ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΨΥΧΟΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΣΕ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: Η ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Σ. ΧΙΤΟΓΛΟΥ-ΧΑΤΖΗ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ: Αριθμ.2309 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΨΥΧΟΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΣΕ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΑΚΡΙΤΟΠΟΥΛΟΥ ΚΥΡΙΑΚΗ ΓΕΝΙΚΗ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Ζ. ΙΑΚΩΒΙΔΟΥ ΚΡΙΤΣΗ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 2. Ε. ΜΙΟΓΛΟΥ-ΚΑΛΟΥΠΤΣΗ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 3. Ι. ΝΗΜΑΤΟΥΔΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ. Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΙΑΚΩΒΙΔΟΥ ΚΡΙΤΣΗ ΖΑΦΕΙΡΟΥΛΑ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 2. ΜΙΟΓΛΟΥ-ΚΑΛΟΥΠΤΣΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 3. ΝΗΜΑΤΟΥΔΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 4. ΜΟΥΡΕΛΑΤΟΣ ΔΙΟΝΥΣΙΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ. 5. ΚΟΚΚΑΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ. 6. ΦΡΑΓΚΟΥ-ΜΑΣΟΥΡΙΔΟΥ ΕΛΕΝΗ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 7. ΙΑΚΩΒΙΔΗΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ. «Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα». (Νόμος 5343/32, άρθρο 202, παρ.2 και Νόμος 1268/82, άρθρο 50, παρ.8)

3 3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Β. ΝΤΟΜΠΡΟΣ

4 4

5 Στους γονείς μου και τις καθηγήτριες μου 5

6 6

7 7 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΨΥΧΟΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΣΕ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ της Γενικής Ιατρού ΑΚΡΙΤΟΠΟΥΛΟΥ ΚΥΡΙΑΚΗΣ

8 8

9 9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Π Ρ Ο Λ Ο Γ Ο Σ... Σελ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ... Σελ Α. ΓΟΝΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ 1. Βλάβες στο DNA. Σελ Ταξινόμηση βλαβών στο DNA.. Σελ Μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DNA Σελ Κύκλος ζωής του κυττάρου Σελ Καρυότυπος ανθρώπου. Σελ Μέθοδοι ελέγχου - ανίχνευσης των βλαβών του γενετικού υλικού Σελ Χρωματιδιακές ανταλλαγές (Sister Chromatid Exchanges, SCEs) 3.1 Ιστορική αναδρομή-ορισμοί Σελ Σημασία των SCEs. Σελ Αυτόματες και προκλητές SCEs... Σελ Πιθανοί μηχανισμοί δημιουργίας των SCEs. Συσχέτιση των SCEs με τις βλάβες και τη σύνθεση του DNA, καθώς και με επιδιορθωτικούς μηχανισμούς..σελ Πλεονεκτήματα της μεθόδου προσδιορισμού της συχνότητας των SCEs.Σελ Μειονεκτήματα της μεθόδου προσδιορισμού της συχνότητας των SCEs.....Σελ 47

10 Εφαρμογές της μεθόδου προσδιορισμού της συχνότητας των SCEs. Σελ Χρωμοσωμικές ατυπίες (Chromosome abberations)....σελ Μικροπυρήνες (Micronuclei)... Σελ Δείκτης ρυθμού πολλαπλασιασμού κυττάρων (Prolilaration Rate Index, PRI)...Σελ Μιτωτικός δείκτης (Mitotic Index). Σελ Β. ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΨΥΧΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ - ΨΥΧΟΤΡΟΠΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ.....Σελ ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΨΥΧΟΦΑΡΜΑΚΩΝ..Σελ ΑΝΤΙΨΥΧΩΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Η ΜΕΙΖΟΝΑ ΗΡΕΜΙΣΤΙΚΑ Σελ Κλοζαπίνη.. Σελ Ρισπεριδόνη...Σελ Ολανζαπίνη. Σελ Ζιπραζιδόνη. Σελ ΑΓΧΟΛΥΤΙΚΑ Η ΗΠΙΑ ΗΡΕΜΙΣΤΙΚΑ-ΒΕΝΖΟΔΙΑΖΕΠΙΝΕΣ Σελ Διαζεπάμη Σελ Aλπραζολάμη.. Σελ Λοραζεπάμη. Σελ Βρωμαζεπάμη. Σελ ΑΝΤΙΕΠΙΛΗΠΤΙΚΑ..... Σελ Bαλπpοϊκό οξύ- Βαλπpoϊκό νάτριο..σελ ΝΕΟΣΥΝΤΙΘΕΜΕΝΕΣ 1,5-ΒΕΝΖΟΔΙΑΖΕΠΙΝΕΣ.. Σελ.91-93

11 11 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ. Σελ Καλλιεργητικά υλικά και χημικά αντιδραστήρια. Σελ Απαιτούμενος εργαστηριακός εξοπλισμός. Σελ Ανάπτυξη καλλιεργειών λεμφοκυττάρων και προετοιμασία παρασκευασμάτων για την παρατήρηση των SCEs και του PRI..... Σελ Παρατήρηση και μελέτη των SCEs και του PRI των κυττάρων.. Σελ Στατιστική μελέτη... Σελ Παρασκευή νεοσυντεθεισών 1,5-βενζοδιαζεπινών ΒΔΖ1 και ΒΔΖ3. Σελ ΒΔΖ2....Σελ104 ΒΔΖ4...Σελ.105

12 12 Β. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κλοζαπίνη...Σελ Ρισπεριδόνη....Σελ Ολανζαπίνη Σελ Ζιπραζιδόνη. Σελ Διαζεπάμη Σελ Λοραζεπάμη Σελ Aλπραζολάμη. Σελ Βρωμαζεπάμη. Σελ Bαλπpοϊκό οξύ....σελ Συνδυασμός ζιπραζιδόνης-βαλπροїκού. Σελ ΝΕΟΣΥΝΤΙΘΕΜΕΝΕΣ 1,5-ΒΕΝΖΟΔΙΑΖΕΠΙΝΕΣ ΒΔΖ1... Σελ ΒΔΖ2 Σελ ΒΔΖ3 Σελ ΒΔΖ4.Σελ ΣΥΖΗΤΗΣΗ. Σελ ΠΕΡΙΛΗΨΗ. Σελ ABSTRACT... Σελ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... Σελ

13 13 Π Ρ Ο Λ Ο Γ Ο Σ Στην σύγχρονη εποχή οι ψυχικές παθήσεις, παρουσιάζουν έξαρση, με αποτέλεσμα την συνεχώς αυξανόμενη χρήση των ψυχοτρόπωνψυχοθεραπευτικών σκευασμάτων. Τα σκευάσματα αυτά, πολλές φορές έχουν κατηγορηθεί για προκλήσεις σοβαρών βλαβών στον ανθρώπινο οργανισμό (παρενέργειες), ακόμα και για τερατογόνο δράση. Σε πολλά από αυτά τα σκευάσματα παρόλο που αποσαφηνίστηκε ο μηχανισμός δράσης τους, η οδός μεταβολισμού τους και οι σημαντικότερες παρενέργειες τους, παραμένει αδιευκρίνιστη η δράση στο κυτταρικό επίπεδο και η επίδραση τους στο γενετικό υλικό. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η κυτταρογενετική δράση πιλεγμένων από τα πιο γνωστά ψυχοτρόπα σκευάσματα στα λεμφοκύτταρα καλλιεργειών περιφερικού αίματος υγειών αιμοδοτών (in vitro), με σκοπό την αποσαφήνιση της κυτταρατοξικότητας και κυτταροστατικότητας τους και στόχο τη συμβολή στην αποτελεσματικότερη φαρμακοθεραπεία με περιορισμένη τοξικότητα. Η εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας και Γενετικής της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με τη συγκατάθεση του τέως Διευθυντή ομότιμου καθηγητή Κου Αλέξανδρου Κώτση και της νυν διευθύντριας κυρίας Χίτογλου- Χατζή Σ., τους οποίους και ευχαριστώ. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την αναπληρώτρια καθηγήτρια κυρία Ιακωβίδου- Κρίτση Ζαφειρούλα για την υπόδειξη του θέματος, την καθοδήγησή της κατά τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας και τις υποδείξεις της κατά τη συγγραφή της. Επίσης, ευχαριστώ θερμά την αναπληρώτρια καθηγήτρια Βιολογίας κυρία Μιόγλου-Καλουπτσή Ελευθερία για την ουσιαστική συμπαράσταση που μου προσέφερε καθ όλη τη διάρκεια της ερευνητικής αυτής εργασίας και τον αναπληρωτή καθηγητή Ψυχιατρικής κ. Νηματούδη Ιωάννη για τις ουσιαστικές υποδείξεις και τη συνεχή καθοδήγηση του στην εκπόνηση της μελέτης αυτής. Θερμά ευχαριστώ τον καθηγητή Βιολογίας και Γενετικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κ. Διονύσιο Μουρελάτο, που με τις συμβουλές και τις γνώσεις του, μας βοήθησε σημαντικά σε όλα τα στάδια της παρούσας εργασίας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω, όλο το

14 14 Εργαστήριο της Γενικής Βιολογίας και Γενετικής της Ιατρικής Σχολής του ΑΠΘ για την ένθερμη υποδοχή και στήριξη που μου παρείχε, καθ όλη την διάρκεια εκπόνησης της διατριβής μου, και ιδιαίτερα τις Κα Οικονομοπούλου Μαρία, και την Κα Χατζηθεοδωρίδου Πόπη. Ευχαριστώ επίσης την κ. Δήμα Ελένη για τη βοήθεια της. Θερμά ευχαριστώ, την καθηγήτρια Οργανικής Χημείας Κα Στεφανίδου- Στεφανάτου Ιουλία, καθώς και τον αναπληρωτή καθηγητή Κο Τσολερίδη Κωνσταντίνο του εργαστηρίου Οργανικής Χημείας, του τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του ΑΠΘ, για τη σύνθεση και την παροχή των 1,5 Βενζοδιαζεπινών για κυτταρογενετική μελέτη. Τέλος ευχαριστώ την οικογένειά μου για την ουσιαστική συμπαράσταση που μου παρείχε όλα αυτά τα χρόνια, καθότι χωρίς αυτήν, η υλοποίηση της παρούσας εργασίας δεν θα ήταν δυνατή. Με σεβασμό και τιμή Ακριτοπούλου Κυριακή

15 15

16 16

17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

18 18

19 19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η σταθερότητα των γενετικών πληροφοριών, οι οποίες είναι κωδικοποιημένες και αποθηκευμένες στο DNA, αποτελεί προϋπόθεση για την ύπαρξη και συνέχιση της ζωής των οργανισμών και οφείλεται στην πιστότητα της αντιγραφής του DNA και στην ύπαρξη πολύπλοκων συστημάτων επιδιόρθωσης του 1. Τελικό προϊόν της αντιγραφής του DNA είναι δύο πιστά αντίγραφα του αρχικού μορίου με συχνότητα λάθους 1x10-9. Το γενετικό υλικό, όμως δεν είναι άτρωτο, αλλά ευάλωτο και, καθώς δέχεται συνεχώς την επίδραση ποικίλων ενδογενών και εξωγενών βλαπτικών παραγόντων 2, αντιμετωπίζει ανεξέλεγκτη αύξηση των πιθανοτήτων εμφάνισης βλάβης. Οι βλαπτικοί παράγοντες χαρακτηρίζονται μεταλλαξιγόνοι και η εγκατάσταση βλαβών που κληρονομούνται ονομάζονται μεταλλάξεις. Οι μεταλλαξιγόνοι παράγοντες χωρίζονται ανάλογα με τη φύση τους σε φυσικούς (ακτινοβολίες, θερμοκρασία), βιολογικούς (ιοί, ογκογονίδια) και χημικούς. Ο κατάλογος των χημικών μεταλλαξιγόνων παραγόντων περιλαμβάνει πλήθος ετερογενών ουσιών, που διαφέρουν σημαντικά στη δομή και επηρεάζουν την ακεραιότητα ή/και τη λειτουργία του DNA με ποικίλους μηχανισμούς 3. Διάφορα φάρμακα εκδηλώνουν γονοτοξική δράση και συγκαταλέγονται στα χημικά μεταλλαξιγόνα. Τα κύτταρα διαθέτουν επιδιορθωτικούς μηχανισμούς, οι οποίοι επάγονται από συγκεκριμένες προς επισκευή βλάβες του DNA (κινητοποίηση επιδιορθωτικών ενζύμων, μεταγραφή παραγόντων επιδιόρθωσης, απόπτωση και αναχαίτηση του κυτταρικού κύκλου), με στόχο την αποτροπή της εγκατάστασης αυτών στο αντιγραμμένο DNA. Αποτυχία επιδιόρθωσης βλαβών του DNA μπορεί να οδηγήσει σε αναπτυξιακές ανωμαλίες, πρόκληση διάφορων ασθενειών, πρόωρη γήρανση και καρκινογένεση 4. Παράγοντες, όμως, που είναι σε θέση να επάγουν βλάβες στο γενετικό υλικό, όπως η ιονίζουσα ακτινοβολία, η υπεριώδης ακτινοβολία (φωτοδυναμική θεραπεία) και οι περισσότεροι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες, χρησιμοποιούνται με ιδιαίτερη επιτυχία στη θεραπευτική αντιμετώπιση σοβαρών ασθενειών, όπως ο καρκίνος, αρτηριακές στενώσεις κ.ά 5. Ενώ η βλάβη του DNA στα τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα (πχ νευρικά, μυϊκά κ.ά.) κινητοποιεί τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης,

20 20 προκειμένου να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα του μεταγραφόμενου γονιδιώματος, αντίστοιχες βλάβες σε ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα ενεργοποιούν τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints). Τα σημεία αυτά σταματούν τον κυτταρικό κύκλο προκειμένου να επιτρέψουν στους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς να λειτουργήσουν, αποτρέποντας τη μεταφορά λανθασμένης γενετικής πληροφορίας στις επόμενες κυτταρικές γενεές 6. Α) ΓΟΝΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ 1. Βλάβες στο DNA 1.1 Ταξινόμηση βλαβών στο DNA Βλάβες του γονιδιωματικού DNA για την πρόκληση των οποίων δεν είναι γνωστά τα αίτια θεωρούνται αυτόματες, ενώ οι προκλητές βλάβες οφείλονται στην επίδραση διάφορων γνωστών βλαπτικών (μεταλλαξιγόνων) παραγόντων. Οι βλάβες του DNA στο μοριακό επίπεδο εκδηλώνονται είτε ως δομικές, είτε ως ποσοτικές,είτε ως δομικές και ποσοτικές συγχρόνως 7 (Εικόνα 1). Περιορισμένης έκτασης ανεπιδιόρθωτες βλάβες (και ενός μόνο νουκλεοτιδίου), μη ορατές, χαρακτηρίζονται ως επιμήκεις ή σημειακές μεταλλάξεις, ενώ εκτεταμμένες βλάβες, πολλές φορές ορατές στο οπτικό μικροσκόπιο, ονομάζονται χρωμοσωμικές ατυπίες. Ως σημειακές βλάβες αναφέρονται αυτές που σχετίζονται με αλλαγή ενός μόνο νουκλεοτιδίου. Οι σημαντικότερες δομικές μεταβολές του DNA είναι: 1. Μεταβολή στο επίπεδο των βάσεων [π.χ. αντικατάσταση (Transversion) Α T ή G C, μετάπτωση (Transition) Α G, T C] 2. Σχηματισμός διμερών πυριμιδινών (δημιουργία ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ γειτονικών μορίων πυριμιδινών της ίδιας έλικας, κυρίως Τ) 3. Αποπουρίνωση (διάσπαση του Ν-γλυκοσιδικού δεσμού ανάμεσα σε μια πουρίνη και στη δεοξυριβόζη) (Depourination) 4. Απαμίνωση (συνήθως της C σε U)

21 21 Οι κυριότερες ποσοτικές μεταβολές εμφανίζονται ως εξής: 1. Έλλειψη βάσης ή βάσεων (deletion) 2. Προσθήκη βάσης ή βάσεων (insertion) 3. Χημική προσθήκη στην έλικα με την ενσωμάτωση ογκώδους καταλοίπου ετερογενούς μορίου (adduct) 4. Σχηματισμός χιαστών δεσμών Ι) εσωτερικών (μεταξύ βάσεων των δύο αλυσίδων) ΙΙ) εξωτερικών (μεταξύ βάσεων της ίδιας αλυσίδας) ΙΙΙ) ως σύνδεση του DNA με πρωτεΐνες (crosslinks) 5. Θραύσεις-ρήξεις σε μονόκλωνο ή δίκλωνο μόριο DNA από κλαστογόνους παράγοντες 6. Παρεμβολή βάσης (intercalation) Σημαντική θεωρείται η παρεμβολή με προσθήκη βάσεων (intercalation) στην αλληλουχία των βάσεων, η οποία όταν εγκαθίσταται σε μεταγραφόμενο τμήμα προκαλεί μετατόπιση του πλαισίου μεταγραφής (frame shift mutation). Τέτοιες μεταλλάξεις αλλάζουν το μεταφραστικό πλαίσιο του mrna, μεταβάλλοντας ολόκληρη την αλληλουχία αμινοξέων από το σημείο της μετάλλαξης και μετά (όταν η προσθήκη ή η απάλοιφη νουκλεοτιδίων δεν είναι ακριβές πολλαπλάσιο του τρία σε περιοχή κωδικοποίησης του DNA). Ο Cleaver το , αποδεχόμενος το γεγονός ότι κάθε παράγοντας προκαλεί διαφορετικού τύπου βλάβες, πρότεινε την ακόλουθη κατάταξη των αρχικών βλαβών, που προκαλούνται από την επίδραση διαφόρων παραγόντων: 1. Διμερή πυριμιδίνης υπεριώδης ακτινοβολία 2. Αλκυλίωση αλκυλιωτικοί παράγοντες 3. Αποπουρίνωση αλκυλιωτικοί παράγοντες 4. Λάθος ενσωμάτωση αναλόγων βάσεων BrdU 5. Θραύση αλυσίδων ιονίζουσα ακτινοβολία, αλκυλιωτικοί παράγοντες 6. Χιαστές συνδέσεις (δεσμοί) αλκυλιωτικοί παράγοντες διπλής δράσης (bifunctional) 7. Παρεμβολή βάσεων πολυκυκλικοί υδρογονάνθρακες, ακριδίνη 8. Αναστολή επιδιόρθωσης του DNA καφεΐνη, θεοφυλλίνη, 3-αμινοβενζαμίδιο

22 22 Εικόνα 1: Τύποι βλαβών του DNA, οι συνέπειές τους και μηχανισμοί επιδιόρθωσης τους ( 1.2 Μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DNA Οι κύριοι μηχανισμοί επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA του γονιδιώματος ευκαρυωτικών κύτταρων 9 θεωρούνται οι εξής : α. Επιδιόρθωση με ανάταξη (Reversion Repair-RR) β. Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (Base Excision Repair-BER) γ. Επιδιόρθωση λανθασμένης βάσης (μη συμπληρωματικής) (Mismatch Repair-MMR) δ. Επιδιόρθωση με εκτομή.νουκλεοτιδίου (Nucleotide Excision Repair- NER)

23 23 ε. Επιδιόρθωση διπλόκλωνου θραύσεως του DNA (DNA Double-Strand Break Repair) Από τους ανωτέρω μηχανισμούς ο πρώτος ανευρίσκεται τόσο σε προκαρυωτικά όσο και σε ευκαρυωτικά κύτταρα, ενώ οι υπόλοιποι αναφέρονται, κυρίως, σε ευκαρυωτικά κύτταρα. α. Επιδιόρθωση με ανάταξη (Reversion Repair-RR) Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται 3 διαφορετικοί μηχανισμοί επιδιόρθωσης: Επιδιόρθωση ενός σταδίου από την Ο 6 μεθυλογουανίνη-dna μεθυλοτρανσφεράση (single step repair by MGMT): ο μηχανισμός αυτός χρησιμοποιείται για την επιδιόρθωση σημειακών βλαβών που επάγονται από αλκυλιωτικούς παράγοντες. Μια από τις πλέον συνήθεις τέτοιες βλάβες είναι η δημιουργία 0 6 -αλκυλογουανίνης (π.χ. Ο 6 μέθυλο- ή αίθυλο-γουανίνη), που αποτελεί την κυριότερη πηγή των GC σε AT μεταλλάξεων κατόπιν αλκυλίωσης 10. Ανάταξη βλάβης του DNA από τα ομόλογα της AlkB: Πρόσφατα έχει περιγραφεί και ένας άλλος τρόπος ανάταξης των βλαβών κατόπιν μεθυλίωσης του DNA τόσο στη μία (single stranded), όσο και στις δύο (double stranded) αλυσίδες του DNA, από τις ομόλογες πρωτεΐνες της οικογένειας AlkB (AlkB1, AlkB2, AlkB3) 11. Φωτοεπιδιόρθωση (photoreactivation): στο μηχανισμό αυτό πρωταγωνιστούν ένζυμα της οικογένειας των φωτολυασών/ κρυπτοχρωμάτων. Οι φωτολυάσες συνδέονται με μηχανισμούς ανεξάρτητους από το φως σε σημείο που έχει επαχθεί βλάβη του DNA από υπεριώδη ακτινοβολία. Η αντίδραση επιδιόρθωσης, ωστόσο, γίνεται με τη χρήση της ενέργειας του φωτός μήκους κύματος nm. Με τον τρόπο αυτό αποκαθίστανται οι βλάβες που αφορούν στη δημιουργία διμερών πυριμιδίνης, τα οποία διασπώνται σε μονομερή 12. Φωτολυάσες ωστόσο, έχουν βρεθεί μόνο σε βακτήρια, κατώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (π.χ. D. melanogaster) και ορισμένα φυτά, αλλά όχι στον άνθρωπο. Αντίθετα, στον άνθρωπο έχουν βρεθεί ορισμένες ομόλογες πρωτεΐνες των φωτολυασών, οι

24 24 οποίες δεν παίζουν ρόλο στην επιδιόρθωση του DNA, αλλά στη ρύθμιση του κιρκάρδιου ρυθμού. β. Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (Base Excision Repair-BER) Η επιδιόρθωση με εκτομή βάσης είναι ένας μηχανισμός υπεύθυνος για την απομάκρυνση κατεστραμμένων βάσεων του DNA, που κινητοποιούν ειδικά ένζυμα, οι DNA γλυκοζυλάσες Οι κυριότερες βλάβες που υπόκεινται σε αυτόν τον επιδιορθωτικό μηχανισμό είναι αυτές ΠΟΥ προκύπτουν τυχαία από το ίδιο το κύτταρο, μέσω παραγωγής ελευθέρων ριζών προερχόμενων από τον κυτταρικό μεταβολισμό ή από φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Επιπλέον, αφορούν βλάβες που προκύπτουν και από εξωγενείς παράγοντες, όπως η ιονίζουσα ακτινοβολία, η υπεριώδης ακτινοβολία μακρού κύματος, αλκυλιωτικούς παράγοντες (π.χ. νιτροαζαμίνες) ή διάφορα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, που επίσης επάγουν αλκυλιωτικές βλάβες (π.χ. αδριαμυκίνη, μιτομυκίνη, DTIC, τεμοζολομίδη 13. Η διαδικασία επιδιόρθωσης BER πραγματοποιείται με τα ακόλουθα βήματα: 1. Αναγνώριση της βλάβης της αζωτούχου βάσης, απομάκρυνση της βάσης και διάνοιξη. Το πρώτο βήμα πραγματοποιείται από τις DNA γλυκοζυλάσες, οι οποίες αναγνωρίζουν και απομακρύνουν τη λάθος βάση με υδρόλυση του Ν- γλυκοσιδικού δεσμού 14. Στα κύτταρα των θηλαστικών έχουν αναγνωριστεί 11 διαφορετικές γλυκοζυλάσες με διαφορετική εξειδίκευση υποστρωμάτων και διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης 13. Αυτές διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: στην κατηγορία I ανήκουν εκείνες που απομακρύνουν την κατεστραμμένη βάση αφήνοντας μια απουρινική/απυριμιδινική ΑΡ (apurinic/apyrimidinic) περιοχή στο DNA, ενώ στην κατηγορία II ανήκουν εκείνες, οι οποίες μετά την απομάκρυνση της βάσης διασπούν την περιοχή ΑΡ με μία ενδογενή 3'- ενδονουκλεάση, δημιουργώντας μονόκλωνη θραύση στην περιοχή. 2. Εισαγωγή νουκλεοτιδίου. Η εισαγωγή του πρώτου νουκλεοτιδίου δεν εξαρτάται από τη χημική δομή της ΑΡ περιοχής.

25 25 3. Επιλογή απομάκρυνσης μικρής ή μεγάλης έκτασης νουκλεοτιδίων που εμπεριέχουν την βλάβη (short or long patch BER). Το κρίσιμο σημείο για την εκτέλεση μικρής Ι μεγάλης έκτασης BER είναι η απομάκρυνση του 5' drp μετά την εισαγωγή του πρώτου νουκλεοτιδίου. 4. Αποκατάσταση της μονόκλωνης θραύσης και επιδιορθωτική σύνθεση DNA με μεγάλης έκτασης BER. Αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί με τις πολυμεράσες δ και ε (ΡοΙδ και ΡοΙε), μαζί με τις ΡCNA και RF-C, οδηγώντας σε μεγαλύτερα τμήματα επιδιόρθωσης που φτάνουν τα 10 νουκλεοτίδια Συνένωση (ligation). Η επιδιόρθωση με εκτομή βάσης ολοκληρώνεται στο στάδιο αυτό, που επιτελείται με τις DNA λιγκάσες I και III. Η λιγκάση I αλληλεπιδρά με τις PCNA και ΡοΙβ, συμμετέχοντας κυρίως στη μεγάλης έκτασης BER, ενώ η λιγκάση III αλληλεπιδρά κυρίως με τις ΡοΙβ και PARP-1 [poly (ADP-ribose) polymerase I], εμπλεκόμενη στη μικρής έκτασης BER 16. Εικόνα 2 : Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (Base Excision Repair-BER)

26 26 γ. Επιδιόρθωση μη συμπληρωματικής βάσης (Mismatch Repair-MMR) Αυτός ο μηχανισμός επιδιόρθωσης είναι υπεύθυνος για την αττομάκρυνση μη συμπληρωματικών βάσεων, που προκύπτουν είτε από τυχαία, είτε από προκλητή απαμίνωση, οξείδωση ή μεθυλίωση των βάσεων ή από λάθη κατά την αντιγραφή 17. Οι κύριοι στόχοι της MMR είναι τα λανθασμένα ζεύγη βάσεων, όπως τα G/T (που προκύπτει από την απαμίνωση της 5-μεθυλ-κυτοσίνης), καθώς και τα G/G, A/C και C/C. Η διαδικασία εττιδιόρθωσης μη συμπληρωματικής βάσης (Mismatch Repair- MMR) πραγματοποιείται με τα ακόλουθα βήματα: 1. Αναγνώριση των βλαβών του DNA. Η αναγνώριση των βλαβών χημικά τροποποιημένων βάσεων γίνεται από το λεγόμενο σύμπλεγμα MutSa, που αποτελείται από τις ομόλογες πρωτεΐνες MSΗ2 και MSH6. Προκειμένου η σύνδεση τους στις λάθος περιοχές να είναι αποτελεσματική, απαιτείται φωσφορυλίωση του συμπλέγματος MutSa. Το κάθε σύμπλεγμα έχει διαφορετικά υποστρώματα και συνεπώς παίζει διαφορετικό ρόλο στην διαδικασία MMR. 2. Διάκριση μεταξύ μητρικής και θυγατρικής αλυσίδας του DNA. Δεν έχει επακριβώς ξεκαθαριστεί ο μηχανισμός με τον οποίο γίνεται η διάκριση των δύο αλυσίδων κατά την MMR. Έχουν προταθεί τουλάχιστον δύο πρότυπα, στα οποία επισημαίνεται ο ρόλος του ΑΤΡ στη διαδικασία αναγνώρισης. 3. Εκτομή και επιδιορθωτική σύνθεση. Από τη στιγμή που το σύμπλεγμα MutSa συνδέεται στην περιοχή της λανθασμένης βάσης, αλληλεπιδρά με ένα άλλο ετεροδιμερές σύμπλεγμα, το MutL, που αποτελείται από τις ομόλογες επιδιορθωτικές πρωτεΐνες MLH1 και PMS2. Η εκτομή του τμήματος του DNA που φέρει τη λάθος βάση γίνεται από την εξωνουκλεάση I και η νέα σύνθεση από την πολυμεράση δ.

27 27 Εικόνα 3 : Επιδιόρθωση μη συμπληρωματικής βάσης (Mismatch Repair-MMR) δ. Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (Nucleotide Excision Repair- NER) Η επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου είναι ο σημαντικότερος μηχανισμός επισκευής μεγάλων βλαβών του DNA, που προκαλούνται από την υπεριώδη ακτινοβολία, όπως διάφορα φωτοπροϊόντα (6-4 photoproducts) διμερή πυριμιδίνης, χιαστές συνδέσεις μέσα στην ίδια αλυσίδα (cross links), καθώς και μεγάλες χημικές προσθήκες (adducts) που προκαλούνται από διάφορους γονοτοξικούς παράγοντες (π.χ. α-τοξίνη, βενζοπυρένιο κ.ά.) 18. Η NER περιλαμβάνει τη γενική επιδιόρθωση του γονιδιώματος μη μεταγραφόμενων τμημάτων (global genomic repair-ggr) και την επιδιόρθωση συνδεδεμένη με τη μεταγραφή (transcription coupled repair-tcr). H οδός GGR θεωρείται ανεξάρτητη της μεταγραφής και απομακρύνει βλάβες από μη μεταγραφόμενες περιοχές του γονιδιώματος ή από το μη μεταγραφόμενο

28 28 τμήμα των μεταγραφόμενων περιοχών. Αντίθετα, η TCR απομακρύνει διάφορες περιοχές με βλάβες που αναστέλλουν τη δραστικότητα της RNAπολυμεράσης από τις μεταγραφόμενες περιοχές των ενεργών γονιδίων 19. Ο μηχανισμός της γενικής επιδιόρθωσης του γονιδιώματος (GGR), πραγματοποιείται σε στάδια: 1. Αναγνώριση της βλάβης του DNA. 2. Εκδίπλωση του DNA (DNA unwinding). 3. Εκτομή της βλάβης. 4. Επιδιορθωτική βιοσύνθεση του DNA. Ο μηχανισμός της TCR περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Αναστολή της δραστικότητας της RNA-πολυμεράσης II (RNAPII). 2. Εκτομή της βλάβης. 3. Επιδιορθωτική βιοσύνθεση του DNA. Εικόνα 4 : Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (Nucleotide Excision Repair- NER)

29 29 ε. Επιδιόρθωση διπλόκλωνης θραύσης του DNA (μετα-αντιγραφική επιδιόρθωση, DNA double strand breaks) Η διπλή θραύση των αλυσίδων του DNA αποτελεί την πλέον γονοτοξική βλάβη, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρού βαθμού χρωμοσωμικές ατυπίες (θραύσεις χρωμοσωμάτων, μετατοπίσεις, χρωματιδιακές ανταλλαγές κ.ά.) ή σε κυτταρικό θάνατο 20. Για το λόγο αυτό η άμεση και αποτελεσματική επιδιόρθωση της βλάβης αποκτά ιδιαίτερη βιολογική σημασία. Έχουν περιγραφεί δύο μηχανισμοί επιδιόρθωσης των διπλόκλωνων θραύσεων του DNA: ο ομόλογος ανασυνδυασμός (homologous recombination-hr) και η μη ομόλογη σύνδεση άκρων (non homologous end-joining NHEJ), όπου ο μεν πρώτος είναι ελεύθερος λαθών, ενώ αντίθετα, ο δεύτερος επιρρεπής σε λάθη, με αποτέλεσμα την απώλεια γενετικής πληροφορίας. Η χρήση του ενός ή του άλλου τύπου εξαρτάται μεταξύ των άλλων και από τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία επάγεται η βλάβη, όπου η NHEJ συμβαίνει κυρίως στη φάση G0/G1, ενώ η HR προς το τέλος της S ή στη G2 φάση, αφού απαραίτητη προϋπόθεση για να γίνει ομόλογος ανασυνδυασμός είναι να έχει προηγηθεί ο αναδιπλασιασμός του DNA και ο σχηματισμός των δύο αδερφών χρωματίδων 21. Κατά τον ομόλογο ανασυνδυασμό το χρωμόσωμα που έχει υποστεί βλάβη συνάπτεται με το ομόλογο άθικτο DNA της αδερφής χρωματίδας, το οποίο χρησιμεύει ως μήτρα για την επιδιόρθωση της βλάβης. Κατά τη μη ομόλογη σύνδεση συγκολλώνται τα άκρα των θραυσμένων χρωμοσωμάτων, χωρίς να εξασφαλίζεται απαραίτητα η ομολογία των βάσεων στα σημεία της σύνδεσης. 1.3 Κύκλος ζωής του κυττάρου Σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, η ικανότητα αύξησης και πολλαπλασιασμού εξαρτάται από διεργασίες που γίνονται στο κυτταρικό επίπεδο. Η διαίρεση και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, καθιστά αναγκαία την αντιγραφή του γενετικού τους υλικού (DNA), που ακολουθείται από τη διαίρεση του πυρήνα και το διαχωρισμό του κυτταροπλάσματος,

30 30 προκειμένου να δημιουργηθούν δυο θυγατρικά κύτταρα. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει : τη μεσόφαση (που διακρίνεται σε τρεις επιμέρους φάσεις G1, S, G2), και την μίτωση (Μ) όπου περιλαμβάνεται και η διαίρεση του κυτταροπλάσματος D. Αυτή η διαδοχική ενορχηστρωμένη διαδικασία εναλλαγής των φάσεων G1-S-G2-M-D είναι γνωστή ως «κύκλος ζωής του κυττάρου» ή «κυτταρικός κύκλος» 22. Το 1882, ο Fleming περιέγραψε μια διαδικασία πυρηνικής διαίρεσης του κυττάρου που την ονόμασε μίτωση (από τον ελληνικό όρο μίτος που σημαίνει νήμα, κλωστή). Επειδή τα κύτταρα έδιναν την εντύπωση ότι είναι ενεργά μόνο στη φάση της μίτωσης, ο υπόλοιπος κυτταρικός κύκλος χαρακτηρίστηκε ως μεσόφαση ή φάση ηρεμίας (interphase). Στην πραγματικότητα όμως κατά τη διάρκεια της μεσόφασης συμβαίνει η μεγαλύτερη κυτταρική δραστηριότητα, που προετοιμάζει το κύτταρο για την κυτταρική διαίρεση με κυρίαρχη την αντιγραφή του γενετικού υλικού κατά τη φάση S 23. Στα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης, τα κύτταρα ακολουθούν επαναλαμβανόμενους κύκλους αντιγραφής του DNA (φάση S) και πυρηνικής και κυτταρικής διαίρεσης (φάση μίτωσης Μ) με πολύ μεγάλη ταχύτητα. Η αντιγραφή του DNA αρχίζει σχεδόν αμέσως μόλις σταματήσει η μίτωση και ένας κυτταρικός κύκλος κυτταρικής διαίρεσης ολοκληρώνεται μέσα σε μισή ώρα 24. Καθώς όμως η εμβρυογένεση εξελίσσεται, οι ανάγκες της κυτταρικής ζωής σε ένα περισσότερο πολύπλοκο περιβάλλον μεγαλώνουν. Έτσι, εμφανίζονται και άλλες φάσεις στον κυτταρικό κύκλο, η φάση G1 (first gap phase), η οποία παρεμβάλλεται ανάμεσα στην Μ φάση και στην S φάση (σύνθεση του DNA), ενώ η φάση G2 (second gap phase), λαμβάνει χώρα μεταξύ S και Μ φάσης. Η δημιουργία των δυο επιπλέον φάσεων προέκυψε από την ανάγκη ελέγχου της σωστής διαμόρφωσης του DNA και ενδεχόμενης επιδιόρθωσης αυτού (φάση G1), καθώς και του ελέγχου και της επιδιόρθωσης σφαλμάτων κατά την αντιγραφή του DNA (φάση G2) 25. Οι επιπλέον φάσεις έχουν ως συνέπεια την αύξηση κατά πολύ του χρόνου ολοκλήρωσης ενός κυτταρικού κύκλου. Στον Πίνακα 1 και την Εικόνα 2 παριστάνεται διαγραμματικά ο κυτταρικός κύκλος και η χρονική διάρκεια των φάσεων που τον απαρτίζουν. Οι χρόνοι που αναφέρονται είναι ενδεικτικοί και υποδεικνύουν τη σχετική διάρκεια της κάθε φάσης.

31 31 Φάση κυτταρικού Διάρκεια (ώρες) κύκλου G S 6-10 G2 2-5 Μ 1-2 Πίνακας 1: Ενδεικτική χρονική διάρκεια φάσεων του κυτταρικού κύκλου Εικόνα 5: Φάσεις του κυτταρικού κύκλου ( Η φάση G1 Η χρονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου εξαρτάται κυρίως από τη φάση G1. Η φάση αυτή διαφέρει σημαντικά μεταξύ διαφόρων κυτταρικών τύπων καθώς και μέσα στον ίδιο κυτταρικό πληθυσμό. Επίσης, είναι δυνατό να επηρεάζεται σε σημαντικό βαθμό από διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες. Έτσι, σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως όταν υπάρχει περιορισμός των θρεπτικών συστατικών ή όταν δίνεται στα κύτταρα το

32 32 σήμα για τελική διαφοροποίηση, είναι δυνατόν τα κύτταρα που βρίσκονται στη G1, αντί να εισέλθουν στη φάση G1 και να προετοιμαστούν για το διπλασιασμό του DNA, να ακολουθήσουν το στάδιο ηρεμίας, γνωστό ως στάδιο G0. Η διάρκεια αυτού του σταδίου, το οποίο θεωρείται ως μέρος της G1, μπορεί να κυμαίνεται από ημέρες έως μήνες ή και χρόνια. Τα κύτταρα σε αυτή τη φάση δεν είναι ανενεργά, αλλά αντίθετα βρίσκονται σε μία διαρκή διαδικασία πρωτεϊνοσύνθεσης, μεταβολισμού, κίνησης ή έκκρισης ουσιών προς το περιβάλλον. Επιπλέον, μπορούν υπό την επίδραση κατάλληλων ερεθισμάτων του περιβάλλοντος να εισέλθουν και πάλι στον κυτταρικό κύκλο στη φάση G1. Η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 ελέγχεται σε δύο σημεία ελέγχου (checkpoints), το σημείο περιορισμού (restriction point) και το σημείο ελέγχου για βλάβη του DNA (G1 DNA damage checkpoint). Αν υπερπηδηθούν τα σημεία αυτά, τότε το κύτταρο θα ολοκληρώσει τον κύκλο ανεξάρτητα από τις συνθήκες του περιβάλλοντος 26. Η φάση S Η διάρκεια της φάσης S, καθώς και των λοιπών φάσεων G2 και Μ του κυτταρικού κύκλου, ποικίλλει στα διαφορετικά είδη κυττάρων, αλλά όχι σημαντικά σε κύτταρα του ίδιου είδους. Σε αντίθεση με τη φάση G1, η διάρκεια των φάσεων αυτών ελάχιστα επηρεάζεται από τις συνθήκες του περιβάλλοντος και μπορεί να θεωρηθεί ως σταθερό χαρακτηριστικό κάθε κυτταρικού τύπου. Η φάση S του κυτταρικού κύκλου αποτελεί τη φάση διπλασιασμού του γενετικού υλικού. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, τα χρωμοσώματα έχουν ιδιαίτερα μεγάλο μέγεθος, αποτελούμενα ΚΑΤΑ ΜΕΣΟΝ ΟΡΟ από 150x10 6 ζεύγη βάσεων. Η αντιγραφή, συνεπώς, σε τέτοιου μεγέθους χρωμοσώματα αρχίζει από πολλαπλά ανεξάρτητα σημεία, που για το ανθρώπινο γονιδίωμα είναι της τάξης των 2x Αν υπήρχε μόνο ένα σημείο έναρξης, θα απαιτούνταν περίπου 800 ώρες για την πλήρη αντιγραφή ενός και μόνο χρωμοσώματος, γεγονός που θα είχε ιδιαίτερες επιπτώσεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 26. Κάθε περιοχή του χρωμοσώματος που αντιγράφεται από ένα σημείο έναρξης ονομάζεται ρεττλικόνιο (replicon). Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς κάθε αντιγραφική μονάδα αποτελείται από μια

33 33 ομάδα ρεπλικονίων. Κάθε τέτοια ομάδα αντιγράφεται σε διαφορετικούς χρόνους κατά τη διάρκεια της φάσης S (ασύγχρονη διαδικασία). Γενικά, οι περιοχές ενεργού μεταγραφής του γονιδιώματος, καθώς και οι περιοχές που εκφράζουν γονίδια που είναι ενεργά σε όλα τα κύτταρα του οργανισμού (γονίδια οικονομίας κυττάρου-housekeeping genes), αντιγράφονται πρώτες κατά τη φάση S, ενώ οι περιοχές ανενεργού ετεροχρωματίνης (π.χ. η περιοχή του κεντρομεριδίου) αντιγράφονται αργότερα, προς το τέλος της S 26,27. Κατά τη διάρκεια της φάσης G1 τα χρωμοσώματα τροποποιούνται με την προσκόλληση διαφόρων πρωτεϊνών στα σημεία έναρξης της αντιγραφής, με αποτέλεσμα το σχηματισμό των προ-αντιγραφικών συμπλεγμάτων (prereplication complexes). Καθώς προχωράει η αντιγραφή κατά τη φάση S, τα συμπλέγματα απενεργοποιούνται, με αποτέλεσμα να αποτρέπεται η διπλή αντιγραφή τμημάτων του DNA στον ίδιο κυτταρικό κύκλο. Οι παραπάνω διαδικασίες ρυθμίζονται από μεταβολές στις δραστηριότητες των κυκλινών (cyclins) και των αντίστοιχων κινασών (cyclin-dependent kinases). Η φάση G2 Κατά τη διάρκεια της φάσης G2, τα κύτταρα ελέγχουν την ακεραιότητα της δομής του DNA και προετοιμάζονται για τη μίτωση. Εφόσον ανιχνευτεί κάποια βλάβη στο γενετικό υλικό, ενεργοποιείται ένας καταρράκτης πρωτεϊνικών κινασών, γνωστός ως σημείο ελέγχου βλαβών του DNA της G2 (G2 DNA damage checkpoint), με τελικό αποτέλεσμα την απενεργοποίηση των κινασών που είναι υπεύθυνες για την έναρξη της μιτωτικής διαίρεσης. Ο κυτταρικός κύκλος καθυστερεί στη G2 (G2 arrest), μέχρις ότου επιδιορθωθεί η βλάβη ή επάγεται η απόπτωση, εφόσον η βλάβη δεν είναι δυνατό να επιδιορθωθεί 27,28. Η φάση Μ της μίτωσης Κατά τη διάρκεια της μίτωσης όπου συμβαίνει και η κυτταροκίνηση, τα χρωμοσώματα και το κυτταρόπλασμα διαιρούνται και σχηματίζονται δύο θυγατρικά κύτταρα. Ο διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων ελέγχεται από το

34 34 σημείο ελέγχου της μετάφασης (metaphase checkpoint), που καθυστερεί το διαχωρισμό των αδερφών χρωματίδων, μέχρις ότου τα χρωμοσώματα ευθυγραμμιστούν πλήρως στη μιτωτική άτρακτο. Το σημείο αυτό ονομάζεται επίσης και σημείο ελέγχου της μιτωτικής ατράκτου (spindle checkpoint). Η μίτωση διακρίνεται σε 5 φάσεις (Εικόνα 5). Η πρόφαση χαρακτηρίζεται από την έναρξη της συμπύκνωσης των χρωμοσωμάτων. Στο κυτταρόπλασμα, λαμβάνουν χώρα δραματικές μεταβολές της κινητικής των μικροσωληνίσκων, των οποίων ο χρόνος ημίσειας ζωής μειώνεται από 10 λεπτά σε 30 δευτερόλεπτα και συνοδεύεται από διαχωρισμό των διπλασιασμένων κεντροσωματίων, καθένα από τα οποία συμμετέχει στο σχηματισμό του ενός πόλου της μιτωτικής ατράκτου. Στον πυρήνα γίνεται η ρήξη του πυρηνικού περιβλήματος και εξαφανίζεται ο πυρηνίσκος, γεγονός που αντανακλά τη μείωση της μεταγραφικής δραστηριότητας του κυττάρου, η οποία σταματά τελείως στο τέλος της πρόφασης. Κατά τη διάρκεια της προμετάφασης, διασπάται πλήρως το πυρηνικό περίβλημα, εξαφανίζονται οι πυρηνίσκοι και τα χρωμοσώματα αρχίζουν να συνδέονται τυχαία με τους μικροσωληνίσκους της μιτωτικής ατράκτου. Αφού συνδεθούν οι κινητοχώροι κάθε χρωμοσώματος με μικροσωληνίσκους των αντίθετων πόλων της μιτωτικής ατράκτου, τότε τα χρωμοσώματα μετακινούνται στον ισημερινό της μιτωτικής ατράκτου. Όταν έχει ολοκληρωθεί η δέσμευση των χρωμοσωμάτων στα ινίδια της ατράκτου, τότε το κύτταρο θεωρείται ότι βρίσκεται στη μετάφαση. Ακολουθεί η ανάφαση, που είναι η μικρότερη χρονικά φάση της μιτωτικής διαίρεσης, καθώς διαρκεί μερικά μόνο λεπτά. Χαρακτηρίζεται από το διαχωρισμό και την κίνηση των αδερφών χρωματίδων προς τους δύο αντίθετους πόλους του κυττάρου (ανάφαση Α), οι οποίοι στη συνέχεια απομακρύνονται μεταξύ τους (ανάφαση Β). Η μετάβαση στην ανάφαση από την προηγούμενη φάση (μετάφαση) απαιτεί την πρωτεολυτική αποδόμηση των μορίων που ρυθμίζουν το ζευγάρωμα των αδερφών χρωματίδων (όπως η πρωτεΐνη CLIP) και εξαρτάται από την τοποϊσομεράση-ii και την ειδική πρωτεόλυση με τη βοήθεια της ουμπικουιτίνης. Η άφιξη των χρωμοσωμάτων στους πόλους σηματοδοτεί την τελόφαση. Στη φάση αυτή τα χρωμοσώματα εκτυλλίσονται, παίρνοντας τη χαρακτηριστική μορφή της χρωματίνης της μεσόφασης. Συγχρόνως,

35 35 επανεμφανίζεται ο πυρηνίσκος και δημιουργείται πάλι το πυρηνικό περίβλημα. Τέλος, ένας δακτύλιος ακτίνης και μυοσίνης, γνωστός και ως συσταλτός δακτύλιος (contractile ring) που αρχίζει από τον ισημερινό της ατράκτου σφίγγει ασφυκτικά το κυτταρόπλασμα και το διαχωρίζει στα δύο θυγατρικά κύτταρα. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται κυτταροκίνηση. Εικόνα 6: Φάσεις της μίτωσης ( 1.4 Καρυότυπος ανθρώπου Ένα ανθρώπινο χρωμόσωμα διατηρεί την αυτοτέλεια του, αποτελείται από ένα μόριο αποτελούμενο από περίπου 50x10 6 έως 250x10 6 ζεύγη βάσεων. Η αυτοτέλεια των χρωμοσωμάτων γίνεται ορατή κατά τη μίτωση και

36 36 ιδιαίτερα κατά τη μετάφαση ή προμετάφαση, όπου το ακανόνιστο δίκτυο της χρωματίνης του μεσοφασικού πυρήνα αποκτά το μέγιστο βαθμό συσπείρωσης, δημιουργώντας ορατούς έως χαρακτηριστικούς σχηματισμούς (χρωμοσώματα). Ένα τυπικό μεταφασικό χρωμόσωμα αποτελείται από δύο αδερφές χρωματίδες, που έχουν προκύψει ήδη κατά τον διπλασιασμό του DNA. Οι αδελφές χρωματίδες είναι συνενωμένες σε όλο τους το μήκος, ενώ κάθε χρωματίδη εμφανίζει μια περίσφιξη με εξειδικευμένη αλληλουχία του DNA, γνωστή ως κεντρομερίδιο. Τα χρωμοσώματα του ανθρώπου τα οποία έχουν το κεντρομερίδιο στο μέσο του μήκους τους ονομάζονται μετακεντρικά, εκείνα που το φέρουν στο ένα άκρο τους λέγονται τελοκεντρικά, ενώ εκείνα στα οποία το κεντρομέρος βρίσκεται κάπου ενδιάμεσα μεταξύ των δύο προηγούμενων θέσεων ονομάζονται υπομετακεντρικά. Τέλος, υπάρχει και ο όρος ακροκεντρικό χρωμόσωμα, για τις περιπτώσεις που το κεντρομερίδιο δε βρίσκεται ακριβώς στο άκρο του χρωμοσώματος, αλλά σχηματίζει ένα πολύ μικρό βραχίονα. Επιπλέον, ένα χρωμόσωμα μπορεί να φέρει και ορισμένες δευτερογενείς περισφίξεις, που μπορεί να βρίσκονται σε οποιαδήποτε περιοχή κατά μήκος αυτού. Στις περισσότερες περιπτώσεις, ωστόσο, περισφίξεις που βρίσκονται κοντά στο ένα άκρο του, διαχωρίζοντας ένα μικρό τελικό τμήμα, που ονομάζεται δορυφόρος και ταυτίζονται με τις πυρηνιακές ζώνες( γονιδια mrnas) 26,27,29 Όλες οι ενδείξεις που υπάρχουν συνηγορούν με το γεγονός ότι το DNA ενός χρωμοσώματος είναι ένα ενιαίο μόριο. Για να διαητρηθεί η η ακεραιότητα ενός μορίου DNA του χρωμόσωματος, πρέπει να περιέχει τις ακόλουθες βασικές αλληλουχίες. α) αλληλουχίες έναρξης της αντιγραφής του, ώστε να εξασφαλίζεται η πιστότητα της αντιγραφής της γενετικής πληροφορίας, β) την αλληλουχία του κεντρομεριδίου όπου αναπτύσσεται ο κινητοχώρος, περιοχή υπεύθυνη για την μετακίνηση των χρωμοσωμάτων και γ) αλληλουχίες των άκρων του χρωμοσώματος (τελομερή). Οι αλληλουχίες αυτές δομούνται από επαναλαμβανόμενα τμήματα (TTAGGG)v και ολοκληρώνουν την πλήρη αντιγραφή του χρωμοσώματος, με τη βοήθεια της τελομεράσης, η αδρανοποίηση της οποίας επιφέρει βράχυνση, λόγω απώλειας των ακραίων νουκλεοτιδίων κατά την αντιγραφή. 26,27,29. Τα χαρακτηριστικά (αριθμός, σχήμα, μέγεθος) των χρωμοσωμάτων σε ένα κύτταρο συνιστούν τον καρυότυπο. Ο ανθρώπινος καρυότυπος

37 37 αποτελείται από 46 χρωμοσώματα (44 αυτοσωμικά και δύο φυλετικά, XX στη γυναίκα και ΧΥ στον άνδρα). Το μέγεθος τους κυμαίνεται από 1-5μm. Eπομένως, με βάση τον αριθμό και το μέγεθος των χρωμοσωμάτων του, ο άνθρωπος βρίσκεται περίπου στη μέση μεταξύ των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών. Τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα κατατάσσονται στις ομάδες A-G, όπως φαίνεται στην Εικόνα 4. Η διάκριση τους βασίζεται στο μέγεθος και τη σχετική θέση των κεντρομεριδίων τους. Έτσι, τα χρωμοσώματα της ομάδας Α (ζεύγη 1-3) είναι τα μεγαλύτερα στον ανθρώπινο καρυότυπο, όπου τα 1 και 3 είναι μετακεντρικά και το 2 ελαφρώς υπομετακεντρικό. Τα χρωμοσώματα της ομάδας Β (ζεύγη 4 και 5) είναι μικρότερα από της ομάδας Α και υπομετακεντρικά. Τα χρωμοσώματα της ομάδας C (ζεύγη 6-12 και χρωμόσωμα Χ) είναι μετακεντρικά ή υπομετακεντρικά και μικρότερα από της ομάδας Β. Η διάκριση μεταξύ τους απαιτεί ειδικές τεχνικές χρώσης κατά ζώνες. Τα χρωμοσώματα των ομάδων D (ζεύγη 13-15), G (ζεύγη 21-22) και το φυλετικό χρωμόσωμα Υ είναι ακροκεντρικά και συνήθως φέρουν δορυφόρους. Τέλος, τα χρωμοσώματα της ομάδας Ε (ζεύγη 16-18) είναι μετακεντρικά -υπομετακεντρικά και μικρότερα της ομάδας C, ενώ ακόμα μικρότερα και μετακεντρικά είναι εκείνα της ομάδας F (ζεύγη 19-20) 26,27,29. Εικόνα 7: Ανθρώπινος καρυότυπος (

38 38 2. Μέθοδοι ελέγχου - ανίχνευσης των βλαβών του γενετικού υλικού Όπως έχει ήδη αναφερθεί, πλήθος παραγόντων φυσικών (π.χ. ακτινοβολίες), χημικών (πλήθος χημικών ουσιών) και βιολογικών (όπως ιοί, μικρόβια και προϊόντα του μεταβολισμού), προκαλεί με ποικίλους μηχανισμούς διαφόρων ειδών, ανεπιδιόρθωτες βλάβες στο DNA, οι οποίες μπορούν να ανιχνευτούν με πολλούς τρόπους 30. Για την εντόπιση των βλαβών αυτών, καθώς και για τον έλεγχο κάθε εν δυνάμει βλαπτικού παράγοντα, έχουν επινοηθεί και εξελιχθεί διάφορες μέθοδοι παράμετροι, οι σημαντικότερες των οποίων είναι: Κυτταρογενετικές μέθοδοι ανίχνευσης Μέθοδοι ανίχνευσης με τη δοκιμασία ελέγχου κατά AMΕS (βακτηριδιακή μέθοδος ανίχνευσης) Βιοχημικές-ανοσοϊστοχημικές μέθοδοι Λόγω του ότι η παρούσα διατριβή μελετά τις πιθανές βλάβες του DNA, που προκαλούνται από ψυχοθεραπευτικά σκευάσματα με κυτταρογενετικές μεθόδους, κρίνεται σκόπιμο να αναλυθούν εκτενέστερα αυτές. Οι κυτταρογενετικές μέθοδοι ελέγχου και ανίχνευσης των βλαβών του DNA περιλαμβάνουν τη μελέτη: α. Χρωματιδιακών ανταλλαγών (Sister Chromatid Exchanges, SCEs) β. Χρωμοσωμικών ατυπιών (Chromosome Aberrations, CA) γ. Μικροπυρήνων (Micronuclei test, MT) δ. Δείκτη Ρυθμού Πολλαπλασιασμού (Proliferation Rate Index, PRI) ε. Μιτωτικού Δείκτη (Mitotic Index, MI) Όλες αυτές οι μέθοδοι παρουσιάζουν ένα σημαντικό πλεονέκτημα: διεξάγονται κυρίως σε δείγματα περιφερικού αίματος και συγκεκριμένα σε λεμφοκύτταρα. Μερικές σταγόνες (10-12) ολικού αίματος προστίθενται σε ειδικά θρεπτικά υποστρώματα (βλ. Ειδικό Μέρος) και επωάζονται επί 3-4 εικοσιτετράωρα, οπότε συμβαίνουν διαδοχικές μιτωτικές διαιρέσεις στα Τ- λεμφοκύτταρα. Με κατάλληλη τεχνική απομονώνονται τα χρωμοσώματα και καθίστανται ορατά με διάφορες τεχνικές χρώσεως.

39 39 3. Χρωματιδιακές ανταλλαγές (Sister Chromatid Exchanges, SCEs) 3.1 Ιστορική αναδρομή-ορισμοί Χρωματιδιακές ανταλλαγές είναι οι ανταλλαγές τμημάτων μεταξύ δύο αδελφών χρωματίδων, σε απόλυτα ομόλογες γονιδιακά θέσεις των χρωμοσωμάτων, που βρίσκονται στο στάδιο της αντιγραφής του DNA και πριν οι χρωματίδες διαχωρίστουν σε δύο αυτοτελή χρωμοσώματα. Η δημιουργία των SCEs προϋποθέτει ρήξη και επανασυγκόλληση ανάμεσα στους δύο κλώνους του DNA. 31,32 Εντός ορίων οι SCEs δε φαίνεται να προκαλούν το θάνατο των κυττάρων και μπορούν να διατηρηθούν μετά από πολλούς κυτταρικούς κύκλους. Το 1957 ο J. Herbert Taylor και οι συνεργάτες του 33 παρατήρησαν το φαινόμενο των SCEs. Μετά από ενσωμάτωση στο DNA σημασμένης με ραδιενεργό τρίτιο θυμιδίνης [ 3 Η], μελέτησαν αυτοραδιογραφικά τη διαφοροποίηση των αδελφών χρωματίδων και απέδειξαν τον ημισυντηρητικό τρόπο αντιγραφής του DNA. Το 1972 οι Zakharov και Egolina 34,35 κατάφεραν να ενσωματώσουν στο DNA την 5-βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU), ένα ανάλογο της θυμιδίνης, σε καλλιέργειες λεμφοκυττάρων σινικού κρικητού. Διαπίστωσαν ότι, κατά τη διάρκεια δύο μιτωτικών κύκλων παρουσία BrdU και μετά τη χρώση των χρωμοσωμάτων με Giemsa, οι δύο αδελφές χρωματίδες διαφοροποιούνταν, με αποτέλεσμα να καθίστανται ορατές κατά την μετάφαση της δεύτερης μιτωτικής διαίρεσης, οι χρωματιδιακές ανταλλαγές. Tο 1973 ο Latt 36,37 με τη χρησιμοποίηση της φθορίζουσας χρωστικής Hoechst πέτυχε καλύτερη διαφοροποίηση των SCEs σε ανθρώπινα πλέον λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος. Το 1974 οι Wolff, Bodycotte και Painter 38 εξέτασαν την επαγωγή των SCEs χρησιμοποιώντας υπεριώδη ακτινοβολία σε κύτταρα κινέζικου χάμστερ. Τα πειράματά τους απέδειξαν ότι οι SCEs δεν μπορούν να συμβούν σε μετα-αντιγραφικά χρωμοσώματα, αλλά μόνο σε χρωμοσώματα που υφίστανται ή είναι έτοιμα να υποστούν αντιγραφή. Το 1974 οι Perry και Wolff 39 εφάρμοσαν την τεχνική FPG (Fluorescence Plus Giemsa), δηλαδή το συνδυασμό χρωστικής Hoechst με υπεριώδη ακτινοβολία και τελική χρώση των αδελφών χρωματίδων με Giemsa. Παράλληλα, αποδείχτηκε ότι η χρησιμοποίηση αλκαλικών διαλυμάτων διευκόλυνε τη

40 40 διάκριση των SCEs. Ακόμη καλύτερη διαφοροποίηση και ευκολότερη καταμέτρηση των SCEs κατορθώθηκε με τη χρησιμοποίηση, μετά από μελέτες, της κατάλληλης συγκέντρωσης της χρωστικής Hoechst και των βέλτιστων τιμών του ρη του καλλιεργητικού υλικού, της θερμοκρασίας κατά την έκθεση των χρωματίδων στην υπεριώδη ακτινοβολία, καθώς και του μήκους κύματος αυτής 40. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν και μονοκλωνικά αντισώματα IgG έναντι του σεσημασμένου με BrdU μονόκλωνου DNA, τεχνική που άνοιξε νέους δρόμους στη μελέτη των SCEs Σημασία των SCEs Όπως προαναφέρθηκε, οι SCEs αποτελούν ένα φυσικό φαινόμενο άμεσα συνδεδεμένο με την αντιγραφή του γενετικού υλικού των κυττάρων. Οι SCEs συμβαίνουν σε απόλυτα ομόλογη θέση (locus) των χρωμοσωμάτων και βέβαια προϋπόθεση για τη δημιουργία τους είναι η ρήξη (breakage) και η επανασυγκόλληση (reunion) μεταξύ των αλυσίδων του δίκλωνου DNA. Στις μέρες μας οι SCEs αποτελούν μια εξαιρετικά ευαίσθητη κυτταρογενετική μέθοδο ανίχνευσης των βλαβών του DNA. Με τη μελέτη των SCEs μπορεί να ανιχνευτεί η ενδεχόμενη γονοτοξική επίδραση ουσιών σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις με ή χωρίς μεταβολική δραστηριοποίηση. Η μέθοδος εκδήλωσης και χρώσης των SCEs είναι χρονικά σύντομη, μικρού γενικά κόστους και ιδιαίτερα μεγάλης ακριβείας με αξιόπιστα αποτελέσματα. Για τη μελέτη των SCEs μπορεί να χρησιμοποιηθούν κύτταρα θηλαστικών ή μη, ακόμη και φυτικά κύτταρα, καρκινικά ή κύτταρα διαφόρων ιστών σε in vitro έρευνα για την ανίχνευση ενδεχόμενα γονοτοξικών ουσιών με ή χωρίς μεταβολική δραστηριοποίηση αλλά και σε in vivo μελέτες για την ανίχνευση γονοτοξικής βλάβης από πιθανές γονοτοξικές ουσίες σε ζώντες οργανισμούς (πειραματόζωα). Τα λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος ανθρώπου θεωρούνται το πλέον κατάλληλο υλικό για την εκτίμηση των SCEs και χρησιμοποιούνται ευρέως σε κυτταρογενετικές μελέτες. Παρουσιάζουν πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με άλλους κυτταρικούς τύπους 42 :

41 41 Αποτελούν εύκολα προσιτό και άφθονο πειραματικό υλικό, στο οποίο χωρίς απαιτήσεις καθορίζονται οι πειραματικές συνθήκες (χρόνος προσθήκης των υπό μελέτη ουσιών, διάρκεια έκθεσης των κυττάρων, συγκέντρωση κ.ά.). Υπό φυσιολογικές συνθήκες τα λεμφοκύτταρα παρουσιάζουν ελάχιστες χρωματιδιακές ανταλλαγές. Προσφέρονται για τη μελέτη βλαβών των χρωμοσωμάτων που προκαλούνται όχι μόνο in vitro αλλά και in vivo μετά από έκθεση σε γονοτοξικούς παράγοντες. Από τα έμμορφα στοιχεία του αίματος, μόνο τα Τ-λεμφοκύτταρα που βρίσκονται στο περιφερικό αίμα στη φάση G0 του κυτταρικού κύκλου, μπορούν να αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται υπό την επίδραση κατάλληλου μιτογόνου παράγοντα όπως η φυτοαιμοσυγκολλητίνη 43. Κυκλοφορούν σε όλους τους ιστούς του σώματος και τουλάχιστον ένα ποσοστό τους παρουσιάζει μακροβιότητα, με αποτέλεσμα να υφίστανται συνεχώς και αθροιστικά την επίδραση διαφόρων εξωτερικών παραγόντων (π.χ. ακτινοβολίες). Έτσι, τα λεμφοκύτταρα αποτελούν το «δοσίμετρο» της έκθεσης του οργανισμού σε διάφορους γονοτοξικούς παράγοντες, καθώς κάθε βλάβη που καταγράφεται σε αυτά αντανακλά τη βλάβη που έχουν υποστεί όλα τα κύτταρα του ανθρώπινου οργανισμού 44. Είναι δυνατόν, χρησιμοποιώντας μικροσωμάτια ήπατος ή διάφορα μεταβολικά ένζυμα (S-9 mix κατά AMES), να ελεγχθεί η δράση των μεταβολικών προϊόντων διαφόρων χημικών ουσιών. Τα μεταβολικά παράγωγα μπορεί να εμφανίζουν ασθενέστερη ή ισχυρότερη γονοτοξική δράση από αυτήν των αρχικών τους ουσιών 45. Διαθέτουν παρόμοιους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς με τα καρκινικά κύτταρα και μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην εκτίμηση της πορείας και της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας σε καρκινοπαθείς. Έτσι, καθορίζονται τα θεραπευτικά σχήματα με τις λιγότερες παρενέργειες, στα οποία τα καρκινικά κύτταρα είναι περισσότερο ευαίσθητα 5. Για να μπορέσουν να γίνουν ορατές οι SCEs στο οπτικό μικροσκόπιο πρέπει να προηγηθεί ενσωμάτωση της BrdU στο DNA (η BrdU αντικαθιστά την θυμιδίνη κατά τη διάρκεια τουλάχιστον του πρώτου από δύο συνεχείς κυτταρικούς κύκλους). Οι SCΕs, όμως, που θα δημιουργηθούν στην πρώτη

42 42 φάση S, θα γίνουν ορατές στο μικροσκόπιο μετά τη δεύτερη φάση S 2. Αυτό οφείλεται: α. στον ημισυντηρητικό τρόπο αναδιπλασιασμού του DNA β. στο γεγονός ότι η επανασυγκόλληση μεταξύ των τεσσάρων αλυσίδων του DNA κατά τη διαδικασία της ανταλλαγής περιορίζεται αυστηρά από την πολικότητα του DNA γ. στην τυχαία διανομή των χρωματίδων στα θυγατρικά κύτταρα Έτσι, όταν η BrdU είναι παρούσα κατά τη διάρκεια δύο συνεχών - διαδοχικών κυτταρικών κύκλων, το σύνολο των SCEs που εμφανίζεται σε ένα κύτταρο στη μετάφαση της δεύτερης γενεάς αντιπροσωπεύει το σύνολο όλων των ανταλλαγών που συνέβησαν και στους δύο προηγούμενους κυτταρικούς κύκλους και δεν έχουν επιδιορθωθεί. 46,47 Εικόνα 8: Σχηματική απεικόνιση της δημιουργίας των SCEs και της ενσωμάτωσης της BrdU στις αδελφές χρωματίδες 48 Με τον τρόπο αυτό και με την τεχνική που χρησιμοποιείται σήμερα για τη μελέτη των SCEs, στο τέλος της πειραματικής διαδικασίας και ύστερα από δύο διαδοχικούς μιτωτικούς κύκλους, τα χρωμοσώματα στη μετάφαση παρουσιάζουν στο οπτικό πεδίο τις δύο χρωματίδες τους διαφορετικά χρωματισμένες. Όταν τα χρωμοσώματα δεν φέρουν SCEs, τότε η μία χρωματίδα φαίνεται ωχρή και η άλλη σκούρη (Εικόνα 6). Εάv το χρωμόσωμα περιέχει SCEs, τότε σε κάθε χρωματίδα θα υπάρχουν περιοχές ωχρές και σκούρες. Μία περιοχή που στη μία χρωματίδα φαίνεται σκούρα, στην αδελφή χρωματίδα σε ομόλογη θέση θα εμφανίζεται ωχρή.

43 43 Εικόνα 9: Μετάφαση 2 ης γενιάς. Διακρίνονται οι δύο χρωματίδες (σκούρη και ωχρά) καθώς και αρκετές SCEs σε διάφορα χρωμοσώματα. Για την εξήγηση του φαινομένου αυτού αποδεχόμαστε ότι: Η προσθήκη BrdU στο καλλιεργητικό υλικό, αντικαθιστά τη θυμιδίνη και ενσωματώνεται κατά το στάδιο της αντιγραφής.τα χρωμοσώματα των κυττάρων που έχουν διανύσει δύο διαδοχικούς μιτωτικούς κύκλους απομονώνονται και χρωματίζονται με τη φθορίζουσα χρωστική Hoechst 33258, εκτίθενται στην επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας και τελικά βάφονται με τη χρωστική Giemsa. Το αποτέλεσμα είναι η μία χρωματίδα, που είναι διπλά αντικατεστημένη από την BrdU, να φαίνεται αποχρωματισμένη (διότι η BrdU μειώνει το φθορισμό της χρωστικής Hoechst), ενώ αντίθετα η απλά αντικατεστημένη χρωματίδα, εμφανίζεται σκούρη Αυτόματες και προκλητές SCEs Οι SCEs διακρίνονται σε αυτόματες και προκλητές. Οι αυτόματες δημιουργούνται χωρίς την παρουσία κάποιου εμφανούς βλαπτικού παράγοντα, ενώ οι προκλητές προκαλούνται από τη βλαπτική επίδραση γνωστού γονοτοξικού παράγοντα. Η συχνότητα των αυτόματων SCEs φαίνεται να σχετίζεται με το περιεχόμενο DΝΑ κάθε κυττάρου και συνήθως κυμαίνεται από 1,5-2/κύτταρο 50. Εργασίες σε μύες, π.χ. επίμυες, σινικούς κρικητούς, καθώς και σε φυτικά κύτταρα φακής δείχνουν ότι οι αυτόματες

44 44 SCEs έχουν ένα εύρος 0,05-0,08 SCEs/pg DNA/μιτωτικό κύκλο 51. Παρά το γεγονός ότι οι SCEs είναι γνωστές από καιρό και έχουν γίνει πολλές μελέτες σχετικά με την επαγωγή τους, η μοριακή βάση της δημιουργίας τους παραμένει ασαφής. Αδιαμφισβήτητα συνδέονται με την αντιγραφή του DNA και τα ευκαρυωτικά κύτταρα που εκτίθενται σε βλαπτικούς παράγοντες στην φάση G2, παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα SCEs μόνο μετά από την συμπλήρωση του επόμενου κύκλου αντιγραφής. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός θεωρείται ένας από τους κυριότερους μηχανισμούς δημιουργίας 52. Η συχνότητα των SCEs σε δείγματα υγιούς πληθυσμού έχει αποτελέσει κατά το παρελθόν αντικείμενο μελέτης πολλών εργαστηρίων, προκειμένου να καθιερωθούν τα αποδεκτά όρια που θα χρησιμοποιούνται ως μέτρο σύγκρισης κατά τη μελέτη της δράσης γονοτοξικών παραγόντων 53. Είναι χαρακτηριστικό ότι παρατηρείται μεγάλη διακύμανση στο μέσο όρο της φυσιολογικής συχνότητας των SCEs στα δείγματα πληθυσμού που χρησιμοποιήθηκαν σε διάφορες μελέτες. Ο μέσοι όροι στις έρευνες αυτές κυμαίνονται από 5-14 SCEs/κύτταρο. Οι διαφορές αυτές μπορεί να οφείλονται στις εφαρμοζόμενες μεθόδους αξιολόγησης ή σε πραγματικές διαφορές στα υπό μελέτη δείγματα των αντίστοιχων πληθυσμών, λόγω γενετικών ή περιβαλλοντικών παραγόντων. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι σε μία εκτενή αξιολόγηση των Morgan και Crossen 54, όπου μελετήθηκαν πάνω από 1000 κύτταρα σε 50 υγιή άτομα, βρέθηκε ότι ο μέσος όρος ήταν 7,9±1,36 SCEs/κύτταρο. Μεταξύ των ατόμων, ωστόσο, υπήρχε μεγάλη διακύμανση, της τάξης 1-21 SCEs/κύτταρο, ενώ σε μία αντίστοιχη εργασία 55 η συχνότητα ήταν 8,29±0,08 SCEs/κύτταρο. Τέλος, σε δείγμα ελληνικού πληθυσμού από υγιείς εθελοντές και των δύο φύλων, ηλικίας ετών, διαπιστώθηκε ότι οι συχνότητες κυμαίνονταν από , με μέση τιμή 9,3 SCEs/κύτταρο 30. Οι περισσότερες εργασίες υποστηρίζουν ότι τα επίπεδα των SCEs δεν επηρεάζονται από το φύλο, 56,57,58 ενώ αντίθετα σε κάποιες αναφέρεται αύξηση της συχνότητας των SCEs αυξανομένης της ηλικίας 59, γι' αυτό είναι σκόπιμο να χρησιμοποιούνται στις έρευνες άτομα από παρόμοιες ηλικιακές ομάδες. Το επίπεδο των SCEs είναι δυνατό να επηρεασθεί από πολλούς άλλους παράγοντες. Έχει βρεθεί ότι η BrdU, που είναι απαραίτητη για τη μελέτη των SCEs, σε υψηλές συγκεντρώσεις είναι δυνατόν από μόνη της να

45 45 προκαλέσει αύξηση στις SCEs, ενώ σε χαμηλές συγκεντρώσεις, έως και 10μg/ml, δεν επηρεάζει ή προκαλεί ασήμαντη αύξηση αυτών. Το κάπνισμα και ο αλκοολισμός 60,61 φαίνεται να αυξάνουν σημαντικά το επίπεδο τους, ενώ αντίθετα δεν επηρεάζονται από την ηλικία. Παρατηρήθηκε ακόμη ότι οι ιογενείς λοιμώξεις αυξάνουν τη συχνότητα τους όταν εξετάσθηκαν ασθενείς σε σχέση με υγιείς μάρτυρες. 62 Το ίδιο συμβαίνει και σε χρόνιους χρήστες ινδικής κάνναβης και ηρωίνης. 63,64 Οι SCEs εμφανίζονται αυξημένες σε πάσχοντες από κληρονομικά νοσήματα, στα οποία είναι γνωστή η ανεπάρκεια των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκουν το σύνδρομο Bloom, η αναιμία Fanconi, η μελαγχρωματική ξηροδερμία και η αταξία-τηλεαγγειεκτασία. Στα παραπάνω νοσήματα έχει διαπιστωθεί υψηλή χρωμοσωμική ευθραυστότητα με μεγάλη αστάθεια του γονιδιώματος, στην οποία συμβάλλει η ανεπάρκεια των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA. 65, Πιθανοί μηχανισμοί δημιουργίας των SCEs. Συσχέτιση των SCEs με τις βλάβες και τη σύνθεση του DNA, καθώς και τους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς Από την εποχή της ανακάλυψης του φαινομένου των SCEs πραγματοποιήθηκαν πολλές μελέτες, για να αξιολογηθεί η βιολογική σημασία τους και για να διερευνηθούν και να επεξηγηθούν οι μηχανισμοί δημιουργίας τους. Σήμερα, είναι γενικά παραδεκτό ότι κάθε αύξηση του επιπέδου των SCEs αντικατοπτρίζει αυξημένες, ανεπιδιόρθωτες βλάβες στο DNA. 67,68,69 Επίσης, θεωρείται ότι SCEs προκαλούνται για να ξεπεραστούν κατά κάποιο τρόπο οι ανεπισκεύαστες βλάβες του DNA κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του. 66,70,71,72,73 Υπάρχουν ενδείξεις ότι οι SCEs δημιουργούνται στα σημεία της έναρξης της αντιγραφής του DNA, δηλαδή στα ρεπλικόνια 74,75,76 Ακόμη, όμως, παραμένουν αρκετά αδιευκρίνιστα σημεία ως προς τους μηχανισμούς δημιουργίας τους. Κατά το πρότυπο του Painter, 76 προκειμένου να δημιουργηθεί μία χρωματιδιακή ανταλλαγή, συμβαίνει διπλόκλωνος ανασυνδιασμός στις περιοχές στις οποίες έρχονται σε επαφή δύο ρεπλικόνια. Η γονοτοξική επίδραση διαφόρων παραγόντων μπορεί να επιφέρει καθυστέρηση ή

46 46 αναστολή της επιμήκυνσης του DNA κυρίως στα ρεπλικόνια και η ανταλλαγή μεταξύ των χρωματίδων να συμβεί στα σημεία επαφής μιας ήδη αντιγραφηθείσας και μιας μη αντιγραφηθείσας περιοχής. Ο Kushima υποστηρίζει ότι η κατανομή των SCEs στα χρωμοσώματα δεν είναι τυχαία, αλλά ότι αυτές προκαλούνται στις αλληλουχίες περιοχών επαφής μεταξύ ευχρωματίνης και ετεροχρωματίνης, που έχουν διαφορετική ταχύτητα αντιγραφής. 77 Όταν λοιπόν εφάπτονται δύο ρεπλικόνια με διαφορετικό ρυθμό αντιγραφής, αυξάνεται η πιθανότητα διπλής ρήξεως στα σημεία επαφής και δημιουργίας SCEs. Ο Shafer 78 προτείνει μια σειρά εναλλακτικών μηχανισμών με τους οποίους μια ανεπιδιόρθωτη βλάβη, π.χ. μια χιαστή σύνδεση, παρακάμπτεται κατά τη διάρκεια της αντιγραφικής φάσης του DNA με τη δημιουργία χρωματιδιακής ανταλλαγής. 3.5 Πλεονεκτήματα της μεθόδου προσδιορισμού της συχνότητας των SCEs Ο προσδιορισμός της συχνότητας των χρωματιδιακών ανταλλαγών (SCEs) σε καλλιεργούμενα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα θεωρείται μια ευαίσθητη και αξιόπιστη μέθοδος για τη μελέτη των επιπτώσεων κυτταροτοξικών παραγόντων και, κυρίως, μεταλλαξιγόνων και/ή καρκινογόνων ουσιών στα ευκαρυωτικά χρωμοσώματα 79. H μέθοδος αυτή, πολλές φορές, είναι προτιμότερη από τη μέτρηση των χρωμοσωμικών ατυπιών, διότι παρουσιάζει μεγαλύτερη ευαισθησία (μεγαλύτερη συχνότητα SCEs) με την επίδραση χαμηλότερων συγκεντρώσεων κυτταρογενετικά δραστικών ουσιών 80. Η μέθοδος των SCEs είναι γρήγορη, ευαίσθητη, φθηνή και απλή και, καθώς μπορεί να ανιχνεύσει τη βλάβη στο χρωμοσωμικό DNA σε κάθε κύτταρο ξεχωριστά, μπορεί να συμβάλλει στην εκτίμηση της ετερογένειας στην ευαισθησία ενός φαρμάκου ανάμεσα στους διάφορους κυτταρικούς υποπληθυσμούς ενός και μόνο όγκου 81. Έτσι, με βάση και τα πειράματα των Τofilon και συν 81 και Deen και συν 82, η μελέτη των SCEs έχει προταθεί ως μέθοδος για την αξιολόγηση και τη βελτίωση της χημειοθεραπείας. Eπίσης, συμβάλλει στην εκτίμηση της επίδρασης γονοτοξικών παραγόντων του περιβάλλοντος (συμπεριλαμβανομένου και του εργασιακού) καθώς και στην

47 47 πρόγνωση μελλοντικών ανεπιθύμητων επιπτώσεων στην υγεία. Επιπροσθέτως, η μελέτη των SCEs μπορεί να χρησιμεύσει στην ανίχνευση κληρονομικών και επίκτητων νοσημάτων. 3.6 Μειονεκτήματα της μεθόδου προσδιορισμού της συχνότητας των SCEs Η μέθοδος των SCEs έχει σε σχέση με άλλες κυτταρογενετικές μεθόδους μεγαλύτερη ευαισθησία αλλά μικρότερη εξειδίκευση. Με τον όρο ευαισθησία εννοούμε την εκατοστιαία (%) αναλογία των βλαπτικών παραγόντων (καρκινογόνων ουσιών), που δίνουν θετικό αποτέλεσμα με τη μέθοδο, ενώ με τον όρο εξειδίκευση εννοούμε την εκατοστιαία (%) αναλογία των μη βλαπτικών παραγόντων (μη καρκινογόνων ουσιών), που δίνουν αρνητικό αποτέλεσμα. Αυτό σημαίνει ότι με τη μέθοδο των SCEs υπάρχει μεγαλύτερη πιθανότητα να επισημανθεί η καρκινογόνος δράση μιας ουσίας, λόγω μεγαλύτερης ευαισθησίας, αλλά και μεγαλύτερη πιθανότητα μια μη καρκινογόνος ουσία να δώσει θετικό αποτέλεσμα λόγω μικρότερης εξειδίκευσης Εφαρμογές της μεθόδου προσδιορισμού της συχνότητας των SCEs Η μελέτη των SCEs συμβάλλει στην ανίχνευση της μεταλλαξιγόνου και καρκινογόνου δράσης διαφόρων ουσιών 84,85,86. Mε αυτόν τον τρόπο έχουν βρεθεί καρκινογόνες ουσίες, που αποτελούν μέρος του ανθρώπινου διαιτολογίου, όπως είναι οι μεθυλοξανθίνες θεοβρωμίνη, θεοφυλλίνη αλλά και η καφεΐνη 87. Επίσης, είναι δυνατό να ανιχνευτεί η προστατευτική δράση κάποιων ουσιών, όπως οι βιταμίνες Α και C (σε μικρές συγκεντρώσεις) 88 έναντι γνωστών νεοπλασματικών παραγόντων, καθώς και αντιοξειδωτικών ουσιών όπως το χαμομήλι 89. Ακόμη, η μελέτη των SCEs συμβάλλει στην εκτίμηση της αντινεοπλασματικής χημειοθεραπείας με πειράματα in vitro, in vivo και συνδυασμό in vitro και in vivo. Σε μελέτες in vitro διαπιστώθηκε συνεργική αύξηση των SCEs, όταν προστέθηκαν αντινεοπλασματικοί αλκυλιωτικοί

48 48 παράγοντες, σε συνδυασμό με καφεΐνη, σε κυτταροκαλλιέργειες λεμφοκυττάρων 90 και παρατηρήθηκε συνεργική αύξηση των SCEs, όταν προστέθηκαν αλκυλιωτικοί παράγοντες σε συνδυασμό με τις προσταγλανδίνες E1 και E2 σε κυτταροκαλλιέργειες λεμφοκυττάρων 91. Ακόμη, παρατηρήθηκε συνεργική αύξηση των χρωματιδιακών ανταλλαγών, όταν προστέθηκε carboplatin μαζί με νιασίνη σε καλλιέργειες λεμφοκυττάρων ανθρώπου Χρωμοσωμικές ατυπίες (Chromosome abberations) Οι χρωμοσωμικές ατυπίες έχουν προ πολλού αναγνωριστεί ως ένας πολύ σημαντικός βιολογικός δείκτης (biomarker) της έκθεσης του ανθρώπινου οργανισμού σε ιονίζουσα ακτινοβολία ή χημικούς γονοτοξικούς παράγοντες (Εικόνα 7). Τόσο οι δομικές όσο και οι αριθμητικές χρωμοσωμικές ατυπίες έχουν συσχετιστεί με δυσμενείς καταστάσεις, όπως συγγενείς ανωμαλίες σε νεογέννητα και νεοπλασίες στους ενήλικες. Η συχνότητα των τυχαίων (spontaneous) χρωμοσωμικών ατυπιών (δηλαδή αυτών που δεν οφείλονται σε κάποιο γνωστό γονοτοξικό παράγοντα) στα νεογέννητα είναι ιδιαίτερα χαμηλή (0,6%). Αλλά σε αυξημένη συχνότητα αυτών οφείλεται περίπου το 50% των τυχαίων αποβολών 93. Επιπλέον, πρόσφατες έρευνες σε ανθρώπινους πληθυσμούς αποκαλύπτουν σαφή θετική ΣΥΣΧέτιση μεταξύ της συχνότητας των τυχαίων χρωμοσωμικών ατυπιών στα περιφερικά λεμφοκύτταρα με την επακόλουθη ανάπτυξη καρκίνου σε άλλους ιστούςστόχους. Οι παραπάνω παρατηρήσεις έχουν επιβεβαιωθεί από πολλές διεθνείς ομάδες σε μεγάλα δείγματα πληθυσμού, καθιστώντας τις χρωμοσωμικές ατυπίες τον κύριο προγνωστικό δείκτη ανάπτυξης καρκίνου, σε αντίθεση με άλλους κυτταρογενετικούς δείκτες, όπως οι χρωματιδιακές ανταλλαγές (SCEs) και οι μικροπυρήνες, για τους οποίους δεν έχει αποδειχθεί αντίστοιχη προγνωστική αξία 94,95. Εκτός από τις μελέτες πληθυσμών, σε ατομικό επίπεδο φαίνεται ότι το σημαντικότερο ρόλο στη σχέση μεταξύ χρωμοσωμικών ατυπιών και ανάπτυξης καρκίνου, παίζουν ορισμένοι εξατομικευμένοι παράγοντες (πολυμορφισμός), που σχετίζονται με τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA, τα ένζυμα μεταβολισμού των καρκινογόνων παραγόντων ή τα ένζυμα

49 49 μεταβολισμού του φυλλικού οξέος, που συμμετέχει στη διατήρηση της ακεραιότητας του γενετικού υλικού 96. Η αλληλεπίδραση των παραγόντων αυτών είναι, εντούτοις, εξαιρετικά πολύπλοκη. Στο γεγονός αυτό συμβάλλει και η επιπρόσθετη συμμετοχή εξωγενών περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως το κάπνισμα, διαιτητικοί παράγοντες, επαγγελματική ή ιατρική έκθεση σε μεταλλαξιογόνους παράγοντες (π.χ. ιονίζουσα ακτινοβολία) κ.α.. Για τους ανωτέρω λόγους η προγνωστική αξία των χρωμοσωμικών ατυπιών ως προς την ανάπτυξη καρκίνου σε ατομικό επίπεδο και όχι σε επίπεδο πληθυσμών είναι ακόμα υπό διερεύνηση. Επιπλέον, μελετάται και η ισχύς της προγνωστικής αξίας των επιμέρους τύπων χρωμοσωμικών ατυπιών 96,97. Εικόνα 10: Χρωμοσωμικές ατυπίες και σχηματισμός μικροπυρήνων (

50 50 5. Μικροπυρήνες (Micronuclei) Η δημιουργία των μικροπυρήνων σχετίζεται άμεσα με το κεντρομέρος και τα μικροσωληνάρια της μιτωτικής ατράκτου. Έτσι, κάθε παράγοντας, ο οποίος καταστρέφει το κεντρομέρος ή αναστέλλει τις λειτουργίες των μικροσωληναρίων της μιτωτικής ατράκτου, προκαλεί αύξηση του αριθμού των μικροπυρήνων 98. Σε αυτούς ανήκουν γνωστά χημειοθεραπευτικά μέσα, όπως η μπλεομυκίνη, η βινκριστίνη, το κυκλοφωσφαμίδιο, η μιτομυκίνη C, καθώς και φυτικής προέλευσης ουσίες, όπως η κολχικίνη, οι επιποδοφυλλοτοξίνες και η φαλλοειδίνη, που καταστρέφουν τα μικροσωληνάρια της μιτωτικής ατράκτου, προκαλώντας αποπολυμερισμό των τουμπουλινών (α και β) 99,100. Ο αποπολυμερισμός των τουμπουλινών (α και β)και η δημιουργία ρηγμάτων στα μικροσωληνάρια έχει ως αποτέλεσμα να επιβραδύνεται η μετακίνηση των θυγατρικών χρωμοσωμάτων προς τους πόλους των κυττάρων. Η διαφορετική ταχύτητα με την οποία μετακινούνται προς τους πόλους, έχει ως συνέπεια να ολοκληρώνονται οι διαδικασίες κυτταροκίνησης, πριν προλάβουν να ενσωματωθούν όλα τα χρωμοσώματα στους νεοσχηματιζόμενους πυρήνες. Τα χρωμοσώματα που παραμένουν εκτός πυρήνα εμφανίζονται κατόπιν κατά τη μεσόφαση με τη μορφή των μικροπυρήνων 101. Ο σχηματισμός των μικροπυρήνων μπορεί να οφείλεται και στη δράση ουσιών που δεν επηρεάζουν τη μιτωτική άτρακτο, αλλά δρουν ως κλαστογόνα, προκαλώντας ρήξεις ή άλλες ατυπίες στα χρωμοσώματα. Σε αυτές ανήκουν διάφορα χημειοθεραπευτικά, όπως η μιτομυκίνη C, η μπλεομυκίνη κ.ά., καθώς και ακτινοβολίες π.χ. ακτίνες Χ 101. Τα θραύσματα αυτά παραμένουν συνήθως εκτός πυρήνα, γιατί αδυνατούν να μετακινηθούν έγκαιρα προς τους πόλους κατά την κυτταροκίνηση, και οδηγούν στο σχηματισμό μικροπυρήνων εντός του κυτταροπλάσματος. Επομένως, η παρουσία μικροπυρήνων αποτελεί έμμεση απόδειξη της κλαστογόνου δράσης ενός παράγοντα, γι 'αυτό το λόγο έχει βρεθεί 100% συσχέτιση μεταξύ της δοκιμασίας των μικροπυρήνων και της δοκιμασίας των χρωμοσωμικών ατυπιών 102.

51 51 6. Δείκτης ρυθμού πολλαπλασιασμού κυττάρων (Prolilaration Rate Index, PRI) Η μελέτη του δείκτη ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων γίνεται στα ίδια παρασκευάσματα και με την ίδια τεχνική που ακολουθείται για τον προσδιορισμό των SCEs. Για τον υπολογισμό του PRI γίνεται εκτίμηση της εκατοστιαίας αναλογίας των μεταφάσεων που βρίσκονται στην πρώτη (Μ 1 ), τη δεύτερη (Μ 2 ) και την τρίτη (Μ 3+ ) ή περαιτέρω κυτταρική διαίρεση. Με τη μέθοδο FPG που χρησιμοποιείται,επίσης, για τη μελέτη των SCEs, τα χρωμοσώματα που βρίσκονται στην πρώτη κυτταρική διαίρεση εμφανίζουν τις αδελφές χρωματίδες σκούρες, του ιδίου δηλαδή χρώματος. Τα χρωμοσώματα που βρίσκονται στη δεύτερη κυτταρική διαίρεση έχουν την μία χρωματίδα σκούρη και την άλλη ωχρή, ενώ τα χρωμοσώματα που έχουν φθάσει ή ξεπεράσει την τρίτη κυτταρική διαίρεση έχουν και τις δύο χρωματίδες ωχρές, του ιδίου δηλαδή χρώματος στα περισσότερα χρωμοσώματα. Ο δείκτης ρυθμού πολλαπλασιασμού υπολογίζεται με την εφαρμογή του τύπου: PRI = (Μ 1 + 2Μ 2 +3Μ 3+ )/ 100 όπου : Μ 1 είναι η επί % αναλογία μεταφάσεων της πρώτης κυτταρικής διαίρεσης, Μ 2 της δεύτερης και Μ 3+ της τρίτης και ανώτερων διαιρέσεων. Με τη μελέτη του δείκτη ρυθμού πολλαπλασιασμού διαπιστώνεται η κυτταροστατική, αλλά ΣΥγχρόνως και η κυτταροτοξική δράση διαφόρων ουσιών Μιτωτικός δείκτης (Mitotic Index) Ο μιτωτικός δείκτης είναι μία παράμετρος εκτίμησης της δυνατότητας πολλαπλασιασμού ενός κυτταρικού πληθυσμού. Ορίζεται ως ο λόγος του αριθμού των κυττάρων, που βρίσκονται σε μίτωση, προς το συνολικό αριθμό κυττάρων. Μία ομάδα κυττάρων, που σπάνια συμπληρώνει τον κυτταρικό κύκλο, θα έχει χαμηλή τιμή μιτωτικού δείκτη, ενώ το αντίθετο θα ισχύει για μία ομάδα κυττάρων, που διαιρείται γρήγορα 103. Η μελέτη του μιτωτικού δείκτη γίνεται στα ίδια παρασκευάσματα που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των SCEs και του PRI. Γίνεται καταμέτρηση περίπου 5.000

52 52 πυρήνων και όλων των μεταφάσεων (1 ης, 2 ης, 3 ης και περαιτέρω κυτταρικών διαιρέσεων) που συναντώνται κατ αυτήν. Ως μιτωτικός δείκτης ορίζεται ο λόγος:αριθμός μιτώσεων/συνολικός αριθμός πυρήνων.

53 53 Β) ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΨΥΧΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ - ΨΥΧΟΤΡΟΠΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι ψυχικές διαταραχές στην πλειονότητά τους αντιμετωπίζονται συχνά με τη μακροχρόνια χορήγηση μονοθεραπείας ή συνδυασμού ψυχοτρόπων φαρμάκων, που διαφέρουν στη χημική σύσταση, στην οδό μεταβολισμού, στα μεταβολικά παράγωγα και στο μηχανισμό δράσης. Στο σύνολό τους ευθύνονται για πληθώρα παρενεργειών ή αλληλεπιδράσεων με άλλα φάρμακα, που αφορούν τα διάφορα συστήματα του οργανισμού. Παράλληλα, πολλά από αυτά ενοχοποιούνται για τερατογόνο δράση, η οποία όμως τις περισσότερες φορές δεν έχει αποδειχθεί. Αρκετά μελετήθηκαν τόσο in vivo όσο και in vitro για πιθανή γονοτοξική δραστηριότητα αλλά η εφαρμογή διαφόρων μη ευαίσθητων μεθόδων δοκιμασίας κατέληξε συχνά σε αντιφατικά αποτελέσματα. Η ανάλυση των χρωμοσωμικών ατυπιών (Chromosomal Abberations, CA), της συχνότητας των χρωματιδιακών ανταλλαγών (Sister Chromatide Exchanges, SCEs) των μικροπυρήνων (Micronuclei, MN), του μιτωτικού δείκτη (Mitotic Index, MI) και του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Proliferation Rate Index, PRI) θεωρούνται από τα πιο αξιόλογα κριτήρια κυτταρογενετικής και κυτταροτοξικής βλάβης. Ιδιαίτερα όμως η αύξηση των SCEs αποδείχθηκε ως ο πιο ευαίσθητος και πρώιμος δείκτης βλαβών του DNA και η μείωση του PRI από τους πιο αξιόπιστους δείκτες κυτταροστατικότητας. Όπως χαρακτηριστικά αναφέρεται από τους Sinues και συν. 104, σε ασθενείς με ιδιοπαθή επιληψία h μακροχρόνια χορήγηση καρβαμαζεπίνης (CBZ) προκάλεσε γονοτοξική βλάβη που εκδηλώθηκε με αύξηση των SCEs (p< 0,01) και πτώση του PRI (p<0,05), αλλά δεν επηρέασε τις άλλες κυτταρογενετικές παραμέτρους όπως τις CA και τους MN στα περιφερικά λεμφοκύτταρα των επιληπτικών. Ως ψυχοτρόπα ορίζονται τα φάρμακα που μεταβάλλουν την ψυχική διάθεση και συμπεριφορά του ατόμου. Οι κατηγορίες των ψυχοτρόπων φαρμάκων είναι οι ακόλουθες 105 : Αντιψυχωσικά ή μείζονα ηρεμιστικά Αγχολυτικά ή ήπια ηρεμιστικά Αντικαταθλιπτικά ή θυμοληπτικά

54 54 Ψυχοδιεγερτικά Ψυχομιμητικά (ψευδαισθησιογόνα ή παραισθησιογόνα) ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΨΥΧΟΦΑΡΜΑΚΩΝ Η μελέτη της μεταβολής της συχνότητας των SCEs και του PRI σε λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος ασθενών, που υποβάλλονται σε θεραπεία με ψυχοφάρμακα, θεωρούνται ισχυρά και πρώιμα κριτήρια της κυτταρογενετικής βλάβης. Απόδειξη αποτελεί ο σημαντικός αριθμός σχετικών ερευνητικών αναφορών που ανευρίσκονται στη διεθνή βιβλιογραφία, όπου όμως δεν αποτελούν σπάνιο γεγονός τα ασαφή και αντίθετα συμπεράσματα. Ως χαρακτηριστικό παράδειγμα αναφέρθηκε η μελέτη της χορήγησης της καρβαμαζεπίνης (CBZ) σε επιληπτικούς ασθενείς. Οι Schaumann και συν. 106 και οι Flejter και συν. 107 απέτυχαν στην προσπάθεια ανεύρεσης σημαντικής αύξησης στις CA ή τις SCEs στα λεμφοκύτταρα ομάδων ασθενών στους οποίους χορηγείτο CBZ. Αντίθετα, τα αποτελέσματα της in vivo έρευνας των Awara και συν. 108 έδειξαν ότι η CBZ κατά τη θεραπεία σε επιληπτικούς ασθενείς επέφερε χρωμοσωμικές βλάβες εκφραζόμενες ως σημαντική αύξηση των CA και SCEs αλλά και ως ελαφρά μείωση του MI και του PRI, χωρίς να έχει διαπιστωθεί όμως σημαντική συσχέτιση μεταξύ της συχνότητας των CA και της διάρκειας της θεραπείας. Στο ίδιο συμπέρασμα κατέληξαν και οι Li και συν Προσδιορίζοντας τη συχνότητα των SCEs σε επιληπτικούς, που υποβάλλονταν σε θεραπεία με CBZ, επεσήμαναν σημαντική αύξηση (p<0,01) των SCEs στα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος θεραπευμένων ασθενών αναφορικά με επιληπτικούς που δεν ελάμβαναν φάρμακα ή φυσιολογικά άτομα. Τα αντιφατικά αυτά αποτελέσματα μπορούν να αποδοθούν στην διαφορετική ατομική απόκριση κάθε ασθενούς μετά τη χορήγηση ενός φαρμάκου, εξαιτίας των ανομοιοτήτων του ρυθμού μεταβολισμού των φαρμάκων μεταξύ των ατόμων. Εξίσου ασαφή είναι τα συμπεράσματα ερευνών σε ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία με διφαινυλυδαντοΐνη (DPH). Σε καλλιέργειες λεμφοκυττάρων επιληπτικών παιδιών 6-16 ετών, που έπαιρναν DPH, βρέθηκε αύξηση των SCEs αναφορικά με ομάδα ελέγχου 110. Αντίθετα οι Hunke και συν. 111 σε παρόμοια μελέτη με επιληπτικά παιδιά ηλικίας 4-16 ετών, στα

55 55 οποία χορηγείτο επίσης DPH ως μονοθεραπεία, δεν επεσήμαναν σημαντική διαφορά στη συχνότητα των SCEs μεταξύ των λεμφοκυττάρων των παιδιών αυτών και των μαρτύρων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα συμπεράσματα της έρευνας των Goyle και συν. 112,113 που συμφωνούν με προγενέστερες μελέτες, όπου στους απογόνους ασθενών με επιληψία, παρατηρήθηκε συχνότερη εμφάνιση συγγενών ανωμαλιών απ ότι στους απογόνους των φυσιολογικών μαρτύρων. Επιπλέον, κατά τη διερεύνηση της γονοτοξικής επίδρασης θεραπείας με αντιεπιληπτικά φάρμακα, οι ερευνητές αυτοί διαπίστωσαν στα λεμφοκύτταρα όλων των ασθενών, αρρένων και θηλέων ανεξαρτήτως ηλικίας προτού χορηγηθεί θεραπεία, αυξημένη συχνότητα SCEs ανά μετάφαση και μειωμένο MI (p<0,01) αναφορικά με τους μάρτυρες. Μολονότι σε μικρές ομάδες ασθενών η διάρκεια της εκδήλωσης της επιληψίας επέφερε αύξηση στις SCEs και πτώση στον MI, καμία διαφορά δεν παρατηρήθηκε εξαιτίας της επιμήκυνσης της θεραπείας. Ομοίως, κατά τη μελέτη της μεταλλαξιγόνου δυνατότητας της φαινυντοΐνης (PHT) σε επιληπτικούς, οι Taneja και συν. 114 σημείωσαν σημαντική αύξηση στη συχνότητα των SCEs στα λεμφοκύτταρα τόσο των ασθενών χωρίς λήψη θεραπείας, όσο και των ασθενών μετά τη χορήγηση PHT σε σχέση με φυσιολογικά άτομα. Δε βρέθηκε συσχέτιση των SCEs με το φύλο των ασθενών ή τη διάρκεια της θεραπείας. Με βάση τα αποτελέσματα και της μελέτης αυτής, η δημιουργία γενετικών βλαβών που εκτιμήθηκε με την αύξηση της συχνότητας των SCEs αποδόθηκε στους μηχανισμούς πρόκλησης της ασθένειας, ενώ νεώτερες έρευνες καταλήγουν σε αντίθετα συμπεράσματα. Συγκεκριμένα, στα περιφερικά λεμφοκύτταρα επιληπτικών ασθενών ηλικίας ετών οι Kaul και συν. 115 βρήκαν σημαντική αύξηση (p<0,001) στη συχνότητα των SCEs μετά τη χορήγηση PHT επί 9 μήνες τουλάχιστον, σε σχέση με τη συχνότητα των SCEs στα λεμφοκύτταρα των ίδιων ασθενών προ της χορήγησης του ίδιου φαρμάκου. Σε πιο πρόσφατη κυτταρογενετική μελέτη 116 δεν επισημάνθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ της συχνότητας των SCEs σε καλλιέργειες λεμφοκυττάρων φυσιολογικών μαρτύρων και επιληπτικών ασθενών, που δε λάμβαναν PHT, ενώ στα λεμφοκύτταρα 42 επιληπτικών ασθενών ηλικίας ετών, στους οποίους χορηγείτο PHT επί 9 μήνες, βρέθηκε σημαντική

56 56 αύξηση (p<0,001) στη συχνότητα των SCEs. Οι παρατηρήσεις αυτές συνηγορούν υπέρ της μη συμμετοχής των μηχανισμών της ασθένειας στην αύξηση της συχνότητας των SCEs. Οι ίδιοι ερευνητές κατέληξαν επίσης σε τρία επιπλέον συμπεράσματα: α) η ηλικία πιθανόν να επηρεάζει τη συχνότητα των SCEs αφού ασθενείς μεγαλύτερης ηλικίας (21-30 ετών) παρουσίαζαν υψηλότερες τιμές SCEs απ ότι νεότεροι ασθενείς (10-20 ετών) μετά τη λήψη του φαρμάκου, β) η συχνότητα των SCEs αυξάνει ανάλογα με τη διάρκεια της θεραπείας και γ) η συχνότητα των SCEs δεν εξαρτάται από το φύλο. 1. Αντιψυχωσικά φάρμακα ή μείζονα ηρεμιστικά H κυριότερη ένδειξη των αντιψυχωσικών φαρμάκων είναι η σχιζοφρενική ψύχωση. Άλλες ενδείξεις χορήγησης είναι η μανία, το οξύ ψυχωσικό επεισόδιο, παραληρητικές μορφές κατάθλιψης (μετά από ταυτόχρονη χορήγηση αντικαταθλιπτικού) και οργανικές ψυχώσεις. Τα φάρμακα αυτά είναι λιγότερο αποτελεσματικά στις χρόνιες παραληρητικές διαταραχές. Oρισμένα αντιψυχωσικά χρησιμοποιούνται και για την αντιμετώπιση της ναυτίας, του εμέτου κλπ. Βελτιώνουν τις διαταραχές της σκέψης, της αντίληψης, του συναισθήματος, την υπερκινητική συμπεριφορά και επηρεάζουν θετικά την επανασύνδεση του σχιζοφρενούς με το περιβάλλον του. H χορήγηση των αντιψυχωσικών επιτρέπει τον αποτελεσματικό έλεγχο των οξέων σχιζοφρενικών επεισοδίων και των υποτροπών της νόσου. H συνέχιση της χορήγησης αυτών μετά την υποχώρηση των συμπτωμάτων σε μειωμένες δόσεις αποβλέπει στην πρόληψη των υποτροπών που εμφανίζονται εβδομάδες ή και μήνες μετά τη διακοπή των φαρμάκων. Στην περίπτωση αυτή προτιμώνται μορφές παρατεταμένης δράσεως 118. Τα αντιψυχωσικά διακρίνονται στα κλασσικά ή τυπικά αντιψυχωσικά ή νευροληπτικά και τα άτυπα ή νέα (δεύτερης γενιάς) αντιψυχωσικά 117. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν κυρίως τα παράγωγα της φαινοθειαζίνης (χλωροπρομαζίνη), της βουτυροφαινόνης και του θειοξανθενίου (αλοπεριδόλη). Τα τυπικά αντιψυχωσικά είναι αποτελεσματικά στην αντιμετώπιση των θετικών συμπτωμάτων της σχιζοφρένειας. Ως πιο πιθανός τρόπος δράσεως θεωρείται ο αποκλεισμός των μετασυναπτικών

57 57 υποδοχέων D 2 της ντοπαμίνης, ενεργώντας ως συναγωνιστικοί ανταγωνιστές της ντοπαμίνης κεντρικά και περιφερικά 118. Η εμφάνιση εξωπυραμιδικών συμπτωμάτων αποδίδεται στην αντιντοπαμινεργική τους δράση. Οι κυριότερες παρενέργειες τους είναι: κινητικές διαταραχές (εξωπυραμιδικά συμπτώματα, δυσκινησία), κακόηθες νευροληπτικό σύνδρομο, καταστολή, διαταραχές σωματικού βάρους, υπερπρολακτιναιμία, φωτοευαισθησία. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν τα άτυπα ή νέα αντυψυχωσικά, τα οποία διαφέρουν σε δομή και δράση από τα τυπικά αντυψυχωσικά. Έχουν τα εξής χαρακτηριστικά: α) αποτελεσματικότητα έναντι τόσο των αρνητικών όσο και των θετικών συμπτωμάτων της σχιζοφρένειας β) αποτελεσματικότητα συχνά σε περιπτώσεις που δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν τα τυπικά αντιψυχωσικά γ) σπάνια προκαλούν κινητικές παρενέργειες Ο μηχανισμός δράσης τους θεωρείται ο εξής: μεγαλύτερη συγγένεια και ικανότητα δέσμευσης σε πολλαπλούς σεροτονινεργικούς υποδοχείς (5-ΗΤ) και ιδίως στον 5-ΗΤ 2Α υποδοχέα. όχι τόσο ισχυρή δέσμευση στους D 2 υποδοχείς της ντοπαμίνης, όπως τα τυπικά αντιψυχωσικά Το κύριο πλεονέκτημα της χορήγησης των άτυπων αντιψυχωσικών φαρμάκων στους ασθενείς με ψύχωση είναι η έλλειψη παρενεργειών τόσο κινητικών (τρόμος χεριών, δυσκαμψία), όσο και συναισθηματικών (κατάθλιψη, έλλειψη ενδιαφέροντος). Η συμμόρφωση με την θεραπεία είναι σχετικά υψηλή και οι ασθενείς σπάνια χρειάζεται να επανεισαχθούν στο νοσοκομείο. Οι κύριες ενδείξεις των άτυπων αντιψυχωσικών φαρμάκων είναι η αντιμετώπιση συμπτωμάτων που συναντώνται σε ψυχωσικές διαταραχές (ψυχωσικό επεισόδιο, σχιζοφρένεια, βραχεία ψυχωσική διαταραχή, παράνοια κ.ά.). Τα δεύτερης γενεάς, άτυπα, αντιψυχωσικά φάρμακα που έχουν εγκριθεί για την αντιμετώπιση της ψύχωσης και της διπολικής διαταραχής χρησιμοποιούνται και σε άλλες καταστάσεις όπως η άνοια και η κατάθλιψη χωρίς όμως ισχυρά στοιχεία για την αποτελεσματικότητά τους, Επίσης έχουν χρησιμοποιηθεί στην αντιμετώπιση της ψυχαναγκαστικής διαταραχής, της

58 58 άνοιας, στις διαταραχές προσωπικότητας, σε επιθετικότητα ή τάσεις αυτοκαταστροφής 119. ΚΛΟΖΑΠΙΝΗ Η σύνθεση της κλοζαπίνης έγινε για πρώτη φορά το 1958 και η χρήση της εγκρίθηκε σε 35 χώρες (κυρίως στην Ευρώπη και τη Νότια Αμερική) στην αρχή της δεκαετίας του Στις ΗΠΑ οι κλινικές δοκιμές άρχισαν το 1972, διεκόπησαν όμως το 1975 επειδή το φάρμακο συσχετίσθηκε με θανάτους, λόγω ακοκκιοκυτταραιμίας, αρκετών ασθενών στη Φινλανδία. Το φάρμακο αποσύρθηκε από την κυκλοφορία σε ορισμένες χώρες, ενώ η χρήση του τέθηκε υπό περιορισμό σε άλλες. Η κλοζαπίνη είναι ένα άτυπο αντιψυχωτικό και ανήκει στις τρικυκλικές διβενζοδιαζεπίνες. Πιστεύεται ότι η κλινική της αποτελεσματικότητα συνδέεται με την αλληλεπίδρασή της με ντοπαμινεργικά και σεροτονινεργικά συστήματα νευρομεταβίβασης. Η συνάφεια της κλοζαπίνης προς τους D2 υποδοχείς της ντοπαμίνης είναι σχετικά χαμηλή σε σύγκριση με τις αντίστοιχες των κλασικών αντιψυχωτικών παραγόντων 121, ενώ η συνάφειά της προς τους D1 122 και D4 123 υποδοχείς της ντοπαμίνης είναι σχετικά υψηλή. Δρα κατά προτίμηση στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες του μεσεγκεφαλομεταιχμιακού συστήματος και λιγότερο σε αυτούς του νεοραβδωτού σώματος. Επίσης, η κλοζαπίνη επιδεικνύει αξιόλογη συνάφεια προς τους χολινεργικούς μουσκαρινικούς υποδοχείς, τους υποδοχείς της σεροτονίνης {5-ΥΔΡΟΞΥΤΡΥΠΤΑΜΙΝΗΣ), τους ισταμινικούς και αδρενεργικούς υποδοχείς 124,125 Εικόνα 11 : Χημικός τύπος κλοζαπίνης

59 59 Η δοσολογία της κλοζαπίνης είναι η ακόλουθη: Συνιστάται η έναρξη της αγωγής με δόση 12.5 mg, χορηγούμενη μία ή δύο φορές τη μέρα και στη συνέχεια αύξηση της δοσολογίας κατά mg/ημέρα σε διάστημα 2-3 εβδομάδων, έως την επίτευξη mg/ημέρα. Στη συνέχεια, τυχόν αυξήσεις πρέπει να είναι σταδιακές και εξατομικευμένες ανάλογα με τα συμπτώματα. Η κλοζαπίνη χρησιμοποιείται κατά της σχιζοφρένειας και είναι σε πολλές περιπτώσεις αποτελεσματική σε καταστάσεις ανασταλτικές της χρήσης των τυπικών αντιψυχωσικών. Επιπλέον, μπορεί να ελαττώσει την επιθετική και εχθρική συμπεριφορά καθώς και τον κίνδυνο αυτοκτονίας. Επίσης, έχει χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία των L-dopa επαγώμενων ψυχωτικών συμπτωμάτων σε ασθενείς με Parkinson 118. Παρά το γεγονός ότι η κλοζαπίνη δεν προκαλεί εξωπυραμιδικά συμπτώματα και άλλες κινητικές διαταραχές, έχει σημαντικές παρενέργειες που περιορίζουν τη χρήση της 126. Μια σημαντική παρενέργειά της είναι η ακοκκυταραιμία, που προκαλείται στο 0,5%-1,5% περίπου των ασθενών. Η προκαλούμενη μείωση των λευκών αιμοσφαιρίων κατά την ακοκκυταραιμία μπορεί να οδηγήσει σε επικίνδυνη για τη ζωή λοίμωξη, οπότε οι ασθενείς που λαμβάνουν κλοζαπίνη χρειάζονται τακτικές εξετάσεις αίματος για τον έλεγχο των λευκών αιμοσφαιρίων κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Άλλες παρενέργειες του φαρμάκου είναι ζάλη, πονοκέφαλος, αδυναμία, πυρετός (5%), μεταβολές πίεσης (<10%), αρρυθμίες, ξηροστομία και επιληπτικές κρίσεις (3-5%). Επειδή παραμένει άγνωστος ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο η κλοζαπίνη προκαλεί την εμφάνιση ακοκκιοκυτταραιμίας, θα πρέπει να αποφεύγεται η ταυτόχρονη λήψη παραγόντων που είναι γνωστό ότι καταστέλλουν τη λειτουργία του μυελού των οστών. Είναι πιθανό να αυξηθούν στο πλάσμα τα επίπεδα φαρμάκων, τα οποία εμφανίζουν υψηλά ποσοστά δέσμευσης με τις πρωτεΐνες (π.χ. βαρφαρίνη, διγιτοξίνη), εάν τα φάρμακα αυτά χορηγηθούν ταυτόχρονα με την κλοζαπίνη. Επίσης, τα φάρμακα αυτά μπορεί να υποκαταστήσουν την κλοζαπίνη στις ενώσεις που σχηματίζει με τα πρωτεϊνικά μόρια, με αποτέλεσμα να σημειωθούν αυξημένες συγκεντρώσεις κλοζαπίνης στο πλάσμα 127. Αύξηση των συγκεντρώσεων της κλοζαπίνης στο πλάσμα μπορεί επίσης να προκληθεί όταν χορηγείται ταυτόχρονα με φάρμακα που

60 60 μεταβολίζονται από τα ένζυμα του κυττοχρώματος Ρ450 ή αναστέλλουν τη δράση τους (π.χ. πολλά αντικαταθλιπτικά, φαινοθειαζίνες, σιμετιδίνη, φλεκαϊνίδη, κινιδίνη, ρισπεριδό-νη). Η ταυτόχρονη χορήγηση φαινυτοΐνης ή καρβαμαζεπίνης ενδέχεται να μειώσει τις συγκεντρώσεις της κλοζαπίνης στο πλάσμα. Η υποτασική δράση των αντιυπερτασικών φαρμάκων και η αντιχολινεργική δράση των φαρμάκων που ομοιάζουν με την ατροπίνη μπορεί να ενισχυθούν από την κλοζαπίνη. Ο συνδυασμός κλοζαπίνης με βενζοδιαζεπίνες ή άλλα ψυχοτρόπα φάρμακα μπορεί να προκαλέσει collapsus και αναπνευστική ή/και καρδιακή ανακοπή. Αν και δεν έχει αποδειχθεί αλληλεπίδραση, απαιτείται μεγάλη προσοχή κατά την ταυτόχρονη χορήγηση αυτών των φαρμάκων. Σε μια μικρής κλίμακας αναδρομική ανάλυση (η=15), δε διαπιστώθηκε αλληλεπίδραση μεταξύ κλοζαπίνης και υπνωτικών, π.χ. ένυδρης χλωράλης και αμοβαρβιτάλης. Οι επιδράσεις της ταυτόχρονης χορήγησης βαλπροϊκού οξέος εμφανίζονται ως αμφιλεγόμενες. Σε δύο μικρής κλίμακας μελέτες, με τη συμμετοχή 4 και 7 σχιζοφρενών ασθενών αντίστοιχα, στους οποίους χορηγήθηκε κλοζαπίνη και βαλπροϊκό οξύ, οι συγκεντρώσεις της κλοζαπίνης στον ορό ήταν μειωμένες 128. Αντίθετα, οι Centorrino και συν. 129 ανέφεραν ελαφρά αύξηση των συγκεντρώσεων της κλοζαπίνης στον ορό, όταν αυτή χορηγήθηκε ταυτόχρονα με βαλπροϊκό οξύ σε 11 ασθενείς. Έχουν, επίσης, αναφερθεί περιστατικά αλληλεπίδρασης μεταξύ κλοζαπίνης και αμπικιλίνης, ερυθρομυκίνης, λιθίου ή καφεΐνης, με αποτέλεσμα να εμφανισθούν φαινόμενα τοξικότητας από την κλοζαπίνη 130. ΡΙΣΠΕΡΙΔΟΝΗ Η ρισπεριδόνη είναι ένα σχετικά νέο αντιψυχωσικό φάρμακο το οποίο παρασκευάστηκε από την εταιρεία Janssen Pharmaceuticals. Η εισαγωγή της στην αγορά έγινε στις αρχές της δεκαετίας του 1990 με την εμπορική ονομασία Risperdal. Χαρακτηρίζεται ως ατυπική δραστική ουσία αν και παρουσιάζει ορισμένες από τις εξωπυραμιδικές παρενέργειες των αντιψυχωσικών φαρμάκων προηγούμενης γενιάς, ιδιαίτερα σε υψηλή δοσολογία.

61 61 Η ρισπεριδόνη ανήκει στην οικογένεια των βενζισοξαζολών και η επιστημονική της ονομασία είναι 3-[2-[4-(6-φθορο-1,2βενζισαξοζολο-3-υλο)-1- πιπεριδινυλ]αιθυλο]-6,7,8,9-τετραϋδρο-2-μεθυλο-4h-πυριδο[1,2-α]πυριμιδινο- 4-ονη. Ο χημικός της τύπος είναι C 23 H 27 FN 4 O 2. Πρόκειται για μια λευκή σκόνη σχεδόν αδιάλυτη στο νερό, ενώ είναι πλήρως διαλυτή στο διχλωρομεθάνιο και αρκετά διαλυτή στη μεθανόλη και σε 0,1 Ν HCl 131. Εικόνα 12 : Χημικός τύπος ρισπεριδόνης Η ρισπεριδόνη είναι εκλεκτικός μονοαμινεργικός ανταγωνιστής με ειδικές ιδιότητες. Έχει μεγάλη συγγένεια με τους 5ΗΤ2 σεροτονινεργικούς και D 2 ντοπαμινεργικούς υποδοχείς. Συνδέεται επίσης με τους α 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς και σε μικρότερο βαθμό με τους Η 1 - ισταμινεργικούς και α 2 - αδρενεργικούς υποδοχείς. Δεν έχει χημική συγγένεια με τους χολινεργικούς υποδοχείς. Αν και η ρισπεριδόνη είναι ένας ισχυρός D 2 ανταγωνιστής, ο οποίος θεωρείται ότι βελτιώνει τα θετικά συμπτώματα της σχιζοφρένειας, προκαλεί μικρότερου βαθμού καταστολή της κινητικής δραστηριότητας και επαγωγή της καταληψίας από τα κλασσικά νευροληπτικά. Ως εξισορροπημένος κεντρικός ανταγωνιστής της σεροτονίνης και της ντοπαμίνης μπορεί να προκαλέσει μείωση της προδιάθεσης για εξωπυραμιδικές ανεπιθύμητες ενέργειες και να επεκτείνει την θεραπευτική δράση στα αρνητικά συμπτώματα και στις διαταραχές του συναισθήματος της σχιζοφρένειας 132. Η ρισπεριδόνη μπορεί να χορηγείται μία ή δύο φορές την ημέρα. Η χορήγηση επιβάλλεται να αρχίσει με 2mg ρισπεριδόνης την ημέρα. Η δόση μπορεί να αυξηθεί την δεύτερη ημέρα σε 4mg. Κατόπιν, αν χρειασθεί, η

62 62 δοσολογία μπορεί να παραμείνει αμετάβλητη, ή να εξατομικευθεί περαιτέρω. Για τους περισσότερους ασθενείς οι αποτελεσματικότερες ημερήσιες δόσεις κυμαίνονται μεταξύ 4 και 6 mg. Σε ορισμένους ασθενείς υπάρχει περίπτωση να είναι κατάλληλη μια βραδύτερη φάση εξατομίκευσης-τιτλοδότησης και χαμηλότερες δόσεις έναρξης και συντήρησης. Δόσεις μεγαλύτερες από 10mg την ημέρα δεν παρουσίασαν καλύτερη αποτελεσματικότητα από αυτήν χαμηλότερων δόσεων, ενώ μπορεί να προκαλέσουν εξωπυραμιδικά συμπτώματα. Επειδή η ασφάλεια δόσεων μεγαλύτερων από 16mg την ημέρα δεν έχει εκτιμηθεί, δόσεις μεγαλύτερες αυτών δεν πρέπει να χορηγούνται. Αν είναι αναγκαία επιπρόσθετη καταστολή στη θεραπεία με ρισπεριδόνη, μπορεί να προστεθεί μια βενζοδιαζεπίνη. Αρχικά, η φαρμακολογική δράση της ρισπεριδόνης στόχευε στην καταπολέμηση των συμπτωμάτων της σχιζοφρένειας. Βρίσκει επίσης εφαρμογή στη θεραπεία επεισοδίων μανίας (παραφυσικά υπέρμετρη κατάσταση ευφορίας ή θυμού) ή μικτών επεισοδίων (συμπτώματα μανίας και κατάθλιψης ταυτόχρονα) σε ασθενείς με διπολική διαταραχή. Τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιείται και για τη θεραπεία ψυχωσικών ασθενειών σε αυτιστικά παιδιά και εφήβους. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται για να μειώσει την επιθετικότητά τους καθώς επίσης και να τους αποτρέψει από επεισόδια αυτοτραυματισμού και απότομης αλλαγής διάθεσης 126. Παρενέργειες της ρισπεριδόνης είναι η ρινική συμφόρηση, η ορθοστατική υπόταση, η αϋπνία και πιθανώς τα εξωπυραμιδικά συμπτώματα. Λόγω της μικτής φύσης της μπορεί να προκαλέσει και κακόηθες νευροληπτικό σύνδρομο. Σε μελέτες (υπο)οξείας τοξικότητας, στις οποίες το φάρμακο χορηγήθηκε σε σεξουαλικώς ανώριμους αρουραίους και σκύλους, δοσοεξαρτώμενες επιδράσεις εμφανίστηκαν στο γεννητικό σύστημα τόσο των αρρένων όσο και των θηλέων πειραματοζώων, καθώς και στους μαστικούς αδένες. Αυτές οι επιδράσεις σχετίζονταν με τα αυξημένα επίπεδα προλακτίνης στον ορό, σαν αποτέλεσμα της ανασταλτικής δράσης της ρισπεριδόνης στους ντοπαμινεργικούς D 2 υποδοχείς. Μελέτες καρκινογένεσης έγιναν σε ποντικούςτης φυλής Albino και σε αρουραίους τύπου Wistar. Οι δόσεις της ρισπεριδόνης που χορηγήθηκαν ήταν 2,4 φορές 9,4 φορές και 37,5 φορές μεγαλύτερες από τη μέγιστη ανθρώπινη δόση σε mg/kg. Παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές αυξήσεις

63 63 σε αδενώματα της υπόφυσης, σε ενδοκρινικά παγκρεατικά αδενώματα και σε αδενοκαρκινώματα μαστικού αδένα. Στα τρωκτικά, τα αντιψυχωσικά φάρμακα έχουν δείξει ότι αυξάνουν χρονικά τα επίπεδα προλακτίνης. Κατά τη διάρκεια μελετών καρκινογένεσης με ρισπεριδόνη δεν μετρήθηκαν επίπεδα προλακτίνης στον ορό. Παρ όλα αυτά, μετρήσεις κατά τη διάρκεια μελετών υποχρόνιας τοξικότητας έδειξαν ότι ίδιες δόσεις ρισπεριδόνης που χορηγήθηκαν στις μελέτες καρκινογένεσης αύξησαν τα επίπεδα προλακτίνης στον ορό ποντικών και αρουραίων 5-6 φορές. Μετά από χρόνια χορήγηση άλλων αντιψυχωσικών φαρμάκων παρατηρήθηκε αύξηση της εμφάνισης νεοπλασμάτων μαστικών αδένων, υπόφυσης και ενδοκρινούς μοίρας του παγκρέατος στα τρωκτικά, για τα οποία η προλακτίνη θεωρήθηκε προαγωγική ουσία. Η συσχέτιση των ευρημάτων αυτών στα τρωκτικά με τον αντίστοιχο κίνδυνο στον άνθρωπο είναι άγνωστη. Σε in vitro και in vivo μελέτες που πραγματοποιήθηκαν, δε βρέθηκαν στοιχεία που να μαρτυρούν πιθανή μεταλλαξιογόνο δράση της ρισπεριδόνης. Σε τρεις μελέτες αναπαραγωγής, η ρισπεριδόνη, χορηγούμενη σε αρουραίους Wistar σε δόσεις 0,1 ως 3 φορές μεγαλύτερες από τη μέγιστη συνιστώμενη ανθρώπινη δόση σε mg/m 2, δεν έδειξε να επηρεάζει τη γονιμότητα. Σε μια μελέτη υποχρόνιας τοξικότητας σε σκύλους Beagle, στην οποία η ρισπεριδόνη χορηγήθηκε σε δόσεις 0,31 ως 5mg/kg, η κινητικότητα του σπέρματος και η συγκέντρωση ελαττώθηκαν σε δόσεις 0,6 ως 10 φορές την ανθρώπινη δόση σε mg/m 2. Δοσοεξαρτώμενες μειώσεις σημειώθηκαν επίσης, στην τεστοστερόνη ορού στις ίδιες δόσεις. Τόσο η τεστοστερόνη του ορού όσο και οι παράμετροι του σπέρματος παρουσίασαν σχετική βελτίωση, αλλά παρέμειναν ελαττωμένες μετά τη διακοπή της θεραπείας. Σε αρουραίους ή σκύλους δεν βρέθηκαν δόσεις στις οποίες δεν παρατηρείται δράση. Το ενδεχόμενο τερατογένεσης της ρισπεριδόνης μελετήθηκε σε τρεις μελέτες Segment II με πειραματόζωα αρουραίους των φυλών Wistar και Sprague- Dawley και σε μία μελέτη Segment II με πειραματόζωα κουνέλια New Zealand. Η συχνότητα εμφάνισης διαμαρτιών της διάπλασης δεν ήταν αυξημένη στους απογόνους των αρουραίων ή των κουνελιών, στους οποίους χορηγείτο το φάρμακο σε δόσεις 0,4 ως 6 φορές μεγαλύτερες από την ανθρώπινη δόση σε mg/m 2. Σε τρεις μελέτες αναπαραγωγής σε αρουραίους, οι οποίοι λάμβαναν ρισπέριδόνη σε δόσεις 0,3 ως 3 φορές μεγαλύτερες από

64 64 την ανθρώπινη δόση σε mg/m 2 υπήρξε μια αύξηση στους θανάτους των νεογνών κατά τη διάρκεια των πρώτων 4 ημερών της γαλουχίας. Δεν έγινε γνωστό αν αυτοί οι θάνατοι οφείλονταν σε άμεση επίδραση στα έμβρυα ή στα νεογνά ή σε έμμεση επίδραση από τις μητέρες. Δεν βρέθηκε δόση στην οποία δεν παρατηρείται επίδραση για αυξημένη θνησιμότητα σε νεογνά αρουραίων. Σε μια μελέτη Segment III, σημειώθηκε μια αύξηση σε θνησιγενή νεογνά αρουραίων, όταν το φάρμακο χορηγήθηκε σε δόση 1,5 φορά μεγαλύτερη από την ανθρώπινη δόση σε mg/m 2. Μεταφορά της ρισπεριδόνης μέσω του πλακούντα παρατηρήθηκε σε νεογνά αρουραίων. Δεν έγιναν επαρκείς και καλά ελεγχόμενες μελέτες σε εγκύους. Παρ όλα αυτά, υπάρχει μία αναφορά περίπτωσης απλασίας του τυλώδους σώματος (ή μεσολοβίου) σε ένα νεογνό που εκτέθηκε σε ρισπεριδόνη στη μήτρα. Η αιτιολογική συσχέτιση με τη θεραπεία με ρισπεριδόνη είναι άγνωστη 132. Οι κίνδυνοι χορήγησης ρισπεριδόνης σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα δεν έχουν συστηματικά αξιολογηθεί. Δεδομένης της πρωταρχικής δράσης της στο ΚΝΣ, η ρισπεριδόνη πρέπει να χρησιμοποιείται με προσοχή σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα που έχουν επίσης δράση στο ΚΝΣ. Η ρισπεριδόνη μπορεί να ανταγωνίζεται την δράση της λεβοντόπα και άλλων αγωνιστών της ντοπαμίνης. Η καρβαμαζεπίνη έχει δείξει ότι ελαττώνει τα επίπεδα στο πλάσμα του ενεργού αντιψυχωσικού μεταβολίτη της ρισπεριδόνης. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν παρατηρηθεί με άλλους επαγωγείς ηπατικών ενζύμων. Σε διακοπή της χορήγησης της καρβαμαζεπίνης ή των άλλων επαγωγέων ηπατικών ενζύμων, η δοσολογία της ρισπεριδόνης πρέπει να επανεκτιμάται και, αν είναι απαραίτητο, να ελαττώνεται. Η τοπιραμάτη μειώνει μετρίως τη βιοδιαθεσιμότητα της ρισπεριδόνης, αλλά όχι του ενεργού αντιψυχωσικού κλάσματος. Για το λόγο αυτό, είναι απίθανο αυτή η αλληλεπίδραση να έχει κλινική σημασία. Φαινοθειαζίνες, τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά και ορισμένοι β-αναστολείς μπορούν να προκαλέσουν αύξηση των επιπέδων της ρισπεριδόνης στο πλάσμα, αλλά όχι και του αντιψυχωσικού μεταβολίτη. Η αμιτριπτυλίνη δεν επιδρά στη φαρμακοκινητική της ρισπεριδόνης ή του ενεργού αντιψυχωσικού μεταβολίτη. Η σιμετιδίνη και η ρανιτιδίνη αυξάνουν τη βιοδιαθεσιμότητα της ρισπεριδόνης αλλά μόνο οριακά αυτή του ενεργού αντιψυχωσικού μεταβολίτη. Η φλουοξετίνη και η παροξετίνη, αναστολείς του CYP 2D6, αυξάνουν τα

65 65 επίπεδα της ρισπεριδόνης στο πλάσμα, αλλά σε μικρότερο βαθμό αυτών του ενεργού αντιψυχωσικού μεταβολίτη. Όταν αρχίζει ή διακόπτεται η ταυτόχρονη χορήγηση φλουοξετίνης ή παροξετίνης, ο θεράπων γιατρός θα πρέπει να επαναξιολογεί τη δοσολογία της ρισπεριδόνης. Η ερυθρομυκίνη, ένας αναστολέας του CYP 3A4, δεν αλλάζει τη φαρμακοκινητική της ρισπεριδόνης και του ενεργού αντιψυχωσικού μεταβολίτη. Οι αναστολείς χολινεστεράσης, γκαλανταμίνη και ντονεζεπίλη, δεν εμφανίζουν κλινικά σημαντική δράση στη φαρμακοκινητική της ρισπεριδόνης και του ενεργού αντιψυχωσικού μεταβολίτη. Όταν η ρισπεριδόνη χορηγείται ταυτόχρονα με άλλα φάρμακα που έχουν υψηλή πρωτεϊνική σύνδεση, δεν υπάρχει κλινικά σημαντική εκτόπιση, είτε της ρισπεριδόνης είτε των άλλων φαρμάκων, από τις πρωτεΐνες του πλάσματος. Η ρισπεριδόνη δεν εμφανίζει κλινικά σημαντική επίδραση στη φαρμακοκινητική του λιθίου, του βαλπροϊκού ή της διγοξίνης. ΟΛΑΝΖΑΠΙΝΗ Η ολανζαπίνη είναι παράγωγο της θειενοβενζοδιαζεπίνης. Έχει την πλησιέστερη στην κλοζαπίνη χημική δομή από όλα τα νεώτερα άτυπα αντιψυχωσικά και παρόμοιο προφίλ. Εγκρίθηκε από το FDA για χρήση στη σχιζοφρένεια το Στην Ελλάδα κυκλοφόρησε τον Δεκέμβριο του H ολανζαπίνη είναι ένας αντιψυχωτικός, αντιμανιακός και σταθεροποιητικός της διάθεσης παράγοντας, ο οποίος εκδηλώνει ένα ευρύ φαρμακολογικό προφίλ επιδράσεων σε ένα αριθμό συστημάτων υποδοχέων. Στις προκλινικές μελέτες, η ολανζαπίνη έδειξε χημική συγγένεια (Κi <100 nμ) για ευρύ φάσμα υποδοχέων όπως οι υποδοχείς της σεροτονίνης 5-HT2A/2C, 5- HT3, 5- HT6, οι υποδοχείς της ντοπαμίνης D1, D2, D3, D4, D5, οι χολινεργικοί μουσκαρινικοί υποδοχείς m1-m5, οι αδρενεργικοίυποδοχείς α1 και οι υποδοχείς της ισταμίνης H1. Οι μελέτες συμπεριφοράς σε ζώα μετά από χορήγηση ολανζαπίνης έδειξαν 5-ΗΤ, ντοπαμινικό και χολινεργικό ανταγωνισμό, συμβατό με το προφίλ σύνδεσης υποδοχέων του φαρμάκου. Η ολανζαπίνη εμφάνισε μεγαλύτερη in vitro συγγένεια για τους υποδοχείς της σεροτονίνης 5-HT2 παρά για τους υποδοχείς της ντοπαμίνης D2 και μεγαλύτερη 5-HT2 παρά D2 δραστηριότητα σε in vivo μοντέλα (πρότυπα). Ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες έδειξαν ότι η ολανζαπίνη εκλεκτικά μείωσε το

66 66 ρυθμό πυροδότησης των μεσομεταιχμιακών (Α10) ντοπαμινεργικών νευρώνων, ενώ έχει μικρή επίδραση στη ραβδωτή οδό (Α9) η οποία εμπλέκεται στην κινητική λειτουργία. Η ολανζαπίνη μείωσε μια εξαρτημένη αντίδραση αποφυγής, δοκιμασία ενδεικτική αντιψυχωτικής δραστηριότητας, σε δόσεις μικρότερες από αυτές που προκαλούν καταληψία, μια δράση ενδεικτική κινητικών παρενεργειών. Aντίθετα προς άλλους αντιψυχωτικούς παράγοντες, η ολανζαπίνη αυξάνει την ανταπόκριση σε μια αγχολυτική δοκιμασία. Εικόνα 13 : Χημικός τύπος ολανζαπίνης Η συνιστώμενη θεραπευτική δόση ανέρχεται σε mg/ημέρα. Σε κάποιες μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί και μεγαλύτερες δόσεις (25-40 mg/ημέρα). Υπάρχουν αναφορές στις οποίες η ολανζαπίνη σε ακόμα μεγαλύτερες δόσεις (50-60 mg/ημέρα) βελτιώνει την κοινωνική λειτουργικότητα ή και την ψυχοπαθολογία σχιζοφρενικών ασθενών. Η ολανζαπίνη ενδείκνυται για τη θεραπεία της σχιζοφρένειας. Είναι αποτελεσματική στη διατήρηση της κλινικής βελτίωσης, κατά τη διάρκεια της συνεχιζόμενης θεραπείας σε ασθενείς, οι οποίοι εμφάνισαν αρχικά ανταπόκριση στη θεραπεία. Επίσης, ενδείκνυται για τη θεραπεία μέτριου έως σοβαρού μανιακού επεισοδίου. Σε ασθενείς στους οποίους το μανιακό επεισόδιο ανταποκρίθηκε στη χορήγηση ολανζαπίνης, η ολανζαπίνη ενδείκνυται για την πρόληψη των υποτροπών σε ασθενείς με διπολική διαταραχή Οι πιο συχνά αναφερόμενες (παρατηρήθηκαν σε 1% των ασθενών) ανεπιθύμητες ενέργειες, οι οποίες σχετίζονταν με τη χορήγηση ολανζαπίνης κατά τη διάρκεια των κλινικών δοκιμών, ήταν υπνηλία, αύξηση σωματικού

67 67 βάρους, ηωσινοφιλία, αυξημένα επίπεδα προλακτίνης, χοληστερόλης, γλυκόζης και τριγλυκεριδίων, γλυκοζουρία, αυξημένη όρεξη, ζάλη, ακαθησία, παρκινσονισμός, δυσκινησία, ορθοστατική υπόταση, αντιχολινεργικές επιδράσεις, παροδικές ασυμπτωματικές αυξήσεις των ηπατικών τρανσαμινασών, εξάνθημα, εξασθένιση, κόπωση και οίδημα. H ολανζαπίνη δεν έχει τερατογόνες επιδράσεις. H καταστολή επηρέασε την ικανότητα ζευγαρώματος των αρρένων αρουραίων. Oι οιστρικοί κύκλοι επηρεάσθηκαν σε δόσεις 1,1 mg/kg (3 φορές ανώτερες της μεγίστης ανθρώπινης δόσης) και οι παράμετροι αναπαραγωγής επηρεάσθηκαν σε αρουραίους που έλαβαν δόσεις 3 mg/kg (9 φορές ανώτερες της μέγιστης ανθρώπινης δόσης). Στους απογόνους αρουραίων που έλαβαν ολανζαπίνη, παρατηρήθηκαν καθυστερήσεις της ανάπτυξης των εμβρύων και παροδικές μειώσεις της δραστηριότητάς τους. H ολανζαπίνη δεν προκάλεσε μεταλλάξεις σε όλες τις τυπικές δοκιμασίες, οι οποίες περιλάμβαναν δοκιμασίες μετάλλαξης σε βακτηρίδια και in vitro και in vivo δοκιμασίες σε θηλαστικά. Με δεδομένα τα αποτελέσματα των μελετών σε ποντικούς και αρουραίους, συμπεραίνεται ότι η ολανζαπίνη από του στόματος δεν έχει καρκινογόνο δράση. Επειδή η ολανζαπίνη μεταβολίζεται μέσω του CYP1A2 (κυτόχρωμα P450-12A), οι ουσίες που προκαλούν επαγωγή ή αναστολή ειδικά του ισοενζύμου αυτού, ενδέχεται να επηρεάσουν τις φαρμακοκινητικές ιδιότητες της ολανζαπίνης. Επαγωγή του CYP1A2. Ο μεταβολισμός της ολανζαπίνης μπορεί να ενισχυθεί από το κάπνισμα και από την καρβαμαζεπίνη, με αποτέλεσμα να παρατηρηθεί μείωση των συγκεντρώσεων της ολανζαπίνης. Έχει αναφερθεί μόνο μικρή έως μέτρια αύξηση της κάθαρσης της ολανζαπίνης. Οι κλινικές επιπτώσεις αναμένεται να είναι περιορισμένες αλλά συνιστάται η κλινική παρακολούθηση των ασθενών. Εάν κριθεί απαραίτητο, μπορεί να γίνει αύξηση της δόσης της ολανζαπίνης. Αναστολή του CYP1A2. Η φλουβοξαμίνη, ένας ειδικός αναστολέας του CYP1A2, έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει σημαντικά τον μεταβολισμό της ολανζαπίνης. Η μέση αύξηση της μέγιστης συγκέντρωσης (Cmax) της ολανζαπίνης, μετά τη χορήγηση της φλουβοξαμίνης, ήταν 54% σε γυναίκες μη καπνιστές και 77% σε άνδρες καπνιστές. Η μέση αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας της ολανζαπίνης ήταν 52% και 108% αντίστοιχα. Η χορήγηση μικρότερης δόσης έναρξης της θεραπείας με ολανζαπίνη θα πρέπει να εξετάζεται σε ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουν

68 68 φλουβοξαμίνη ή άλλους αναστολείς του CYP1A2, όπως η σιπροφλοξασίνη. Σε περίπτωση έναρξης θεραπείας με έναν αναστολέα του CYP1A2, το ενδεχόμενο μείωσης της δοσολογίας της ολανζαπίνης θα πρέπει να εξετάζεται 134. ΖΙΠΡΑΖΙΔΟΝΗ Η ζιπρασιδόνη, μια βενζοϊσοθειαζολοπιπεραζίνη, ανήκει φαρμακολογικά στην ομάδα των αντιψυχωτικών. Είναι ένα νευροληπτικό φάρμακο, που δεν παρουσιάζει καμία χημική συγγένεια με άλλο τυπικό, αλλά ούτε και με κανένα άτυπο νευροληπτικό. Η ζιπραζιδόνη ανήκει στην κατηγορία των άτυπων αντιψυχωσικών. Είναι ένας ισχυρός D2 ανταγωνιστής τόσο in vivo όσο και in vitro, ενώ διαθέτει πέντε έως έξι φορές ασθενέστερη χημική συγγένεια με τον D2 υποδοχέα, απ ότι η υψηλής ισχύος κλασσική αλοπεριδόλη. Οι in vivo μελέτες έδειξαν μία δοσοεξαρτώμενη δέσμευση στους D2 υποδοχείς, που κλινικά σημαίνει ότι παρατηρείται αντιψυχωσική δράση του φαρμάκου χωρίς κινητικές εξωπυραμιδικές ανεπιθύμητες ενέργειες. Η ζιπραζιδόνη διαθέτει γενικά υψηλή χημική συγγένεια με όλους τους D2 υποδοχείς. Η δέσμευση της στους D3 υποδοχείς είναι εξίσου ισχυρή όπως και στους D2 υποδοχείς, ενώ η δράση της στους D4 υποδοχείς είναι λιγότερο έκδηλη. Είναι ένας ισχυρός 5HT2A ανταγωνιστής με σημαντικά υψηλότερη ικανότητα δέσμευσης στους 5HT2A υποδοχείς απ ότι στους D2 υποδοχείς. Διαθέτει επίσης υψηλή συγγένεια και με άλλους διαφορετικούς υπότυπους των 5ΗΤ υποδοχέων. Με βάση το μοντέλο δράσης της, η ζιπραζιδόνη θεωρήθηκε ως ο κύριος δρών αγωνιστής των 5ΗΤ1Α υποδοχέων, σε αντίθεση με τα άλλα άτυπα αντιψυχωτικά. Παρουσιάζει μέτρια μόνο χημική συγγένεια προς τους α1 αδρενεργικούς υποδοχείς. Στην ιδιότητα αυτή οφείλεται η καλή της ανοχή όσον αφορά τις καρδιοπάθειες και τις παθήσεις του κυκλοφορικού συστήματος. Διαθέτει πολύ ασθενή χημική συγγένεια προς τους Η1 υποδοχείς και για αυτό το λόγο ασκεί ήπιας μορφής υπνωτική δράση, ενώ παράλληλα δεν προκαλεί αύξηση του σωματικού βάρους 135.

69 69 S N Cl N N (CH 2 ) 2 H N O. HC l. H 2O Εικόνα 14 : Χημικός τύπος ζιπραζιδόνης Η συνιστώμενη δόση για τη θεραπεία οξέων επεισοδίων είναι 40 mg δύο φορές ημερησίως ταυτόχρονα με τη λήψη τροφής. Η ημερήσια δόση μπορεί στη συνέχεια να προσαρμοστεί με βάση την κλινική κατάσταση του κάθε ασθενούς μέχρι τη μέγιστη δόση των 80 mg δύο φορές ημερησίως. Η μέγιστη συνιστώμενη δόση μπορεί να χορηγηθεί ακόμα και από την 3η ημέρα της θεραπείας, εφόσον αυτό ενδείκνυται. Κατά τη θεραπεία συντήρησης πρέπει να χορηγείται στους ασθενείς η χαμηλότερη αποτελεσματική δόση. Σε πολλές περιπτώσεις δόση 20 mg δύο φορές ημερησίως μπορεί να είναι επαρκής. H ζιπρασιδόνη χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των συμπτωμάτων των ψυχωσικών διαταραχών όπως η σχιζοφρένεια, που μπορεί να περιλαμβάνουν ακουστικές ή οπτικές ψευδαισθήσεις, παραληρητικές ιδέες, ασυνήθιστη καχυποψία ή απόσυρση από το οικογενειακό και φιλικό περιβάλλον. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες της ζιπραζιδόνης είναι οι ακόλουθες: Οργανικό Πολύ Συχνές Όχι συχνές Σπάνιες σύστημα συχνές (> 1/100, < 1/10) (> 1/1000, (> 1/10000, (> 1/10) < 1/100) < 1/1000) Οργανισμός ως Εξασθένιση Άλγος Αλλεργική σύνολο κεφαλαλγία αντίδραση, πυρετός δκαρδιαγγειακό Ορθοστατική Ημκρανία υπόταση, ταχυκαρδία

70 70 Πεπτικό Δυσκοιλιότητα, ξηροστομία, δυσπεψία, σιελόρροια, ναυτία, έμετος Αιμοοποιητικό και λεμφικό Μεταβολισμός και θρέψη Μυοσκελετικό Νευρικό Υπνηλία Ψυχοκινητική διέγερση, ακαθησία, ζάλη, δυστονία, εξωπυραμιδική συνδρομή, υπερτονία, τρόμος Αναπνευστικό Δέρμα και εξαρτήματα Ειδικές Διαταραχές της αισθήσεις όρασης Ουρογεννητικό Μετεωρισμός Δίψα Διαταραχές αρθρώσεων, κράμπες κάτω άκρων Δυσκαμψία τύπου "οδοντωτού τροχού", παραισθησίες, διαταραχές λόγου, όψιμη δυσκινησία Ρινίπδα Κηλιδοβλατιδώδες εξάνθημα, εξάνθημα, κνίδωση Οίδημα γλώσσας Ηωσινοφιλία Αύξηση της γαλακτικής αφυδρογονάσης Μυαλγίες, μυασθένεια Εφιάλτες, διαταραχές βηματισμού, ακινησία, αταξία, ψευδαισθήσεις, νευροπάθεια, παράλυση, ίλιγγος Ψωρίαση, δερματικές διαταραχές Αμβλυωπία, επιπεφυκίτιδα, ξηροφθαλμία Δυσουρία, γυναικομαστία, : ανικανότητα, ακράτεια ούρων

71 71 Σύμφωνα με πειράματα τοξικότητας κατά την αναπαραγωγική φάση πειραματοζώων όταν χορηγήθηκε η μέγιστη θεραπευτική δόση ζιπραζιδόνης, δεν διαπιστώθηκαν ενδείξεις τερατογένεσης. Παρατηρήθηκε, ωστόσο, χαμηλότερη γονιμότητα, μείωση του βάρους του σώματος βρεφών, υψηλότερη περιγεννητική θνησιμότητα και καθυστέρηση στην ανάπτυξη. Φαρμακοκινητικές και φαρμακοδυναμικές μελέτες με ζιπραζιδόνη και άλλα φάρμακα, τα οποία προκαλούν παράταση του διαστήματος QT δεν έχουν πραγματοποιηθεί. Συνεργική δράση της ζιπραζιδόνης με αυτά τα φάρμακα δεν μπορεί να αποκλεισθεί και κατά συνέπεια η ζιπραζιδόνη δεν πρέπει να χορηγείται με φαρμακευτικά προϊόντα, τα οποία προκαλούν παράταση του διαστήματος QT, όπως αντιαρρυθμικά φάρμακα τάξης Ια και ΙΙΙ, τριοξείδιο του αρσενικού, αλοφαιτρίνη, οξική λεβομεθαδίλη, μεζοριδαζίνη, θειοριδαζίνη, πιμοζίδη, σπαρφλοξασίνη, γκατιφλοξασίνη, μοξιφλοξασίνη, μεθανοσουλφονική δολασετρόνη, μεφλοκίνη, σερτινδόλη ή σιζαπρίδη. Λαμβάνοντας υπόψη τις κύριες επιδράσεις της ζιπραζιδόνης στο ΚΝΣ, απαιτείται προσοχή όταν λαμβάνεται σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα που δρουν στο ΚΝΣ, καθώς και με οινοπνευματώδη ποτά. Μία in vivo μελέτη με δεξτρομεθορφάνη δεν έδειξε αξιοσημείωτη αναστολή του CYP2D6 σε συγκεντρώσεις πλάσματος 50% χαμηλότερες από εκείνες που επιτεύχθηκαν μετά από λήψη 40 mg ζιπραζιδόνης δύο φορές ημερησίως. Δεδομένα in vitro υποδεικνύουν ότι η ζιπραζιδόνη είναι πιθανό να αποτελεί έναν μέτριο αναστολέα των CYP2D6 και CYP3A4. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι η ζιπραζιδόνη επιδρά, σε κλινικά σημαντικό βαθμό, στη φαρμακοκινητική φαρμάκων που μεταβολίζονται από αυτές τις ισομορφές. Η χορήγηση ζιπραζιδόνης δεν επηρέασε σημαντικά τη φαρμακοκινητική των συστατικών αντισυλληπτικού φαρμάκου, δηλαδή του οιστρογόνου (ethinyl oestradiol - υπόστρωμα του CYP3A4) ή του προγεστερινοειδούς. Ταυτόχρονη χορήγηση ζιπραζιδόνης και λιθίου δεν είχε επίδραση στη φαρμακοκινητική του λιθίου 136.

72 72 2. Αγχολυτικά ή ήπια ηρεμιστικά-βενζοδιαζεπίνες Γενικά τα φάρμακα αυτής της κατηγορίας δρουν ως αγχολυτικά, όταν χορηγούνται σε μικρές δόσεις στη διάρκεια της ημέρας και ως υπνωτικά σε μεγαλύτερες δόσεις το βράδυ. Παλαιότερα χρησιμοποιήθηκαν κυρίως τα βαρβιτουρικά, τα ανάλογά τους μη βαρβιτουρικά υπνωτικά και η μεπροβαμάτη. Σήμερα τα φάρμακα αυτά έχουν σχεδόν αντικατασταθεί από τις βενζοδιαζεπίνες, αφ ενός λόγω του ότι αυτές είναι ελάχιστα τοξικές και αφ ετέρου η εξάρτηση που προκαλούν είναι σπανιότερη και ηπιότερη. Εξαιτίας της αποτελεσματικότητας και ασφάλειας τους, αλλά και της μεγάλης συχνότητας του άγχους και της αϋπνίας στον πληθυσμό, οι βενζοδιαζεπίνες έχουν ευρύτατη χρήση. Aν και εξάρτηση μπορεί να συμβεί ακόμη και με θεραπευτικές δόσεις μετά από μακρά, μεγαλύτερη των 6 μηνών λήψη, ο κίνδυνος να προκύψουν σοβαρά προβλήματα εξάρτησης είναι πολύ μικρός. Το ενδεχόμενο της εξάρτησης θα πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη κατά τη χορήγηση των βενζοδιαζεπινών, αλλά και δεν επιτρέπεται, λόγω υπερβολικού φόβου, να αποστερούνται μιας αποτελεσματικής θεραπείας ασθενείς που υποφέρουν από άγχος ή αϋπνία 137. Ο μηχανισμός δράσης των βενζοδιαζεπινών είναι ο εξής: Οι βενζοδιαζεπίνες διεγείρουν τους ανασταλτικούς νευρώνες του ΚΝΣ, δρώντας στα σημεία εκείνα, όπου το GABA (γ-αμινοβουτυρικό οξύ) δρα ως ανασταλτικός νευροδιαβιβαστής (στον φλοιό του εγκεφάλου, στον υποθάλαμο, στη μέλαινα ουσία, στον ιππόκαμπο και στην παρεγκεφαλίδα). Οι ενέργειες αυτές φαίνεται ότι είναι εξειδικευμένες, αφού συμβαίνουν σε συγκεντρώσεις που δεν επηρεάζουν την δράση άλλων νευροδιαβιβαστών όπως της νορ-αδρεναλίνης και της σεροτονίνης. Οι βενζρδιαζεπίνες δεν υποκαθιστούν το GABA δρώντας στις ίδιες θέσεις σύνδεσης, αλλά ενισχύουν την δράση του στο άνοιγμα των διαύλων ιόντων χλωρίου (Cl - ). Μηχανιστικά, οι βενζοδιαζεπίνες και τα βαρβιτουρικά συνδέονται στους GABA A υποδοχείς, που βρίσκονται στους ανασταλτικούς νευρώνες του ΚΝΣ. Οι υποδοχείς αυτοί αποτελούν διαμεμβρανικές πρωτεΐνες της κυτταρικής μεμβράνης των νευρικών κυττάρων, που λειτουργούν ως δίαυλοι ιόντων χλωρίου (Cl - ) και αποτελούνται από ετερο-ολιγομερή πεπτίδια. Συγκεκριμένα, οι GABΑ Α υποδοχείς, αποτελούνται από πέντε υπομονάδες α 2 β 2 γ, που

73 73 εντοπίζονται σε διάφορες περιοχές του ΚΝΣ υπό μορφή διαφόρων υποτύπων: Μοριακή ανάλυση έδειξε ότι οι διάφορες υπομονάδες των GABA A υποδοχέων κωδικοποιούνται από περισσότερα των 15 γονιδίων στον άνθρωπο 138. Οι πεπτιδικές υπομονάδες διαμορφώνονται στο επίπεδο της φωσφολιποειδούς διπλοστοιβάδας των ανασταλτικών νευρώνων, έτσι ώστε να σχηματίζουν δίαυλο για τη διέλευση των ιόντων χλωρίου που εμφανίζεται σε κλειστή και ανοικτή διαμόρφωση. Ο υποδοχέας που συμπεριφέρεται ως δίαυλος ιόντων χλωρίου ανοίγει μόνο όταν διεγείρεται από GABA, βενζοδιαζεπίνες και βαρβιτουρικά. Ο GABA A υποδοχέας διαθέτει δύο διακριτές θέσεις αναγνώρισης-σύνδεσης για τον νευροδιαβιβαστή GABA και μία για τις βενζοδιαζεπίνες, που εντοπίζονται σε διαφορετικές υπομονάδες. Οι θέσεις αυτές αλληλεπιδρούν αλλοστερικά (π.χ. οι θέσεις σύνδεσης των βενζοδιαζεπικών επηρεάζουν και διαμορφώνουν τις θέσεις πρόσδεσης του GABA (Εικόνα 8). Νευροχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα βαρβιτουρικά και οι βενζοδιαζεπίνες ελαττώνουν τον χρόνο ημιζωής της νορ-αδρεναλίνης και της σεροτονίνης ιδιαίτερα στα κυτταρικά σώματα των νευρώνων, που εντοπίζονται στους ραφιαίους πυρήνες (μεσεγκέφαλος). Αυτό μπορεί να γίνεται είτε απ ευθείας ή διαμέσου μεταβολικών διαδικασιών 139. Πρόσφατα, εντοπίσθηκαν υποδοχείς για τις βενζοδιαζεπίνες σε ορισμένες περιοχές του εγκεφάλου δηλ. τον φλοιό, το μεσεγκέφαλο και τον ιππόκαμπο. Οι υποδοχείς αυτοί βρίσκονται τοπογραφικά κοντά στους υποδοχείς του GABA. Υποστηρίζεται ότι η αντίδραση με βενζοδιαζεπίνες βοηθά τη δράση του GABA που διεκπεραιώνεται από αύξηση των ιόντων χλωρίου και υπερπόλωση της μετασυναπτικής μεμβράνης. Υπάρχει και η άποψη ότι τα βαρβιτουρικά υποβοηθούν τη δράση του GABA μεταβάλλοντας τη διαπερατότητα των ιόντων χλωρίου.

74 74 Εικόνα 15. Διαγραμματική παράσταση των υπομονάδων του υποδοχέα GABA A που εντοπίζεται μετασυναπτικά στους ανασταλτικούς νευρώνες του ΚΝΣ Οι βενζοδιαζεπίνες έχουν αγχολυτικές, υπνωτικές, αντισπασμωδικές και μυοχαλαρωτικές ιδιότητες, κυρίως όμως ενδείκνυνται για αγχώδεις διαταραχές και βραχυχρόνια συμπτωματική θεραπεία του έντονου, παθολογικού άγχους. Δεν έχουν ένδειξη στο άγχος και στην υπερένταση που συνδέονται με προβλήματα της καθημερινής ζωής. H δραστικότητα τους για διάστημα μεγαλύτερο των 4 μηνών είναι αμφίβολη και γι' αυτό θα πρέπει κατά τακτά χρονικά διαστήματα να επανεξετάζεται η αναγκαιότητα συνέχισης της θεραπείας. Oι βενζοδιαζεπίνες χορηγούνται και στο σύνδρομο στερήσεως του οινοπνεύματος (delirium tremens), ως συμπληρωματική θεραπεία. Σχετικές ενδείξεις αποτελούν οι νυχτερινοί εφιάλτες και η υπνοβασία, αλλά και σε αυτές τις περιπτώσεις έχουν παρατηρηθεί ανεπιθύμητες ενέργειες και επιπλοκές που καθιστούν προβληματική τη χρήση τους. H χορήγηση τους σε παιδιά πρέπει κατά το δυνατό να αποφεύγεται. Όλες οι βενζοδιαζεπίνες έχουν παρόμοιες φαρμακολογικές ιδιότητες και διαφοροποιούνται μόνο ως προς την κατασταλτική τους επίδραση, την ισχύ (potency) και τη φαρμακοκινητική. Tα μεγάλης ισχύος παράγωγα έχουν χρησιμότητα στις διαταραχές πανικού και στην επιληψία, αλλά μπορεί να αυξάνουν την πιθανότητα εξάρτησης. Όπως φαίνεται στον πίνακα 3 υπάρχουν μεγάλες διαφορές στη φαρμακοκινητική συμπεριφορά ανάμεσα στα

75 75 διάφορα παράγωγα και παρέχεται έτσι η δυνατότητα επιλογής της κατάλληλης βενζοδιαζεπίνης για συνεχή (αγχολυτική) ή βραχεία (υπνωτική) δράση. Tα σκευάσματα μακράς διάρκειας δράσης μπορούν να χορηγούνται σε εφάπαξ ημερήσια δόση, ενώ σκευάσματα με βραχεία ημιπερίοδο ζωής απαιτούν συχνότερη χορήγηση. Σε ηλικιωμένα άτομα και σε ηπατοπαθείς προτιμώνται σκευάσματα με βραχεία διάρκεια δράσης που δεν παράγουν ενεργούς μεταβολίτες (λοραζεπάμη, τεμαζεπάμη). Eπίσης, σε ηλικιωμένους τα σκευάσματα μακράς διάρκειας δράσης πρέπει να χορηγούνται σε πολύ μικρές αρχικές δόσεις και σε αραιότερα διαστήματα για να αποφεύγονται αθροιστικές ενέργειες. Οι βενζοδιαζεπίνες μπορούν να προκαλέσουν εξάρτηση, με εμφάνιση στερητικών συμπτωμάτων (άγχος, ευερεθιστότητα, τρόμος, αϋπνία, εφίδρωση, κοιλιακά ενοχλήματα, διάρροια, ναυτία, ανορεξία, κόπωση, ταχυκαρδία, υπέρταση και σπάνια σπασμοί), που εμφανίζονται 1-2 ημέρες μετά τη διακοπή χορήγησης βραχείας δράσης παραγώγων και 2-5 ή και περισσότερες ημέρες μετά τη διακοπή χορήγησης μακράς δράσης παραγώγων, αυξάνονται προοδευτικά και συνήθως υποχωρούν μετά 1-3 εβδομάδες. O κίνδυνος ανάπτυξης εξάρτησης είναι μεγαλύτερος και τα στερητικά συμπτώματα εντονότερα με τα μεγάλης ισχύος και βραχείας δράσης παράγωγα, τις υψηλότερες δόσεις και το μακρότερο χρόνο χορήγησης. Για αποφυγή του συνδρόμου στέρησης συνιστάται η ημερήσια δόση να μειώνεται προοδευτικά με ρυθμό 1/4-1/8 της ημερήσιας δόσης κάθε 1-2 εβδομάδες 140. Σε μια πρόσφατη ανασκόπηση 141 μελετήθηκε η γονοτοξική και καρκινογόνος δράση μεγάλου αριθμού βενζοδιαζεπινών. Τα αποτελέσματα είναι διαφορετικά για κάθε φάρμακο. Για ορισμένα υπάρχουν ενδείξεις γονοτοξικής και καρκινογόνου δράσης.

76 76 Πίνακας 3: ΦAPMAKOKINHTIKA ΣTOIXEIA BENZOΔIAZEΠINΩN ΔΙΑΖΕΠAΜΗ Η διαζεπάμη είναι παράγωγο βενζοδιαζεπίνης, που κυκλοφόρησε αρχικά από την εταιρεία Roche. Η επιστημονική της ονομασία είναι 7-χλωρο- 1,3-διυδρο-1-μεθυλ-5-φαινυλ-2H-1,4-βενζοδιαζεπιν-2-όνη. Η διαζεπάμη έχει αγχολυτικές, ηρεμιστικές, μυοχαλαρωτικές και αντισπασμωδικές ιδιότητες. Ο μέχρι στιγμής γνωστός βιολογικός της ρόλος είναι η ενίσχυση της δράσης του GABA, μέσω σύνδεσης στον GABA A υποδοχέα. CH 3 N O Cl N Εικόνα 16: Χημικός τύπος διαζεπάμης

77 77 Η διαζεπάμη είναι βενζοδιαζεπίνη μακράς διάρκειας δράσης, που χρησιμοποιείται σε αγχώδεις διαταραχές και στη συμπτωματική θεραπεία του παθολογικού άγχους. Επίσης, χορηγείται σε αϋπνία που συνοδεύεται από άγχος, στο status epilepticus, στο σύνδρομο στερήσεως του οινοπνεύματος ως συμπληρωματική θεραπεία, ως μυοχαλαρωτικό και στην αναισθησιολογία. Απορροφάται καλά κατόπιν απλής δόσης από του στόματος, οδηγώντας σε ταχεία έναρξη των κλινικών αποτελεσμάτων της 142. Για την επίτευξη του μέγιστου θεραπευτικού αποτελέσματος, η δόση θα πρέπει να εξατομικεύεται. Η δοσολογία μπορεί να χρειασθεί μείωση σε ασθενείς με ηπατική ή νεφρική νόσο, όπου ο χρόνος ημίσειας ζωής μπορεί να παραταθεί. Οι ηλικιωμένοι ασθενείς θα πρέπει να λαμβάνουν μειωμένη δόση και να ελέγχονται τακτικά από την αρχή της θεραπείας. Η συνήθης δοσολογία για τους ενήλικες είναι: ως αγχολυτικό 2-10 mg 2-4 φορές ημερησίως, κατά του στερητικού συνδρόμου αλκοόλ 10mg 3 ή 4 φορές τις πρώτες 24 ώρες με μειούμενη ακολούθως δοσολογία, ως μυοχαλαρωτικό 2-10 mg 3-4 φορές ημερησίως και ως αντισπασμωδικό 2-10 mg 2-4 φορές ημερησίως 143. Οι συχνότερα αναφερόμενες ανεπιθύμητες ενέργειες είναι κόπωση, υπνηλία, μυϊκή αδυναμία και αταξία, που συνήθως είναι δοσοεξαρτώμενα. Επίσης, μπορεί να παρατηρηθούν αμνησία, σύγχυση, δυσκοιλιότητα, κατάθλιψη, διπλωπία, γαστρεντερικές διαταραχές, κεφαλαλγία, υπόταση, ακράτεια, αύξηση ή μείωση της λίμπιντο, ναυτία, ξηροστομία, δερματικές αντιδράσεις όπως εξάνθημα, δυσαρθρία, τρόμος, κατακράτηση ούρων, ίλιγγος και θολή όραση. Πολύ σπάνια εκδηλώνονται αυξημένα επίπεδα τρανσαμινασών και αλκαλικής φωσφατάσης, ίκτερος, καθώς και περιπτώσεις καρδιακής ανακοπής και ουδετεροπενίας. Μειωμένη εγρήγορση, διακυμάνσεις καρδιακού ρυθμού και κατάθλιψη έχουν αναφερθεί περιστασιακά με ενέσιμη διαζεπάμη. Κατά καιρούς έχει αναφερθεί ζάλη κατόπιν λήψης διαζεπάμης από του στόματος, καθώς και παράδοξες αντιδράσεις, όπως διέγερση, επιθετικότητα και διαταραχές του ύπνου. Λόγω της μακράς διάρκειας δράσης παρατηρείται άθροιση του φαρμάκου και του κύριου ενεργού μεταβολίτη του, της δεσμεθυλοδιαζεπάμης. Η τοξικότητα της διαζεπάμης έχει διερευνηθεί αρκετά. Η καρκινογόνος δυνατότητα της διαζεπάμης έχει μελετηθεί σε διάφορα είδη τρωκτικών. Αύξηση της συχνότητας εμφάνισης κακοήθων

78 78 ηπατοκυτταρικών όγκων σημειώθηκε σε αρσενικά ποντίκια και αρουραίους μετά από χορήγηση διαζεπάμης σε 75 mg/kg/ημέρα. Υπάρχουν στοιχεία μεταλλαξιγόνου και γονοτοξικής δράσης της διαζεπάμης σε κύτταρα μυελού των οστών ποντικού 144, πρόκλησης ανευπλοειδίας σε καλλιέργειες κυττάρων θηλαστικών καθώς και δημιουργίας δομικών ανωμαλιών και μικροπυρήνων σε in vivo και in vitro μελέτες 145. Η διαζεπάμη βρέθηκε τερατογόνος στα ποντίκια μετά από ενδοφλέβιες δόσεις των 45 mg/kg ή μεγαλύτερη και κατόπιν χορήγησης από του στόματος σε δόσεις των 100 mg/kg ή μεγαλύτερη. Η διαζεπάμη παρουσιάζει συνεργική δράση με άλλα κατασταλτικά του ΚΝΣ (π.χ. βαρβιτουρικά, αλκοόλη, αγχολυτικά, ηρεμιστικά, αναστολείς MAO, υπνωτικά, αντιεπιληπτικά, αντιψυχωσικά, μυοχαλαρωτιά, αντιισταμινικά, ναρκωτικά αναλγητικά και αναισθητικά). Υπάρχει δυνητικά αλληλεπίδραση μεταξύ διαζεπάμης και ενώσεων που αναστέλλουν ορισμένα ηπατικά ένζυμα (ιδιαίτερα το κυτοχρώμα P450-3Α). Τα στοιχεία δείχνουν ότι οι ενώσεις αυτές επηρεάζουν τη φαρμακοκινητική της διαζεπάμης και μπορούν να οδηγήσουν σε αυξημένη και παρατεταμένη καταστολή. Η διαζεπάμη υφίσταται εκτεταμμένο οξειδωτικό μεταβολισμό και συνεπώς, μπορεί να αλληλεπιδράσει με δισουλφιράμη, σιμετιδίνη, κετοκοναζόλη, φλουοξετίνη ή ομεπραζόλη, με αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων πλάσματος της διαζεπάμης. Υπήρξαν επίσης αναφορές ότι ο μεταβολισμός της φαινυτοΐνης επηρεάζεται από τη διαζεπάμη. Η σισαπρίδη μπορεί να οδηγήσει σε μια προσωρινή αύξηση του κατασταλτικού αποτελέσματος της χορηγούμενης από το στόμα διαζεπάμης, λόγω ταχύτερης απορρόφησης. Οι αντιχολινεργικές δράσεις άλλων φαρμάκων συμπεριλαμβανομένων της ατροπίνης και παρόμοιων φαρμάκων, των αντιισταμινικών και των αντικαταθλιπτικών μπορεί να ενισχύονται με τη συγχορήγηση διαζεπάμης 146. AΛΠΡΑΖΟΛAΜΗ Η αλπραζολάμη είναι παράγωγο βενζοδιαζεπίνης, που κυκλοφόρησε αρχικά από την εταιρεία Upjohn (μέλος τώρα του ομίλου Pfizer). Το επιστημονικό της όνομα είναι: 8-χλωρο-1-μεθυλ-6-φαινυλ-4H-1,2,4-τριαζολο-

79 79 4,3α-1,4-βενζοδιαζεπίνη. Η δράση της ασκείται ενισχύοντας τη δράση του GABA, μέσω σύνδεσης στον GABA A υποδοχέα. CH 3 N N N Cl N Εικόνα 17 : Χημικός τύπος αλπραζολάμη Η αλπραζολάμη είναι βενζοδιαζεπίνη βραχείας διάρκειας δράσης, που χρησιμοποιείται σε αγχώδεις διαταραχές και στη βραχυπρόθεσμη ανακούφιση των συμπτωμάτων άγχους. Επίσης, ενδείκνυται στη θεραπεία του άγχους που σχετίζεται με κατάθλιψη. Θεωρείται περισσότερο αποτελεσματική για τη θεραπεία της διαταραχής πανικού, με ή χωρίς αγοραφοβία 147. Για την επίτευξη του μέγιστου θεραπευτικού αποτελέσματος, η δοσολογία θα πρέπει να εξατομικεύεται. Η συνήθης δοσολογία για τους ενήλικες είναι: ως αγχολυτικό 0,25-0,5 mg 3 φορές ημερησίως με μέγιστο τα 4 mg και κατά της διαταραχής πανικού 5-6 mg ημερησίως. Οι συχνότερες παρενέργειες της αλπραζολάμης είναι όμοιες με της διαζεπάμης. Σπάνια, έχουν παρατηρηθεί αύξηση των ηπατικών ενζύμων, γυναικομαστία και γαλακτόρροια. Οι αλληλεπιδράσεις της με άλλα φάρμακα είναι όμοιες της διαζεπάμης, αλλά σε μικρότερο βαθμό. Λόγω της βραχείας διάρκειας δράσης δεν προκαλούνται αθροιστικές ενέργειες, όπως συμβαίνει με τα παράγωγα μακράς διάρκειας δράσης. Eπεισόδια υπομανίας και μανίας έχουν αναφερθεί κατά τη χορήγηση αλπραζολάμης σε ασθενείς με κατάθλιψη. Δε διαπιστώθηκαν στοιχεία καρκινογόνου δράσης κατά τη διάρκεια μελετών 2 ετών χορήγησης αλπραζολάμης σε αρουραίους σε δόσεις μέχρι 30 mg/kg/ημέρα και σε ποντικούς σε δόσεις μέχρι 10 mg/kg/ημέρα. Η

80 80 αλπραζολάμη δεν αποδείχθηκε μεταλλαξιογόνος σε αρουραίους σε δόσεις έως 100 mg/kg, η οποία είναι. 500 φορές μεγαλύτερη της μέγιστης συνιστώμενης ημερήσιας ανθρώπινης δόσης των 10mg/ημέρα. Αν η αλπραζολάμη πρέπει να συνδυάζεται με άλλους ψυχοτρόπους παράγοντες ή αντισπασμωδικά, ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στην φαρμακολογία των παραγόντων αυτών. Η αλπραζολάμη παρουσιάζει συνεργική δράση με άλλα κατασταλτικά του ΚΝΣ (π.χ. ψυχοτρόπα, αντισπασμωδικά, αντιισταμινικά, αλκοόλη). Χρήση με ιμιπραμίνη και δεσιπραμίνη οδηγεί σε αύξηση της συγκέντωσής τους στο πλάσμα κατά 31% και 20% αντίστοιχα. Φάρμακα που αναστέλλουν το μεταβολισμό της αλπραζολάμης μέσω του κυτοχρώματος P450 3A μπορεί να έχουν σημαντικές επιπτώσεις για την κάθαρσή της. Τα διαθέσιμα στοιχεία από κλινικές μελέτες υποδηλώνουν πιθανή αλληλεπίδραση της αλπραζολάμης με τα ακόλουθα: διλτιαζέμη, ισονιαζίδη, μακρολίδια όπως ερυθρομυκίνη και κλαριθρομυκίνη και χυμό γκρέιπφρουτ 148. ΛΟΡΑΖΕΠAΜΗ Η λοραζεπάμη είναι είναι παράγωγο βενζοδιαζεπίνης, που κυκλοφόρησε αρχικά από την εταιρεία Wyeth. Το επιστημονικό της όνομα είναι: 7-χλωρο-5-(2-χλωροφαινυλ)-3-υδροξυ-1,3-διυδρο-1,4-βενζοδιαζεπίν-2- όνη. Πρόκειται για μια βενζοδιαζεπίνη μέσης διάρκειας δράσης, που έχει αγχολυτικές και ηρεμιστικές ιδιότητες. H N O OH Cl N Cl Εικόνα 18 : Χημικός τύπος λοραζεπάμη

81 81 Η λοραζεπάμη χορηγείται για την βραχυπρόθεσμη ανακούφιση των συμπτωμάτων παθολογικού άγχους σε ασθενείς με αγχώδη νεύρωση. Είναι επίσης χρήσιμη ως συμπλήρωμα για την ανακούφιση από το υπερβολικό άγχος, που μπορεί να παρουσιαστεί πριν από χειρουργικές επεμβάσεις. Η ενέσιμη λοραζεπάμη είναι χρήσιμη ως αρχική αντισπασμωδική φαρμακευτική αγωγή για τον έλεγχο του status epilepticus 149. Για καλύτερα αποτελέσματα η δοσολογία, η συχνότητα και διάρκεια της θεραπείας θα πρέπει να εξατομικεύονται σύμφωνα με την αντίδραση του ασθενή. Η δοσολογία πρέπει να εξατομικεύεται για το μέγιστο ωφέλιμο αποτέλεσμα. Η μέση ημερήσια δοσολογία είναι 2-3 mg, χορηγούμενα ανά ίσα διαστήματα, αλλά μπορεί να κυμανθεί μεταξύ 1-10 mg. H μεγαλύτερη δόση πρέπει να λαμβάνεται πριν από την νυχτερινή κατάκλιση. Σε ηλικιωμένα και εξασθενημένα άτομα συνιστάται μια αρχική δόση 1 ή 2 mg την ημέρα σε ίσα διαστήματα προσαρμοσμένη κατά περίπτωση. Η αγωγή θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν βραχύτερης διάρκειας. Ο ασθενής επιβάλλεται να επανεξετάζεται τακτικά και να εκτιμάται η αναγκαιότητα συνέχισης της αγωγής, ειδικότερα στην περίπτωση που είναι ελεύθερος συμπτωμάτων. Γενικά η συνολική διάρκεια της αγωγής δεν πρέπει να υπερβαίνει τις 8-12 εβδομάδες, συμπεριλαμβανομένου και του χρόνου σταδιακής διακοπής της. Σε εξαιρετικές περιπτώσεις είναι δυνατό να απαιτηθεί παράταση της αγωγής πέραν της μέγιστης συνιστώμενης διάρκειας. Σε αυτή την περίπτωση πρέπει να γίνει προηγουμένως επανέλεγχος της κατάστασης του ασθενούς από ειδικό γιατρό. Οι συχνότερες παρενέργειες της λοραζεπάμης είναι: υπνηλία, αίσθημα αιμωδίας, μειωμένη εγρήγορση, σύγχυση, κόπωση, κεφαλαλγία, ίλιγγος, μυϊκή αδυναμία, αταξία ή διπλωπία. Τα φαινόμενα αυτά εμφανίζονται, κυρίως, κατά την έναρξη της αγωγής και συνήθως εξαφανίζονται με την επαναλαμβανόμενη χορήγηση. Ενίοτε αναφέρθηκαν και άλλες ανεπιθύμητες ενέργειες, όπως γαστρεντερικές διαταραχές, μεταβολές της libido ή δερματικές αντιδράσεις. Κατά τη χορήγηση θεραπευτικών δόσεων μπορεί να παρουσιασθεί προχωρητική αμνησία. Ο κίνδυνος αυτός αυξάνει σε μεγαλύτερες δοσολογίες. Τα φαινόμενα της αμνησίας μπορεί να συνοδεύονται με ανάρμοστη συμπεριφορά. Κατά τη χορήγηση βενζοδιαζεπινών είναι δυνατό να εκδηλωθεί προϋπάρχουσα κατάθλιψη. Όταν χορηγούνται

82 82 βενζοδιαζεπίνες ή σκευάσματα βενζοδιαζεπινών είναι γνωστό ότι παρουσιάζονται αντιδράσεις όπως ανησυχία, διέγερση, ευερεθιστότητα, επιθετικότητα, παραισθήσεις, μανία, εφιάλτες, ψευδαισθήσεις, ψυχώσεις, ανάρμοστη συμπεριφορά και άλλες ανεπιθύμητες αντιδράσεις συμπεριφοράς. Υπάρχει μεγαλύτερη πιθανότητα να εμφανισθούν οι αντιδράσεις αυτές σε παιδιά και υπερήλικες. Η χρήση (ακόμη και σε θεραπευτικές δόσεις) μπορεί να οδηγήσει σε ανάπτυξη σωματικής εξάρτησης. Διακοπή της θεραπείας μπορεί να καταλήξει σε φαινόμενα στέρησης ή υποτροπής. Μπορεί να παρουσιασθεί ψυχική εξάρτηση. Καμμία ένδειξη καρκινογόνου δράσης δεν ανέκυψε σε αρουραίους ή ποντικούς κατά μία 18μηνη μελέτη με χορήγηση λοραζεπάμης από το στόμα. Μία έρευνα της μεταλλαξιογόνου δράσης της λοραζεπάμης στη Drosophila melanogaster έδειξε ότι το φάρμακο αυτό προκάλεσε μεταλλάξεις. Χορήγηση 20 mg/kg λοραζεπάμης από το στόμα σε αρουραίους πριν από την εμφύτευση του γονιμοποιημένου ωαρίου δεν έδειξε καμμία διαταραχή της γονιμότητας 150. Εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα που δρουν στο ΚΝΣ, ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στη φαρμακολογία των παραγόντων αυτών. Η λοραζεπάμη προκαλεί συνεργικό αποτέλεσμα με άλλα κατασταλτικά του ΚΝΣ π.χ. βαρβιτουρικά, αλκοόλη, αγχολυτικά, ηρεμιστικά, υπνωτικά, αντιεπιληπτικά, αντιψυχωσικά, μυοχαλαρωτιά, αντιισταμινικά, ναρκωτικά αναλγητικά και αναισθητικά. Υπήρξαν αναφορές για άπνοια, κώμα, βραδυκαρδία, καρδιακή παύση και θάνατο με την ταυτόχρονη χρήση ενέσιμης λοραζεπάμης-αλοπεριδόλης. Η ταυτόχρονη χρήση με κλοζαπίνη μπορεί να προκαλέσει έντονη καταστολή, υπερβολική σιελόρροια και αταξία. Ταυτόχρονη χορήγηση με βαλπροϊκό μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της συγκεντρώσης του πλάσματος και μείωση της κάθαρσης της λοραζεπάμης γι αυτό η δοσολογία της πρέπει να μειώνεται σε ποσοστό 50% περίπου, όταν συγχορηγείται με βαλπροϊκό. Ο συνδυασμός λοραζεπάμης-προβενεκίδης μπορεί να οδηγήσει σε πιο γρήγορη έναρξη ή παρατεταμένη δράση της λοραζεπάμης, που οφείλεται στην αύξηση του χρόνου ημιζωής και σε μειωμένη ολική κάθαρση, γι αυτό η δοσολογία της πρέπει να μειώνεται περίπου 50% όταν συγχορηγείται με προβενεκίδη. Η λήψη θεοφυλλίνης ή αμινοφυλλίνης μπορεί να μειώσει την κατασταλτική δράση των

83 83 βενζοδιαζεπινών, συμπεριλαμβανομένης της λοραζεπάμης. Όταν χρησιμοποιείται σκοπολαμίνη ταυτόχρονα με ενέσιμη λοραζεπάμη, έχουν παρατηρηθεί αυξημένα περιστατικά νάρκωσης, παραισθήσεις και παράλογη συμπεριφορά 149. ΒΡΩΜΑΖΕΠΑΜΗ Η βρωμαζεπάμη είναι είναι παράγωγο βενζοδιαζεπίνης, που κυκλοφόρησε αρχικά από την εταιρεία Roche. Η βρωμαζεπάμη διαφέρει στη δομή από τις άλλες βενζοδιαζεπίνες, λόγω της παρουσίας στο μόριό της του βρωμίου στη θέση 7 και του δακτυλίου της πυριδίνης στη θέση 5, αντί του φαινυλικού δακτυλίου. Το επιστημονικό της όνομα είναι: 7-βρωμο-1,3- διυδρο-5-(2-πυριδυλ)-2h-1,4-βενζοδιαζεπιν-2-όνη. Πρόκειται για παράγωγο βενζοδιαζεπίνης με αγχολυτικές ιδιότητες σε χαμηλές δόσεις. Σε υψηλές δόσεις εμφανίζει ηρεμιστικές και μυοχαλαρωτικές ιδιότητες. N O Br N N Εικόνα 19 : Χημικός τύπος βρωμαζεπάμης Η βρωμαζεπάμη χρησιιμοποείται για τη συμπτωματική ανακούφιση από την ένταση, το άγχος και την ταραχή. Δεδομένου ότι η επίδραση της παρουσίας τροφής στην απορρόφηση της βρωμαζεπάμης δεν έχει μελετηθεί, οι δόσεις θα πρέπει κατά προτίμηση να χορηγούνται με άδειο στομάχι. Η μέγιστη συνιστώμενη δόση είναι 60 mg την ημέρα. Η μέση δόση είναι 3 mg 2-3 φορές την ημέρα. Συνιστάται η βραδινή δόση να είναι μεγαλύτερη από τις άλλες ή όταν η συνολική δόση είναι χαμηλή (π.χ. 3 ή 6 mg), να χορηγείται το βράδυ εφ άπαξ. Σε σοβαρές περιπτώσεις η δόση αυξάνεται σε 6-12 mg 2-3

84 84 φορές ημερησίως. Η διάρκεια της θεραπείας επιβάλλεται να είναι όσο το δυνατόν πιο σύντομη. Η κατάσταση του ασθενούς απαιτείται να επανεκτιμάται τακτικά και η ανάγκη για τη συνέχιση της θεραπείας πρέπει να αξιολογείται. Η συνολική θεραπεία δε θα πρέπει να διαρκεί περισσότερο από 2-4 βδομάδες, ακολουθούμενη από σταδιακή μείωση μέχρι τις 6-8 εβδομάδες. Η βρωμαζεπάμη δε συνιστάται σε παιδιά, καθώς δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία ασφάλειας και αποτελεσματικότητάς της σε αυτήν την ομάδα. Ηλικιωμένοι ασθενείς και άτομα με μειωμένη ηπατική λειτουργία ενδέχεται να απαιτούν μικρότερες δόσεις. Οι περισσότερες ανεπιθύμητες ενέργειες που παρατηρούνται εξαιτίας της βρωμαζεπάμης αφορούν στο ΚΝΣ. Σε κλινικές δοκιμές, στις οποίες η μέση ημερήσια δόση βρωμαζεπάμης ήταν 24 mg, αναφέρθηκαν: υπνηλία (32%), αταξία (13%), ζάλη (7,6%), διαταραχές συμπεριφοράς (4%), διαταραχές λόγου (2%), διαταραχές ύπνου (1%), σύγχυση (1%), κεφαλαλγία (1%), κατάθλιψη (1%), ναυτία (1%), έμετος (1%), γαστρεντερικές διαταραχές (1%). Μπορεί να παρατηρηθούν, επίσης, παράδοξες αντιδράσεις όπως ανησυχία, διέγερση, ευερεθιστότητα, επιθετικότητα, παραισθήσεις, οργή, εφιάλτες, διαταραχές του ύπνου, ψευδαισθήσεις, ψύχωση, ανάρμοστη συμπεριφορά. Αυτές οι αντιδράσεις είναι πιθανότερο να εμφανιστούν σε παιδιά και ηλικιωμένους ασθενείς από ό,τι σε άλλους ασθενείς. Η χρόνια χρήση (ακόμη και σε θεραπευτικές δόσεις) μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη σωματικής και ψυχικής εξάρτησης. Διαταραχές του νευρικού συστήματος: Υπνηλία και αταξία, κεφαλαλγία, ζάλη, μειωμένη εγρήγορση, σπασμοί, τρόμος, διαταραχές του λόγου και ακράτεια. Οφθαλμικές διαταραχές: Διπλωπία και θόλωση της όρασης. Διαταραχές του γαστρεντερικού συστήματος: Γαστρεντερικές διαταραχές, ξηροστομία, ναυτία και έμετος. Μεταβολικές και διατροφικές διαταραχές: Ανορεξία. Διαταραχές δέρματος και υποδόριου ιστού: Δερματικές αντιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων κνησμού και εξανθήματος. Διαταραχές του μυοσκελετικού συστήματος και του συνδετικού ιστού: Μυϊκή αδυναμία και μυϊκός σπασμός. Διαταραχές του αναπνευστικού συστήματος: Αναπνευστική καταστολή. Καρδιακές διαταραχές: Καρδιακή ανεπάρκεια, καρδιακή ανακοπή, υπόταση, ταχυκαρδία και αίσθημα παλμών.

85 85 Η βρωμαζεπάμη υφίσταται οξειδωτικό μεταβολισμό μέσω του κυτοχρώματος P450. Ως εκ τούτου, πρέπει να λαμβάνεται υπόψην το γεγονός αυτό όταν χορηγείται βρωμαζεπάμη σε ασθενείς που λαμβάνουν φάρμακα τα οποία αναστέλλουν το P450 (π.χ. αντιμυκητιασικά αζολίου, μακρολιδικά αντιβιοτικά, αναστολείς της πρωτεάσης του HIV, αναστολείς διαύλων ασβεστίου). Λόγω του οξειδωτικού μεταβολισμού της η βρωμαζεπάμη μπορεί να αλληλεπιδράσει με δισουλφιράμη ή σιμετιδίνη, με αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της βρωμαζεπάμης στο πλάσμα. Η βρωμαζεπάμη προκαλεί συνεργικό αποτέλεσμα με άλλα κατασταλτικά του ΚΝΣ π.χ. βαρβιτουρικά, αλκοόλη, αγχολυτικά, ηρεμιστικά, υπνωτικά, αντιεπιληπτικά, αντιψυχωσικά, μυοχαλαρωτιά, αντιισταμινικά, ναρκωτικά αναλγητικά και αναισθητικά. Η αντιχολινεργική δράση της ατροπίνης και παρόμοιων φαρμάκων, των αντιισταμινικών και των αντικαταθλιπτικών μπορεί να ενισχυθεί με τη συγχορήγηση βρωμαζεπάμης. Αλληλεπιδράσεις έχουν αναφερθεί μεταξύ ορισμένων βενζοδιαζεπινών και αντισπασμωδικών, με αποτέλεσμα μεταβολές στη συγκέντρωσή τους στον ορό Αντιεπιληπτικά Ως επιληψία χαρακτηρίζεται οποιαδήποτε διαταραχή του ΚΝΣ, που εκδηλώνεται με υποτροπιάζοντες σπασμούς, ιδιάζουσες ηλεκτροεγκεφαλογραφικές και διανοητικές διαταραχές και εμφανίζεται στο 0,5-1% του πληθυσμού. Οι επιληπτικοί σπασμοί αποτελούν παροδικές διαταραχές της λειτουργίας του ΚΝΣ και οφείλονται σε ανώμαλες παροξυσμικές αποπολώσεις των νευρώνων του εγκεφάλου. Αιτιολογικά, η ε- πιληψία μπορεί να οφείλεται σε κληρονομικούς παράγοντες (ιδιοπαθής επιληψία) αλλά και σε πλήθος άλλων παραγόντων στους οποίους ανήκουν μεταβολικές διαταραχές (π.χ. υπασβεστιαιμία, υπογλυκαιμία, φαινυλκετονουρία), κρανιοεγκεφαλικές κακώσεις, νεοπλάσματα του ΚΝΣ, αγγειοπάθειες, εκφυλιστικές διαταραχές και λομώξεις του ΚΝΣ (π.χ. μηνιγγίτιδα). Παθοφυσιολογικά, η επιληψία αποτελεί ετερογενή εγκεφαλική διαταραχή όχι μόνο ως προς την βαρύτητα, την εμφάνιση και το είδος των σπασμών αλλά και των μηχανισμών, που συμβαίνουν στο επίπεδο των νευρώνων. Οι επιληπτικές προσβολές (σπασμοί) διακρίνονται σε

86 86 γενικευμένες, αλλά και σε μερικές που αφορούν μόνο ένα τμήμα του εγκεφάλου (εστιακές). Ο επιληπτικές εκδηλώσεις ποικίλουν ανάλογα με το τμήμα του εγκεφάλου που διαταράσσεται. Η προσπάθεια ανεύρεσης τρόπων αντιμετώπισης της επιληψίας άρχισε πολύ παλιά με τη χρήση αφεψημάτων, αλλά και άλλων φυτικών προϊόντων, για τον κατευνασμό των σπασμών σε επιληπτικούς ασθενείς. Το 1857 χρησιμοποιήθηκε το βρωμιούχο κάλιο και το 1912 η φαινοβαρβιτάλη και παράγωγά της για τον έλεγχο της επιληψίας. Μετά το 1930 αναπτύχθηκε η φαινυτοΐνη και άρχισε εντατική προσπάθεια για ανάπτυξη νέων αντιεπιληπτικών φαρμάκων και μεθόδων αξιολόγησης αντιεπιληπτικής δράσης σε πειραματόζωα. Μετά το 1990 εμφανίσθηκαν νέα αντιεπιληπτικά φάρμακα. Ο βασικοί μηχανισμοί δράσης των αντιεπιληπτικών φαρμάκων αφορούν βασικές λειτουργίες των νευρώνων του εγκεφάλου, όπως: α) μεταφορά ιόντων διαμέσου διαύλων, που εξαρτάται από το ηλεκτροχημικό δυναμικό της μεμβράνης και (β) ανασταλτικά και διεγερτικά συναπτικά δυναμικά, που ρυθμίζονται μέσω του GABA-εργικού και του γλουταμινεργικού συστήματος. Δομικά, τα νεώτερα αντιεπιληπτικά φάρμακα αποτελούν παράγωγα των: α) βαρβιτουρικών, β) της υδαντοΐνης, (γ) της οξαζολιδίνης, δ) του ηλεκτρικού οξέος και ε) της ακετυλο-ουρίας 105. Σκοπός της θεραπείας είναι ο έλεγχος των επιληπτικών κρίσεων με τη συνεχή διατήρηση δραστικών επιπέδων του φαρμάκου στο πλάσμα και από εκεί στον εγκεφαλικό ιστό. H δόση και η συχνότητα χορήγησής τους καθορίζονται από το χρόνο υποδιπλασιασμού, γι' αυτό και είναι σκόπιμος ο προσδιορισμός των επιπέδων των φαρμάκων αυτών στο πλάσμα. Αρχικά χορηγούνται μικρές δόσεις, που στη συνέχεια αυξάνονται βαθμιαία μέχρι να ελεγχθούν οι κρίσεις ή να εμφανιστούν τοξικά φαινόμενα. Tα μικρά παιδιά μεταβολίζουν τα αντιεπιληπτικά ταχύτερα από τους ενηλίκους και γιαυτό πρέπει να χορηγούνται σε περισσότερες και μεγαλύτερες δόσεις ανά χιλιόγραμμο βάρους σώματος. H έναρξη της θεραπείας πρέπει να γίνεται κατά κανόνα με ένα φάρμακο, που στις περισσότερες περιπτώσεις αρκεί για τον έλεγχο των κρίσεων. Προσθήκη δεύτερου φαρμάκου δικαιολογείται μόνο όταν οι κρίσεις συνεχίζονται παρά τις υψηλές συγκεντρώσεις στο αίμα του πρώτου

87 87 ή εμφανιστούν τοξικά φαινόμενα. Η χρησιμοποίηση περισσότερων των δύο αντιεπιληπτικών σπανίως είναι απαραίτητη. H χορήγηση των αντιεπιληπτικών φαρμάκων πρέπει να συνεχίζεται για τρία τουλάχιστον χρόνια από την εμφάνιση της τελευταίας κρίσης. Τυχόν παράταση της χορήγησης θα εξαρτηθεί από το είδος των κρίσεων, την ευκολία ή μη του ελέγχου τους και την ηλεκτροεγκεφαλογραφική εικόνα. Ανεξαρτήτως πάντως από τα παραπάνω, διακοπή της θεραπείας επιβάλλεται 5 χρόνια μετά την τελευταία κρίση. Πιθανότητα υποτροπής υπάρχει στο 15% περίπου των περιπτώσεων. Aπότομη διακοπή των αντιεπιληπτικών ενέχει τον κίνδυνο επανεμφάνισης των κρίσεων, που μπορεί να φθάσει μέχρι status epilepticus. Για το λόγο αυτό πρέπει να γίνεται βαθμιαίως σε διάστημα μηνών. Tο ίδιο ισχύει και στην περίπτωση αλλαγής από ένα φάρμακο σε άλλο που πρέπει επίσης να γίνεται βαθμιαίως σε διάστημα εβδομάδων. Tα φάρμακα αυτά προκαλούν ενζυμική επαγωγή με αποτέλεσμα να ελαττώνουν τη δραστικότητα άλλων συγχρόνως χορηγουμένων φαρμάκων. Για ορισμένα αντιεπιληπτικά έχει αποδειχθεί τερατογόνος δράση στα πειραματόζωα. Στον άνθρωπο εντούτοις ο κίνδυνος πρόκλησης συγγενών ανωμαλιών του εμβρύου είναι πρακτικά μικρός. Επίσης, τυχόν διακοπή της θεραπείας στη διάρκεια της κύησης θα προκαλέσει υποτροπή των κρίσεων, που η επίδρασή τους στο έμβρυο δεν είναι γνωστή και δεν μπορεί να υποστηριχθεί ότι είναι λιγότερο επιβλαβής από τη φαρμακευτική αγωγή. Γι' αυτό η αντιεπιληπτική αγωγή θα πρέπει να συνεχίζεται στη διάρκεια της κύησης 152. BAΛΠPOΪKO ΟΞΥ- BAΛΠPOΪKO NATPIO Το βαλπροϊκό οξύ (Valproic Acid-VA) ή n-διπροπυλακετικό οξύ άρχισε να χορηγείται στις ΗΠΑ το Είναι ένα καρβοξυλικό οξύ με απλά διακλαδιζόμενη ανθρακική αλυσίδα. Ο σχετικά αυξημένος αριθμός των ατόμων του άνθρακα σε 9 προσδίδει στο μόριο κατευναστικές ιδιότητες, ενώ τα οξέα με δομή ευθείας αλυσίδας έχουν μικρή έως μηδενική δραστηριότητα. Το πρωταρχικό αμίδιο του βαλπροϊκού οξέος έχει περίπου διπλάσια δραστικότητα από το τελικό προϊόν.

88 88 H 3 C CH 3 OH Εικόνα 20 : Χημικός τύπος βαλπροϊκού οξέος O Η δοσολογία του VA συνήθως προσαρμόζεται για να παρέχει συγκεντρώσεις στο πλάσμα της τάξεως των μg/ml. Οι θεραπευτικές δόσεις αρχίζουν από 15mg/kg και αυξάνονται εβδομαδιαίως 5-10 mg/kg μέχρι την επίτευξη της επιθυμητής δοσολογίας, ενώ το μέγιστο της ημερήσιας δόσης είναι της τάξεως των 60mg/kg. Άλλωστε, το VA χορηγείται συνήθως σε ασθενείς υπό αγωγή με λίθιο, όταν δεν καλύπτονται πλήρως από τις υποτροπές των διπολικών διαταραχών με τη μονοθεραπεία και απαιτείται ο συνδυασμός με ένα αντιεπιληπτικό. Το VA είναι ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται ευρέως στην κλινική πράξη, αντί τον αλάτων του λιθίου, για την αντιμετώπιση της διπολικής διαταραχής. Αποτελεί επί σειρά ετών ένα από τα συνηθέστερα αντιεπιληπτικά, αλλά ο μηχανισμός δράσης του δεν έχει διευκρινιστεί σε όλα τα στάδια. Παρά το γεγονός ότι ένας μεγάλος αριθμός εμμέσων στόχων καθώς και ένας πολύ μικρότερος αριθμός άμεσων in vitro κυτταρικών στόχων του VA έχουν περιγραφεί, δεν αποδείχθηκε ότι αυτοί οι στόχοι παίζουν κάποιο ρόλο στη θεραπευτική απόκριση. Πρόσφατα, βρέθηκε ότι το VA αναστέλλει τις αποακετυλάσες των ιστονών, που αποτελούν ρυθμιστές-κλειδιά στη δομή της χρωματίνης και στη μεταγραφική δραστηριότητα 153. Λόγω της ομοιότητας της δομικής του διαμόρφωσης με τα λιπαρά οξέα, πιθανόν να παρεμποδίζει τη μεταφορά τους στα μιτοχόνδρια καθώς και τον ενδομιτοχονδριακό μεταβολισμό τους. Το VA, κατά τη διερεύνηση της επίδρασής του στην αύξηση και την επιβίωση ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων in vitro, αποδείχθηκε δοσοεξαρτώμενος επαγωγέας των μηχανισμών κυτταρικού θανάτου σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Στην MV411 κυτταρική σειρά προκάλεσε αποπτωτικές αλλαγές, όπως κατακερματισμό του DNA, εξωτερίκευση της φωσφατιδυλοσερίνης, έκλυση του κυτοχρώματος c από τα

89 89 μιτοχόνδρια και ενεργοποίηση των κασπασών -3, -8, Παρά το γεγονός ότι η τερατογόνος δράση του VA έχει καταδειχθεί με την εφαρμογή εντελώς διαφορετικών πειραματικών πρωτοκόλλων 155,156, η κυτταρογενετική του δραστηριότητα με δείκτη τη συχνότητα των SCEs αμφισβητήθηκε από τους Taneja και συν 157 και τους Shaumann και συν 158. Και οι δύο ερευνητικές ομάδες μελέτησαν τη συχνότητα των SCEs στα λεμφοκύτταρα επιληπτικών με μονοθεραπεία VA αλλά δεν επεσήμαναν αξιόλογη αύξηση συγκριτικά με υγιείς μάρτυρες. Σε αντίθετα αποτελέσματα όμως κατέληξαν οι Hu και συνεργάτες 159 κατά τη μελέτη των SCEs και των CA σε περιφερικά λεμφοκύτταρα 20 επιληπτικών παιδιών, που υποβάλλονταν σε μονοθεραπεία με VA επί 6-52 μήνες. Η συχνότητα των SCEs σημείωσε στατιστικά σημαντική αύξηση (p<0,01), ενώ η συχνότητα των CA παρουσίασε μικρή άνοδο αναφορικά με δύο ομάδες υγειών μαρτύρων. Το βαλπροϊκό οξύ επιδρά στους απομονωμένους νευρώνες με παραπλήσιο τρόπο, όπως η φαινυτοΐνη και η εθοσουξιμίδη. Σε θεραπευτικές συγκεντρώσεις το βαλπροϊκό οξύ αναστέλλει τις διατηρούμενες επαναληπτικές πυροδοτήσεις σπασμών, που προκαλούνται από την αποπόλωση των εγκεφαλικών νευρώνων και των νευρώνων του νωτιαίου μυελού των επίμυων. Η δράση του VA είναι παραπλήσια με αυτή της φαινυτοΐνης και της καρβαμαζεπίνης, ενώ φαίνεται να μεσολαβεί μια παρατεταμένη παύση της λειτουργίας των αντλιών Να + λόγω απενεργοποίησής τους. Σε νευρώνες απομονωμένους σε απομακρυσμένη περιοχή, όπως το οζώδες γάγγλιο, το βαλπροϊκό οξύ προκαλεί μικρή μείωση της οδού ροής του Cα ++. Η θεραπεία με το βαλπροϊκό οξύ, όπως και με το λίθιο, οδηγεί σε σταθερή μείωση της λειτουργίας των πρωτεϊνικών κινασών στον εγκεφαλικό ιστό, συμπεριλαμβανομένης και της φωσφολιπιδοεξαρτώμενης πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC), που ενεργοποιείται από το Ca και ιδιαίτερα των υπότυπων α και ε. Το κύριο υπόστρωμα για την εγκεφαλική PKC είναι η πρωτεΐνη MARCKS, πλούσια σε τροποποιημένη αλανίνη, εστεροποιημένη με μυριστικό οξύ, που ενοχοποιείται για τη συναπτική και τη νευρωνική πλαστικότητα. Μια άλλη σημαντική πρωτεϊνική κινάση που αναστέλλεται από τη θεραπεία με λίθιο και βαλπροϊκό οξύ είναι η γλυκογονοσυνθάση-κινάση 3β (GSK-3β), που εμπλέκεται στη ρυθμιστική διαδικασία των νευρώνων και του πυρήνα, η οποία συμπεριλαμβάνει και τον περιορισμό

90 90 έκφρασης της ρυθμιστικής πρωτεΐνης β-κατενίνης. Tο λίθιο και το βαλπροϊκό οξύ αλληλεπιδρούν με τους μεταγραφικούς παράγοντες. Αποτελέσματα τέτοιων επιδράσεων αποτελούν η αυξημένη δέσμευση της πρωτεΐνης Ι (ΑΡ- 1), ενεργοποιητή της μεταγραφικής διαδικασίας στο DNA, όπως επίσης και η τροποποιημένη έκφραση άλλων ρυθμιστικών παραγόντων της μεταγραφής συμπεριλαμβανομένων των ΑΜΙ-1β ή ΡΕΒΡ-2Β. Επιπροσθέτως, η θεραπεία με λίθιο και βαλπροϊκό οξύ έχει συσχετιστεί και με την αυξημένη έκφραση της ρυθμιστικής πρωτείνης-2 των β-λεμφοκυττάρων (bcl-2) που σχετίζεται με την προστασία έναντι της νευρωνικής εκφύλισης. Η σημασία αυτών των σοβαρών επιδράσεων των σταθεροποιητικών παραγόντων διάθεσης (VA και Li) με τους κυτταρικούς ρυθμιστικούς παράγοντες θα πρέπει να διευκρινιστεί περαιτέρω. Κατά την διάρκεια των αρχικών μηνών θεραπείας με VA, παρατηρείται άνοδος των ηπατικών ενζύμων στο πλάσμα των ασθενών, σε ποσοστό έως και 40%, ενώ συχνά εμφανίζεται ασυμπτωματικά. Μια σπάνια επιπλοκή είναι η κεραυνοβόλος ηπατίτιδα, που συνήθως είναι θανατηφόρα. Οι ιστολογικές και εργαστηριακές εξετάσεις αποκαλύπτουν μια μικρο-κυψελιδωτή στεάτωση, χωρίς αποδείξεις φλεγμονής ή αντίδρασης υπερευαισθησίας. Οξεία παγκρεατίτιδα και υπερ-αμμωναιμία συχνά έχουν σχετιστεί με την χρήση του βαλπροϊκού οξέως. Το βαλπροΐκό οξύ αρχικά αναστέλλει τη δράση των φαρμάκων που μεταβολίζονται από το ένζυμο CYP2C9 όπως η φαινυτοΐνη και η φαινοβαρβιτάλη. Επίσης, αποτελεί αναστολέα του ενζύμου UGT και έτσι αναστέλλει επιπλέον το μεταβολισμό της λαμοτρυγίνης και της λοραζεπάμης. Ένα υψηλό ποσοστό του βαλπροϊκού οξέος δεσμεύεται με την αλβουμίνη και οι υψηλές μοριακές συγκεντρώσεις του κατά την κλινική θεραπεία έχουν ως αποτέλεσμα την αντικατάσταση της φαινυτοΐνης και των άλλων φαρμάκων, που ήταν δεσμευμένα στην αλβουμίνη. Το βαλπροΐκό οξύ πολύ συχνά σχετίζεται με την εμφάνιση τρόμου και αύξηση του σωματικού βάρους. Είναι εξίσου αποτελεσματικό με την καρβαμαζεπίνη στον έλεγχο των δευτερευόντων γενικευμένων τονικοκλονικών σπασμών. Το VA αποτελεί παράγοντα πρώτης επιλογής στην περίπτωση ύπαρξης τονικοκλονικών σπασμών ή στην εμφάνιση τους κατά την διάρκεια της θεραπείας. Επίσης θεωρείται θεραπεία εκλογής και για τους μυοκλονικούς σπασμούς στο σύνδρομο της νεανικής μυοκλονικής επιληψίας.

91 91 4. Νεοσυντιθέμενες 1,5-Βενζοδιαζεπίνες Οι 1,5-βενζοδιαζεπίνες αποτελούν μια πολυπληθή ομάδα πολυκυκλικών ενώσεων με χαρακτηριστικό επταμελή ετεροκυκλικό δακτύλιο. Μερικά μέλη της παρουσιάζουν σημαντικές βιολογικές ιδιότητες. Πρόσφατη βιβλιογραφική έρευνα χαρακτηρίζει ορισμένες 1,5-βενζοδιαζεπίνες εύστροφα φαρμακοφόρα (versatile pharmacophore), λόγω του γεγονότος ότι εστιάζουν το επιστημονικό ενδιαφέρον ως σημαντικές βιολογικά ενεργές πρώτες ύλες. Είναι γνωστές για τις ψυχοθεραπευτικές τους ιδιότητες, καθώς και τη δυναμική τους επέμβαση στην υπέρταση, την αρρυθμία και άλλες σχετικές καρδιακές δυσλειτουργίες 160. Πειραματική μελέτη των τελευταίων μηνών αποκάλυψε ότι συγκεκριμένα παράγωγα 1,5-βενζοδιαζεπινών αποτελούν μια νέα τάξη, μη νουκλεοσιδικών αναστολέων της πολυμεράσης του ιού της ηπατίτιδας C 161. Δύο νεοσυντιθέμενες 1,5-βενζοδιαζεπίνες παρουσίασαν ιδιότητες μη συναγωνιστικών αναστολέων της ακετυλοχοληνεστεράσης και της ATPDάσης του εγκεφαλικού φλοιού επίμυος, 162 ενώ τρία άλλα μέλη της ομάδας αποδείχθηκαν ανταγωνιστές τόσο in vitro, όσο και in vivo του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων 163. Παρά το γεγονός ότι στη διεθνή βιβλιογραφία ανευρίσκονται αρκετές επιστημονικές εργασίες σχετικές με τις βιολογικές ιδιότητες των 1,5- βενζοδιαζεπινών, σε καμία δεν μελετήθηκε η επίδραση των ενώσεων αυτών στο DNA, γεγονός που συνέβαλε στην επέκταση της παρούσας διατριβής με την κυτταρογενετική μελέτη των τεσσάρων νεοσυντεθειμένων 1,5- βενζοδιαζεπινών, των οποίων οι χημικοί τύποι και το επιστημονικό όνομα είναι : ΒΔΖ1 (4Ε)-2,5,5-τριμεθυλ-4-(4,4,7,8-τετραμεθυλ-1,3,4,5-τετραϋδρο-2Η-1,5- βενζοδιαζεπιν-2-υλιδεν) διυδροθειοφεν-3(2η)-ενα

92 92 Εικόνα 21 : Χημικός τύπος ΒΔΖ1 ΒΔΖ2 (4Ε)-4-(8-βενζοϋλ-4,4διμεθυλ-1,3,4,5τετραϋδρο-2Η-1,5-βενζοδιαζεπιν-2- υλιδεν)-2,5,5-τριμεθυλδιυδροθειοφεν-3(2η)-ενα Εικόνα 22: Χημικός τύπος ΒΔΖ2 ΒΔΖ3 2,3α,5,5,8,9-εξαμεθυλ-3α,4, 5,6-τετραϋδρο[1,3]θειαζολο[3,2-α]1,5- βενζοδιαζεπιν-1 (2Η)-ενα H 3 C CH3 O H N N CH 3 CH 3 CH 3 S CH 3 Εικόνα 23 : Χημικός τύπος ΒΔΖ3

93 93 ΒΔΖ4 (4Ε)-4-(4,4-διμεθυλ-1,3,4,5-τετραϋδρο-2Η-1,5-βενζοδιαζεπιν-2-υλιδεν)-5,5- διμεθυλδιυδροθειοφεν-3(2η)-ενα Εικόνα 24 : Χημικός τύπος ΒΔΖ4

94 94

95 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 95

96 96

97 97 Α) ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ως πειραματικό υλικό στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν δείγματα περιφερικού αίματος υγειών εθελοντών, ηλικίας ετών, αμφοτέρων των φύλων. Οι εθελοντές αιμοδότες ήταν μη καπνιστές, μη συστηματικοί χρήστες αλκοόλ, δεν έπαιρναν φάρμακα και δεν είχαν πρόσφατα προσβληθεί από ιογενή νόσο. Οι αιμοληψίες γίνονταν στο εργαστήριο Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής, όπου ακολουθούσε η λοιπή, βάσει πρωτοκόλλου, πειραματική διαδικασία. Συγκεκριμένα το ολικό περιφερικό αίμα προστίθετο σε ειδικό καλλιεργητικό υλικό, ώστε να αναπτυχθούν καλλιέργειες λεμφοκυττάρων. Στις καλλιέργειες των φυσιολογικών λεμφοκυττάρων μελετήθηκε η κυτταρογενετική δράση των ψυχοφαρμάκων: Κλοζαπίνης Ρισπεριδόνης Ολανζαπίνης Ζιπραζιδόνης Διαζεπάμης Αλπραζολάμης Λοραζεπάμης Βρωμαζεπάμης Βαλπροϊκού Οξύ και 4 νεο-συντιθέμενων 1,5-βενζοδιαζεπινών (1,5-ΒΔΖ): (4Ε)-2,5,5-τριμεθυλ-4-(4,4,7,8-τετραμεθυλ-1,3,4,5-τετραϋδρο-2Η-1,5- βενζοδιαζεπιν-2-υλιδεν)διυδροθειοφεν-3(2η)-ενα (ΒΔΖ1) (4Ε)-4-(8-βενζοϋλ-4,4διμεθυλ-1,3,4,5-τετραϋδρο-2Η-1,5-βενζοδιαζεπιν-2- υλιδεν)-2,5,5-τριμεθυλδιυδροθειοφεν-3(2η)-ένα (ΒΔΖ2) 2,3α,5,5,8,9-εξαμεθυλ-3α,4,5,6-τετραϋδρο[1,3]θειαζολο[3,2-α]1,5- βενζοδιαζεπιν-1(2η)-ενα (ΒΔΖ3)

98 98 (4Ε)-4-(4,4-διμεθυλ-1,3,4,5-τετραϋδρο-2Η-1,5-βενζοδιαζεπιν-2-υλιδεν)-5,5- διμεθυλδιυδροθειοφεν-3(2η)-ενα (ΒΔΖ4) Η εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας των ενώσεων βασίστηκε στον προσδιορισμό της συχνότητας των Χρωματιδιακών Ανταλλαγών (Sister Chromatid Exchanges-SCEs) και της κυτταροστατικότητάς τους στον υπολογισμό του δείκτη ρυθμού πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων (Proliferation Rate Index-PRI, ΔΡΠ). 1) Καλλιεργητικά υλικά και χημικά αντιδραστήρια 1. Διάλυμα ηπαρίνης (Heparin-Leo). Προ της αιμοληψίας τοποθετούνται 1-2 σταγόνες ηπαρίνης σε κάθε σύριγγα μιας χρήσεως, η οποία ανακινείται ώστε να επαληφθούν τα εσωτερικά τοιχώματα της για την αποφυγή πήξης του αίματος. 2. Καλλιεργητικό υλικό RPMI-1640 (Biochrom, Berlin). με φυτοαιμοσυγκολλητίνη (PHA, Biochrom). Σε 100 ml καλλιεργητικού υλικού RPMI-1640 προστίθενται 20 ml ορού εμβρύου μόσχου (Fetal Calf Serum), 2 ml πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης, 2,5 ml PHA και 2 ml L-γλουταμίνης. 3. Διάλυμα 5-βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU-Sigma). Παρασκευάζεται με δισαπεσταγμένο-αποστειρωμένο νερό. σε τελική συγκέντρωση 400 μg/mι. Διατηρείται σε φιαλίδια σκοτεινού χρώματος, προς αποφυγή της φωτόλυσης. 4. Κολχικίνη (Colchicine-Sigma). Παρασκευάζεται διάλυμα με δισαπεσταγμένο-αποστειρωμένο νερό, τελικής συγκέντρωσης 50 μg/ml. 5. Διάλυμα Χλωριούχου Καλίου (KCI) 0,075 Μ. Διαλύονται 2,74 gr KCI σε 500 ml απεσταγμένου νερού και το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου για 1 εβδομάδα. 6. Διάλυμα μονιμοποιήσης (FIX). Παρασκευάζεται με την ανάμιξη μεθυλικής αλκοόλης και οξικού οξέος (3:1) πριν από την έναρξη της χρήσης του. 7. Διάλυμα φθορίζουσας χρωστικής Hoechst (Bisbenzimide H 33258). Μικρότερη επιτρεπτή συγκέντρωση 1 μg/ml σε απεσταγμένο νερό.

99 99 8. Ρυθμιστικό διάλυμα ρη 6,8. (Hopkin-Williams, Gurr) Διαλύεται ένα δισκίο Gurr (Aldrich Chem. Co BDH) σε 1 λίτρο απεσταγμένου νερού. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία 4 C στο ψυγείο. 9. Ρυθμιστικό Διάλυμα McLivaines (Buffer pη 8). Γίνεται ανάμιξη σε αναλογία 15:85 διαλύματος κιτρικού οξέος (21,02 gr/lt) και διαλύματος μονοόξινου φωσφορικού νατρίου (Na 2 HP0 4, 35,6 gr/lit). 10.Διάλυμα χρωστικής Giemsa (Merck). Παρασκευάζεται διάλυμα χρωστικής Giemsa 3% v/v σε ρυθμιστικό διάλυμα ρη 6,8. Το διάλυμα παρασκευάζεται πριν από τη χρήση του. 11.Τα διαλύματα των υπό μελέτη ενώσεων σε συγκεντρώσεις ίσες ή ισοδύναμες των από του στόματος χορηγούμενων δόσεων. Η παρασκευή των διαλυμάτων γίνεται με διάλυση των ουσιών (ταμπλέτας ή κόνεως) σε μικρή ποσότητα DMSO (dimethylsoulfoxide) και στη συνέχεια το πυκνό διάλυμα αραιώνεται με αραβοσιτελαίου (1:9).Το DMSO δεν πρέπει να υπερβαίνει στη τελική του συγκέντρωση το 10%: 2) Απαιτούμενος εργαστηριακός εξοπλισμός 1. Θάλαμος ρεύματος αέρα συνεχούς ροής (Laminar Air Flow) για την εξασφάλιση άσηπτων συνθηκών εργασίας. 2. Φυγόκεντρος τύπου Hettick. 3. Επωαστικός κλίβανος Heraeus για την ανάπτυξη των καλλιεργειών στη θερμοκρασία tvn 37 C. 4. Ηλεκτρονικός ζυγός Sartorius. 5. Ψυκτικός θάλαμος και ψυγείο για την καλύτερη διατήρηση των χρησιμοποιουμένων διαλυμάτων. 6. Συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας : ειδική λυχνία UV ισχύος 300 Watt (Osram) τοποθετείται σε ειδική διάταξη, ώστε οι αντικειμενοφόρες πλάκες που φέρουν τα προς ακτινοβόληση παρασκευάσματα να απέχουν από αυτή 40 cm. 7. Οπτικά μικροσκόπια Zeiss και Olympus για την παρατήρηση των παρασκευασμάτων.

100 100 3) Ανάπτυξη καλλιεργειών λεμφοκυττάρων και προετοιμασία παρασκευασμάτων για την παρατήρηση των SCEs και του PRI Οι αιμοληψίες των εθελοντών αιμοδοτών έγιναν με ηπαρινισμένες σύριγγες μιας χρήσεως στο χώρο του εργαστηρίου και κάτω από άσηπτες συνθήκες. Οι επόμενοι χειρισμοί για την ανάπτυξη των καλλιεργειών των λεμφοκυττάρων διενεργήθηκαν μέσα στο άσηπτο περιβάλλον του θαλάμου ρεύματος αέρα συνεχούς ροής (Laminar Air Flow), όπου το αίμα και οι υπό μελέτη ουσίες τοποθετήθηκαν στο καλλιεργητικό υλικό. Ο φωτισμός ήταν ελάχιστος για την αποφυγή φωτόλυσης της Brdu. Η διαδικασία της μεθόδου γίνεται σύμφωνα με τη τεχνική Fluorescence Plus Giemsa 40 και είναι κατά σειρά η ακόλουθη: 1.Σε 5 ml του καλλιεργητικού υλικού RPMI τοποθετούνται : σταγόνες αίματος, εφ' όσον ο αριθμός των λευκοκυττάρων του ασθενούς την ημέρα της αιμοληψίας είναι μεγαλύτερος από 6000/mm 3. Αν ο αριθμός των λευκοκυττάρων είναι μικρότερος, αυξάνεται ο αριθμός των σταγόνων. Το θρεπτικό υλικό περιέχει ήδη ΡΗΑ, η οποία διεγείρει τα λεμφοκύτταρα, ώστε να αρχίσει ο πολλαπλασιασμός τους, τα διαλύματα των υπό εξέταση ουσιών, και 0,05 ml BrdU του προπαρασκευασθέντος διαλύματος των 400 μg/ml, ώστε να επιτευχθεί συγκέντρωση 4 μg/ml καλλιέργειας. 2. Οι καλλιέργειες τοποθετούνται στον επωαστικό κλίβανο σε σταθερή θερμοκρασία 37 C για 72 ώρες. Το χρονικό αυτό διάστημα είναι αρκετό, ώστε σε πολλά κύτταρα να πραγματοποιηθούν 2 ή και περισσότερες μιτωτικές διαιρέσεις. 3. Μετά από παρέλευση 72 ωρών προστίθεται σε όλες τις καλλιέργειες κολχικίνη 0,05 ml από το προπαρασκευασθέν διάλυμα των 50 μg/ml, ώστε να προκύψει συγκέντρωση 0,5 μg/ml καλλιέργειας. 4. Η επώαση των καλλιεργειών συνεχίζεται για 2 ώρες ακόμη. Η κολχικίνη διακόπτει τη μίτωση στο στάδιο της μετάφασης, εμποδίζοντας τον

101 101 πολυμερισμό των μικροσωληναρίων της μιτωτικής ατράκτου. Τα κύτταρα που βρίσκονται σε μίτωση, αλλά δεν έχουν φθάσει ακόμη στο στάδιο της μετάφασης, προχωρούν κανονικά στη διαδικασία για να φθάσουν στην μετάφαση, όπου και σταματάει η περαιτέρω μίτωση. Με αυτόν τον τρόπο εμπλουτίζεται η καλλιέργεια με κύτταρα που βρίσκονται στη μετάφαση, η οποία αποτελεί και το καταλληλότερο στάδιο της μίτωσης για τη μελέτη των χρωματοσωμάτων. 5. Οι καλλιέργειες βγαίνουν από τον επωαστικό κλίβανο και μετά από ανάδευση μεταγγίζονται σε σωληνάρια φυγοκέντρησης των 10ml (ένα σωληνάριο για κάθε καλλιέργεια). 6. Φυγοκεντρούνται τα σωληνάρια επί 5 min σε 1000 στροφές. 7. Απορρίπτεται το υπερκείμενο, προστίθενται στο ίζημα με συνεχή ανάδευση 5 ml διαλύματος υποτόνου KCL 0,075 Μ και αφήνονται τα σωληνάρια για 10 min σε θερμοκρασία του δωματίου, ώστε να θραυστούν οι κυτταρικές μεμβράνες. 8. Τα σωληνάρια φυγοκεντρούνται πάλι επί 5min στις 1000 στροφές. 9. Απορρίπτεται το υπερκείμενο και με σύγχρονη ανάδευση προστίθεται στο ίζημα 5 ml διαλύματος μονιμοποιήσεως (FIX, μεθανόλη:oξικό οξύ 3:1). Φυγοκεντρείται πάλι επί 5 min στις 1000 στροφές. Εκτελούνται 3 αλληλοδιάδοχες πλύσεις με το διάλυμα FIX. 10.Μετά από μεσοδιάστημα ηρεμίας (20 min-48 h) επαναλαμβάνεται η πλύση με διάλυμα FIX, απορρίπτεται το υπερκείμενο και το ίζημα επιστρώνεται στάγδην με πιπέτες Pasteur σε αντικειμενοφόρες πλάκες (2-3 σταγόνες σε κάθε πλάκα), που αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα. 11.Οι αντικειμενοφόρες πλάκες εμβυθίζονται σε διάλυμα Hoechst για 12 min. 12. Γίνεται ενστάλαξη 2-3 σταγόνων ρυθμιστικού διαλύματος McLivaines ρη=8 σε κάθε αντικειμενοφόρο και κάλυψη αυτών αμέσως με καλυπτρίδες. 13. Τα παρασκευάσματα ακτινοβολούνται με υπεριώδη ακτινοβολία για 1 ώρα.

102 Αφαιρούνται οι καλυπτρίδες και εμβυθίζονται σε διάλυμα της χρωστικής Giemsa 3% για 7-15 min. 15. Ξεπλένονται οι αντικειμενοφόρες πλάκες με νερό και αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα. 4) Παρατήρηση και μελέτη των SCEs και του PRI των κυττάρων Η παρατήρηση πραγματοποιήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο Olympus και σε μεγέθυνση 10 χ 100. (καταδυτικός φακός) Τα απαραίτητα κριτήρια για την ορθή μελέτη των SCEs είναι τα εξής: α) Η ικανοποιητική διαφοροποίηση (διαφορετική χρώση) των αδελφών χρωματίδων και η σαφής διάκριση μεταξύ 1 ης, 2 ης και 3 ης ή μετέπειτα γενιάς. β) Μιτώσεις με αριθμό χρωμοσωμάτων τουλάχιστον 40, όταν πρόκειται για ουσίες των οποίων η τοξικότητα αναστέλλει το ρυθμό διαίρεσης των κυττάρων. γ) Η απουσία αλληλοεπικαλύψεων (overlaps) στα χρωματοσώματα, ώστε να μην αποκρύπτεται αριθμός ανταλλαγών και να μην αλλοιώνονται τα αποτελέσματα. δ) Η μελέτη των μιτωτικών κύκλων έγινε με προσδιορισμό της εκατοστιαίας αναλογίας των μεταφάσεων της 1 ης, 2 ης και 3 ης ή μετέπειτα κυτταρικής διαίρεσης. Με τον τρόπο αυτό μπορούμε να διαπιστώσουμε αν υπάρχει επιτάχυνση ή επιβράδυνση στην ταχύτητα των διαιρέσεων των κυττάρων. Ο υπολογισμός του PRI έγινε σύμφωνα με τον τύπο: PRI = Μ1+2xΜ2+3xΜ3 + )/100 όπου Μ1 = η εκατοστιαία αναλογία των μεταφάσεων στην 1 η διαίρεση, Μ2 = η εκατοστιαία αναλογία των μεταφάσεων στη 2 η μιτωτική μιτωτική

103 103 διαίρεση και Μ3 + = η εκατοστιαία αναλογία των μεταφάσεων στην 3 η μετέπειτα μιτωτικές διαιρέσεις. και 5) Στατιστική μελέτη Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων των SCEs υπολογίσθηκαν οι μέσες τιμές (Mean-MO) και το τυπικό σφάλμα κάθε μέσης τιμής (Standard error of the mean-se). Η στατιστική μελέτη των αποτελεσμάτων για τις SCEs βασίσθηκε στο κριτήριο Student s t-test και για τα PRI στο κριτήριο χ 2. Εκτιμήθηκε επίσης στατιστικά η συσχέτιση των SCEs με τους PRI των κυττάρων, με τον προσδιορισμό του συντελεστή συσχετίσεως r κατά Pearson. 6) Παρασκευή νεοσυντεθεισών 1,5-βενζοδιαζεπινών ΒΔΖ1 και ΒΔΖ3 Οι ενώσεις ΒΔΖ1 και ΒΔΖ3 παρασκευάστηκαν σε απόδοση 35% και 3% αντίστοιχα από την αντίδραση της 4,5-διμεθυλο-1,2- φαινυλενοδιαμίνης, με μερκαπτοπροπιονικό οξύ και οκταπλάσια ποσότητα ακετόνης σε διαλύτη τολουόλιο και 6 ώρες θέρμανση με ψυκτήρα επαναρροής.

104 104 ΒΔΖ32,3a,5,5,8,9-εξαμεθυλο-3a,4,5,6-τετραϋδρο [1,3]θειαζολο[3,2-a][1,5] βενζοδιαζεπιν-1(2η)-όνη Εικόνα 25: Τρόπος παρασκευής ενώσεων ΒΔΖ1 και ΒΔΖ3 ΒΔΖ2 Η ένωση ΒΔΖ2 παρασκευάστηκε σε απόδοση 30% από την αντίδραση ης 4-βενζοϋλο-1,2-φαινυλενοδιαμίνης, με μερκαπτοπροπιονικό οξύ και οκταπλάσια ποσότητα ακετόνης σε διαλύτη τολουόλιο και 6 ώρες θέρμανση με ψυκτήρα επαναρροής. ΒΔΖ12,5,5-τριμεθυλο-4-(4,4,7,8 -τετραμεθυλο-1,3,4,5 -τετραϋδρο-1,5 βενζοδιαζεπινο-2 -υλιδενο)-3(-2η,5η)θειοφαινόνη 2,5,5-τριμεθυλο-4-(8 -βενζοϋλο-4,4 -διμεθυλο-1,3,4,5 -τετραϋδρο-1,5 βενζοδιαζεπινο-2 -υλιδενο)-3(2η,5η)θειοφαινόνη Εικόνα 26: Τρόπος παραασκεύης ένωσης ΒΔΖ2

105 105 ΒΔΖ4 Η ένωση ΒΔΖ4 παρασκευάστηκε σε απόδοση 45% από την αντίδραση της 1,2-φαινυλενοδιαμίνης με θειογλυκολικό οξύ και οκταπλάσια ποσότητα ακετόνης σε διαλύτη τολουόλιο και 6 ώρες θέρμανση με ψυκτήρα επαναρροής. 5,5-διμεθυλο-4-(4,4 διμεθυλο-1,3,4,5 -τετραϋδρο-1,5 -βενζοδιαζεπινο-2 υλιδενο)-3(-2η,5η)θειοφαινόνη Εικόνα 27 : Τρόπος παρασκευής ένωσης ΒΔΖ4

106 106 Β) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΛΟΖΑΠΙΝΗ Η από του στόματος χορηγούμενη δόση της κλοζαπίνης κυμαίνεται από mg ημερησίως. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η κλοζαπίνη προκάλεσε κυτταρογενετικές βλάβες στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος τριών διαφορετικών υγιών αιμοδοτών. Η επίδραση της μελετήθηκε σε πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις 30μΜ, 60μΜ, 90μΜ, 120μΜ και 150μΜ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος ημερήσιες θεραπευτικές δόσεις. Όπως φαινεται στον Πίνακα 1 και στο Ιστόγραμμα 1 η κυτταροτοξικότητά της κλοζαπίνης επέφερε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη συχνότητα των SCEs σχεδόν σε όλες τις καλλιέργειες, ενώ στην συγκέντρωση των 90μΜ η συχνότητα των SCEs στα λεμφοκύτταρα των δύο αιμοδοτών διπλασιάζεται. Η αύξηση των SCEs εμφανίζεται στατιστικά σημαντική ήδη από την δόση των 60μΜ. Τα αποτελέσματα της επίδραση της κλοζαπίνης στη συχνότητα του PRI των λεμφοκυττάρων από τις καλλιέργειες του αίματος των τριών υγιών ανθρώπων παρουσιάζονται στον Πίνακα 2 και στο Ιστόγραμμα 2. Ο PRI των λεμφοκυττάρων μειώθηκε μετά την επίδραση της κλοζαπίνης, αλλά η πτώση αυτή εμφανίζεται στατιστικά σημαντική (p<0,001), μόνο στην συγκέντρωση των 150 μμ της κλοζαπίνης στις καλλιέργειες του 2 ου αιμοδότη. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι οι καλλιέργειες του 1 ου αιμοδότη δεν αναπτύχθηκαν πέραν των 90μΜ, του 2 ου αιμοδότη πέραν των 150μΜ και του 3 ου αιμοδότη πέραν των 120μΜ, γεγονός που μπορεί να αποδοθεί στην τοξικότητα του φαρμάκου.

107 107 ΠΙΝΑΚΑΣ 1: Επίδραση της Κλοζαπίνης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωσ η (μm) Συγκέντρωσ η (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE/ κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 3 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο Μάρτυρες 0 9,624 ± 0,558 9,157 ± 0,575 9,272 ± 0, μg/ ml 11,513 ± 0,649 11,787 ± 0,641 10,838 ± 0, μg/ ml 13,905 ± 0,704* 13,353 ± 0,630* 13,093 ± 0,477* 90 30μg/ ml 20,016 ± 0,614* 19,143 ± 0,786* 13,918 ± 0,441* μg/ ml 17,317 ± 0,836* 16,258 ± 0,622* μg/ ml 20,604 ± 0,904* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 1: Επίδραση της Κλοζαπίνης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων ος Αιμοδότης SCEs/κύτταρο ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες Συγκέντρωση (μμ)

108 108 ΠΙΝΑΚΑΣ 2: Επίδραση της Κλοζαπίνης στον PRI, λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI 3 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 0 2,142 2,038 2, μg/ ml 2,01 1,953 2, μg/ ml 1,87 2,037 2, μg/ ml 1,794 1,701 2, μg/ ml 1,758 2, μg/ ml 1,554* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 2: Επίδραση της Κλοζαπίνης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 3 2,5 1ος Αιμοδότης 2 PRI 1,5 2ος Αιμοδότης 1 0,5 3ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες Συγκέντρωση (μμ)

109 109 ΡΙΣΠΕΡΙΔΟΝΗ Η από του στόματος χορηγούμενη δόση της ρισπεριδόνης κυμαίνεται από 1-6mg ημερησίως. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η ρισπεριδόνη προκάλεσε κυτταρογενετικές βλάβες στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος τριών υγιών αιμοδοτών. Η ρισπεριδόνη μελετήθηκε σε πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις: 0,5μΜ, 1μΜ, 2μΜ, 3μΜ και 4μΜ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος ημερήσιες θεραπευτικές δόσεις. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3 και στο Ιστόγραμμα 3 η κυτταροτοξικότητα της ρισπεριδόνης προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη συχνότητα των SCEs των λεμφοκυττάρων σε όλες τις υπό μελέτη καλλιέργειες, ενώ στην συγκέντρωση των 3μΜ ρισπεριδόνης διπλασιάζεται η συχνότητα των SCEs στα δύο από τα τρία πειράματα. Αύξηση της συχνότητας των SCEs στατιστικά σημαντική εμφανίζεται ήδη από την δόση του 1 μμ. Τα αποτελέσματα της επίδρασης της ρισπεριδόνης στη συχνότητα του PRI των λεμφοκυττάρων από τις καλλιέργειες αίματος των τριών υγιών ανθρώπων παρουσιάζονται στον Πίνακα 4 και στο Ιστόγραμμα 4. Ο PRI των λεμφοκυττάρων δεν παρουσίασε καμία ουσιαστική μείωση μετά την επίδραση της ρισπεριδόνης, εκτός από μία μικρή πτώση που εμφάνισε ο1 ος αιμοδότης στις συγκεντρώσεις 2μΜ, 3μΜ και 4μΜ.

110 110 ΠΙΝΑΚΑΣ 3: Επίδραση της Ρισπεριδόνης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 3 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο Μάρτυρες 0 9,863 ± 0,461 9,624 ± 0,558 9,157 ± 0,575 0,5 0,2 μg/ ml 11,927± 0,516 13,895 ± 0,525* 11,276 ± 0,457 1,0 0,4 μg/ ml 15,315 ± 0,538* 16,412 ± 0,719* 12,138± 0,437* 2,0 0,8 μg/ ml 15,223± 0,685* 17,408 ± 0,741* 13,389± 0,614* 3,0 1,2 μg/ ml 18,299 ± 0,809* 18,687 ± 0,82* 15,370 ± 0,415* 4,0 1,6 μg/ ml 19,342 ± 0,809* 20,333 ± 0,611* 16,959 ± 0,598* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 3: Επίδραση της Ρισπεριδόνης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. SCEs/κύτταρο Μάρτυρες 0, Συγκέντρωση (μμ) 1ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης

111 111 ΠΙΝΑΚΑΣ 4: Επίδραση της Ρισπεριδόνης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI 3 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 0 2,681 2,142 2,038 0,5 0,2 μg/ ml 2,600 2,132 2,26 1,0 0,4 μg/ ml 2,601 2,120 2,147 2,0 0,8 μg/ ml 2,336 2,026 2,116 3,0 1,2 μg/ ml 2,401 2,201 2,093 4,0 1,6 μg/ ml 2,366 2,108 2,035 *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 4: Επίδραση της Ρισπεριδόνης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 3 PRI 2,5 2 1,5 1 0,5 1ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 0, Συγκέντρωση (μμ)

112 112 ΟΛΛΑΝΖΑΠΙΝΗ Η από του στόματος χορήση της ολλανζαπίνης κυμαίνεται από 5-30 mg ημερησίως. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η ολλανζαπίνη προκάλεσε κυτταρογενετικές βλάβες στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος τριών υγιών αιμοδοτών. Η ολλανζαπίνη μελετήθηκε σε έξι διαφορετικές συγκεντρώσεις: 3,2μΜ, 6,4μΜ, 9,6μΜ, 12,8μΜ, 16μΜ και 19,2 μμ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος ημερήσιες θεραπευτικές δόσεις. Η κυτταροτοξικότητα της ολλανζαπίνης, όπως φαίνεται στον Πίνακα 5 και το Ιστόγραμμα 5, επέφερε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη συχνότητα των SCEs των λεμφοκυττάρων σε όλες τις υπό μελέτη καλλιέργειες, ενώ στην συγκέντρωση των 19,2μΜ η συχνότητα των SCEs σχεδόν διπλασιάζεται και στα 3 πειράματα. Η αύξηση της συχνότητας των SCEs εμφανίζεται στατιστικά σημαντική στα δύο από τα τρία πειράματα, ήδη από την δόση των 6,4μΜ της ολλανζαπίνης, ενώ στην δόση των 12,8μΜ παρουσιάζεται στατιστικά σημαντική σε όλα τα πειράματα. Τα αποτελέσματα της επίδραση της ολλανζαπίνης στη συχνότητα του PRI των λεμφοκυττάρων των καλλιεργειών αίματος των τριών υγιών ανθρώπων παρουσιάζονται στον Πίνακα 6 και στο Ιστόγραμμα 6. Ο PRI παρουσίασε μικρή μείωση μετά την επίδραση της ολλανζαπίνης, αλλά η πτώση αυτή δεν εμφανίζεται στατιστικά σημαντική (p<0,001).

113 113 ΠΙΝΑΚΑΣ 5: Επίδραση της Ολλανζαπίνης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωσ η (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs±SE/ κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs±SE/ κύτταρο 3 ος Αιμοδότης SCEs±SE/ κύτταρο Μάρτυρες 0 9,272 ± 0,458 8,743± 0,455 9,288 ± 0,577 3,2 1 11,810 ± 0,510 11,094± 0,354 9,533 ± 0,685 6,4 2 12,813 ± 0,458* 11,843± 0,583* 12,017 ± 0,579 9,6 3 13,069 ± 0,266* 12,753± 0,494* 12,150 ± 0,605 12,8 4 14,493 ± 0,482* 13,593± 0,530* 12,947 ± 0,460* 16,0 5 15,622 ± 0,600* 16,757± 0,699* 15,864 ± 0,489* 19,2 6 16,907 ± 0,582* 17,145± 0,878* 17,636 ± 0,7* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 5: Επίδραση της Ολλανζαπίνης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 20 SCEs/κύτταρο ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 3,2 6,4 9,6 12, ,2 Συγκέντρωση (μμ)

114 114 ΠΙΝΑΚΑΣ 6: Επίδραση της Ολλανζαπίνης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI 3 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 0 2,517 2,3 2,566 3,2 1μg/ ml 2,453 2,2 2,647 6,4 2μg/ ml 2,555 2,194 2,547 9,6 3μg/ ml 2,326 2,153 2,551 12,8 4μg/ ml 2,347 2,171 2,578 16,0 5μg/ ml 2,254 2,088 2,457 19,2 6μg/ ml 2,261 2,080 2,271 *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 6: Επίδραση της Ολλανζαπίνης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 3 2,5 1ος Αιμοδότης 2 PRI 1,5 2ος Αιμοδότης 1 0,5 3ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 3,2 6,4 9,6 12, ,2 Συγκέντρωση (μμ)

115 115 ΖΙΠΡΑΣΙΔΟΝΗ Η από του στόματος χορηγούμενη δόση της ζιπρασιδόνης κυμαίνεται από mg ημερησίως. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η ζιπρασιδόνη προκάλεσε κυτταρογενετικές βλάβες στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος τριών υγιών αιμοδοτών. Μελετήθηκε σε τέσσερις διαφορετικές συγκεντρώσεις, 0,12μΜ, 0,2μΜ, 0,4μΜ, και 0,6μΜ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος χορηγούμενες ημερήσιες θεραπευτικές δόσεις. Η κυτταροτοξικότητα της ζιπρασιδόνης, όπως φαίνεται στον Πίνακα 7 και στο Ιστόγραμμα 7, προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη συχνότητα των SCEs σε όλες τις υπό μελέτη καλλιέργειες. Η αύξηση της συχνότητας των SCEs στα λεμφοκύτταρα των δύο από τους τρεις αιμοδότες, εμφανίζεται στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) μετά την επίδραση 0,4μΜ ζιπρασιδόνης, ενώ στην συγκέντρωση των 0,6μΜ του φαρμάκου διπλασιάζεται. Επίδραση ζιπρασιδόνης σε συγκέντρωση 0,6μΜ επάγει στατιστικά σημαντική άνοδο στις SCEs όλων των καλλιεργειών. Τα αποτελέσματα της κυτταροστατικής δράσης της ζιπρασιδόνης παρουσιάζονται στον Πίνακα 8 και στο Ιστόγραμμα 8. Ο PRI των λεμφοκυττάρων των καλλιεργειών παρουσίασε μικρή μείωση με την επίδραση της ζιπρασιδόνης, αλλά η πτώση αυτή, δεν εμφανίζεται στατιστικά σημαντική (p<0,001).

116 116 ΠΙΝΑΚΑΣ 7: Επίδραση της Ζιπρασιδόνης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 3 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο Μάρτυρες 0 0,12 49,98μg 0,20 83,3 μg 0,40 166,6μg 0,60 249,9μg 7,806 ± 0,436 8,703 ± 0,611 8,417 ± 2,100 10,692 ± 0,910 11,819 ± 0,685 11,74 ± 1,830 11,931 ± 0,745 12,97 ± 0,751 10,046 ± 2,142 13,784 ± 0,681* 13,996 ± 0,867 13,678 ± 2,000* 14,53 ± 0,533* 16,247 ± 0,712* 14,827 ± 1,612* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 7: Επίδραση της Ζιπρασιδόνης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 18 SCEs/κύτταρο ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 0,12 0,20 0,40 0,60 Συγκέντρωση (μm)

117 117 ΠΙΝΑΚΑΣ 8: Επίδραση της Ζιπρασιδόνης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI 3 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 0 2,297 2,464 2,1 0,12 0,20 0,40 0,60 49,98μg 2,181 2,293 1,83 83,3 μg 2,038 2,226 2, ,6μg 2 2, ,9μg 1,937 2,2 1,612 *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 8: Επίδραση της Ζιπρασιδόνης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 3 2,5 1ος Αιμοδότης 2 PRI 1,5 2ος Αιμοδότης 1 0,5 3ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 0,12 0,20 0,40 0,60 Συγκέντρωση (μm)

118 118 ΔΙΑΖΕΠΑΜΗ Η από του στόματος χορηγούμενη δόση της διαζεπάμης κυμαίνεται από 1,5-18 mg ημερησίως. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η διαζεπάμη προκάλεσε κυτταρογενετικές βλάβες στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος τεσσάρων υγιών αιμοδοτών. Η διαζεπάμη μελετήθηκε σε εννέα συγκεντρώσεις: 17,6μΜ, 35,2μΜ, 52,8μΜ, 70,4μΜ, 88μΜ, 105,6μΜ, 140,8μΜ, 176μΜ, και 211,2μΜ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος χορηγούμενες ημερήσιες θεραπευτικές δόσεις. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 9 και στο Ιστόγραμμα 9, η κυτταροτοξικότητα της διαζεπάμης επέφερε δοσοεξαρτώμενη αύξηση της συχνότητας των SCEs. Στην συγκέντρωση των 105,6μΜ διπλασιάζεται η συχνότητα των SCEs των λεμφοκυττάρων σχεδόν σε όλες τις καλλιέργειες. Στον τέταρτο αιμοδότη η άνοδος των τιμών των SCEs εμφανίζεται στατιστικά σημαντική ήδη στη συγκέντρωση των 35,2μΜ, στο δεύτερο και τρίτο αιμοδότη στα 52,8 μμ, ενώ στον πρώτο μετά από επίδραση 105,6 μμ διαζεπάμης. Τα αποτελέσματα της κυτταροστατικής δράσης της διαζεπάμης παρουσιάζονται στον Πίνακα 10 και στο Ιστόγραμμα 10. Μετά την επίδραση της διαζεπάμης παρατηρούνται σημαντικές ατομικές διαφορές μεταξύ των λεμφοκυττάρων των τεσσάρων αιμοδοτών ως προς τις τιμές του PRI. Σε 70,4μΜ η μείωση του PRI των λεμφοκυττάρων των καλλιεργειών του πρώτου και του τέταρτου αιμοδότη εμφανίζεται στατιστικά σημαντική (p<0,001), ενώ στις συγκεντρώσεις 176μΜ και 211,2μΜ η πτώση των τιμών του PRI είναι στατιστικά σημαντική στα λεμφοκύτταρα όλων των αιμοδοτών.

119 119 ΠΙΝΑΚΑΣ 9: Επίδραση της Διαζεπάμης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τεσσάρων υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 3 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 4 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο Μάρτυρες 0 7,70 ± 0,56 7,5 ± 0,52 9,45 ± 0,62 9,15 ± 0,407 17,6 35,2 52,8 70,4 88,0 105,6 140,8 176,0 7,5 15,0 22,5 30,0 37,5 45,0 60,0 75,0 7,16 ± 0,42 11,07± 0,80 12,02 ±,684 12,99 ± 0,646 8,10 ± 0,598 11,6 ± 0,531 13,69 ±,714 14,74 ± 0,435* 10,06 ± 0,50 12,66 ± 0,68* 15,17± 0,517* 13,89 ± 0,5* 8,99 ± 0,52 14,13 ± 0,46* 15,52 ± 0,566* 18,57 ± 0,405* 10,1 ± 0,509 15,02 ± 0,34* 15,75 ± 0,505* 16,14 ± 0,714* 12,16 ± 0,534* 15,31 ± 0,40* 19,22 ± 0,816* 17,29 ± 0,5* 11,06 ± 0,555 16,84 ± 0,537* 19,1 ± 0,545* 19,14 ± 0,807* 15,82 ± 0,535* 16,38 ± 0,538* 19,21 ± 0,519* 20,27 ± 0,501* 211,2 18,96 ± 1,26* 18,65 ± 0,437* 23,19 ± 0,642* 21,22 ± 0,511* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 9: Επίδραση της Διαζεπάμης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τεσσάρων υγιών ανθρώπων. SCEs/κύτταρο Μάρτυρες 17,6 35,2 52,8 70, ,6 140, ,2 Συγκέντρωση (μμ) 1ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης 4ος Αιμοδότης

120 120 ΠΙΝΑΚΑΣ 10: Επίδραση της Διαζεπάμης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τεσσάρων υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI 3 ος Αιμοδότης PRI 4 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 17,6 35,2 52,8 70,4 88,0 105,6 140,8 176,0 211,2 0 7,5 15,0 22,5 30,0 37,5 45,0 60,0 75,0 90,0 2,35 2,46 2,53 2,51 2,27 2,37 2,33 2,43 2,16 2,32 1,99** 2,26 2,28 2,3 2,27 2,2 1,53** 2,12 2,16 2,04** 1,75** 2,18 1,85** 2,09 1,95** 2,03 1,79** 2,05** 1,95** 2,13 1,43** 1,58** 1,64** 2,043** 1,57** 1,66** 1,58** 1,92** 1,54** 1,39** *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 10: Επίδραση της Διαζεπάμης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τεσσάρων υγιών ανθρώπων. 3 PRI 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Μάρτυρες 17,6 35,2 52,8 70, ,6 140, ,2 Συγκέντρωση (μm) 1ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης 4ος Αιμοδότης

121 121 ΛΟΡΑΖΕΠΑΜΗ Η από του στόματος χορηγούμενη δόση της λοραζεπάμης κυμαίνεται από 1-6 mg ημερησίως. Η κυτταρογενετική δράση της λοραζεπάμης μελετήθηκε σε λεμφοκύτταρα καλλιεργειών από περιφερικό αίμα δύο υγιών αιμοδοτών.οι τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια είναι 0,62μΜ, 1,24μΜ, 1,86μΜ, 2,48μΜ, 3,1μΜ και 3,72μΜ, ισοδύναμες με τις από του στόματος χορηγούμενες δοσολογίες. Στον Πίνακα 11 και στο Ιστόγραμμα 11 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της επίδρασης της λοραζεπάμης στη συχνότητα των SCEs. Η λοραζεπάμη προκαλεί δοσοεξαρτώμενη αύξηση της συχνότητας των SCEs στα λεμφοκύτταρα και των δύο δοτών. Επίδραση των συγκεντρώσεων από 1,86μΜ έως 3,72μΜ επάγει στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) αύξηση των τιμών των SCEs και στα δύο πειράματα. Τα αποτελέσματα της κυτταροστατικής δράσης της λοραζεπάμης παρουσιάζονται στον Πίνακα 12 και στο Ιστόγραμμα 12. Μετά την επίδραση της λοραζεπάμης δεν παρατηρούνται σημαντικές ατομικές διαφορές μεταξύ των λεμφοκυττάρων των δύο αιμοδοτών ως προς τις τιμές του PRI. Πτώση των τιμών του PRI παρατηρείται σε όλες τις υπό μελέτη συγκεντρώσεις, αλλά στατιστικά σημαντική είναι μείωση των επιπέδων του PRI στην υψηλότερη συγκέντρωση (3,72 μμ).

122 122 ΠΙΝΑΚΑΣ 11: Επίδραση της Λοραζεπάμης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο Μάρτυρες 0 9,272 ± 0,458 6,55 ± 0,716 0,62 0,199 10,497 ± 0,45 8,12 ± 0,582 1,24 0,398 12,433 ± 0,75 9,08 ± 0,568 1,86 0,597 13,738 ± 0,675* 11,902 ± 0,579* 2,48 0,796 16,759 ± 0,653* 12,277 ± 0,553* 3,1 0,995 16,445 ± 0,727* 13,468 ± 0,567* 3,72 1,194 18,562 ± 0,676* 14,602 ± 0,633* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 11: Επίδραση της Λοραζεπάμης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. SCEs/κύτταρο ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης Μάρτυρες 0,62 1,24 1,86 2,48 3,1 3,72 Συγκέντρωση (μμ)

123 123 ΠΙΝΑΚΑΣ 12: Επίδραση της Λοραζεπάμης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 0 2,517 2,127 0,62 0,199 2,44 2,06 1,24 0,398 2,441 1,98 1,86 0,597 2,366 1,984 2,48 0,796 2,397 1,966 3,1 0,995 2,324 1,955 3,72 1,194 2,240** 1,923** *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 12: Επίδραση της Λοραζεπάμης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. 3 2,5 2 1ος Αιμοδότης PRI 1,5 1 0,5 2ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 0,62 1,24 1,86 2,48 3,1 3,72 Συγκέντρωση (μμ)

124 124 ΑΛΠΡΑΖΟΛΑΜΗ Η από του στόματος χορηγούμενη δόση της αλπραζολάμης κυμαίνεται από 0,25-6 mg ημερησίως. Η κυτταρογενετική της δράση μελετήθηκε σε λεμφοκύτταρα καλλιεργειών από περιφερικό αίμα δύο υγιών αιμοδοτών. Οι τελικές συγκεντρώσεις της αλπραζολάμης ανά καλλιέργεια είναι 0,16μΜ, 0,32μΜ, 0,64μΜ, 1,28μΜ, 2,56μΜ, και 3,84μΜ, ισοδύναμες με τις από του στόματος χορηγούμενες δοσολογίες. Στον Πίνακα 13 και στο Ιστόγραμμα 13 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της επίδρασης της στη συχνότητα των SCEs. Η αλπραζολάμη προκαλεί δοσοεξαρτώμενη αύξηση της συχνότητας των SCEs στα λεμφοκύτταρα και των δύο δοτών. Επίδραση όλων των υπό μελέτη συγκεντρώσεων (από 0,16μΜ έως 3,84 μμ) επάγει στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) αύξηση των τιμών των SCEs και στα δύο πειράματα. Τα αποτελέσματα της κυτταροστατικής δράσης της αλπραζολάμης παρουσιάζονται στον Πίνακα 14 και στο Ιστόγραμμα 14. Μετά την επίδραση της αλπραζολάμης δεν παρατηρούνται σημαντικές ατομικές διαφορές μεταξύ των λεμφοκυττάρων των δύο αιμοδοτών ως προς τις τιμές του PRI. Πτώση των τιμών του PRI παρατηρείται σε όλες τις υπό μελέτη συγκεντρώσεις, αλλά στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) είναι η μείωση των επιπέδων του PRI στις συγκεντρώσεις 1,28 μμ, 2,56 μμ και 3,84 μμ.

125 125 ΠΙΝΑΚΑΣ 13: Επίδραση της Αλπραζολάμης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Μάρτυρες Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 0 7,08 ± 0,503 7,10 ± 0,38 0,16 0,049 10,070 ± 0,923* 10,767 ± 0,532* 0,32 0,098 11,201 ± 0,905* 12,604 ± 0,530* 0,64 0,196 12,322 ± 0,719* 13,266 ± 0,487* 1,28 0,392 12,565 ± 0,808* 15,063 ± 0,587* 2,56 0,784 12,998 ± 0,854* 16,241 ± 0,879* 3,84 1,176 13,323 ± 0,714* 15,788 ± 0,686* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 13: Επίδραση της Αλπραζολάμης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. SCEs/κύτταρο Μάρτυρες 0,16 0,32 0,64 1,28 2,56 3,84 Συγκέντρωση (μμ) 1ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης

126 126 ΠΙΝΑΚΑΣ 14: Επίδραση της Αλπραζολάμης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 0 2,19 2,166 0,16 0,049 1,975 2,111 0,32 0,098 1,927 2,064 0,64 0, ,973 1,28 0,392 1,801** 1,946** 2,56 0,784 1,79** 1,95** 3,84 1,176 1,77** 1,798** *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 14: Επίδραση της Αλπραζολάμης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. 2,5 PRI 2 1,5 1 0,5 1ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 0,16 0,32 0,64 1,28 2,56 3,84 Συγκέντρωση (μμ)

127 127 ΒΡΩΜΑΖΕΠΑΜΗ Η από του στόματος χορηγούμενη δόση της βρωμαζεπάμης κυμαίνεται από 1,5-18 mg ημερησίως Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η βρωμαζεπάμη παρουσίασε κυτταρογενετικές βλάβες στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος τριών υγιών αιμοδοτών. Η βρωμαζεπάμη μελετήθηκε σε έξι διαδοχικές δοσολογίες: 0,47μΜ, 0,95μΜ, 1,42μΜ, 1,90μΜ, 2,37μΜ και 2,85 μμ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος ημερήσιες θεραπευτικές δόσεις. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 15 και στο Ιστόγραμμα 15 η κυτταροτοξικότητα της βρωμαζεπάμης προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη συχνότητας των SCEs. Στατιστικά σημαντική αύξηση ( p<0,001) παρουσιάζει η συχνότητα των SCEs μετά την επίδραση 0,95μΜ βρωμαζεπάμης στα λεμφοκύτταρα του πρώτου και του δεύτερου αιμοδότη, ενώ 1,90μΜ βρωμαζεπάμης διπλασιάζουν τη συχνότητα των SCEs των λεμφοκυττάρων σε όλες τις καλλιέργειες. Η άνοδος των τιμών των SCEs διατηρείται στατιστικά σημαντική στα λεμφοκύτταρα όλων των καλλιεργειών μετά την επίδραση 2,37μΜ και 2,85μΜ βρωμαζεπάμης Τα αποτελέσματα της κυτταροστατικής δράσης της βρωμαζεπάμης παρουσιάζονται στον Πίνακα 16 καθώς και στο Ιστόγραμμα 16. Μετά την επίδραση της βρωμαζεπάμης παρατηρούνται σημαντικές ατομικές διαφορές μεταξύ των λεμφοκυττάρων των τριών αιμοδοτών ως προς τις τιμές του PRI. Πτώση των τιμών του PRI επιφέρουν συγκεντρώσεις της βρωμαζεπάμης μεγαλύτερες από 0,95 μμ, αλλά στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) μείωση των επιπέδων του PRI προκαλούν οι συγκεντρώσεις 2,37μΜ και 2,845μΜ, μόνο στις καλλιέργειες του δεύτερου αιμοδότη.

128 128 ΠΙΝΑΚΑΣ 15: Επίδραση της Βρωμαζεπάμης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 3 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο Μάρτυρες 0 8,518 ± 0,492 8,748 ± 0,422 10,949 ± 0,366 0,47 1,5 9,899 ± 0,816 11,528 ± 0,652 12,422 ± 0,591 0, ,345 ± 0,617* 12,67 ± 0,634* 12,302 ± 0,613 1,42 4,5 17,268 ± 1,541* 14,016 ± 0,824* 15,994 ± 1,527 1, ,593 ± 0,731* 16,761 ± 0,930* 20,311 ± 1,536* 2,37 7,5 26,717 ± 1,053* 18,69 ± 0,366* 25,381 ± 1,039* 2, ,366 ± 1,196* 18,177 ± 1,624* 24,991 ± 1,613* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 15: Επίδραση της Βρωμαζεπάμης στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 1ος Αιμοδότης SCEs/κύτταρο 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης Μάρτυρες 0,47 0,95 1,42 1,9 2,37 2,85 Συγκέντρωση (μμ)

129 129 ΠΙΝΑΚΑΣ 16: Επίδραση της Βρωμαζεπάμης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI 3 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 0 0,47 1,5 0,95 3 2,004 2,014 2,21 2,08 1,895 2,23 1,943 1,973 1,949 1,42 4,5 1,91 1,847 1,91 1,90 6 1,757 1,544 1,764* 2,37 7,5 1,847 1,475* 1,895 2,85 9 1,86 1,45* 1,818 *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 16: Επίδραση της Βρωμαζεπάμης στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 2,5 PRI 2 1,5 1 0,5 0 1ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης Μάρτυρες 0,47 0,95 1,42 1,9 2,37 2,85 Συγκέντρωση (μμ)

130 130 ΒΑΛΠΡΟÏΚΟ ΟΞΥ Η από του στόματος χορηγούμενη δόση του βαλπροïκού οξέος κυμαίνεται από mg ημερησίως. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, το βαλπροïκό οξύ, προκάλεσε κυτταρογενετικές βλάβες στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος τριών διαφορετικών, υγιών αιμοδοτών. Το βαλπροïκό οξύ μελετήθηκε σε τέσσερις συγκεντρώσεις: 2,1μΜ, 3,5μΜ, 7,0μΜ και 10,5 mμ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος ημερήσιες θεραπευτικές δόσεις. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 17 και στο Ιστόγραμμα 17 σε όλες σχεδόν τις συγκεντρώσεις το βαλπροïκό οξύ επέφερε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) στη συχνότητα των SCEs των λεμφοκυττάρων και των τριών αιμοδοτών. Συγκεκριμένα, 3,5mΜ βαλπρϊκού διπλασιάζουν τη συχνότητα των SCEs των λεμφοκυττάρων του πρώτου αιμοδότη. Στα 7mΜ φαίνεται ότι επιβιώνουν τα πλέον ανθεκτικά κύτταρα του συγκεκριμένου αιμοδότη, ενώ η συγκέντρωση των 10,5mΜ αποδείχθηκε ιδιαίτερα κυτταροστατική. Στα λεμφοκύτταρα του δεύτερου αιμοδότη το βαλπροïκό οξύ επάγει δοσοεξαρτώμενη αύξηση της συχνότητας των SCEs, η οποία διπλασιάζεται στα 10,5mΜ. Η συχνότητα των SCEs των λεμφοκυττάρων του τρίτου αιμοδότη διπλασιάζεται στη συγκέντρωση των 7,0 Mμ και αυξάνει ακόμη περισσότερο μετά την επίδραση 10,5 mμ του βαλπροïκού οξέος. Τα αποτελέσματα της κυτταροστατικής δράσης του βαλπροïκού οξέος παρουσιάζονται στον Πίνακα 18 καθώς και στο Ιστόγραμμα 18. Σε όλες τις υπό μελέτη συγκεντρώσεις του βαλπροïκού οξέος προκλήθηκε πτώση των επιπέδων του PRI των λεμφοκυττάρων όλων των καλλιεργειών, αλλά βρέθηκαν σημαντικές ατομικές διαφορές μεταξύ των λεμφοκυττάρων των τριών αιμοδοτών ως προς τις τιμές του PRI. Στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) μείωση των τιμών του PRI των λεμφοκυττάρων όλων των αιμοδοτών όμως σημειώθηκε στη συγκέντρωση των 10,5mΜ.

131 131 ΠΙΝΑΚΑΣ 17: Επίδραση του Βαλπροïκού οξέως στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (mm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 3 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο Μάρτυρες 0 2,1 300μg VA 3,5 500 μg VA 7,0 1000μg VA 10,5 1500μg VA 7,71 ± ,544 ± 0,378 7,826 ± 0,343 12,953 ± 0.518* 10,879 ± 0,397* 10,888 ± 0,301* 15,094 ± 0.481* 12,526 ± 0,640* 11,169 ± 0,538* 8,841 ± ,538 ± 0,521* 15,642 ± 0,679* 0* 14,533 ± 0,443* 18,480 ± 0,529* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 17: Επίδραση του Βαλπροïκού οξέως στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 20 SCEs/κύτταρο ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 2,1 3,5 7 10,5 Συγκέντρωση (mm)

132 132 ΠΙΝΑΚΑΣ 18: Επίδραση του Βαλπροïκού οξέως στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση (mm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI 3 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 0 2 2,355 2,587 2,1 300μg VA 1,89 2,294 2,457 3,5 500 μg VA 1,711 2,21 2,25 7,0 1000μg VA 1,45* 1,954 2* 10,5 1500μg VA 1* 1,871* 1,812* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 18: Επίδραση του Βαλπροïκού οξέως στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος τριών υγιών ανθρώπων. 3 2,5 1ος Αιμοδότης 2 PRI 1,5 1 0,5 2ος Αιμοδότης 3ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 2,1 3,5 7 10,5 Συγκέντρωση (mμ)

133 133 ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΖΙΠΡΑΖΙΔΟΝΗΣ-ΒΑΛΠΡΟЇΚΟΥ Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η ζιπρασιδόνη, σε τέσσερις διαφορετικές συγκεντρώσεις: 0,12Μμ, 0,2μΜ, 0,4μΜ, και 0,6μΜ, προκάλεσε κυτταρογενετικές βλάβες στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος δύο υγιών αιμοδοτών. Παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη συχνότητα των SCEs σε όλες τις υπό μελέτη καλλιέργειες μετά τη χορήγηση ζιπρασιδόνης. Η αύξηση αυτή εμφανίζεται στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) μετά την επίδραση 0,2μΜ ζιπρασιδόνης, ενώ στην συγκέντρωση των 0,6μΜ του φαρμάκου διπλασιάζεται. Επίδραση ζιπρασιδόνης σε συγκέντρωση 0,6 μμ επάγει στατιστικά σημαντική άνοδο στις SCEs όλων των καλλιεργειών. Ο PRI των λεμφοκυττάρων των καλλιεργειών παρουσίασε μικρή μείωση με την επίδραση της ζιπρασιδόνης, αλλά η πτώση αυτή, δεν εμφανίζεται στατιστικά σημαντική (p<0,001). Στα λεμφοκύτταρα των ίδιων αιμοδοτών το βαλπροïκό οξύ, σε τέσσερις συγκεντρώσεις: 2,1mΜ 3,5mΜ 7mΜ και 10,5mΜ, προκάλεσε κυτταρογενετικές βλάβες. Συγκεκριμένα επέφερε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) στη συχνότητα των SCEs των λεμφοκυττάρων και των δύο αιμοδοτών Σε όλες τις υπό μελέτη συγκεντρώσεις του βαλπροïκού οξέος προκλήθηκε πτώση των επιπέδων του PRI των λεμφοκυττάρων όλων των καλλιεργειών, αλλά βρέθηκαν σημαντικές ατομικές διαφορές μεταξύ των λεμφοκυττάρων των δύο αιμοδοτών ως προς τις τιμές του PRI. Στατιστικά σημαντική (ρ<0,001) μείωση των τιμών του PRI των λεμφοκυττάρων και των δύο αιμοδοτών όμως σημειώθηκε στη συγκέντρωση των 10,5mΜ. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 19 και στο Ιστόγραμμα 19 η ταυτόχρονη χορήγηση ζιπραζιδόνης και βαλπροικού οξέος προκαλεί αύξηση στη συχνότητα των SCEs των λεμφοκυττάρων και των δύο αιμοδοτών στατιστικά σημαντική (p<0,001) ήδη στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Η παρατηρούμενη αυτή αύξηση των SCEs είναι υψηλότερη από την αύξηση που επιφέρει η μεμονομένη χορήγηση της ζιπρασιδόνης ή του βαλπροïκού οξέος, αλλά δεν ωφείλεται σε συνεργική δράση των δύο ουσιών.

134 134 Ο Πίνακας 20 καθώς και το Ιστόγραμμα 20 παρουσιάζουν την επίδραση της ζιπρασιδόνης, του βαλπροïκού οξέος και του συνδυασμού αυτών στις τιμές του PRI των λεμφοκυττάρων των δύο αιμοδοτών. Η μικρή μείωση του PRI που παρατηρείται από τη μεμονομένη χορήγηση των δύο φαρμάκων δεν μεταβάλλεται από την ταυτόχρονη επίδραση αυτών στις καλλιέργειες, γεγονός που αποκλείει τη συνεργική δράση.

135 135 ΠΙΝΑΚΑΣ 19: Επίδραση της Ζιπρασιδόνης(ZPN), του Βαλπροïκού οξέο ς (BO) και του συνδυασμού αυτών στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. Ουσίες Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο 2 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο Μάρτυρες 0 0 7,544 ± 0,378 7,826 ± 0,343 ΖΠΝ ΒΟ ΖΠΝ + ΒΟ 0, , , , ,076 ± 0,374 10,879 ± 0,397* 11,588 ± 0,491* 9,366 ± 0,,557 10,888 ± 0,301* 10, 128 ± 0,479* ΖΠΝ ΒΟ ΖΠΝ + ΒΟ 0, , , , ,311 ± 0,547* 12,526 ± 0,640* 15,399 ± 0,681* 10,609 ± 0,476* 11,169 ± 0,538* 12,904 ± 0,497* ΖΠΝ ΒΟ ΖΠΝ + ΒΟ 0, , , , ,735 ± 0,683* 13,538 ± 0,521* 15,853 ± 0,773* 12,129 ± 0,528* 15,642 ± 0,679* 15,456 ± 0,550* ΖΠΝ ΒΟ ΖΠΝ + ΒΟ 0, , , , ,444 ± 0,686* 14,533 ± 0,443* 20,136 ± 0,707* 14,015 ± 0,617* 18,480 ± 0,529* 18,708 ± 0,498* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 19: Επίδραση της Ζιπρασιδόνης, του Βαλπροïκού οξέως και του συνδυασμού αυτών, στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. 25 SCEs/κύτταρο ος Αιμοδότης 2ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 0,12/ 2,1/ 0,12+2,1 0,2/ 3,5/ 0,2+3,5 0,4/ 7/ 0,4+7 0,6/ 10,5/ 0,6+10,5 Συγκέντρωση ΖΠΝ (μμ), ΒΟ (mm)

136 136 ΠΙΝΑΚΑΣ 20: Επίδραση της Ζιπρασιδόνης, του Βαλπροïκού οξέως και του συνδυασμού αυτών στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. Ουσίες Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI 2 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες 0 0 2,355 2,587 ΖΠΝ ΒΟ ΖΠΝ + ΒΟ ΖΠΝ ΒΟ ΖΠΝ + ΒΟ ΖΠΝ ΒΟ ΖΠΝ + ΒΟ ΖΠΝ ΒΟ ΖΠΝ + ΒΟ 0, , , , , , , , , , , , , , , , ,352 2,294 2,028 2,342 2,21 1,963 2,075 1,954 1,944 1,895 1,871* 1,861* 2,526 2,457 2,25 2,328 2,25 2,108 2,063* 2* 2* 1,902* 1,812* 1,841* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 20: Επίδραση της Ζιπρασιδόνης, του Βαλπροïκού οξέως και του συνδυασμού αυτών, στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων. 3 2,5 2 1ος Αιμοδότης 1,5 PRI 1 0,5 2ος Αιμοδότης 0 Μάρτυρες 0,12/ 2,1/ 0,12+2,1 0,2/ 3,5/ 0,2+ 3,5 0,4/ 7/ 0,4+7 0,6/ 10,5/ 0,6+10,5 Συγκέντρωση ΖΠΝ (μμ ), ΒΟ (mm)

137 137 ΝΕΟΣΥΝΤΙΘΕΜΕΝΕΣ 1,5-ΒΕΝΖΟΔΙΑΖΕΠΙΝΕΣ ΒΔΖ1 Η κυτταρογενετική δράση της ΒΔΖ1 μελετήθηκε σε συγκεντρώσεις ισοδύναμες με τις από του στόματος χορηγούμενες δόσεις των 1,4- βενζοδιαζεπινών. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η ΒΔΖ1 εκδήλωσε κυτταρογενετική δράση στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος των δύο υγιών αιμοδοτών. Η ΒΔΖ1 μελετήθηκε σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις: 1μΜ, 5μΜ και 10μΜ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος ημερήσιες χορηγούμενες δόσεις των 1,4- βενζοδιαζεπινών. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 21 και στο Ιστόγραμμα 21, η ΒΔΖ1 προκάλεσε μείωση της συχνότητας των SCEs των λεμφοκυττάρων σε όλες τις υπό μελέτη καλλιέργειες, η οποία έγινε στατιστικά σημαντική στις δύο μεγαλύτερες συγκεντρώσεις (5μΜ και 10μΜ). Τα αποτελέσματα της επίδρασης της ΒΔΖ1 στη συχνότητα του PRI των λεμφοκυττάρων από τις καλλιέργειες αίματος των δύο υγιών ανθρώπων παρουσιάζονται στον Πίνακα 22 και στο Ιστόγραμμα 22. Ο PRI των λεμφοκυττάρων δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική μεταβολή μετά την επίδραση της ΒΔΖ1 σε καμία συγκέντρωση.

138 138 ΠΙΝΑΚΑΣ 21: Επίδραση της ΒΔΖ1 στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δυο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση Συγκέντρωση 1 ος Αιμοδότης 2 ος Αιμοδότης (μm) (μg/ml) SCEs ± SE / SCEs ± SE / κύτταρο κύτταρο Μάρτυρες 0 6, ,3445 6,23 5,8 5 1,7225 5,05* 4,95* 10 3,445 4,6* 4,54* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 21: Επίδραση της ΒΔΖ1 στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων.

139 139 ΠΙΝΑΚΑΣ 22: Επίδραση της ΒΔΖ1 στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δυο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση Συγκέντρωση 1 ος Αιμοδότης 2 ος Αιμοδότης (μm) (μg/ml) PRI PRI Μάρτυρες 0 2, ,3445 2,26 1,96 5 1,7225 2,22 1,9 10 3,445 2,12 1,86 *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 22: Επίδραση της ΒΔΖ1 στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων.

140 140 ΒΔΖ2 Η κυτταρογενετική δράση της ΒΔΖ2 μελετήθηκε σε συγκεντρώσεις ισοδύναμες με τις από του στόματος χορηγούμενες δόσεις των 1,4- βενζοδιαζεπινών. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η ΒΔΖ2 εκδήλωσε ισχυρή κυτταρογενετική δράση στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος των δύο υγιών αιμοδοτών. Η ΒΔΖ2 μελετήθηκε σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις: 1μΜ, 5μΜ και 10μΜ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος ημερήσιες χορηγούμενες δόσεις των 1,4- βενζοδιαζεπινών. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 23 και στο Ιστόγραμμα 23, η ΒΔΖ2 προκάλεσε στατιστικά σημαντική μείωση της συχνότητας των SCEs των λεμφοκυττάρων σε όλες τις υπό μελέτη καλλιέργειες, σε όλες τις συγκεντρώσεις. Η ΒΔΖ2 έχει την ισχυρότερη κυτταρογενετική δράση μεταξύ των τεσσάρων υπό μελέτη ουσιών. Τα αποτελέσματα της επίδρασης της ΒΔΖ2 στη συχνότητα του PRI των λεμφοκυττάρων από τις καλλιέργειες αίματος των δύο υγιών ανθρώπων παρουσιάζονται στον Πίνακα 24 και στο Ιστόγραμμα 24. Ο PRI των λεμφοκυττάρων δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική μείωση μετά την επίδραση της ΒΔΖ2 σε καμία συγκέντρωση.

141 141 ΠΙΝΑΚΑΣ 23: Επίδραση της ΒΔΖ2 στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δυο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση Συγκέντρωση 1 ος Αιμοδότης 2 ος Αιμοδότης (μm) (μg/ml) SCEs ± SE / SCEs ± SE / κύτταρο κύτταρο Μάρτυρες 0 6, ,421 4,41* 4,7* 5 2,103 4,3* 4,65* 10 4,206 4,52* 4,85* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 23: Επίδραση της ΒΔΖ2 στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων.

142 142 ΠΙΝΑΚΑΣ 24: Επίδραση της ΒΔΖ2 στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δυο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση Συγκέντρωση 1 ος Αιμοδότης 2 ος Αιμοδότης (μm) (μg/ml) PRI PRI Μάρτυρες 0 2, ,421 2,25 1,9 5 2,103 2,2 1, ,206 2,16 1,71 *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 24: Επίδραση της ΒΔΖ2 στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων.

143 143 ΒΔΖ3 Η κυτταρογενετική δράση της ΒΔΖ3 μελετήθηκε σε συγκεντρώσεις ισοδύναμες με τις από του στόματος χορηγούμενες δόσεις των 1,4- βενζοδιαζεπινών. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η ΒΔΖ3 εκδήλωσε κυτταρογενετική δράση στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος των δύο υγιών αιμοδοτών. Η ΒΔΖ3 μελετήθηκε σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις: 1μΜ, 5μΜ και 10μΜ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος ημερήσιες χορηγούμενες δόσεις των 1,4- βενζοδιαζεπινών. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 25 και στο Ιστόγραμμα 25, η ΒΔΖ3 προκάλεσε μείωση της συχνότητας των SCEs των λεμφοκυττάρων σε όλες τις υπό μελέτη καλλιέργειες, η οποία έγινε στατιστικά σημαντική στη μεγαλύτερη συγκέντρωση (10μΜ). Τα αποτελέσματα της επίδρασης της ΒΔΖ3 στη συχνότητα του PRI των λεμφοκυττάρων από τις καλλιέργειες αίματος των δύο υγιών ανθρώπων παρουσιάζονται στον Πίνακα 26 και στο Ιστόγραμμα 26. Ο PRI των λεμφοκυττάρων δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική μείωση μετά την επίδραση της ΒΔΖ3 σε καμία συγκέντρωση.

144 144 ΠΙΝΑΚΑΣ 25: Επίδραση της ΒΔΖ3 στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δυο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση Συγκέντρωση 1 ος Αιμοδότης 2 ος Αιμοδότης (μm) (μg/ml) SCEs ± SE / SCEs ± SE / κύτταρο κύτταρο Μάρτυρες 0 6, ,305 6,6 6,5 5 1,523 6,05 5,9 10 3,045 4,93* 4,8* *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 25: Επίδραση της ΒΔΖ3 στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων.

145 145 ΠΙΝΑΚΑΣ 26: Επίδραση της ΒΔΖ3 στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δυο υγιών ανθρώπων. Συγκέντρωση Συγκέντρωση 1 ος Αιμοδότης 2 ος Αιμοδότης (μm) (μg/ml) PRI PRI Μάρτυρες 0 2, ,305 2,1 1,93 5 1,523 1,95 1, ,045 1,9 1,83 *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 26: Επίδραση της ΒΔΖ3 στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος δύο υγιών ανθρώπων.

146 146 ΒΔΖ4 Η κυτταρογενετική δράση της ΒΔΖ4 μελετήθηκε σε συγκεντρώσεις ισοδύναμες με τις από του στόματος χορηγούμενες δόσεις των 1,4- βενζοδιαζεπινών. Μετά από επίδραση 72 ωρών στους 37 C, η ΒΔΖ4 δεν εκδήλωσε κυτταρογενετική δράση στα λεμφοκύτταρα των καλλιεργειών του αίματος του ενός υγιούς αιμοδότη. Η ΒΔΖ4 μελετήθηκε σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις: 1μΜ, 5μΜ και 10μΜ (τελικές συγκεντρώσεις ανά καλλιέργεια), ισοδύναμες με τις από του στόματος ημερήσιες χορηγούμενες δόσεις των 1,4-βενζοδιαζεπινών. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 27 και στο Ιστόγραμμα 27, η ΒΔΖ4 δεν προκάλεσε στατιστικά σημαντική μεταβολή της συχνότητας των SCEs των λεμφοκυττάρων σε καμία συγκέντρωση. Τα αποτελέσματα της επίδρασης της ΒΔΖ4 στη συχνότητα του PRI των λεμφοκυττάρων από τις καλλιέργειες αίματος του ενός υγιούς ανθρώπου παρουσιάζονται στον Πίνακα 28 και στο Ιστόγραμμα 28. Ο PRI των λεμφοκυττάρων δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική μεταβολή μετά την επίδραση της ΒΔΖ4 σε καμία συγκέντρωση.

147 147 ΠΙΝΑΚΑΣ 27: Επίδραση της ΒΔΖ4 στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος ενός υγιούς ανθρώπου. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης SCEs ± SE / κύτταρο Μάρτυρες ,302 6,65 5 1,512 6, ,024 6,6 *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση της συχνότητας των SCEs, (t- test). Κάθε τιμή SCEs, αντιστοιχεί στον μέσο όρο 20 και πλέον μεταφάσεων 2ης μιτωτικής διαίρεσης, κάθε καλλιέργειας. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 27: Επίδραση της ΒΔΖ4 στη συχνότητα των SCEs λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος υγιούς ανθρώπου.

148 148 ΠΙΝΑΚΑΣ 28: Επίδραση της ΒΔΖ4 στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος ενός υγιούς ανθρώπου. Συγκέντρωση (μm) Συγκέντρωση (μg/ml) 1 ος Αιμοδότης PRI Μάρτυρες ,302 1,85 5 1,512 1, ,024 1,8 *Στατιστικά σημαντική (p<0,001) πτώση του PRI (χ² test). Κάθε τιμή PRI = (M1 +M2 +M3 + ) /100, όπου M1, M2, M3 + = % μεταφάσεις 1ης, 2ης, 3ης και μετέπειτα μιτωτικών διαιρέσεων, αντίστοιχα. Σε κάθε καλλιέργεια, μετρούνται το λιγότερο 100 μεταφάσεις για τον υπολογισμό του PRI. ΙΣΤΟΓΡΑΜΜΑ 28: Επίδραση της ΒΔΖ4 στον PRI λεμφοκυττάρων από καλλιέργειες αίματος υγιούς ανθρώπου.