησαν την επίδραση των PME και PG (παραγόμενες από μύκητες) στη δομή πηκτίνης από βατόμουρα επεξεργασμένα με υπερυψηλή πίεση. Οι ερευνητές αυτοί πρότειναν τη δημιουργία ενός ενεργητικά προνομιούχου συμπλέγματος ενζύμου-υποστρώματος με εφαρμογή υπερυψηλής πίεσης, οδηγώντας σε μεγαλύτερη αποικοδόμηση, όταν κατά την επεξεργασία είναι παρόντα και τα ένζυμα και το υπόστρωμα. Όπως συμβαίνει και κατά τη θερμική επεξεργασία, αύξηση της πίεσης έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης των ενζύμων. Ωστόσο ορισμένοι ερευνητές έχουν παρατηρήσει μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης ορισμένων ενζύμων με αύξηση της πίεσης σε σταθερή θερμοκρασία, υποδηλώνοντας μια ανταγωνιστική δράση των δύο παραμέτρων στην απενεργοποίηση των ενζύμων αυτών. Οι Weemaes et al. (1998) παρατήρησαν ότι χαμηλές πιέσεις (<250 MPa) ασκούν προστατευτική επίδραση στη θερμική απενεργοποίηση της PPO αβοκάντο, για θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 62,5 C. Παρόμοια συμπεριφορά εμφάνισε και η PME τομάτας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.6 αύξηση της πίεσης από την ατμοσφαιρική στα 100 MPa προκάλεσε μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου, ο οποίος εμφάνισε ελάχιστη τιμή μέχρι τα 600 MPa ενώ σε μεγαλύτερες πιέσεις άρχισε πάλι να αυξάνεται. Αντίθετα στην περίπτωση της PG αύξηση της k (min -1 ) PG PME P (MPa) Σχήμα 3.6 Σχηματική απεικόνιση της συνεργιστικής και ανταγωνιστικής δράσης της πίεσης και της θερμοκρασίας στο ρυθμό απενεργοποίησης των PG (60 C) και PME (70 C) τομάτας (Kalamaki et al., 2006) -77-

118 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης πίεσης σε σταθερή θερμοκρασία έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης, υποδηλώνοντας συνεργιστική δράση των παραμέτρων στην απενεργοποίηση του ενζύμου (Kalamaki et al., 2006). Ωστόσο, στη βιβλιογραφία έχει αναφερθεί ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίησης και της PG τομάτας. Οι Fachin et al. (2003) παρατήρησαν ότι σε σχετικά χαμηλές πιέσεις (250 MPa) και υψηλή θερμοκρασία (55 C), αύξηση της πίεσης προκάλεσε μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης της PG σε σχέση με τον αντίστοιχο ρυθμό που παρατηρήθηκε κατά τη θερμική επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση. Αυτή η ανταγωνιστική δράση πίεσης και θερμοκρασίας μπορεί να αποδοθεί στην αντίθετη επίδραση της πίεσης και της θερμοκρασίας στους δεσμούς υδρογόνου και τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις (Balny & Masson, 1993; Mozhaev et al., 1996). Ο Mozhaev και οι συνεργάτες του (1996) θεώρησαν ότι στο αρχικό στάδιο της θερμικής μετουσίωσης, οι πρωτεΐνες χάνουν μόρια νερού τα οποία είναι σημαντικά δομικά στοιχεία. Ενώ, όπως έχει ήδη αναλυθεί, η πίεση ενισχύει την ενυδάτωση τόσο των πολικών όσο και των μη πολικών ομάδων, της πρωτεΐνης εμποδίζοντας το αρχικό στάδιο της θερμικής μετουσίωσης πρωτεϊνών και ενζύμων 3.6 Κινητική αντιδράσεων απενεργοποίησης με ΥΥΠ Σε αντιστοιχία με τη θερμική απενεργοποίηση, η απενεργοποίηση ενζύμων και μικροοργανισμών με υπερυψηλή πίεση ακολουθεί συνήθως κινητική 1 ης τάξης, ενώ έχουν χρησιμοποιηθεί και κινητικά μοντέλα μερικής μετατροπής ή διφασικά. Συνήθως τα μοντέλα μερικής μετατροπής χρησιμοποιούνται για να περιγράψουν κάποια εναπομένουσα συγκέντρωση του μικροοργανισμού/ενζύμου στόχου, μετά την επεξεργασία με ΥΥΠ. Επιπλέον, κάποιοι ερευνητές έχουν μοντελοποιήσει τέτοια δεδομένα με κινητική αντίδρασης νιοστής τάξης (Εξ. 2.2). Οι Stoforos και Taoukis (2001) περιέγραψαν την απενεργοποίηση του μικροοργανισμού E. Coli (200 MPa, 25 C) με n ης τάξης κινητικό μοντέλο (n = 1,274) (Σχήμα 3.7). Για να περιγραφεί η εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης, k, από την πίεση χρησιμοποιείται η έννοια του όγκου ενεργοποίησης ( V α ), όπως -78-

119 Κινητική αντιδράσεων απενεργοποίησης με ΥΥΠ δίνεται από τη γραμμικοποιημένη σχέση του Eyring (3.1). Η σχέση αυτή ισχύει για ισοθερμοκρασιακές συνθήκες. ( P P ) Va ln( k) = ln( k ) P ref (3.1) ref R T όπου, P ref είναι η πίεση αναφοράς και k P ref είναι η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης στην P ref. Σε αντιστοιχία με την Εξίσωση (2.8), για την εξάρτηση του χρόνου D από την πίεση έχει προταθεί (Mussa & Ramaswamy, 1997) η Εξίσωση (3.2). όπου, Pref P log( D) = log( DP ) + (3.2) ref zp z P είναι η αύξηση της πίεσης που απαιτείται ώστε να επιτευχθεί δεκαδική μείωση του χρόνου D. Βακτηριακά σπόρια και ορισμένα ένζυμα εμφανίζονται ιδιαίτερα ανθεκτικά στην εφαρμογή πίεσης. Για το λόγο αυτό η διεργασία της υπερυψηλής πίεσης συνδυάζεται συχνά και με κάποια άλλη επεξεργασία, όπως για παράδειγμα τη θέρμανση. Ο συνδυασμός της υπερυψηλής πίεσης με ήπιες θερμοκρασίες μπορεί να οδηγήσει σε μεγαλύτερους ρυθμούς απενεργοποίησης μικροοργανισμών και ενζύμων, παρέχοντας έτσι τη δυνατότητα παραγωγής μικροβιολογικά ασφαλών και log(survivors) (a) Experimental Predicted (n=1.274) Time (min) Σχήμα 3.7 Κινητική απενεργοποίησης E. coli με υπερυψηλή πίεση (200 MPa, 25 C) (Stoforos & Taoukis, 2001) -79-

120 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης ποιοτικών προϊόντων. Στην περίπτωση αυτή προκειμένου να σχεδιαστεί μια συνδυασμένη διεργασία θα πρέπει να είναι γνωστή η εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης του παράγοντα εκείνου (μικροοργανισμός ή ένζυμο) βάσει του οποίου θα σχεδιαστεί η διεργασία, τόσο από την πίεση όσο και από τη θερμοκρασία επεξεργασίας Μοντελοποίηση της επίδρασης της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση ενζύμων Για να περιγραφεί η εξάρτηση της απενεργοποίησης ενζύμων από την πίεση και τη θερμοκρασία, έχουν πραγματοποιηθεί κατά καιρούς διάφορες προσεγγίσεις. Έτσι έχουν αναπτυχθεί μαθηματικά μοντέλα που περιγράφουν την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από την πίεση και τη θερμοκρασία χρησιμοποιώντας είτε την εξίσωση Arrhenius ή Eyring ως σημείο αναφοράς, είτε τροποποιημένες θερμοδυναμικές εξισώσεις, καθώς και ελλειπτικές εξισώσεις ή μοντέλα που βασίζονται σε δύο παράλληλους μηχανισμούς απενεργοποίησης Εμπειρική προσέγγιση Η εξίσωση του Arrhenius ή Eyring μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βάση για την κατασκευή κινητικών μοντέλων που να περιγράφουν την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από την πίεση και τη θερμοκρασία, αρκεί να ισχύει σε όλο το εύρος πίεσης-θερμοκρασίας που μελετάται κάθε φορά. Χρησιμοποιώντας ως βάση την εξίσωση Arrhenius, οι εξαρτώμενες από την πίεση παράμετροι E α και k ref αντικαθίστανται από μαθηματικές εκφράσεις που δείχνουν την εξάρτησή τους από την πίεση (Εξίσωση 3.3 και 3.4, αντίστοιχα). ( P) E a = f 1 (3.3) ( P) k ref = f 2 (3.4) Οι εκφράσεις αυτές μπορούν να προσδιοριστούν βασιζόμενοι στις καμπύλες που περιγράφουν τα πειραματικά δεδομένα (π.χ. γραμμική, εκθετική, δευτεροβάθμια, πολυωνυμική ή πιο σύνθετες μαθηματικές εξισώσεις). Στη συνέχεια -80-

121 Κινητική αντιδράσεων απενεργοποίησης με ΥΥΠ οι Εξισώσεις (3.3) και (3.4) αντικαθίστανται στην εξίσωση Arrhenius καταλήγοντας στην Εξίσωση (3.5). f ( ) ( ) 1 P 1 1 ln( k) = ln( f 2 P ) (3.5) R T T ref Η προσέγγιση αυτή έχει χρησιμοποιηθεί για να περιγράψει την εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης της πηκτινομεθυλεστεράσης, πολυφαινολικής οξειδάσης και α-αμυλάσης από τη συνδυασμένη εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας (Van den Broeck, 2000; Ludikhuyez et al., 1997; Weemaes et al., 1998). Κατά αναλογία μπορεί να χρησιμοποιηθεί η εξίσωση Eyring για να περιγράψει την εξάρτηση της απενεργοποίησης από την πίεση και τη θερμοκρασία. Οι εξαρτώμενες από τη θερμοκρασία παράμετροι V α και k ref αντικαθίστανται από μαθηματικές εκφράσεις που δείχνουν την εξάρτησή τους από τη θερμοκρασία (Εξίσωση 3.6 και 3.7 αντίστοιχα) και αντικαθιστώντας τες στην Εξίσωση (3.5) προκύπτει η Εξίσωση (3.8). ( T) V a = f 1 (3.6) ( T ) k ref = f 2 (3.7) ( T ) ( ) f1 ln( k) = ln( f 2 ( T) ) P Pref (3.8) R T Τα κινητικά διαγράμματα πίεσης θερμοκρασίας εμφανίζουν συνήθως ελλειπτικό σχήμα και η μαθηματική Εξίσωση 3.9 χρησιμοποιείται για να περιγράψει το φαινόμενο αυτό. log( + a 4 k) = ao + a1 ( P Pref ) + a2 ( T Tref ) + a3 ( P Pref ) ( P P ) ( T T ) + a ( T T ) 2 ref ref 5 ref 2 (3.9) όπου, a o, a 1, a 2, a 3, a 4, και a 5 είναι παράμετροι του μοντέλου. Η προσέγγιση αυτή χρησιμοποιήθηκε από τους Reyns et al. (2000) για να περιγράψει την απενεργοποίηση της ζύμης Zygosaccharomyces bailii λόγω επεξεργασίας με συνδυασμένη εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας. -81-

122 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Θερμοδυναμική προσέγγιση Αρκετοί ερευνητές έχουν προσεγγίσει θερμοδυναμικά την επίδραση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση διαφόρων ενζύμων όπως η λυποξυγενάση, πολυγαλακτουρονάση (Indrawati, 2000; Fachin et al., 2002b, 2003, 2004) αλλά και μικροοργανισμών όπως Lactobacillus casei και Escherichia coli (Sonoike et al., 1992). Σύμφωνα με τη θερμοδυναμική προσέγγιση, η συμπεριφορά ενός συστήματος που υφίσταται αλλαγές στην πίεση και τη θερμοκρασία του, περιγράφεται από την Εξίσωση (3.10) (Hawley, 1971; Morild, 1981). ( G) = ΔS dt + ΔV dp d Δ (3.10) Η μεταβολή της εντροπίας ( Δ S ) και του όγκου ( Δ V ) διαφέρει ανάλογα με την πίεση και τη θερμοκρασία, όπως φαίνεται στις Εξισώσεις (3.11) και (3.12) δδs δδs d( Δ S) = dt + dp (3.11) δτ δp P δδv δδv d( Δ V) = dt + dp (3.12) δτ δp Η Εξίσωση (3.10) μπορεί επομένως να μετατραπεί στην εξίσωση (3.13) P T T 1 ( P P ) ΔS ( T T ) + Δκ( P P ) ΔG = ΔGref + ΔVref ref ref ref 2 + ( )( ) T Δζ P P ref T Tref ΔC p T ln 1 + T ref Tref ref 2 (3.13) όπου, ΔC p είναι η μεταβολή θερμοχωρητικότητας, Δ ζ ο συντελεστής θερμικής διαστολής και Δκ ο συντελεστής συμπιεστότητας. Το θερμοδυναμικό αυτό μοντέλο μπορεί να μετατραπεί σε ένα κινητικό μοντέλο αν υποτεθεί ότι η ενζυμική απενεργοποίηση συνοδεύεται από τη δημιουργία ενός μετασταθούς ενζύμου ( # ) το οποίο βρίσκεται σε ισορροπία με το φυσικό ένζυμο (θεωρία μεταβατικής κατάστασης του Eyring). Οπότε, -82-

123 Κινητική αντιδράσεων απενεργοποίησης με ΥΥΠ αντικαθιστώντας τις Εξισώσεις (3.14) και (3.15) στην (3.13) προκύπτει η Εξίσωση (3.16) # # ΔG = R T ln( K ) (3.14) # k h K = r kb T (3.15) Όπου # ΔVref ln k = ln( kref ) RT # Δζ RT ( P P )( T T ) ref ref ΔS # ref 1 Δκ ( P P ) + ( T T ) ( P P ) ref RT # ΔC p T ln RT # ΔV ref είναι η μεταβολή του όγκου και # ref 2 RT 1 + T ref ref T T ref 2 (3.16) # ΔS ref η μεταβολή εντροπίας μεταξύ της φυσικής και μετουσιωμένης κατάστασης του ενζύμου σε πίεση, και θερμοκρασία αναφοράς, P ref και T ref ατίστοιχα, Δ Cp η ειδική θερμοχωρητικότητα, # Δζ ο συντελεστής θερμικής διαστολής και # Δκ ο συντελεστής συμπιεστότητας. Σύμφωνα με τον Morild (1981), η Εξίσωση (3.13) μπορεί να περιγράψει τα περισσότερα φαινόμενα σχετικά με τη συμπεριφορά τους στην εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας. Ωστόσο, ο προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (3.13) και κατά συνέπεια και της Εξίσωσης (3.16) που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν συνοδευόταν με μεγάλα τυπικά σφάλματα (Hawley, 1971; Sonoike et al., 1992). Για το λόγο αυτό σε νεότερες μελέτες οι όροι Δ Cp και # Δκ παραλήφθηκαν, και η εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης ενζύμων από την πίεση και τη θερμοκρασία περιγράφηκε με την τροποποιημένη μορφή της Εξίσωσης (3.16), όπως περιγράφεται από την Εξίσωση 3.17: # ΔVref ln k = ln( kref ) RT # Δζ ref ref RT ( P P )( T T ) ΔSref ( P P ) + ( T T ) ref RT # ref (3.17) -83-

124 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Η εξίσωση 3.17 έχει χρησιμοποιηθεί από τους Fachin et al. (2002b), (2003), (2004) για να περιγράψει την εξάρτηση της απενεργοποίησης της PG τομάτας από την πίεση και τη θερμοκρασία Άλλες μαθηματικές προσεγγίσεις Επιπλέον έχουν χρησιμοποιηθεί και άλλες μαθηματικές προσεγγίσεις της επίδρασης της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση ενζύμων. Οι Stoforos et al. (2002) προκειμένου να περιγράψουν την απενεργοποίηση της PME τομάτας κατά την επεξεργασία με συνδυασμένη πίεση και θερμοκρασία θεώρησαν ότι η μείωση της ενεργότητας του ενζύμου μπορεί να προκύψει μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών απενεργοποίησης (Σχήμα 3.8) όπως περιγράφεται από την Εξίσωση (3.18). da = k1 A k2 A (3.18) dt Ο ένας μηχανισμός μπορεί να συσχετιστεί με μεταβολές της ενζυμικής ενεργότητας που οφείλονται στη θερμοκρασία και ο άλλος στην πίεση. Η εξάρτηση των σταθερών ρυθμού απενεργοποίησης k 1 και k 2 από την πίεση και τη θερμοκρασία εκφράστηκαν μέσω της ενέργειας και του όγκου ενεργοποίησης αντίστοιχα, δηλαδή για το k 1 ισχύει: E a k 1 = kt ref exp (3.19) 1 R T Tref ( T) ( P P ) Va 1 ref k1 = kpref exp (3.20) 1 R T Αντίστοιχες εξισώσεις ισχύουν και για το k 2. Βασιζόμενοι στα παραπάνω κινητικά μοντέλα η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης στις διάφορες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας περιγράφηκε από την Εξίσωση (3.21). -84-

125 Κινητική αντιδράσεων απενεργοποίησης με ΥΥΠ k = kref + kref 2 1 Ea exp R Ea exp R T Tref 1 1 T T ref V a R V a R 2 1 ( P Pr ef ) ( P Pr ef ) T T (3.21) Το μοντέλο αυτό έδωσε συγκρίσιμα αποτελέσματα με το μοντέλο που προτάθηκε από τους Weemaes et al. (1998) για την απενεργοποίηση της PPO αβοκάντο, το οποίο συσχέτισε τη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης με την πίεση και τη θερμοκρασία μέσω της Εξίσωσης (3.22): 2 3 ln( k) = a + b P + c P + d P ( E exp( y P) ) a a 1 1 R T T ref (3.22) Όπου a, b, c, d και y είναι παράμετροι του μοντέλου και Ea a η ενέργεια ενεργοποίησης σε πίεση αναφοράς. Παρόλο που και τα δύο μοντέλα έδωσαν στατιστικά αποδεκτά αποτελέσματα, οι ερευνητές θεώρησαν ότι το προτεινόμενο μοντέλο των δύο παράλληλων μηχανισμών θα μπορούσε να δώσει μια καλύτερη φυσική ερμηνεία της διεργασίας απενεργοποίησης (Stoforos et al., 2002). Αναφορικά με τα ένζυμα της τομάτας, έχουν πραγματοποιηθεί ολοκληρωμένες μελέτες που αφορούν την επίδραση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίησή τους (Crelier et al., 2001; Fachin et al., 2002b; Stoforos et al., 2002; Fachin et al., 2003; Fachin et al., 2004). Σύμφωνα με τις μελέτες Σχήμα 3.8 Σχηματική απεικόνιση της απενεργοποίησης της PME τομάτας όπως περιγράφεται από δύο παράλληλους μηχανισμούς, ο καθένας ακολουθώντας κινητική πρώτης τάξης με τις δικές του κινητικές παραμέτρους (Stoforos et al., 2002) -85-

126 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης αυτές η απενεργοποίηση της PME ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης, όπως περιγράφεται από την Εξίσωση 2.3 (Crelier et al., 2001; Stoforos et al., 2002). Στην περίπτωση της PG, η απενεργοποίηση του ενζύμου χυμού τομάτας υπό συνθήκες υπερυψηλής πίεσης ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης σε εύρος συνθηκών MPa και C (Crelier et al., 2001). Αντιθέτως, σύμφωνα με τους Fachin et al. (2002b, 2003) η απενεργοποίηση της PG ακατέργαστου εκχυλίσματος τομάτας στο εύρος MPa και 5-50 C περιγράφηκε από κινητικό μοντέλο πρώτης τάξης μερικής μετατροπής (Εξίσωση 2.4), το οποίο κάνει λόγο για ένα ευαίσθητο στην πίεση ένζυμο και για την ύπαρξη ενός ανθεκτικού στην πίεση κλάσματος (περίπου 5%). Από την άλλη πλευρά, η απενεργοποίηση των ισοενζύμων PG1 και PG2 καθαρού εκχυλίσματος τομάτας, ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης στο ίδιο εύρος συνθηκών επεξεργασίας (Fachin et al., 2004). Στον Πίνακα 3.3 παρουσιάζονται τα διάφορα κινητικά μοντέλα που έχουν προταθεί για την περιγραφή της εξάρτησης του ρυθμού απενεργοποίησης των ενζύμων της τομάτας από την πίεση και τη θερμοκρασία επεξεργασίας. Τα μοντέλα αυτά αναπτύχθηκαν βασιζόμενοι είτε σε μαθηματικές είτε σε θερμοδυναμικές προσεγγίσεις. Παρόλο που οι συγκεκριμένες μελέτες αφορούν ένα ευρύ φάσμα πιέσεων και θερμοκρασιών επεξεργασίας, τα διαθέσιμα κινητικά δεδομένα διαφέρουν μεταξύ τους. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι κάθε ερευνητής χρησιμοποίησε διαφορετική πηγή προέλευσης του ενζύμου. Ωστόσο, οι Fachin et al. 2002b και χρησιμοποιώντας το ίδιο ένζυμο από την ίδια πηγή προέλευσης και το ίδιο κινητικό μοντέλο, προσδιόρισαν διαφορετικές παραμέτρους αυτού. Το γεγονός αυτό πιθανότατα να οφείλεται στην αδυναμία του κινητικού μοντέλου να περιγράψει εξίσου τη συμπεριφορά του ενζύμου σε διαφορετικά εύρη συνθηκών επεξεργασίας, όταν αυτό δεν εμπεριέχει κάποιου είδους φυσική ερμηνεία της παρατηρούμενης συμπεριφοράς. Η παρατήρηση αυτή ενισχύεται και στην περίπτωση των Crelier et al. (2001), οι οποίοι χρησιμοποίησαν ένα αμιγώς μαθηματικό μοντέλο για την περιγραφή των κινητικών δεδομένων απενεργοποίησης της PG, το οποίο οδήγησε σε στατιστικά μη αποδεκτά αποτελέσματα (R 2 =0,759). -86-

127 Κινητική αντιδράσεων απενεργοποίησης με ΥΥΠ Πίνακας 3.3 Κινητικά δεδομένα απενεργοποίησης PME και PG τομάτας κατά τη συνδυασμένη εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας Περιβάλλον Συνθήκες Κινητικό μοντέλο Παράμετροι Αναφορά k ref1 = 3,34*10-4 min -1 PME - Χυμός (Nema 1401) C 0,1-800 MPa k = kref + kref 2 1 Ea V a 1 exp R T Tref R Ea V a 2 exp R T T ref R ( P Pref ) ( P Pref ) T T E a1 = 373 kj/mol V a1 = 50,4 ml/mol k ref2 = 9,36*10-5 min -1 E a2 = 71,7 kj/mol V a2 = -54,5 ml/mol Stoforos et al PG - Χυμός (Flandria Prince) 5-55 C MPa ln k = ln( k # ref ΔS + RT ref ( P P ) # Δζ ( T T ) ( P P )( T T ) ref # ref ΔV ) RT RT ref ref ref ΔV ref# =-39,55 cm 3 /mol ΔS ref# =175,8 J/mol K Δζ # =0,85 cm 3 /mol K k ref = 3,43*10-4 s -1 Fachin et al PG - Χυμός (Flandria Prince) 5-50 C MPa ln k = ln( k # ref ΔS + RT ref ( P P ) # Δζ ( T T ) ( P P )( T T ) ref # ref ΔV ) RT RT ref ref ref ΔV ref# = -55,7 cm 3 /mol ΔS ref# = 265,3 J/mol K Δζ # = -1,03 cm 3 /mol K k ref = 0,0383 min -1 Fachin et al. 2002b -87-

128 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης (συνέχεια Πίνακα 3.3) Περιβάλλον Συνθήκες Κινητικό μοντέλο Παράμετροι Αναφορά PG2 σε δ/μα οξικού νατρίου ph 4, C MPa ln k = ln( k # ref ΔS + RT ref ( P P ) # Δζ ( T T ) ( P P )( T T ) ref # ref ΔV ) RT RT ref ref ref ΔV ref# = -26,3 cm 3 /mol ΔS ref# = 217,4J/mol K Δζ # = 0,58 cm 3 /mol K k ref = 0,0419 min -1 Fachin et al k 0 =3,067*10-12 exp(0,36*t) PME - Χυμός (Nema 1401) C 0,1-800 MPa ( A P) + [ B ( P C) ] k( P) = k0 exp exp A=3,7*10-4 T 2-4,9*10-2 T+1,645 B = 1,9*10-2 Crelier et al C = 17,14 T-3,53*10-2 PG - Χυμός (Nema 1401) C MPa a k = k exp exp 2 T ( a P) k 0 = 1,403*10 10 s -1 α 1 = 1,055*10 4 K α 2 = 6,049*10 3 MPa -1 Crelier et al

129 Κινητική αντιδράσεων απενεργοποίησης με ΥΥΠ Όπως προέκυψε από την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας δεδομένα που αφορούν τη σταθερότητα στη θερμοκρασία και την πίεση των PME και PG, ένζυμα που έχουν ρόλο κλειδί στο ιξώδες των προϊόντων τομάτας, δίνουν έμφαση στη δυνατότητα εφαρμογής της υπερυψηλής πίεσης στον κλάδο της βιομηχανίας τομάτας. Παρόλο που η θερμική επεξεργασία δεν επιτρέπει την επιλεκτική απενεργοποίηση της PG τομάτας με ταυτόχρονη διατήρηση της ενεργότητας της PME, αυτή είναι εφικτή με την εφαρμογή ήπιων διεργασιών υπερυψηλής πίεσης. Από τις κινητικές μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί για ένζυμα της τομάτας, προκύπτει ότι τα ένζυμα από διαφορετική πηγή προέλευσης (διαφορετική ποικιλία) παρουσιάζουν διαφορετική συμπεριφορά κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ. Έτσι ενισχύεται η ανάγκη διεξαγωγής κινητικών μελετών για ένα ευρύτερο φάσμα ποικιλιών τομάτας, σημαντικών για τη βιομηχανία. Η συλλογή τέτοιων δεδομένων θα συμβάλει στην επιλογή βέλτιστων συνθηκών επεξεργασίας με ΥΥΠ, οι οποίες θα επιτρέπουν την επιλεκτική απενεργοποίηση των ενζύμων. Αυτή η επιλεκτική απενεργοποίηση αναμένεται να οδηγήσει στην παραγωγή προϊόντων τομάτας ανώτερης ποιότητας, γεγονός που χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. -89-

130 Κεφάλαιο 3-Η τεχνολογία της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης -90-

131 Κεφάλαιο 4 Υλικά και μέθοδοι Η παρούσα διδακτορική διατριβή αφορά στη συστηματική κινητική μελέτη της απενεργοποίησης των ενζύμων PME και PG της τομάτας, τόσο κατά τη θερμική επεξεργασία όσο και κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ. Στόχο μιας τέτοιας προσπάθειας αποτελεί η επιλογή κατάλληλων συνθηκών πίεσης, θερμοκρασίας και χρόνου επεξεργασίας που θα έχουν ως αποτέλεσμα την επιλεκτική απενεργοποίηση της PG με ταυτόχρονη διατήρηση της ενεργότητας της PME. Η επιλεκτική αυτή απενεργοποίηση αναμένεται να συμβάλει σημαντικά στην παραγωγή προϊόντων τομάτας με βελτιωμένα ποιοτικά χαρακτηριστικά (υψηλό ιξώδες και συνεκτικότητα) σε σύγκριση με τη συμβατική θερμική επεξεργασία. Στη συνέχεια περιγράφεται ο σχεδιασμός των πειραμάτων της διατριβής, ο οποίος βασίστηκε στα συμπεράσματα που προέκυψαν από την ανασκόπηση της τρέχουσας επιστημονικής γνώσης. 4.1 Σχεδιασμός πειραμάτων Η πειραματική διαδικασία της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε σε τρεις φάσεις. Η πρώτη περιλαμβάνει την κινητική μελέτη της επίδρασης της θερμικής επεξεργασίας και των παραμέτρων της διεργασίας ΥΥΠ στην απενεργοποίηση των ενζύμων PME και PG από χυμό επιτραπέζιας τομάτας. Στη συνέχεια ο χυμός επεξεργάστηκε σε επιλεγμένες συνθήκες ΥΥΠ και μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας σε ποιοτικά και διατροφικά χαρακτηριστικά του χυμού, όπως το χρώμα, το ιξώδες και η περιεκτικότητα σε λυκοπένιο. Κατά τη δεύτερη φάση πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της επίδρασης των συνθηκών θερμικής επεξεργασίας και επεξεργασίας με ΥΥΠ στα ένζυμα υβριδίων τομάτας βιομηχανικής χρήσης. Στη συνέχεια ακολούθησε σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ των διαφορετικών ποικιλιών-υβριδίων τομάτας. -91-

132 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι Στο τέλος και με βάση την αποκτειθήσα εμπειρία και γνώση παράχθηκε ελαφρά συμπυκνωμένος χυμός από τομάτες επεξεργασμένες με ΥΥΠ αλλά και με τη συμβατική θερμική επεξεργασία και πραγματοποιήθηκε σύγκριση των ποιοτικών χαρακτηριστικών των παραγόμενων προϊόντων με τις δύο μεθόδους επεξεργασίας. Τα ποιοτικά χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν ήταν το χρώμα, το ιξώδες και η συνεκτικότητα των παραγόμενων χυμών. Ο σχεδιασμός των πειραμάτων αυτών περιγράφεται αναλυτικά στη συνέχεια Μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας με θέρμανση και ΥΥΠ στην απενεργοποίηση των ενζύμων PME και PG και στα χαρακτηριστικά ποιότητας χυμού επιτραπέζιας τομάτας. Αρχικά πραγματοποιηθηκε κινητική μελέτη της επίδρασης των παραμέτρων της θερμικής επεξεργασίας και της επεξεργασίας με ΥΥΠ στην ενεργότητα των ενζύμων PME και PG προερχόμενων από χυμό επιτραπέζιας τομάτας. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε χυμός από τομάτα Σαντορίνης (ποικιλία Cherrelino). Για τη μελέτη της θερμικής απενεργοποίησης πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε θερμοκρασίες C σε ατμοσφαιρική πίεση. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της εφαρμογής ΥΥΠ σε συνδυασμό με θερμοκρασία στην απενεργοποίηση των ενζύμων. Οι πιέσεις που εφαρμόστηκαν κυμάνθηκαν από 100 έως 800 MPa για την PME και 100 έως 600 MPa για την PG, οι οποίες συνδυάστηκαν με θερμοκρασίες C. Ο χρόνος επεξεργασίας ήταν διαφορετικός για κάθε συνδυασμό πίεσης και θερμοκρασίας και επιλέχθηκε ανάλογα με τον αναμενόμενο ρυθμό απενεργοποίησης. Μετά την κινητική μελέτη ακολούθησε επεξεργασία των αποτελεσμάτων και έγινε μια προσπάθεια μαθηματικής έκφρασης της επίδρασης του συνδυασμού πίεσης, θερμοκρασίας και χρόνου επεξεργασίας στην απενεργοποίηση των ενζύμων. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας επεξεργασίας που επέτρεψαν την επιλεκτική απενεργοποίηση της PG με ταυτόχρονη διατήρηση ενεργότητας της PME, στις οποίες επεξεργάστηκε ο χυμός. Ακολούθησε μελέτη της -92-

133 Σχεδιασμός πειραμάτων επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας το ιξώδες, το χρώμα και την περιεκτικότητα σε λυκοπένιο του χυμού Κινητική μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας με θέρμανση και ΥΥΠ στην απενεργοποίηση των ενζύμων PME και PG διαφορετικών υβριδίων βιομηχανικής τομάτας. Σκοπός των κινητικών πειραμάτων ήταν η μελέτη της επίδρασης των παραμέτρων της θερμικής επεξεργασίας και της επεξεργασίας με ΥΥΠ στην ενεργότητα των ενζύμων PME και PG δύο διαφορετικών υβριδίων τομάτας, σημαντικών στη βιομηχανία μεταποίησης. Τα υβρίδια που μελετήθηκαν ήταν το Oval Red και Red Sea. Για τη μελέτη της θερμικής απενεργοποίησης πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε θερμοκρασίες C σε ατμοσφαιρική πίεση. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της εφαρμογής ΥΥΠ σε συνδυασμό με θερμοκρασία στην απενεργοποίηση των ενζύμων. Στην περίπτωση της PME εμαρμόστηκαν πιέσεις που κυμάνθηκαν από 100 έως 800 MPa σε συνδυασμό με θερμοκρασίες C. Για τη μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στην απενεργοποίηση της PG εφαρμόστηκαν θερμοκρασίες C σε ατμοσφαιρική πίεση, και πιέσεις MPa σε συνδυασμό με θερμοκρασίες C. Ο χρόνος επεξεργασίας ήταν διαφορετικός για κάθε συνδυασμό πίεσης και θερμοκρασίας και επιλέχθηκε ανάλογα με τον αναμενόμενο ρυθμό απενεργοποίησης. Μετά την κινητική μελέτη ακολούθησε επεξεργασία των αποτελεσμάτων και έγινε μια προσπάθεια μαθηματικής έκφρασης της επίδρασης του συνδυασμού πίεσης, θερμοκρασίας και χρόνου επεξεργασίας στην απενεργοποίηση των ενζύμων. Οι συνθήκες επεξεργασίας που μελετήθηκαν για την κινητική απενεργοποίησης της PME και PG, προερχόμενες από τις τρεις ποικιλίες-υβρίδια, παρουσιάζονται στους Πίνακες 4.1 και 4.2, αντίστοιχα. -93-

134 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι Πίνακας 4.1 Πειραματικές συνθήκες επεξεργασίας για την κινητική μελέτη απενεργοποίησης της PME χυμού τομάτας 0.1 MPa 100 MPa 600 MPa 700 MPa 800 MPa 40 C Cherrelino Cherrelino Cherrelino Cherrelino Cherrelino 50 C Cherrelino Oval Red Red Sea 60 C Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea 65 C Cherrelino C Oval Red Oval Red Oval Red Oval Red Oval Red Red Sea Red Sea Red Sea Red Sea Red Sea 80 C Cherrelino Oval Red Oval Red Oval Red Oval Red Oval Red Red Sea Red Sea Red Sea Red Sea Red Sea Πίνακας 4.2 Πειραματικές συνθήκες επεξεργασίας για την κινητική μελέτη απενεργοποίησης της PG χυμού τομάτας 0.1 MPa 100 MPa 200 MPa 300 MPa 400 MPa 40 C Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea 50 C Oval Red Oval Red Oval Red Oval Red Oval Red Red Sea Red Sea Red Sea Red Sea Red Sea 60 C Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea 65 C Cherrelino C Oval Red Oval Red Oval Red Oval Red Oval Red Red Sea Red Sea Red Sea Red Sea Red Sea Cherrelino Cherrelino Cherrelino Cherrelinο Cherrelino 80 C Oval Red -94-

135 Σχεδιασμός πειραμάτων Παραγωγή ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού από τομάτες βιομηχανικής χρήσης επεξεργασμένες τόσο με την τεχνολογία της υπερυψηλής πίεσης όσο και με τη συμβατική θερμική επεξεργασία και αξιολόγηση των ποιοτικών του χαρακτηριστικών. Με βάση την παραπάνω κινητική μελέτη επιλέχθηκαν συνθήκες διεργασίας που επιτρέπουν την επιλεκτική απενεργοποίηση της PG με ταυτόχρονη διατήρηση της PME. Οι συνθήκες αυτές (250, 400, 500 και 600 MPa στους 50 C για 10 min) εφαρμόστηκαν σε ολόκληρες τομάτες, οι οποίες στη συνέχεια χυμοποιήθηκαν και o λαμβανόμενος χυμός χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού τομάτας. Επιπλέον, χυμός τομάτας επεξεργάστηκε θερμικά (65 και 95 C, 2 min) και χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή προϊόντος σε μια προσπάθεια προσομοίωσης της βιομηχανικής πρακτικής. Ο παραγόμενος χυμός μελετήθηκε ως προς τα ποιοτικά του χαρακτηριστικά, χρώμα, ιξώδες και συνεκτικότητα τόσο αμέσως μετά την επεξεργασία όσο και μετά από 5 μήνες αποθήκευσης. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ των προϊόντων που επεξεργάστηκαν με ΥΥΠ και με θέρμανση. 4.2 Υλικά Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων της πρώτης φάσης χρησιμοποιήθηκε χυμός από τομάτα Σαντορίνης, ποικιλίας Cherrelino (Σχήμα 4.1α). Ο χυμός παραχωρήθηκε από το Συναιτερισμό Θηραϊκών Προϊόντων στη Σαντορίνη. Η τομάτα Σαντορίνης είναι μια ποικιλία που παρουσιάζει ιδιαίτερο εμπορικό ενδιαφέρον. Στον Ελλαδικό χώρο καλλιεργείται αποκλειστικά στη Σαντορίνη. Συγκομίζεται τον Ιούλιο και καταναλώνεται κυρίως σε νωπή μορφή, σε σαλάτες. Λόγω του υγρού κλίματος του νησιού, οι απαιτήσεις του φυτού σε νερό έιναι ελάχιστες, με αποτέλεσμα ο ώριμος καρπός να εμφανίζει υψηλή περιεκτικότητα σε διαλυτά στερεά (8-9 Brix). Κατά τη δεύτερη φάση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν υβρίδια τομάτας βιομηχανικής χρήσης, οι οποίες καλλιεργήθηκαν στην περιοχή της Βοιωτίας. Οι τομάτες παραχωρήθηκαν από τη βιομηχανία μεταποίησης τομάτας Δ. Νομικός ΑΒΕΚ (Αλίαρτος, Βοιωτία). Τα υβρίδια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το Red Sea και -95-

136 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι Oval Red. Η Red Sea (Σχήμα 4.1β) είναι όψιμο υβρίδιο που συγκομίζεται τέλος Σεπτέμβρη. Ο καρπός του είναι οβάλ με έντονο κόκκινο χρώμα. Πρόκειται για ένα υβρίδιο με μέτρια περιεκτικότητα σε διαλυτά στερεά (4,5 Brix), έχει ph 4,40 και χρησιμοποιείται κυρίως για την παραγωγή τοματοπολτού. Το υβρίδιο Oval Red (Σχήμα 4.1γ) είναι μεσο-όψιμο που συγκομίζεται το Σεπτέμβρη. Πρόκειται για έναν καρπό του έχει οβάλ σχήμα και έντονο κόκκινο χρώμα. Είναι πολύ παραγωγική ποικιλία που μπορεί να ξεπεράσει τους 10 τόννους ανά στρέμμα. Το υβρίδιο έχει υψηλή περιεκτικότητα σε διαλυτά στερεά (5,8 Brix) και ph 4,30. Οι τομάτες αφού μεταφέρθηκαν στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του ΕΜΠ πολτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας οικιακό ομογενοποιητή, ο χυμός που προέκυψε συσκευάστηκε σε σακουλάκια πολυαιθυλενίου και καταψύχθηκε στους -40 C μέχρι τη χρήση του. (α) (β) (γ) Σχήμα 4.1 (α) Τομάτα Σαντορίνης, ποικιλία Cherrelino, (β) υβρίδιο Red Sea και (γ) υβρίδιο Oval Red 4.3 Πειραματική διαδικασία Θερμική επεξεργασία χυμού τομάτας Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων θερμικής επεξεργασίας του χυμού τομάτας σε ατμοσφαιρική πίεση, δείγματα 2,5 ml χυμού τομάτας (επιτραπέζιας και βιομηχανικής) συσκευάστηκαν σε σακουλάκια πολυαιθυλενίου, τα οποία σφραγίστηκαν με θερμοκόλληση, αφού προηγουμένως αφαιρέθηκε από μέσα όσο το δυνατό περισσότερος αέρας (MAP, Boss P021, Homburg, Germany). Οι διαστάσεις των σακουλιών επέτρεπαν την ταχεία και ομοιόμορφη θέρμανση των δειγμάτων. -96-

137 Πειραματική διαδικασία Τα δείγματα (δύο για κάθε χρόνο επεξεργασίας) εμβαπτίζονταν σε υδατόλουτρο (Bioline Scientific, Αθήνα, Ελλάδα) ρυθμισμένο στην επιθυμητή θερμοκρασία, σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό. Η χρονική στιγμή που η θερμοκρασία του δείγματος έφτανε την επιθυμητή τιμή θεωρήθηκε ως χρόνος έναρξης του πειράματος (t=0). Τη χρονική αυτή στιγμή απομακρύνονταν από το υδατόλουτρο δύο δείγματα και τοποθετούνταν σε πάγο για γρήγορη πτώση της θερμοκρασίας τους. Μετά την εξισορρόπηση της θερμοκρασίας στην επιθυμητή τιμή, τα υπόλοιπα δείγματα απομακρύνονταν, ανά δύο, διαδοχικά από το υδατόλουτρο σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα ακολουθώντας την ίδια διαδικασία. Τα δείγματα φυλάγονταν σε θερμοκρασία κατάψυξης (-40 C) μέχρι τη μέτρηση της ενεργότητας των ενζύμων Επεξεργασία με ΥΥΠ Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκε εξοπλισμός εργαστηριακής κλίμακας Food Pressure Unit FPU 1.01, της Resato International ΒV (Roden, Holland). Ο εξοπλισμός αποτελεί συνιδιοκτησία του ΕΜΠ και του Ινστιτούτου Τεχνολογίας Γεωργικών Προϊόντων του ΕΘΙΑΓΕ και είναι εγκατεστημένος και λειτουργεί σε ειδικά διαμορφωμένο χώρο στο Ι.ΤΕ.ΓΕ.Π, ΕΘΙΑΓΕ (Λυκόβρυση, Αθήνα) Μονάδα Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Ο συγκεκριμένος εξοπλισμός περιλαμβάνει μια μονάδα ΥΥΠ, η οποία συνδέεται με δύο συστήματα θαλάμων υπερυψηλών πιέσεων που λειτουργούν ανεξάρτητα μεταξύ τους (Σχήμα 4.2). Το ένα σύστημα περιλαμβάνει μια συστοιχία 6 κατακόρυφων κυλινδρικών μικροθαλάμων υπερυψηλής πίεσης με κωνικό πυθμένα, όγκου 42 ml ο καθένας (Σχήμα 4.3). Κάθε μικροθάλαμος έχει τη δυνατότητα ανεξάρτητου χειρισμού. Το σύστημα αυτό χρησιμοποιείται για τη συλλογή κινητικών δεδομένων των αντιδράσεων καταστροφής των παραγόντων αλλοίωσης ή υποβάθμισης των ποιοτικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών των τροφίμων κατά την επεξεργασία τους με υπερυψηλές πιέσεις. Το δεύτερο σύστημα -97-

138 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι περιλαμβάνει ένα θάλαμο υπερυψηλής πίεσης όγκου 1,5 L σε κατακόρυφη θέση και χρησιμοποιείται για την επεξεργασία και την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων προϊόντων και την περαιτέρω μελέτη τους (Σχήμα 4.4). Για τη δημιουργία των υπερυψηλών πιέσεων χρησιμοποιείται η αρχή του ενισχυτή πίεσης (pressure intensifier). Για την επίτευξη πιέσεων έως 0,5 MPa χρησιμοποιείται ένας αεροσυμπιεστής. Ο πεπιεσμένος αέρας χαμηλής πίεσης εισέρχεται σε μια αντλία αέρα από την οποία εξέρχεται το υγρό μεταφοράς της πίεσης με πολύ μεγαλύτερη πίεση (100 MPa). Η διαφορά πίεσης επιτυγχάνεται εξαιτίας της διαφοράς διατομών των σωληνώσεων εισόδου και εξόδου της αντλίας. Σχήμα 4.2 Μονάδα Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης Σχήμα 4.3 Συστοιχία κατακόρυφων κυλινδρικών μικροθαλάμων υπερυψηλής πίεσης όγκου 42 ml ο καθένας, που χρησιμοποιείται για κινητικές μελέτες -98-

139 Πειραματική διαδικασία Για πιέσεις μεγαλύτερες από 100 MPa χρησιμοποιείται αντλία λαδιού, όπου μια σχετικά χαμηλή πίεση λαδιού χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει την επιθυμητή υψηλή πίεση εξόδου. Αυτό επιτυγχάνεται με τη σύνδεση ενός μικρού εμβόλου με ένα έμβολο λαδιού μεγαλύτερης επιφάνειας. Η πίεση του υγρού μεταφοράς της πίεσης που δρα στη μικρή επιφάνεια αντισταθμίζει την πίεση του λαδιού που δρα στη μεγαλύτερη επιφάνεια. Η πίεση του υγρού μεταφοράς της πίεσης είναι μεγαλύτερη από την πίεση του λαδιού λόγω της αναλογίας των επιφανειών των εμβόλων του λαδιού και του υγρού. Η ρύθμιση της πίεσης εξόδου του ενισχυτή πίεσης μπορεί να γίνει ρυθμίζοντας την πίεση εισόδου του λαδιού. Ο ενισχυτής πίεσης της συγκεκριμένης μονάδας είναι διπλής δράσης και λειτουργεί με τη βοήθεια μιας υδραυλικής αντλίας, η οποία τροφοδοτείται από ηλεκτρικό κινητήρα και διοχετεύει το απαιτούμενο λάδι στον ενισχυτή ισοσταθμίζοντας την πίεση. Μια μικρότερη αντλία χρησιμοποιείται για την κυκλοφορία του λαδιού μέσω ενός συστήματος ψύξης (για τον έλεγχο της θερμοκρασίας του) και ενός φίλτρου λαδιού χαμηλής πίεσης. Ο ενισχυτής πίεσης διαθέτει βαλβίδες ελέγχου εισόδου και εξόδου, λειτουργώντας έτσι ως παλινδρομική αντλία. Όταν το υδραυλικό έμβολο του ενισχυτή φτάσει στο τέλος ενεργοποιεί έναν ηλεκτρονικό διακόπτη και η ροή του λαδιού αντιστρέφεται καθώς το έμβολο κινείται τώρα προς την αντίθετη κατεύθυνση. Σχήμα 4.4 Κυλινδρικός θάλαμος υπερυψηλής πίεσης όγκου 1,5 L σε κατακόρυφη διάταξη -99-

140 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι Το υγρό μεταφοράς της πίεσης εισέρχεται στον ενισχυτή. Η πίεση του υγρού αυξάνεται σύμφωνα με την παραπάνω αρχή και μεταφέρεται προς τους θαλάμους υπερυψηλής πίεσης μέσω της ροής του υγρού σε σωλήνες από ανοξείδωτο χάλυβα. Πνευματικές χειροκίνητες βαλβίδες ρυθμίζουν την εισαγωγή ή όχι του υγρού σε κάθε έναν από τους θαλάμους. Για λόγους ασφαλείας το σύστημα περιλαμβάνει ειδικούς δακτυλίους, οι οποίοι διαρρηγνύονται σε περίπτωση που παρουσιαστεί κάποιο πρόβλημα, έτσι ώστε να εκτονωθεί η υψηλή πίεση. Οι θάλαμοι υπερυψηλής πίεσης και των δύο συστημάτων της μονάδας είναι κατασκευασμένοι από ειδικά τοιχώματα μεγάλου πάχους και υψηλής ανθεκτικότητας, κλείνουν με καπάκια συνεχούς σπείρας και γύρω από κάθε έναν από αυτούς έχει τοποθετηθεί θερμοστατούμενος μανδύας στον οποίο κυκλοφορεί υγρό για ψύξη ή θέρμανση. Κάθε ένα από τα δύο συστήματα βρίσκεται σε ειδική καμπίνα με παράθυρα από γυαλί υψηλής ανθεκτικότητας. Για λόγους ασφαλείας, όταν η πόρτα της καμπίνας ανοίξει η πίεση απελευθερώνεται αυτόματα. Κύρια τεχνικά χαρακτηριστικά της μονάδας ΥΥΠ που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή αναφέρονται η μέγιστη πίεση λειτουργίας που είναι 1000 MPa και το εύρος της θερμοκρασίας της διεργασίας που μπορεί να κυμαίνεται από -40 έως 100 C. Το μέσο μεταφοράς της πίεσης του συστήματος ήταν πολυγλυκόλη (Polyglyvol ISO viscosity class VG 15, Resato International BV, Roden, Holland). Η πίεση του συστήματος καθώς και η πίεση στο εσωτερικού του μεγάλου θαλάμου ελέγχονταν και καταγράφονταν μέσω δύο μετατροπέων σήματος, ενώ εμφανίζονταν κατά τη διάρκεια λειτουργίας του συστήματος σε οθόνη αυτόματου συστήματος ελέγχου PLC (Programmable Linear Controllers) της μονάδας ΥΥΠ, καθώς και σε ηλεκτρονικό υπολογιστή, ο οποίος ήταν συνδεδεμένος με τη μονάδα, μέσω κατάλληλου λογισμικού (Σχήμα 4.5). Για την καταγραφή της θερμοκρασίας στο εσωτερικό καθενός θαλάμου πίεσης του συστήματος χρησιμοποιούνταν θερμοστοιχεία τύπου K. Η θερμοκρασία παρακολουθείται μέσω του ίδιου λογισμικού από την οθόνη του υπολογιστή. Η πίεση λειτουργίας της μονάδας ρυθμίζεται με τη βοήθεια των πλήκτρων του PLC με βήμα αύξησης ή μείωσης 25 MPa. Για ταχύτερη άνοδο της πίεσης υπάρχει η δυνατότητα άμεσης συμπίεσης στα 250, 500 και 750 MPa

141 Πειραματική διαδικασία Ο χρόνος επίτευξης της επιθυμητής πίεσης εξαρτάται από το μέγεθος αυτής και από τη μεταβολή της πίεσης. Ο ρυθμός αύξησης της πίεσης είναι περίπου 20 MPa/sec, ενώ ο χρόνος εκτόνωσης της πίεσης είναι μικρότερος από 3 sec. Για την προστασία και την αποφυγή απευθείας επαφής του εξεταζόμενου τροφίμου με το μέσο μεταφοράς της πίεσης, τα δείγματα συσκευάζονται κατάλληλα. Η χρήση εξωτερικής προστατευτικής συσκευασίας είναι απαραίτητη και για τη αποφυγή φραξίματος των οπών εισόδου/εξόδου του υγρού μεταφοράς της πίεσης στον πυθμένα των δοχείων πίεσης από τα διάφορα σωματίδια του τροφίμου. Σχήμα 4.5 Λογισμικό μονάδας ΥΥΠ Κινητικά πειράματα ΥΥΠ Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων επεξεργασίας του χυμού σε συνθήκες ΥΥΠ σε συνδυασμό με θερμοκρασία χρησιμοποιήθηκε το σύστημα που περιλαμβάνει τους 6 κυλινδρικούς μικροθαλάμους υπερυψηλής πίεσης. Δώδεκα δείγματα χυμού τομάτας όγκου 2,5 ml συσκευάστηκαν σε σακουλάκια πολυαιθυλενίου, τα οποία σφραγίστηκαν με θερμοκόλληση. Για την αποφυγή διαρροής του χυμού στο υγρό μεταφοράς της πίεσης, τα σακουλάκια τοποθετήθηκαν σε δεύτερη συσκευασία (ελαφρώς μεγαλύτερα σακουλάκια) και μεταφέρθηκαν ανά δύο στους έξι θαλάμους, οι οποίοι πληρώθηκαν με το υγρό μεταφοράς της πίεσης (πολυγλυκόλη) και σφραγίστηκαν. Τόσο τα σακουλάκια με το δείγμα όσο και η δεύτερη συσκευασία -101-

142 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι σφραγίστηκαν αφού προηγουμένως είχε αφαιρεθεί όσο το δυνατό περισσότερος αέρας. Αρχικά, οι βαλβίδες εισαγωγής του υγρού πίεσης στα δοχεία ήταν ανοιχτές ώστε η επιθυμητή πίεση του συστήματος να μεταφερθεί σε κάθε ένα από αυτά. Εφόσον ρυθμίστηκε και επιτεύχθηκε η επιθυμητή πίεση, κλείστηκαν οι βαλβίδες, οπότε οι θάλαμοι πίεσης απομονώθηκαν και η πίεση διατηρήθηκε σταθερή σε κάθε έναν από αυτούς. Η χρονική αυτή στιγμή θεωρήθηκε ως ο χρόνος έναρξης της διεργασίας (t=0), οπότε και εξασφαλίστηκαν οι ισοβαρείς συνθήκες του πειράματος. Τη χρονική στιγμή μηδέν ανοίχθηκε η βαλβίδα του πρώτου μικροθαλάμου οπότε η πίεση εκτονώθηκε. Η πίεση κάθε μικροθαλάμου εκτονώθηκε ύστερα από καθορισμένα χρονικά διαστήματα σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό, ανοίγοντας την εκάστοτε βαλβίδα. Όλα τα δείγματα μετά την επεξεργασία με ΥΥΠ φυλάχθηκαν υπό κατάψυξη (-40 C) έως τον πειραματικό προσδιορισμό της ενεργότητας των ενζύμων σε κάθε συνθήκη Παραγωγή ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού από τομάτες επεξεργασμένες με ΥΥΠ Αντικείμενο της τρίτης σειράς πειραμάτων αποτέλεσε η παραγωγή ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού τομάτας επεξεργασμένου τόσο με την τεχνολογία της υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης όσο και με θερμική επεξεργασία. Τα πειράματα ΥΥΠ πραγματοποιήθηκαν στο σύστημα του μεγάλου θαλάμου (1,5 L) πίεσης. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε, η οποία απεικονίζεται σχηματικά στο Σχήμα 4.6, ήταν η εξής: Ολόκληρες τομάτες (υβρίδιο Red Sea), αφού πλύθηκαν, συσκευάστηκαν σε σακουλάκια, τα οποία σφραγίστηκαν με θερμοκόλληση αφαιρώντας από μέσα όσο το δυνατό περισσότερο αέρα. Οι τομάτες τοποθετήθηκαν στο θάλαμο υπερυψηλής πίεσης, ο οποίος πληρώθηκε με πολυγλυκόλη και σφραγίστηκε. Η μονάδα υπερυψηλής πίεσης τέθηκε σε λειτουργία, ρυθμίστηκε η επιθυμητή πίεση και όταν αυτή επιτεύχθηκε κλείστηκε η βαλβίδα εισαγωγής του υγρού πίεσης στο δοχείο. Η χρονική αυτή στιγμή θεωρήθηκε ως ο χρόνος έναρξης της διεργασίας. Ύστερα από καθορισμένο κατά τον πειραματικό σχεδιασμό χρονικό διάστημα η πίεση εκτονώθηκε ανοίγοντας η βαλβίδα. Το δοχείο υπερυψηλής πίεσης -102-

143 Πειραματική διαδικασία ανοίχθηκε και απομακρύνθηκαν οι τομάτες. Στη συνέχεια ακολούθησε θραύση των τοματών χρησιμοποιώντας οικιακό ομογενοποιητή. Η τοματόμαζα προωθήθηκε σε κάθετο διαχωριστήρα (διάμετρος οπής κόσκινου 1 mm) όπου απομακρύνθηκαν οι φλοιοί και τα σπόρια της τομάτας. Ο παραγόμενος χυμός, περιεκτικότητας σε διαλυτά στερεά περίπου 4,2 Brix, συμπυκνώθηκε μέχρι τα 8,5 Brix με τη βοήθεια εργαστηριακού περιστροφικού εξατμιστήρα (Laborota 4000 Heidolph, Germany). Η συμπύκνωση πραγματοποιήθηκε υπό κενό σε θερμοκρασία 60 C. Οι παραπάνω διεργασίες πραγματοποιήθηκαν στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας Γεωργικών Προϊόντων του ΕΘΙΑΓΕ. Στη συνέχεια ο συμπυκνωμένος χυμός τομάτας τοποθετήθηκε σε γυάλινους περιέκτες και μεταφέρθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του ΕΜΠ όπου πραγματοποιήθηκαν οι αναλύσεις των ποιοτικών του χαρακτηριστικών. Οι παράμετροι ποιότητας που μελετήθηκαν ήταν το ιξώδες, η συνεκτικότητα κατά Bostwick, το χρώμα, καθώς και η ενεργότητα των ενζύμων PME και PG. Έπειτα, ποσότητα συμπυκνωμένου χυμού παστεριώθηκε σε θερμοκρασία 95 C για 20 min και τοποθετήθηκε σε σκοτεινό θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 20 C, όπου φυλάχθηκε για 5 μήνες, οπότε και επαναλήφθηκαν οι μετρήσεις των ποιοτικών του χαρακτηριστικών. Σκοπός της αποθήκευσης ήταν να μελετηθεί κατά πόσο οι συνθήκες αποθήκευσης επηρεάζουν τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του χυμού. Για την παραγωγή συμπυκνωμένου χυμού τομάτας επεξεργασμένου με θερμική επεξεργασία ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία όπως και προηγουμένως, με τη διαφορά ότι αρχικά πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση των τοματών και έπειτα ακολούθησε θέρμανση της τοματόμαζας, σε συνθήκες που καθορίστηκαν κατά τον πειραματικό σχεδιασμό (65 και 95 C για 2 min), προσομοιάζοντας έτσι τη βιομηχανική πρακτική

144 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι 1 η ύλη (ολόκληρες ντομάτες) Πλύση συσκευασία (σακουλάκια) συμπίεση (θάλαμος ΥΥΠ) θραύση τοματών (οικιακός ομογενοποιητής) απομάκρυνση φλοιών & σπορίων τομάτας (κάθετος διαχωριστήρας) συμπύκνωση χυμού τομάτας (περιστροφικός εξατμιστήρας) αποθήκευση (20 C για 5 μήνες) παστερίωση (95 C για 20 min) συσκευασία συμ πυκνωμένου χυμού τομάτας (γυάλινοι περιέκτες) Σχήμα 4.6 Διάγραμμα ροής πειραματικής διαδικασίας παραγωγής τοματοπολτού 4.4. Αναλυτικές μέθοδοι Στη συνέχεια αναπτύσσονται οι μέθοδοι σύμφωνα με τις οποίες μετρήθηκαν οι διάφορες παράμετροι κάθε σειράς πειραμάτων Μέτρηση ενεργότητας της πηκτινομεθυλεστεράσης (PME) Για τη μέτρηση της ενεργότητας της πηκτινομεθυλεστεράσης χρησιμοποιήθηκε τροποποιημένη η μέθοδος των Rouse & Atkins (1955). Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην τιτλοδότηση σε ph 7,5 και θερμοκρασία 30 C των ελεύθερων -104-

145 Αναλυτικές μέθοδοι καρβοξυλικών ομάδων που δημιουργούνται κατά την υδρόλυση της πηκτίνης από την πηκτινομεθυλεστεράση. Συγκεκριμένα, δείγμα χυμού τομάτας όγκου 2 ml ρυθμισμένο σε ph 7,5 με προσθήκη διαλύματος NaOH 0,2 Ν προστέθηκε σε 50 ml διαλύματος πηκτίνης 1 % σταθερής θερμοκρασίας 30 C (εμπορική πηκτίνη μήλου βαθμού εστεροποίησης %, Fluka BioChemika, Buchs, Switzerland) που περιείχε 0,3 Μ NaCl, το οποίο είχε ρυθμιστεί εκ των προτέρων σε ph 7,5 με προσθήκη διαλύματος NaOH 0,2 Ν στους 30 C. Μετά την ανάμιξη, το ph του αντιδρώντος μίγματος διατηρήθηκε σταθερό στο 7,5 προσθέτοντας διάλυμα NaOH 0,2 Ν με τη βοήθεια αυτόματου τιτλοδότη (TitraLab 854, ph-stat Titration Manager, Radiometer Analytical, France) (Σχήμα 4.7). Η θερμοκρασία διατηρήθηκε σταθερή με τη χρήση ειδικού γυάλινου δοχείου ανάμιξης με διπλά τοιχώματα, διαμέσου των οποίων κυκλοφορούσε νερό σταθερής θερμοκρασίας (30 C) από υδατόλουτρο (D3 HAAKE, Berlin, Germany). Η κλίση dv NaOH / dt προσδιορίστηκε στο γραμμικό τμήμα της καμπύλης τιτλοδότησης (Σχήμα 4.7). Η ενεργότητα της πηκτινομεθυλεστεράσης του χυμού τομάτας, A, είναι ανάλογη της κλίσης της καμπύλης τιτλοδότησης, υπολογίστηκε μέσω της εξίσωσης 4.1 και εκφράστηκε ως meq υδρολυμένων εστέρων ανά ml χυμού και ανά μονάδα χρόνου (min) (units/ml) σε ph 7,5 και θερμοκρασία 30 C. ml NaOH 0.02N dv NaOH dt Χρόνος (min) Σχήμα. 4.7 Συσκευή μέτρησης και υπολογισμός της δραστικότητας της PME (κατανάλωση NaOH 0,02 Ν συναρτήσει του χρόνου τιτλοδότησης) -105-

146 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι όπου, dvnaoh N NaOH A = (4.1) dt Vδείγματος N NaOH είναι η κανονικότητα του διαλύματος NaOH που χρησιμοποιήθηκε κατά την τιτλοδότηση (meq/ ml) και (μετά τη ρύθμιση του ph) δείγματος χυμού (ml). V δείγματος είναι ο όγκος του αραιωμένου Για τον υπολογισμό της ενεργότητας της πηκτινομεθυλεστεράσης του αρχικού δείγματος χυμού τομάτας (πριν τη ρύθμιση του ph) ελήφθη υπόψη η αραίωση του δείγματος κατά τη ρύθμιση του ph. Κάθε δείγμα μετρήθηκε δύο φορές Μέτρηση ενεργότητας της πολυγαλακτουρονάσης (PG) Όπως αναφέρθηκε στο Κεφάλαιο 2, η μέτρηση της ενεργότητας της πολυγαλακτουρονάσης βασίζεται στην απελευθέρωση των αναγωγικών σακχάρων που παράγονται κατά τη δράση της στην πηκτίνη. Ωστόσο η τομάτα αποτελεί ένα προϊόν που περιέχει σημαντικό ποσοστό φυσικών αναγωγικών σακχάρων. Για το λόγο αυτό πριν από τη μέτρηση της ενεργότητας της πολυγαλακτουρονάσης κρίθηκε απαραίτητη η εκχύλιση του ενζύμου από το χυμό τομάτας (Pressey, 1986) Εκχύλιση Πολυγαλακτουρονάσης Για την εκχύλιση της PG ακολουθήθηκε η μεθοδολογία που περιγράφεται από τους Fachin et al. (2003). Δείγμα χυμού τομάτας όγκου 5 ml φυγοκεντρήθηκε (High speed refrigerated centrifuge, ALC 4239R, ALC International, Milano Italy) σε rpm για 10 min. Το υπερκείμενο υγρό της φυγοκέντρησης αντικαταστάθηκε με κρύο απιονισμένο νερό, το ph του οποίου είχε ρυθμιστεί στην τιμή 3 με τη χρήση 0,1 Ν HCl, και ακολούθησε μηχανική ανάδευση για 30 min. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις rpm για 10 min, το υπερκείμενο υγρό απορρίφθηκε και το ίζημα αναμίχθηκε με διάλυμα NaCl 1,2 M σε αναλογία 1:4 (w/v). Ακολούθησε ανάδευση του μίγματος για 1 ώρα και στη συνέχεια φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min. Για τη μέτρηση της ενεργότητας της PG -106-

147 Αναλυτικές μέθοδοι χρησιμοποιήθηκε το υπερκείμενο υγρό της τελευταίας φυγοκέντρησης. Όλα τα στάδια της εκχύλισης πραγματοποιήθηκαν σε σταθερή θερμοκρασία 5 C Δοκιμή ενεργότητας της πολυγαλακτουρονάσης Για τη μέτρηση της ενεργότητας της πολυγαλακτουρονάσης χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτομετρική μέθοδος όπως περιγράφεται από τον Gross (1982). Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην απελευθέρωση αναγωγικών σακχάρων κατά τη διάσπαση του πολυγαλακτουρονικού οξέος λόγω της δράσης της PG σε ph 4,4 και θερμοκρασία 35 C. Τρακόσια (300) μl υποστρώματος πολυγαλακτουρονικού οξέος (PGA, Sigma, BioChemika,) 0,2% w/v σε ρυθμιστικό διάλυμα CH 3 COONa 40 mm ph 4,4, αναμίχθηκαν με 100 μl εκχυλίσματος ενζύμου και ακολούθησε επώαση του μίγματος σε θερμοκρασία 35 C για 10 min. Η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 2 ml κρύου ρυθμιστικού διαλύματος βορικού νατρίου ph 9,0 συγκέντρωσης 0,1 Μ και 400 μl διαλύματος 1% w/v κυανοακεταμίδιο-2. Το μίγμα εμβαπτίστηκε σε λουτρό θερμοκρασίας 100 C και ακολούθησε βρασμός για 10 min. Μετρήθηκε η απορρόφηση του μίγματος με ψηφιακό φασματοφωτόμετρο πολλαπλών θέσεων (Unicam Helios a. Spectronic Unicam EMEA, Cambridge, UK) σε μήκος κύματος 276 nm και θερμοκρασία 25 C. Τυφλά δείγματα προετοιμάστηκαν χρησιμοποιώντας απενεργοποιημένο ένζυμο (βρασμός εκχυλίσματος για 10 min). Κάθε δείγμα μετρήθηκε τρεις φορές. Μία μονάδα ενεργότητας της PG ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για την παραγωγή 1 μmol αναγωγικών ομάδων ανά min σε ph 4,4 και θερμοκρασία 35 C. Η μετρούμενη απορρόφηση ανάχθηκε σε μονάδες ενεργότητας ενζύμου χρησιμοποιώντας καμπύλη βαθμονόμησης η οποία κατασκευάστηκε με πρότυπο διάλυμα γαλακτουρονικού οξέος Εναλλακτική μέθοδος μέτρησης της ενεργότητας της PG Για την εκχύλιση της PG από το χυμό τομάτας ποικιλίας Cherrelino, ακολουθήθηκε τροποποιημένη η μέθοδος που περιγράφηκε από τους Brummell et al. (2004). Δείγμα χυμού τομάτας όγκου 15 ml αναμίχθηκε με ίση ποσότητα κρύου διαλύματος 12% πολυαιθυλενικής γλυκόλης (polyethylene glycol 3350), το οποίο -107-

148 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι περιείχε 0,2% NaHSO 3, και ακολούθησε ανάδευση για 10 min. Τα αδιάλυτα στερεά συλλέχθηκαν σε υφασμάτινο μέσo διήθησης, ξεπλύθηκαν με 15 ml διαλύματος 0,2% NaHSO 3, αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm CH 3 COONa ph 5,0 που περιείχε 0,75 M NaCl σε αναλογία 1:10 (w/v) και ακολούθησε μηχανική ανάδευση του μίγματος για μία ώρα. Στη συνέχεια το μίγμα φυγοκεντρήθηκε σε rpm για 10 min (High speed refrigerated centrifuge, ALC 4239R, ALC International, Milano Italy). Το υπερκείμενο υγρό της φυγοκέντρησης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ενεργότητας της PG. Όλα τα στάδια εκχύλισης πραγματοποιήθηκαν σε σταθερή θερμοκρασία 5 C. Η μέτρηση της ενεργότητας της PG βασίστηκε στη μείωση του ιξώδους διαλύματος πηκτίνης λόγω αποκοδόμησής της από τη δράση του ενζύμου. Για τη μέτρηση του ιξώδους χρησιμοποιήθηκε περιστροφικό ιξωδόμετρο RHEOTEST RC1 (Medingen GmbH, Radeburg, Germany) (Σχήμα 4.8), το οποίο είναι συνδεδεμένο με ηλεκτρονικό υπολογιστή. Το ιξωδόμετρο περιλαμβάνει μια ηλεκτρονική μονάδα με πρότυπα DIN συστήματα ομόκεντρων κυλίνδρων για τη μέτρηση διαφορετικού εύρους ιξώδους, ένα θερμοστοιχείο Pt100 για τη μέτρηση της θερμοκρασίας, ένα θερμοστατούμενο μανδύα FTK-CC (-10 C έως 90 C) και λογισμικό RHEO Σχήμα 4.8 Ηλεκτρονικό ιξωδόμετρο RHEOTEST RC1 (Medingen GmbH, Radeburg, Germany) -108-

149 Αναλυτικές μέθοδοι Το σύστημα μέτρησης που χρησιμοποιήθηκε (double gap cylinder DG DIN) αποτελείται από δύο ομόκεντρους κυλίνδρους, έναν ακίνητο (εξωτερικό) και έναν περιστρεφόμενο (εσωτερικό), ενώ το μετρήσιμο ιξώδες κυμαίνεται από 0,001 έως 1,30 Pa s. Τέσσερα (4) ml εκχυλίσματος ενζύμου αναμίχθηκαν με 18,5 ml διαλύματος πηκτίνης 2% (εμπορική πηκτίνη εσπεριδοειδών διαλυμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm CH 3 COONa, ph 4,4) (Pectin from citrus fruits, P9135, Sigma-Aldrich, Denmark). Το μίγμα τοποθετήθηκε στο διάκενο μεταξύ των δύο κυλίνδρων και ακολούθησε μέτρηση του ιξώδους σε σταθερό ρυθμό διάτμηση 99 s -1 και θερμοκρασία 35 C. Τιμές του ιξώδους καταγράφονταν κάθε 12 s για συνολικό χρόνο μέτρησης 600 s. Κάθε δείγμα μετρήθηκε δύο φορές. Η μέση μεταβολή του ιξώδους στο σύνολο του χρόνου μέτρησης των 600 s συσχετίστηκε με την ενεργότητα του ενζύμου χρησιμοποιώντας καμπύλη βαθμονόμησης, η οποία κατασκευάστηκε με δείγματα εμπορικής PG γνωστής συγκέντρωσης, όπως περιγράφεται αναλυτικά στο επόμενο κεφάλαιο Μέτρηση ιξώδους Για τη μέτρηση του ιξώδους του ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού τομάτας χρησιμοποιήθηκε το περιστροφικό ιξωδόμετρο που περιγράφηκε στην προηγούμενη παράγραφο και απεικονίζεται στο Σχήμα 4.8. Το στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του ιξώδους αποτελείται από δύο ομόκεντρους κυλίνδρους, έναν ακίνητο (εξωτερικό) και έναν περιστρεφόμενο (εσωτερικό), ενώ το μετρήσιμο ιξώδες κυμαίνεται από 0,118 έως 100 Pa s. Το υπό εξέταση δείγμα (17,5 ml) τοποθετήθηκε στο εσωτερικό του ακίνητου κυλίνδρου. Η διατμητική τάση καθώς και το ιξώδες του δείγματος μετρήθηκαν σε διάφορους ρυθμούς διάτμησης από 0,1 έως 10 s -1. Κάθε δείγμα μετρήθηκε δύο φορές σε σταθερή θερμοκρασία 20 C Μέτρηση συνεκτικότητας κατά Bostwick Η συνεκτικότητα των ελαφρά συμπυκνωμένων χυμών τομάτας μετρήθηκε με τη μέθοδο Bostwick. Η μέθοδος αυτή αναπτύχθηκε από τον E.P. Bostwick ειδικά για τη μέτρηση της συνεκτικότητας τοματοπολτού και αποτελεί την πλέον διαδεδομένη -109-

150 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι μέθοδο στη βιομηχανία τομάτας (USDA, 1971). Συνεκτικότητα κατά Bostwick ορίζεται ως η απόσταση που διανύει ένα ρευστό μόνο υπό την επίδραση του βάρους του κατά μήκος μιας πλήρως ευθυγραμμισμένης και βαθμονομημένης επιφάνειας σε συγκεκριμένο χρονικό διάστημα (συνήθως 30 sec) και θερμοκρασία 20 C. Για τη μέτρηση της συνεκτικότητας χρησιμοποιήθηκε το Bostwick consistometer. Πρόκειται για ένα «κανάλι» από ανοξείδωτο χάλυβα. Στο ένα άκρο του τοποθετείται το δείγμα σε κατάλληλα διαμορφωμένο χώρο (δεξαμενή χωρητικότητας 100 ml) που χωρίζεται από το υπόλοιπο τμήμα της συσκευής με μεταλλικό έλασμα. Κατάλληλος μηχανισμός επιτρέπει την ακαριαία ανύψωση του ελάσματος και την ελεύθερη ροή του δείγματος στο ευθύγραμμο τμήμα της συσκευής που έχει μήκος 24 cm και είναι βαθμονομημένο ανά 0,5 cm (Gould, 1971). Στο Σχήμα 4.9 απεικονίζεται σχηματικά η διαδικασία μέτρησης της συνεκτικότητας κατά Bostwick. Αρχικά το έλασμα τοποθετείται στην κλειστή θέση Βήμα 1 Βήμα 2 Βήμα 3 Βήμα 4 30 sec Βήμα 5 17 cm Σχήμα 4.9 Σχηματική απεικόνιση μέτρησης της συνεκτικότητας κατά Bostwick -110-

151 Αναλυτικές μέθοδοι (Βήμα 1). Με τη βοήθεια των ρυθμιστικών βιδών (βήμα 2) το όργανο ευθυγραμμίζεται πλήρως. Στη συνέχεια το δείγμα τοποθετείται στον ειδικά διαμορφωμένο χώρο (βήμα 3), το έλασμα ανυψώνεται ακαριαία, επιτρέποντας στο ρευστό να κινηθεί κατά μήκος του ευθύγραμμου τμήματος της συσκευής (βήμα 4). Μετά την παρέλευση χρόνου 30 sec διαβάζεται η διανυθείσα απόσταση πάνω στη βαθμονομημένη κλίμακα (βήμα 5). Κάθε δείγμα μετρήθηκε τρεις φορές σε σταθερή θερμοκρασία 20 C. Μετά από κάθε μέτρηση η συσκευή πλενόταν με νερό και στέγνωνε καλά πριν χρησιμοποιηθεί ξανά. Το στέγνωμα είναι απαραίτητο καθώς μια υγρή επιφάνεια μειώνει το συντελεστή τριβής του οργάνου, οδηγώντας σε λανθασμένες μετρήσεις, ενώ παράλληλα μπορεί να προκληθεί τοπική αραίωση του προϊόντος μεταβάλλοντας την περιεκτικότητά του σε διαλυτά στερεά (Verlent et al., 2006) Μέτρηση χρώματος Για τη μέτρηση του χρώματος χρησιμοποιήθηκε χρωματόμετρο HunterLab Colorflex (Σχήμα 4.10). Για τη βαθμονόμηση του οργάνου χρησιμοποιήθηκαν πρότυπες πλάκες BCR (άσπρη, μαύρη και κόκκινη). Το δείγμα τοποθετήθηκε σε Σχήμα 4.10 Χρωματόμετρο HunterLab Colorflex και συντεταγμένες L, a, b σε κλίμακα Hunter -111-

152 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι ειδικό γυάλινο δοχείο έως ότου γεμίσει. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε ώστε το δείγμα να μην περιέχει φυσαλίδες αέρα. Το δοχείο τοποθετήθηκε στην ειδική θέση στο χρωματόμετρο και καλύφθηκε με ειδικό σκουρόχρωμο κάλυμμα. Κάθε δείγμα μετρήθηκε τρεις φορές. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν στην κλίμακα Hunter L, a, b και καταγράφηκαν οι παράμετροι L, a, b και a/b του χρώματος. Οι τιμές a και b είναι οι ορθογώνιες συντεταγμένες του χρώματος πάνω στο επίπεδο διατομής του χρώματος, κάθετο στον άξονα μαύρου-λευκού. Μια θετική τιμή για το a υποδεικνύει κόκκινο χρώμα (redness), ενώ μια αρνητική τιμή πράσινο χρώμα (greeness). Μια θετική τιμή για το b υποδεικνύει κίτρινο χρώμα (yellowness), ενώ μια αρνητική τιμή μπλε χρώμα (blueness). To L εκφράζει τη φωτεινότητα (λαμπρότητα) του χρώματος Προσδιορισμός περιεκτικότητας σε λυκοπένιο Η περιεκτικότητα σε λυκοπένιο προσδιορίστηκε με υγρή χρωματογραφία HPLC σύμφωνα με τη μέθοδο των Sadler et al. (1990). Δείγμα χυμού τομάτας βάρους 1 g τοποθετήθηκε σε ποτήρι ζέσεως 250 ml, το οποίο ήταν καλυμμένο εξωτερικά με αλουμινόχαρτο, ώστε να αποκλεισθεί το ενδεχόμενο αποικοδόμησης του λυκοπενίου λόγω φωτο-οξείδωσης. Η ποσότητα του χυμού αναμίχθηκε με 100 ml μίγματος εξανίου-ακετόνης-αιθανόλης (50:25:25) και ακολούθησε μηχανική ανάδευση για 30 min. Έπειτα προστέθηκαν 15 ml απιονισμένου νερού και η ανάδευση συνεχίστηκε για ακόμη 10 min. Το μίγμα μεταφέρθηκε σε διαχωριστική χοάνη και αφέθηκε σε ηρεμία έως ότου γίνει ορατός ο σχηματισμός και διαχωρισμός δύο στοιβάδων, μιας πολικής (~65 ml) και μιας μη πολικής (~50 ml). Σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml τοποθετήθηκε η μη πολική πορτοκαλόχρωμη στοιβάδα υψηλής περιεκτικότητας σε λυκοπένιο. Το μίγμα στη συνέχεια φιλτραρίστηκε με φίλτρο διαμέτρου 0,02 μm (Chromafil PET-20/25, Macherey- Nagel, Germany). Ποσότητα 20 μl αναλύθηκε με τη μέθοδο HPLC. Για τη χρωματογραφική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε χρωματογραφικό σύστημα (HP Series 1100, Waldbronn, Germany) που αποτελείται από βαθμωτή αντλία τεσσάρων -112-

153 Αναλυτικές μέθοδοι καναλιών, απαερωτή κενού, βρόγχο όπου πραγματοποιείται η «ένεση» Rheodyne 20 µl injection loop και ανιχνευτή Diode-Array Detector. Το σύστημα ελέγχεται μέσω κατάλληλου λογισμικού HPChemStation. Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε, Hypersil ODS (250 4,6 mm), έχει μέγεθος σωματιδίων 5µm και ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα μεθανόλης-ακετονιτριλίου [90:10 (v/v)] με ρυθμό ροής 1,5 ml/min. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε στα 475 nm. Τα αποτελέσματα των χρωματογραφημάτων εκφράστηκαν σε mg ολικού λυκοπενίου ανά 100 mg of χυμού τομάτας, με βάση καμπύλη βαθμονόμησης, η οποία κατασκευάστηκε με πρότυπο διάλυμα λυκοπενίου 10% (FS, Roche Vitamines, France). Όλα τα δείγματα μετρήθηκαν δύο φορές Μέτρηση διαλυτών στερεών ( Brix) Ένας σημαντικός δείκτης ποιότητας των προϊόντων τομάτας αποτελούν τα ολικά στερεά. Ωστόσο, οι διαθέσιμες τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση των ολικών στερεών είναι αρκετά χρονοβόρες, με αποτέλεσμα να μην είναι εφικτό να πραγματοποιούνται κατά την παραγωγική διαδικασία προϊόντων τομάτας. Για το λόγο αυτό η εκτίμηση της ποιότητας των προϊόντων τομάτας γίνεται με μέτρηση των διαλυτών στερεών τους (ή βαθμοί Brix) (Gould, 1992). Για τη μέτρηση των διαλυτών στερεών των παραγόμενων χυμών χρησιμοποιήθηκε διαθλασίμετρο χειρός (Σχήμα 4.11) (Atago Hand Refractometer N-1a, Atago CO. LTD, Tokyo, Japan). Τα δείγματα βρίσκονταν σε σταθερή θερμοκρασία 20 C. Σχήμα 4.11 Διαθλασίμετρο χειρός -113-

154 Κεφάλαιο 4-Υλικά και μέθοδοι 4.5 Ανάλυση δεδομένων Με βάση τα πειραματικά δεδομένα της κινητικής απενεργοποίησης των ενζύμων και με χρήση κατάλληλων μαθηματικών εξισώσεων, προσδιορίστηκε η τάξη της αντίδρασης απενεργοποίησης των PME και PG. Οι σταθερές των ρυθμών απενεργοποίησης των ενζύμων προσδιορίστηκαν με μη γραμμική παλινδρόμηση (Sigma Plot 8.02, Richmond, California, USA). Για την περιγραφή της επίδρασης της συνδυασμένης εφαρμογής πίεσης και θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση των ενζύμων PME και PG αναπτύχθηκαν κατάλληλα μαθηματικά μοντέλα. Ο προσδιορισμός των σταθερών των εξισώσεων που χρησιμοποιήθηκαν πραγματοποιήθηκε με μη γραμμική παλινδρόμηση (SYSTAT 10.2, Systat Software Inc. Chicago Ill. USA). Η δυνατότητα περιγραφής των πειραματικών δεδομένων από τα κινητικά μοντέλα που αναπτύχθηκαν εκτιμήθηκε με στατιστικές παραμέτρους όπως ο συντελεστής συσχέτισης R 2 και με τη σύγκριση των πειραματικών και προβλεπόμενων από τα αντίστοιχα μοντέλα τιμών

155 Κεφάλαιο 5 Αποτελέσματα και Σχολιασμός Σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό, ο οποίος αναλύθηκε στο προηγούμενο κεφάλαιο, οι ποικιλίες τομάτας οι οποίες μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή ήταν η τομάτα Σαντορίνης (Cherrelino) και τα υβρίδια βιομηχανικής χρήσης Oval Red και Red Sea. Για κάθε μία από τις ποικιλίες-υβρίδια αυτά πραγματοποιήθηκαν πειράματα κινητικής μελέτης της επίδρασης των συνθηκών θερμικής επεξεργασίας και επεξεργασίας με ΥΥΠ στην απενεργοποίηση των ενζύμων PME και PG. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ως πρώτη ύλη τομάτες υβριδίου Red Sea παρήχθει ελαφρώς συμπυκνωμένος χυμός τομάτας, επεξεργασμένος τόσο με θερμική επεξεργασία όσο και με ΥΥΠ. Στο κεφάλαιο αυτό παρατίθενται τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων με ταυτόχρονο σχολιασμό τους. Η σειρά με την οποία επιλέχθηκε να παρουσιαστούν τα αποτελέσματα της διατριβής είναι ανά κατηγορία τομάτας, επιτραπέζια και βιομηχανική, προσφέροντας τη δυνατότητα αυτόνομης και ολοκληρωμένης μελέτης για κάθε μία από αυτές. 5.1 Μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας με ΥΥΠ στα ένζυμα και ποιοτικά χαρακτηριστικά χυμού επιτραπέζιας τομάτας Στην πρώτη φάση της πειραματικής διαδικασίας της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας με ΥΥΠ στα ένζυμα, PME και PG, και στα ποιoτικά χαρακτηριστικά χυμού επιτραπέζιας τομάτας, ποικιλίας Cherrelino. Στη συνέχεια παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της κινητικής μελέτης απενεργοποίησης των ενζύμων καθώς και η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο ιξώδες, το χρώμα και την περιεκτικότητα σε λυκοπένιο του χυμού

156 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στα ένζυμα χυμού τομάτας Σαντορίνης Η απενεργοποίηση της PME και PG προερχόμενης από τομάτα Σαντορίνης, ποικιλίας Cherrelino, ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης σε όλες τις συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας επεξεργασίας που μελετήθηκαν, η οποία περιγράφηκε από την Εξίσωση (5.1). k t A = A o e (5.1) όπου, Α (U/mL) η ενεργότητα του ενζύμου μετά από επεξεργασία για χρόνο t, A o (U/mL) η ενεργότητα του ενζύμου στο χρόνο μηδέν της επεξεργασίας (t = 0), t (min) ο χρόνος επεξεργασίας και k (min -1 ) η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης Κινητική απενεργοποίησης της PME ποικιλίας Cherrelino Στο Σχήμα 5.1 απεικονίζεται η μείωση της ενεργότητας της PME συναρτήσει του χρόνου κατά τη θερμική επεξεργασία στους 40, 50, 60, 65 και 80 C. 1,0 0,8 A/Ao 0,6 0,4 0,2 40 C 50 C 60 C 65 C 80 C 0, Χρόνος (min) Σχήμα 5.1 Απενεργοποίηση της PME ποικιλίας Cherrelino κατά την επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση και διάφορες ισοθερμοκρασιακές συνθήκες ( ) 40 C, ( ) 50 C, ( ) 60 C, ( ) 65 C και ( ) 80 C. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της Εξίσωσης 5.1 σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση μεταξύ των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου -116-

157 Επεξεργασία επιτραπέζιας τομάτας Παρατηρούμε ότι κατά την επεξεργασία στους 40 C δεν παρατηρήθηκε μείωση στην ενεργότητα της PME, ενώ αύξηση της θερμοκρασίας οδήγησε σε αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης. Οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης κατά την επεξεργασία της PME στις διάφορες θερμοκρασίες, όπως υπολογίστηκαν με προσαρμογή της εξίσωσης 5.1 στα πειραματικά δεδομένα παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.1. Πίνακας 5.1 Κινητικές παράμετροι απενεργοποίησης της PME κατά τη θερμική επεξεργασία χυμού ποικιλίας Cherrelino Τ ( C) k (min -1 ) R ,0001± 0,0004 0, ,0037 ± 0,0012 0, ,0361 ± 0,0040 0, ,152 ± 0,0178 0, ,301 ± 0,0479 0,978 Η εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από τη θερμοκρασία εκφράστηκε, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.2, μέσω της σχέσης Arrhenius (Εξ. 5.2): k T = k Tref e E a 1 1 R T Tref (5.2) Όπου k T (min -1 ) η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης σε θερμοκρασία Τ ( C), k T ref (min -1 ) η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης σε θερμοκρασία αναφοράς, Τ ref (343,16 Κ, 70 C), E a (J/mol) η ενέργεια ενεργοποίησης και R (8,314 J/mol K) η παγκόσμια σταθερά των αερίων. Η ενέργεια ενεργοποίησης, E a, υπολογίστηκε ίση με 244 ± 11,6 kj/mol και η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης k Tref, σε θερμοκρασία αναφοράς 343,16 Κ προσδιορίστηκε ίση με 0,544 min -1 (R 2 =0,996). Για τον προσδιορισμό της ενέργειας ενεργοποίησης δε χρησιμοποιήθηκαν τα δεδομένα των 80 C λόγω απόκλισης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.2, από το μοντέλο του Arrhenius

158 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός lnk ,0002-0,0001 0,0000 0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 1/T-1/Tref Σχήμα 5.2 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού θερμικής απενεργοποίησης της PME ποικιλίας Cherrelino από τη θερμοκρασία επεξεργασίας (T ref =343,16 Κ) Η απενεργοποίηση της PME στους 40 και 60 C συναρτήσει της εφαρμοζόμενης πίεσης και του χρόνου επεξεργασίας απεικονίζεται στο Σχήμα 5.3. Τα σύμβολα αντιστοιχούν στα πειραματικά δεδομένα, ενώ οι καμπύλες αντιπροσωπεύουν την προσαρμογή της Εξίσωσης 5.1 σε αυτά. 1,0 (α) 1,0 (β) 0,8 0,8 A/A0 100 MPa 0,6 600 MPa 700 MPa 0,4 800 MPa 100 MPa 600 MPa 0,2 700 MPa 800 MPa 0, A/A0 0,6 100 MPa 600 MPa 700 MPa 0,4 800 MPa 100 MPa 0,2 600 MPa 700 MPa 800 MPa 0, Χρόνος (min) Χρόνος (min) Σχήμα 5.3 Απενεργοποίηση της PME ποικιλίας Cherrelino κατά την επεξεργασία σε σταθερή θερμοκρασία (α) 40 C και (β) 60 C και διάφορες ισοβαρείς συνθήκες -118-

159 Επεξεργασία επιτραπέζιας τομάτας Παρατηρούμε ότι η PME εμφανίστηκε ιδιαίτερα ανθεκτική στην εφαρμογή πίεσης. Όπως φαίνεται και στο Σχήμα 5.3 επεξεργασία στα 800 MPa και 60 C για 15 min δεν επέφερε σημαντική μεταβολή στην ενεργότητα του ενζύμου. Κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ σε πιέσεις MPa και υψηλή θερμοκρασία 60 C, παρουσιάστηκαν μικρότεροι ρυθμοί απενεργοποίησης του ενζύμου σε σχέση με τη θερμική επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση (0,1 MPa) (Σχήμα 5.4). Η συμπεριφορά αυτή υποδηλώνει ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση της PME. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί και από άλλους ερευνητές (Crelier et al. 2001; Van den Broeck et al. 2001; Stoforos et al., 2002), οι οποίοι κάνουν λόγο για περισσότερο ευαίσθητα ένζυμα (μεγαλύτερους ρυθμούς απενεργοποίησης), πιθανόν λόγω της διαφορετικής ποικιλίας τομάτας που χρησιμοποιήθηκε. Σύμφωνα με τα βιβλιογραφικά δεδομένα, 1,0 A/Ao 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Χρόνος (min) 0.1 MPa 100 MPa 600 MPa 700 MPa 800 MPa 0.1 MPa 100 MPa 600 MPa 700 MPa 800 MPa Σχήμα 5.4 Απενεργοποίηση της PME ποικιλίας Cherrelino κατά την επεξεργασία στους 60 C και διάφορες ισοβαρείς συνθήκες (0,1-800 MPa). Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της εξίσωσης 5.1 σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου -119-

160 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός η διαφορετική επίδραση των χαμηλών πιέσεων στη δραστικότητα των ενζύμων μπορεί να οφείλεται στον ιδιαίτερο τρόπο με τον οποίο διαμορφώνονται οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις υπό πίεση. Σύμφωνα με τους Mozhaev et al. (1996) κατά το αρχικό στάδιο της θερμικής μετουσίωσης, οι πρωτεΐνες χάνουν μόρια νερού τα οποία είναι σημαντικά δομικά στοιχεία. Ωστόσο η πίεση ενισχύει την ενυδάτωση τόσο των πολικών όσο και των μη πολικών ομάδων, της πρωτεΐνης (Weale, 1967; Morild, 1981) εμποδίζοντας το αρχικό στάδιο της θερμικής μετουσίωσης πρωτεϊνών και ενζύμων. Αντίθετα, σε υψηλότερες πιέσεις οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις συνοδεύονται από μείωση του όγκου, με αποτέλεσμα η πίεση να ευνοεί τις αλληλεπιδράσεις που προκαλούν μετουσίωση της πρωτεΐνης. Συνεπώς ο βαθμός μετουσίωσης μιας πρωτεΐνης σε δεδομένη πίεση καθορίζεται σε μεγάλο ποσοστό από το επίπεδο υδροφοβικότητάς της (Farkas & Hoover, 2001). Για την περιγραφή αυτής της συμπεριφοράς χρησιμοποιήθηκε το μαθηματικό μοντέλο που περιγράφηκε από τους Stoforos et al. (2002), σύμφωνα με το οποίο η απενεργοποίηση του ενζύμου διέπεται από δύο παράλληλους μηχανισμούς, ο καθένας από τους οποίους ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης, με τον έναν να ευνοείται από την πίεση και τον άλλο από τη θερμοκρασία. Σύμφωνα με τους Stoforos et al. (2002) η Εξίσωση 5.3 μπορεί να περιγράψει την ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση της PME. ( P P ) E a 1 1 V 1 a 1 ref k ref exp t 1 R T Tref R T = exp E V ( P P ) (5.3) 0 a a 2 ref k ref exp t 2 R T Tref R T A A Όπου kref είναι η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης σε πίεση και θερμοκρασία αναφοράς, P ref και Tref αντίστοιχα, Ε a και V a είναι η ενέργεια και ο όγκος ενεργοποίησης, αντίστοιχα. Οι δείκτες 1 και 2 υποδηλώνουν τους δύο μηχανισμούς απενεργοποίησης. Χρησιμοποιώντας τα πειραματικά δεδομένα ενζυμικής ενεργότητας της PME μετά από επεξεργασία σε πιέσεις 0,1-800 MPa και θερμοκρασίες C, -120-

161 Επεξεργασία επιτραπέζιας τομάτας προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι της Εξίσωσης (5.3) μέσω μη γραμμικής παλινδρόμησης. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα 5.2. Πίνακας 5.2 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.3) για την απενεργοποίηση της PME ποικιλίας Cherrelino σε συνθήκες πίεσης 0,1 800 MPa και θερμοκρασίας C για Τ ref =343,16 K (70 C) και P ref =300 MPa, (R 2 =0,870) Παράμετρος Τιμή 95 % Διάστημα εμπιστοσύνης Κατώτερο όριο Ανώτερο όριο k ref 1 (min -1 ) 2,87x10-4 1,51x10-4 8,12x10-4 E a 1 (kj/mol) -22,883-62,198 17,207 V a 1 (ml/mol) -12,796-28,024-0,208 k ref 2 (min -1 ) 3,10x10-5 1,10x10-5 5,30x10-5 E a 2 (kj/mol) 153,9 142, ,714 V a 2 (ml/mol) 83,581 53, ,672 Η συσχέτιση των πειραματικών τιμών της εναπομένουσας ενεργότητας της PME με τις προβλεπόμενες από την Εξίσωση (5.3) τιμές υπήρξε σχετικά καλή (R 2 =0,870). Συνδυάζοντας και συγκρίνοντας τις Εξισώσεις (5.1) και (5.3), προκύπτει Εξίσωση (5.4), η οποία περιγράφει την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από την πίεση και τη θερμοκρασία επεξεργασίας: k = k + k ref 2 ref1 Ea1 exp R Ea2 exp R 1 1 T Tref Va 1 R 1 1 Va 2 T Tref R ( P P ) ( P P ) T T ref ref + (5.4) Χρησιμοποιώντας στην Εξίσωση (5.4) τις τιμές των παραμέτρων που παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.2, προσδιορίστηκαν οι τιμές της σταθεράς του -121-

162 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός ρυθμού απενεργοποίησης της PME ποικιλίας Cherrelino σε διάφορες ισοθερμοκρασιακές συνθήκες (40-80 C) για πιέσεις 0,1 έως 800 MPa. Έτσι κατασκευάστηκε το Σχήμα 5.5, όπου παρουσιάζεται η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PME ποικιλίας Cherrelino συναρτήσει της πίεσης επεξεργασίας για διάφορες ισοθερμοκρασιακές συνθήκες. Παρατηρούμε ότι με αύξηση της πίεσης από 0,1 MPa στα 100 MPa η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης μειώθηκε. Σε πιέσεις μεταξύ 100 και 600 MPa παρουσίασε ελάχιστη τιμή και στη συνέχεια άρχισε να αυξάνεται. Η ίδια συμπεριφορά παρατηρήθηκε για όλες τις θερμοκρασίες επεξεργασίας. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί και από τους Crelier et al. (2001), σύμφωνα με τους οποίους κατά την επεξεργασία χυμού τομάτας ποικιλίας ΝΕΜΑ 1401 σε θερμοκρασίες C, ο ρυθμός απενεργοποίησης της PME μειώθηκε με αύξηση της πίεσης από την ατμοσφαιρική (0,1 MPa) στα 100 MPa, παρουσίασε ελάχιστο μεταξύ 300 και 600 MPa και στη συνέχεια άρχισε να αυξάνεται. 0,06 0,05 0,04 40 C 60 C 65 C 80 C k (min -1 ) 0,03 0,02 0,01 0, P (MPa) Σχήμα 5.5 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME ποικιλίας Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας, όπως προσδιορίστηκε από την Εξίσωση (5.3) -122-

163 Επεξεργασία επιτραπέζιας τομάτας Κινητική απενεργοποίησης της PG ποικιλίας Cherrelino Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο , για τη μέτρηση της ενεργότητας της PG ποικιλίας Cherrelino χρησιμοποιήθηκε μια μέθοδος η οποία βασίστηκε στη μείωση του ιξώδους διαλύματος πηκτίνης που προκλήθηκε λόγω αποικοδόμησής της από τη δράση της PG. Στη συνέχεια ακολουθεί ανάπτυξη της μεθοδολογίας που ακολουθήθηκε για τον προσδιορισμό της ενεργότητας της PG. Η μείωση του ιξώδους μίγματος πηκτίνης-ενζύμου σε συνάρτηση με το χρόνο μέτρησης, που αντιστοιχεί και στο χρόνο δράσης του ενζύμου, παρουσιάζεται στο Σχήμα 5.6α, για δείγματα με απενεργοποιημένο ή όχι ένζυμο. Η ανεπεξέργαστη PG που αναφέρεται στη λεζάντα του σχήματος αντιστοιχεί σε ανεπεξέργαστο χυμό τομάτας, ο οποίος περιέχει όλη την ποσότητα του ενζύμου. Αντίστοιχα, η απενεργοποιημένη PG προέκυψε μετά από βρασμό δείγματος χυμού τομάτας για 20 min. Για τον καλύτερο συσχετισμό της ενεργότητας της PG με τη μείωση του ιξώδους χρησιμοποιήθηκε η κανονικοποιημένη μορφή του ιξώδους, δηλαδή ο λόγος n / n o (Σχήμα 5.6β), όπου n είναι το ιξώδες του μίγματος πηκτίνης-ενζύμου σε κάθε χρόνο μέτρησης και μέτρησης. no είναι το αρχικό ιξώδες του μίγματος, κατά την έναρξη της (α) 1,0 (β) 30 0,8 Ιξώδες (mpa.s) Ανεπεξέργαστη PG Απενεργοποιημένη PG η/η ο 0,6 0,4 Ανεπεξέργαστη PG Απενεργοποιημένη PG , Χρόνος μέτρησης (s) 0, Χρόνος μέτρησης (s) ) μίγματος πηκτίνης- Σχήμα 5.6 (α) Ιξώδες και (β) κανονικοποιημένο ιξώδες ( n / ενζύμου συναρτήσει του χρόνου μέτρησης no -123-

164 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Η εξάρτηση του λόγου από μια εξίσωση δύο εκθετικών όρων της μορφής: n / no συναρτήσει του χρόνου μέτρησης περιγράφηκε n n o b t d t = a e + c e (5.5) Το εμβαδό που περικλείεται κάτω από την καμπύλη μείωσης του κανονικοποιημένου ιξώδους συναρτήσει του χρόνου μέτρησης συσχετίστηκε με την ενεργότητα του ενζύμου. Με την αναλυτική ολοκλήρωση της Εξίσωσης 5.5 υπολογιζόταν κάθε φορά το εμβαδό που περικλείεται κάτω από τη καμπύλη μείωσης του ιξώδους συναρτήσει του χρόνου μέτρησης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.7, για κάθε συνθήκη επεξεργασίας (R 2 >0,994). Το υπολογιζόμενο κάθε φορά εμβαδό συσχετιζόταν με την ενεργότητα του ενζύμου. Σύμφωνα με την υπάρχουσα βιβλιογραφία (Lopez et al., 1994) η μείωση του ιξώδους συναρτήσει του χρόνου μέτρησης περιγράφηκε από μια εκθετική εξίσωση με έναν όρο, και η ενεργότητα του ενζύμου συσχετιζόταν με τον αρχικό ρυθμό μείωσης του ιξώδους. Μια τέτοια προσέγγιση για τα δεδομένα της παρούσας διατριβής δεν έδωσε ικανοποιητικά 1,0 Απενεργοποιημένη PG Ανεπεξέργαστη PG 0,8 η/η ο 0,6 0,4 0,2 0, Χρόνος μέτρησης (s) Σχήμα 5.7 Επιφάνεια που περικλείεται κάτω από τη καμπύλη μείωση του ιξώδους συναρτήσει του χρόνου μέτρησης -124-

165 Επεξεργασία επιτραπέζιας τομάτας αποτελέσματα (0,803<R 2 <0,994). Για το λόγο αυτό επιλέχθηκε η ενεργότητα του ενζύμου να συσχετιστεί με το εμβαδό της καμπύλης μείωσης του ιξώδους με το χρόνο μέτρησης. Για τη συσχέτιση της ενεργότητας του ενζύμου με το εμβαδό χρησιμοποιήθηκε καμπύλη βαθμονόμησης, η οποία κατασκευάστηκε με δείγματα εμπορικής PG γνωστής ενεργότητας ενζύμου και παρουσιάζεται στο Σχήμα 5.8. Για την κατασκευή της καμπύλης αυτής ακολουθήθηκε η διαδικασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η εξάρτηση της ενεργότητας του ενζύμου από την επιφάνεια που εκτείνεται κάτω από τη καμπύλη μείωσης του ιξώδους συναρτήσει του χρόνου μέτρησης, περιγράφηκε από μια εξίσωση της μορφής: Area = 2.11 A e (5.6) όπου, Area είναι το εμβαδό της επιφάνειας κάτω από τη καμπύλη μείωσης του ιξώδους με το χρόνο μέτρησης και A η ενεργότητα του ενζύμου (U/mL) (R 2 =0,999). Από τα δεδομένα μείωσης του ιξώδους και χρησιμοποιώντας την Εξίσωση Area ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 A (U/mL) Σχήμα 5.8 Καμπύλη βαθμονόμησης με εμπορική PG (σε άξονες, ενεργότητα ενζύμου, Α (U/mL) και εμβαδό επιφάνειας (Area) κάτω από την καμπύλη μείωσης του ιξώδους με το χρόνο μέτρησης, R 2 =0,998) -125-

166 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός υπολογιζόταν κάθε φορά η ενεργότητα της PG ποικιλίας Cherrelino. Στη συνέχεια παρατίθενται τα αποτελέσματα της κινητικής μελέτης απενεργοποίησης του ενζύμου. Όπως προαναφέρθηκε η απενεργοποίηση της PG τομάτας Σαντορίνης ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης σε όλες τις συνθήκες επεξεργασίας. Στο Σχήμα 5.9 απεικονίζεται η απενεργοποίηση του ενζύμου κατά τη θερμική επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση. Τα σημεία αντιστοιχούν στα πειραματικά δεδομένα, ενώ οι καμπύλες αντιπροσωπεύουν την προσαρμογή της Εξίσωσης 5.1 σε αυτά. Το ένζυμο παρουσιάστηκε ιδιαίτερα ευαίσθητο κατά τη θερμική επεξεργασία καθώς μόλις 8 min επεξεργασίας σε θερμοκρασία 65 C οδήγησαν σε σχεδόν πλήρη απενεργοποίησή του (ποσοστό απενεργοποίησης περίπου 97%). Παρατηρούμε ότι κατά την επεξεργασία στους 40 C δεν παρατηρήθηκε απενεργοποίηση του ενζύμου. 1,2 1,0 0,8 A/Ao 0,6 0,4 0,2 40 C 60 C 65 C 80 C 0, Χρόνος (min) Σχήμα 5.9 Απενεργοποίηση της PG ποικιλίας Cherrelino κατά την επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση και διάφορες ισοθερμοκρασιακές συνθήκες ( ) 40 C, ( ) 60 C, ( ) 65 C και ( ) 80 C. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της Εξίσωσης 5.1 σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου -126-

167 Επεξεργασία επιτραπέζιας τομάτας Αντιθέτως, παρατηρήθηκε μικρή αύξηση της ενεργότητας της PG σε σχέση με τον ανεπεξέργαστο χυμό. Επιπλέον, αύξηση της θερμοκρασίας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίσης της PG. Στον Πίνακα 5.3 παρατίθενται οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης, όπως υπολογίστηκαν μέσω της Εξίσωσης 5.1, για κάθε θερμοκρασία επεξεργασίας. Πίνακας 5.3 Σταθερά ρυθμού απενεργοποίησης της PG ποικιλίας Cherrelino κατά τη θερμική επεξεργασία Τ ( C) k (min -1 ) R ,0335 ± 0,0130 0, ,297 ± 0,154 0, ,16 ± 0,0223 0,999 Η εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από τη θερμοκρασία εκφράστηκε μέσω της ενέργειας ενεργοποίησης, Ε a. Συνδυάζοντας τις Εξισώσεις 5.1 και 5.2, προέκυψε η Εξίσωση 5.7, η οποία περιγράφει τη μείωση της ενεργότητας του ενζύμου συναρτήσει του χρόνου και της θερμοκρασίας επεξεργασίας. A A o E a 1 1 = c exp k T exp t (5.7) ref R T Tref όπου, c σταθερά, η οποία εισήχθει στην εξίσωση για να απορροφήσει τυχόν πειραματικά σφάλματα προσδιορισμού των τιμών Α ο. Με προσαρμογή της εξίσωσης 5.7 στα πειραματικά δεδομένα και μη γραμμική παλινδρόμηση προσδιορίστηκαν οι τιμές των παραμέτρων της. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα 5.4. Σε αντίθεση με την PME, η PG εμφανίστηκε περισσότερο ευαίσθητη στην επεξεργασία με ΥΥΠ. Στο Σχήμα 5.10 απεικονίζεται η απενεργοποίηση της PG στους 40, 60 και 80 C συναρτήσει του χρόνου και της πίεσης επεξεργασίας

168 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Πίνακας 5.4 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.7) για τη θερμική απενεργοποίηση της PG ποικιλίας Cherrelino για Τ ref =343,16 K (70 C) (R 2 =0,922) Παράμετρος Τιμή 95 % Διάστημα εμπιστοσύνης Κατώτερο όριο Ανώτερο όριο c 1,04 0,945 1,14 k T ref (min -1 ) 2,04-0,279 4,36 E a (kj/mol) A/Ao 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Χρόνος (min) 1,0 (α) 100 MPa 200 MPa 400 MPa 100 MPa 200 MPa 400 MPa A/Ao 1,0 0,8 0,6 100 MPa 0,4 200 MPa 300 MPa 0,2 100 MPa 200 MPa 300 MPa 0, (γ) Χρόνος (min) (β) A/A O 0,8 0,6 0,4 0.1 MPa 100 MPa 200 MPa 0.1 MPa 100 MPa 200 MPa 0,2 0, Χρόνος (min) Σχήμα 5.10 Απενεργοποίηση της PG ποικιλίας Cherrelino κατά την επεξεργασία σε θερμοκρασία (α) 40 C, (β) 60 C και (γ) 80 C και διάφορες ισοβαρείς συνθήκες (0,1-400 MPa) -128-

169 Επεξεργασία επιτραπέζιας τομάτας Στο Σχήμα 5.10(α) φαίνεται ότι κατά την επεξεργασία της PG σε πίεση 100 MPa και θερμοκρασία 40 C παρατηρήθηκε μικρή αύξηση της ενεργότητας του ενζύμου σε σχέση με τον ανεπεξέργαστο χυμό. Αύξηση της ενεργότητας μετά από επεξεργασία με υπερυψηλή πίεση έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία και για άλλα ένζυμα. Οι Van de Broeck et al. (2000) παρατήρησαν αύξηση της ενεργότητας της PME τομάτας κατά 26% μετά από επεξεργασία στους 60 C και 100 MPa. Αυτή την αύξηση την απέδωσαν σε δομικές αλλαγές του ενζύμου που συμβαίνουν κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ. Επίσης ο Cano και οι συνεργάτες του (1997) ανέφεραν ενεργοποίηση της πολυφαινολικής οξειδάσης, περοξειδάσης και πηκτινομεθυλεστεράσης μετά από επεξεργασία σε πιέσεις MPa και θερμοκρασία περιβάλλοντος. Περαιτέρω αύξηση της πίεσης στα 200 και 400 MPa είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης της PG (Σχήμα 5.10α). Επιπλέον, αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης παρατηρήθηκε με αύξηση της πίεσης σε θερμοκρασία επεξεργασίας 60 C (Σχήμα 5.10β). Ωστόσο, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.10(γ), στις χαμηλές πιέσεις MPa και υψηλή θερμοκρασία 80 C, η αύξηση της πίεσης είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης σε σχέση με την αντίστοιχη τιμή που εμφάνισε σε ατμοσφαιρική πίεση. Η συμπεριφορά αυτή υποδηλώνει μια ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση του ενζύμου. Ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση της PG τομάτας έχει αναφερθεί και από τους Fachin et al. (2003), οι οποίοι παρατήρησαν ότι σε χαμηλές πιέσεις MPa και υψηλή θερμοκρασία (55 C) αύξηση της πίεσης οδήγησε σε μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης PG προερχόμενης από τομάτα ποικιλίας Flandria Prince. Κατά την επεξεργασία σε πιέσεις μεγαλύτερες των 400 MPa επιτεύχθηκε πλήρης απενεργοποίηση της PG από το χρόνο μηδέν της διεργασίας (χρόνος επίτευξης της πίεσης διεργασίας), σε όλα τα επίπεδα θερμοκρασιών που μελετήθηκαν. Με βάση τις Εξισώσεις 5.1 και 5.2 και λαμβάνοντας υπόψη την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από τον όγκο απενεργοποίησης και γραμμική εξάρτηση της ενέργειας ενεργοποίησης από την πίεση, η μείωση της -129-

170 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός ενεργότητας της PG ως συνάρτηση της πίεσης, της θερμοκρασίας και του χρόνου επεξεργασίας περιγράφηκε ικανοποιητικά από την Εξίσωση 5.8. A A o Va ( P Pref ) Ea + d ( P Pref ) o 1 1 = c exp kt exp( ) exp( ( )) t (5.8) ref RT R T Tref όπου Τ ref =343,16 K, P ref =300 MPa. Χρησιμοποιώντας το σύνολο των πειραματικών δεδομένων τόσο σε στμοσφαιρική πίεση όσο και σε συνθήκες ΥΥΠ, προσδιορίστηκαν οι τιμές των παραμέτρων της Εξίσωσης 5.8 με μη γραμμική παλινδρόμηση. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.5. Στη συνέχεια συνδυάζοντας τις Εξισώσεις 5.1 και 5.8 προέκυψε η Εξίσωση 5.9, η οποία περιγράφει την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από την πίεση και τη θερμοκρασία επεξεργασίας: Va ( P Pref ) Ea + d ( P Pref ) o 1 1 k = kt exp( ) exp( ( )) (5.9) ref RT R T T ref Χρησιμοποιώντας τις τιμές του Πίνακα 5.5 και με χρήση της Εξίσωσης 5.9 υπολογίστηκαν οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησηςτης PG. Πίνακας 5.5 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.8) για την απενεργοποίηση της PG χυμού τομάτας ποικιλίας Cherrelino σε συνθήκες πίεσης 0,1 600 MPa και θερμοκρασία C για Τ ref =343,16 K (70 C) και P ref =300 MPa (R 2 =0,870) Παράμετρος Τιμή 95 % Διάστημα εμπιστοσύνης Κατώτερο όριο Ανώτερο όριο c 0,957 0,896 1,02 k T ref (min -1 ) 4,66-0,508 9,83 E a o (kj/mol) d (ml/mol) -2,82-3,53-2,12 V a (ml/mol) 29,3 16,0 42,5-130-

171 Επεξεργασία επιτραπέζιας τομάτας Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.11 αύξηση της πίεσης και της θερμοκρασίας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης σε όλες τις συνθήκες επεξεργασίας. 0,20 0,15 40 C 50 C 60 C k (min -1 ) 0,10 0,05 0, P (MPa) Σχήμα 5.11 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG ποικιλίας Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας, όπως προσδιορίστηκε από την Εξίσωση (5.9) και τις τιμές του Πίνακα Επίδραση των συνθηκών επεξεργασία στην ποιότητα χυμού τομάτας Σαντορίνης Σε συνέχεια της κινητικής μελέτης απενεργοποίησης των ενζύμων και με βάση τα μοντέλα που αναπτύχθηκαν για κάθε ένζυμο, επιλέχθηκαν συνθήκες επεξεργασίας τέτοιες ώστε να επιτευχθεί επιλεκτική απενεργοποίηση της PG με ταυτόχρονη διατήρηση της PME. Ο χυμός τομάτας Σαντορίνης επεξεργάστηκε σε διάφορους συνδυασμούς πίεσης, θερμοκρασίας και χρόνου (0,1 MPa και 80 C για 10 min, 400 MPa και 40 C για 5 min, 400 MPa και 80 C για 1 min, 800 MPa και 80 C για 1 min) και μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας σε ποιοτικά και διατροφικά χαρακτηριστικά του χυμού, τα οποία συγκρίθηκαν με τον -131-

172 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός ανεπεξέργαστο χυμό. Οι παράμετροι που εξετάστηκαν ήταν το χρώμα, το ιξώδες και η περιεκτικότητα σε λυκοπένιο του χυμού. Στον Πίνακα 5.6 παρουσιάζεται η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο χρώμα και την περιεκτικότητα σε λυκοπένιο. Παρατηρούμε ότι το χρώμα του χυμού επηρεάστηκε ελάχιστα από τις συνθήκες επεξεργασίας σε σχέση με τον ανεπεξέργαστο χυμό. Μετά τη θερμική επεξεργασία παρατηρήθηκε μικρή υποβάθμιση του κόκκινου χρώματος (παράμετρος a) του χυμού. Αντιθέτως, κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ η παράμετρος του κόκκινου χρώματος παρουσίασε μικρή αύξηση. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 5.6 η μέση περιεκτικότητα σε λυκοπένιο του ανεπεξέργαστου χυμού υπολογίστηκε ίση με 9 mg/100 g. Η τιμή αυτή είναι αρκετά μεγαλύτερη σε σχέση με τη μέση τιμή που αναφέρεται στη βιβλιογραφία για τομάτες άλλων ποικιλιών (4,7 mg/100 g) (Shi & Le Maguer, 2000; Belitz, 2006). Σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα παρατηρήθηκε μικρή αύξηση της περιεκτικότητας σε λυκοπένιο του χυμού μετά από κάθε συνθήκη επεξεργασίας. Πίνακας 5.6 Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο χρώμα και την περιεκτικότητα σε λυκοπένιο του χυμού τομάτας Σαντορίνης Συνθήκη επεξεργασίας Λυκοπένιο Χρώμα (mg/100 g) L a b Ανεπεξέργαστος χυμός 9,0 ± 0,05 36,6±0,29 16,2±0,63 13,5±0,39 0,1 MPa 80 C για 10 min 9,5 ± 0,35 36,4±0,17 15,7±0,36 14,6±0, MPa 40 C για 5 min 9,3 ± 0,05 37,4±0,31 16,0±0,91 14,4±0, MPa 80 C για 1 min 9,9 ± 0,08 37,3±0,11 16,7±0,10 14,3±0, MPa 80 C για 1 min 9,6 ± ,7±0,25 16,7±0,42 14,1±0,41 Μια ακόμη παράμετρος που μελετήθηκε ήταν το ιξώδες του χυμού. Μετά την επεξεργασία του χυμού στις προαναφερόμενες συνθήκες, ακολούθησε μέτρηση του ιξώδους του. Το ιξώδες μετρήθηκε τόσο αμέσως μετά την επεξεργασία (t=0) όσο και μετά από χρόνο 90 min. Στη δεύτερη περίπτωση, μετά από τη μέτρηση του ιξώδους -132-

173 Επεξεργασία επιτραπέζιας τομάτας σε χρόνο t=0, τα δείγματα παρέμειναν στο ιξωδόμετρο για 90 min σε θερμοκρασία 35 C. Αυτός ο χρόνος παραμονής επέτρεψε τη δράση των ενζύμων πάνω στο πηκτινικό υπόστρωμα του χυμού. Στο Σχήμα 5.12 απεικονίζεται η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο φαινόμενο ιξώδες των δειγμάτων, τόσο μετά την επεξεργασία όσο και μετά από 90 min ενζυμικής δράσης. Παρατηρούμε ότι μεταξύ των συνθηκών επεξεργασίας που μελετήθηκαν, επεξεργασία σε πίεση 400 MPa και θερμοκρασία 80 C, είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή χυμού τομάτας μεγαλύτερου ιξώδους. Αξίζει να σημειωθεί το γεγονός ότι μετά από 90 min ενζυμικής δράσης το ιξώδες του χυμού μειώθηκε και στις τρεις διαφορετικές συνθήκες επεξεργασίας. Τα αποτελέσματα του ιξώδους συσχετίστηκαν με την εναπομένουσα ενεργότητα των ενζύμων PME και PG του χυμού. Στον Πίνακα 5.7 φαίνονται τα μετρηθέντα ποσοστά εναπομένουσας δραστικότητας των ενζύμων μετά από κάθε συνθήκη επεξεργασίας. Παρατηρούμε ότι με την ΥΥΠ επιτεύχθηκε επιλεκτική απενεργοποίηση της PG με παράλληλη ολική ή μερική διατήρηση της ενεργότητας της PME. Βέλτιστο προϊόν, σε όρους ιξώδους, οδήγησε η επεξεργασία που επέτρεψε την πλήρη απενεργοποίηση της PG με ταυτόχρονη διατήρηση υψηλής ενεργότητας της PME. 0,4 (α) 0,4 (β) Φαινόμενο ιξώδες (Pa.s) 0,3 0,2 0,1 400 MPa 40 C 5 min 400 MPa 80 C 1 min 800 MPa 80 C 1 min Φαινόμενο ιξώδες (Pa.s) 0,3 0,2 0,1 400 MPa 40 C 5 min 400 MPa 80 C 1 min 800 MPa 80 C 1 min 0, Ρυθμός διατμησης (s -1 ) 0, Ρυθμός διατμησης (s -1 ) Σχήμα 5.12 Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο φαινόμενο ιξώδες χυμού ποικιλίας Cherrelino (α) αμέσως μετά την επεξεργασία και (β) μετά από 90 min ενζυμικής δράσης -133-

174 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Πίνακας 5.7 Εναπομένουσα δραστικότητα των PME και PG μετά από κάθε συνθήκη επεξεργασίας, εκφρασμένη σε % του ανεπεξέργαστου χυμού Συνθήκη επεξεργασίας PME (%) PG (%) 0,1 MPa στους 80 C για 10 min Δ.Α Δ.Α 400 MPa στους 40 C για 5 min MPa στους 80 C για 1 min 90 Δ.Α 800 MPa στους 80 C για 1 min 80 Δ.Α Δ.Α: Δεν ανιχνεύθηκε -134-

175 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας 5.2 Μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στην απενεργοποίηση των ενζύμων βιομηχανικής τομάτας. Στη δεύτερη φάση της πειραματικής διαδικασίας της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας με ΥΥΠ των ενζύμων PME και PG χυμού τομάτας βιομηχανικής χρήσης. Στη συνέχεια παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της κινητικής μελέτης απενεργοποίησης των ενζύμων, προερχόμενων από υβρίδια τομάτας βιομηχανικής χρήσης, τόσο κατά τη θερμική επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση όσο και σε συνθήκες ΥΥΠ. Η παρουσίαση των αποτελεσμάτων γίνεται ανά μελετούμενο ένζυμο Κινητική μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στην PG βιομηχανικής τομάτας Όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενο κεφάλαιο, η απενεργοποίηση των ενζύμων ακολουθεί συνήθως κινητική πρώτης τάξης (Eξ. 2.3) (Crelier et al., 2001; Stoforos et al. 2001; Boulekou et al., 2008; ), ενώ αρκετοί είναι οι ερευνητές που χρησιμοποιούν το κινητικό μοντέλο μερικής μετατροπής (Eξ. 2.4) για την περιγραφή του φαινομένου (Fachin et al., 2003, 2004; Polydera et al., 2004). Στην παρούσα διατριβή, η προσέγγιση των πειραματικών δεδομένων για την περιγραφή της κινητικής απενεργοποίησης της πολυγαλακτουρονάσης βιομηχανικής τομάτας έγινε αρχικά δοκιμάζοντας τα δύο συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα μοντέλα. Όπως ενδεικτικά φαίνεται στο Σχήμα 5.13, η πλειοψηφία των πειραματικών δεδομένων μείωσης της ενζυμικής ενεργότητας συναρτήσει του χρόνου επεξεργασίας σε διεργασίες ΥΥΠ, παρουσίασαν μια καμπυλότητα, η οποία δεν μπορούσε να περιγραφεί ικανοποιητικά από τα προαναφερόμενα κινητικά μοντέλα. Ύστερα από δοκιμές διαφόρων μαθηματικών εξισώσεων (νιοστής τάξης, εξίσωση Weibull) παρατηρήθηκε ότι η απενεργοποίηση του ενζύμου περιγράφεται ικανοποιητικά από κινητική «n-ης» τάξης, η οποία περιγράφεται από την Εξίσωση (5.10): A 1 n = A 1 n 0 + ( n 1) k t (5.10) -135-

176 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός όπου, Α (U/mL) είναι η ενεργότητα του ενζύμου σε χρόνο t της διεργασίας, Α ο (U/mL) είναι η ενεργότητα του ενζύμου στο χρόνο μηδέν της διεργασίας, n η τάξη της αντίδρασης, k (min -1 ) η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου και t (min) ο χρόνος διεργασίας. Μια τέτοια προσέγγιση ήταν εφαρμόσιμη στο σύνολο των συνθηκών επεξεργασίας με ικανοποιητικά αποτελέσματα. Για λόγους καλύτερης κατανόησης και σύγκρισης των αποτελεσμάτων στα διαγράμματα απεικονίζονται τα πειραματικά δεδομένα με τη μορφή του λόγου, Α/Α ο, της ενεργότητας του ενζύμου σε χρόνο t της διεργασίας προς την αντίστοιχη ενεργότητα στο χρόνο μηδέν (t = 0). 1,0 0,8 1ης τάξης n-στης τάξης μερικής μετατροπής A/Ao 0,6 0,4 0,2 0, Χρόνος (min) Σχήμα 5.13 Προσαρμογή κινητικής πρώτης τάξης (R 2 =0,872), νιοστής τάξης (R 2 =0,969) και μερικής μετατροπής (R 2 =0,924) στα πειραματικά δεδομένα απενεργοποίησης της PG σε διεργασία υπερυψηλής πίεσης -136-

177 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Θερμική απενεργοποίηση της PG βιομηχανικής τομάτας σε ατμοσφαιρική πίεση Η μείωση της ενεργότητας της PG υβριδίου Oval Red και Red Sea ως συνάρτηση του χρόνου επεξεργασίας κατά τη διάρκεια θερμικής επεξεργασίας στους 50, 60, 70 και 80 C παρουσιάζεται στο Σχήμα Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.14α η PG προερχόμενη από το υβρίδιο Oval Red εμφανίστηκε ιδιαίτερα ανθεκτική στη θερμική επεξεργασία. Θερμοκρασίες έως και 70 C δεν επέφεραν μείωση στην ενεργότητα του ενζύμου, ενώ στη θερμοκρασία των 80 C απαιτήθηκε επεξεργασία διάρκειας μιας ώρας για την απενεργοποίηση της PG σε ποσοστό περίπου 60%. Αντιθέτως η PG προερχόμενη από το υβρίδιο Red Sea εμφανίστηκε περισσότερο ευαίσθητη στη θερμική επεξεργασία (Σχήμα 5.14β). Όπως φαίνεται από τα πειραματικά δεδομένα, για να επιτευχθεί πλήρης απενεργοποίηση της PG απαιτούνται ιδιαίτερα έντονες συνθήκες και στις δύο περιπτώσεις υβριδίων τομάτας. Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώνει τη μέχρι τώρα βιβλιογραφία, σύμφωνα με τη οποία στη βιομηχανική πρακτική η θερμή θραύση πραγματοποιείται σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 80 C. 1,0 (α) 1,0 (β) 0,8 0,8 A/A0 0,6 A/A0 0,6 0,4 50 C 60 C 0,2 70 C 80 C 0, ,4 0,2 50 C 60 C 70 C 0, Χρόνος (min) Χρόνος (min) Σχήμα 5.14 Μείωση της ενεργότητας της PG υβριδίου (α) Oval Red και (β) Red Sea, συναρτήσει του χρόνου επεξεργασίας σε θερμοκρασία ( ) 50 C, ( ) 60 C, ( ) 70 C και ( ) 80 C. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της εξισωσης 5.10 σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου -137-

178 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Στην περίπτωση του υβριδίου Oval Red και για θερμοκρασίες επεξεργασίας C, όπου δεν παρατηρήθηκε απενεργοποίηση του ενζύμου, δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισμός της σταθεράς απενεργοποίησης, k. Ωστόσο, με προσαρμογή της Eξίσωσης 5.10 στα πειραματικά δεδομένα των 80 C, υπολογίστηκαν οι κινητικές παράμετροι n και k για τη συγκεκριμένη θερμοκρασία επεξεργασίας. Η τάξη της αντίδρασης, n, βρέθηκε ίση με 2,43 και η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης, k, ίση με 3x10-5 min -1 (R 2 =0,993). Αντικαθιστώντας στην Eξίσωση 5.10 τη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης όπως αυτή εκφράζεται μέσω της σχέσης του Arrhenius (Εξίσωση 5.2) προέκυψε η Εξίσωση A 1 n = A 1 n o + E a 1 1 R T T ref ( n ) k e t 1 (5.11) Tref Με προσαρμογή της Eξίσωσης 5.11 στα πειραματικά δεδομένα της θερμικής απενεργοποίησης της PG του υβριδίου Red Sea και μη γραμμική παλινδρόμηση υπολογίστηκαν οι τιμές των παραμέτρων της Εξίσωσης 5.11 για T ref =343,16Κ (70 C). Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα 5.8. Πίνακας 5.8 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης 5.11 για τη θερμική απενεργοποίησης σε ατμοσφαιρική πίεση της PG υβριδίου Red Sea για =343,16Κ (70 C). R 2 (πειραματικών σε σχέση με τις προβλεπόμενες τιμές)=0,940 T ref Παράμετρος Τιμή 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης Κατώτερο Όριο Ανώτερο όριο n 1,65 0,839 2,47 k T ref (min -1 ) 0, ,0134 0,0206 E a (kj/mol) Για την τιμή του n = 1,65 όπως προσδιορίστηκε από την Εξίσωση 5.11 και με προσαρμογή της Eξίσωσης 5.10 στα πειραματικά δεδομένα, υπολογίστηκαν οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea σε κάθε -138-

179 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας θερμοκρασία επεξεργασίας. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα 5.9. Παρατηρούμε ότι αύξηση της θερμοκρασίας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου. Η εξάρτηση της σταθεράς k από τη θερμοκρασία απεικονίζεται στο Σχήμα 5.15 και εκφράστηκε μέσω της ενέργειας ενεργοποίησης Ε a, και τη σχέση Arrhenius (Εξίσωση 5.2) (R 2 =0,987). Πίνακας 5.9 Κινητικές παράμετροι θερμικής απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea για n = 1,65 και T ref =343,16Κ (70 C) T ( C) k (x10-3 min -1 ) R ,118±0,047 0, ,909±0,187 0, ,29±1,11 0,928 E a =154±17 kj/mol, k T =0,00369 (min -1 ) ref T ( C) lnk , , , , , , /T-1/Tref Σχήμα 5.15 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea από τη θερμοκρασία επεξεργασίας σε ατμοσφαιρική πίεση -139-

180 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Όπως φαίνεται από τους Πίνακες 5.8 και 5.9 δεν υπήρξαν διαφορές στις τιμές των E a και kt ref κατά τον υπολογισμό τους είτε μέσω της Εξίσωσης 5.11 ή της σχέσης Arrhenius (Εξίσωση 5.2) Απενεργοποίηση της PG βιομηχανικής τομάτας σε συνθήκες ΥΥΠ Στο Σχήμα 5.16 απεικονίζεται η εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Oval Red από τη θερμοκρασία (40-70 C) και το χρόνο διεργασίας για σταθερή πίεση επεξεργασίας MPa, όπως προέκυψε από τα πρωτογενή πειραματικά δεδομένα. 1,0 (α) 1,0 (β) 0,8 0,8 A/Ao 0,6 0,4 0,2 40 C 50 C 60 C 70 C A/A o 0,6 0,4 0,2 40 C 50 C 60 C 70 C 0, Χρόνος (min) 0, Χρόνος (min) 1,0 (γ) 1,0 (δ) 0,8 0,8 A/A o 0,6 0,4 0,2 40 C 50 C 60 C 70 C A/Ao 0,6 0,4 0,2 40 C 50 C 60 C 0, Χρόνος (min) 0, Χρόνος (min) Σχήμα 5.16 Εξάρτηση της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας της PG υβριδίου Oval Red από τη θερμοκρασία και το χρόνο διεργασίας σε συνθήκες σταθερής πίεσης επεξεργασίας (α) 100 MPa, (β) 200 MPa, (γ) 300 MPa και (δ) 400 MPa -140-

181 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Όπως φαίνεται και στο Σχήμα 5.16α η επεξεργασία σε πίεση 100 MPa δεν προκάλεσε σημαντική απενεργοποίηση του ενζύμου σε όλες τις θερμοκρασίες επεξεργασίας. Με αύξηση της πίεσης παρατηρήθηκε εντονότερη απενεργοποίηση της PG (Σχήμα 5.16β, γ), ενώ σε συνθήκες επεξεργασίας 400 MPa και υψηλές θερμοκρασίες, απαιτήθηκαν μόλις λίγα λεπτά για τη σχεδόν πλήρη απενεργοποίηση του ενζύμου (Σχήμα 5.16δ). Επίσης, σε σταθερή πίεση επεξεργασίας, αύξηση της θερμοκρασίας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου. Ωστόσο, τα παραπάνω πειραματικά δεδομένα δεν είναι απολύτως συγκρίσιμα, καθώς πρόκειται για δεδομένα που προέκυψαν από την επεξεργασία χυμού τομάτας σε συνθήκες σταθερής πίεσης αλλά μη απολύτως σταθερής θερμοκρασίας όπως αναλύεται παρακάτω. Αυτό οφείλεται στo γεγονός ότι κατά τη διάρκεια των διεργασιών Υπερυψηλής Πίεσης παρατηρείται αύξηση της θερμοκρασίας του περιεχομένου του δοχείου πίεσης κατά τη συμπίεση, λόγω αδιαβατικής θέρμανσης (περίπου 3 C ανά 100 MPa) (Farkas & Hoover, 2001). Αν κατά το χρόνο παραμονής του τροφίμου στην επιθυμητή πίεση δεν πραγματοποιείται μεταφορά θερμότητας μέσω των τοιχωμάτων του δοχείου πίεσης σε αυτό (μονωμένο σύστημα), το τρόφιμο επανέρχεται στην αρχική του θερμοκρασία κατά την αποσυμπίεση. Σε αντίθετη περίπτωση, η θερμοκρασία μειώνεται σταδιακά κατά τη διάρκεια εφαρμογής της πίεσης, λόγω φαινομένων μεταφοράς θερμότητας, προσπαθώντας να εξισορροπήσει με τη θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το γεγονός αυτό πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά τον προσδιορισμό κινητικών παραμέτρων. Για τον προσδιορισμό της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης, k, ενός ενζύμου σε συγκεκριμένο συνδυασμό πίεσηςθερμοκρασίας πρέπει να θεωρούνται οι αντίστοιχες ισοβαρείς-ισοθερμοκρασιακές συνθήκες. Διαφορετικά τα κινητικά δεδομένα αναφέρονται σε ισοβαρείς συνθήκες και μεταβαλλόμενη θερμοκρασία. Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο , για τη συλλογή των κινητικών δεδομένων τα δείγματα των ενζύμων παρέμειναν στους θαλάμους επεξεργασίας για διαφορετικούς χρόνους. Αν και οι θάλαμοι επεξεργασίας ήταν θερμοστατούμενοι, η αδιαβατική θέρμανση δεν επέτρεψε τη διεξαγωγή πειραμάτων σε απόλυτα -141-

182 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός ισοθερμοκρασιακές συνθήκες. Στο Σχήμα 5.17 απεικονίζεται ένα τυπικό διάγραμμα μεταβολής της πίεσης του συστήματος ΥΥΠ που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή και της θερμοκρασίας του υγρού μεταφοράς της πίεσης κατά τη διάρκεια της συμπίεσης. Σε χαμηλές πιέσεις, MPa, παρατηρήθηκε μικρή μεταβολή της θερμοκρασίας λόγω αδιαβατικής θέρμανσης, η οποία σε συνδυασμό με τους μεγάλους χρόνους παραμονής είχε ως αποτέλεσμα η θερμοκρασία να είναι σταθερή στο μεγαλύτερο μέρος του πειράματος. Αντίθετα, σε υψηλότερες πιέσεις MPa, όπου παρατηρήθηκε μεγαλύτερη θερμοκρασιακή μεταβολή λόγω αδιαβατικής θέρμανσης, και σε συνδυασμό με τους μικρούς χρόνους δειγματοληψίας, καταγράφηκαν μεταβαλλόμενα θερμοκρασιακά προφίλ, όπως ενδεικτικά παρουσιάζεται στο Σχήμα Όπως φαίνεται στο σχήμα, κατά τη συμπίεση στα 400 MPa παρατηρήθηκε αύξηση της θερμοκρασίας λόγω αδιαβατικής θέρμανσης κατά περίπου 12 C. Λόγω των φαινομένων μεταφοράς θερμότητας και Πίεση Θερμοκρασία Πίεση (MPa) Θερμοκρασία ( C) Χρόνος διεργασίας (min) 40 Σχήμα 5.17 Τυπικό διάγραμμα μεταβολής της πίεσης του συστήματος ΥΥΠ που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή και της θερμοκρασίας του υγρού μεταφοράς της πίεσης κατά τη συμπίεση χυμού τομάτας στα 400 MPa και ονομαστική (επιδιωκόμενη) θερμοκρασία 50 C για 6 min -142-

183 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας προσπαθώντας το σύστημα να ισορροπήσει στην επιδιωκόμενη θερμοκρασία, η οποία στο συγκεκριμένο παράδειγμα ήταν 50 C, παρατηρήθηκε μείωση της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια του πειράματος, με αποτέλεσμα να καταγραφεί μεταβαλλόμενο θερμοκρασιακό προφίλ σε κάθε χρόνο δειγματοληψίας (Σχήμα 5.18(α)-(δ)). Η μέση τιμή της θερμοκρασίας κάθε χρόνου δειγματοληψίας του συγκεκριμένου παραδείγματος παρουσιάζεται στον Πίνακα (α) 65 (β) Θερμοκρασία ( c) Θερμοκρασία ( c) ,0-0,5 0,0 0,5 1,0 40-1,0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Χρόνος διεργασίας (min) Χρόνος διεργασίας (min) (γ) 65 (δ) Θερμοκρασία ( c) Θερμοκρασία ( c) ,0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3, Χρόνος διεργασίας (min) Χρόνος διεργασίας (min) Σχήμα 5.18 Θερμοκρασιακό προφίλ χυμού τομάτας κατά την επεξεργασία σε πίεση 400 MPa και επιδιωκόμενη θερμοκρασία 50 C σε χρόνο δειγματοληψίας (α) 1 min, (β) 2 min, (γ) 3 min και (δ) 6 min -143-

184 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Πίνακας 5.10 Μέση θερμοκρασία για κάθε χρόνο δειγματοληψίας κατά την επεξεργασία χυμού τομάτας σε πίεση 400 MPa και επιδιωκόμενη θερμοκρασία 50 C Χρόνος δειγματοληψίας (min) Μέση Θερμοκρασία ( C) 1 59,5 2 58, Μ.Ο θερμοκρασίας: 58 C Σύμφωνα με τα παραπάνω κρίθηκε σκόπιμο να ληφθεί υπόψη το μεταβαλλόμενο θερμοκρασιακό προφίλ κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, ώστε να αναχθούν τα αποτελέσματα σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας. Για το σκοπό αυτό τα πραγματικά χρονοθερμοκρασιακά προφίλ των διεργασιών ΥΥΠ χρησιμοποιήθηκαν για την επεξεργασία των αποτελεσμάτων, κατ αντιστοιχία με τη θεωρία των ισοδύναμων διεργασιών των θερμικών διεργασιών. Ως σταθερή θερμοκρασία αναγωγής των αποτελεσμάτων επιλέχθηκε να χρησιμοποιηθεί η μέση τιμή της θερμοκρασίας των δειγμάτων κάθε συνθήκης επεξεργασίας. Δύο θερμικές διεργασίες θεωρούνται ισοδύναμες μόνο όταν παράγουν το ίδιο αποτέλεσμα σε δεδομένο ποιοτικό χαρακτηριστικό ή παράγοντα αλλοίωσης. Έτσι για παράδειγμα, η ενεργότητα ενός ενζύμου σε δύο όμοια δείγματα τροφίμου μετά από δύο, αντίστοιχα θερμικές διεργασίες που διαφέρουν μεταξύ τους στο χρόνο και τη θερμοκρασία επεξεργασίας, αλλά με ίδιες όλες τις άλλες συνθήκες και παραμέτρους, πρέπει να είναι η ίδια για να μπορούν να θεωρηθούν οι δύο θερμικές επεξεργασίες ισοδύναμες. Η ανάλυση αυτή οδηγεί στην έννοια της τιμής F. Η τιμή F δεδομένης θερμικής επεξεργασίας ορίζεται ως ο ισοδύναμος χρόνος κατεργασίας σε μια σταθερή θερμοκρασία αναφοράς μιας υποθετικής θερμικής επεξεργασίας που παράγει το ίδιο αποτέλεσμα με τη δεδομένη θερμική επεξεργασία. Υποθέτοντας ότι η θερμική απενεργοποίηση ενός ενζύμου ακολουθεί κινητική νιοστής τάξης, τότε ο ρυθμός απενεργοποίησης (μεταβολή της ενεργότητας -144-

185 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Α, με το χρόνο) κατά τη διεργασία σε σταθερή θερμοκρασία δίνεται από την Εξίσωση (5.12): da k n = T dt A (5.12) Ο δείκτης Τ στη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης, k T, δηλώνει την εξάρτησή του από τη θερμοκρασία. Ολοκληρώνοντας την Eξίσωση (5.12) μεταξύ των αρχικών, t a, και τελικών, t b συνθηκών της διεργασίας προκύπτει η Eξίσωση (5.13): f A t da b, b n T A (5.13) b ( A A ) = k dt a A a Ο τύπος της συνάρτησης f ( A a, A b ) που ορίζεται από το πρώτο ολοκλήρωμα της Eξίσωσης (5.13) προσδιορίζεται από την κινητική που ακολουθεί η θερμική απενεργοποίηση. Έτσι για κινητικές νιοστής τάξης ισχύει: f 1 n n ( A A ) 1 = ( A 1 A ) t a a, b a n 1 b (5.14) Συγκρίνοντας τις Eξισώσεις (5.13) και (5.14) προκύπτει η Eξίσωση (5.15): 1 n a 1 n b A A = 1 tb ( n ) k T ta dt (5.15) Από τον ορισμό των ισοδύναμων θερμοκρασιών, είναι κατανοητό ότι η τιμή της διαφοράς n n 1 b A 1 a A πρέπει να είναι η ίδια για να θεωρούνται δύο θερμικές επεξεργασίες ισοδύναμες. Υπολογίζοντας το ολοκλήρωμα στην Eξίσωση (5.15) για μια κατεργασία σε σταθερή θερμοκρασία αναφοράς T ref (όπου, k T = k Tref = σταθερά), διάρκειας ( t2 t 1 ) που επιφέρει το ίδιο αποτέλεσμα, δηλαδή οδηγεί σε ίδια διαφορά, n n 1 b A 1 a A, παίρνουμε: A 1 n a A 1 n b = ( n 1) k ( t t ) Tref 2 1 (5.16) -145-

186 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Και επειδή εξ ορισμού, T = t 2 t1, προκύπτει: F ref A 1 n a A 1 n b = ( n 1) kt ref FT ref (5.17) Τελικά από τις Εξισώσεις (5.16) και (5.17) προκύπτει η Εξίσωση (5.18): F Tref 1 = k Tref tb k T ta dt (5.18) Μεταξύ των παραμέτρων που επηρεάζουν την ειδική ταχύτητα αντίδρασης, η θερμοκρασία είναι η πλέον καθοριστική. Χρησιμοποιώντας τη σχέση του Arrhenius (Εξίσωση 5.2) για να εκφράσουμε την επίδραση της θερμοκρασίας στην ειδική ταχύτητα της αντίδρασης, k T, η Εξίσωση (5.18) δίνει: F Tref = tb ta e E a 1 1 R T Tref dt (5.19) αναφοράς Ο χρόνος F T είναι ο ισοδύναμος χρόνος σε μια επιλεγμένη θερμοκρασία ref T ref που επιφέρει το ίδιο αποτέλεσμα με την υπό εξέταση επεξεργασία κατά την οποία η θερμοκρασία του δείγματος δεν ήταν σταθερή. Έτσι, οι πειραματικοί χρόνοι της κάθε δειγματοληψίας, κατά τη διάρκεια της οποίας η θερμοκρασία του δείγματος δεν ήταν σταθερή (όπως ενδεικτικά απεικονίζεται στο Σχήμα 5.18), διορθώνονται με βάση την εξίσωση Προκειμένου λοιπόν να υπολογιστεί ο ισοδύναμος χρόνος της διεργασίας, είναι απαραίτητη η γνώση της ενέργειας ενεργοποίησης σε κάθε πίεση επεξεργασίας, για την αρχική εκτίμηση της οποίας ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: από τα δεδομένα θερμοκρασίας-χρόνου σε σταθερή πίεση, που λήφθηκαν από το σύστημα ΥΥΠ, υπολογίστηκε μια μέση θερμοκρασία κατεργασίας, T avg i, για κάθε χρόνο επεξεργασίας, t i, ως ο αριθμητικός μέσος της τιμής της θερμοκρασίας, Τ, για το δεδομένο χρονικό διάστημα. Θεωρώντας κινητική νιοστής τάξης, σταθερή θερμοκρασία για κάθε χρόνο επεξεργασίας ίση με T avg i, και γραμμική εξάρτηση της ενέργειας ενεργοποίησης, E a, από την πίεση επεξεργασίας, P, η ενεργότητα του ενζύμου, Α, περιγράφηκε ως -146-

187 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας συνάρτηση της πίεσης, της θερμοκρασίας και του χρόνου επεξεργασίας μέσω της Εξίσωσης A = A 1 n 0 + ( n 1) k P, T avg i E exp a o + c R (5.20) ( P P ) ref 1 T avg i 1 T ref Va R T avg i ( P P ) ref ti 1 1 n Όπου T ref =333,16 K και P ref = 250 MPa. Η υπόθεση περί γραμμικής εξάρτησης της ενέργειας ενεργοποίησης E a, από την πίεση επεξεργασίας βασίστηκε σε προκαταρκτική ανάλυση των δεδομένων (πριν τη διαδικασία διόρθωσης των χρόνων δειγματοληψίας) σε κάθε πίεση, κάτι το οποίο επαληθεύθηκε και παρουσιάζεται στη συνέχεια. Με προσαρμογή της Εξίσωσης 5.20 στα πειραματικά δεδομένα της ενεργότητας της PG συναρτήσει του χρόνου σε κάθε συνθήκη επεξεργασίας, και με μη γραμμική παλινδρόμηση έγινε μια πρώτη εκτίμηση της τάξης, n, της αντίδρασης απενεργοποίησης της PG υβριδίου Oval Red. Η τιμή του n προσδιορίστηκε ίση με 1,35 (R 2 =0,973). Στη συνέχεια υπολογίστηκε η ενέργεια ενεργοποίησης σε κάθε πίεση επεξεργασίας. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η Εξίσωση 5.11, η οποία εκφράζει την εξάρτηση της ενζυμικής ενεργότητας από τη θερμοκρασία και το χρόνο επεξεργασίας σε δεδομένη πίεση. Με προσαρμογή της Εξίσωσης (5.11) στα πειραματικά δεδομένα, θεωρώντας το n σταθερό και ίσο με 1,35 (όπως υπολογίστηκε προηγουμένως) και τη θερμοκρασία ίση με τη μέση θερμοκρασία κατεργασίας, T avgi, για κάθε χρόνο επεξεργασίας, t i, προσδιορίστηκε, μέσω μη γραμμικής παλινδρόμησης, η ενέργεια ενεργοποίησης E a για κάθε πίεση επεξεργασίας. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα Ακολούθως, η τιμή της E a χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του ισοδύναμου χρόνου της διεργασίας. Με την αριθμητική ολοκλήρωση της Εξίσωσης 5.19 (κανόνας του τραπεζίου) ο διορθωμένος χρόνος επεξεργασίας, * t i, σε σταθερή θερμοκρασία αναφοράς, T ref, υπολογίστηκε μέσω της Εξίσωσης (5.21). Ως θερμοκρασία αναφοράς, T ref δοχείων πίεσης στην εκάστοτε συνθήκη επεξεργασίας., χρησιμοποιήθηκε η μέση τιμή της θερμοκρασίας των -147-

188 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός = ref n a ref a ref n a ref a ref a T T R E T T R E n T T R E T T R E T T R E i e e e e e t t * Δ (5.21) Πίνακας 5.11 Τιμές των Ε α (kj/mol) και T ref k (x10-3 min -1 ) όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.11) για n = 1,35 και T ref = 328,16 K σε κάθε πίεση επεξεργασίας 100 MPa 200 MPa 300 MPa 400 MPa a E 22,3±16,3 75,2±11,9 142±18,3 199±22,5 T ref k 0,534±0,173 1,054±0,189 2,96±0,810 41,9±10,3 R 2 0,920 0,931 0,977 0,991 Στο Σχήμα 5.19 απεικονίζεται ενδεικτικά η μείωση της ενζυμικής ενεργότητας συναρτήσει του χρόνου διεργασίας σε μεταβαλλόμενο θερμοκρασιακό προφίλ και του διορθωμένου χρόνου σε σταθερή θερμοκρασία αναφοράς 50 C και πίεση επεξεργασίας 400 MPa. Χρόνος (min) A/A o Χρόνος δειγματοληψίας Διορθωμένος χρόνος t2 t1 t3 t4 t1 * t2 * t3 * t4 * Σχήμα 5.19 Η μεταβολή της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας σε μια διεργασία ΥΥΠ σε σχέση με το χρόνο διεργασίας. Στο διάγραμμα οι χρόνοι t 1 -t 4 είναι οι χρόνοι δειγματοληψίας (δηλ. οι χρόνοι παραμονής των δειγμάτων στο θάλαμο πίεσης) και οι χρόνοι t 1* -t 4 * είναι οι διορθωμένοι χρόνοι που προέκυψαν από την Εξίσωση 5.21

189 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Οι χρόνοι t 1, t 2, t 3 και t 4 αντιστοιχούν σε μια μέση θερμοκρασία ίση με 60, 59, 58 και 56 C, αντίστοιχα, ενώ οι διορθωμένοι χρόνοι, t 1* - t * 4 αντιστοιχούν σε σταθερή θερμοκρασία 58 C, ίση με το μέσο όρο των θερμοκρασιών που αντιστοιχούν στους χρόνους t 1 -t 4. Παρατηρούμε ότι η τιμή του διορθωμένου χρόνου ήταν μεγαλύτερη της αντίστοιχης τιμής του χρόνου δειγματοληψίας στις περιπτώσεις όπου η σταθερή θερμοκρασία αναφοράς στην οποία έγινε η διόρθωση του χρόνου ήταν μεγαλύτερη από την εκάστοτε μέση θερμοκρασία του δείγματος. Επιπλέον, η διαφορά μεταξύ του πραγματικού χρόνου παραμονής στο μεταβαλλόμενο χρονοθερμοκρασιακό προφίλ, t, και του διορθωμένου χρόνου, t *, σε σταθερό χρονοθερμοκρασιακό προφίλ ήταν σημαντική στις περιπτώσεις όπου η τιμή της ενέργειας ενεργοποίησης ήταν μεγάλη. Αντιθέτως, σε μικρές τιμές της ενέργειας ενεργοποίησης (μικρές πιέσεις επεξεργασίας, MPa) αυτή η διαφορά ήταν ελάχιστη. Συνεπώς η επεξεργασία των δεδομένων σε ισοβαρείς συνθήκες μεταβαλλόμενου χρονοθερμοκρασιακού προφίλ θα οδηγούσε σε υπερεκτίμηση των ρυθμών απενεργοποίησης του ενζύμου συγκριτικά με την επεξεργασία σε ισοβαρείς και ισοθερμοκρασιακές συνθήκες. Αφού προσδιορίστηκαν οι διορθωμένοι χρόνοι διεργασίας για όλες τις συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας επεξεργασίας, προσδιορίστηκε η εξάρτηση της απενεργοποίησης του ενζύμου από την πίεση και τη θερμοκρασία μέσω της Εξίσωσης (5.22): A = A 1 n 0 + ( n 1) k P, T ref E exp a o + c ( P P ) ref R (5.22) 1 1 T Tref Va R T ( P P ) ref * t 1 1 n όπου, Τ (Κ) η σταθερή θερμοκρασία αναγωγής των αποτελεσμάτων, Τ ref = 333,16 K και P ref =250 MPa. Οι τιμές των παραμέτρων της παραπάνω εξίσωσης προσδιορίστηκαν με μη γραμμική παλινδρόμηση. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον υπολογισμό του διορθωμένου χρόνου συνοψίζεται στο Σχήμα Επιπλέον επανάληψη της διαδικασίας διόρθωσης δε μετέβαλε τις τιμές των κινητικών παραμέτρων

190 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Διεξαγωγή πειραμάτων ΥΥΠ σε ισοβαρείς συνθήκες σε συνδυασμό με διαφορετικές θερμοκρασίες Προσδιορισμός ενζυμικής ενεργότητας για κάθε χρόνο διεργασίας ΥΥΠ Θερμοκρασία ( o C) (δ) Χρόνος (min) Εξ Εκτίμηση της τάξης της αντίδρασης, n, για το σύνολο των πειραματικών δεδομένων Εξ Προσδιορισμός της ενέργειας ενεργοποίησης σε σταθερή πίεση Εξ Προσδιορισμός του διορθωμένου χρόνου διεργασίας σε θερμοκρασία αναφοράς ίση με τη μέση τιμή της θερμοκρασίας κάθε πειράματος Προσδιορισμός των κινητικών παραμέτρων της εξίσωσης 5.21 Εξ Σχήμα 5.20 Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας διόρθωσης του χρόνου επεξεργασίας -150-

191 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Στον Πίνακα 5.12 παρουσιάζονται οι τιμές των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.22), όπως προσδιορίστηκαν, με ικανοποιητικά αποτελέσματα (R 2 =0,973). Πίνακας 5.12 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.22) για την απενεργοποίηση της PG (Oval Red) σε διάφορες συνθήκες πίεσης ( MPa) και θερμοκρασίας (41-75 C) για Τ ref = 333,16 K και P ref = 250 MPa. R 2 (πειραματικών σε σχέση με τις προβλεπόμενες τιμές) = 0,973 Παράμετρος Τιμή 95 % Διάστημα εμπιστοσύνης Κατώτερο όριο Ανώτερο όριο n 1,48 0,763 2,21 k P, T ref (min -1 ) 2,004 x ,71 x ,72 x 10-3 E a o (kj/mol) ,4 126 c (kj/(mol MPa) 0,762 0,468 1,055 V a (ml/mol) -47,9-61,7-34,2 Ο όρος Va αντιστοιχεί στον όγκο ενεργοποίησης και εκφράζει την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από την πίεση επεξεργασίας. Με βάση τη βιβλιογραφία μια αρνητική τιμή του όγκου ενεργοποίησης υποδεικνύει την επίδραση της πίεσης προς την κατεύθυνση της απενεργοποίησης ενώ μια θετική τιμή του όγκου ενεργοποίησης υποδηλώνει πως η εφαρμογή πίεσης παρεμποδίζει την απενεργοποίηση ενζύμων. Στη συγκεκριμένη περίπτωση η τιμή του όγκου ενεργοποίησης υπολογίστηκε αρνητική υποδηλώνοντας ότι η εφαρμογή πίεσης είχε ως αποτέλεσμα την απενεργοποίηση της PG. Στο Σχήμα 5.21 παρουσιάζεται η συσχέτιση μεταξύ των πειραματικών και των προβλεπόμενων από την Εξίσωση 5.22 τιμών της ενεργότητας της PG υβριδίου Oval Red. Παρατηρούμε ότι η συσχέτιση μεταξύ τους υπήρξε πολύ καλή. Παρόλο που υπήρχαν κάποιες αποκλίσεις, αυτές δεν ήταν δυνατό να αποδοθούν σε κάποιο συγκεκριμένο σετ δεδομένων και θεωρήθηκαν τυχαίες

192 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Η ανάπτυξη ενός αξιόπιστου μαθηματικού μοντέλου αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο που επιτρέπει την άντληση σημαντικών πληροφοριών σχετικά με το φαινόμενο για το οποίο αναπτύχθηκε. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, κάνοντας χρήση των διορθωμένων χρόνων, και της τάξης της αντίδρασης, n =1,48, όπως υπολογίστηκαν προηγουμένως, προσδιορίστηκαν οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης, k, της PG υβριδίου Oval Red για κάθε συνθήκη επεξεργασίας μέσω της Εξίσωσης (5.10). Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα 5.13, όπου φαίνεται ότι αύξηση της θερμοκρασίας σε σταθερή πίεση επεξεργασίας καθώς και η αύξηση της πίεσης είχαν ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου σε όλο το εύρος των πιέσεων και θερμοκρασιών που μελετήθηκαν. 200 Προβλεπόμενες τιμές Α (U/mL) Πειραματικές τιμές Α (U/mL) 100 MPa 200 MPa 300 MPa 400 MPa Σχήμα 5.21 Σύγκριση των πειραματικών και προβλεπόμενων τιμών της ενεργότητας της PG κατά τη διάρκεια επεξεργασίας χυμού τομάτας υβριδίου Oval Red σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων ( MPa) και θερμοκρασιών (41-75 C) -152-

193 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Πίνακας 5.13 Σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Oval Red, k, (x10-3 min -1 ) όπως υπολογίστηκε από την Εξίσωση (5.10) για n =1,48 και τους διορθωμένους χρόνους διεργασιών P (MPa) T ( C) k (x 10-3 min -1 ) R ,155 ± 0,242 0, ,318 ± 0,285 0, ,228 ± 0,252 0, ,416 ± 0,130 0, ,156 ± 0,098 0, ,438 ± 0,038 0, ,31 ± 0,527 0, ,51 ± 0,673 0, ,168 ± 0,076 0, ,31 ± 0,611 0, ,02 ± 0,423 0, ,5 ± 11,8 0, ,05 ± 1,14 0, ,0 ± 3,45 0, ± 75,2 0,994 Κάνοντας χρήση των διορθωμένων χρόνων επεξεργασίας και των τιμών της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης που παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.13, κατασκευάστηκε το Σχήμα 5.22, όπου απεικονίζονται οι ρυθμοί απενεργοποίησης της PG για τους διορθωμένους χρόνους των διεργασιών. Τα σύμβολα αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, ενώ οι καμπύλες αντιπροσωπεύουν την προσαρμογή της Εξίσωσης (5.10) στα δεδομένα της ενεργότητας του ενζύμου συναρτήσει των διορθωμένων χρόνων διεργασίας. Επιπλέον, οι θερμοκρασίες αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή της θερμοκρασίας στην οποία πραγματοποιήθηκε κάθε πείραμα και στην οποία έγινε η διόρθωση του χρόνου επεξεργασίας. Η εξάρτηση της απενεργοποίησης της PG από τη θερμοκρασία για σταθερή πίεση επεξεργασίας εκφράστηκε μέσω της ενέργειας ενεργοποίησης. Με -153-

194 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός προσαρμογή της Εξίσωσης (5.11) στα πειραματικά δεδομένα και μη γραμμική παλινδρόμηση, υπολογίστηκαν οι τιμές της ενέργειας ενεργοποίησης για κάθε επίπεδο πιέσεων επεξεργασίας που μελετήθηκαν. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρουσιάζονται στον Πίνακα Παρατηρούμε ότι αύξηση της πίεσης οδήγησε σε αύξηση της ενέργειας ενεργοποίησης, υποδηλώνοντας μεγαλύτερη εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου από τη θερμοκρασία στις υψηλότερες πιέσεις. 1,0 (α) 1,0 (β) 0,8 0,8 A/Ao 0,6 41 C 54 C 65 C 0,4 74 C 41 C 0,2 54 C 65 C 74 C 0, Διορθωμένος χρόνος t* (min) A/A ο 0,6 43 C 52 C 66 C 0,4 75 C 43 C 0,2 52 C 66 C 75 C 0, Διορθωμένος χρόνος t* (min) 1,0 (γ) 1,0 (δ) 0,8 0,8 A/A o 0,6 0,4 0,2 42 C 54 C 65 C 75 C 42 C 54 C 65 C 75 C A/Ao 0,6 0,4 0,2 47 C 58 C 70 C 47 C 58 C 70 C 0, Διορθωμένος Χρόνος t* (min) 0, Διορθωμένος χρόνος t* (min) Σχήμα 5.22 Εξάρτηση της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας της PG Oval Red από το διορθωμένο χρόνο διεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία και πίεση επεξεργασίας (α) 100 MPa, (β) 200 MPa, (γ) 300 MPa και (δ) 400 MPa. Οι καμπύλες αντιπροσωπεύουν την προσαρμογή της Εξ στα πειραματικά δεδομένα και οι θερμοκρασίες τη μέση τιμή της θερμοκρασίας επεξεργασίας κάθε πειράματος -154-

195 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Πίνακας 5.14 Τιμές των Εα (kj/mol) και k T ref (x10-4 min -1 ) όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.11) για n = 1,48 και T ref = 333,16 K σε κάθε πίεση επεξεργασίας 100 MPa 200 MPa 300 MPa 400 MPa Ea 21,1± 15,1 75,9±11,3 147±18,9 228±27,5 k 3,05±1,05 8,08±1,16 35,1±8,84 898±332 T ref R 2 0,921 0,933 0,977 0,991 Η ενέργεια ενεργοποίησης βρέθηκε να εξαρτάται γραμμικά από την εφαρμοζόμενη πίεση (Σχήμα 5.23). Η εξάρτηση αυτή περιγράφηκε από την Εξίσωση (5.25): Ea ( P P ) = Ea + c ref (5.25) o Όπου P ref =250 MPa, Ea o =118 kj/mol (ενέργεια ενεργοποίησης σε πίεση αναφοράς, P ref ) και c = 0,692 kj/(mol MPa) (R 2 =0,993). P (MPa) E a (kj/mol) P-P ref (MPa) Σχήμα 5.23 Εξάρτηση της ενέργειας ενεργοποίησης από την πίεση επεξεργασίας για την PG υβριδίου Oval Red -155-

196 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Η παρατηρούμενη γραμμική εξάρτηση της E a από την πίεση επεξεργασίας επαληθεύει την αρχική υπόθεση για την ανάπτυξη της Εξίσωσης Οι τιμές των Ea o και c που υπολογίστηκαν κατ αυτό τον τρόπο συμφωνούν με τις αντίστοιχες τιμές που προσδιορίστηκαν με προσαρμογή της Εξίσωσης 5.20 στο σύνολο των πειραματικών δεδομένων και εμφανίζονται στον Πίνακα Απομονώνοντας από την Εξίσωση (5.24) τον όρο που αντιστοιχεί στη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης, αυτή εκφράστηκε μέσω της Εξίσωση (5.26): ( P P ) Ea + c o ref 1 1 Va k = kp, T exp ( P P ) ref (5.26) ref R T Tref R T Με χρήση της Εξίσωσης (5.26) και των τιμών των παραμέτρων που φαίνονται στον Πίνακα 5.12, δίνεται η δυνατότητα υπολογισμού της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης για κάθε συνδυασμό πίεσης και θερμοκρασίας επεξεργασίας που περιλαμβάνεται στο εύρος πιέσεων και θερμοκρασιών που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Η εξάρτηση του k από την πίεση σε διάφορες σταθερές θερμοκρασίες επεξεργασίας απεικονίζεται στο Σχήμα ,030 k (min -1 ) 0,025 0,020 0,015 0, C 45 C 50 C 55 C 60 C 65 C 70 C 75 C 0,005 0, P (MPa) Σχήμα 5.24 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Oval Red από την πίεση επεξεργασίας σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας -156-

197 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Παρατηρούμε ότι αύξηση της πίεσης σε σταθερή θερμοκρασία επεξεργασίας καθώς και αύξηση της θερμοκρασίας σε σταθερή πίεση επεξεργασίας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου, υποδηλώνοντας συνεργιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση της PG. Παρόμοια συμπεριφορά έχει παρατηρηθεί και από τους Crelier et al. (2001). Ωστόσο, οι συγκεκριμένοι ερευνητές υπολόγισαν τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG χυμού τομάτας, ποικιλίας NEMA 1401, που κυμάνθηκαν μεταξύ 0,021 min -1 και 0,151 min -1 στο εύρος πιέσεων και θερμοκρασιών MPa και C, υποδηλώνοντας ένα περισσότερο ευαίσθητο στην επεξεργασία με ΥΥΠ ένζυμο

198 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Υβρίδιο Red Sea Στο Σχήμα 5.25 απεικονίζεται η μείωση της ενεργότητας της PG υβριδίου Red Sea με το χρόνο κατά την επεξεργασία χυμού τομάτας σε πιέσεις MPa και θερμοκρασίες C. Παρατηρούμε ότι, σε αντίθεση με την PG προερχόμενη από το υβρίδιο Oval Red, η PG υβριδίου Red Sea εμφανίστηκε ευαίσθητη στην εφαρμογή πίεσης. Κατά την επεξεργασία στις χαμηλές πιέσεις 100 και 200 MPa και υψηλές θερμοκρασίες (> 60 C) επιτεύχθηκε απενεργοποίηση της PG σε ποσοστό περίπου 60% σε χρόνους που κυμάνθηκαν από 20 έως 60 min (Σχήμα 5.25 (α),(β)) 1,0 (α) 1,0 (β) 0,8 0,8 A/A o 0,6 0,4 0,2 40 C 50 C 60 C 70 C A/A o 0,6 0,4 0,2 40 C 50 C 60 C 70 C 0, Χρόνος (min) 0, Χρόνος (min) 1,0 (γ) 1,0 (δ) A/Ao 0,8 0,6 0,4 40 C 50 C 60 C 70 C A/A o 0,8 0,6 0,4 40 C 50 C 60 C 0,2 0,2 0, Χρόνος (min) 0, Χρόνος (min) Σχήμα 5.25 Μείωση της εργότητας της PG υβριδίου Red Sea συναρτήσει του χρόνου κατά την επεξεργασία σε θερμοκρασίες C πίεσεις (α) 100 MPa, (β) 200 MPa, (γ) 300 MPa και (δ) 400 MPa -158-

199 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.25 (γ) και (δ) σε μεγαλύτερες πιέσεις, MPa, επιτεύχθηκαν μεγαλύτερα ποσοστά απενεργοποίησης του ενζύμου (της τάξεως του 80%) σε μικρότερους χρόνους επεξεργασίας σχεδόν σε όλα τα επίπεδα θερμοκρασιών που μελετήθηκαν. Αύξηση της θερμοκρασίας σε σταθερή πίεση είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της απενεργοποίησης της PG σε όλα τα επίπεδα πιέσεων που μελετήθηκαν. Ωστόσο, παρατηρώντας τα δεδομένα των 100 και 200 MPa στη θερμοκρασία 70 C φαίνεται στην πίεση των 200 MPa επιτεύχθηκε μικρότερο ποσοστό απενεργοποίσης (45% σε 25 min) συγκριτικά με την πίεση των 100 MPa, όπου επιτεύχθηκε απενεργοποίηση της PG σε ποσοστό 55% στο ίδιο χρονικό διάστημα. Η συμπεριφορά αυτή που υποδηλώνει ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση του ενζύμου, είναι σε συμφωνία με τα αντίστοιχα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν για την PG της ποικιλίας Cherrelino. Ωστόσο και σε αυτή την περίπτωση, λόγω του φαινομένου της αδιαβατικής θέρμανσης κατά την εφαρμογή πίεσης, οι πραγματικές θερμοκρασίες στις οποίες εκτελέστηκαν τα πειράματα ήταν μεταβαλλόμενες και διαφορετικές από τις επιδιωκόμενες, όπως παρουσιάζονται στο Σχήμα Για το λόγο αυτό, και για την ακριβή επεξεργασία των αποτελεσμάτων απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea έγινε διόρθωση του χρόνου επεξεργασίας, ανηγμένου σε σταθερή θερμοκρασία αναφοράς. Ως θερμοκρασία αναφοράς χρησιμοποιήθηκε η μέση τιμή της θερμοκρασίας στην οποία εκτελέστηκε κάθε σειρά πειραμάτων και η οποία προέκυψε από τα χρονοθερμοκρασιακά δεδομένα που λήφθησαν από το σύστημα ΥΥΠ. Στον Πίνακα 5.15 παρουσιάζονται οι επιδιωκόμενες και οι μέσες τιμές της θερμοκρασίας των πειραμάτων. Για τη διόρθωση του χρόνου επεξεργασίας ακολουθήθηκε η διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως και απεικονίζεται στο Σχήμα 5.20, με διαφοροποιήσεις ως προς τις εξισώσεις που χρησιμοποιήθηκαν. Θεωρώντας κινητική νιοστής τάξης και λαμβάνοντας υπόψη την ανταγωνιστική δράση της πίεσης έναντι της θερμοκρασίας που παρατηρήθηκε στις χαμηλές πιέσεις επεξεργασίας MPa, η εξάρτηση της ενεργότητας του ενζύμου από την πίεση, τη θερμοκρασία και το χρόνο επεξεργασίας εκφράστηκε μέσω της Εξίσωσης

200 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Πίνακας 5.15 Επιδιωκόμενες και μέσες τιμές θερμοκρασίας επεξεργασίας υβριδίου Red Sea σε κάθε πίεση Πίεση (MPa) Επιδιωκόμενη Τ ( C) Μέση τιμή Τ ( C) A = A 1 n o + ( n 1) ( P P ) E a Va k ref exp 1 R Tavgi T ref R Tavgi E a Va + kref exp 2 R Tavgi T ref R T ref ( P P ) avgi t i + t i ref 1 1 n (5.27) Με προσαρμογή των πρωτογενών πειραματικών δεδομένων στην Εξίσωση 5.27 έγινε μια εκτίμηση της τάξης της αντίδρασης, η οποία υπολογίστηκε ίση με 2,42. Στη συνέχεια υπολογίστηκε η ενέργεια ενεργοποίησης, E a για κάθε σταθερή πίεση επεξεργασίας από 100 έως 400 MPa, χρησιμοποιώντας την Εξίσωση (5.11) και -160-

201 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας την τιμή της τάξης της αντίδρασης που προσδιορίστηκε προηγουμένως (n=2,42). Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα 5.16 Πίνακας 5.16 Τιμές των Ε α (kj/mol) και ref T k (x10-3 min -1 ) όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.11) για n =2,42 και T ref = 343,16 K σε κάθε πίεση επεξεργασίας 100 MPa 200 MPa 300 MPa 400 MPa a E 140±43,7 113±14,6 101±14,3 141±23,9 T ref k 0,009±0,003 0,0110±0, ,0380±0,011 3,80±1,42 R 2 0,850 0,952 0,955 0,981 Ακολούθως, χρησιμοποιώντας τις τιμές των ενεργειών ενεργοποίησης που που παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.16 και της Εξίσωσης (5.21), προσδιορίστηκε με μη γραμμική παλινδρόμηση ο διορθωμένος χρόνος για κάθε συνδυασμό πίεσης και θερμοκρασίας επεξεργασίας. Ως θερμοκρασία αναφοράς στην οποία έγινε η αναγωγή των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε η μέση τιμή της θερμοκρασίας κάθε συνθήκης επεξεργασίας, όπως παρουσιάζονται στον Πίνακα Αφού προσδιορίστηκαν οι διορθωμένοι χρόνοι, η εξάρτηση της μείωσης της ενεργότητας του ενζύμου από την πίεση και τη θερμοκρασία επεξεργασίας περιγράφηκε μέσω της Εξίσωσης (5.28): ( ) ( ) ( ) n ref a ref a ref ref a ref a ref n t T P P R V T T R E k t T P P R V T T R E k n A A = 1 1 * * exp 1 1 exp 1 (5.28) Όπου Τ ref =343,16 K και P ref =300 MPa. Με μη γραμμική παλινδρόμηση και χρησιμοποιώντας τα πειραματικά δεδομένα, προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι της Εξίσωσης (5.28). Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.17.

202 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Πίνακας 5.17 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.28) για την απενεργοποίηση της PG υβριδίου Red Sea σε διάφορες συνθήκες πίεσης ( MPa) και θερμοκρασίας (41-75 C) για Τ ref =343,16 K (70 C) και P ref =300 MPa. (R 2 =0,955) Παράμετρος Τιμή 95 % Διάστημα εμπιστοσύνης Κατώτερο όριο Ανώτερο όριο n 2,49 1,93 3,05 k (min -1 ) 0,230x ,520x10-4 0,990x10-4 ref 1 E a 1 (kj/mol) V a 1 (ml/mol) ,9 k ref 2 (min -1 ) 0,0516x ,110x10-4 0,210x10-4 E a 2 (kj/mol) ,4 128 V a 2 (ml/mol) 1,49-10,2 13,2 Στο Σχήμα 5.26 απεικονίζεται η συσχέτιση μεταξύ των πειραματικών και των προβλεπόμενων από την Εξίσωση (5.28) τιμών της ενεργότητας της PG. 700 Προβλεπόμενες τιμές Α (U/mL) Πειραματικές τιμές Α (U/mL) 100 MPa 200 MPa 300 MPa 400 MPa Σχήμα 5.26 Σύγκριση των πειραματικών και προβλεπόμενων τιμών της ενεργότητας της PG κατά την επεξεργασία χυμού τομάτας υβριδίου Red Sea σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων ( MPa) και θερμοκρασιών (41-75 C) -162-

203 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Στο Σχήμα 5.26 φαίνεται ότι η συσχέτιση μεταξύ των πειραματικών και των προβλεπόμενων τιμών της ενεργότητας της PG υπήρξε πολύ καλή. Για σταθερή τιμή της τάξης της αντίδρασης n και ίση με 2,49, όπως υπολογίστηκε προηγουμένως, και προσαρμόζοντας την Εξίσωση (5.10) στα πειραματικά δεδομένα, προσδιορίστηκαν οι σταθερές του ρυθμού απενεργοποίησης της PG σε κάθε συνθήκη επεξεργασίας (Πίνακας 5.18). Στο Σχήμα 5.27 απεικονίζεται η μείωση της ενζυμικής ενεργότητας συναρτήσει του ισοδύναμου χρόνου στις μελετώμενες συνθήκες επεξεργασίας. 1,0 (α) 1,0 (β) 0,8 0,8 A/Ao 41 C 0,6 54 C 66 C 0,4 74 C 41 C 0,2 54 C 66 C 74 C 0, A/Ao 0,6 43 C 53 C 67 C 0,4 74 C 43 C 0,2 53 C 67 C 74 C 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) Διορθωμένος χρόνος, t* (min) 1,0 (γ) 1,0 (δ) A/Ao 0,8 0,6 42 C 54 C 67 C 0,4 75 C 42 C 0,2 54 C 67 C 75 C 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) A/Ao 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) 45 C 58 C 67 C 45 C 58 C 67 C Σχήμα 5.27 Εξάρτηση της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας της PG Red Sea από το διορθωμένο χρόνο διεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία ίση με τη μέση τιμή της θερμοκρασίας εκτέλεσης των πειραμάτων και πίεση επεξεργασίας (α) 100 MPa, (β) 200 MPa, (γ) 300 MPa και (δ) 400 MPa. Οι καμπύλες αντιπροσωπεύουν την προσαρμογή της Εξίσωσης (5.10) στα πειραματικά δεδομένα -163-

204 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Πίνακας 5.18 Σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea, k, (x10-5 min -1 ) όπως υπολογίστηκε από την Εξίσωση (5.10) για n=2,49 και τους διορθωμένους χρόνους διεργασιών P (MPa) T ( C) k (x 10-5 min -1 ) R , 612±0, 302 0, ,21±0,249 0, ,106±0, , ,597±0,311 0, ,602±0,223 0, ,111±0,0499 0, ,801±0,197 0, ,21±0,803 0, ,33±0,899 0, ,51± 1,65 0, ,6±19,4 0, ±11,5 0,920 Οι καμπύλες αντιπροσωπεύουν την προσαρμογή της Εξίσωσης (5.10) στα πειραματικά δεδομένα. Παρατηρούμε ότι αύξηση της θερμοκρασίας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου, σε όλα τα επίπεδα πιέσεων που μελετήθηκαν, ενώ με αύξηση της πίεσης από 100 σε 200 MPa σε σταθερή θερμοκρασία 74 C παρατηρήθηκε μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης της PG (Πίνακας 5.18). Η εξάρτηση της απενεργοποίησης της PG από τη θερμοκρασία για σταθερή πίεση επεξεργασίας εκφράστηκε μέσω της ενέργειας ενεργοποίησης. Με προσαρμογή της Εξίσωσης (5.11) στα πειραματικά δεδομένα και μη γραμμική παλινδρόμηση, υπολογίστηκαν οι τιμές της ενέργειας ενεργοποίησης για κάθε επίπεδο πιέσεων επεξεργασίας που μελετήθηκαν. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρουσιάζονται στον Πίνακα

205 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Πίνακας 5.19 Τιμές των Ε α (kj/mol) και k T ref (x10-3 min -1 ) για την απενεργοποίηση της PG υβριδίου Red Sea όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.11) για n =2,49 και T ref = 343,16 K σε κάθε πίεση επεξεργασίας 100 MPa 200 MPa 300 MPa 400 MPa E a 142±44,1 98,1±16,5 103±15,5 162±21,6 k 0,006±0,002 0,005±0,002 0,0260±0,008 4,44±1,47 T ref R 2 0,851 0,936 0,952 0,984 Παρατηρούμε ότι αύξηση της πίεσης από τα 100 στα 200 MPa οδήγησε σε μείωση της ενέργειας ενεργοποίησης, μεταξύ 200 και 300 MPa παρέμεινε σταθερή, ενώ περαιτέρω αύξηση της πίεσης στα 400 MPa είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της ενέργειας ενεργοποίησης. Η συμπεριφορά αυτή απεικονίζεται στο Σχήμα P (MPa) E a (kj/mol) P-P ref (MPa) Σχήμα 5.28 Εξάρτηση της ενέργειας ενεργοποίησης από την πίεση επεξεργασίας για την PG υβριδίου Red Sea -165-

206 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Ωστόσο, όπως φαίνεται στο παραπάνω Σχήμα, το τυπικό σφάλμα της πρόβλεψης της ενέργειας ενεργοποίησης στα 100 MPa (± 44,1 kj/mol) είναι αρκετά μεγάλο. Η παρατήρηση αυτή σε συνδυασμό με το χαμηλό συντελεστή προσαρμογής, R 2 (0,851), της Εξίσωσης 5.11 στα πειραματικά δεδομένα, μας οδηγεί στον ισχυρισμό ότι η ενέργεια ενεργοποίησης παραμένει σταθερή στο εύρος πιέσεων MPa και στη συνέχεια αρχίζει και αυξάνεται. Παρόμοια συμπεριφορά έχει αναφερθεί και από τους Fachin et al. (2003), οι οποίοι υπολόγισαν τιμές της ενέργειας ενεργοποίησης ίσες με 82, 50, 89, 108 και 84 kj/mol σε πιέσεις 350, 400, 450, 500 και 550 MPa αντίστοιχα. Οι συγκεκριμένοι ερευνητές θεώρησαν ότι η ενέργεια ενεργοποίησης παρέμεινε πρακτικά σταθερή στις υψηλές πιέσεις επεξεργασίας. Η συμπεριφορά αυτή βρίσκεται σε αντίθεση με τα αντίστοιχα αποτελέσματα που προέκυψαν για την PG υβριδίου Oval Red, όπου αύξηση της πίεσης οδήγησε σε αύξηση της E a, ενισχύοντας την άποψη ότι η διαφορετική πηγή προέλευσης του ενζύμου χαρακτηρίζεται και από διαφορετική συμπεριφορά κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ. Ακολούθως, συγκρίνοντας τις τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης κατά την επεξεργασία σε συνθήκες ΥΥΠ με τις αντίστοιχες τιμές που υπολογίστηκαν κατά τη θερμική απενεργοποίηση του ενζύμου σε ατμοσφαιρική πίεση, παρατηρούμε ότι στη δεύτερη περίπτωση η σταθερά k έλαβε χαμηλότερες τιμές, υποδηλώνοντας ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση της PG. Ωστόσο, επειδή η τάξη της αντίδρασης στις δύο περιπτώσεις είναι διαφορετική, 1,82 κατά τη θερμική επεξεργασία και 2,49 κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ, τα αποτελέσματα δεν είναι πλήρως συγκρίσιμα. Για το λόγο αυτό και προκειμένου να αναπτυχθεί ένα γενικευμένο μοντέλο που θα περιγράφει το σύνολο των πειραματικών δεδομένων, για τον προσδιορισμό των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.28) συμπεριλήφθηκαν και τα πειραματικά δεδομένα της θερμικής απενεργοποίησης της PG σε ατμοσφαιρική πίεση και υπολογίστηκαν εκ νέου οι κινητικές παράμετροί της. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα

207 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Πίνακας 5.20 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.28) για την απενεργοποίηση της PG υβριδίου Red Sea σε συνθήκες πίεσης 0,1 400 MPa και θερμοκρασία C για Τ ref =333,16 K (65 C) και P ref =250 MPa. R 2 =0,941 Παράμετρος Τιμή 95 % Διάστημα εμπιστοσύνης Κατώτερο όριο Ανώτερο όριο n 1,82 1,43 2,22 k ref 1 (min -1 ) 0,146x ,203x10-3 0,495x10-3 E a 1 (kj/mol) 93,0 80,1 106 V a 1 (ml/mol) -72,2-82,3-62,0 k ref 2 (min -1 ) 0,012x ,016x10-3 0,04x10-3 E a 2 (kj/mol) V a 2 (ml/mol) 34,4 25,5 43,3 Συγκρίνοντας τις Εξισώσεις (5.10) και (5.28) προκύπτει η Εξίσωση (5.29): k ref k = + k 1 Ea1 exp R ref 2 Ea2 exp R 1 1 T Tref 1 1 T Tref Va 1 R Va 2 R ( P P ) T ref ( P P ) T ref + (5.29) Χρησιμοποιώντας τις τιμές των παραμέτρων που παρατίθενται στον Πίνακα 5.20 στην Εξίσωση (5.29), προσδιορίστηκαν οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης σε σταθερή θερμοκρασία και διαφορετικές πιέσεις. Η εξάρτηση του k από την πίεση σε σταθερή θερμοκρασία επεξεργασίας απεικονίζεται στο Σχήμα Όπως φαίνεται και στο Σχήμα 5.29 αύξηση της πίεσης από την ατμοσφαιρική στα 100 MPa είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης της PG, σε όλα τα επίπεδα θερμοκρασιών. Ο ρυθμός απενεργοποίησης εμφάνισε ελάχιστη τιμή στα 200 MPa, ενώ περαιτέρω αύξηση της πίεσης οδήγησε σε αύξηση του -167-

208 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός ρυθμού απενεργοποίησης. Η ανταγωνιστική δράση της πίεσης έναντι της θερμοκρασίας ήταν εντονότερη στην περιοχή υψηλών θερμοκρασιών (Τ>65 C) και χαμηλών πιέσεων (0,1 MPa< P <100 MPa). Σε πιέσεις 300 και 400 MPa ο ρυθμός απενεργοποίησης εμφάνισε μεγαλύτερες τιμές σε σχέση με την ατμοσφαιρική πίεση. k (min -1 ) 0,010 0,008 0,006 0, C 45 C 50 C 55 C 60 C 65 C 70 C 75 C 0,002 0, P (MPa) Σχήμα 5.29 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Red Sea από την πίεση επεξεργασίας σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας, όπως προσδιορίστηκε από την Εξίσωση (5.29) και τις τιμές του Πίνακα

209 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Κινητική μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στην PME βιομηχανικής τομάτας Η απενεργοποίηση της πηκτινομεθυλεστεράσης βρέθηκε ότι ακολουθεί κινητική 1 ης τάξης σε όλες τις συνθήκες επεξεργασίας που μελετήθηκαν, τόσο κατά τη θερμική επεξεργασία όσο και κατά την επεξεργασία με υπερυψηλή πίεση. Για να περιγραφεί η απενεργοποίηση του ενζύμου στις συνθήκες που μελετήθηκαν, χρησιμοποιήθηκε η Εξίσωση (5.1). Το ίδιο μοντέλο έχει χρησιμοποιηθεί και από άλλους ερευνητές για να περιγράψει την απενεργοποίηση της PME προερχόμενης από τομάτα (Crelier et al., 2001; Stoforos et al., 2002) και άλλα φρούτα όπως π.χ. από πορτοκάλι, ροδάκινο, λωτό κ.α. (Polydera et al., 2004; Boulekou et al., 2008; Katsaros et al., 2008). Κινητική 1 ης τάξης έχει επίσης προταθεί και για την απενεργοποίηση διαφορετικών ενζύμων όπως πχ. της PG από τομάτα (Fachin et al., 2003) και της πολυφαινολικής οξειδάσης από αβοκάντο (Weemaes et al., 1999) Θερμική απενεργοποίηση της PME βιομηχανικής τομάτας σε ατμοσφαιρική πίεση Η μείωση της ενεργότητας της PME υβριδίου Oval Red και Red Sea ως συνάρτηση του χρόνου επεξεργασίας κατά τη διάρκεια θερμικής επεξεργασίας στους 50, 60, 70 και 80 C παρουσιάζεται στο Σχήμα (5.30). Τα σημεία A/A0 1,0 0,8 0,6 (α) A/A0 1,0 0,8 0,6 (β) 50 C 60 C 70 C 80 C 0,4 50 C 60 C 0,2 70 C 80 C 0, Χρόνος (min) 0,4 0,2 0, Χρόνος (min) Σχήμα 5.30 Μείωση της ενεργότητας της PME υβριδίου (α) Oval Red και (β) Red Sea, συναρτήσει του χρόνου επεξεργασίας σε θερμοκρασία ( ) 50 C, ( ) 60 C, ( ) 70 C και ( ) 80 C -169-

210 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, ενώ οι καμπύλες την προσαρμογή της Εξίσωσης (5.1) σε αυτά. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.30 η PME και των δύο υβριδίων εμφανίστηκε ευαίσθητη στη θερμική επεξεργασία. Αύξηση της θερμοκρασίας οδήγησε σε υψηλότερους ρυθμούς απενεργοποίησης του ενζύμου και για τα δύο υβρίδια τομάτας. Με προσαρμογή της Εξίσωσης 5.1 στα πειραματικά δεδομένα υπολογίστηκαν οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME των δύο υβριδίων σε κάθε θερμοκρασία επεξεργασίας. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα Παρατηρούμε ότι η PME υβριδίου Red Sea παρουσίασε μεγαλύτερους ρυθμούς απενεργοποίησης από την PME υβριδίου Oval Red, σε θερμοκρασίες επεξεργασίας έως και 70 C, ενώ στη θερμοκρασία των 80 C η συμπεριφορά αυτή αντιστράφηκε, λόγω της διαφορετικής επίδρασης της θερμοκρασίας στο ρυθμό θερμικής απενεργοποίησης. Η εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης, k, από τη θερμοκρασία εκφράστηκε μέσω της εξίσωσης Arrhenius (Εξίσωση 5.2) και της ενέργειας ενεργοποίησης, E a, όπως φαίνεται στο Σχήμα Οι τιμές των ενεργειών ενεργοποίησης που υπολογίστηκαν με προσαρμογή της εξίσωσης 5.2 στα πειραματικά δεδομένα παρουσιάζονται επίσης στον Πίνακα Όπως φαίνεται από τις τιμές των ενεργειών ενεργοποίησης Ea, η θερμική απενεργοποίηση της PME υβριδίου Oval Red εμφάνισε μεγαλύτερη εξάρτηση από τη θερμοκρασία συγκριτικά με την PME υβριδίου Red Sea, υποδηλώνοντας ένα ένζυμο περισσότερο ευαίσθητο στις θερμοκρασιακές μεταβολές. Στο θερμοκρασιακό εύρος C οι τιμές της ενέργειας ενεργοποίησης που έχουν αναφερθεί για τη θερμική απενεργοποίηση της PME τομάτας, κυμαίνονται από 267 έως 477 kj/mol (Crelier et al. 2001; Anthon et al. 2002), υποδηλώνοντας ένζυμα περισσότερο ευαίσθητα στη θερμική επεξεργασίας, σε σύγκριση με τα εξεταζόμενα στην παρούσα διατριβή. Οι διαφορές μεταξύ των βιβλιογραφικά διαθέσιμων τιμών ενέργειας ενεργοποίησης και των παρατηρούμενων αποδίδονται στο γεγονός ότι χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές ποικιλίες τομάτας ή/και στο διαφορετικό περιβάλλον του ενζύμου (χυμός τομάτας ή ένζυμο σε καθαρή, εκχυλισμένη μορφή)

211 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Πίνακας 5.21 Κινητικές παράμετροι απενεργοποίησης της PME υβριδίου Oval Red και Red Sea κατά τη θερμική επεξεργασία χυμού τομάτας για T ref =343,16 Κ (70 C) Τ ( C) Oval Red Red Sea k (min -1 ) R 2 k (min -1 ) R ,00216±0, ,879 0,00931±0, , ,0109±0,0021 0,885 0,0226±0,0032 0, ,297±0,0181 0,982 0,517±0,0368 0, ,14±0,527 0,975 1,86±0,231 0,971 E a (kj/mol) 238±23,9 (R 2 =0,980) 180±29,0 (R 2 =0,951) k T ref (min -1 ) 0,258±0,0817 0,325±0,126 T( o C) Oval Red Red Sea k (min -1 ) , , , , , , , /T-1/Tref Σχήμα 5.31 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PΜΕ υβριδίου ( ) Oval Red και ( ) Red Sea από τη θερμοκρασία επεξεργασίας σε ατμοσφαιρική πίεση -171-

212 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Απενεργοποίηση της PME βιομηχανικής τομάτας σε συνθήκες ΥΥΠ Η κινητική μελέτη της απενεργοποίησης της PME από τη συνδυασμένη εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας, πραγματοποιήθηκε σε ισοβαρείς συνθήκες των 100, 600, 700 και 800 MPa, σε συνδυασμό με υψηλές θερμοκρασίες C. Η απενεργοποίησης της PME από την εφαρμογή της ΥΥΠ περιγράφηκε ικανοποιητικά από κινητική 1 ης τάξης. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, η αδιαβατική αύξηση της θερμοκρασίας κατά την εφαρμογή της πίεσης είχε ως αποτέλεσμα να καταγραφούν χρονοθερμοκρασιακά προφίλ μεταβαλλόμενης θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια των πειραμάτων. Για το λόγο αυτό έγινε διόρθωση του χρόνου επεξεργασίας, ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφηκε αναλυτικά προηγουμένως για την απενεργοποίηση της PG και παρουσιάστηκε συνοπτικά στο Σχήμα Για κάθε χρόνο δειγματοληψίας υπολογίστηκε η μέση τιμή της θερμοκρασίας, T avg, στο συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Στον Πίνακα 5.22 παρουσιάζονται οι τιμές της επιδιωκόμενης και της μέσης τιμής της θερμοκρασίας διεξαγωγής των πειραμάτων. Οι πειραματικές τιμές της εναπομένουσας ενζυμικής ενεργότητας της PME σε κάθε συνδυασμό πίεσης και θερμοκρασίας επεξεργασίας, καθώς και η τιμή της μέσης θερμοκρασίας χρησιμοποιήθηκαν για κάθε σταθερή πίεση επεξεργασίας και μέσω της Εξίσωσης (5.30) υπολογίστηκε η ενέργεια ενεργοποίησης για κάθε πίεση επεξεργασίας. A A o E a 1 1 = exp k T exp t (5.30) ref R Tavg Tref όπου, Α (U/mL) η ενεργότητα του ενζύμου μετά από επεξεργασία για χρόνο t, A ο (U/mL) η ενεργότητα του ενζύμου στο χρόνο μηδέν της επεξεργασίας (t=0), (min -1 ) η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης σε θερμοκρασία αναφοράς T ref (343,16 K, 70 C), T avg (Κ) η μέση τιμή της θερμοκρασίας στο αντίστοιχο χρονοθερμοκρασιακό προφίλ του αντίστοιχου χρόνου διεργασίας, t (min). k T ref -172-

213 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Πίνακας 5.22 Επιδιωκόμενη και μέση τιμή θερμοκρασίας επεξεργασίας του χυμού τομάτας υβριδίων Oval Red και Red Sea σε κάθε πίεση Πίεση (MPa) Επιδιωκόμενη Μέση τιμή Τ( C) Τ( C) Oval Red Red Sea Στη συνέχεια κάνοντας χρήση των τιμών της ενέργειας ενεργοποίησης όπως προσδιορίστηκαν, στην Εξίσωση (5.21), υπολογίστηκε ο διορθωμένος χρόνος της διεργασίας στη θερμοκρασίας αναφοράς. Για τον υπολογισμό του διορθωμένου χρόνου, ως θερμοκρασία αναφοράς χρησιμοποιήθηκε η μέση θερμοκρασία των δοχείων πίεσης σε κάθε συνθήκη επεξεργασίας (Πίνακας 5.22). Χρησιμοποιώντας τις τιμές του διορθωμένου χρόνου, t * (min), υπολογίστηκε η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης σε κάθε συνθήκη επεξεργασίας από την Εξίσωση (5.1). Υβρίδιο Oval Red Στο Σχήμα 5.32 απεικονίζεται η μείωση της ενεργότητας της PME προερχόμενης από το υβρίδιο Oval Red, συναρτήσει του διορθωμένου χρόνου στους διάφορους συνδυασμούς ισοβαρών και ισοθερμοκρασιακών συνθηκών επεξεργασίας. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, ενώ οι καμπύλες την προσαρμογή της Εξίσωσης 5.1 σε αυτά. Όπως φαίνεται στο Σχήμα -173-

214 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός 5.32 η PME εμφανίστηκε ιδιαίτερα ανθεκτική στην εφαρμογή της πίεσης. Σε πίεση επεξεργασίας 100 MPa και θερμοκρασίες έως 71 C και για 93 min επεξεργασίας δεν παρατηρήθηκε απενεργοποίηση του ενζύμου. Σε υψηλότερες πιέσεις MPa και για θερμοκρασίες επεξεργασίας C απαιτήθηκαν αρκετά μεγάλοι χρόνοι (έως 60 min) ώστε να επιτευχθεί μείωση της ενεργότητας της PME σε ποσοστό 40%. Ο μεγαλύτερος ρυθμός απενεργοποίησης επιτεύχθηκε σε ιδιαίτερα έντονες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας επεξεργασίας (Σχήμα 5.32 (δ)). 1,0 (α) 1,0 (β) 0,8 0,8 A/Ao 0,6 0,4 0,2 61 C 71 C 81 C 61 C 71 C 81 C 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) A/Ao 0,6 0,4 0,2 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) 66 C 75 C 89 C 66 C 75 C 89 C 1,0 (γ) 1,0 (δ) 0,8 0,8 A/Ao 0,6 0,4 0,2 63 C 73 C 63 C 73 C 0, A/Ao 0,6 0,4 0,2 67 C 76 C 91 C 67 C 76 C 91 C 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) Διορθωμένος χρόνος, t* (min) Σχήμα 5.32 Μείωση της ενεργότητας της PME υβριδίου Oval Red συναρτήσει του διορθωμένου χρόνου επεξεργασίας σε σταθερό χρονοθερμοκρασιακό προφίλ και πιέσεις (α) 100 MPa, (β) 600 MPa, (γ) 700 MPa και (δ) 800 MPa. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν τα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες την προσαρμογή της εξίσωσης (5.1) σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης την τυπική απόκλιση των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου -174-

215 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Στον Πίνακα 5.23 παρουσιάζονται οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου για τις διάφορες συνθήκες επεξεργασίας, όπως υπολογίστηκαν με προσαρμογή της Εξίσωσης 5.1 στα πειραματικά δεδομένα. Για τις συνθήκες επεξεργασίας που δεν εμφανίζονται στον Πίνακα 5.23, όπου πρακτικά δεν παρατηρήθηκε απενεργοποίηση του ενζύμου, δεν υπολογίστηκαν τιμές για τη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης. Παρατηρούμε ότι αύξηση της θερμοκρασίας σε συνθήκες σταθερής πίεσης επεξεργασίας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης της PME. Η εξάρτηση της απενεργοποίησης από τη θερμοκρασία εκφράστηκε μέσω της ενέργειας ενεργοποίσης, E a. Με προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων στην Εξίσωση 5.7 υπολογίστηκε η ενέργεια ενεργοποίησης σε κάθε πίεση επεξεργασίας. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα Παρατηρούμε ότι αύξηση της πίεσης από τα 100 στα 600 MPa είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της ενέργειας ενεργοποίησης, ενώ περαιτέρω αύξηση της πίεσης δεν οδήγησε σε σημαντική μεταβολή της E a. Πίνακας 5.23 Σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης, k (x10-2 min -1 ), της PME υβριδίου Oval Red κατά την επεξεργασία σε συνθήκες ΥΥΠ, όπως υπολογίστηκαν με προσαρμογή της Εξίσωσης (5.1) στα πειραματικά δεδομένα και τους διορθωμένους χρόνους διεργασιών P (MPa) T( C) k (x10-2 min -1 ) R ,130±0,0418 0, ,18±0,0304 0, ,241±0,0626 0, ,776±0,0591 0, ,29±1,88 0, ±0,257 0, ,566±0,142 0, ,786±0,181 0, ,16±0,0227 0,

216 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Πίνακας 5.24 Τιμές των Ε α (kj/mol) και k T ref ( x10-2 min -1 ) για την απενεργοποίηση της PME υβριδίου Oval Red όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.30) για T ref =343,16 K (70 C) σε κάθε πίεση επεξεργασίας 100 MPa 600 MPa 700 MPa 800 MPa E a 188±49,9 147±47,7 124±20,5 135±31,8 k 0,149± ,355±0,275 0,278±0,102 0,502±0,245 T ref R 2 0,979 0,933 0,774 0,844 Συγκρίνοντας τις τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME κατά τη θερμική επεξεργασία σε σταθερή πίεση (0,0109, 0,297 και 3,14 min -1 σε θερμοκρασία επεξεργασίας 60, 70 και 80 C, αντίστοιχα), με τις αντίστοιχες τιμές κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ, που παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.23, φαίνεται ότι κατά την επεξεργασία με συνδυασμένη εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας παρατηρήθηκαν μικρότεροι ρυθμοί απενεργοποίησης σε σύγκριση με τη θερμική επεξεργασία του ενζύμου σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης, υποδηλώνοντας ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση του ενζύμου. Όπως έχει ήδη προαναφερθεί, ανταγωνιστική δράση της πίεσης έναντι της θερμοκρασίας παρατηρήθηκε στην περίπτωση της PME ποικιλίας Cherrelino, αλλά και για την PG υβριδίου Red Sea. Προκειμένου να περιγραφεί η συμπεριφορά της PME κατά τη συνδυασμένη επεξεργασία με ΥΥΠ και θέρμανση στο εύρος των συνθηκών που μελετήθηκαν και λαμβάνοντας υπόψη την ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας, η εναπομένουσα ενζυμική ενεργότητα σε διάφορες ισοβαρείς και ισοθερμοκρασιακές συνθήκες περιγράφηκε από την Εξίσωση 5.3. Χρησιμοποιώντας τα πειραματικά δεδομένα ενζυμικής ενεργότητας της PME που μετρήθηκαν μετά από επεξεργασία σε πιέσεις 0,1, 100, 600, 700 και 800 MPa και διάφορες θερμοκρασίες C, προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι της Εξίσωσης (5.3) μέσω μη γραμμικής παλινδρόμησης. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα

217 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας Πίνακας 5.25 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.30) για την απενεργοποίηση της PΜΕ υβριδίου Oval Red σε διάφορες συνθήκες πίεσης (0,1 800 MPa) και θερμοκρασίας (50-91 C) για Τ ref =358,16 K (85 C) και P ref =100 MPa. R 2 (πειραματικών σε σχέση με τις προβλεπόμενες τιμές) = 0,937 Παράμετρος Τιμή 95 % Διάστημα εμπιστοσύνης Κατώτερο όριο Ανώτερο όριο k ref 1 (min -1 ) 0,0167 0, ,0280 E a 1 (kj/mol) V a 1 (ml/mol) -2,93-6,20 0,337 k ref 2 (min -1 ) 0, ,0173 0,0281 E a 2 (kj/mol) V a 2 (ml/mol) ,2 Προβλεπόμενες τιμές Α/Αο 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0.1 MPa 100 MPa 600 MPa 700 MPa 800 MPa 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Πειραματικές τιμές Α/Αο Σχήμα 5.33 Σύγκριση των πειραματικών και προβλεπόμενων τιμών Α/Α ο της PME κατά τη διάρκεια επεξεργασίας χυμού τομάτας υβριδίου Oval Red σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων (0,1-800 MPa) και θερμοκρασιών (50-91 C) -177-

218 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Στο Σχήμα 5.33 απεικονίζεται η συσχέτιση μεταξύ των πειραματικών και των προβλεπόμενων από την Εξίσωση (5.3) τιμών της ενεργότητας του ενζύμου, όπου φαίνεται ότι η συσχέτιση μεταξύ τους υπήρξε πολύ καλή. Χρησιμοποιώντας την Εξίσωση 5.4 και τις τιμές του Πίνακα 5.25, υπολογίστηκαν οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων και θερμοκρασιών. Στο Σχήμα 5.34 απεικονίζεται η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PME ως συνάρτηση της πίεσης και της θερμοκρασίας, όπου φαίνεται η ανταγωνιστικη δράση των δύο παραμέτρων στην απενεργοποίηση της PME. Με αύξηση της πίεσης από την ατμοσφαιρική στα 100 MPa παρατηρήθηκε μείωση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου. Περαιτέρω αύξηση της πίεσης και για θερμοκρασίες επεξεργασίας έως 70 C δεν επέφερε σημαντική μεταβολή στο ρυθμό απενεργοποίησης της PMΕ, ενώ σε μεγαλύτερες θερμοκρασίες αύξηση της πίεσης από τα 100 στα 800 MPa οδήγησε k (min -1 ) 0,20 0,15 0,10 60 C 65 C 70 C 75 C 80 C 85 C 90 C 0,05 0, P (MPa) Σχήμα 5.34 Επίδραση της πίεσης στη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PME υβριδίου Oval Red σε διαφορετικές θερμοκρασίες, όπως περιγράφηκε από την Εξίσωση (5.3) -178-

219 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας σε αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης. Ωστόσο, ακόμα και σε έντονες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας επεξεργασίας οι ρυθμοί απενεργοποίησης που παρατηρήθηκαν ήταν μικρότεροι από τους αντίστοιχους ρυθμούς σε ατμοσφαιρική πίεση. Υβρίδιο Red Sea Η μείωση της ενζυμικής ενεργότητας της PME υβριδίου Red Sea συναρτήσει των διορθωμένων χρόνων κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ απεικονίζεται στο Σχήμα Τα σύμβολα αντιστοιχούν στα πειραματικά δεδομένα, οι καμπύλες 1,0 (α) 1,0 (β) 0,8 0,8 A/Ao 0,6 61 C 0,4 70 C 81 C 61 C 0,2 70 C 81 C 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) A/Ao 0,6 65 C 0,4 75 C 89 C 0,2 65 C 75 C 89 C 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) 1,0 (γ) 1,0 (δ) 0,8 0,8 A/Ao 0,6 0,4 0,2 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) 63 C 73 C 63 C 73 C A/Ao 0,6 67 C 0,4 76 C 90 C 0,2 67 C 76 C 90 C 0, Διορθωμένος χρόνος, t* (min) Σχήμα 5.35 Μείωση της ενεργότητας της PME υβριδίου Red Sea συναρτήσει του διορθωμένου χρόνου επεξεργασίας σε σταθερό χρονοθερμοκρασιακό προφίλ και πιέσεις (α) 100 MPa, (β) 600 MPa, (γ) 700 MPa και (δ) 800 MPa -179-

220 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός στην προσαρμογή της εξίσωσης 5.1 σε αυτά και οι μπάρες διακύμανσης αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση των μετρήσεων ενεργότητας του ενζύμου. Παρατηρούμε ότι και σε αυτή την περίπτωση η PME παρουσιάστηκε ιδιαίτερα ανθεκτική στην εφαρμογή πίεσης. Για πιέσεις επεξεργασίας 100 και 600 MPa και θερμοκρασία μέχρι και 75 C δεν παρατηρήθηκε μείωση της ενεργότητας του ενζύμου, ενώ σε πιέσεις επεξεργασίας 700 και 800 MPa απαιτήθηκαν θερμοκρασίες από 73 έως 76 C σε συνδυασμό με μεγάλους χρόνους επεξεργασίας (έως 50 min) για τη μερική μόνο απενεργοποίηση του ενζύμου. Μεγαλύτεροι ρυθμοί απενεργοποίησης παρατηρήθηκαν σε θερμοκρασίες επεξεργασίας μεγαλύτερες των 80 C σε όλα τα επίπεδα πιέσεων που μελετήθηκαν. Οι χρόνοι επεξεργασίας που απαιτήθηκαν για την απενεργοποίηση του ενζύμου σε ποσοστό περίπου 80% ήταν μεγαλύτεροι των 10 min. Στον Πίνακα 5.26 παρουσιάζονται οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης όπως υπολογίστηκαν από την Εξίσωση 5.1 με προσαρμογή της στα πειραματικά δεδομένα ενζυμικής ενεργότητας συναρτήσει των διορθωμένων χρόνων επεξεργασίας. Αύξηση της θερμοκρασίας σε συνθήκες σταθερής πίεσης επεξεργασίας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου. Στις περιπτώσεις όπου δεν παρατηρήθηκε Πίνακας 5.26 Σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης, k (x10-2 min -1 ), της PME υβριδίου Red Sea κατά την επεξεργασία σε συνθήκες ΥΥΠ, όπως υπολογίστηκαν με προσαρμογή της Εξίσωσης (5.1) στα πειραματικά δεδομένα και τους διορθωμένους χρόνους διεργασιών P (MPa) T( C) k (x10-2 min -1 ) R ,967 ± 0,149 0, ,359 ± 0,0749 0, ,363 ± 0,0742 0, ,55 ±,565 0, ,718 ± 0,0611 0, ,472 ± 0,0343 0, ,12 ± 0,279 0, ,27 ± 0,105 0,

221 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας απενεργοποίηση του ενζύμου, δεν υπολογίστηκαν τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης. Η εξάρτηση της απενεργοποίησης από τη θερμοκρασία εκφράστηκε μέσω της ενέργειας ενεργοποίησης, Ε a, και τη σχέση του Arrhenius (Εξίσωση 5.30). Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα Όπως φαίνεται στον Πίνακα 5.27 αύξηση της πίεσης από 100 σε 600 MPa οδήγησε σε μείωση της ενέργειας ενεργοποίησης, ενώ επιπλέον αύξηση της πίεσης δεν επηρέασε την ενέργεια ενεργοποίησης. Πίνακας 5.27 Τιμές των Ε α (kj/mol) και k T ref (x10-2 min -1 ) για την απενεργοποίηση της PME υβριδίου Red Sea όπως προσδιορίστηκαν από την Εξίσωση (5.30) για T ref =343,16 K (70 C) σε κάθε πίεση επεξεργασίας 100 MPa 600 MPa 700 MPa 800 MPa E a 242±99,1 171±58,2 200± ±38,7 k 0,0794±0,0297 0,147±0,0873 0,407± 0,328±0,177 T ref R 2 0,912 0,871 0,940 0,870 Συγκρίνοντας τις τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME κατά τη θερμική επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση που παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.21 (0,0226, 0,517 και 1,86 min -1 σε θερμοκρασία επεξεργασίας 60, 70 και 80 C, αντίστοιχα), με τις αντίστοιχες τιμές κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ, που παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.26, φαίνεται ότι κατά την επεξεργασία με συνδυασμένη εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας παρατηρήθηκαν μικρότεροι ρυθμοί απενεργοποίησης σε σύγκριση με τη θερμική επεξεργασία του ενζύμου σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης, υποδηλώνοντας, ομοίως με προηγουμένως, ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση του ενζύμου. Για να περιγραφεί η συμπεριφορά της PME υβριδίου Red Sea κατά τη συνδυασμένη επεξεργασία με ΥΥΠ και θέρμανση στο εύρος των συνθηκών που μελετήθηκαν και λαμβάνοντας υπόψη την ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της -181-

222 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός θερμοκρασίας, η εναπομένουσα ενζυμική ενεργότητα σε διάφορες ισοβαρείς και ισοθερμοκρασιακές συνθήκες περιγράφηκε από την Εξίσωση 5.3. Χρησιμοποιώντας τα πειραματικά δεδομένα ενζυμικής ενεργότητας της PME που μετρήθηκαν μετά από επεξεργασία σε πιέσεις 0,1, 100, 600, 700 και 800 MPa και διάφορες θερμοκρασίες C, προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι της Εξίσωσης (5.3) μέσω μη γραμμικής παλινδρόμησης. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών παρατίθενται στον Πίνακα Στο Σχήμα 5.36 απεικονίζεται η συσχέτιση μεταξύ των πειραματικών και των προβλεπόμενων από την Εξίσωση (5.3) τιμών της εναπομένουσας ενεργότητας του ενζύμου, όπου φαίνεται ότι η συσχέτιση μεταξύ τους υπήρξε πολύ καλή. Πίνακας 5.28 Προσδιορισμός των παραμέτρων της Εξίσωσης (5.3) για την απενεργοποίηση της PΜΕ υβριδίου Red Sea σε διάφορες συνθήκες πίεσης (0,1 800 MPa) και θερμοκρασίας (50-90 C) για Τ ref =358,16 K (85 C) και P ref =100 MPa. R 2 (πειραματικών σε σχέση με τις προβλεπόμενες τιμές) = 0,904 Παράμετρος Τιμή 95 % Διάστημα εμπιστοσύνης Κατώτερο όριο Ανώτερο όριο k ref 1 (min -1 ) 0, , ,00920 E a 1 (kj/mol) V a 1 (ml/mol) -9,44-15,5-3,41 k ref 2 (min -1 ) 0,0173 0, ,0272 E a 2 (kj/mol) V a 2 (ml/mol) Χρησιμοποιώντας την Εξίσωση 5.4 και τις τιμές του Πίνακα 5.28, υπολογίστηκαν οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων και θερμοκρασιών. Στο Σχήμα 5.37 απεικονίζεται η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PME ως συνάρτηση της πίεσης και της θερμοκρασίας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.37, με αύξηση της πίεσης από την -182-

223 Επεξεργασία βιομηχανικής τομάτας ατμοσφαιρική στα 100 MPa παρατηρήθηκε μείωση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου. Περαιτέρω αύξηση της πίεσης και για θερμοκρασίες επεξεργασίας έως 75 C δεν επέφερε σημαντική μεταβολή στο ρυθμό απενεργοποίησης της PMΕ, ενώ σε μεγαλύτερες θερμοκρασίες αύξηση της πίεσης από τα 100 στα 800 MPa οδήγησε σε αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου. Επιπλέον, μετά από κάθε επεξεργασία με συνδυασμένη εφαρμογή ΥΥΠ και θέρμανσης, ακόμα και σε έντονες συνθήκες, οι ρυθμοί απενεργοποίησης που παρατηρήθηκαν ήταν μικρότεροι από τους αντίστοιχους ρυθμούς σε ατμοσφαιρική πίεση. 1,2 Προβλεπόμενες τιμές Α/Αο 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0.1 MPa 100 MPa 600 MPa 700 MPa 800 MPa 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Πειραματικές τιμές Α/Αο Σχήμα 5.36 Σύγκριση των πειραματικών και προβλεπόμενων τιμών Α/Α ο της PME κατά τη διάρκεια επεξεργασίας χυμού τομάτας υβριδίου Red Sea σε διάφορους συνδυασμούς πιέσεων (0,1-800 MPa) και θερμοκρασιών (50-90 C) -183-

224 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός k (min -1 ) 0,20 0,15 0,10 60 C 65 C 70 C 75 C 80 C 85 C 90 C 0,05 0, P (MPa) Σχήμα 5.37 Επίδραση της πίεσης στη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης της PME υβριδίου Red Sea σε διαφορετικές θερμοκρασίες, όπως περιγράφηκε από την Εξίσωση (5.33) -184-

225 Συγκριτικά αποτελέσματα μεταξύ των μελετώμενων υβριδίων 5.3 Συγκριτική μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας στα ένζυμα των διαφορετικών υβριδίων τομάτας Με την ολοκλήρωση της κινητικής μελέτης απενεργοποίησης των ενζύμων κατά τη θερμική επεξεργασία και την επεξεργασία με ΥΥΠ, κρίθηκε απαραίτητη η σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ των δύο ενζύμων και μεταξύ των διαφορετικών υβριδίων τομάτας που μελετήθηκαν Συγκριτκά αποτελέσματα κατά τη θερμική επεξεργασία Στο Σχήμα 5.38 απεικονίζεται ο ρυθμός απενεργοποίησης της PME και PG των τριών μελετηθέντων υβριδίων κατά τη θερμική επεξεργασία χυμού τομάτας στους 60 και 80 C. Παρατηρούμε ότι η PME υβριδίου Oval Red εμφανίστηκε πιο ανθεκτική κατά τη θερμική επεξεργασία στους 60 C σε σχέση με την PME των άλλων δύο υβριδίων, ενώ η PME ποικιλίας Cherrelino εμφάνισε τον πιο μεγάλο ρυθμό απενεργοποίησης στην ίδια θερμοκρασία επεξεργασίας (Σχήμα 5.38α). Αντιθέτως, A/Ao 1,0 0,8 0,6 (α) A/Ao 1,0 0,8 0,6 (β) Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino 0,4 Oval Red Red Sea Cherrelino 0,2 Oval Red Red Sea Cherrelino 0, Χρόνος (min) 0,4 0,2 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Χρόνος (min) Σχήμα 5.38 Σύγκριση των ρυθμών απενεργοποίησης της PME κατά τη θερμική επεξεργασία χυμού τομάτας των διαφορετικών υβριδίων στους (α) 60 C και (β) 80 C -185-

226 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός σε υψηλότερη θερμοκρασία επεξεργασίας η συμπεριφορά αυτή αντιστράφηκε. Έτσι, σε θερμοκρασία επεξεργασίας 80 C ο ρυθμός απενεργοποίησης της PME ποικιλίας Cherrelino παρουσίασε τη μικρότερη τιμή μεταξύ των μελετούμενων υβριδίων, ενώ η PME υβριδίου Oval Red απενεργοποίηθηκε με τον πιο γρήγορο ρυθμό. Στο Σχήμα 5.39 απεικονίζεται η εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME από τη θερμοκρασία επεξεργασίας. Παρατηρούμε ότι για Τ<74 C και Τ<62 C ο ρυθμός απενεργοποίησης της PME υβριδίου Red Sea παρουσιάστηκε περισσότερο ευαίσθητος στη θερμοκρασία από τον αντίστοιχο ρυθμό της PME υβριδίου Oval Red και Cherrelino, αντίστοιχα, ενώ για θερμοκρασίες επεξεργασίας μεγαλύτερες των 74 C και 62 C, αντίστοιχα, η συμπεριφορά αυτή αντιστράφηκε. Επιπλέον, συγκρίνοντας τις τιμές των ενεργειών ενεργοποίησης που υπολογίστηκαν για κάθε μια ποικιλία, συμπεραίνουμε ότι T ( C) Oval Red Red Sea Cherrelino lnk ,0002-0,0001 0,0000 0,0001 0,0002 0,0003 1/T-1/Tref Σχήμα 5.39 Εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης της PME από τη θερμοκρασία κατά τη θερμική επεξεργασία σε ατμοσφαιρική πίεση, χυμού τομάτας των τριών υβριδίων -186-

227 Συγκριτικά αποτελέσματα μεταξύ των μελετώμενων υβριδίων ο ρυθμός απενεργοποίησης της PME των υβριδίων Oval Red και Cherrelino, με τιμές της ενέργειας ενεργοποίησης ίσες με 238 και 244 kj/mol αντίστοιχα, παρουσίασε μεγαλύτερη εξάρτηση από τη θερμοκρασία συγκριτικά με την PME προερχόμενη από το υβρίδιο Red Sea, για την οποία η ενέργεια ενεργοποίησης υπολογίστηκε ίση με 180 kj/mol. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η PME υβριδίου Red Sea παρουσιάστηκε περισσότερο ανθεκτική στις θερμοκρασιακές μεταβολές, μεταξύ των τριών υβριδίων. Στο Σχήμα 5.40 απεικονίζεται η μείωση της ενεργότητας της PG κατά την επεξεργασία στους 60 C σε ατμοσφαιρική πίεση, για τα τρία υβρίδια τομάτας που μελετήθηκαν. Η PG υβριδίου Oval Red εμφανίστηκε ιδιαίτερα ανθεκτική κατά τη θερμική επεξεργασία στους 60 C, εφόσον δεν παρατηρήθηκε απενεργοποίηση του ενζύμου. Αντιθέτως στις άλλες δύο ποικιλίες, παρατηρήθηκε απενεργοποίηση της PG με παρόμοιους ρυθμούς. Εδώ αξίζει να σημειωθεί το γεγονός ότι, ενώ στο Σχήμα 5.40 φαίνεται ότι η PG των υβριδίων Red Sea και Cherrelino απενεργοποιήθηκε με 1,0 A/Ao 0,8 0,6 0,4 Oval Red Red Sea Cherrelino Oval Red Red Sea Cherrelino 0,2 0, Χρόνος (min) Σχήμα 5.40 Σύγκριση των ρυθμών απενεργοποίησης της PG των τριών μελετούμενων υβριδίων κατά την επεξεργασία στους 60 C σε ατμοσφαιρική πίεση -187-

228 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός παρόμοιο ρυθμό, αντίθετα οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου στη θερμοκρασία των 60 C υπολογίστηκαν ίσες με 0,909*10-3 min -1 και 0,0335 min -1 αντίστοιχα. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η τάξη της κινητικής απενεργοποίησης του ενζύμου στις δύο περιπτώσεις ήταν διαφορετική και ίση με 1,65 για την PG υβριδίου Red Sea και 1 για την PG της ποικιλίας Cherrelino. Κατά την επεξεργασία των αποτελεσμάτων παρατηρήθηκε ότι όσο μεγαλύτερη ήταν η τάξη της αντίδρασης υπολογίστηκαν μικρότερες τιμές για τη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης. Στο Σχήμα 5.41 παρουσιάζονται οι ρυθμοί θερμικής απενεργοποίησης των δύο ενζύμων PME και PG και για τις τρεις ποικιλίες-υβρίδια τομάτας που μελετήθηκαν. 1,0 (α) 1,0 (β) A/A0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 PME PG PME PG Χρόνος (min) A/A0 0,8 0,6 0,4 PME PG 0,2 PME PG 0, Χρόνος (min) 1,0 (γ) A/A0 0,8 0,6 PME PG PME PG 0,4 0,2 0, Χρόνος (min) Σχήμα 5.41 Σύγκριση των ρυθμών απενεργοποίησης των PME και PG κατά τη θερμική επεξεργασία χυμού τομάτας (α) υβριδίου Red Sea στους 70 C, (β) υβριδίου Oval Red στους 80 C και (γ) ποικιλίας Cherrelino στους 80 C -188-

229 Συγκριτικά αποτελέσματα μεταξύ των μελετώμενων υβριδίων Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.41α,β στην περίπτωση των υβριδίων Red Sea και Oval Red, κατά τη θερμική επεξεργασία στους 70 και 80 C αντίστοιχα, η PME απενεργοποιήθηκε με πιο γρήγορο ρυθμό από την PG. Η ίδια συμπεριφορά παρατηρήθηκε σε όλα τα επίπεδα θερμοκρασίας επεξεργασίας που μελετήθηκαν, επιβεβαιώνοντας τα βιβλιογραφικά δεδομένα που θέλουν να απαιτούνται εντονότερες συνθήκες θερμικής επεξεργασίας για την απενεργοποίηση της PME έναντι της PG. Αντίθετα στην περίπτωση της ποικιλίας Cherrelino, η PG απενεργοποιήθηκε με μεγαλύτερο ρυθμό σε σχέση με την PME στο εύρος των θερμοκρασιών που μελετήθηκαν (Σχήμα 5.41γ). Το γεγονός αυτό, ωστόσο, έρχεται σε αντίθεση με την υπάρχουσα βιβλιογραφία. Σε αυτή την περίπτωση θα παρουσίαζε ενδιαφέρον η περαιτέρω διερεύνηση του φαινομένου. Πιθανότατα η διαφοροποίηση αυτή της συγκεκριμένης ποικιλίας να οφείλεται στις διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες του χυμού έναντι των βιομηχανικών υβριδίων Συγκριτκά αποτελέσματα κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ Σε αντίθεση με τη θερμική επεξεργασία, κατά την επεξεργασία με συνδυασμένη εφαρμογή πίεσης και θερμοκρασίας, η PME εμφανίστηκε ιδιαίτερα ανθεκτική. Για όλες τις μελετώμενες ποικιλίες-υβρίδια τομάτας απαιτήθηκαν ιδιαίτερα έντονες συνθήκες επεξεργασίας για τη μερική μόνο απενεργοποίηση της PME. Στο Σχήμα 5.42 απεικονίζεται η εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME από την πίεση επεξεργασίας για σταθερή θερμοκρασία επεξεργασίας και ίση με 65 C και 80 C, όπως προβλέφθηκαν από το κινητικό μοντέλο (εξ. 5.4) που αναπτύχθηκε για τα υβρίδια Cherrellino, Oval Red και Red Sea. Και στις τρεις περιπτώσεις των υβριδίων τομάτας που μελετήθηκαν παρατηρήθηκε ανταγωνιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση της PME. Αύξηση της πίεσης από 0,1 έως 100 MPa είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού απενεργοποίησης, ο οποίος με περαιτέρω αύξηση της πίεσης άρχισε να αυξάνεται. Με αύξηση της θερμοκρασίας οι τιμές της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης αυξήθηκαν, με την PME προερχόμενη από το υβρίδιο Oval Red να εμφανίζει μεγαλύτερους ρυθμούς απενεργοποίησης

230 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Περισσότερο θερμοάντοχη στις χαμηλές θερμοκρασίες εμφανίστηκε η PME υβριδίου Red Sea (Σχήμα 5.42α), ενώ σε υψηλότερες θερμοκρασίες η PME ποικιλίας Cherrelino εμφάνισε τους μικρότερους ρυθμούς απενεργοποίησης (Σχήμα 5.42β). Σε αντίθεση με την PME, η PG εμφανίστηκε ιδιαίτερα ευαίσθητη στην εφαρμογή πίεσης. Πιέσεις επεξεργασίας μεγαλύτερες των 400 MPa οδήγησαν σε πλήρη απενεργοποίηση του ενζύμου σε όλα τα επίπεδα θερμοκρασιών και για τις τρεις ποικιλίες-υβρίδια τομάτας που μελετήθηκαν. Στο Σχήμα 5.43 απεικονίζεται η εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης της PG χυμού τομάτας Oval Red, Red Sea και Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία 40, 50, 60 και 70 C, όπως προσδιορίστηκαν από τα μαθηματικά μοντέλα που αναπτύχθηκαν (εξ. 5.26, 5.29 και 5.9, αντίστοιχα). Παρατηρούμε ότι αύξηση της πίεσης σε σταθερή θερμοκρασία επεξεργασίας οδήγησε σε αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης του ενζύμου, για κάθε πηγή προέλευσης αυτού και σε όλα τα επίπεδα θερμοκρασιών που μελετήθηκαν. Η PG ποικιλίας Cherrelino εμφάνισε τους μεγαλύτερους ρυθμούς απενεργοποίησης μεταξύ των μελετηθέντων ποικιλιών, σε όλα τα επίπεδα θερμοκρασιών. k (min -1 ) 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 (α) Oval Red Red Sea Cherrelino k (min -1 ) 0,10 0,08 0,06 0,04 (β) Oval Red Red Sea Cherrelino 0,001 0,02 0, P (MPa) 0, P (MPa) Σχήμα 5.42 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME υβριδίου Oval Red, Red Sea και ποικιλίας Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία επεξεργασίας (α) 65 C και (β) 80 C -190-

231 Συγκριτικά αποτελέσματα μεταξύ των μελετώμενων υβριδίων Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.43α η PG υβριδίου Oval Red παρουσιάστηκε περισσότερο θερμοάντοχη συγκριτικά με τις άλλες δύο ποικιλίες σε θερμοκρασία επεξεργασίας 40 C. Ωστόσο σε μεγαλύτερες θερμοκρασίες επεξεργασίας η συμπεριφορά αυτή άλλαξε. Έτσι, σε μεγαλύτερες θερμοκρασίες επεξεργασίας (> 50 C) (Σχήμα 5.43β,γ,δ) η PG υβριδίου Red Sea εμφανίστηκε περισσότερο θερμοάντοχη σε σχέση με τις άλλες δύο ποικιλίες. 0,010 (α) 0,020 (β) k (min -1 ) 0,008 0,006 0,004 Oval Red Red Sea Cherrelino k (min -1 ) 0,015 0,010 Oval Red Red Sea Cherrelino 0,002 0,005 0, P (MPa) 0, P (MPa) 0,08 (γ) 0,10 (δ) k (min -1 ) 0,06 0,04 Oval Red Red Sea Cherrelino k (min -1 ) 0,08 0,06 0,04 Oval Red Red Sea 0,02 0,02 0, P (MPa) 0, P (MPa) Σχήμα 5.43 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PG υβριδίου Oval Red, Red Sea και ποικιλίας Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία επεξεργασίας (α) 40 C, (β) 50 C, (γ) 60 C και (δ) 70 C -191-

232 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Τέλος ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η σύγκριση της συμπεριφοράς των δύο ενζύμων, PME και PG, κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ. Στο Σχήμα 5.44 παρουσιάζονται ενδεικτικά συγκριτικά αποτελέσματα απενεργοποίησης των δύο ενζύμων των υβριδίων Oval Red, Red Sea και Cherrelino. Παρατηρούμε ότι τα δύο ένζυμα εμφάνισαν διαφορετική συμπεριφορά κατά την επεξεργασία στις ίδιες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας. Και στις τρεις περιπτώσεις των ποικιλιών τομάτας που μελετήθηκαν, το ένζυμο PME εμφανίστηκε ιδιαίτερα ανθεκτικό στην k (min -1 ) 0,05 0,04 0,03 0,02 PME-60 C PG-60 C PME-70 C PG-70 C (α) k (min -1 ) 0,020 0,015 0,010 PME-60 C PG-60 C PME-70 C PG-70 C (β) 0,01 0,005 0, P (MPa) 0, P (MPa) 0,20 (γ) 0,15 k (min -1 ) 0,10 PME 60 C PG 60 C 0,05 0, P (MPa) Σχήμα 5.44 Εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης της PME και PG υβριδίου (α) Oval Red, (β) Red Sea και (γ) Cherrelino από την πίεση επεξεργασίας σε σταθερή θερμοκρασία -192-

233 Συγκριτικά αποτελέσματα μεταξύ των μελετώμενων υβριδίων επεξεργασία με ΥΥΠ σε αντίθεση με την PG, για την οποία απαιτήθηκαν ηπιότερες συνθήκες επεξεργασίας για την πλήρη απενεργοποίησή της. Το γεγονός αυτό καθιστά εφικτή την επιλεκτική απενεργοποίηση της PG με ταυτόχρονη διατήρηση της ενεργότητας της PME. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.44 αυτή η επιλεκτική απενεργοποίηση μπορεί να επιτευχθεί για πιέσεις επεξεργασίας μεγαλύτερες των 100 MPa, στην περίπτωση της ποικιλίας Cherrelino, ενώ για τα υβρίδια Oval Red και Red Sea σε πιέσεις μεγαλύτερες των 200 και 300 MPa, αντίστοιχα. Η επιλεκτική απενεργοποίηση των PME και PG με χρήση της ΥΥΠ, προσφέρει ένα σημαντικό πλεονέκτημα της νέας αυτής τεχνολογίας έναντι της συμβατικής θερμικής επεξεργασίας για τη βιομηχανία τομάτας. Με την κατασκευή τέτοιων καμπυλών, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.44, δίνεται η δυνατότητα επιλογής των συνθηκών που οδηγούν στην επιλεκτική απενεργοποίηση των ενζύμων. Επιλέγοντας τις βέλτιστες συνθήκες σε όρους απενεργοποίησης των ενζύμων, μπορεί να πραγματοποιηθεί εκτενέστερη μελέτη της επίδρασης αυτών των συνθηκών στην ποιότητα των προϊόντων τομάτας επεξεργασμένων με ΥΥΠ -193-

234 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός 5.4 Εκτίμηση της ποιότητας ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού τομάτας παραγόμενου από τομάτες επεξεργασμένες με ΥΥΠ Όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 4.3.3, για την παραγωγή χυμού τομάτας επεξεργασμένου με ΥΥΠ, ολόκληρες τομάτες (υβρίδιο Red Sea) αφού πλύθηκαν και συσκευάστηκαν συμπιέστηκαν σε πιέσεις 250, 400, 500 και 600 MPa. Η θερμοκρασία του θαλάμου πίεσης διατηρήθηκε ίση με 50 C ενώ η διεργασία της συμπίεσης διήρκησε 10 min. Στη συνέχεια ακολούθησε θραύση τους με οικιακό ομογενοποιητή, απομάκρυνση των φλοιών και σπόρων και συμπύκνωση του παραγόμενου χυμού μέχρι περιεκτικότητας σε διαλυτά στερεά 8,5% (8,5 Brix). Ο χυμός που προέκυψε μελετήθηκε ως προς τα ποιοτικά του χαρακτηριστικά αμέσως μετά την επεξεργασία, ακολούθησε παστερίωση του στους 95 C για 20 min και αποθηκεύθηκε σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 20 C για 5 μήνες, οπότε και μετρήθηκαν ξανά οι παράμετροι ποιότητας του χυμού. Στο Σχήμα 5.45 (α) και (β) απεικονίζεται ο καρπός της τομάτας τόσο πριν όσο και μετά την επεξεργασία με ΥΥΠ. Όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα δεν παρουσιάστηκε διαφορά στην εξωτερική εμφάνιση του καρπού της τομάτας μετά από επεξεργασία σε 600 MPa στους 50 C για 10 min σε σχέση με τη νωπή τομάτα. Ωστόσο ο καρπός εμφανίστηκε πιο μαλακός μετά από κάθε επεξεργασία με ΥΥΠ. Στο Σχήμα 5.45 (γ) και (δ) όπου παρουσιάζεται μια οριζόντια τομή του καρπού, φαίνεται ότι μετά την επεξεργασία με ΥΥΠ ο καρπός εμφάνισε μία ζελώδη όψη ενώ δεν υπήρχαν διακριτές περιοχές του καρπού (περικάρπιο και κοιλότητες). Επιπλέον φαίνεται ότι υπήρξε περισσότερο ελεύθερο νερό σε σχέση με τον ανεπεξέργαστο καρπό. α β γ δ Σχήμα 5.45 Φωτογραφία υβριδίου Red Sea (α,γ) πριν την επεξεργασία και (β,δ) μετά από επεξεργασία στα 600 MPa και 50 C για 10 min -194-

235 Παραγωγή χυμού τομάτας με ΥΥΠ Σύμφωνα με τους Tangwongchai et al. (2000), οι οποίοι μελέτησαν την επίδραση της ΥΥΠ στην υφή τομάτας τύπου cherry, οι αλλαγές στην υφή οφείλονται και στη φυσική διάρηξη του φυτικού ιστού, αλλά και στη δράση των ενζύμων της τομάτας. Επειδή η αέρια φάση εμφανίζει μεγαλύτερη συμπιεστότητα σε σχέση με τα υγρά και στερεά συστατικά της τομάτας, κατά την αποσυμπιέση παρατηρείται ταχεία διόγκωση του αέρα προκαλώντας διάρρηξη των κυτταρικών μεμβρανών. Κατά συνέπεια η διαπερατότητα των μεμβρανών αυξάνεται επιτρέποντας την απελευθέρωση δεσμευμένου νερού και συνεπώς καθιστώντας το φρούτο πιο μαλακό. Επιπλέον, οι δομικές αυτές αλλαγές του φυτικού ιστού ενισχύουν τη δράση των ενδογενών ενζύμων, PME και PG, τα οποία γίνονται περισσότερο ενεργά, προκαλώντας περαιτέρω μεταβολές στον ιστό και μαλάκωμα του φρούτου. Μετά από κάθε επεξεργασία μετρήθηκε η ενεργότητα των ενζύμων PME και PG. Στον Πίνακα 5.29 παρουσιάζονται τα ποσοστά εναπομένουσας δραστικότητας των PME και PG μετά από κάθε συνθήκη επεξεργασίας. Παρατηρούμε ότι η ενεργότητα της PG μειώθηκε μετά από κάθε επεξεργασία. Συγκεκριμένα παρατηρήθηκε απενεργοποίηση του ενζύμου σε ποσοστό περίπου 35 % κατά την ψυχρή θραύση και μετά από επεξεργασία στα 250 MPa, ενώ κατά τη θερμή θραύση και σε πιέσεις των 400, 500 και 600 MPa το ποσοστό απενεργοποίησης έφτασε περίπου το 99%. Αντίθετα με την PG, παρουσιάστηκε αύξηση της ενεργότητας της PME (σε σχέση με τον ανεπεξέργαστο χυμό) μετά από επεξεργασία με ΥΥΠ κατά 1,5 περίπου φορές. Παρόμοια αποτελέσματα ενεργοποίησης της PME έχουν παρατηρηθεί και από τους Hernandez & Cano (1998) σε πιέσεις MPa και έως 60 C, ενώ οι Krebbers et al. (2003) παρατήρησαν ενεργοποίηση του ενζύμου κατά 5,5-6,5 φορές στην περιοχή πιέσεων MPa στους 20 C. Η ενεργοποίηση αυτή οφείλεται σε δομικές αλλαγές του μορίου του ενζύμου που συμβαίνουν κατά την επεξεργασία με υψηλή πίεση (Fachin et al., 2003) ή στην ενδεχόμενη αύξηση της εκχυλισιμότητας του ενζύμου μετά από επεξεργασία με ΥΥΠ

236 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Πίνακας 5.29 Εναπομένουσα δραστικότητα των PME και PG μετά από κάθε επεξεργασία, εκφρασμένη σε ποσοστό (%) του ανεπεξέργαστου χυμού Δείγμα Συνθήκη επεξεργασίας PME (%) PG (%) CB 60 C για 2 min HB 95 C για 2 min < 3 < 2 HP1 250 MPa στους 50 C για 10 min HP2 400 MPa στους 50 C για 10 min 137 < 1 HP3 500 MPa στους 50 C για 10 min 160 < 1 HP4 600 MPa στους 50 C για 10 min 162 < 1 Σύμφωνα με την υπάρχουσα βιβλιογραφία η μεταβολή της πίεσης μπορεί να προκαλέσει σταθεροποίηση ή/και αύξηση της δραστικότητας των ενζύμων (Eisenmenger & Reyes De Corcuera, 2009a,b), όταν η μεταβολή του όγκου μεταξύ της φυσικής (native state) και της μετουσιωμένης (unfolded state) διαμόρφωσης των ενζύμων είναι θετική. Αυτό αποδίδεται στο γεγονός ότι η πίεση ευνοεί τους δεσμούς υδρογόνου και τις ηλεκτροστατικές δυνάμεις Van der Waals οι οποίοι συνδέονται με μεταβολές του όγκου του πολυπεπτιδίου. Αυτό το είδος δυνάμεων (οι οποίες βρίσκονται στη δευτεροταγή και τριτοταγή δομή) μειώνουν τις διαμοριακές αποστάσεις προκαλώντας μείωση του όγκου της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (Gross & Jaenicke 1994; Boonyaratanakornkit et al., 2002). Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στα ποιοτικά χαρακτηριστικά των παραγόμενων χυμών, όπως το χρώμα, το ιξώδες και η συνεκτικότητα κατά Bostwick. Το χρώμα αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους παράγοντες ποιότητας των προϊόντων τομάτας, καθώς σχετίζεται άμεσα με την αποδοχή τους από το καταναλωτικό κοινό (Gould, 1992). Όπως έχει ήδη αναφερθεί (παράγραφος 4.4.5), στη βιομηχανία τομάτας οι μετρήσεις του χρώματος εκφράζονται στην κλίμακα Hunter L,a,b. Η ερυθρότητα των προϊόντων τομάτας εκφράζεται από το λόγο a/b (Min & Zhang, 2003). Ένας λόγος a/b μεγαλύτερος ή ίσος με 1,90 υποδηλώνει προϊόντα τομάτας ανώτερης ποιότητας σε όρους χρώματος, ενώ όταν ο λόγος a/b λάβει τιμές μικρότερες του 1,80, τα -196-

237 Παραγωγή χυμού τομάτας με ΥΥΠ αντίστοιχα προϊόντα τομάτας δε θεωρούνται πολύ καλής ποιότητας (Hayes et al. 1998). Στο Σχήμα 5.46 απεικονίζεται η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο χρώμα (λόγος a/b) του παραγόμενου χυμού αμέσως μετά την επεξεργασία του. Το χρώμα της νωπής τομάτας προσδιορίστηκε ίσο με 2,40, ενώ κατά τη θερμή θραύση ο λόγος a/b έλαβε την τιμή 2,25. Η παρατηρούμενη υποβάθμιση του χρώματος του HB χυμού, πιθανώς να οφείλεται στη διάσπαση του λυκοπενίου και τη δημιουργία προϊόντων αντίδρασης καστάνωσης λόγω εφαρμογής υψηλής θερμοκρασίας (Shi & Le Maguer, 2000; Krebbers et al., 2003). Αντίθετα τα δείγματα επεξεργασμένα με ΥΥΠ εμφάνισαν χρώμα ίσο με 2,43. Σύμφωνα με τα βιβλιογραφικά δεδομένα οι ομοιοπολικοί δεσμοί και οι μικρού μοριακού βάρους ενώσεις δεν επηρεάζονται από την εφαρμογή υπερυψηλής πίεσης (Cheftel, 1992) με αποτέλεσμα να διατηρείται το χρώμα φρέσκιας τομάτας. Στα ίδια επίπεδα κυμάνθηκε και το χρώμα του CB χυμού τομάτας (λόγος a/b 2,42). Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί και από άλλους ερευνητές σχετικά με την επίδραση της πίεσης στο χρώμα χυμού τομάτας. Ο Hsu (2008) αναφέρει τιμές 2,50 2,45 2,40 a/b 2,35 2,30 2,25 2,20 Νωπή CB HB HP1 HP2 HP3 HP4 τομάτα Συνθήκη επεξεργασίας Σχήμα 5.46 Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο λόγο a/b του χρώματος του χυμού τομάτας -197-

238 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός για το λόγο a/b που κυμαίνονται από 3,62 για ανεπεξέργαστο χυμό έως 3,70 για χυμό επεξεργασμένο στα 500 MPa σε θερμοκρασία 50 C για 10 min. Επιπλέον,παρατήρησε αύξηση του χρώματος με αύξηση της εφαρμοζόμενης πίεσης και μείωση της θερμοκρασίας επεξεργασίας. Σύμφωνα με τους Porretta et al. (1995) και Krebbers et al. (2003) η αύξηση του κόκκινου χρώματος χυμού τομάτας επεξεργασμένου με ΥΥΠ σε σύγκριση με θερμικά επεξεργασμένο χυμό μπορεί να αποδοθεί στην καλύτερη ομογενοποίηση του χυμού κατά την επεξεργασία με ΥΥΠ. Ακολούθως, μετρήθηκε το ιξώδες των προϊόντων με περιστροφικό ιξωδόμετρο σε συνθήκες αυξανόμενου ρυθμού διάτμησης 0,1-10 s -1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.47, αύξηση του ρυθμού διάτμησης είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του ιξώδους όλων των δειγμάτων υποδηλώνοντας ψευδοπλαστική συμπεριφορά. Η διαφορά στο ιξώδες των διαφόρων δειγμάτων ήταν εντονότερη σε μικρούς ρυθμούς διάτμησης (έως 3 s -1 ) ενώ παρουσίασε πλατό σε μεγαλύτερους ρυθμούς διάτμησης. Φαινόμενο ιξώδες (Pa.s) Φαινόμενο ιξώδες (Pa.s) ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Ρυθμός διάτμησης (s -1 ) Ρυθμός διάτμησης (s -1 ) Σχήμα 5.47 Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στο φαινόμενο ιξώδες χυμού τομάτας αμέσως μετά την επεξεργασία ( ) CB, ( ) HB, ( ) 250 MPa_50 C _10 min, ( ) 400 MPa_50 C _10 min, ( ) 500 MPa_50 C _10 min, ( ) 600 MPa_50 C _10 min -198-

239 Παραγωγή χυμού τομάτας με ΥΥΠ Παρατηρώντας το Σχήμα 5.47 φαίνεται ότι αύξηση της πίεσης είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ιξώδους των δειγμάτων. Επιπλέον, τα δείγματα επεξεργασμένα με ΥΥΠ και σε πιέσεις MPa εμφάνισαν υψηλότερο ιξώδες σε σχέση με τα θερμικά επεξεργασμένα δείγματα. Εκτός από το ιξώδες, για την εκτίμηση της ποιότητας των προϊόντων επεξεργασμένων με ΥΥΠ μετρήθηκε και η συνεκτικότητα κατά Bostwick. Το Bostwick αποτελεί σημαντική παράμετρο της ποιότητας των επεξεργασμένων προϊόντων τομάτας κατά τη συνήθη βιομηχανική πρακτική προσφέροντας μια γρήγορη και εύκολη εκτίμηση της συνεκτικότητας τους. Μικρές τιμές Bostwick υποδηλώνουν προϊόν με αυξημένη συνεκτικότητα κάτι το οποίο είναι επιθυμητό για τη βιομηχανία τομάτας, ενώ μεγάλες τιμές Bostwick υποδηλώνουν ένα όχι τόσο συνεκτικό προϊόν. Για CB προϊόντα οι τιμές κυμαίνονται συνήθως μεταξύ 8 και 12 cm, ενώ για τα ΗB προϊόντα η συνεκτικότητα παίρνει τιμές συνήθως μικρότερες των 6 cm. Στο Σχήμα 5.48 απεικονίζεται η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στη συνεκτικότητα των προϊόντων τομάτας. 12 Συνεκτικότητα Bostwick (cm) CB HB HP1 HP2 HP3 HP4 Συνθήκη επεξεργασίας Σχήμα 5.48 Επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στη συνεκτικότητα κατά Bostwick χυμού τομάτας αμέσως μετά από επεξεργασία CB, HB, (HP1) 250 MPa_50 C _10 min, (HP2) 400 MPa_50 C _10 min, (HP3) 500 MPa_50 C _10 min και (HP4) 600 MPa_50 C _10 min -199-

240 Κεφάλαιο 5-Αποτελέσματα και σχολιασμός Παρατηρούμε ότι τα επεξεργασμένα δείγματα σε πιέσεις 500 και 600 MPa εμφάνισαν το μικρότερο Bostwick μεταξύ των δειγμάτων, υποδηλώνοντας προϊόν με μεγαλύτερη συνεκτικότητα. Το γεγονός αυτό ενδέχεται να οφείλεται στην επιλεκτική απενεργοποίηση των ενζύμων κατά τη διεργασία της ΥΥΠ. Η επιλεκτική απενεργοποίηση της PG μπορεί να προκαλέσει μείωση του ρυθμού αποπολυμερισμού της πηκτίνης, με αποτέλεσμα την κατακράτηση μεγαλύτερου μέρους της στη σωματιδιακή φάση του χυμού, αυξάνοντας έτσι τη συνεκτικότητά του (Kalamaki et al., 2003). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι με την επεξεργασία στα 500 και 600 MPa επιτεύχθηκαν πολύ υψηλές τιμές της συνεκτικότητας, κάτι το οποίο στη βιομηχανική πρακτική δεν είναι εφικτό ακόμη και κατά τη διεργασία ΗΒ. Στην αγορά κυκλοφορεί ένα προϊόν Super Hot Break ειδικών εφαρμογών, με επιπλέον προσθήκη φυτικών ινών, το οποίο σε περιεκτικότητα 8,3 Brix εμφανίζει τιμές Bostwick, για χρόνο μέτρησης 10 sec, που κυμαίνονται μεταξύ 3-5 cm. Η παρατήρηση αυτή μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι η επεξεργασία με ΥΥΠ έγινε σε ολόκληρη τομάτα και κατόπιν ακολούθησε θραύση της, αποτρέποντας έτσι την ακαριαία δράση των ενζύμων και την επακόλουθη αποκοδόμηση των πηκτινικών συστατικών της τομάτας. Στη βιβλιογραφία δεν έχουν αναφερθεί τιμές συνεκτικότητας κατά Bostwick για άλλες ποικιλίες τομάτας. Επιπλέον η επεξεργασία με ΥΥΠ έχει πραγματοποιηθεί σε χυμό τομάτας μετά από παρέλευση χρόνου τουλάχιστον 15 min από τη θραύση των τοματών, επιτρέποντας σε αυτό το χρονικό διάστημα τη δράση των ενζύμων και κατά συνέπεια τη μείωση του ιξώδους του χυμού. Ωστόσο όλα τα δείγματα επεξεργασμένα με ΥΥΠ παρουσίασαν μεγάλη συναίρεση. Η συναίρεση αποτελεί ένα από τα μειονεκτήματα της διεργασίας CB έναντι της διεργασίας HB και αφορά στον αποχωρισμό του ορού κατά την παραμονή των προϊόντων τομάτας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.49 μετά από επεξεργασία στα 600 MPa και 50 C για 10 min ο αποχωρισμός του ορού ήταν εντονότερος σε σχέση με την επεξεργασία CB (65 C για 2 min). Σύμφωνα με τους Verlent et al. (2006) παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν μετά από επεξεργασία σε πιέσεις έως 500 MPa σε συνδυασμό με θερμοκρασίες έως 60 C. Σε -200-

241 Παραγωγή χυμού τομάτας με ΥΥΠ χαμηλότερα επίπεδα πιέσεων ή σε ατμοσφαιρική πίεση το φαινόμενο αυτό παρατηρήθηκε σε μικρότερη έκταση. Αφού προσδιορίστηκαν οι παραπάνω παράμετροι ποιότητας των δειγμάτων, ακολούθησε παστερίωσή τους και αποθήκευσή τους σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 20 C για 5 μήνες, οπότε και μετρήθηκαν ξανά οι ίδιες παράμετροι ποιότητας. Σκοπός της αποθήκευσης ήταν να μελετηθεί κατά πόσο οι παράμετροι ποιότητας του προϊόντος παραγόμενου με ΥΥΠ επηρεάζονται από το χρόνο αποθήκευσης. Στον Πίνακα 5.30 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των μετρήσεων. Παρατηρούμε ότι η συνεκτικότητα κατά Bostwick διατηρήθηκε πρακτικά σταθερή μετά την αποθήκευση των δειγμάτων, σε σύγκριση με τις τιμές του Σχήματος Οι παρατηρούμενες διαφορές στο χρώμα των δειγμάτων οφείλονται κυρίως στη διεργασία της παστερίωσης και όχι στην υποβάθμισή τους λόγω αποθήκευσης. Από τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι η επεξεργασία με υπερυψηλή πίεση μπορεί να οδηγήσει σε παραγωγή προϊόντων τομάτας με βελτιωμένα ποιοτικά χαρακτηριστικά, συγκριτικά με τη συμβατική θερμική επεξεργασία. (α) (β) Σχήμα 5.49 Σύγκριση της συνεκτικότητας κατά Bostwick και της συναίρεσης ελαφρώς συμπυκνωμένου χυμού τομάτας επεξεργασμένου (α) στα 600 MPa και 50 C για 10 min και (β) στους 65 C για 2 min -201-