ΕΚΦΡΑΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΘΕΡΜΙΚΟΥ ΣΟΚ ΚΑΙ ΝΕΟΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ ΣΤΑ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ ΤΩΝ ΣΙΕΛΟΓΟΝΩΝ ΑΔΕΝΩΝ ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΑΟΥ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ-ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΗΣ ΓΟΡΓΟΥΛΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΘΕΡΜΙΚΟΥ ΣΟΚ ΚΑΙ ΝΕΟΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ ΣΤΑ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ ΤΩΝ ΣΙΕΛΟΓΟΝΩΝ ΑΔΕΝΩΝ ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΑΟΥ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΙΑΤΡΟΣ - ΩΤΟΡΙΝΟΛΑΡΥΓΓΟΛΟΓΟΣ ΑΘΗΝΑ

2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΥΠΟΒΟΛΗΣ ΑΙΤΗΣΗΣ 06/10/2000 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΟΡΙΣΜΟΥ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ 17/10/2000 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΟΡΙΣΜΟΥ ΘΕΜΑΤΟΣ 01/07/2002 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ 1 ΗΣ ΕΚΘΕΣΗΣ ΠΡΟΟΔΟΥ 12/07/2002 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ 2 ΗΣ ΕΚΘΕΣΗΣ ΠΡΟΟΔΟΥ 08/09/2006 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ 3 ΗΣ ΕΚΘΕΣΗΣ ΠΡΟΟΔΟΥ 17/12/2012 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Τηνιακού Κωνσταντίνα, Αν. Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ (επιβλέπουσα) Αναγνωστοπούλου Σοφία, Αν. Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ Κίττας Χρήστος, Ομ. Καθηγητής, Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΚΑΤΑΘΕΣΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ

3 ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟΣ ΟΡΚΟΣ Χειρόγραφο του όρκου από τον 12ο αιώνα σε μορφή σταυρού 3

4 ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟΣ ΟΡΚΟΣ 4

5 ΣΥΝΟΠΤΙΚΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ Πτυχίο Ιατρικής Ιατρική Σχολή Αθηνών, 1997 (Λίαν Καλώς) Εμπειρία Γενικότερο Ιατρικό έργο Σμηνίας Υγειονομικού Ιατρός, 120 ΠΕΑ, Καλαμάτα (12/ /1998, 9 μήνες) Εσωτερικός Βοηθός Παθολογικού Τμήματος (Χρόνος Παθολογίας), 251 ΓΝΑ, Αθήνα, (07/ /1999, 10 μήνες) Υπηρεσία Υπαίθρου, Περιφερειακό Ιατρείο Βαλύρας, ΚΥ Μελιγαλά Μεσσηνίας, (09/ /2000, 12 μήνες) Επιστημονικός Συνεργάτης, Κλινική Πλαστικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής, Άγιος Σάββας, (04/ /2003, 9 μήνες) Εμπειρία-Ειδικότητα Ωτορινολαρυγγολογία Ειδικότητα Χειρουργικής, Χειρουργική Κλινική7 ο ΙΚΑ, Αθήνα, (02/ /2002, 12 μήνες) Ειδικευόμενος ΩΡΛ-Μεγάλη Βρετανία, Department of Otorhinolaryngology, Leeds General Infirmary, NHS, Leeds, Yorkshire, (02/ /2003, 6 μήνες) Ειδικευόμενος ΩΡΛ-Μεγάλη Βρετανία, Dept of Otorhinolaryngology, St Johns Hospital, NHS, Chelmsford, Essex, (08/ /2004, 11 μήνες) Ειδικευόμενος ΩΡΛ- Ελλάδα, Α Πανεπιστημιακή ΩΡΛ Κλινική, Ιπποκράτειο, Αθήνα, (08/ /2007, 2 έτη, 9 μήνες) Εμπειρία-Μετά την ειδικότητα-ευρωπαϊκή Ένωση και Ελλάδα Έμμισθος Επιμελητής (LAS Specialist Registrar), Dept of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, Leighton Hospital, NHS, Crewe, Cheshire (Μεγάλη Βρετανία), (08/ /2007, 1.5 μήνας) Λέκτορας-Επιμελητής (Lecturer-Registrar), Dept of Otorhinolaryngology, Galway University Hospital, Galway, Ιρλανδία, (09/ /2009, 1 έτος 8 μήνες) Επικουρικός Επιμελητής, Α Πανεπιστημιακή ΩΡΛ Κλινική, Ιπποκράτειο, Αθήνα, (06/ /2010 και 08/ /2011, συνολικώς 1 έτος, 10 μήνες) Επιμελητής Β, Α Πανεπιστημιακή ΩΡΛ Κλινική, Ιπποκράτειο, Αθήνα, 06/2011 σήμερα (07/2013, 2 έτη, 1 μήνας) Επιστημονικό έργο-διδακτορική διατριβή Έκφραση πρωτεϊνών θερμικού σοκ και νεαγγειογένεση στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων, Εργαστήριο Ιστολογίας-Εμβρυολογίας. Φεβρουάριος

6 Επιστημονικό έργο-βραβεύσεις-διακρίσεις Δύο Βραβεία καλύτερης προφορικής παρουσίασης σε 2 διεθνή συνέδρια (2000, 2008) Ένα Βραβείο καλύτερης προφορικής παρουσίασης σε ξενόγλωσσο συνέδριο (2009) Δύο άρθρα βραβευμένα ως οι καλύτερες δημισιεύσεις του 2009 από διεθνές περιοδικό (2009) Επιστημονικό έργο-δημοσιεύσεις 18 Πλήρεις Διεθνείς (συνολικό Impact factor: ) 7 Πλήρεις Ελληνικές Επιστημονικό έργο-citations 231 αναφορές στην διεθνή βιβλιογραφία 12 δημοσιεύσεων Επιστημονικό έργο-συγγραφικό έργο 5 κεφάλαια στο Πανεπιστημιακό Σύγγραμμα της ΩΡΛ. 1 κεφάλαιο σε ξενόγλωσσο βιβλίο Συμμετοχή στην μετάφραση 4 συγγραμμάτων Επιστημονικό έργο-ανακοινώσεις 29 Διεθνείς /Ξενόγλωσσες, 9 δημοσιευμένες σε supplements περιοδικών 13 ελληνικές Επιστημονικό έργο-άλλα Συμμετοχή στην έκδοση περιοδικών, 1 Οργάνωση συνεδρίων-προεδρίες, 1 Εκπαιδευτικό Έργο Εκπαιδευόμενος Διάγνωση και αντιμετώπιση Δερματικών βλαβών Κεφαλής Τραχήλου, Dept of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, Leighton Hospital, NHS, Crewe, Cheshire (Μεγάλη Βρετανία), (08/ /2007) Διάγνωση και αντιμετώπιση Αλλεργίας και Αλλεργικής Ρινίτιδας, Dept of Otorhinolaryngology, Galway University Hospital, Galway, Ιρλανδία, (09/ /2009) Συμμετοχή σε Μετεκπαιδευτικά Σεμινάρια-Μαθήματα: 10 ελληνικά -4 διεθνή/ξενόγλωσσα Συμμετοχή σε Συνέδρια-Ημερίδες: 14 ελληνικά -15 διεθνή/ξενόγλωσσα Εκπαιδευτικό Έργο Εκπαιδευτής-Προπτυχιακή Εκπαίδευση Συμμετοχή στην οργάνωση του προγράμματος εκπαίδευσης-εξέτασης φοιτητών, Ιρλανδία, 2 ακαδημαϊκά έτη ( ) 6

7 Συμμετοχή στην εκπαίδευση φοιτητών ιατρικής και Erasmus, Ιρλανδία, 2 ακαδημαϊκά έτη ( ) Συμμετοχή στην εκπαίδευση φοιτητών Λογοθεραπείας Ιρλανδία, 1 ακαδημαϊκό έτος ( ) Συμμετοχή στην εκπαίδευση φοιτητών (ιατρικής, οδοντιατρικής, κατ επιλογήν μάθημα), 4 ακαδημαϊκά έτη ( ) Εκπαιδευτικό Έργο - Εκπαιδευτής Μεταπτυχιακή Εκπαιδευση Υπεύθυνος για τα κοινά μαθήματα ΩΡΛ-Ακτινολογίας, Ιρλανδία, 2 ακαδημαϊκά έτη ( ) Υπεύθυνος ενδοκλινικών μαθημάτων ειδικευόμενων, Ιπποκρατείου, 4 ακαδημαϊκά έτη ( ) Ομιλητής Μετεκπαιδευτικών μαθημάτων, 4 Εκπαιδευτής σε Hands-on Courses, 2 ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΕΙΣ ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΜΕ ΤΗΝ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 1. An Immunohistochemical Study of Regulators of Angiogenesis in Benign and Malignant Salivaty Gland Tumours. Papanikolaou V, Nikitakis N, Tiniakos D, Keogh IJ, Ioffe OB, Sauk JJ. Sylvester O Halloran Surgical/Scientific Meeting. Limerick, Ireland 6-7 March Δημοσίευση σε Supplement Irish Journal Medical Science (Vol 178, Sup 2). 2. An Immunohistochemical Study of Regulators of Angiogenesis in Benign and Malignant Salivaty Gland Tumours. Papanikolaou V, Nikitakis N, Tiniakos D, Keogh IJ, Ioffe OB, Sauk JJ. 49 th Annual Meeting of the Irish Otorhinolaryngologic Society, Enniskillen, October Immunohistochemical expression of angiogenesis-related markers in salivary gland neoplasms. VS Papanikolaou, NG Nikitakis, D Tiniakos, D Anteriotis, M Arnaouti, N Apostolikas, H Siavash, OB Ioffe, and JJ Sauk. Annual Meeting, American Academy of Oral and Maxillofacial Pathology, Banff, Canada, Μαϊου,

8 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μελέτη αποτέλεσε από την αρχή ένα δύσκολο εγχείρημα και η ολοκλήρωσή της ένα σημαντικό στοίχημα για όλους μας. Το μεγάλο μέγεθος του πειράματος, οι ατελείωτες ώρες στο πειραματικό εργαστήριο, τα καθημερινά προβλήματα σε όλες τις φάσεις της μελέτης και ο συντονισμός των πολλών ατόμων που συνεργάστηκαν στα διάφορα στάδια ήταν μερικά μόνο από τα προβλήματα που αντιμετωπίσαμε με υπομονή και σκληρή δουλειά. Η παρούσα διδακτορική διατριβή δεν θα είχε ολοκληρωθεί αν η τριμελής επιτροπή δεν την είχε στηρίξει σε τέτοιο βαθμό. Τα μέλη της αξίζουν κάτι παραπάνω από ένα απλό ευχαριστώ. Ιδιαίτερα, η Αν. Καθηγήτρια κ. Τηνιακού ήταν πάντα υπομονετική και πρόθυμη να βοηθήσει, την ευχαριστώ ιδιαιτέρως. Ο Καθηγητής κ. Κίττας ήταν πάντα παρών όταν ζητούσαμε τη βοήθεια και τη γνώμη του δίνοντας άμεσες λύσεις στα δύσκολα προβλήματα. Η Αν. Καθηγήτρια κυρία Αναγνωστοπούλου ήταν πάντα έτοιμη να βοηθήσει και να συνδράμει έμπρακτα. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον καθηγητή κ. Νικητάκη για την συμπαράστασή του και την αρωγή του σε κάθε βήμα. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω τον κ. Ραπίδη για τη βοήθειά του σε αυτό το έργο. Επίσης, ιδιαίτερες ευχαριστίες απευθύνω στον κ. Τσιάμπα, στον κ. Κικίδη για τη συμμετοχή τους και στον Καθηγητή κ. Γιωτάκη για την συμπαράσταση τιυ. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους αυτούς που βοήθησαν σε κάθε στάδιο της διδακτορικής διατριβής επειδή πίστεψαν σε αυτή τη μελέτη και σε εμάς που την είχαμε αναλάβει. Δεν θα είχα τελειώσει τη διδακτορική μου διατριβή αν δεν είχα ως πηγή έμπνευσής μου την οικογένειά μου, τους γονείς μου και τη σύζυγο μου 8

9 Αφιερωμένο Στους γονείς μου, για το ζην αλλά και για το ευ ζην Στη γυναίκα μου, για την συμπαράσταση της σε κάθε μου βήμα 9

10 Η έγκριση διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα (Νόμος 5543/1932, άρθρο 202, παράγραφος 2) 10

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 11

12 ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ (Σελ. 2) ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟΣ ΟΡΚΟΣ (Σελ. 3) ΣΥΝΟΠΤΙΚΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΕΙΣ ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ (Σελ. 5) ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ (Σελ. 7) ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ (Σελ. 11) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ (Σελ. 16) 1. ΣΙΕΛΟΓΟΝΟΙ ΑΔΕΝΕΣ (Σελ. 17) 1.1. Εισαγωγή (Σελ. 17) 1.2. Εμβρυολογική Ανάπτυξη (Σελ. 18) 1.3. Ιστολογική δομή (Σελ. 18) 2. ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ ΣΙΕΛΟΓΟΝΩΝ ΑΔΕΝΩΝ: ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ (Σελ. 23) 2.1. Επιδημιολογικά χαρακτηριστικά (Σελ. 23) 2.2. Παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων (Σελ. 24) 3. ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΣΙΕΛΟΓΟΝΩΝ ΑΔΕΝΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟΝ ΠΑΓΚΟΣΜΙΟ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟ ΥΓΕΙΑΣ (Σελ. 26) 3.1. Εισαγωγή (Σελ. 26) 3.2. Σύντομη παρουσίαση των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικών των συχνότερων επιθηλιακών νεοπλασμάτων των σιαλογόνων αδένων (Σελ. 28) Καλοήθη νεοπλάσματα επιθηλιακής αρχής (Σελ. 28) Πλειόμορφο αδένωμα (Σελ. 28) Όγκος Warthin (Σελ. 30) 12

13 Κακοήθη επιθηλιακά νεοπλάσματα (Σελ. 32) Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα (Σελ. 32) Αδενοκυστικό καρκίνωμα (Σελ. 33) Πολύμορφο αδενοκαρκίνωμα χαμηλού δυναμικού κακοηθείας (Σελ. 35) Διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα μη ειδικού τύπου (Σελ. 36) Καρκίνωμα εκφορητικών πόρων των σιελογόνων αδένων (Σελ. 36) Αδενοκαρκίνωμα μη ειδικού τύπου (Σελ. 37) Μυοεπιθηλιακό καρκίνωμα (Σελ. 38) Καρκίνωμα προερχόμενο από πλειόμορφο αδένωμα (Σελ. 39) Λεμφοεπιθηλιακό καρκίνωμα (Σελ. 40) Σταδιοποίηση με βάση το σύστημα ΤΝΜ (Σελ. 41) Βαθμός Κακοήθειας (Σελ. 45) 4. ΝΕΟΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ (Σελ. 46) 4.1. Εισαγωγή (Σελ. 46) 4.2. Μηχανισμοί δημιουργίας νέων αγγείων (Σελ. 46) Vasculogenesis (Σελ. 46) Αγγειογένεση (Σελ. 47) 4.3. Αγγειογόνοι και αντι-αγγειογόνοι μηχανισμοί κατά την αγγειογένεση (Σελ. 48) Κυριότεροι αγγειογόνοι παράγοντες (Σελ. 49) Κυριότεροι αντι-αγγειογόνοι παράγοντες (Σελ. 51) 4.4. Αγγειογένεση στη νεοπλασία (Σελ. 52) Εισαγωγή (Σελ. 52) 13

14 Νεοπλασματικός Αγγειογενετικός Φαινότυπος (Σελ. 52) Αγγειοβρίθεια νεοπλασμάτων (Σελ. 54) Ο ρόλος της αγγειογένεσης στον καρκίνο της κεφαλής και τραχήλου (Σελ. 56) Ο ρόλος της αγγειογένεσης στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων (Σελ. 58) 5. ΕΙΔΙΚΑ ΜΟΡΙΑ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΑ ΜΕ ΤΗ ΝΕΟΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ (Σελ. 61) 5.1. Αγγειακός Ενδοθηλιακός Αυξητικός Παράγοντας (Σελ. 61) 5.2. Ενδοστατίνη (Σελ. 64) 5.3. Κολλαγόνο 18 (Σελ. 65) 5.4. Πρωτεΐνη Θερμικού Σοκ 47 (Σελ. 66) 5.5.Παράγοντας VIII (Αντιγόνο Σχετιζόμενο με τον Παράγοντα VIII) (Σελ. 67) Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ (Σελ. 69) 6. ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ (Σελ. 70) 7. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ (Σελ. 71) 7.1. Υλικό (Σελ. 71) 7.2. Ανοσοϊστοχημική Τεχνική (Σελ. 72) 7.3. Αξιολόγηση ανοσοϊστοχημικών αποτελεσμάτων (Σελ. 75) 7.4. Στατιστική Ανάλυση (Σελ. 77) 8. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Σελ. 79) 8.1. Δημογραφικά στοιχεία (Σελ. 79) 8.2. Ιστοπαθολογικά στοιχεία (Σελ. 80) 14

15 8.3. Ανοσοϊστοχημικά αποτελέσματα (Σελ. 82) VEGF (Σελ. 82) Endostatin (Σελ. 85) Collagen XVIII (Σελ. 88) HSP47 (Σελ. 91) Factor VIII Related Antigen (Σελ. 94) 8.4. Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων (Σελ. 96) 9. ΣΥΖΗΤΗΣΗ (Σελ. 103) 10. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ (Σελ. 112) 11. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ (Σελ. 113) 12. ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ (Σελ. 114) 13. ΠΕΡΙΛΗΨΗ (Σελ. 116) 14. SUMMARY (Σελ. 118) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (Σελ. 120) 15

16 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 16

17 1. ΣIΕΛΟΓΟΝΟΙ ΑΔΕΝΕΣ 1.1. Εισαγωγή Οι σιελογόνοι αδένες είναι εξωκρινή όργανα, από τα οποία παράγεται η σίελος (Εικόνα 1). Διακρίνονται δε σε δύο κατηγορίες αναλόγως του μεγέθους τους: 1. Τρία ζεύγη μεγάλων (μειζόνων) σιελογόνων αδένων που συνδέονται με το στοματικό βλεννογόνο μέσω εκφορητικών πόρων. Εντοπίζονται σε συμμετρικές θέσεις στην κεφαλή και περιλαμβάνουν το ζεύγος των παρωτίδων, το ζεύγος των υπογναθίων και το ζεύγος των υπογλωσσίων. 1 Γναθοϋοειδής μυς (διατομή) Εικόνα 1. Εντόπιση σιελογόνων αδένων (τροποιημένο από Junqueira 2010) 1 2. Μεγάλο αριθμό μικρών (ελασσόνων) σιελογόνων αδένων οι οποίοι εκκρίνουν κατευθείαν στη στοματική κοιλότητα. Ο αριθμός των ελασσόνων ποικίλλει, παρά ταύτα έχει υπολογιστεί ότι κυμαίνεται μεταξύ 500 και Εντοπίζονται σε όλη τη στοματική κοιλότητα, πλην του ερυθρού κρασπέδου των χειλέων, των ούλων, και του προσθίου τμήματος και της μέσης γραμμής της σκληράς υπερώας. Αναλόγως της θέσης τους διακρίνονται σε i) χειλικούς, ii) παρειακούς, iii) υπερώιους, iv) γλωσσοϋπερώιους, v) οπισθογόμφιους, vi) ελάσσονες υπογλώσσιους και vii) γλωσσικούς. 17

18 1.2. Εμβρυολογική ανάπτυξη Η διάπλαση των σιελογόνων αδένων ξεκινά κατά το διάστημα της 5 ης - 6 ης εμβρυϊκής εβδομάδας, από τα κύτταρα του έξω βλαστικού δέρματος το οποίο επενδύει την αρχέγονη στοματική κοιλότητα και, από το οποίο θα σχηματιστούν τόσο οι μείζονες όσο και οι ελάσσονες σιελογόνοι αδένες. Η διαδικασία ξεκινά με το σχηματισμό των παρωτιδών, κατά το τέλος της 6 ης εβδομάδας παρατηρείται η καταβολή του υπογναθίου και κατά την 7 η με 8 η εβδομάδα κύησης παρατηρείται η καταβολή των υπογλωσσίων αδένων. Τέλος, κατά το τέλος 1 ου τριμήνου της κύησης καταβάλλονται οι ελάσσονες σιελογόνοι αδένες 2,3. Η διαδικασία της καταβολής των σιελογόνων αδένων ξεκινά με το σχηματισμό καταδύσεων από αναπτυσσόμενο επιθήλιο εντός του υποκείμενου μεσεγχύματος, με επακόλουθη τη δημιουργία δομών, όπως νησιδίων, χορδών και ταινιών. Σταδιακώς, τα καταδυόμενα επιθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται με αποτέλεσμα τον τελικό σχηματισμό αδένων. Παράλληλα, το περιβάλλον μεσέγχυμα διαμορφώνει το συνδετικό ιστό που θα σχηματίσει το στρώμα και την κάψα του σιελογόνου αδένα 2. Η εκκριτική δραστηριότητα ξεκινά κατά την 16 η εβδομάδα Ιστολογική δομή Οι σιελογόνοι αδένες ανεξαρτήτως μεγέθους παρουσιάζουν παρόμοια αρχιτεκτονική δομή, αποτελούμενοι από 1) αδενοκυψέλες, 2) εκφορητικούς πόρους, και 3) στηρικτικό υπόστρωμα 1. Οι αδενοκυψέλες που συγκροτούν το αδενικό παρέγχυμα είναι κυψελοειδείς ή σωληνοειδείς σχηματισμοί που συγκροτούνται από συναθροίσεις εκκριτικών κυττάρων, που παράγουν τη σίελο. Σύνολα αδενοκυψελών σχηματίζουν τα λοβίδια, που με τη σειρά τους συγκροτούν τους λοβούς των σιελογόνων αδένων. Τα εκκριτικά κύτταρα των αδενοκυψελών επικάθονται στη βασική μεμβράνη και σχηματίζουν τον αυλό, όπου και παροχετεύεται η σίελος. Τα κύτταρα που εντοπίζονται στις αδενοκυψέλες μπορεί να είναι εκκριτικά (ορώδη ή βλεννώδη) ή μυεπιθηλιακά. Ανάλογα με τον πληθυσμό των εκκριτικών κυττάρων 18

19 τους οι αδενοκυψέλες διακρίνονται σε βλεννώδεις, ορώδεις ή μικτές (Εικόνα 2), με αποτέλεσμα να ορίζονται ανάλογα και οι αντίστοιχοι σιελογόνοι αδένες (Πίνακας 1). Πίνακας 1. Κατηγοριοποίηση σιελογόνων αδένων αναλόγως της συνθέσεως της σιέλου (1,8) Μείζονες Τύπος Ελάσσονες Τύπος Παρωτίδα Ορώδης Χειλικοί Μικτοί (κυρίως βλεννώδεις) Υπογνάθιος Μικτός (κυρίως ορώδης) Παρειακοί Μικτοί (κυρίως βλεννώδεις) Υπογλώσσιος Μικτός (κυρίως βλεννώδης) Οπισθογόμφιοι Βλεννώδεις Ελλάσσονες Υπογλώσσιοι Υπερώϊοι Μικτοί (κυρίως βλεννώδεις) Βλεννώδεις Γλωσσοϋπερώιοι Γλωσσικοί Βλεννώδεις Μικτοί (κυρίως βλεννώδεις), ορώδεις και βλεννώδεις i. Τα βλεννώδη κύτταρα περιέχουν κοκκία βλέννης. Διακρίνονται δυσχερώς στο οπτικό μικροσκόπιο και με τη χρήση αιματοξυλίνης ηωσίνης το κυτταρόπλασμα τους είναι διαυγές ή κυανό. Παρουσιάζουν θετική αντίδραση βλεννοκαρμίνης (μεταχρωματικά κύτταρα). Το σχήμα και η θέση του πυρήνα εξαρτάται από τη λειτουργική φάση του κυττάρου, γενικώς όμως είναι ευρύς και συνήθως εντοπίζεται κοντά στη βασική μεμβράνη. Τα βλεννώδη κύτταρα παρουσιάζουν αναπτυγμένα τα κυτταρικά οργανίδια που σχετίζονται με τον εκκριτικό τους ρόλο, αναπτυγμένη συσκευή Golgi, αυξημένο αριθμό μιτοχονδρίων και εκτενώς αναπτυγμένο ενδοπλασματικό δίκτυο. ii. Τα ορώδη κύτταρα, είναι μικρότερα από τα βλεννώδη, περιέχουν ζυμογόνα κοκκία και διακρίνονται ευχερώς στο οπτικό μικροσκόπιο με έντονη χρώση του πυρήνα από την αιματοξυλίνη ηωσίνη. Παρουσιάζουν αρνητική αντίδραση της βλεννοκαρμίνης (μημεταγχρωματικά κύτταρα). Ο πυρήνας τους είναι στρογγυλός, 19

20 συνήθως εντοπιζόμενος στο βασικό τμήμα του κυττάρου. Τα ορώδη κύτταρα παρουσιάζουν ανάπτυξη των κυτταρικών οργανιδίων που σχετίζονται με την εκκριτική τους λειτουργία, με εκτενή ανάπτυξη του ενδοπλασματικού δικτύου, της συσκευής Golgi καθώς και πολυάριθμα μιτοχόνδρια 2,4. Τονίζεται ότι η διάκριση σε ορώδη και βλεννώδη κύτταρα δεν είναι απόλυτη, καθώς τα πρώτα εκκρίνουν και βλέννη, με αποτέλεσμα ενίοτε να χαρακτηρίζονται στη βιβλιογραφία και ως οροβλεννώδη κύτταρα iii. Τα μυοεπιθηλιακά κύτταρα είναι επιθηλιογενή μη-αδενικά κύτταρα. Εντοπίζονται μεταξύ των εκκριτικών κυττάρων και της βασικής μεμβράνης. Επίσης, εντοπίζονται και στους εκφορητικούς πόρους, μεταξύ των κυττάρων και της βασικής μεμβράνης. Δεν διακρίνονται στο οπτικό μικροσκόπιο με τις συνήθεις χρώσεις. Το σχήμα τους είναι αστεροειδές καθώς αποτελούνται από το κεντρικό τμήμα και αποφυάδες που περιβάλλουν τις αδενοκυψέλες, σαν καλάθι (basket). Το κυτταρόπλασμά τους περιέχει μυοϊνίδια, με αποτέλεσμα να έχουν συσταλτικές ιδιότητες που συμβάλλουν στην έκκριση και προώθηση της σιέλου από τις αδενοκυψέλες 2,4. Εικόνα 2. Επιθηλιογενή στοιχεία σιελογόνου αδένα (τροποποιημένο από Junqueira 2010) 1 20

21 2. Οι εκφορητικοί πόροι αποτελούν επιμήκεις σχηματισμούς, επιθηλιακής προέλευσης με αποστολή τη μεταφορά και την τελική διαμόρφωση της σιέλου. Οι εκφορητικοί πόροι διακρίνονται ιστολογικά σε i) εμβόλιμους ii) γραμμωτούς και iii) τελικούς (Εικόνα 2). i. Εμβόλιμοι πόροι: συνδέουν τον αυλό των αδενοκυψελών με τον υπόλοιπο εκφορητικό πόρο. Δομούνται από κυβοειδή επιθηλιακά κύτταρα, επί μιας βασικής μεμβράνης. Με χρώσεις ρουτίνας διακρίνονται δυσχερώς στο οπτικό μικροσκόπιο, ο πυρήνας τους είναι κεντρικός και το κυτταρόπλασμα είναι οξύφιλο. Στους εμβόλιμους πόρους παρατηρούνται επίσης και μυοεπιθηλιακά κύτταρα 2,4. ii. iii. Γραμμωτοί πόροι: συνέχονται με τους εμβόλιμους πόρους και δομούνται από κυλινδρικά κύτταρα. Διακρίνονται ευχερώς με τις χρώσεις ρουτίνας και το κυτταρόπλασμά τους είναι ηωσινόφιλο και ο πυρήνας τους είναι κεντρικός. Χαρακτηριστικό των κυττάρων αυτών είναι η παρουσία γραμμώσεων στο βασικό τμήμα τους, οι οποίες σχηματίζονται από ανάλογη διάταξη των μιτοχονδρίων των κυττάρων αυτών. Η δομή τους αυτή φαίνεται να σχετίζεται με την λειτουργία των κυττάρων αυτών, που είναι η μετατροπή της σιέλου από ισότονο σε υπότονο διάλυμα 2,4. Τελικοί εκφορητικοί πόροι: συνέχονται με τους γραμμωτούς έως την εκβολή στην στοματική κοιλότητα. Εντοπίζονται εντός του συνδετικού ιστου μεταξύ των λοβιδίων. Αρχικώς, δομούνται από ψευδοπολύστοιβο κυλινδρικό επιθήλιο το οποίο σταδιακά αντικαθίσταται από πολύστιβο πλακώδες, εν συνεχεία με τον στοματικό βλεννογόνο 2,4. Οι εκφορητικοί πόροι μπορούν επίσης να διακριθούν με βάση τη θέση τους σε: i) ενδολοβίδιους, ii) ενδολόβιους, iii) μεσολόβιους, και iv) τελικούς. Στους εκφορητικούς πόρους παρατηρούνται επίσης τα ογκοκύτταρα, τα οποία είναι μεγάλα κύτταρα με ηωσινόφιλο κυτταρόπλασμα, πολλά μιτοχόνδρια και στρογγυλό κεντρικό πυρήνα. Η λειτουργία τους είναι άγνωστη και πιστεύεται ότι πρόκειται για εκφυλισμένα κύτταρα 3. 21

22 3. Το στρώμα, αποτελείται από συνδετικό ιστό εντός του οποίου περιέχονται οι αδενοκυψέλες, οι εκφορητικοί πόροι, τα αγγεία και τα νεύρα του αδένα. Τέλος, από το στηρικτικό υπόστρωμα σχηματίζεται η κάψα των μειζόνων σιελογόνων αδένων και τα διαφραγμάτια που τους διαχωρίζουν. Στο στρώμα επίσης παρατηρούνται ινοβλάστες, ινοκύτταρα, και λεμφοκύτταρα και δικτυωτά κύτταρα 2,4. 22

23 2. ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ ΣΙΕΛΟΓΟΝΩΝ ΑΔΕΝΩΝ: ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ 2.1. Επιδημιολογικά χαρακτηριστικά Παρά το μεγάλο αριθμό μελετών σχετικά με τους όγκους των σιελογόνων αδένων, υπάρχουν κενά γνώσης σχετικά με την επιδημιολογία τους. Οι ελλείψεις αυτές αποδίδονται στα εξής αίτια: i) στην απουσία επαρκών δεδομένων σχετικά με την παθολογική ανατομική των νεοπλασιών των ελασσόνων αδένων, ii) σημαντικός αριθμός εργασιών είναι ξεπερασμένος επιστημονικά, iii) πολλές εργασίες έχουν μικρό αριθμό περιστατικών και iv) μερικοί ιστολογικοί τύποι δεν περιλαμβάνονται 5 7. Γενικώς, τα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων συνιστούν λιγότερο από το 3% όλων των νεοπλασιών, με αποτέλεσμα να είναι σχετικώς σπάνια. Η καταγεγραμμένη επίπτωσή τους παρουσιάζει σημαντικές ελλείψεις και ποικίλλει σημαντικά από 0.4 έως ,8, ανά κατοίκους παγκοσμίως. Σε μια πρόσφατη μελέτη οι Bradley και συνεργάτες υπολόγισαν την ετήσια επίπτωση των καλοήθων όγκων σε και των κακοήθων σε 8-14 ανά κατοίκους 9. Οι όγκοι των σιελογόνων αδένων συνήθως απαντώνται συχνότερα στις γυναίκες. Ο μέσος όρος ηλικίας εμφάνισης είναι η 4 η δεκαετία ζωής 5. Η συχνότερη θέση εμφάνισης των όγκων των σιελογόνων αδένων είναι οι μείζονες αδένες. Η παρωτίδα εμφανίζει το υψηλότερο ποσοστό εντόπισης (64-80%) με το ποσοστό κακοήθειας να κυμαίνεται από 15-32%. Μεταξύ των μειζόνων σιελογόνων αδένων δεύτερος σε συχνότητα εμφάνισης νεοπλασίας είναι ο υπογνάθιος (8-11%) και ακολουθεί ο υπογλώσσιος (0,3-1%), με ποσοστά κακοήθειας 37-45% και 70-90% αντίστοιχα. Οι όγκοι των ελασσόνων σιελογόνων αδένων αντιπροσωπεύουν το 9-23% του συνόλου των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων, με τους μισούς (49%) περίπου να είναι κακοήθεις. Η συχνότερη θέση εντόπισης είναι τα όρια σκληρής και μαλθακής υπερώας (42-54%) και ακολουθούν τα χείλη και ο βλεννογόνος της παρειάς (21-25% και 11-15% αντίστοιχα) 2,10 15 (Εικόνα 3). 23

24 Εικόνα 3. Η συχνότητα εμφάνισης των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων (τροποποιημένο από Junqueira 2010) 1 Ο συχνότερος τύπος νεοπλάσματος των σιελογόνων αδένων είναι το πλειόμορφο αδένωμα (περίπου 50% των περιπτώσεων), ενώ μεταξύ των καλοήθων όγκων δεύτερος σε συχνότητα είναι ο όγκος του Warthin. Ο συχνότερος κακοήθης όγκος, βάσει των περισσότερων μελετών, είναι το βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα 2, Παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων Παρά το γεγονός ότι ορισμένοι παράγοντες κινδύνου έχουν συσχετισθεί με την εμφάνιση όγκων των σιελογόνων αδένων (Πίνακας 2), η μελέτη της αιτιοπαθογένειας των όγκων αυτών παρουσιάζει σημαντικά κενά 2. Το κάπνισμα δεν συνδέεται με την εμφάνιση κακοήθειας, όμως υπάρχει ισχυρή συσχέτιση με την εμφάνιση του όγκου του Warthin Υπάρχει πλήθος δεδομένων για τη συμμετοχή της ιονίζουσας ακτινοβολίας στην εμφάνιση νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων Οι επιδημιολογικές μελέτες σε επιζώντες από τους πυρηνικούς βομβαρδισμούς στην Ιαπωνία μετά το 2 ο Παγκόσμιο Πόλεμο έδειξαν 2.6 υψηλότερη επίπτωση νεοπλασμάτων των σιελογόνων 24

25 Πίανκας 2. Παράγοντες κινδύνου που έχουν μελετηθεί σε σχέση με την αιτιολογία των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων Παράγοντες κινδύνου Καπνός Ιονίζουσα ακτινοβολία Έκθεση σε ιούς Επαγγελματική έκθεση σε βαρέα μέταλλα και άλλες χημικές ουσίες Γενετική προδιάθεση αδένων και 10 φορές υψηλότερη επίπτωση κακοήθειας των σιελογόνων αδένων συγκριτικά με το μη-ακτινοβολημένο πληθυσμό 24,25. Επίσης, η χρήση ραδιενεργού ιωδίου (I 131 ) ενέχει τον κίνδυνο εμφάνισης νεοπλασίας λόγω του γεγονότος ότι συγκεντρώνεται στους σιελογόνους αδένες 5,26. Τα ευρήματα για την καρκινογόνο δράση των ιών συσχετίζουν τον ιό Epstein-Barr με τα σπάνια λεμφοεπιθηλιακά καρκινώματα, χωρίς άλλη γενικότερη συσχέτιση 27,28. Επίσης, δεν υπάρχουν δεδομένα για την συμμετοχή των ιών τύπου Human Papilloma Virus (HPV) στην εμφάνιση των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων 2,5,27. Σύμφωνα με επιδημιολογικά στοιχεία εργαζόμενοι σε διάφορα επαγγέλματα παρουσιάζουν αυξημένη συχνότητα εμφάνισης νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Η αύξηση αυτή παρατηρήθηκε στους εργαζόμενους στη βιομηχανία ελαστικών 29,30, σε διάφορους χώρους με έκθεση σε μόλυβδο ή νικέλιο 29,31, σε εργαζόμενους στη βιομηχανία αυτοκινήτων 32 καθώς και στους εργαζόμενους σε κομμωτήρια 33. Επίσης, σε κατοίκους περιοχών πέριξ ορυχείων αμιάντου 34. Επιδημιολογικές μελέτες δεν καταδεικνύουν οικογενή εμφάνιση, με αποτέλεσμα να μην υπάρχουν στοιχεία συνηγορητικά υπέρ της γενετικής προδιάθεσης για την εμφάνιση νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Έχει όμως παρατηρηθεί κάποια συσχέτιση με το σύνδρομο Brooke-Spiegler

26 3. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΣΙΕΛΟΓΟΝΩΝ ΑΔΕΝΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟΝ ΠΑΓΚΟΣΜΙΟ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟ ΥΓΕΙΑΣ 3.1. Εισαγωγή Συχνά η προσπάθεια να τεθεί η ιστολογική διάγνωση ενός όγκου των σιελογόνων αδένων, μπορεί να είναι ιδιαιτέρως δυσχερής. Οι δυσκολίες αυτές οφείλονται σε ορισμένες ιδιαιτερότητες των όγκων αυτών, όπως την ύπαρξη ιστολογικών διαφορών μεταξύ νεοπλασμάτων ιδίου τύπου ή ακόμα και μέσα στο ίδιο το νεόπλασμα (ετερογένεια), την ύπαρξη πολλών τύπων και υποτύπων, την ύπαρξη κοινών ιστολογικών χαρακτηριστικών σε διαφορετικούς τύπους, την πιθανότητα κακοήθους εξαλλαγής σε ένα καλόηθες νεόπλασμα και τη σπανιότητα και συνακόλουθη έλλειψη εξοικείωσης με αυτούς τους όγκους 5,36. Προς αντιμετώπιση όλων αυτών των δυσκολιών έχουν κατά καιρούς προταθεί διάφορα συστήματα για την ταξινόμηση των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Η ευρύτερα αποδεκτή ιστολογική ταξινόμηση των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων είναι αυτή που προτάθηκε από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (World Health Organization WHO, 2005) 5,37, όπου περιγράφονται πάνω από 40 καλοήθη και κακοήθη νεοπλάσματα και παρουσιάζεται στον Πίνακα 3 (1). Το σύστημα κατά WHO, παρά την πολυπλοκότητα του, έχει προγνωστική και θεραπευτική αξία, καθώς κάθε τύπος όγκου μελετάται ξεχωριστά 2,5,38. Πίνακας 3. : Όγκοι των σιελογόνων αδένων κατά WHO 5,37 Ιστολογική ταξινόμηση νεοπλασμάτων σιελογόνων αδένων Καλοήθη νεοπλάσματα επιθηλιακής αρχής Πλειόμορφο αδένωμα Μυοεπιθηλίωμα Αδένωμα από βασικά κύτταρα Όγκος Warthin Ογκοκύττωμα Σωληνώδες αδένωμα Αδένωμα σμηγματογόνων αδένων 26

27 Λεμφαδένωμα - Σμηγματογόνo - Μη σμηγματογόνο Θηλώματα πόρων -Ανάστροφο θήλωμα πόρων -Ενδοπορικό θήλωμα Θηλώδους μορφολογίας σιαλαδένωμα Κυσταδένωμα Κακοήθη επιθηλιακά νεοπλάσματα Καρκίνωμα από κύτταρα αδενοκυψελών Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα Αδενοκυστικό καρκίνωμα Πολύμορφο αδενοκαρκίνωμα χαμηλού δυναμικού κακοηθείας Επιθηλιακό-μυοεπιθηλιακό καρκίνωμα Διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα, μη ειδικού τύπου Αδενοκαρκίνωμα από βασικά κύτταρα Καρκίνωμα σμηγματογόνων αδένων Λεμφαδενοκαρκίνωμα σμηγματογόνων αδένων Κυσταδενοκαρκίνωμα Χαμηλού βαθμού κακοηθείας κυσταδενοκαρκίνωμα Βλεννώδες αδενοκαρκίνωμα Ογκοκυτταρικό καρκίνωμα Καρκίνωμα εκφορητικών πόρων των σιελογόνων αδένων Αδενοκαρκίνωμα μη ειδικού τύπου Μυοεπιθηλιακό καρκίνωμα Καρκίνωμα προερχόμενο από πλειόμορφο αδένωμα Καρκινοσάρκωμα Μεταστατικό πλειόμορφο αδένωμα 27

28 Καρκίνωμα πλακώδους επιθηλίου Μικροκυτταρικό καρκίνωμα Καρκίνωμα από μεγάλα κύτταρα Λεμφοεπιθηλιακό καρκίνωμα Σιαλοβλάστωμα Νεοπλάσματα μαλακών μορίων Αιμαγγείωμα Νεοπλάσματα λεμφικού/αιμοποιητικού ιστού Hodgkin λέμφωμα Διάχυτο λέμφωμα από μεγάλα Β-λεμφοκύτταρα Εξωλεμφαδενικό λέμφωμα οριακής ζώνης από Β-λεμφοκύτταρα Μεταστατικοί όγκοι 3.2. Σύντομη παρουσίαση των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικών των συχνότερων επιθηλιακών νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Σύμφωνα με την ισχύουσα ταξινόμηση του WHO (2005) τα νεοπλάσματα διακρίνονται σε πρωτοπαθή και δευτεροπαθή 5,37. Οι πρωτοπαθείς όγκοι διακρίνονται περαιτέρω σε καλοήθεις και κακόηθεις όγκους. Εν συνεχεία, παρουσιάζονται τα κύρια κλινικο-παθολογοανατομικά στοιχεία των τύπων των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων, που συγκροτούν το υλικό της μελέτης Καλοήθη νεοπλάσματα επιθηλιακής αρχής Πλειόμορφο αδένωμα (Pleomorphic Adenoma) Πρόκειται για καλόηθες νεόπλασμα με κάψα ποικίλου πάχους και χαρακτηριστική αρχιτεκτονική. Παρουσιάζει επιθηλιακά και μυοεπιθηλιακά στοιχεία σε ένα ετερογενές υπόστρωμα ινώδους, υαλινοποιημένου, βλεννώδους, μυξωματώδους, χονδρικό και/ή οστίτη ιστού. 28

29 Αποτελεί το 60% των όγκων των σιελογόνων αδένων και όπως προαναφέρθηκε είναι ο συχνότερα απαντώμενος ιστολογικός τύπος 15. Η αναφερόμενη ετήσια επίπτωση είναι περιπτώσεις ανά κατοίκους 6,39. Εντοπίζεται συνήθως στη παρωτίδα, στον υπογνάθιο και στους ελάσσονες σιελογόνους αδένες (80%, 10%, και 10% των πλειομόρφων αδενωμάτων αντιστοίχως). Στη παρωτίδα, συνήθως εντοπίζεται στον κάτω πόλο, αλλά μπορεί και να εμφανιστεί ακόμα και στον εν τω βάθει λοβό αυτής 13. Το ηλικιακό εύρος των ασθενών κυμαίνεται από την 1 η έως τη 10 η δεκαετία της ζωής με μέσο όρο την 4 η δεκαετία. Η συχνότητά τους παρουσιάζει μια σχετική αύξηση στο γυναικείο φύλο 13,40. Κλινικά, εμφανίζεται συνήθως ως μια ανώδυνη, βραδέως αναπτυσσόμενη ομαλή ευκίνητη και συμπαγής μάζα, διαμέτρου 2-5 cm συνήθως. Έχουν παρατηρηθεί και μεγαλύτεροι όγκοι, οι οποίοι συνήθως έχουν μικροϋβώδη επιφάνεια. Σε περιπτώσεις υποτροπής δεν είναι σπάνιο να παρατηρηθεί καθήλωση της μάζας. Εμφάνιση άλγους ή διαταραχή της λειτουργίας του προσωπικού νεύρου παρατηρούνται σπανίως. Έχουν παρατηρηθεί περιπτώσεις σύγχρονης ή και μετάχρονης εμφάνισης άλλων όγκων, ιδίως όγκων του Warthin 41. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από μεγάλη ποικιλομορφία. Τα κύρια στοιχεία είναι η ινώδης κάψα, οι συναθροίσεις επιθηλιακών και μυοεπιθηλιακών κυττάρων και το στρώμα 5. Η κάψα δομείται από πυκνό ινώδη συνδετικό ιστό, ποικίλλει σε πάχος και μπορεί να είναι ατελής, ενίοτε απούσα σε ορισμένα σημεία και σε κάποιες περιπτώσεις διηθημένη 42. Τα νεοπλασματικά επιθηλιακά και μυοεπιθηλιακά κύτταρα παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία, με κυβοειδές, κυλινδρικό, επιθηλιοειδές και ατρακτοκυτταρικό σχήμα 43. Επίσης, μπορεί να παρατηρηθούν διαυγή, βλεννώδη, ορώδη ή σμηγματογόνα εκκριτικά κύτταρα. Η ατυπία και η μιτωτική δραστηριότητα είναι περιορισμένες 8. Τα επιθηλιακά στοιχεία συγκροτούν συναθροίσεις ή δομές δίκην εκφορητικών πόρων που περιέχουν άμορφο ηωσινόφιλο υλικό 43. Επίσης, συχνά παρατηρείται πλακώδης μεταπλασία με σφαιρίδια κερατίνης ή εναπόθεση κρυστάλλων εντός των πόρων 44. Το στρώμα μπορεί να αποτελείται από ινώδη, λιπώδη, μυξωματώδη, χονδρόμορφο, οστίτη ή υαλινοποιημένο ιστό 2. Παρατηρείται μεγάλη διαφοροποίηση στην αναλογία 29

30 κυτταρικών στοιχείων και στρώματος, τόσο μεταξύ περιπτώσεων όσο και μεταξύ περιοχών του ιδίου όγκου 5. Η πρόγνωση του πλειόμορφου αδενώματος είναι αρίστη και το ποσοστό ίασης σε περίπτωση ολικής χειρουργικής αφαίρεσης ξεπερνά το 95% σε ορισμένες σειρές. Η θεραπευτική αντιμετώπιση του πλειόμορφου αδενώματος της παρωτίδας είναι η επιπολής ή η ολική παρωτιδεκτομή αναλόγως της εντοπίσεως. Η εκπυρήνιση του όγκου συνοδεύεται από υψηλά ποσοστά υποτροπής και συνιστάται η αποφυγή της 8. Η χειρουργική αντιμετώπιση περιπλέκεται από τη γειτνίαση του προσωπικού νεύρου, την τάση του όγκου να υποτροπιάζει και την πιθανότητα κακοήθους εξαλλαγής. Η εξαλλαγή σε καρκίνωμα προερχόμενο από πλειόμορφο αδένωμα παρατηρείται στο 5% των περιπτώσεων, ειδικά σε μακρόχρονη πορεία και/ή συχνές υποτροπές 45, Όγκος Warthin (Warthin Tumor) Πρόκειται για καλοήθη όγκο που αποτελείται από αδενικές ή κυστικές δομές, ενίοτε με θηλώδη εμφάνιση, που επενδύονται από δύο στοίχους επιθηλίου. Αποτελεί το δεύτερο σε συχνότητα καλοήθη όγκο των σιελογόνων αδένων στις περισσότερες χώρες 2. Το ηλικιακό εύρος των ασθενών κυμαίνεται από 12 έως 92 ετών με μέσο όρο διάγνωσης 62 ετών. Η συχνότητα του παρουσιάζει σταθερή αύξηση στο γυναικείο πληθυσμό, ξεκινώντας από αναλογία ανδρών προς γυναίκες 10:1 το 1953 και φτάνοντας 1.2:1 το ,47. Υπάρχει ισχυρή συσχέτιση καπνίσματος και εμφάνισης του όγκου Warthin 48,49. Μάλιστα η σταθερή αύξηση στη συχνότητα του όγκου Warthin που παρατηρείται τα τελευταία 50 χρόνια, αποδίδεται στην αντίστοιχη αύξηση του καπνίσματος στον γυναικείο πληθυσμό που παρατηρήθηκε στο δεύτερο ήμισυ του 20 ου αιώνα, χωρίς όμως να έχει διευκρινισθεί ο ακριβής μηχανισμός 50,51. Η έκθεση στην ιονίζουσα ακτινοβολία επίσης σχετίζεται με την αύξηση της εμφάνισης του όγκου όπως φαίνεται από την αυξημένη συχνότητά του σε επιβιώσαντες από τους πυρηνικούς βομβαρδισμούς 52. Ενίοτε, μπορεί να παρατηρηθούν και άλλες νεοπλασίες σε συνδυασμό με τον όγκο Warthin, τόσο στους σιελογόνους αδένες (συνήθως πλειόμορφα αδενώματα) όσο και σε άλλα όργανα Κατά μία θεωρεία αυτή η πολυεστιακή εμφάνιση αποδίδεται στην ογκογενετική δράση του καπνίσματος

31 Κλινικά, εμφανίζεται ως ανώδυνη μάζα διαμέτρου 2-4 cm, αν και αναφέρονται περιπτώσεις όγκων σημαντικά μεγαλύτερων. Η μέση διάρκεια συμπτωμάτων είναι περίπου 20 μήνες, αν και σε πολλούς ασθενείς μπορεί να είναι πολύ μικρότερη 57. Σημαντικό ποσοστό ασθενών αναφέρουν μεταβολές μεγέθους, ιδίως κατά την σίτιση 58. Σε ποσοστό περίπου 9% αναφέρονται διαταραχές της λειτουργίας του προσωπικού νεύρου 59. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από επιθηλιακά κύτταρα με λεπτόκοκκο, ηωσινόφιλο κυτταρόπλασμα και από άφθονα λεμφοκύτταρα και δικτυωτά κύτταρα στο στρώμα. Μικροσκοπικά, παρατηρούνται κυστικοί σχηματισμοί που επενδύονται από δύο στοίχους επιθηλιακών κυττάρων. Η εσωτερική στιβάδα αποτελείται από κύτταρα που ομοιάζουν με οξύφιλα ογκοκύτταρα, υψηλά κυλινδρικά κύτταρα με τον πυρήνα τοποθετημένο προς τον αυλό. Η εξωτερική στιβάδα αποτελείται από μικρότερα, αποπλατυσμένα ή κυβοειδή κύτταρα με πυκνωτικούς πυρήνες. Η ατυπία και η μιτωτική δραστηριότητα είναι περιορισμένες 57. Το στρώμα διηθείται από λεμφοειδή κύτταρα. Η ένταση της διήθησης ποικίλει από πολύ πυκνή έως αραιή ή και σχεδόν απούσα. Συχνό εύρημα είναι τα λεμφοζίδια με εμφανή βλαστικά κέντρα. Οι κυστικοί χώροι περιέχουν ηωσινόφιλο υλικό με κρυσταλλοειδείς σχηματισμούς 57. Η πρόγνωση του όγκου του Warthin είναι αρίστη. Η θεραπευτική αντιμετώπιση του είναι η επιπολής παρωτιδεκτομή ή η εκπυρήνιση του όγκου, με χαμηλά ποσοστά υποτροπής (2.5-5%) 2,57. Κακοήθης εξαλλαγή είναι σπάνια και θεωρείται ότι σχετίζεται με προηγηθείσα έκθεση σε ακτινοβολία 52,60,61. 31

32 Κακοήθη επιθηλιακά νεοπλάσματα Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα (Mucoepidermoid Carcinoma) Πρόκειται για κακόηθες νεόπλασμα που χαρακτηρίζεται από βλεννώδη, ενδιάμεσα και επιδερμοειδή κύτταρα, με κυλινδρικούς, διαυγοκυτταρικούς και ογκοκυτταρικούς χαρακτήρες. Αποτελεί το συχνότερο πρωτοπαθές κακόηθες νεόπλασμα των σιελογόνων αδένων 62,63. Η συχνότερη θέση εμφάνισης του είναι η παρωτίδα (45%) και ακολουθούν ο υπογνάθιος και ο υπογλώσσιος (7% και 1% αντίστοιχα). Ενδοστοματικά εντοπίζεται συνήθως στην υπερώα ή στον παρειακό βλεννογόνο 5. Το ηλικιακό εύρος των ασθενών καλύπτει όλες τις ηλικίες και σε αντίθεση με άλλα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων εμφανίζεται ακόμα και στην παιδική ηλικία 64,65. Ο μέσος όρος εμφάνισης είναι η 4 η δεκαετία της ζωής. Παρατηρείται μία προτίμηση εμφάνισης στο γυναικείο φύλο, με αναλογία 3:2 γυναίκες προς άνδρες 2. Κλινικά εμφανίζεται ως μια συμπαγής, στερεά προσφυώμενη, ανώδυνη μάζα. Εντόπιση του όγκου στον υπογλώσσιο αδένα συνήθως συνοδεύεται από άλγος. Επί εντόπισης σε ελάσσονες αδένες η κλινική εικόνα μπορεί να μην είναι ανησυχητική. Εάν εξελιχθεί η νόσος, τότε μπορεί να παρατηρηθούν ανησυχητικά συμπτώματα, όπως πόνος, διαταραχή του προσωπικού νεύρου, τρισμός, αιμορραγία και συμπτώματα οστικής διήθησης 40. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από την παρουσία επιδερμοειδών, ενδιάμεσων και βλεννωδών κυττάρων, με ποικίλη αναλογία και αρχιτεκτονική διάταξη. Η αρχιτεκτονική είναι συνήθως του τύπου της πολυκυστικής ανάπτυξης. Οι κυστικοί σχηματισμοί αυτοί επενδύονται από βλεννώδη, εκκριτικά και ενδιάμεσα κύτταρα και παρουσιάζουν ποικίλο εύρος διαμετρήματος. Επίσης, παρατηρούνται διαυγή κύτταρα, σμηγματογόνα κύτταρα και ογκοκύτταρα 66,67. Το ινώδες στρώμα μπορεί να παρουσιάζει σκληρυντικές εστίες πέριξ των κυστικών δομών και ποικίλου βαθμού λεμφοκυτταρική διήθηση με πιθανότητα ανάπτυξης βλαστικών κέντρων 68,69. Υπάρχει μεγάλος αριθμός προταθέντων συστημάτων σταδιοποίησης των βλενοεπιδερμοειδών καρκινωμάτων, χωρίς κάποιο να έχει τύχει γενικής αποδοχής 66,70,71. Ένα προταθέν σύστημα σταδιοποίησης με βάση 5 ιστολογικά 32

33 κριτήρια, που παρέχει σταθερά και αναπαράξιμα αποτελέσματα, διακρίνει τους όγκους σε: i) χαμηλής κακοήθειας (υψηλής διαφοροποίησης), ii) ενδιάμεσης κακοήθειας, (μέτριας διαφοροποίησης), και iii) υψηλής κακοήθειας (χαμηλής διαφοροποίησης) 66,72,73 (Πίνακας 4) (44-46). Πίνακας 4. Σύστημα σταδιοποίησης βάσει ιστοπαθολογικών κριτηρίων Ιστοπαθολογικό χαρακτηριστικό Βαθμοί Σταδιοποίηση όγκου Συνολική Βαθμολογία Κυστικό στοιχείο <20% 2 Χαμηλή κακοήθεια 0-4 Νευρική διήθηση 2 Μέτρια κακοήθεια 5-6 Νέκρωση 3 Υψηλή κακοήθεια μιτώσεις/ 10 πεδία υψηλής μεγέθυνσης 3 Αναπλασία 4 Η πρόγνωση του όγκου είναι ικανοποιητική με ασθενείς πρώιμου σταδίου να παρουσιάζουν ίαση σε ποσοστό 90-98%. Καθώς η νόσος εξελίσσεται η πρόγνωση επιβαρύνεται με πενταετή επιβίωση περίπου 60-75% για το στάδιο ΙΙ και 30-54% για το στάδιο III 44. Γενικώς, η θεραπεία συνίσταται σε χειρουργική αντιμετώπιση με συμπληρωματική ακτινοβόληση, εάν απαιτείται Αδενοκυστικό Καρκίνωμα (Adenoid Cystic Carcinoma) Πρόκειται για κακόηθες νεόπλασμα που χαρακτηρίζονται από επιθηλιακά και μυοεπιθηλιακά κύτταρα κατανεμημένα σε σωληνοειδή, ηθμοειδή και συμπαγή διάταξη. Η κλινική πορεία του είναι επιθετική και η πλειονότητα των ασθενών συνήθως καταλήγουν από τη νόσο. Αποτελεί έναν από τους συχνότερους κακοήθεις όγκους των σιελογόνων αδένων, με συχνότερη θέση εντόπισης τους ελάσσονες αδένες (50-60% των αδενοειδών κυστικών καρκινωμάτων) 46. Σύμφωνα με ορισμένους ερευνητές είναι συχνότερο του βλεννοεπιδερμοειδούς καρκινώματος Η υπερώα αποτελεί τη συνηθέστερη ενδοστοματική εντόπιση 5. Το ηλικιακό εύρος των ασθενών καλύπτει ευρύ φάσμα, 33

34 σπανίως όμως παρατηρείται πριν την ηλικία των 20 ετών. Η μεγαλύτερη συχνότητα παρατηρείται στη 6 η δεκαετία της ζωής 5. Παρατηρείται επικράτηση του γυναικείου φύλου, με αναλογία 3:2 γυναίκες προς άνδρες 2. Κλινικά, εμφανίζεται ως μια βραδέως αναπτυσσόμενη μάζα, συχνά επώδυνη, λόγω του νευροτροπισμού του όγκου 5. Η μάζα μπορεί να επικαλύπτεται από φυσιολογικό βλεννογόνο, καθιστώντας δυσχερή τη διάγνωση. Μπορεί επίσης να παρατηρηθεί διαταραχή της λειτουργίας του προσωπικού νεύρου ή οστική διήθηση αναλόγως της εντόπισης και του σταδίου του όγκου 81. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από κύτταρα των πόρων και τροποποιημένα μυοεπιθηλιακά κύτταρα, τα οποία διατάσσονται κατά 3 αρχιτεκτονικά πρότυπα i) ηθμοειδές, ii) σωληνώδες και iii) συμπαγές. Ο ηθμοειδής τύπος είναι ο συχνότερος και χαρακτηρίζεται από νησίδια από κυβοειδή-γωνιώδη μικρά βασικοειδή επιθηλιακά κύτταρα, με έντονα βαθυχρωματικό πυρήνα και ελάχιστο κυτταρόπλασμα. Τα κύτταρα διαμορφώνουν κυστικούς σχηματισμούς που περιέχουν βασεόφιλο ή ηωσινόφιλο υαλινοποιημένο υλικό. Ο σωληνώδης τύπος χαρακτηρίζεται από κυβοειδή και μυοεπιθηλιακά κυττάρα, που επενδύουν σε 1-2 στοιβάδες τους χαρακτηριστικούς σωληνοειδείς ή δοκιδώδεις σχηματισμούς 82,83. Ο συμπαγής υπότυπος αποτελείται από νησίδια ή χορδές νεοπλασματικών κυττάρων. Συχνά, παρατηρείται στο κέντρο των σχηματισμών αύξηση μιτώσεων και εστιακή νέκρωση. Χαρακτηριστικό αλλά όχι παθογνωμονικό - εύρημα είναι η εμφάνιση περινευρικών διηθήσεων 8. Η πρόγνωση είναι κακή λόγω της επιθετικής συμπεριφοράς του όγκου, της αυξημένης συχνότητας υποτροπής και της τάση για εμφάνιση απομακρυσμένων μεταστάσεων. Τονίζεται ότι ενώ η πενταετής επιβίωση είναι αξιόλογη (έως και 70%), η δεκαετής και εικοσαετής επιβίωση μειώνονται σημαντικά (50% και 25% αντιστοίχως) 8. Απομακρυσμένες μεταστάσεις παρατηρούνται σε ποσοστό 25-55% και εντοπίζονται συνήθως στους πνεύμονες, τα οστά και το ήπαρ 84. Γενικά, η θεραπεία συνίσταται σε χειρουργική αντιμετώπιση με συμπληρωματική ακτινοθεραπεία 85. Καθώς οι επιχώριες τραχηλικές μεταστάσεις είναι σχετικώς σπάνιες (5-25%) δεν απαιτείται τραχηλικός λεμφαδενικός καθαρισμός 8. 34

35 Πολύμορφο αδενοκαρκίνωμα χαμηλού δυναμικού κακοήθειας (Polymorphous low-grade adenocarcinoma) Πρόκειται για κακόηθες νεόπλασμα που χαρακτηρίζεται από κυτταρική ομοιομορφία, ποικίλη μορφολογία, διηθητική ανάπτυξη και χαμηλή μεταστατική τάση. Αποτελεί το δεύτερο σε συχνότητα κακόηθες νεόπλασμα των ελασσόνων σιελογόνων αδένων, με ποσοστό που αγγίζει το 26%. Η υπερώα αποτελεί τη συνηθέστερη θέση ενδοστοματικής εντόπισης (60%), ακολουθούν η παρειά, το οπισθογόμφιο τρίγωνο, το άνω χείλος και η βάση της γλώσσας, ενώ σπάνια εντοπίζεται στους μείζονες αδένες 86,87. Το ηλικιακό εύρος των ασθενών εκτείνεται από 16 έως 94 έτη, με μέσο όρο ηλικίας τα 59 έτη. Η αναλογία γυναικών ανδρών είναι 2:1 5. Κλινικά, εμφανίζεται ως μονήρης ασυμπτωματική μάζα στην υπερώα, που μπορεί να προϋπάρχει από εβδομάδες έως δεκαετίες. Μπορεί επίσης να παρατηρηθούν αιμορραγία, τηλαγγειεκτασία, εξέλκωση καθώς και οστική διήθηση ανάλογα με το στάδιο της νόσου 5,8. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από ομοιόμορφα μικρά έως μέτριου μεγέθους κύτταρα, αχνό, ελάχιστα ηωσινόφιλο κυτταρόπλασμα, με ωοειδείς πυρήνες. Επίσης, χαρακτηριστική είναι η ποικιλία κυτταροδομικού προτύπου τόσο μεταξύ περιπτώσεων όσο και μέσα στον ίδιο όγκο. Τα κύρια αρχιτεκτονικά πρότυπα είναι : i) το λοβιδιακό, ii) το θηλώδες-κυστικό, iii) το ηθμοειδές (που ενίοτε ομοιάζει με το αδενοειδές κυστικό καρκίνωμα), και iv) το δοκιδώδες (1). Παρά την αθώα εμφάνιση παρατηρείται πάντα διήθηση των πέριξ μαλακών ιστών. Το στρώμα μπορεί να παρουσιάζει βλεννώδεις ή υαλινοποιημένες περιοχές. Επίσης, χαρακτηριστικός είναι ο έντονος νευροτροπισμός που παρατηρείται. Η πρόγνωση του όγκου είναι καλή με χαμηλό ποσοστό υποτροπών και επιχώριων μεταστάσεων (9-17% και 10% αντίστοιχα) και σπάνιες απομακρυσμένες μεταστάσεις 86,87. Γενικά, η θεραπεία συνίσταται σε χειρουργική αντιμετώπιση. 35

36 Διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα μη ειδικού τύπου (Clear Cell Carcinoma, NOS) Πρόκειται για κακόηθες νεόπλασμα που χαρακτηρίζεται από μονόμορφο κυτταρικό πληθυσμό με διαυγές κυτταρόπλασμα, στις συνήθεις χρώσεις. Διαυγή κύτταρα παρατηρούνται σε πολλούς όγκους των σιελογόνων αδένων, όμως ο τύπος αυτός διακρίνεται από την έλλειψη λοιπών χαρακτηριστικών ευρημάτων και το μονόμορφο κυτταρικό του πληθυσμό Πρόκειται για σπάνιο νεόπλασμα, που εμφανίζεται συνήθως στους ελάσσονες σιελογόνους αδένες. Η υπερώα αποτελεί τη συνηθέστερη θέση ενδοστοματική εντόπιση, ακολουθούν ο παρειακός βλεννογόνος, η γλώσσα, το έδαφος του στόματος, το χείλος, το οπισθογόμφιο τρίγωνο και η αμυγδαλική χώρα Το ηλικιακό εύρος των ασθενών εκτείνεται από 40 έως 70 έτη. Η συχνότητα εμφάνισης του δεν μεταβάλλεται με το φύλο. Κλινικά, εμφανίζεται ως μια ανώδυνη περιγεγραμμένη μάζα στην υπερώα, που μπορεί να υπάρχει από 1 μήνα έως 15 έτη. Ενίοτε παρατηρείται άλγος και εξέλκωση 90. Ιστολογικά, το νεόπλασμα χαρακτηρίζεται από μονόμορφα πολυγωνικά ή στρογγυλά κύτταρα, με διαυγές κυτταρόπλασμα. Ενίοτε παρατηρούνται κύτταρα με ελαφρώς ηωσινόφιλο κυτταρόπλασμα. Τα καρκινικά κύτταρα διατάσσονται σε συμπαγείς αθροίσεις, χορδές ή, ταινίες και δεν παρατηρούνται πόροι. Το στρώμα αποτελείται από χαλαρό ή πυκνό ινώδη ή υαλινοποιημένο συνδετικό ιστό Η πρόγνωση του όγκου είναι καλή με χαμηλό ποσοστό υποτροπών και επιχώριων μεταστάσεων 88,92,93. Γενικά η θεραπεία συνίσταται σε χειρουργική αντιμετώπιση Καρκίνωμα εκφορητικών πόρων των σιελογόνων αδένων (Salivary Duct Carcinoma) Πρόκειται για κακόηθες νεόπλασμα που χαρακτηρίζεται από εικόνα αδενοκαρκινώματος των σιελογόνων αδένων με ιδιαίτερα επιθετική κλινική πορεία. 36

37 Πρόκειται για ασύνηθες, αλλά όχι σπάνιο κακόηθες νεόπλασμα των σιελογόνων αδένων, με ποσοστό 9% επί του συνόλου των κακοηθειών. Η παρωτίδα αποτελεί τη συνηθέστερη θέση εντόπισης, ακολουθούν ο υπογνάθιος και ο υπογλώσσιος αδένας και οι ελάσσονες αδένες Το ηλικιακό εύρος των ασθενών εκτείνεται από την παιδική ηλικία έως 91 ετών, με μεγαλύτερη συχνότητα στην 6 η και 7 η δεκαετία της ζωής. Η συχνότητα εμφάνισης του είναι μεγαλύτερη στο ανδρικό φύλο, με αναλογία 3:2 άνδρες προς γυναίκες Κλινικά, εμφανίζεται ως ταχεία αναπτυσσόμενη μονήρης μάζα, πρόσφατης εμφάνισης. Ενίοτε παρατηρείται μεταβολή του μεγέθους της. Συχνά, παρατηρείται τραχηλική λεμφαδενική διόγκωση, καθώς το 59% των ασθενών προσέρχεται με επιχώριες μεταστάσεις κατά τη διάγνωση. Μπορεί επίσης να παρατηρηθεί άλγος και διαταραχή της λειτουργίας του προσωπικού νεύρου, αναλόγως του σταδίου της νόσου 5. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από εικόνα παρόμοια με το φαγεσωρικό (comedo) ενδοπορικό καρκίνωμα του μαστού. Παρατηρούνται άτυπες αδενοκυψέλες και αυλοί, που επενδύονται από πολλές στιβάδες κυττάρων που αθροίζονται κατά περιοχές και προβάλλουν εντός των αυλών. Τα κύτταρα έχουν αραιοχρωματικο ηωσινόφιλο κυτταρόπλασμα και μεγάλους πυρήνες με έντοη πολυμορφία. Το στρώμα αποτελείται από πυκνό ινοκολλαγονώδη ιστό με εστίες υαλινοποίησης. Η πρόγνωση του όγκου είναι κακή, με αυξημένη τάση υποτροπής και εμφάνισης απομακρυσμένων μεταστάσεων, νωρίς στην πορεία της νόσου 103. Η θεραπεία συνίσταται σε χειρουργική αντιμετώπιση, με συνοδό ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία για την αντιμετώπιση των απομακρυσμένων μεταστάσεων Αδενοκαρκίνωμα μη ειδικού τύπου (Adenocarcinoma NOS) Πρόκειται για κακόηθες νεόπλασμα που χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη πόρων, χωρίς όμως ιστολογικά στοιχεία που χαρακτηρίζουν τους άλλους τύπους αδενοκαρκινωμάτων των σιελογόνων αδένων. 37

38 Λόγω της ελλιπούς καταγραφής του, προκύπτουν σημαντικά προβλήματα στη μελέτη της επιδημιολογίας, της κλινικής πορείας και της πρόγνωσής του. Με βάση τα υπάρχοντα δεδομένα αποτελεί το τρίτο σε συχνότητα κακόηθες νεόπλασμα των σιελογόνων αδένων, με ποσοστό 9% επί του συνόλου των όγκων και 16% των κακοηθειών των σιελογόνων αδένων. Η παρωτίδα αποτελεί την συνηθέστερη θέση εντόπισης (88,5%), ακολουθούν ο υπογνάθιος (11%) και ο υπογλώσσιος αδένας (0,5%). Ενδοστοματικά, συνήθως εντοπίζεται στη σκληρή υπερώα, στο βλεννογόνο της παρειάς, τα χείλη, τη γλώσσα, το έδαφος του στόματος, το οπισθογόμφιο τρίγωνο και την αμυγδαλική χώρα. Το ηλικιακό εύρος των ασθενών εκτείνεται από 40 έως 70 έτη. Η συχνότητα εμφανίσης του είναι ελαφρώς μεγαλύτερη στο γυναικείο φύλο 2,5,8. Κλινικά, εμφανίζεται ως μονήρης, ασυμπτωματική μάζα των μειζόνων σιελογόνων αδένων. Σπανίως παρατηρείται άλγος, που σχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου. Στους ελάσσονες σιελογόνους αδένες μπορεί να παρατηρηθεί εξέλκωση ή οστική διήθηση 5,104. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από την παρουσία νεοπλασματικών κυττάρων κατανεμημένων σε μικρά νησίδια, χορδές, ή μεγαλύτερες αθροίσεις με διαφράγματα συνδετικού ιστού. Μπορεί επίσης να παρατηρηθούν μεγάλες αθροίσεις με ελάχιστο στρώμα 5,104. Η πρόγνωση του όγκου ποικίλει αναλόγως του σταδίου, της εντόπισης και της διαφοροποίησης. Παρά τις υπάρχουσες επιδημιολογικές δυσκολίες, η συνολική δεκαετής επιβίωση υπολογίζεται σε 26-55% και καλύτερη πρόγνωση παρατηρείται σε καλά διαφοροποιημένους όγκους καθώς και σε αυτούς των ελασσόνων αδένων 8. Γενικά, η θεραπεία συνίσταται σε χειρουργική αντιμετώπιση Μυοεπιθηλιακό καρκίνωμα (Myoepithelial Carcinoma) Πρόκειται για κακόηθες νεόπλασμα που χαρακτηρίζεται από τη σχεδόν αποκλειστική παρουσία νεοπλασματικών κυττάρων με μυοεπιθηλιακή διαφοροποίηση, με τάση διηθητικής ανάπτυξης. 38

39 Η καταγεγραμένη του συχνότητα είναι 2% των κακοήθων νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων, πιστεύεται όμως ότι είναι μεγαλύτερη. Η παρωτίδα αποτελεί τη συνηθέστερη θέση εντόπισης (75%), μπορεί όμως να παρατηρηθεί και στον υπογνάθιο και στους ελάσσονες σιελογόνους αδένες. Το ηλικιακό εύρος των ασθενών εκτείνεται από 14 έως 86 έτη, με τη μέση ηλικία 55 ετών. Η συχνότητα τους δεν μεταβάλλεται σε σχέση με φύλο 105. Κλινικά, εμφανίζεται ως μονήρης, ανώδυνη περιγεγραμμένη λοβωτή μάζα. Αναλόγως του σταδίου μπορεί να παρατηρηθεί οστική διάβρωση, νευρική και αγγειακή διήθηση και τραχηλική λεμφαδενική διόγκωση 5. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από κυτταρική πολυμορφία με έντονη μιτωτική δραστηριότητα, και νεκρωτικές εστίες. Τα κύτταρα μπορεί να είναι ατρακτοειδή, διαυγή ή δίκην σφραγιστήρος δακτυλίου (signet ring) Σχηματίζουν συμπαγείς νησίδες ή σωληνοειδείς δομές με νεκρωτικά κέντρα. Σπανίως παρατηρούνται δομές που ομοιάζουν με πραγματικούς πόρους. Η διηθητική του ανάπτυξη αποτελεί διαφοροδιαγνωστικό χαρακτηριστικό από τον καλοήθη τύπο 5. Η πρόγνωση του όγκου ποικίλει, με περίπου το 1/3 των ασθενών να καταλήγουν από τη νόσο, 1/3 να παρουσιάζουν υποτροπή και το 1/3 να είναι ελεύθεροι νόσου 105,110. Γενικά, η θεραπεία συνίσταται σε ευρεία εκτομή του όγκου με συμπληρωματική ακτινοβόληση και χημειοθεραπεία επί ενδείξεων Καρκίνωμα προερχόμενο από πλειόμορφο αδένωμα (Carcinoma ex pleomorphic adenoma) Πρόκειται για κακόηθες νεόπλασμα που χαρακτηρίζεται από την κακοήθη εξαλλαγή προϋπάρχοντος πλειόμορφου αδενώματος. Αποτελεί το 3,6% του συνόλου των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων και 12% των κακοηθειών, υπολογίζεται δε ότι το 5-6,2% των πλειόμορφων αδενωμάτων υφίσταται κακοήθη εξαλλαγή 45,46,111. Οι μείζονες σιελογόνοι αδένες αποτελούν τη συνηθέστερη θέση εντόπισης (80%) και κυρίως η παρωτίδα. Ενδοστοματικά, συνήθως εντοπίζονται στη σκληρή υπερώα (66%) 111,112. Το ηλικιακό εύρος των 39

40 ασθενών εκτείνεται από 12 έως 92 έτη, με τη μεγαλύτερη συχνότητα στην 6 η και 7 η δεκαετία. Κλινικά, εμφανίζεται ως μια ταχέως διογκούμενη μάζα, η οποία συχνά μπορεί να προϋπήρχε επί μακρόν. Αναλόγως του σταδίου και της εντόπισης μπορεί να παρατηρηθεί διαταραχή της λειτουργίας του προσωπικού νεύρου ή οστική διήθηση 5,8. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από περιοχές τυπικού πλειόμορφου αδενώματος και περιοχές κακοήθους εξαλλαγής με κυτταρική πολυμορφία, ατυπία και μιτώσεις. Η αναλογία των δύο στοιχείων ποικίλλει και κατά περιπτώσεις μπορεί να είναι δύσκολη η ταυτοποίηση κάποιου από τα δύο στοιχεία. Το καρκινικό στοιχείο είναι συνήθως αδενοκαρκίνωμα χαμηλής διαφοροποίησης, αν και οποιοσδήποτε τύπος καρκινώματος μπορεί να παρατηρηθεί. Τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να διηθούν την κάψα του πλειόμορφου αδενώματος και αυτό το ιστολογικό στοιχείο έχει σημαντική προγνωστική σημασία 113,114. Η πρόγνωση του όγκου είναι κακή με πενταετή επιβίωση 25-65% και δεκαπενταετή να μειώνεται στο 10-35% Γενικά, η θεραπεία συνίσταται σε χειρουργική αντιμετώπιση και εάν απαιτείται ακτινοβόληση Λεμφοεπιθηλιακό καρκίνωμα (Lymphoepithelial Carcinoma) Πρόκειται για αδιαφοροποίητο κακόηθες νεόπλασμα που χαρακτηρίζεται από έντονη μη-νεοπλαστική λεμφοπλασματοκυτταρική διήθηση Αποτελούν λιγότερο από το 1% όλων των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Παρατηρείται ενδημικά σε διάφορους πληθυσμούς, όπως στους Εσκιμώους, νοτιοανατολικούς Κινέζους και Ιάπωνες 28, Η παρωτίδα αποτελεί τη συνηθέστερη θέση εντόπισης (80%) και κατόπιν ο υπογνάθιος, σπανίως δε παρατηρείται στους ελάσσονες αδένες 28,121,123. Το ηλικιακό εύρος των ασθενών εκτείνεται από την 1 η έως την 9 η δεκαετία της ζωής, με τη μεγαλύτερη συχνότητα στην 5 η δεκαετία. Η συχνότητα του παρουσιάζει μια μικρή αύξηση στο ανδρικό φύλο

41 Κλινικά, εμφανίζεται ως μια επώδυνη ταχέως διογκούμενη μάζα, η οποία συχνά μπορεί να προϋπήρχε επί μακρόν 27,121,124. Διαταραχή της λειτουργίας του προσωπικού νεύρου παρατηρείται στο 20% των περιπτώσεων. Αναλόγως του σταδίου της νόσου μπορεί να παρατηρηθεί οστική διάβρωση. Επίσης, μπορεί να παρατηρηθεί τραχηλική λεμφαδενική διόγκωση, με 10-40% των ασθενών να παρουσιάζουν επιχώριες μεταστάσεις κατά τη διάγνωση της νόσου 27,28, Λόγω των ομοιοτήτων που παρουσιάζει ο όγκος με το ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα πρέπει να εξετάζεται ενδελεχώς και ο ρινοφάρυγγας, προκειμένου να αποκλειστεί η πιθανότητα μεταστατικής διασποράς έναντι πρωτοπαθούς λεμφοεπιθηλιακού καρκινώματος 126,127. Ιστολογικά, ο όγκος χαρακτηρίζεται από κύτταρα με ασαφή όρια, ελαφρώς ηωσινόφιλο κυτταρόπλασμα και ωοειδείς πυρήνες ποικίλου μεγέθους. Παρατηρούνται νεκρώσεις και έντονη μιτωτική δραστηριότητα. Τα κύτταρα διατάσσονται σε μεγάλες αθροίσεις, νησίδια και χορδές μέσα στο λεμφοειδές στρώμα. Η μη-νεοπλασματική φλεγμονώδης διήθηση είναι έντονη και αποτελείται από Β και Τ λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα, συχνά με παρουσία αντιδραστικών λεμφοζιδίων. Στις ενδημικές περιοχές, εντοπίζεται το DNA ή/και RNA του EBV με in situ υβριδισμό σε ιστικές τομές του όγκου 120,121,124,128,129 Η πρόγνωση του όγκου εξαρτάται από το στάδιο της νόσου, με πενταετή επιβίωση 75-86% 27,121,126,127. Η θεραπεία συνίσταται σε ευρεία εκτομή του όγκου, με συνοδό λεμφαδενικό καθαρισμό και εάν απαιτείται ακτινοβόληση Σταδιοποίηση με βάση το σύστημα ΤΝΜ Το σύστημα ταξινόμησης ΤΝΜ είναι παγκοσμίως αποδεκτό για την κατηγοριοποίηση και την κλινική σταδιοποίηση των κακοήθων νεοπλασμάτων, με ειδικές κατηγορίες για όλα τα νεοπλάσματα, συμπεριλαμβανομένων και αυτών των σιελογόνων αδένων. Οι βασικές παράμετροι που αξιολογούνται για κάθε περίπτωση είναι i) το μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου (Tumor), ii) η ύπαρξη, ο αριθμός, το μέγεθος και η πλευρά επιχώριων λεμφαδενικών μεταστάσεων (Node), και iii) η ύπαρξη απομακρυσμένων μεταστάσεων (Metastasis) (Πίνακας 5). Αναλόγως της ΤΝΜ κατάταξης καθορίζεται και η σταδιοποίηση του όγκου 5 (Πίνακας 6). 41

42 Το πλεονέκτημα της ταξινόμησης ΤΝΜ είναι ότι παρουσιάζει σημαντική κλινική αντιστοιχία καθώς και ότι χαρακτηρίζεται από την ελάχιστη δυνατή υποκειμενικότητα, με αποτέλεσμα να μπορεί να χρησιμοποιηθεί με ασφάλεια και επαναληψιμότητα για την σταδιοποίηση της νόσου και την πρόγνωση και τον σχεδιασμό της θεραπείας. Μειονέκτημα της μεθόδου είναι το γεγονός ότι πλήθος στοιχείων και δεδομένων σημαντικών για την εξέλιξη και πορεία της νόσου δεν λαμβάνονται υπόψη, όπως ο ιστολογικός τύπος, το βάθος διήθησης, η εξωκαψική διήθηση, η περινευρική διήθηση, η αγγειακή διήθηση και άλλα 5. Για το λόγο αυτό οι διεθνείς κατευθυντήριες γραμμές αν και στηρίζονται στο ΤΝΜ σύστημα για την πρόγνωση και τον σχεδιασμό της θεραπείας, έχουν συμπεριλάβει στους θεραπευτικούς τους αλγόριθμους ορισμένα από αυτά τα στοιχεία

43 Πίνακας 5. Ταξινόμηση των κακοήθων νεοπλασμάτων των μειζόνων σιελογόνων αδένων με βάση το σύστημα ΤΝΜ (Barnes et al., 2005) 5 Πρωτοπαθής Όγκος (Tumor) Λεμφαδένες (Nodes) Μετάσταση (Metastasis) Tx Ο αρχικός όγκος δεν μπορεί να εκτιμηθεί Nx Επιχώριοι λεμφαδένες μη αξιολογήσιμοι Mx Απομακρυσμένες μεταστάσεις μη αξιολογήσιμες T0 Δεν υπάρχουν ενδείξεις αρχικού όγκου N0 Μη ψηλαφητοί επιχώριοι λεμφαδένες M0 Απουσία απομακρυσμένων μεταστάσεων T1 Μέγιστη διάμετρος έως 2 cm. χωρίς εξωπαρεγχυματική επέκταση* N1 Ψηλαφητός μονήρης ομόπλευρος λεμφαδένας μεγίστης διαμέτρου έως 3 cm. M1 Ύπαρξη απομακρυσμένων μεταστάσεων T2 T3 T4a Μέγιστη διάμετρος από 2 έως 4 cm. χωρίς εξωπαρεγχυματική επέκταση Μέγιστη διάμετρος πάνω από 4 cm ή/και παρουσία εξωπαρεγχυματικής επέκτασης Ο όγκος διηθεί το δέρμα, τις γνάθους, τον ακουστικό πόρο ή το προσωπικό νεύρο N2a Ψηλαφητός μονήρης ομόπλευρος λεμφαδένας μεγίστης διαμέτρου από 3 έως 6 cm. N2b Ψηλαφητοί πολλαπλοί ομόπλευροι λεμφαδένες κανένας από τους οποίους δεν υπερβαίνει σε μέγιστη διάμετρο τα 6 cm. N2c Ψηλαφητοί πολλαπλοί αμφοτερόπλευροι ή ετερόπλευροι λεμφαδένες κανένας από τους οποίους δεν υπερβαίνει σε μέγιστη διάμετρο τα 6 cm. T4b Ο όγκος διηθεί τη βάση του κρανίου, τις πτερυγοειδείς αποφύσεις ή την καρωτίδα N3 Ψηλαφητός μονήρης λεμφαδένας μεγίστης διαμέτρου πάνω από 6 cm. Tx Ο αρχικός όγκος δεν μπορεί να εκτιμηθεί Nx Επιχώριοι λεμφαδένες μη αξιολογήσιμοι *Εξωπαρεγχυματική επέκταση θεωρείται η ύπαρξη κλινικών ή μακροσκοπικών ευρημάτων διήθησης μαλακών μορίων ή νευρικών στελεχών πέραν των περιγραφόμενων στις κατηγορίες Τ4a και Τ4b.

44 Πίνακας 6. Σταδιοποίηση των κακοήθων νεοπλασμάτων των μειζόνων σιελογόνων αδένων με βάση το σύστημα TNM (Barnes et al., 2005) 5 Στάδιο Τα Ν Μ Στάδιο Ι T1 N0 M0 Στάδιο ΙΙ T2 N0 M0 Στάδιο ΙΙΙ T3 N0 M0 T1-3 N1 M0 Στάδιο Iva T1-3 N2 M0 T4a N0-2 M0 Στάδιο IVb T4b Οποιοδήποτε N M0 Οποιοδήποτε Τα N3 M0 Στάδιο IVc Οποιοδήποτε Τα Οποιοδήποτε N M1

45 Βαθμός Κακοήθειας Σε μια σειρά εργασιών ο ιστολογικός βαθμός κακοήθειας έχει βρεθεί ότι αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα και έχει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της αντιμετώπισης. Ο βαθμός κακοήθειας των κακοήθων νεοπλασμάτων των σιελογόνων καθορίζεται αναλογώς του ιστολογικού τύπου. Ορισμένοι ιστολογικοί τύποι έχουν εξ ορισμού προκαθορισμένο βαθμό κακοήθειας. Τυπικό παράδειγμα αποτελούν τα πολύμορφα αδενοκαρκινώματα χαμηλου δυναμικού κακοήθειας. Άλλοι ιστολογικοί τύποι αξιολογούνται με βάση τα κυτταρομορφικά χαρακτηριστικά τους. Με βάση τα δεδομένα αυτά, τα αδενοκυστικά καρκινώματα διαχωρίζονται σε μέσης και υψηλής κακοήθειας αναλόγως αν το κυρίαρχο αρχιτεκτονικό τους πρότυπο είναι ηθμοειδές-σωληνώδες ή συμπαγές. Για τα βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα όπως προαναφέρθηκε υπάρχουν συγκεκριμένα συστήματα αξιολόγησης του βαθμού κακοήθειας. Διάφορα άλλα καρκινώματα όπως τα καρκινώματα προερχόμενα εκ πλειόμορφων αδενωμάτων αξιολογούνται με βάση τους ιστοπαθολογικούς τους χαρακτήρες 2,112, Στον Πίνακα 7 παρουσιάζεται ο βαθμός κακοήθειας σε σχέση με τον ιστολογικό τύπο των επιθηλιακών κακοήθων νεοπλασμάτων του δείγματος Πίνακας 7. Βαθμός κακοήθειας σε σχέση με τον ιστολογικό τύπο των συχνότερων επιθηλιακών κακοήθων νεοπλασμάτων Χαμηλού Βαθμού Κακοήθειας Πολύμορφο αδενοκαρκίνωμα χαμηλής κακοήθειας Ενδιάμεσου Βαθμού Κακοήθειας Μυοεπιθηλιακό καρκίνωμα Υψηλού Βαθμού Κακοήθειας Καρκίνωμα εκφορητικών πόρων των σιελογόνων αδένων Αναλόγως ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών Αδενοκυστικό Καρκίνωμα Διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα, μη ειδικού τύπου Λεμφοεπιθηλιακό καρκίνωμα Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα Αδενοκαρκίνωμα μη ειδικού τύπου Καρκίνωμα προερχόμενο από πλειόμορφο αδένωμα 45

46 4. ΝΕΟΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ 4.1. Εισαγωγή Ο όρος αγγειογένεση αναφέρεται στο σχηματισμό νέων αγγειακών κλάδων μέσω πολλαπλασιασμού, μετανάστευσης και κατάλληλης οργάνωσης ενδοθηλιακών κυττάρων. Η αγγειογένεση παρατηρείται σε πλήθος φυσιολογικών καταστάσεων, όπως κατά την αναπαραγωγή , την ανάπτυξη 138 και την επούλωση 139. Πέραν όμως της συμμετοχής της αγγειογένεσης σε διαδικασίες φυσιολογικές και απαραίτητες για τον οργανισμό, μετέχει και σε πλήθος παθολογικών καταστάσεων και νοσημάτων, όπως στην νεοπλασία 140, στην αρθρίτιδα και αλλού. Ο Folkman διατύπωσε πρώτος τη θεωρία ότι η ανάπτυξη των συμπαγών νεοπλασμάτων πέραν των 2-3 mm σε διάμετρο προϋποθέτει επαρκή αγγείωση. Η δημιουργία νέων αγγείων καθορίζεται από την αλληλεπίδραση μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων και εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Ο ενδοθηλιακός πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση ελέγχονται από αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες που παράγονται από τον όγκο και από το μικροπεριβάλλον του 144. Η ισορροπία αυτών των μορίων που δρουν επαγωγικά ή ανασταλτικά στην αγγειογένεση καθορίζει τη δημιουργία και το σχηματισμό των νέων αγγείων Μηχανισμοί δημιουργίας νέων αγγείων Νέα αιμοφόρα αγγεία στους ενήλικες μπορούν να δημιουργηθούν μέσω δύο βασικών μηχανισμών: ο ένας (vasculogenesis) αναφέρεται στη de novo δημιουργία ενδοθηλιακών κυττάρων από πρόδρομα κύτταρα, ενώ ο δεύτερος (angiogenesisαγγειογένεση) αφορά στη διαδικασία με την οποία τα ενδοθηλιακά κύτταρα σχηματίζουν νέα αγγεία από προϋπάρχοντα αγγειακά στελέχη Vasculogenesis Κατά τη vasculogenesis σπλαγχνικά κύτταρα του μεσοδέρματος μετατρέπονται σε αιμαγγειοβλάστες οι οποίες με τη σειρά τους σχηματίζουν νησίδια (blood islands). Τα 46

47 νησίδια αυτά κεντρικά αποτελούνται από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, ενώ περιφερικά στελεχώνονται από αγγειοβλάστες, οι οποίες διαφοροποιούνται σε ενδοθηλιακά κύτταρα 146,147. Στη συνέχεια, υπό την επίδραση διαφόρων ινοβλαστικών αγγειογόνων παραγόντων τα ενδοθηλιακά κύτταρα οργανώνονται, σχηματίζοντας το πρωτογενές τριχοειδικό πλέγμα (Primitive capillary plexus) το οποίο υφίσταται αναδιαμόρφωση που οδηγεί στο σχηματισμό αρτηριών και φλεβών 148. Φυσιολογικά, ο μηχανισμός της vasculogenesis παρατηρείται κατά την εμβρυογέννεση 149,150. Φαίνεται όμως ότι υπό ιδιαίτερες συνθήκες και καταστάσεις ενεργοποιείται και σε ενήλικες Αγγειογένεση Σε αντίθεση με τη vasculogenesis η αγγειογένεση αφορά στη δημιουργία νέων αγγείων από προϋπάρχοντα αγγειακά στελέχη. Η έναρξη της αγγειογένεσης πραγματοποιείται με απώλεια των περικυττάρων και καταστροφή της βασικής μεμβράνης των τριχοειδών από τη δράση διαφόρων πρωτεασών, όπως μελών της οικογένειας των matrix metalloproteinases (MMP). Η διάσπαση της βασικής μεμβράνης επιτρέπει στα ενδοθηλιακά κύτταρα να αλληλεπιδρούν με το εξωκυττάριο περιβάλλον Δύο είναι οι κύριοι μηχανισμοί μέσω των οποίων πραγματοποιείται ο σχηματισμός νέων αγγείων στην αγγειογένεση: i) μέσω της εκβλάστησης ενδοθηλιακών κυττάρων από προϋπάρχον ενδοθήλιο και ii) μέσω του διχασμού των τριχοειδών αγγείων σε θυγατρικά αγγεία. i) Η διαδικασία της εκβλάστησης (sprouting), αποτελεί τον πλέον μελετημένο μηχανισμό αγγειογένεσης. Η διαδικασία ξεκινά υπό την επίδραση κάποιου αγγειογόνου ερεθίσματος, δια μέσου ποικίλων μοριακών διαμεσολαβητών οδηγώντας στη μετατροπή αδρανών φαινοτυπικά αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων σε ενεργά. Μετά την απομάκρυνση των περικυττάρων από το εξωτερικό του τριχοειδούς αγγείου, τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα επιδρούν και διασπούν τους 47

48 δεσμούς μεταξύ γειτονικών ενδοθηλιακών κυττάρων, εισβάλλουν στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, πολλαπλασιάζονται και σχηματίζουν εκβλαστήσεις και αγγειακούς αυλούς. Ο νεοσχηματισμένος αυλός επενδύεται ξανά από περικύτταρα ii) Ο μηχανισμός της αγγειογένεσης μέσω διχασμού και ενδίπλωσης προϋπαρχόντων αγγείων δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Σύμφωνα με ορισμένους μελετητές τα ενδοθηλιακά κύτταρα υπόκεινται σε διαδικάσια πινοκύττωσης με αποτέλεσμα να σχηματίζονται ενδοκυττάρια κενοτόπια τα οποία συγχωνεύονται και έτσι προκύπτει ο νέος αυλός 154. Σύμφωνα με μια άλλη θεωρία, τα κεντρικώς εντοπιζόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα αποπίπτουν με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός νέου αυλού Είναι πιθανόν ταυτόχρονα και ανά περίπτωση να συνυπάρχουν οι δύο μηχανισμοί. Η όλη διαδικασία ολοκληρώνεται με την αναστόμωση των νεοσχηματισθέντων αγγειακών αυλών, με το υπάρχον δίκτυο. Αφορά ουσιαστικά στη διαδικασία συνένωσης 2 αγγειακών αυλών για το σχηματισμό ενός συνεχούς αυλού. Έχει βρεθεί ότι απαιτούνται 3-7 ημέρες για το σχηματισμό αγγειακών αναστομώσεων μεταξύ δερματικών μοσχευμάτων και ενός δέκτη Αγγειογόνοι και αντι-αγγειογόνοι μηχανισμοί κατά την αγγειογένεση Όπως προαναφέρθηκε, ο σχηματισμός ή όχι νεόπλαστων αγγείων σχετίζεται με την τοπική ιστική ισορροπία μεταξύ των παραγόντων που ευοδώνουν (αγγειογόνοι παράγοντες) και αναστέλλουν (αντι-αγγειογόνοι παράγοντες) την αγγειογένεση. Η δράση των αγγειογενετικών διαμεσολαβητών είναι η ίδια σε φυσιολογικές και σε παθολογικές καταστάσεις, ξεκινάει όμως από διαφορετικά ερεθίσματα και καταλήγει σε διαφορετικό κλινικό αποτέλεσμα 159. Παρά την πρόοδο της μοριακής βιολογίας, που έχει επιτρέψει την αναγνώριση του σημαντικού ρόλου διαφόρων παραγόντων της αγγειογένεσης, είναι γεγονός ότι ο αριθμός και η φύση τους δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί 156. Με βάση τα υπάρχοντα ερευνητικά δεδομένα έχει προταθεί ο ρόλος διαλυτών πεπτιδίων και πρωτεϊνών των κυτταρικών μεμβρανών, αλληλεπιδράσεων των ενδοθηλιακών κυττάρων με το μικροπεριβάλλον τους και αιμοδυναμικών παραγόντων. 48

49 Η δράση των μοριακών μεσολαβητών είναι ιδιαιτέρως σημαντική προκαλώντας ενεργητική κίνηση των ενδοθηλιακών κυττάρων και αύξηση της μιτωτικής τους δραστηριότητας 160. Χαρακτηριστική δε είναι η πειραματική μελέτη των Parson- Wingerter και συνεργατών 161 όπου χρησιμοποιώντας αγγειογόνους και αντιαγγειογόνους παράγοντες προκάλεσαν αντίστοιχη ελεγχόμενη αύξηση και επιβράδυνση του ρυθμού αγγειακής ανάπτυξης Κυριότεροι αγγειογόνοι παράγοντες Ο πλέον μελετημένος επαγωγέας της αγγειογένεσης είναι ο Αγγειακός Ενδοθηλιακός Αυξητικός Παράγονας (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Προάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων, ενισχύει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης και αυξάνει την κυτταρική διαπερατότητα. Ο VEGF φαίνεται ότι κατέχει σημαντικό ρόλο τόσο στη φυσιολογική όσο και στην παθολογική αγγειογένεση. Η υπερέκφραση του έχει διαπιστωθεί σε μεγάλο αριθμό νεοπλασιών και έχει συσχετιστεί με επιβαρυμένη πρόγνωση Εκτενέστερη αναφορά στον VEGF και στη δράση του παρατίθεται στην αντίστοιχη ενότητα. Η έκκριση του VEGF φαίνεται ότι επάγεται από την υποξία, μέσω του HIF (Hypoxia Induced Factor, Επαγώμενος από την Υποξία Παράγοντας) που ρυθμίζει την έκφραση του VEGF, όπως και άλλων αυξητικών παραγόντων όπως του FGF (Fibroblast Growth Factor, Αυξητικός Παράγοντας Ινοβλαστών) και του ΕGF (Epidermal Growth Factor, Επιδερμιδικός Αυξητικός Παράγοντας ), προκαλώντας αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της αγγειακής διαπερατότητας και της κυτταρικής μετανάστευσης 165. Άλλοι σημαντικοί αγγειογόνοι παράγοντες είναι η αγγειοποιητίνη 1 και 2 (Angiopoetin 1-2, Ang1 και Ang2) που εντοπίζονται στο αγγειακό ενδοθήλιο και στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα. Η δράση τους ασκείται μέσω σύνδεσης με τον υποδοχέα τυροσινικής κινάσης Tie2 και σχετίζεται με την ωρίμανση των σχηματισμένων αγγείων Επίσης, σημαντικός είναι και ο ρόλος του βασικού Αυξητικού Παράγοντα των Ινοβλαστών (basic Fibroblast Growth Factor, bfgf), που εντοπίζεται στη βασική 49

50 μεμβράνη και στη θεμέλια ουσία των αγγείων. Ο ρόλος του είναι σύνθετος, φαίνεται πάντως ότι επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την χημειοταξία και τη ρύθμιση της δραστηριότητας διαφόρων μορίων προσκόλλησης 170. Οι Παράγοντες Νέκρωσης Όγκου α και β (Tumor Necrosis Factor α and β, TNFα και TNFβ), παράγονται από φλεγμονώδη κύτταρα και επάγουν την αγγειογένεση εμμέσως, μέσω ενίσχυσης άλλων αυξητικών παραγόντων και βοηθώντας την έναρξη της διαδικασίας της εκβλάστησης 171,172 Η Αγγειογενίνη (Angiogenin) διεγείρεται από άλλους αγγειογόνους παράγοντες, όπως τον VEGF και τον bfgf. Η Αngiogenin μετέχει στην μεταγραφή του ριβοσωμικού RNA του ενδοθηλίου, επηρεάζοντας έτσι τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό 173,174 Σημαντική είναι και οι δράση των Αυξητικών Παραγόντων Μετασχηματισμού α και β (Transforming Growth Factor α and β, TGFα και TGFβ). Έχουν πολλαπλούς και σύνθετους ρόλους στην αγγειογένεση ελέγχοντας τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση Ο EGF δρα μέσω της σύνδεσης με τον αντίστοιχο υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας EGFR. Επάγει τη μετανάστευση των κυττάρων και το σχηματισμό τριχοειδών 180. Οι Μεταλλοπρωτεϊνάσες εξωκυττάριας ουσίας 1,2,9 (Matrix Metaloproteinases- MMP1, MMP2 και MMP9), ανήκουν σε μια οικογένεια ενζύμων που έχουν ως αποστολή την πρωτεολυτική διάσπαση στοιχείων της θεμέλιας ουσίας, προκαλώντας την απομάκρυνση των περικυττάρων και μετέχοντας στην αναδιαμόρφωση (remodeling) της βασικής μεμβράνης. Επίσης, μετέχουν στον σχηματισμό και την απελευθέρωση διαφόρων αυξητικών παραγόντων μέσα στη θεμέλια ουσία καθώς και στη διάσπαση μεσοκυττάριων δεσμών 181. Υπάρχει πλήθος άλλων μορίων που επάγουν την αγγειογένεση, όπως ο Αυξητικός Παράγοντας των Ηπατοκυττάρων (Hepatocyte Growth Factor, HGF), ο Αυξητικός Παράγοντας ομοιάζων της Ινσουλίνης (Insulin-like Growth Factor, IGF), οι Αυξητικοί Παράγοντες των Κοκκιοκυττάρων και των Κοκκιοκυττάρων-Μακροφάγων (Granulocyte Colony Stimulating Factor και Granulocyte-Macrophages Colony 50

51 Stimulating Factor, G-CSF και GM-CSF), η Ιντερλευκίνη 6 και 8 (Interleukin 6 και 8, IL-6/8) και διάφορες Προσταγλανδίνες (Prostaglandins, PGE1 και PGE2) Κυριότεροι αντι-αγγειογόνοι παράγοντες Όπως προανεφέρθηκε πέραν των αγγειογόνων παραγόντων υπάρχουν και μοριακοί διαμεσολαβητές που παρουσιάζουν κατασταλτικό ρόλο στη διαδικασία της αγγειογένεσης, Οι κυριότεροι από αυτούς είναι οι παρακάτω: Η Αγγειοστατίνη (Angiostatin) προϊόν της πρωτεολυτικής διάσπασης του πλασμινογόνου αποτελεί ισχυρό αναστολέα της αγγειογένεσης. Επιφέρει συρρίκνωση και ελάττωση της πυκνότητας των αιμοφόρων αγγείων οδηγώντας στην υποστροφή των όγκων. Οι μελέτες δείχνουν ότι η Αγγειοστατίνη προάγει την απόπτωση και αναστέλλει την ανάπτυξη και μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων 182,183. Παράλληλα αυξάνει την απόπτωση σε μεταστατικούς όγκους εμποδίζοντας την εξέλιξη τους 184. Η Ενδοστατίνη (Endostatin) είναι αγγειοστατικός παράγοντας, θραύσμα του καρβοξυτελικού άκρου του κολλαγόνου ΧVIII, μιας σημαντικής πρωτεογλυκάνης των βασικών μεμβρανών. Μειώνει την έκφραση του αγγειογενετικού παράγοντα VEGF, παρεμποδίζοντας έτσι τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, το σχηματισμό των αυλών και την ανάπτυξη του όγκου 185,186. Εκτενέστερη αναφορά στην Ενδοστατίνη και στη δράση της παρατίθεται στην αντίστοιχη ενότητα Ορισμένα στελέχη των MMPs οι οποίες προαναφέρθηκαν στους προαγγειογενετικούς παράγοντες έχουν αντι-αγγειογόνο ρόλο (πχ ΜΜΡ-19) μέσω του σχηματισμού αναστολέων, παράγοντας μόρια με δράση παρόμοια με την αγγειοστατίνη 181,187. Πλήθος άλλων μοριακών διαμεσολαβητών, όπως οι Tumstatin, Platelet Factor-4 (PF- 4), Thrombospondin-1 (TSP-1), Tissue Inhibitors of Metalloproteinases, Ιντερφερόνες (IFNs) μελετώνται ως προς τις αντι-αγγειογόνες τους ιδιότητες 176,177,188. Η μελέτη της δράσης των αντι-αγγειογόνων παραγόντων έχει συμβάλλει αποφασιστικά στην 51

52 ανάπτυξη νέων φαρμάκων που εμποδίζουν την ανάπτυξη των όγκων και τη μετάσταση των κακοήθων νεοπλασμάτων 188, Αγγειογένεση στη νεοπλασία Εισαγωγή Χρησιμοποιώντας τα προϋπάρχοντα αγγειακά δίκτυα οι νεοπλασματικοί όγκοι δεν θα μπορούσαν να αυξηθούν πέρα των 1 2 mm, λόγω έλλειψης οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών. Προκειμένου να παρακάμψουν αυτούς τους περιορισμούς, εκκρίνουν αυξητικούς παράγοντες, ή εμποδίζουν τη δράση αντι-αγγειογόνων ουσιών, με αποτέλεσμα την επαγωγή της αγγειογένεσης. Με τον τρόπο αυτό, εξασφαλίζουν την ικανοποίηση των διατροφικών τους αναγκών και την απομάκρυνση των βλαβερών προϊόντων του μεταβολισμού τους, ενώ στην περίπτωση των κακοήθων νεοπλασμάτων διευκολύνεται η μεταστατική τους επέκταση μέσω ευχερέστερης πρόσβασης στην κυκλοφορία 141,190. Αυτή η μετατροπή των κυττάρων από αδρανή σε αγγειογενετικά δραστήρια ονομάζεται αγγειογενετική μεταστροφή (angiogenic switch) και αποτελεί αντικείμενο εκτενούς έρευνας. Σύμφωνα με πειραματικά δεδομένα ότι η μεταστροφή μπορεί να επέλθει είτε απότομα 141, είτε σταδιακώς Νεοπλασματικός Αγγειογενετικός Φαινότυπος Οι μηχανισμοί που μετέχουν στη φυσιολογική αγγειογένεση μετέχουν και στην νεοπλασματική, με την διαφορά ότι πλέον δεν βρίσκονται υπό έλεγχο και συντονισμό αλλά δρουν ανεξέλεγκτα με στόχο την ανάπτυξη του όγκου, έχοντας προσδώσει στο νεοπλασματικό κύτταρο αγγειογενετικό φαινότυπο (Εικόνα 4) 194 Ο ακριβής μηχανισμός αυτής της αγγειογενετικής μεταστροφής του κυτταρικού φαινοτύπου δεν έχει διευκρινιστεί, αλλά δεδομένα υποστηρίζουν την άποψη ότι σχετίζεται με την προοδευτική συσσώρευση γενετικών μεταλλάξεων (πολυσταδιακή καρκινογένεση). Οι μεταλλάξεις αυτές προκαλούν τη σταδιακή ενεργοποίηση 52

53 ογκογονιδίων και την απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων 193, , προκαλώντας τη μετατροπή του κυτταρικού φαινοτύπου. Χαρακτηριστικό Εικόνα 4. Βασικοί μηχανισμοί νεοπλασματικής αγγειογένεσης. Λόγω κεντρικής υποξίας, αποδεσμεύεται από τον όγκο ο παράγοντας HIF, ο οποίος επάγει τη σύνθεση αγγειογόνων παραγόντων από τον όγκο και τους πέριξ ιστούς, όπως VEGF, PDGF, EGF, MMPs και TGFb, που οδηγούν σε νεοαγγειακό σχηματισμό και ωρίμανση. Η όλη διεργασία ενισχύεται περαιτέρω και από άλλους αγγειογόνους παράγοντες (από Kiessling 2007) 194 παράδειγμα είναι η αυξημένη έκφραση του VEGF ως αποτέλεσμα επίκτητων μεταλλάξεων σε καρκινικά κύτταρα 156. Στην περίπτωση των συμπαγών νεοπλασμάτων, φαίνεται ότι η ανοξία που επικρατεί στην κεντρική περιοχή του όγκου οδηγεί στην έκφραση του HIF (Hypoxia Inducible Factor-Επαγόμενος από την Υποξία Παράγοντας) που ρυθμίζει την έκφραση του VEGF, όπως και άλλων αυξητικών παραγόντων όπως του FGF και του ΕGF, προκαλώντας αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της αγγειακής διαπερατότητας και της κυτταρικής μετανάστευσης 165. Με το μηχανισμό αυτό οι κακοήθεις όγκοι -οι οποίοι χαρακτηρίζονται από ισχαιμική κεντρική περιοχήδημιουργούν μέσω θετικής ανατροφοδότησης συνθήκες ευνοϊκές για την παραπέρα 53

54 επέκτασή τους, την περαιτέρω πρόκληση κεντρικής υποξίας και συνέχιση της αγγειογενετικής διαδικασίας 199. Τα σχηματιζόμενα νεόπλαστα αγγεία επιτελούν το ρόλο της μεταφοράς αίματος, για τη μεταφορά οξυγόνου και μεταβολιτών, αλλά κατασκευαστικά είναι ατελή. Το εύρος τους ποικίλλει, παρουσιάζουν οφιοειδή πορεία, το περικυττάριο περίβλημα και η βασική μεμβράνη τους είναι ατελείς. Τα τοιχώματα τους είναι εξαιρετικά διαπερατά λόγω της παρουσίας θυριδώσεων, διακυττάριων οπών και λόγω της έλλειψης βασικής μεμβράνης και περικυττάρων 200. Λόγω της ανεπαρκούς κατασκευής αυτής η απομάκρυνση των προϊόντων του κυτταρικού μεταβολισμού είναι ελλιπής, επιδεινώνοντας τις τοπικές συνθήκες ανοξίας, ενεργοποιώντας περαιτέρω τoν καταρράκτη της αγγειογένεσης Αγγειοβρίθεια νεοπλασμάτων Καθώς η αγγειογένεση του όγκου είναι σημαντικό στοιχείο για την ανάπτυξη και την επέκταση του, η ποσοτικοποίηση της πυκνότητας των αγγείων εντός του όγκου έχει θεωρηθεί ότι μπορεί να σχετίζεται με την κλινική πορεία του 201. Η Μικροαγγειακή Πυκνότητα (Μicrovessel density-mvd) αποτελεί τον πλέον διαδεδομένο ποσοτικό δείκτη της πυκνότητας του αγγειακού πλέγματος ενός όγκου. Η μέθοδος μέτρησης του MVD αναπτύχθηκε αρχικώς από τον Weidner 202 το 1991 και στηρίζεται στην ανοσοϊστοχημική χρώση του αγγειακού ενδοθηλίου για τον εντοπισμό των αγγείων. Σύμφωνα με την τεχνική του Weidner στο οπτικό μικροσκόπιο υπό χαμηλή μεγέθυνση εντοπίζονται περιοχές με τη μέγιστη αγγειακή πυκνότητα, οι οποίες ονομάζονται Hot spots. Κατόπιν στις περιοχές αυτές και υπό μεγέθυνση μετρώνται τα αγγεία και υπολογίζεται ο μέσος όρος των αγγείων, ανά mm 2. Λόγω της υποκειμενικότητας που χαρακτηρίζει την τεχνική αυτή έχουν αναπτυχθεί διάφορες άλλες τεχνικές, με σκοπό την ανάπτυξη μιας αντικειμενικότερης μέτρησης. Για το λόγο αυτό οι τεχνικές καθορισμού της MVD ποικίλλουν σημαντικά μεταξύ μελετητών, καθιστώντας δυσχερή τη σύγκριση των αποτελεσμάτων 201,203. Πέραν των hot spots έχει εφαρμοστεί και η μέτρηση σε τυχαίες περιοχές του όγκου και ο 54

55 υπολογισμός μιας μέσης τιμής 204,205. Διαφορές έχουν επίσης παρατηρηθεί και στον τρόπο με τον οποίο μετρώνται τα αγγεία, με άμεσες μετρήσεις και με κλίμακες αξιολόγησης της αγγειοβρίθειας Επίσης, έχει εφαρμοστεί και η ψηφιακή ανάλυση εικόνας κατά την οποία πεδία από κάθε όγκο μετρώνται και υπολογίζεται ένας μέσος όρος αγγείων και μέσος όρος έντασης χρώσης ανά όγκο 207,208. Οι τιμές από τις μετρήσεις αυτές είναι απόλυτες με αυξημένη ευαισθησία και επαναληψιμότητα, που προσεγγίζει το 99% Για τη ανοσοχρώση του αγγειακού ενδοθηλίου έχουν χρησιμοποιηθεί αντισώματα έναντι διαφόρων μορίων, όπως ο Παράγοντας VIII (Factor VIII ή Factor VIII Related antigen), το CD31, το CD34, το CD105, η integrin α ν β 3 και το collagen IV. Για κάθε τύπο δείκτη έχουν περιγραφεί διάφορα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα, χωρίς όμως να έχει καθιερωθεί η αποκλειστική χρήση ενός Σύμφωνα με ερευνητικά δεδομένα η νεοαγγειογένεση του όγκου σχετίζεται με την πρόγνωση σε διάφορες περιπτώσεις νεοπλασίας, συχνά όμως τα δεδομένα είναι αντιφατικά με άλλες εργασίες να καταλήγουν στο αντίθετο συμπέρασμα. Για ορισμένους όγκους η πλειονότητα των εργασιών έχει καταλήξει στο συμπέρασμα ότι η αυξημένη MVD -όπως αυτή εκφράζει την αυξημένη νεοαγγείωση του νεοπλάσματος- σχετίζεται με επιθετικότερη συμπεριφορά και δυσμενέστερη πρόγνωση 219,220. Πρέπει όμως να τονιστεί ότι συχνά είναι δυσχερής η σύγκριση των δεδομένων, καθώς υπάρχει μεγάλη ποικιλία στα κριτήρια επιλογής ασθενών και οι τεχνικές διαφέρουν, καθώς επίσης υπεισέρχεται ζήτημα της χρήσης υποκειμενικών τεχνικών υπολογισμού της MVD 202,209,217, Η σχέση της MVD και της κλινικής πορείας έχει μελετηθεί καλύτερα στον καρκίνο του μαστού, όπου σε μια μετανάλυση 87 δημοσιευμένων μελετών διαφαίνεται ότι υψηλή MVD συνοδεύεται από αυξημένη θνησιμότητα σε ασθενείς με ή/και χωρίς λεμφαδενικές μεταστάσεις 230. Επίσης, η MVD έχει συσχετισθεί με την πρόγνωση της πορείας της νόσου σε καρκινώματα άλλων οργάνων, όπως του πνεύμονα, του στομάχου, του παχέος εντέρου, του τραχήλου της μήτρας και της ουροδόχου κύστεως 217, Όσον αφορά στους όγκους της κεφαλής και του τραχήλου τα ερευνητικά δεδομένα που υπάρχουν δεν έχουν βρει κλινική εφαρμογή, καθώς δεν έχει καταδειχθεί συσχέτιση μεταξύ της MVD και της επιθετικότητας των όγκων 203,205,

56 Ο ρόλος της αγγειογένεσης στον καρκίνο της κεφαλής και τραχήλου Τα δεδομένα δείχνουν ότι, σε αντιστοιχία με την πλειονότητα των συμπαγών νεοπλασματικών όγκων, οι όγκοι της κεφαλής και του τραχήλου στηρίζονται στην νεοαγγειογένεση προκειμένου να επεκταθούν και να εμφανίσουν μεταστάσεις. Υπάρχει μεγάλος αριθμός παραγόντων με αγγειογόνο δράση που εκφράζεται στους όγκους της κεφαλής και του τραχήλου. Συνοπτικά θα αναφερθούμε στα κυριότερα μόρια που έχουν συσχετισθεί με την ανάπτυξη των όγκων κεφαλής και τραχήλου Ο VEGF-A (Vascular Endothelial Growth Factor A, Αγγειακός Ενδοθηλιακός Αυξητικός Παράγοντας Α) αποτελεί τον πλέον μελετημένο αγγειογόνο παράγοντα. Η σημαντικότητα του παράγοντα αυτού στα νεοπλάσματα κεφαλής και τραχήλου καταδεικνύεται από μια μετανάλυση 1002 περιστατικών, όπου η έκφραση του VEGF συσχετίσθηκε με υποδιπλασιασμό της διετούς επιβίωσης 233. Επιπλέον, η συμμετοχή του VEGF στην κακοήθη νεοπλασματική διεργασία στην κεφαλή και στον τράχηλο φαίνεται από μια σειρά εργασιών, όπου μελετήθηκαν μόρια με ανασταλτική δράση κατά του VEGF ή του υποδοχέα του (VEGFR). Στις μελέτες αυτές παρατηρήθηκε μείωση της MVD και της ανάπτυξης του όγκου από την δράση των αντι-vegf και άντι-vegfr παραγόντων Με βάση τα ερευνητικά δεδομένα η υπερέκφραση του VEGF στους όγκους της κεφαλής και του τραχήλου έχει συσχετισθεί με προχωρημένο στάδιο νόσου, αντοχή στη θεραπεία και κακή πρόγνωση Οι Hasina και συνεργάτες 245 μελέτησαν την έκφραση διάφορων κυτοκινών όπως VEGF, IL-8/CXCL8 (interleukine-8/chemokine lignand-8, ιντερλευκίνη-8/χημιοκίνη-lignand-8), HGF, FGF-2, σε φυσιολογικούς, δυσπλαστικούς και καρκινικούς ιστούς κεφαλής και τραχήλου. Παρατήρησαν δε ότι οι κυτοκίνες αυτές πρακτικά δεν εκφράζονταν σε φυσιολογικούς ιστούς, ενώ ήταν αυξημένες σε δυσπλαστικούς ιστούς και πολύ αυξημένες σε καρκινικούς ιστούς. Μάλιστα παρατήρησαν ότι υπήρχαν όγκοι με αυξημένο VEGF και FGF-2 και χαμηλά επίπεδα IL-8/CXCL8, HGF, FGF-2 και το αντίστροφο. Οι συγγραφείς ερμήνευσαν αυτά τα δεδομένα ως ένδειξη ύπαρξης διαφορετικών μηχανισμών νεοαγγειογένεσης στους όγκους αυτούς. H συμμετοχή του αγγειογόνου παράγοντα EGFR στην ανάπτυξη των όγκων της κεφαλής και του τραχήλου φαίνεται από την εργασία των Bonner και συνεργατών

57 όπου ο αντι-egfr παράγοντας Cetuximab, σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία βελτίωσε την επιβίωση ασθενών με προχωρημένα ακανθοκυτταρικά καρκινώματα κεφαλής και τραχήλου Επίσης, υπάρχουν και άλλες μελέτες όπου συνδυασμοί αντι-vegf μορίων με αντι- EGF μόρια και άλλες θεραπευτικές παρεμβάσεις επέφεραν βελτίωση της κλινικής πορείας των ασθενών 237,247,248 και μείωση της αγγείωσης των όγκων 248, έως και πλήρη ύφεση της νόσου σε πειραματόζωα 249. Οι Myoung και συνεργάτες 250, χορήγησαν αντι-αγγειογόνες ουσίες με δράση κατά της έκφρασης του VEGF. Παρά τα ανοσοϊστοχημικά ευρήματα που υποδήλωναν τη σημαντική δράση των χορηγούμενων μορίων, δεν παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των όγκων. Οι συγγραφείς κατέληξαν ότι στα ακανθοκυτταρικά καρκινώματα της κεφαλής και του τραχήλου η αναστολή της αγγειογέννεσης δεν επαρκεί για την καταστολή του όγκου, αποτέλεσμα στο οποίο έχουν καταλήξει στο παρελθόν και άλλοι συγγραφείς 251. Υπάρχουν επίσης διάφορες μελέτες που ασχολήθηκαν όχι μόνο με τον αριθμό αλλά και τα λοιπά μορφομετρικά χαρακτηριστικά των νεοαγγείων. Έχει παρατηρηθεί ότι όγκοι χαμηλού μεταστατικού δυναμικού παρουσιάζουν αγγεία μικρότερου εύρους σε σχέση με μεταστατικούς όγκους 252. Επίσης, οι Kademani και συνεργάτες 253 παρατήρησαν ότι η παρουσία διηθητικής κατανομής του αγγειακού ενδοθηλιακού δείκτη CD34 επί παρουσίας του p53 σχετίζεται με τάση για πρώιμη υποτροπή. Όσον αφορά στους όγκους της κεφαλής και του τραχήλου τα ερευνητικά δεδομένα που υπάρχουν δεν έχουν βρει κλινική εφαρμογή, καθώς δεν έχει καταδειχθεί συσχέτιση μεταξύ της MVD και της κλινικής πορείας του όγκου 203,205,232. Πρέπει όμως να τονιστεί ότι η απουσία της συσχέτισης της MVD με την πρόγνωση δεν αποτελεί απόδειξη ότι δεν υπάρχει τέτοια σχέση, καθώς η πλειονότητα των μελετών είναι αναδρομικές και με μειωμένη στατιστική ισχύ

58 Ο ρόλος της αγγειογένεσης στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων Η μελέτη της MVD και της νεοαγγειογένεσης στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων παραμένει περιορισμένη. Οι υπάρχουσες μελέτες υποδηλώνουν ότι οι αγγειογόνοι παράγοντες μετέχουν στη διαμόρφωση του μικροπεριβάλλοντος των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων, καθώς και στην ανάπτυξη και μετάσταση των όγκων. Ακολουθεί μια συνοπτική παρουσίαση των κυριότερων ευρημάτων των σχετικών εργασιών Οι Soares και συνεργάτες 254 (129) μελέτησαν την αγγειογένεση σε σχέση με την καρκινωματώδη εξαλλαγή σε 10 πλειόμορφα αδενώματα και 16 καρκινώματα προερχόμενα από πλειόμορφο αδένωμα, 8 πρώιμου σταδίου και 8 προχωρημένου σταδίου. Η σύγκριση της νεοαγγεογένεσης μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων κατέδειξε αύξηση στα κακοήθη. Οι Costa και συνεργάτες 255 σε μια μελέτη 82 κακοήθων νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων διαπίστωσαν ότι η MVD ήταν μειωμένη σε κύτταρα με μυοεπιθηλιακή διαφοροποίηση. Επίσης, παρατήρησαν μεγαλύτερη αγγειοβρίθεια στα βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα σε σχέση με τα αδενοκυστικά καρκινώματα. Οι Luukkaa και συνεργάτες 209 συνέκριναν την αγγειογένεση με ανάλυση εικόνας μεταξύ 37 αδενοκυστικών και 18 βλεννοεπιδερμοειδών καρκινωμάτων. Διαπίστωσαν ότι η χρώση των αγγείων ήταν εντονότερη στα βλεννοεπιδερμοειδή σε σχέση με τα αδενοκυστικά καρκινώματα, καθώς και στα υψηλής κακοήθειας σε σχέση με τα λοιπά βλεννοεπιδερμοειδή. Οι Ota και συνεργάτες 256 μελέτησαν σε 15 αδενοκυστικά καρκινώματα, 15 βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα και 15 πλειόμορφα αδενώματα την MVD και την έκφραση του αγγειογενετικού πάραγοντα Midkine, που έχει συσχετισθεί με την αγγειογένεση σε διάφορους άλλος όγκους Τα αποτελέσματά τους έδειξαν ότι οι κακοήθεις όγκοι παρουσίαζαν υψηλότερη έκφραση Midkine. Επιπλέον, σε όγκους με αυξημένη Midkine παρατηρήθηκε και αυξημένη MVD. Οι συγγραφείς ερμήνευσαν τα ευρήματά τους ως ένδειξη ότι η Midkine μετέχει στην κακοήθη εξαλλαγή και στην αγγειογένεση των όγκων αυτών. 58

59 Διαφορά μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όγκων έχουν παρατηρηθεί και ως προς την έκφραση του Επαγωγέα των Μεταλλοπρωτεινασών (extracellular matrix metalloproteinase inducer-emmprin) και η έκφραση αυτή έχει συσχετισθεί και με την MVD. Η έκφραση του EMMPRIN βρέθηκε υψηλότερη σε βλεννοεπιδερμοειδή και αδενοκυστικά καρκινώματα σε σχέση με πλειόμορφα αδενώματα και φυσιολογικούς ιστούς, ενώ παράλληλα η MVD μετρήθηκε υψηλότερη σε όγκους θετικούς για EMMPRIN σε σχέση με τους αρνητικούς. Τα δεδομένα αυτά συνηγορούν στην άποψη ότι ο EMMPRIN είναι σημαντικός δείκτης της αγγειογένεσης και χαρακτηρίζει τη βιολογική συμπεριφορά των όγκων των σιελογόνων αδένων 263. Συνδυασμένη έκφραση του VEGF και της Τhymidine phosphorylase (TPφωσφορυλάση θυμιδίνης) έχει μελετηθεί σε ομάδα βλενοεπιδερμοειδών καρκινωμάτων, αδενοκυστικών καρκινωμάτων, πολύμορφων αδενοκαρκινωμάτων χαμηλής κακοήθειας και πλειόμορφων αδενωμάτων. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής έδειξαν χαμηλή έως μηδενική έκφραση των παραγόντων αυτών σε καλοήθεις όγκους και αυξημένη έκφραση σε κακοήθεις, γεγονός που μπορεί να βοηθήσει στον καθορισμό της βιολογικής συμπεριφοράς των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Τα δεδομένα της συνδυαστικής αυτής έκφρασης δεν παρουσίασαν συσχέτιση με την μεταστατικότητα ή τη μη-μεταστατικότητα των όγκων αυτών 264. Η έκφραση του VEGF, της inducible nitric oxide synthase (inos) και της MVD μελετήθηκε σε 70 βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα και 40 φυσιολογικούς σιελογόνους αδένες. Η inos παρατηρείται στους ιστούς σε φλεγμονώδεις καταστάσεις και οδηγεί στον σχηματισμό υψηλών συγκεντρώσεων ΝΟ στους ιστούς 265. Αυξάνεται σε διάφορες καρκινωματώδεις καταστάσεις και ενδέχεται να μετέχει στην παραγωγή του VEGF και στη νεοαγγειογένεση 266,267. Στη μελέτη αυτή, η έκφραση της inos και του VEGF στα βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα παρουσίασε συσχέτιση με την MVD, τη διαφοροποίηση και την υποτροπή. Επίσης, η έκφραση της inos συσχετιζόταν με αυτήν του VEGF. Οι συγγραφείς ερμήνευσαν τα ευρήματά τους ως ένδειξη ότι η inos επάγει την έκφραση του VEGF και της νεοαγγειογένεσης 268. Οι Demasi και συνεργάτες 255 μελέτησαν την έκφραση των Ang-1 και Ang-2 και των VEGF και Tie2 σε βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα. Παρατήρησαν ότι όγκοι 59

60 υψηλής κακοήθειας παρουσίαζαν περιοχές του στρώματος με έντονη έκφραση Ang-1 και Ang-2 και χαμηλή έκφραση των VEGF και Tie2. Επίσης, παρατήρησαν ότι τα νεοπλασματικά κύτταρα εξέφραζαν σε υψηλότερα επίπεδα την Ang-2 και τον VEGF σε σύγκριση με την Ang-1 και τον Tie2. Σύμφωνα με τους συγγραφείς τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν ότι στα βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα η δράση μεταξύ των διαφόρων Angs και VEGF διαμορφώνει την αγγειακή ανάπτυξη του όγκου και καθορίζει την επιθετικότητά του 255. O παράγοντας CD105 θεωρείται δείκτης υψηλής αγγειογενετικής δραστηριότητας που ανιχνεύεται κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και την επούλωση των τραυμάτων. Σε μελέτη έχει βρεθεί απουσία του CD105 σε φυσιολογικούς ιστούς, σπάνια έκφραση σε πλειόμορφα αδενώματα και αδενοειδή κυστικά καρκινώματα και υψηλή έκφραση σε βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα. Το εύρημα της μεγαλύτερης αγγειοβρίθειας των βλεννοεπιδερμοειδών σε σχέση με τα αδενοκυστικά καρκινώματα επιβεβαιώνει προηγούμενα ανάλογα ευρήματα 255. Τα δεδομένα επιβεβαιώνουν τη συμμετοχή της αγγειογένεσης στην ανάπτυξη των κακοήθων όγκων των σιελογόνων αδένων, όπως και τον πιθανό ρόλο των μυοεπιθηλιακών κύτταρων στον έλεγχο της αγγειογένεσης 269. Σε μια πρόσφατη μελέτη κακοήθων και 23 καλοήθων όγκων, μελετήθηκε η έκφραση της MVD, με τους ενδοθηλιακούς δείκτες CD31 και CD105 και την τεχνική των Hot spots. Μόνο η χρώση με CD105 ανέδειξε στατιστικώς σημαντική διαφορά της MVD στους κακοήθεις όγκους. Επίσης, όγκοι με μυεπιθηλιακή διαφοροποίηση παρουσίασαν χαμηλότερη MVD, εύρημα που έχει παρατηρηθεί και σε άλλες μελέτες 255. Οι Tadbir και συνεργάτες 270 σε ένα δείγμα 19 αδενοκυστικών, 20 βλεννοεπιδερμοειδών καρκινωμάτων και 20 πλειόμορφων αδενωμάτων μελέτησαν την MVD μέσω του δείκτη CD105. Παρατήρησαν στατιστικώς σημαντική αύξηση της MVD στους κακοήθεις όγκους σε σχέση με τους καλοήθεις. 60

61 5. ΕΙΔΙΚΑ ΜΟΡΙΑ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΑ ΜΕ ΤΗ ΝΕΟΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ 5.1. Αγγειακός Ενδοθηλιακός Αυξητικός Παράγοντας (Vascular Endothelial Growth Factor) Η οικογένεια του Αγγειακού Ενδοθηλιακού Αυξητικού Παράγοντα (VEGF) αποτελείται από τουλάχιστον 11 γλυκοπρωτεΐνες που προέρχονται από το splicing 6 γονιδίων (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-Ε και PlGF) 271. Ο παράγοντας VEGF-A που πριν την ανακάλυψη των λοιπών ισομορφών αποκαλούνταν VEGF, αποτελεί την αγγειογενετικά δραστικότερη μορφή 271. Τα VEGF μόρια συνδέονται με 3 τύπους υποδοχέων τυροσινικής κινάσης: VEGFR1, VEGFR2 και VEGFR3. Οι υποδοχείς 1 και 2 εντοπίζονται συνήθως στο αγγειακό ενδοθήλιο σε ενήλικες και ο 3 στο λεμφαγγειακό ενδοθήλιο 271. Ο τύπος 2 αποτελεί τον κύριο επαγωγέα της δράσης του VEGF 272,273. Στην Εικόνα αποδίδονται σχηματικά τα κύρια μέλη της VEGF οικογένειας. Εικόνα 5.Σχηματικά τα κύρια μέλη της VEGF οικογένειας και οι δράσεις τους (από Ferrara, 2003) 271 Ο VEGF θεωρείται ως ο κύριος επαγωγέας και σημαντικός παράγοντας καθορισμού του ρυθμού της φυσιολογικής και παθολογικής νεοαγγειογένεσης. Ασκεί μιτωτική και αντι-αποπτωτική δράση στο αγγειακό ενδοθήλιο και δρα ως χημειοτακτικός 61

62 παράγοντας για τα ενδοθηλιακά κύτταρα προγεννήτορες 273,275. Ο ρόλος του είναι ιδιαιτέρως σημαντικός κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής vasculogenesis, της αγγειογένεσης, της διαμόρφωσης των οργάνων και της ενδοχόνδριας οστεοποίησης 272. Υπάρχει πλήθος μελετών, σύμφωνα με τα δεδομένα των οποίων ο VEGF πέρα του φυσιολογικού του ρόλου, κατέχει σημαντικό ρόλο και στην παθογένεια των νεοπλασιών. Αυξημένα επίπεδα VEGF έχουν βρεθεί σε διάφορα νεοπλάσματα, όπως καρκινώματα του γαστρεντερικού, του πνεύμονα, του μαστού, του νεφρού, της ουροδόχου κύστεως, των ωοθηκών, του ενδομητρίου και άλλα 272,276. Επίσης, υποδοχείς του VEGF έχουν εντοπιστεί σε πλήθος καρκινικών κυττάρων 275. Επιπλέον, σύμφωνα με πειραματικά δεδομένα η αναστολή της VEGF δραστηριότητας προκαλεί και αναστολή της ανάπτυξης του όγκου Σε ορισμένα πειράματα η αναστολή της έκφρασης του VEGF προκάλεσε μέχρι και υποστροφή του όγκου, που αποδόθηκε σε μείωση της αγγειοβρίθειας του όγκου 280,281. Οι Jain και συνεργάτες 281 αναφέρουν υποτροπή όγκου κατόπιν διακοπής ορμονοθεραπείας, που συνδυάστηκε με ταυτόχρονη μείωση των VEGF επιπέδων και της αγγειοβρίθειας του όγκου. Επιπλέον, στοιχεία που υποστηρίζουν τον αγγειογόνο ρόλο του VEGF παρέχουν σειρά μελετών σε όγκους μαστού 282, νεφρού 283, πνεύμονα 284 και σε αδαμαντινοβλαστώματα 285. Πέραν της αγγειογένεσης φαίνεται ότι ο VEGF παίζει σημαντικό ρόλο και στην διατήρηση των αγγείων. Οι Benjamin και συνεργάτες παρατήρησαν ότι αυτή η δράση συντήρησης ασκείται μόνο σε νεοσχηματισμένα και όχι σε ώριμα αγγεία 200. Αντίθετα αποτελέσματα παρατήρησαν οι Huang και συνεργάτες 286, όπου η αντι-vegf αγωγή επηρέασε ακόμα και τα ώριμα αγγεία, προκαλώντας υποστροφή και των πρωτοπαθών όγκων αλλά ακόμα και των μεταστάσεών τους. Ο VEGF μετέχει και στην μεταστατική επέκταση των νεοπλασμάτων. Μέσω της αγγειογένεσης, παρέχει πρόσβαση των νεοπλασματικών κυττάρων στη συστηματική κυκλοφορία. Επιπλέον, προκαλώντας αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας διευκολύνει την είσοδο δυνητικά μεταστατικών κυττάρων στην κυκλοφορία 275. Τέλος, λόγω της ικανότητάς του να επάγει τη λεμφαγγειογένεση, δημιουργεί συνθήκες ευνοϊκές για την λεμφαδενική διασπορά της νόσου και την εμφάνιση μεταστάσεων

63 Επιπλέον, η έκφραση του VEGF και των υποδοχέων αυτού έχει συνδεθεί με το βαθμό κακοήθειας, τη διηθητικότητα και τη μεταστατική τάση των νεοπλασμάτων 288, σε ασθενείς με καρκίνωμα στομάχου 289, παχέος εντέρου 290, οισοφάγου 291 και μαστού 282. Στην περίπτωση δε του καρκίνου του μαστού ο VEGF έχει συσχετιστεί και με ταχύτερη εμφάνιση υποτροπής Η αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας, προκαλεί και αυξημένη εξαγγείωση πρωτεϊνών, γεγονός που συμβάλλει στην δημιουργία ινώδους θεμέλιας ουσίας, η οποία υποστηρίζει περαιτέρω το νεο-σχηματισθέν αγγειακό δίκτυο 292. Όπως προαναφέρθηκε, η μεταγραφή του VEGF επάγεται από τις συνθήκες ανοξίας που παρατηρούνται κεντρικά στους όγκους, μέσω ενεργοποίησης του μεσολαβητή HIF-1 275, όπως και μέσω μεταλλάξεων των ογκογονιδίων ras, v-src, fos, raf, erb family και του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 275,293. Αντιθέτως, η έκφραση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Hippel-Lindau, αναστέλλει την παραγωγή του. Πλήθος αυξητικών παραγόντων, ορμονών και φλεγμονωδών κυτοκινών αυξάνουν την συγκέντρωση του VEGF 272. Ταυτόχρονα, οι συνθήκες υποξίας εντός του όγκου και η τοπικώς αυξημένη συγκέντρωση του VEGF προκαλούν ευαισθητοποίηση του υποδοχέα του VEGF 294. Οι Zhang και συνεργάτες 295 παρατήρησαν αυξημένη έκφραση VEGF σε αδενοκυστικά καρκινώματα των σιελογόνων αδένων σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς. Η έκφραση του VEGF είχε ανεξάρτητο προγνωστικό χαρακτήρα και σχετιζόταν με την MVD, το μέγεθος του όγκου, το κλινικό στάδιο, την αγγειακή διήθηση, την υποτροπή και την εμφάνιση απομακρυσμένων μεταστάσεων. Σε μια άλλη μελέτη 296 με 66 καρκινώματα σιελογόνων αδένων, ο VEGF συσχετίστηκε με την εμφάνιση τραχηλικών λεμφαδενικών μεταστάσεων και δυσμενέστερη πρόγνωση. Οι Lim και συνεργάτες 297 μελέτησαν όγκους των σιελογόνων αδένων και επίσης κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ο VEGF συσχετίζεται με την εμφάνιση τραχηλικών λεμφαδενικών μεταστάσεων, όπως και με το μέγεθος του όγκου, την κλινική σταδιοποίηση, την περινευρική και αγγειακή διήθηση, την εμφάνιση υποτροπής και την επιβίωση. Σύμφωνα με τα δεδομένα τους ο VEGF κατείχε σημαντικότερη 63

64 προγνωστική αξία σε σύγκριση με την παρουσία τραχηλικών λεμφαδενικών μεταστάσεων. Επίσης, οι Doi και συνεργάτες 228 παρατήρησαν συσχέτιση του VEGF με την παρουσία μεταλλαγμένου p53 και πιθανή σχέση με την MVD, την ύπαρξη απομακρυσμένων μεταστάσεων και χειρότερη επιβίωση σε ασθενείς με όγκους των σιελογόνων αδένων. Έχει επίσης παρατηρηθεί ότι κύτταρα αδενοκυστικού καρκινώματος με υψηλή μεταστατική τάση παρουσίασαν εντονότερη έκφραση του VEGF, σε σχέση με κυτταρικές σειρές με χαμηλή μεταστατική τάση 298. Σε άλλη μελέτη, σημαντική θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ VEGF και MVD σε βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα, που σχετίζονταν με το κλινικό στάδιο, το βαθμό κακοήθειας και την εμφάνιση υποτροπής, χωρίς σχέση ανεξάρτητου προγνωστικού δείκτη, σε αντίθεση με παραπάνω εργασίες 299. Έντονη ανοσοχρώση του VEGF σε βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα σε σχέση με τους πέριξ υγιείς ιστούς παρατηρήθηκε από τους Younnes και συνεργάτες 300. Στην μελέτη αυτή η αναστολή των υποδοχέων του VEGF και του EGF ανέστειλε την ανάπτυξη του πρωτοπαθούς όγκου και των πνευμονικών μεταστάσεων σε πειραματικά μοντέλα 5.2. Ενδοστατίνη Η Ενδοστατίνη (Εndostatin), αποτελεί έναν από τους ισχυρότερους αντι-αγγειογόνους παράγοντες που έχουν μελετηθεί 301. Πρόκειται για ένα μόριο 20 kda, που αρχικά απομονώθηκε από τον O'Reilly από κύτταρα αιμαγγειοθηλιώματος 185. Σχηματίζεται από το Κολλαγόνο XVIII, με την πρωτεολυτική αποκοπή του καρβοξυτελικού τμήματος του. Παράγεται μέσω της δράσης διαφόρων ενζύμων, όπως της καθεψίνης L και K 302,303, της ελαστάσης 304 και διάφορων μεταλλοπρωτεασών 302,305. Στις δράσεις της Εndostatin περιλαμβάνονται, η αναστολή της μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων , η αναστολή του πολλαπλασιασμού 185,307,309,311,313, η επαγωγή της απόπτωσης του ενδοθηλίου 311,314, η αναστολή της νεοαγγειογένεσης 185,315 και η 64

65 αναστολή της μετανάστευσης των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων (progenitor cells) 316. Διάφορες μελέτες έχουν αποδώσει στην Endostatin αντι-νεοπλασματική δράση καθώς η δράση της έχει συνδεθεί με καταστολή της ανάπτυξης διαφόρων κακοηθειών, όπως πνεύμονα, μαστού, ακανθοκυτταρικών καρκινωμάτων κεφαλής και τραχήλου, λευχαιμίας, νεφρού και γλοιωμάτων σε πειραματικά μοντέλα 185,186,306,310,311,313,317,318. Η αντι-νεοπλασματική δράση αυτή αποδόθηκε στην καταστολή της νεοαγγειογένεσης του όγκου 310,317, όπως και της διηθητικότητας και της μεταστατικότητας 185,307,317. Επίσης, σε πειραματική μελέτη επανειλημμένοι κύκλοι θεραπείας με Endostatin οδήγησαν σε καταστολή της κακοήθειας, χωρίς εμφάνιση υποτροπής 319. Άλλα δεδομένα δείχνουν ότι η αντι-νεοπλασματική αυτή δράση ασκείται όχι μόνο μέσω της αναστολής της αγγειογένεσης, αλλά και δια μέσου άμεσης δράσης στα κακοήθη κύτταρα 186,316. Η παρουσία της Endostatin στους σιελογόνους αδένες, όπως και στους όγκους αυτών, δεν έχει μελετηθεί Κολλαγόνο XVIII Όπως προαναφέρθηκε, η Εndostatin προέρχεται από το Kολλαγόνο XVIII (Collagen XVIII), το οποίο ανήκει σε μια υποοικογένεια πολυπλεξινών 320,321. Το μόριο του Collagen XVIII δομείται από τη χαρακτηριστική τριμερή έλικα του κολλαγόνου, με 10 κολλαγονικές περιοχές διαχωριζόμενες από 11 μη-κολλαγονικά (NC) τμήματα 320. Το NC1 τελικό τμήμα περιέχει την Endostatin 315. Στη Εικόνα 6. αποδίδεται σχηματικά το μόριο του Collagen XVIII. Το Collagen XVIII απαντάται με δύο μορφές, μία βραχεία που συνήθως εντοπίζεται στην αγγειακή και στην επιθηλιακή βασική μεμβράνη και μια μακρά μορφή που συνήθως εντοπίζεται στο ήπαρ 322. Το Collagen XVIII παρατηρείται σε όργανα με έντονη αιμάτωση, όπως το ήπαρ, ο πνεύμονας, ο νεφρός και ο πλακούντας 320, και θεωρείται ότι μετέχει στην δομή ειδικών επιθηλιακών και ενδοθηλιακών βασικών μεμβρανών 322,323,325. Η απουσία του έχει συσχετιστεί με την εμφάνιση οφθαλμικών διαταραχών

66 Η παρουσία του Collagen XVIII στους όγκους των σιελογόνων αδένων, δεν έχει μελετηθεί. Εικόνα 6. Σχηματική παράσταση του μορίου TOY Collagen XVIII 5.4. Πρωτεϊνη Θερμικού Σοκ 47 Η Πρωτεϊνη Θερμικού Σοκ 47 (Heat Shock Protein 47, HSP-47) αναγνωρίστηκε αρχικώς από τους Nagata και συνεργάτες ως μια γλυκοπρωτεϊνη που εκλύεται υπό συνθήκες θερμικού σοκ, με τάση προσκόλλησης σε διάφορα μόρια κολλαγόνου 327. Πρόκειται για μια γλυκοπρωτεΐνη ατομικού βάρους 47kDa που εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Ανήκει στην οικογένεια των serpins και δρα ως εξειδικευμένη σαπερόνη (chaperone) για το προκολλαγόνο 328. Η έκφραση της HSP- 47 παρατηρείται κατά αποκλειστικότητα σε κύτταρα που παράγουν κολλαγόνο 329. Η λειτουργία της είναι απαραίτητη για την ωρίμανση και έκκριση του φυσιολογικού κολλαγόνου, όπως φάνηκε σε knock-out HSP-47 κύτταρα και ποντίκια 330,331. Επάγει την αλληλεπίδραση με αδρανείς αλύσσους προκολλαγόνου 332 καθώς και με πλήρως σχηματισμένες τριμερείς έλικες 333. Η υπερέκφραση της HSP-47 έχει συσχετιστεί με διάφορες παθολογικές καταστάσεις όπου παρατηρείται ίνωση, όπως την αρτηριοσκλήρυνση 334, το έμφραγμα του μυοκαρδίου 335, την ίνωδη εκφύλιση του ήπατος, του νεφρού και του πνεύμονα Επίσης, αυξημένα επίπεδα HSP-47 έχουν εντοπιστεί σε διάφορους όγκους, όπως στο σκιρρώδες καρκίνωμα του στομάχου 339, στο καρκίνωμα του πνεύμονα 340 σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα κεφαλής και τραχήλου 341 σε πορογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος 342, σε οστεοσαρκώματα 343 και σε καρκινώματα σχετιζόμενα με ελκώδη κολίτιδα

67 Η παρουσία της HSP-47 στους όγκους των σιελογόνων αδένων δεν έχει μελετηθεί Παράγοντας VIII (Αντιγόνο Σχετιζόμενο με τον Παράγοντα VIII) Το 1973 οι Bloom και συνεργάτες 345 και ταυτόχρονα οι Hoyer και συνεργάτες 346 εντόπισαν με έμμεσο ανοσοφθορισμό στο αγγειακό ενδοθήλιο καθώς και σε μεγακαρυοκύτταρα και αιμοπετάλια τον Παράγοντα VIII. Ο παράγοντας αυτός κατείχε ιδιαιτέρως σημαντικό ρόλο στην έναρξη των μηχανισμών πήξης του αίματος καθώς και στην λειτουργία των αιμοπεταλίων. Κατόπιν περεταίρω έρευνας, διαπιστώθηκε ότι οι δύο διακριτές αυτές λειτουργίες ελέγχονται από δύο διαφορετικές πρωτεΐνες, οι οποίες όμως κυκλοφορούν ως ενιαίο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα. Το σύμπλεγμα αυτό αποτελείται: i.) από τον Αντι-Αιμοφιλικό Παράγοντα VIII (anti-haemophilia factor VIII, FVIII), και ii.) από το Σχετιζόμενο με τον Παράγοντα VIII Αντιγόνο (Factor VIII Related Antigen, FVIIIR:Ag), γνωστό επίσης και ως Παράγοντα von Willebrand (von Willebrand Factor, Vwf) 347. Το σύμπλεγμα FVIII-FVIIIR:Ag κατέχει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της δράσης των αιμοπεταλίων και του καταρράκτη των μηχανισμών πήξης. Έχει όμως πλέον αποδειχτεί ότι οι παράγοντες FVIII και FVIIIR:Ag αποτελούν προϊόντα διαφορετικών γονιδίων, με διαφορετικές λειτουργίες, παρά το γεγονός ότι η παρουσία και η δράση τους είναι αλληλένδετα συνδεδεμένα 348. O FVIIIR:Ag παράγεται κατά αποκλειστικότητα στα ενδοθηλιακά κύτταρα και σε μεγακαρυοκύτταρα 347, Κατόπιν του σχηματισμού του είτε εκκρίνεται στην κυκλοφορία, είτε αποθηκεύεται ενδοκυτταρίως σε σωματίδια Weibel-Palade. Όταν αποδεσμευτεί στην κυκλοφορία συνδέεται με τον παράγοντα VIII, προστατεύοντάς τον από την πρωτεολυτική διάσπαση Πέραν του φυσιολογικού ρόλου του FVIIIR:Ag στην πήξη παρατηρήθηκαν αυξημένες συγκεντρώσεις του κατόπιν πειραματικών αγγειακών τραυματισμών 356 και 67

68 σε πλήθος παθήσεων , συνήθως σχετιζόμενων με αγγειακή νόσο Αρχικώς, διαπιστώθηκε ότι μετέχει στην αιμορραγική νόσο von Willebrand, εξού και η εναλλακτική ονομασία του. Πλέον έχει συσχετισθεί με τη θρομβωτική θρομβοπενική πορφύρα, διάφορες αγγειακές νόσους και ηπατικές διαταραχές 367. Λόγω της σχεδόν αποκλειστικής εντόπισης του FVIIIR:Ag σε ενδοθηλιακά κύτταρα η διερεύνηση της έκφρασης του έχει χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση νεοπλασμάτων αγγειακής αρχής , για τη μελέτη της νεοπλασματικής αγγειακής διήθησης 370,371 και για τον καθορισμό της κυτταρικής προέλευσης ορισμένων όγκων όπως το σάρκωμα Kaposi 369,370, Πλέον θεωρείται αξιόπιστος δείκτης εντοπισμού ενδοθηλιακών κυττάρων τόσο σε φυσιολογικούς ανθρώπινους και ζώιους ιστούς 347,368, όπως και σε νεοπλασματικούς ιστούς Η ανοσοϊστοχημική εντόπιση του FVIIIR:Ag έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για την ποσοτική καταμέτρηση της αγγειοβρίθειας διαφόρων νεοπλασμάτων Η αποτελεσματικότητα των μετρήσεων αυτών επηρεάζεται βεβαίως από μεθοδολογικές διαφορές, τεχνικές ανάκτησης αντιγόνου και τεχνικές καταμέτρησης των αγγειακών σχηματισμών 201,216,398. Ειδικά στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων το FVIIIR:Ag έχει χρησιμοποιηθεί μαζί με άλλα μόρια για την εκτίμηση της MVD. Όμως, όπως προαναφέρθηκε, δεν έχει καταδειχθεί συσχέτιση μεταξύ της MVD και της κλινικής πορείας του όγκου, όπως και σε όλα τα νεοπλάσματα της κεφαλής και του τραχήλου 203,205,232. Συχνά απαντάται και με την αρχική του ονομασία Παράγοντας VIII (Factor VIII). 68

69 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 69

70 6. ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Υπάρχει πλήθος μορίων με αγγειογόνο και αντι-αγγειογόνο δράση που αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα και το στρώμα και υπό φυσιολογικές συνθήκες βρίσκονται υπό ισορροπία. Κατά την καρκινική εξαλλαγή μπορεί να παρατηρηθεί διαταραχή της ισορροπίας των αγγειογενετικών παραγόντων, αποδίδοντας στα καρκινικά κύτταρα αγγειογενετικό φαινότυπο και επάγοντας την νεοαγγειογένεση στους όγκους στους οποίους αυτή απαιτείται για την συντήρηση τους. Ειδικά όσον αφορά στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων οι μηχανισμοί της νεοαγγειογένεσης δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς και τα υπάρχοντα δεδομένα είναι περιορισμένα. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε σε κακοήθη και καλοήθη νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων: Την ανοσοέκφραση του αγγειογόνου παράγοντα VEGF. Την ανοσοέκφραση του αντι-αγγειογόνου παράγοντα Εndostatin. Την ανοσοέκφραση του Collagen XVIII (πρόδρομο μόριο της Endostatin). Την ανοσοέκφραση της HSP-47, (chaperon-πρωτεϊνη σχετιζόμενη με την παραγωγή της Endostatin). Την αγγειοβρίθεια των νεοπλασμάτων με υπολογισμό της MVD και της έντασης της ανοσοχρώσης του ενδοθηλιακού δείκτη FVIIIR:Ag Τη συσχέτιση της ανοσοέκφρασης των παραπάνω μορίων μεταξύ τους Τη συσχέτιση της ανοσοέκφρασης των παραπάνω μορίων με την MVD Τη συσχέτιση της ανοσοέκφρασης των παραπάνω μορίων με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους των κακόηθων όγκων Σύμφωνα με την υπάρχουσα βιβλιογραφία δεν υπάρχει άλλη εκτενής μελέτη αυτών των παραγόντων στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων ή συγκριτική μελέτη τους μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όγκων των σιελογόνων αδένων. 70

71 7. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ 7.1. Υλικό Το υλικό της παρούσας μελέτης επιλέχθηκε αναδρομικώς από τα αρχεία ασθενών της Γναθοπροσωπικής Κλινικής του Αντικαρκινικού Νοσοκομείου Άγιος Σάββας και του Εργαστηρίου Στοματολογίας, της Οδοντιατρικής Σχολής του Πανεπιστήμιου Αθηνών. Με βάση την πληρότητα των στοιχείων και την επάρκεια του υλικού επιλέχθηκαν συνολικώς 100 περιπτώσεις κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Εν συνεχεία, αναζητήθηκαν οι κύβοι παραφίνης από τα αρχεία των αντίστοιχων Παθολογοανατομικών Εργαστηρίων. Από κάθε κύβο παραφίνης κόπηκαν 7 τομές πάχους 5 μm. Η πρώτη και η τελευταία βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, προς επιβεβαίωση της ορθής ιστολογικής διάγνωσης και της ταξινόμησης κατά WHO 5, καθώς και της υπάρξεως αντιπροσωπευτικού ιστού. Με βάση τα κριτήρια αυτά επιλέχθηκαν τελικώς 79 περιπτώσεις νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων (61 κακοήθεις και 18 καλοήθεις). Αναλυτικά το υλικό περιγράφεται στον Πίνακα 8. Πίνακας 8. Ιστολογικοί τύποι των νεοπλασμάτων που συμπεριλήφθησαν στην μελέτη. Κακοήθη Νεοπλάσματα Καλοήθη Νεοπλάσματα Αδενοκυστικό καρκίνωμα 16 Πλειόμορφο Αδένωμα 13 Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα 12 Όγκος Warthin 5 Πολύμορφο αδενοκαρκίνωμα χαμηλού δυναμικού κακοηθείας 11 Αδενοκαρκίνωμα μη ειδικού τύπου 9 Καρκίνωμα εκφορητικών πόρων των σιελογόνων αδένων 6 Καρκίνωμα προερχόμενο από πλειόμορφο αδένωμα 3 Λεμφοεπιθηλιακό καρκίνωμα 2 Μυοεπιθηλιακό καρκίνωμα 1 Διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα, μη ειδικού τύπου 1 Σύνολο 61 Σύνολο 18 71

72 7.2. Ανοσοϊστοχημική τεχνική Η ανοσοϊστοχημική τεχνική στις τομές παραφίνης, για τα υπό διερεύνηση μόρια εφαρμόσθηκε ως εξής: Για τον εντοπισμό του Collagen XVIII και της Εndostatin παράχθηκαν αντισώματα έναντι των συνθετικών πεπτιδίων των αντίστοιχων μορίων, στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του University of Maryland, ΗΠΑ. Για το Collagen XVIII παράχθηκε αντίσωμα έναντι του πεπτιδίου CLDEEGDDSDGAFGD ( ). Η αλληλουχία αυτή των αμινοξέων είναι συχνή και στην μακρά και στη βραχεία μορφή του Collagen XVIII. Για την Εndostatin παράχθηκε αντίσωμα και κατά του πεπτιδίου GSDPNGRRLTESYCE ( ), μια αλληλουχία που είναι χαρακτηριστική του μορίου της Εndostatin. Αμφότερα τα μόρια υπεβλήθησαν σε διαχωρισμό και καθαρισμό με τη βοήθεια χρωματογραφίας συγγένειας (affinity chromatography) χρησιμοποιώντας Collagen XVIII Sepharose 4B (Sigma, St Louis, MO, USA) ή Sepharose 4B, αντιστοίχως, και σύζευξη με αιμοκυανίνη (keyholelimpet hemocyanin, Sigma). Τα παραπάνω αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις 1:200. Για την HSP47 χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα SPA-470 (StressGen, Victoria, Canada), σε συγκέντρωση 1:500. Για το VEGF χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα της Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) σε αραίωση 1:100. Για τον FVIIIR:Ag χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα της Dako (Copenhagen, Denmark), σε αραίωση 1:100. Για τα αντισώματα Collagen XVIII, Endostatin, και HSP47 χρησιμοποιήθηκαν τομές παραφίνης 5-μm, οι οποίες αρχικώς αποπαραφινώθηκαν μέσω ξυλόλης και κατόπιν ενυδατώθηκαν με κατιούσα κλίμακα αιθυλικής αλκοόλης. Ακολούθησε ανάκτηση αντιγονικότητας με τη χρήση 200 ml διαλύματος Target Retrieval Solution, ph 6.0 (DAKO, Carpinteria, CA, USA), για 20 mins στους 100 C. Κατόπιν τα πλακίδια αφέθησαν να ψυχθούν για 20 mins και εξουδετερώθηκε η ενδογενής υπεροξειδάση με διάλυμα Η %. Στη συνέχεια, οι τομές επωάσθηκαν με τα αντίστοιχα αντισώματα, για 60 mins με τη χρήση αυτοματοποιημένου συστήματος slide stainer (Ventana ES 72

73 Slide Staining System, Ventana, Tucson, AZ, USA). Εν συνεχεία, οι τομές επωάσθηκαν με το δευτερογενές βιοτινυλωμένο αντίσωμα (VIEW DAB Detection Kit, Ventana, για Collagen XVIII, Endostatin, και HSP47). Κατόπιν, χρησιμοποιήθηκε σύμπλεγμα αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (Ventana). Τέλος, τα πλακίδια επωάσθηκαν με διάλυμα 3,3 διαμινοβενζίδης (DAB) (Ventana) και βάφτηκαν με αιματοξυλίνη Harris. Για τον VEGF, τα πλακίδια αρχικώς αποπαραφινώθηκαν και ενυδατώθηκαν κατά την προαναφερθείσα διαδικασία. Κατόπιν έγινε ανάκτηση της αντιγονικότητας μέσω τοποθέτησης τους σε διάλυμα κιτρικού οξέος (ph 6.0) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) στο φούρνο μικροκυμάτων (ισχύς 800 W, 2 κύκλοι των 15 min). Εν συνεχεία, εξουδετερώθηκε η ενδογενής υπεροξειδάση με διάλυμα 3% Η για 20 mins. Κατόπιν, επωάστηκαν επί 60 min στους 37 ο C με το πρωτογενές αντίσωμα. Στη συνέχεια, επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα για 30 mins (Zymed, San Francisco, USA). Τέλος, ετέθη Streptavidin-HRP (Zymed; ) για 30 mins και οι τομές επωάσθηκαν με διάλυμα DAB και βάφτηκαν με αιματοξυλίνη Harris. Το αντίσωμα κατά του FVIIIR:Ag, (Dako, Copenhagen, Denmark) χρησιμοποιήθηκε βάσει των οδηγιών του κατασκευαστή. Χρησιμοποιήθηκαν τομές παραφίνης που ετέθησαν σε ξυλόλη και κατόπιν κλίμακα αλκοόλης. Ακολούθησε θρυψινισμός τομών με διάλυμα θρυψίνης (Sigma, USA) για 10 mins. Κατόπιν εξουδετερώθηκε η ενδογενής υπεροξειδάση με επώαση των τομών σε διάλυμα 0.3% Η για 30 mins. Στη συνέχεια, οι τομές ετέθησαν σε 2% φυσιολογικό ορό για 30 mins. Κατόπιν επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα για 60 mins σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως, επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένη anti-rabbit ανοσοσφαιρίνη (συγκέντρωση 1:400) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Ακολούθησε επώαση με το σύμπλεγμα avidin-biotin (Vector Laboratories kit). Τέλος, τα πλακίδια επωάσθηκαν με διάλυμα DAB και βάφτηκαν με αιματοξυλίνη Harris. Για κάθε αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε και ένας γνωστός θετικός μάρτυρας, ώστε να επιβεβαιωθεί η σωστή χρώση. Συγκεκριμένα για τα VEGF, Endostatin, Collagen XVIII και HSP-47 χρησιμοποιήθηκαν τομές ακανθοκυτταρικού καρκινώματος στόματος με γνωστή θετικότητα για τα αντίστοιχα αντισώματα, από υλικό από προηγούμενη σχετική μελέτη. Για τον FVIIIR:Ag χρησιμοποιήθηκαν τομές από 73

74 αιμαγγείωμα. Επίσης, για κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες, ιστικές τομές που δεν είχαν επωαστεί με το πρωτογενές αντίσωμα. Οι χρώσεις των Collagen XVIII, Εndostatin, HSP47, του VEGF και του FVIIIR:Ag πραγματοποιήθηκαν σε συνεργασία με το Department of Diagnostic Sciences and Pathology της Οδοντιατρικής Σχολής του University of Maryland, ΗΠΑ Αξιολόγηση ανοσοϊστοχημικών χρώσεων Η αξιολόγηση των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων για το Collagen XVIII, την Εndostatin, την HSP47 και τον VEGF έγινε από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές (ΝΝ, ΒΠ) με εκπαίδευση στην ιστοπαθολογία των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Σε περίπτωση απόκλισης, έγινε εκ νέου, από κοινού αξιολόγηση της περίπτωσης μέσω μικροσκοπίου διπλής παρατήρησης. Σε κάθε περιστατικό παρατηρήθηκαν τουλάχιστον 20 οπτικά πεδία υψηλής μεγέθυνσης. Αξιολογήθηκαν η θετικότητα και η ένταση της χρώσης και η ανοσοέκφραση ταξινομήθηκε στις εξής κατηγορίες: i) Αναλόγως με το ποσοστό των θετικών κυττάρων: -βαθμού 0 (αρνητικό), 0-5% ποσοστό θετικών κυττάρων -βαθμού 1, >5-20% ποσοστό θετικών κυττάρων -βαθμού 2, >20-50% ποσοστό θετικών κυττάρων -βαθμού 3, >50% ποσοστό θετικών κυττάρων ii) Ανάλογα με την ένταση της χρώσης: -βαθμού 0, (αρνητική) -βαθμού 1, ήπια χρώση -βαθμού 2, μέτρια χρώση -βαθμού 3, έντονη χρώση 74

75 Για κάθε περίπτωση έγινε άθροιση των βαθμών ποσοστού και έντασης της χρώσης και υπολογίστηκε το συνολικό σκορ ανοσοχρώσης (0, 2-6). Η αξιολόγηση της αγγειοβρίθειας των όγκων έγινε με καταμέτρηση των αγγείων (όπως αυτά σημάνθηκαν από τον ενδοθηλιακό δείκτη FVIIIR:Ag) και υπολογισμό της MVD, καθώς και με αξιολόγηση της εντάσεως της χρώσης του FVIIIR:Ag. Η αξιολόγηση της ανοσοχρώσης του FVIIIR:Ag έγινε με τη χρήση Ημιαυτόματου Συστήματος Ανάλυσης Εικόνας (Semi automated Ιmage Analysis System). Χρησιμοποιήθηκε υπολογιστής με επεξεργαστή Intel Pentium IV, φωτογραφική μηχανή Microwave Systems Framebragger Matrox II (με ανάλυση 800X600), Μικροσκόπιο Olympus BX-50. Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν Image Pro Plus version 3.0-Media Cybernetics 1997, σε περιβάλλον Windows XP (Microsoft, USA). Για τον καθορισμό του χρωματικού εύρους πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις επί της ψηφιοποιημένης εικόνας του οπτικού πεδίου του μικροσκοπίου, μέσω αντίστοιχης μακροεντολής, δομημένης σε γλώσσα Basic. Κατά τη μέτρηση η αναλογική εικόνα του μικροσκοπίου ψηφιοποιείται, και οι μετρούμενοι χώροι σημαίνονται με κόκκινο χρώμα, ώστε πριν εξαχθεί το τελικό αποτέλεσμα να έχει τη δυνατότητα ο χειριστής να παρέμβει μέσω προσθήκης ή αφαίρεσης περιοχών ενδιαφέροντος, τους οποίους αγνόησε ή υπερεκτίμησε το σύστημα (Εικόνα 7). Οι μετρήσεις πραγματοποιούνται σε μεγάλη μεγέθυνση, σε σταθερό πλαίσιο μέτρησης ( ενεργό κάδρο -active window), το οποίο είχε συγκεκριμένη επιφάνεια (68000μm 2 ) Η MVD υπολογίστηκε με τη χρήση αγγειακών Hot-Spots, με βάση τις αρχές που διατύπωσε ο Weidner το Σε κάθε πλακίδιο επιλέχθηκαν 5 αντιπροσωπευτικές περιοχές μεγάλης αγγειοβρίθειας ( Hot-Spots ) υπό μικρή μεγέθυνση. Κατόπιν σε μεγαλύτερη μεγέθυνση (200x) μετρήθηκε ο αριθμός των αγγείων (objects) ανά σταθερό παράθυρο και κατόπιν υπολογίστηκε ο μέσος όρος αγγείων ανά σταθερό παράθυρο. Για τον υπολογισμό της ένταση της χρώσης του FVIIIR:Ag μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα (Optical Density) της χρώσης. Κατά τον υπολογισμό της οπτικής πυκνότητας σε κάθε εικονοστοιχείο (pixel) αποδίδεται μια τιμή του χρωματικού 75

76 α β β γ Εικόνα 7. Υπολογισμός MVD σε νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων: α) Χρώση FVIIIR:Ag στο αγγειακό ενδοθήλιο, β) Σήμανση αγγείων, γ) Τελικές μετρήσεις 76

77 φάσματος του καφέ -λόγω του χρωμογόνου DAB- κατά το πρότυπο ανάλυσης βασικών χρωμάτων RGB (Red/Green/Blue). Οι τιμές και οι αντίστοιχες χρώσεις κυμαίνονται σε μια κλίμακα 256 διαβαθμίσεων που ξεκινάει από το 0 (απόλυτο μαύρο-έντονη χρώση) έως το 255 (απόλυτο λευκό-απουσία χρώσης). Δηλαδή τιμές κοντά στο 0 αντιστοιχούν σε υψηλή οπτική πυκνότητα, δηλαδή έντονη χρώση, άρα αυξημένη αγγειοβρίθεια, ενώ τιμές κοντά στο 255 αντιστοιχούν σε χαμηλή οπτική πυκνότητα, δηλαδή ασθενή χρώση και χαμηλή αγγειοβρίθεια. Κατά τον τρόπο αυτό οι μετρούμενες τιμές της Οπτικής Πυκνότητας (Optical Density) είναι αντίστροφες της αγγειοβρίθειας. Η ικανότητα του συστήματος να διακρίνει μεγάλο εύρος τιμών χρωμάτων σε συνδυασμό με τη δυνατότητα περαιτέρω μεγέθυνσης (zoom) του χειριστή, οδηγεί σε αντικειμενικότερους υπολογισμούς, με σταθερά και αναπαράξιμα αποτελέσματα. Επίσης, συνδυασμός σωστής μακροεντολής, ποιότητας κεχρωσμένου πλακιδίου (καθαρότητα-ειδικότητα ανοσοϊστοχημικής χρώσης) και εμπειρίας του χρήστη μειώνουν σημαντικά την πιθανότητα στατιστικού σφάλματος Στατιστική Ανάλυση Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του λογισμικού IBM Statistics 20 (πρώην Statistical Package for Social Studies-SPSS). Χρησιμοποιήθηκαν καταλλήλως οι δοκιμασίες ANOVA, x 2, t test, univariate analysis και correlation. Η στατιστική δοκιμασία ΑΝΟVA χρησιμοποιήθηκε για τη συσχέτιση της έκφρασης των μορίων με τα κλινικοπαθολογοανατομικά δεδομένα των κακοήθων όγκων, δηλαδή το στάδιο κατά Τ (Τ1-Τ4), τη σταδιοποίηση με βάση το σύστημα ΤΝΜ (Ι- ΙV), το βαθμό κακοήθειας των νεοπλασμάτων (χαμηλής μέσης και υψηλής), την παρουσία ή απουσία περινευρικών/αγγειακών/λεμφαγγειακών διηθήσεων μέσα στον όγκο, καθώς και την έξωπαρεγχυματική επέκταση του όγκου (παρουσία/απουσία). Κατόπιν, έγινε σύγκριση της ανοσοέκφρασης των 4 μορίων (VEGF, Endostatin, Collagen XVIII και HSP47), καθώς και της MVD και της Optical Density του FVIIIR:Ag μεταξύ των κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων. 77

78 Η σύγκριση έγινε ως προς τη θετικότητα (με διαβάθμιση από 0 ως 3), την ένταση (επίσης με διαβάθμιση από 0 ως 3), αλλά και ως προς το συνολικό σκορ της ανοσοχρώσης (με διαβάθμιση 0, 2-6), το οποίο προκύπτει από το άθροισμα των δύο. Η σύγκριση της θετικότητας και της έντασης της ανοσοχρώσης των 4 μορίων, λόγω της φύσης της κατανομής των δεδομένων, έγινε με σύμπτυξη σε τετράπτυχο πίνακα και διαχωρισμό των απαντήσεων σε δύο ομάδες, μικρή (0, 1) και μεγάλη (2, 3) έκφραση. Ως εκ τούτου η σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων έγινε με τη χρήση της στατιστικής δοκιμασίας x 2. Η σύγκριση του συνολικού σκορ ανοσοχρώσης έγινε με τη χρήση της στατιστικής δοκιμασίας t test, λόγω της διάταξης των αποτελεσμάτων, μετά τον έλεγχο των σχετικών προϋποθέσεων. Επίσης, με το t test πραγματοποιήθηκαν οι συγκρίσεις της MVD και της Optical Density του FVIIIR:Ag. Ο έλεγχος της συσχέτισης της ανοσοέκφρασης των 4 μορίων (VEGF, Endostatin, Collagen XVIII, HSP47) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της στατιστικής δοκιμασίας univariate analysis. Ο έλεγχος της συσχέτισης των δεικτών αγγειοβρίθειας (MVD και της Optical Density του FVIIIR:Ag) και της ανοσοέκφρασης των 4 μορίων (VEGF, Endostatin, Collagen XVIII, HSP47) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της στατιστικής δοκιμασίας univariate correlation. Ως επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε το 5% (p value <0,05). 78

79 8. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 8.1. Δημογραφικά στοιχεία Η κατανομή των περιπτώσεων της μελέτης στα δυο φύλα, εμφανίζεται υπέρ των γυναικών. Συγκεκριμένα, το ποσοστό των γυναικών είναι 54.4% (43) ενώ οι άνδρες συμμετέχοντες είναι το 43.6% (36) (Διάγραμμα 1). Άνδρες 43.6% (36) Γυναίκες 54.4% (43) Διάγραμμα 2. Κατανομή περιπτώσεων ανά φύλο Η ηλικιακή κατανομή του δείγματος σε συνδυασμό με το φύλο είναι η ακόλουθη (Πίνακας 9) Πίνακας 9. Σχέση Ηλικίας και φύλου στο δείγμα της μελέτης Ηλικία (έτη) Σύνολο < >65 Φύλο Γυναίκα Άνδρας Σύνολο

80 Η κατανομή των περιπτώσεων, ανά φύλο σε κακοήθη και καλοήθη νεοπλάσματα ξεχωριστά φαίνεται στα κάτωθι γραφήματα. Το 35.5% των περιπτώσεων κακοήθων νεοπλασμάτων και το 10.1% των καλοήθων νεοπλασμάτων είναι άνδρες. Επίσης, το 41.7% των κακοήθων και το 12.7% και των καλοήθων είναι γυναίκες. (Διάγραμμα 2) Κακοήθη Νεοπλάσματα Καλοήθη Νεοπλάσματα Άνδρες 35.44% Γυναίκες 41.77% Άνδρες 10.13% Γυναίκες 12.68% Διάγραμμα 2. Κατανομή περιπτώσεων ανά φύλο 8.2. Ιστοπαθολογικά στοιχεία Η σύνθεση του δείγματος και η κατανομή των ιστολογικών τύπων σε σχέση με την ηλικία φαίνεται στον Πίνακα 10. Η μεγαλύτερη ομάδα είναι τα αδενοκυστικά καρκινώματα, στην ηλικιακή ομάδα Το εύρημα αυτό είναι αναμενόμενο με δεδομένο ότι τα αδενοκυστικά καρκινώματα είναι η συχνότερη ομάδα του δείγματος. Τα κλινικοπαθολογοανατομικά δεδομένα και η σταδιοποίηση κατά το σύστημα ΤΝΜ των κακοήθων όγκων καταγράφηκαν σύμφωνα με τις τρέχουσες σχετικές κατευθυντήριες γραμμές 5,37. Το μέγεθος του όγκου κατηγοριοποιήθηκε σύμφωνα με το ΤΝΜ σύστημα, με αποτέλεσμα από τους 61 ασθενείς με κακοήθεις όγκους, οι 22 (34,4%) να χαρακτηρίζονται ως σταδίου Τ1, οι 17 Τ2(26,6%), οι 15 Τ3 (23,4%) και οι 7 Τ4 (10,9%). Η μεγάλη πλειοψηφία (58 από τους 61, 95,3%), δεν εμφάνισαν τραχηλικές μεταστάσεις (Ν0). Μόνο δύο ασθενείς κατατάχθηκαν στην κατηγορία Ν2 και ένας στη Ν1. Επίσης, κανείς ασθενής δεν εμφάνισε απομακρυσμένες μεταστάσεις και ως εκ τούτου χαρακτηρίστηκε ως Μ0. 80

81 Τα δεδομένα αυτά κατέστησαν απαγορευτική τη στατιστική σύγκριση ως προς τα Ν και Μ, λόγω απουσίας δύο ομάδων στη μία περίπτωση και τεράστιας διαφοράς στον αριθμό παρατηρήσεων στην άλλη (58 έναντι 3). Ταυτόσημη κατανομή υπήρξε και ως προς το ΤΝΜ stage, καθώς οι 3 ασθενείς με τραχηλικούς λεμφαδένες ήταν ήδη σταδίου Τ4, και επομένως δεν μεταβλήθηκε η κατάταξή τους ως προς το συνολικό ΤΝΜ stage. Όσον αφορά στον βαθμό κακοηθείας οι 15 ασθενείς ήταν χαμηλής, ποσοστό %, οι 27 μέσης (44,26%) και οι 19 υψηλής (31,14%). Αναφορικά με τα παρουσία αγγειακής/περινευρικής/λεμφαγγειακής διήθησης εντός του νεοπλάσματος ευρήματα δεν παρατηρήθηκαν σε 52 ασθενείς (82,1%) και παρατηρήθηκαν 9 (14,8%). Τέλος, όσον αφορά στην εξωπαρεγχυματική επέκταση ήταν θετικό σε 19 ασθενείς (31.14%) και αρνητικό σε 42 (68,85%). Κακοήθη Νεοπάσματα Καλοήθη Νεοπάσματα Πίνακας 10. Η σύνθεση του δείγματος της μελέτης ανάλογα με την ηλκία των ασθενών Σύνολο < >65 Αδενοκυστικό καρκίνωμα Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα Πολύμορφο αδενοκαρκίνωμα χαμηλού δυναμικού κακοηθείας Αδενοκαρκίνωμα μη ειδικού τύπου Καρκίνωμα εκφορητικών πόρων των σιελογόνων αδένων Καρκίνωμα προερχόμενο από πλειόμορφο αδένωμα Λεμφοεπιθηλιακό καρκίνωμα Μυοεπιθηλιακό καρκίνωμα Διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα, μη ειδικού τύπου Πλειόμορφο Αδένωμα Όγκος Warthin Σύνολο 79 81

82 8.3. Ανοσοϊστοχημικά αποτελέσματα VEGF Κακοήθη νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων Ο VEGF εκφράστηκε στο 83.6% (n=51) των περιπτώσεων, με το 73.77% (n=45) να εμφανίζει βαθμού 3 θετικότητα και στο 37.7% (n=23) να παρατηρείται ένταση ανοσοχρώσης βαθμού 3. Το 37.7% (n=23) των περιπτώσεων εμφάνισαν συνολικό σκορ ανοσοχρώσης 6 (Εικόνα 8α-γ). Στον Πίνακα 11 παρατίθενται αναλυτικά οι βαθμολογίες ανά κατηγορία Πίνακας 11. VEGF, κατανομή βαθμολογίας στα κακοήθη νεοπλάσματα Θετικότητα Ένταση Συνολικό Σκορ Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό % % % % % % % % % % % % % % 82

83 Καλοήθη νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων Ο VEGF εκφράστηκε στο 94.44% (n=17) των περιπτώσεων, με το 72.22% (n=13) των περιπτώσεων να εμφανίζει βαθμού 3 θετικότητα και στο 44.44% (n=8) να παρατηρείται ένταση ανοσοχρώσης βαθμού 2. Το 33.33% (n=6) των περιπτώσεων εμφάνισαν συνολικό σκορ ανοσοχρώσης 5 (Εικόνα 8δ-στ). Στον Πίνακα 12 παρατίθενται αναλυτικά οι βαθμολογίες ανά κατηγορία Πίνακας 12. VEGF, κατανομή βαθμολογίας στα καλοήθη νεοπλάσματα Θετικότητα Ένταση Συνολικό Σκορ Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό % % % % % % % % % % % % % % 83

84 α β γ δ ε στ Εικόνα 8. Χρώση VEGF σε νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων: α) Αδενοκυστικό καρκίνωμα έντονης εντάσεως χρώση (x200), β) Αδενοκυστικό καρκίνωμα με αρνητική χρώση (x200), γ) Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα με έντονη χρώση (x200), δ) Πλειόμορφο αδένωμα με έντονη χρώση (x200), ε) Πλειόμορφο αδένωμα με μέτριας εντάσεως χρώση (x200), στ) Όγκος Warthin με έντονη χρώση (x100). 84

85 Endostatin Κακοήθη νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων H Endostatin εκφράστηκε στο 91.8% (n=56) των περιπτώσεων, με όλες τις περιπτώσεις (91,8%, n=56) να εμφανίζουν βαθμού 3 θετικότητα και στο 36.06% (n=22) να παρατηρείται ένταση ανοσοχρώσης βαθμού 1. Το 36.06% (n=22) των περιπτώσεων εμφάνισαν συνολικό σκορ ανοσοχρώσης 4 (Εικόνα 9α-δ). Στον Πίνακα 13 παρατίθενται αναλυτικά οι βαθμολογίες ανά κατηγορία Πίνακας 13. Endostatin, κατανομή βαθμολογίας στα κακοήθη νεοπλάσματα Θετικότητα Ένταση Συνολικό Σκορ Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό % % % 1 0 0% % 2 0 0% 2 0 0% % 3 0 0% % % % % % 85

86 Καλοήθη νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων H Endostatin εκφράστηκε στο 100% (n=18) των περιπτώσεων, με όλες τις περιπτώσεις (100%, n=18) να εμφανίζουν βαθμού 3 θετικότητα και στο 66.66% (n=12) να παρατηρείται ένταση ανοσοχρώσης βαθμού 3. Το 66.66% (n=12) των περιπτώσεων εμφάνισαν συνολικό σκορ ανοσοχρώσης 6 (Εικόνα 9ε-στ). Στον Πίνακα 14 παρατίθενται αναλυτικά οι βαθμολογίες ανά κατηγορία Πίνακας 14. Endostatin, κατανομή βαθμολογίας στα καλοήθη νεοπλάσματα Θετικότητα Ένταση Συνολικό Σκορ Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό 0 0 0% 0 0 0% 0 0 0% 1 0 0% 1 0 0% 2 0 0% 2 0 0% % 3 0 0% % % 4 0 0% % % 86

87 α β γ δ ε στ Εικόνα 9. Χρώση Endostatin σε νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων: α) Αδενοκυστικό καρκίνωμα έντονης εντάσεως χρώση (x200), β) Αδενοκυστικό καρκίνωμα με ασθενή χρώση (x200), γ) Αδενοκαρκίνωμα μη ειδικού τύπου με αρνητική χρώση (x200, δ) Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα με έντονη χρώση (x200), ε) Πλειόμορφο αδένωμα με έντονη χρώση (x200), στ) Όγκος Warthin με έντονη χρώση (x100). 87

88 Collagen XVIII Κακοήθη νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων To Collagen XVIII εκφράστηκε στο 100% (n=61) των περιπτώσεων, με όλες τις περιπτώσεις να εμφανίζουν βαθμού 3 θετικότητα και στο 44.26% των περιπτώσεων (n=27) να παρατηρείται ένταση ανοσοχρώσης βαθμού 3 και συνολικό σκορ ανοσοχρώσης 6 (Εικόνα 10α-δ). Στον Πίνακα 15 παρατίθενται αναλυτικά οι βαθμολογίες ανά κατηγορία Πίνακας 15. Collagen XVIII, κατανομή βαθμολογίας στα κακοήθη νεοπλάσματα Θετικότητα Ένταση Συνολικό Σκορ Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό 0 0 0% 0 0 0% 0 0 0% 1 0 0% % 2 0 0% 2 0 0% % 3 0 0% % % % % % 88

89 Καλοήθη νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων To Collagen XVIII εκφράστηκε στο 100% (n=18) των περιπτώσεων, με όλες τις περιπτώσεις (100%, n=18) να εμφανίζουν βαθμού 3 θετικότητα και στο 83.33% (n=15) να παρατηρείται ένταση ανοσοχρώσης βαθμού 3. Το 83.33% (n=15) των περιπτώσεων εμφάνισαν συνολικό σκορ ανοσοχρώσης 6 (Εικόνα 10ε-στ). Στον Πίνακα 16 παρατίθενται αναλυτικά οι βαθμολογίες ανά κατηγορία Πίνακας 16. Collagen XVIII, κατανομή βαθμολογίας στα καλοήθη νεοπλάσματα Θετικότητα Ένταση Συνολικό Σκορ Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό 0 0 0% 0 0 0% 0 0 0% 1 0 0% 1 0 0% 2 0 0% 2 0 0% % 3 0 0% % % 4 0 0% % % 89

90 α β γ δ ε στ Εικόνα 10. Χρώση Collagen XVIII σε νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων: α) Αδενοκυστικό καρκίνωμα έντονης εντάσεως χρώση (x200), β) Αδενοκυστικό καρκίνωμα με ασθενή χρώση (x200), γ) Αδενοκαρκίνωμα μη ειδικού τύπου με ασθενή χρώση (x200), δ) Πολύμορφο αδενοκαρκίνωμα χαμηλού δυναμικού κακοηθείας με έντονη χρώση (x200), ε) Πλειόμορφο αδένωμα με έντονη χρώση (x200), στ) Όγκος Warthin με έντονης εντάσεως χρώση (x100), 90

91 HSP47 Κακοήθη νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων H HSP47 εκφράστηκε στο 78.68% (n=48) των περιπτώσεων, με 72.13% (n=44) των περιπτώσεων να εμφανίζουν βαθμού 3 θετικότητα και στο 27.86% των περιπτώσεων (n=17) να παρατηρείται ένταση ανοσοχρώσης βαθμού 3 και συνολικό σκορ ανοσοχρώσης 6. Στον Πίνακα 17 παρατίθενται αναλυτικά οι βαθμολογίες ανά κατηγορία Πίνακας 17. HSP47, κατανομή βαθμολογίας στα κακοήθη νεοπλάσματα Θετικότητα Ένταση Συνολικό Σκορ Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό % % % % % % % % % % % % % 91

92 Καλοήθη νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων H HSP47 εκφράστηκε στο 100% (n=18) των περιπτώσεων με όλες τις περιπτώσεις να να εμφανίζουν βαθμού θετικότητα 3, στο 27.77% των περιπτώσεων (n=5) παρατηρήθηκε ένταση ανοσοχρώσης βαθμού 2 και το 50% των περιπτώσεων (n=9) εμφάνισαν συνολικό σκορ ανοσοχρώσης 6. Στον Πίνακα 18 παρατίθενται αναλυτικά οι βαθμολογίες ανά κατηγορία Πίνακας 18. HSP47, κατανομή βαθμολογίας στα καλοήθη νεοπλάσματα Θετικότητα Ένταση Συνολικό Σκορ Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό Βαθμός n Ποσοστό 0 0 0% 0 0 0% 0 0 0% 1 0 0% % 2 0 0% 2 0 0% % 3 0 0% % % % % 92

93 α β γ δ ε στ Εικόνα 11. Χρώση HSP-47 σε νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων: α) Αδενοκυστικό καρκίνωμα με έντονη χρώση (x200), β) Καρκίνωμα εκφορητικών πόρων σιελογόνων αδένων με έντονη χρώση (x200), γ) Πολύμορφο αδενοκαρκίνωμα χαμηλού δυναμικού κακοηθείας με ασθενή χρώση (x200), δ) Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα με αρνητική χρώση (x200), ε) Πλειόμορφο αδένωμα με έντονη χρώση (x200), στ) Όγκος Warthin με έντονης εντάσεως χρώση (x100). 93

94 Factor VIII Related Antigen Κακοήθη νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων Με βάση την τεχνική που περιγράφτηκε παραπάνω υπολογίστηκε η MVD ως μέσος όρος αγγείων ανά σταθερό παράθυρο. Οι κακοήθεις όγκοι παρουσίασαν μέσο όρο MVD 10,64. Αναλυτικά ο μέσος όρος MVD κατά φθίνουσα σειρά ήταν 16 για τα αδενοκυστικά καρκινώματα, 12,6 για τα καρκινώματα εκφορητικών πόρων των σιελογόνων αδένων, 11.8 για το διαυγοκυτταρικό καρκινώμα μη εδικού τύπου, 10,8 για τα βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα, 10,4 για το μυοεπιθηλιακό καρκίνωμα, 8,95 για τα αδενοκαρκίνωματα μη ειδικού τύπου, 8,9 για τα πολύμορφα αδενοκαρκινώματα χαμηλού δυναμικού κακοηθείας, 8,5 για τα λεμφοεπιθηλιακά καρκινώματα και 7,86 για το καρκίνωμα προερχόμενο από πλειόμορφο αδένωμα (Εικόνα 12α-γ). Επίσης, μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα της ανοσοχρώσης του FVIIIR:Ag, η οποία κατά φθίνουσα σειρά ήταν 146,836 για τα λεμφοεπιθηλιακά καρκινώματα, 129,936 για τα αδενοκυστικά καρκινώματα, 123,153 για το μυοεπιθηλιακό καρκίνωμα, 120,227 για τα καρκινώματα εκφορητικών πόρων των σιελογόνων αδένων, 116,764 για τα βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα, 109,449 για τα αδενοκαρκίνωματα μη ειδικού τύπου, 107,545 για το διαυγοκυτταρικό καρκινώμα μη εδικού τύπου, 105,935 για το καρκίνωμα προερχόμενο από πλειόμορφο αδένωμα και τέλος για τα πολύμορφα αδενοκαρκινώματα χαμηλού δυναμικού κακοηθείας. Δεδομένου ότι η οπτική πυκνότητα μετρά το λευκό και είναι αντίστροφη της έντασης της ανοσοχρώσης του FVIIIR:Ag, τα πολύμορφα αδενοκαρκινώματα χαμηλού δυναμικού κακοηθείας παρουσίαζαν την εντονότερη ανοσοχρώση και τα λεμφοεπιθηλιακά καρκινώματα την μικρότερη. Καλοήθεις Όγκοι Σιελογόνων Αδένων: Οι καλοήθεις όγκοι παρουσίασαν μέσο όρο MVD 12,0 (αγγεία ανά σταθερό παράθυρο ) με τους όγκους Warthin να έχουν μέσο όρο 11,1 και τα πλειόμορφα αδενώματα 12.9 (Εικόνα 12δ-στ). 94

95 Επίσης η οπτική πυκνότητα ήταν 138 για τους όγκους Warthin και 141,476 για τα πλειόμορφα αδενώματα, άρα οι όγκοι Warthin είχαν μεγαλύτερη ένταση ανοσοχρώσης. α β γ δ ε στ Εικόνα 12. Χρώση FVIIIR:Ag σε νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων: α) Αδενοκυστικό καρκίνωμα (x400), β) Αδενοκαρκίνωμα μη ειδικού τύπου (x400), γ) Βλεννοεπιδερμοειδές καρκίνωμα (x100), δ) Πλειόμορφο αδένωμα (x100), ε) Όγκος Warthin (x100), στ) Όγκος Warthin (x400). 95

96 8.4. Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων Σύγκριση της έκφρασης των μορίων VEGF, Endostatin, Collagen XVIII και HSP47, καθώς και της αγγειοβρίθειας (MVD, οπτική πυκνότητα FVIIIR:Ag) σε κακοήθεις όγκους, με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά τους. Η σύγκριση αυτή έγινε με βάση τα ιστολογικά χαρακτηριστικά, το στάδιο κατά ΤΝΜ, το βαθμό διαφοροποίησης, την παρουσία περινευρικών/αγγειακών/λεμφαγγειακών διηθήσεων εντός του όγκου και την εξωπαρεγχυματική διασπορά. H σύγκριση ως προς Ν και Μ δεν ήταν δυνατό να γίνει λόγω πολύ μικρού αριθμού παρατηρήσεων (3 και 1 αντίστοιχα). Χρησιμοποιήθηκαν οι στατιστικές δοκιμασίες ANOVA και t test. Ως προς το στάδιο κατά ΤΝΜ (Ι-ΙV), η σύγκριση με τις συνολικές τιμές της ανοσοέκφρασης ανέδειξε θετική συσχέτιση με την έκφραση του VEGF. Τα αποτελέσματα συνοπτικά παρουσιάζονται στον Πίνακα 19. Πίνακας 19. Σύγκριση ως προς το κλινικό στάδιο κατά ΤΝΜ Mόριο P value Στατιστικά σημαντική συσχέτιση VEGF 0,00005 Ναι Endostatin 0,86 Όχι Collagen XVIII 0,77 Όχι HSP47 0,52 Όχι MVD 0,79 Όχι F8 Οπτική Πυκνότητα 0,69 Όχι Ως προς το βαθμό κακοήθειας, η σύγκριση με τις συνολικές τιμές της ανοσοέκφρασης δεν ανέδειξε κάποια στατιστική συσχέτιση. Τα αποτελέσματα συνοπτικά παρουσιάζονται στον Πίνακα

97 Πίνακας 20. Σύγκριση ως προς το βαθμό κακοήθειας Mόριο P value Στατιστικά σημαντική συσχέτιση VEGF 0,38 Όχι Endostatin 0,28 Όχι Collagen XVIII 0,16 Όχι HSP47 0,66 Όχι MVD 0,69 Όχι F8 Οπτική Πυκνότητα 0,79 Όχι Ως προς την παρουσία περινευρικών/αγγειακών/λεμφαγγειακών διηθήσεων εντός του όγκου, η σύγκριση με τις συνολικές τιμές της ανοσοέκφρασης δεν ανέδειξε κάποια στατιστική συσχέτιση. Τα αποτελέσματα συνοπτικά παρουσιάζονται στον Πίνακα 21. Πίνακας 21. Σύγκριση ως προς την παρουσία περινευρικών/αγγειακών/λεμφαγγειακών διηθήσεων εντός του όγκου Mόριο P value Στατιστικά σημαντική συσχέτιση 0,44 Όχι VEGF 0,56 Όχι Endostatin 0,7 Όχι Collagen XVIII 0,42 Όχι HSP47 0,32 Όχι MVD 0,63 Όχι F8 Οπτική Πυκνότητα Ως προς την παρουσία εξωπαρεγχυματικών διηθήσεων, η σύγκριση με βάση τις συνολικές τιμές της ανοσοέκφρασης ανέδειξε ανέδειξε θετική συσχέτιση με την έκφραση του VEGF. Τα αποτελέσματα συνοπτικά παρουσιάζονται στον Πίνακα

98 Πίνακας 22. Σύγκριση ως προς την παρουσία εξωπαρεγχυματικών διηθήσεων Mόριο P value Στατιστικά σημαντική συσχέτιση VEGF 0,00063 Ναι Endostatin 0,33 Όχι Collagen XVIII 0,87 Όχι HSP47 0,55 Όχι MVD 0,83 Όχι F8 Οπτική Πυκνότητα 0,54 Όχι Σύγκριση ανάμεσα σε καλοήθεις και κακοήθεις όγκους ως προς την έκφραση των VEGF, Endostatin, Collagen XVIII και HSP Σύγκριση με βάση τη θετικότητα της έκφρασης Η σύγκριση της θετικότητας της έκφρασης των μορίων μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων έγινε με τη δοκιμασία x 2. Λόγω της κατανομής των αποτελεσμάτων έγινε διαχωρισμός σε δύο ομάδες υψηλή (βαθμός 2 και 3) και χαμηλή (0, 1) θετικότητα. Για τον VEGF, την Endostatin και το Collagen XVIII δεν διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά (p=0.1433, p=0.264 και p=0.2278, αντίστοιχα). Για την HSP-47 διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά (p=0.0067), με αυξημένη θετικότητα στους καλοήθεις όγκους Σύγκριση με βάση την ένταση της ανοσοχρώσης Η σύγκριση της έντασης της ανοσοχρώσης των μορίων μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων έγινε επίσης με τη δοκιμασία x 2. Και πάλι λόγω της κατανομής των αποτελεσμάτων έγινε διαχωρισμός σε δύο ομάδες υψηλή (βαθμός 2 και 3) και χαμηλή (0, 1) χρώση. 98

99 Για τον VEGF, την Endostatin και το Collagen XVIII δεν διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά (p=0.2416, p= και p=0.1234, αντίστοιχα. Για την HSP-47 διαπιστώθηκε και πάλι στατιστικώς σημαντική διαφορά (p=0.0249), με αυξημένη χρώση στους καλοήθεις όγκους Σύγκριση με βάση το συνολικό σκορ (θετικότητα και ένταση χρώσης) Η σύγκριση της συνολικής βαθμολογίας ανοσοχρώσης των μορίων μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων έγινε με τη δοκιμασία t-test. Για τον VEGF δεν διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά (p=0.702). Για την Endostatin, το Collagen XVIII και την HSP-47, αντίθετα, διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά (p=0.01, p=0.02 και p= , αντίστοιχα) με αυξημένη βαθμολογία στους καλοήθεις όγκους. Στον Πίνακα 23, καταγράφονται οι μέσοι όροι του συνολικού σκορ για κάθε μόριο, τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης (p value), καθώς και η στατιστική σημαντικότητα τους Πίνακας 23. Αποτελέσματα από τη σύγκριση συνολικού σκορ ανοσοχρώσης Καλοήθεις Κακοήθεις P value Στατιστικά σημαντική διαφορά VEGF 4,18 4,41 0,702 Όχι Endostatin 5,83 5,164 0,01 Ναι Collagen XVIII 5,66 4,44 0,02 Ναι HSP47 5,27 3,82 0,0096 Ναι 99

100 Σύγκριση ανάμεσα σε καλοήθεις και κακοήθεις όγκους ως προς την αγγειοβρίθεια με βάση το MVD και την οπτική πυκνότητα της χρώσης του FVIIIR:Ag Ο παράγοντας FVIIIR:Ag μελετήθηκε όσον αφορά στην MVD (οbjects/window) μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων με τη δοκιμασία t-test και δεν διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά (p=0.1853). Η οπτική πυκνότητα της χρώσης του FVIIIR:Ag μελετήθηκε με τη δοκιμασία t-test και διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά (p=0.013) μεταξύ των μέσων όρων οπτικής πυκνότητας (κακοήθεις= καλοήθεις= ). Τονίζεται εδώ ότι καθώς η ένταση χρώσης και η οπτική πυκνότητα είναι αντίστροφα, άρα τα κακοήθη νεοπλάσματα παρουσιάζουν εντονότερη χρώση (Πίνακας 24) Πίνακας 24. Αποτελέσματα από την σύγκριση συνολικού σκορ ανοσοχρώσης Καλοήθεις Κακοήθεις P value Στατιστικά σημαντική διαφορά MVD 10,09 11,56 0,1853 Όχι Οπτική Πυκνότητα FVIIIA:Ag 140,51 125,270 0,013 Ναι Επίσης μελετήθηκε η πιθανότητα διαφοράς στην αγγειοβρίθεια μεταξύ των συχνότερων κακοηθών νεοπλασμάτων (MEC, ACC, PLGA) με τη δοκιμασία oneway ANOVA και δεν διαπιστώθηκε κάποια συσχέτιση (p=0.757 για MVD και p=0.178 για οπτική πυκνότητα) Συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της Endostatin και των μορίων Collagen XVIII και HSP47 Με βάση τη γνωστή βιοχημική τους συνάφεια, έγινε στατιστικός έλεγχος της συσχέτισης μεταξύ της έκφρασης της Endostatin και των μορίων Collagen XVIII και 100

101 HSP47. Χρησιμοποιήθηκε η στατιστική δοκιμασία univariate analysis. Διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ Collagen XVIII και Endostatin (p<0.001). Αντίθετα, δεν σημειώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στην Endostatin και το HSP Συσχέτιση αγγειοβρίθειας και έκφρασης παραγόντων VEGF, Endostatin, Collagen XVIII και HSP47 Κατά τη σύγκριση αυτή αναζητήθηκε η πιθανή συσχέτιση της έκφρασης των μορίων VEGF, Endostatin, Collagen XVIII και HSP47με την αγγειοβρίθεια, όπως εκφράζεται με την MVD και την οπτική πυκνότητα. Χρησιμοποιήθηκε η στατιστική δοκιμασία univariate correlation. Από τη στατιστική μελέτη δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση των εξεταζόμενων παραγόντων και στους δείκτες αγγειοβρίθειας. Τα αποτελέσματα για τη συσχέτιση με την MVD συνοψίζονται στον Πίνακα 25. και τα αποτελέσματα για τη συσχέτιση με την οπτική πυκνότητα στον Πίνακα 26. Πίνακας 25. Συσχέτιση Οπτικής πυκνότητας και έκφρασης VEGF, Endostatin, Collagen XVIII και HSP47 Mόριο P value Στατιστικά σημαντική συσχέτιση MVD VEGF 0,61 Όχι MVD Endostatin 0,22 Όχι MVD Collagen XVIII 0,18 Όχι MVD HSP47 0,24 Όχι 101

102 Πίνακας 26. Συσχέτιση Οπτικής πυκνότητας και έκφρασης VEGF, Endostatin, Collagen XVIII και HSP47 FVIIIR:Ag οπτική Mόριο P value Στατιστικά πυκνότητα VEGF 0,38 Όχι FVIIIR:Ag οπτική πυκνότητα Endostatin 0,39 Όχι FVIIIR:Ag οπτική πυκνότητα Collagen XVIII 0,4 Όχι FVIIIR:Ag οπτική πυκνότητα HSP47 0,9 Όχι σημαντική συσχέτιση Συμπεράσματα από τη στατιστική μελέτη Από την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων διαπιστώνονται τα εξής: Υπάρχει στατιστικώς σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ της ανοσοέκφρασης του VEGF και του σταδίου ΤΝΜ στα κακοήθη νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων Υπάρχει στατιστικώς σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ της ανοσοέκφρασης του VEGF και της εξωπαρεγχυματικής διήθησης στα κακοήθη νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων Υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά ανάμεσα στα καλοήθη και κακοήθη νεοπλάσματα ως προς την έκφραση της Endostatin, του Collagen XVIII, και της HSP-47 (αυξημένη στα καλοήθη). Υπάρχει στατιστικώς σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της Endostatin και της έκφρασης του Collagen XVIII στα καλοήθη νεοπλάσματα. Υπάρχει στατιστικώς σημαντική θετική συσχέτιση με την ένταση της χρώσης του FVIIIR:Ag στα κακοήθη νεοπλάσματα 102

103 9. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η νεοαγγειογένεση αποτελεί απαραίτητο παράγοντα για την ανάπτυξη πολλών τύπων νεοπλασιών και έχει συσχετιστεί συχνά με την επιθετικότητα του νεοπλάσματος και την πρόγνωση του ασθενούς. Παρά την σημασία της αγγειογένεσης στην νεοπλασματική πορεία οι μηχανισμοί της δεν έχουν έως σήμερα μελετηθεί επαρκώς στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων. Ειδικότερα δε, για την αναστολή των αντι-αγγειογόνων μορίων και μηχανισμών υπάρχουν πολύ λίγα στοιχεία. Το έλλειμμα σε αυτό το ερευνητικό περδίο παρατηρείται παρά τις γνωστές εφαρμογές και την επιτυχία της αντι-αγγειογενετικής αντινεοπλασματικής αγωγής. Μελετήσαμε την ανοσοϊστοχημική έκφραση μορίων που σχετίζονται με την αγγειογένεση σε κακοήθη και καλοήθη νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων VEGF Στην παρούσα μελέτη δεν διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων όσο αφορά στην θετικότητα, την ένταση της χρώσης και το ολικό σκορ για τον παράγοντα VEGF. Στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων διάφορες εργασίες υποστηρίζουν τη συμμετοχή του VEGF στην πορεία και εξέλιξη της νόσου, θεωρώντας την έκφρασή του ως σημαντικό προγνωστικό δείκτη 228,295,296,299,402. Σύμφωνα με τους Lim και συνεργάτες η προγνωστική αξία της αυξημένης έκφρασης του VEGF είναι σημαντικότερη και από την παρουσία τραχηλικών λεμφαδενικών μεταστάσεων 297. Ο VEGF έχει επίσης συσχετισθεί με την MVD σε νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων, σε ορισμένες εργασίες 228,295,299,402. Επίσης, διάφορα άλλα χαρακτηριστικά των όγκων, όπως κλινικό στάδιο, διαστάσεις του όγκου, περινευρική και αγγειακή διήθηση έχουν συσχετισθεί με την έκφραση του VEGF στις εργασίες αυτές. Σε μια πειραματική μελέτη η έκφραση του VEGF ήταν αυξημένη σε βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα των σιελογόνων αδένων σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς 403. Σε άλλη πειραματική μελέτη η δέσμευση των υποδοχέων του VEGF και του EGFπροκάλεσε αναστολή της ανάπτυξης των πρωτοπαθών όγκων και των πνευμονικών τους μεταστάσεων 300. Αντιθέτως, οι Pammer και συνεργάτες μελέτησαν την έκφραση 103

104 του VEGF σε κακοήθη και καλοήθη νεοπλάσματα και φυσιολογικούς σιελογόνους αδένες. Με βάση τα δεδομένα τους δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση του VEGF μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασιών και μάλιστα η έκφραση ήταν αυξημένη στους φυσιολογικούς σιελογόνους αδένες 404. Τέλος, σε μια πρόσφατη μελέτη οι de Faria και συνεργάτες μελέτησαν την έκφραση του VEGF, μεταξύ κακοήθων και καλοήθων βλαβών και διαπίστωσαν διαφορετική έκφραση του, χωρίς όμως συσχέτιση της έκφρασης με τη μεταστατική συμπεριφορά του νεοπλάσματος 264. Στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε συσχέτιση του TNM σταδίου και της εξωπαρεγχυματικής επέκτασης με την έκφραση του VEGF όσον αφορά στους κακοήθεις όγκους, εύρημα το οποίο όπως προαναφέρθηκε έχει παρατηρηθεί και σε σειρά άλλων μελετών. Επίσης, στη μελέτη μας δεν διαπιστώθηκε διαφορά στην έκφραση του VEGF, τόσο στη θετικότητα, όσο στην ένταση της χρώσης μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων. Πιθανή εξήγηση της διαφοράς των ευρημάτων αυτών με μερικές από τις προαναφερθείσες εργασίες να αποτελεί το γεγονός ότι στην πλειονότητά τους η σύγκριση της έκφρασης γίνεται μεταξύ κακοήθων όγκων 228,295,299,402 και σε 2 με φυσιολογικούς αδένες 295,300. Αντιθέτως, στο υλικό της παρούσας μελέτης η σύγκριση έγινε μεταξύ κακοήθων και καλοήθων όγκων. Στις ελάχιστες μελέτες όπου συγκρίνονται καλοήθεις με κακοήθεις ιστούς τα αποτελέσματα ποικίλλουν: οι Pammer και συνεργάτες 404 καταλήγουν σε παρόμοια αποτελέσματα με της παρούσας μελέτης, και πιθανολογούν ότι ο VEGF μετέχει στη φυσιολογική ρύθμιση της έκκρισης σιέλου και της επούλωσης του στοματικού βλεννογόνου. Αντιθέτως, οι de Faria και συνεργάτες 264 διαπίστωσαν διαφορά στην έκφραση μεταξύ κακοήθων και καλοηθών νεοπλασιών. Γενικότερα, τα αποτελέσματα της σύγκρισης της έκφρασης του VEGF μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων, σε άλλα όργανα, ποικίλλουν στη βιβλιογραφία. Οι Kumamoto και συνεργάτες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η έκφραση του VEGF δεν παρουσιάζει διαφορές μεταξύ καλοήθων και κακοήθων αδαμαντινοβλαστωμάτων 285. Επίσης αυξημένη έκφραση VEGF παρατηρήθηκε σε κακοήθη αλλά και σε καλοήθη νεοπλάσματα 405,406. Αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε άλλες μελέτες στον θυρεοειδή και στον προστάτη, με εντονότερη έκφραση του VEGF στους κακοήθεις όγκους 292,407,

105 Όσον αφορά στη μελέτη του VEGF σε νεοπλάσματα της κεφαλής και του τραχήλου γενικότερα, υπάρχουν δεδομένα μόνο από κακοήθεις όγκους. Ωστόσο και πάλι τα αποτελέσματα όσο αφορά στον ρόλο και στην έκφραση του VEGF ποικίλλουν. Σε διάφορες μελέτες παρατηρήθηκε αύξηση της VEGF έκφρασης, ειδικά στα ακανθοκυτταρικά καρκινώματα, όπου συσχετίσθηκε με χαμηλή διαφοροποίηση 409, προχωρημένη νόσο 410 και εξέλιξη της δυσπλασίας 411. Αντιθέτως σε άλλες μελέτες αμφισβητήθηκε ο ρόλος του VEGF Σε ορισμένες μάλιστα από αυτές τις μελέτες παρατηρήθηκε ακόμα και σημαντικότερη έκφραση της VEGF στους φυσιολογικούς σε σχέση με τους νεοπλασματικούς ιστούς 412,414. Με βάση τα δεδομένα αυτά ορισμένοι μελετητές διατύπωσαν την άποψη ότι στα νεοπλάσματα κεφαλής και τραχήλου ο VEGF μετέχει μόνο σε φυσιολογικούς μηχανισμούς 404,412,414. Πρέπει επίσης να τονιστεί ότι ορισμένοι τύποι κακοήθων νεοπλασμάτων δεν εκφράζουν καθόλου ή δεν αυξάνουν την έκφραση του VEGF 275. Επίσης, τονίζεται ότι ενώ ο VEGF κατέχει σημαντικό ρόλο στην έναρξη της αγγειογένεσης 412,415, στην συνέχεια άλλοι παράγοντες όπως ο bfgf και ο TGF-α αναλαμβάνουν εξίσου σημαντικό ρόλο 403, Όπως σχολίασαν και άλλοι συγγραφείς οι παραπάνω λόγοι, καθώς και διαφορές στην επιλογή των αντι-vegf αντισωμάτων, όπως και μεθοδολογικές διαφορές, μπορεί να εξηγούν τις παρατηρούμενες διαφορές μεταξύ μετρήσεων 414. Endostatin Όσον αφορά στην έκφραση της Εndostatin, αυτή ήταν σημαντικά αυξημένη στους καλοήθεις όγκους. Όσο αφορά στην θετικότητα και στην ένταση της χρώσης οι μέσοι όροι ήταν επίσης υψηλότεροι στους καλοήθεις όγκους, χωρίς όμως η διαφορά αυτή να είναι στατιστικώς σημαντική. Αυτή η αυξημένη στα καλοήθη και μειωμένη στα κακοήθη έκφραση είναι μπορεί να θεωρηθεί λογική, λαμβάνοντας υπόψη τον αγγειοστατικό ρόλο της Εndostatin, καθώς αντιπροσωπεύει την απώλεια των αντι-αγγειογόνων παραγόντων και την επικράτηση των αγγειογόνων, με αποτέλεσμα την αγγειογενετική μεταστροφή του κυτταρικού φαινοτύπου. 105

106 Ο ρόλος της Εndostatin στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων δεν έχει μελετηθεί έως σήμερα. Για τα νεοπλάσματα της κεφαλής και του τραχήλου υπάρχουν δεδομένα από τους Nikitakis και συνεργάτες 418 για τα ακανθοκυτταρικά καρκινώματα της στοματικής κοιλότητας. Με βάση τα ευρήματα αυτά λιγότερο επιθετικοί μημεταστατικοί όγκοι είχαν αυξημένη έκφραση Εndostatin και Collagen XVIII σε σχέση με κακοηθέστερους μεταστατικούς όγκους. Υπάρχουν επίσης μελέτες όπου έχει μελετηθεί η συγκέντρωση της Εndostatin σε ασθενείς με νεοπλασίες, άλλων ανατομικών περιοχών. Οι Teh και συνεργάτες μελέτησαν τα επίπεδα της Εndostatin στο πλάσμα σε ασθενείς με καρκίνο μαστού και παρατήρησαν αύξηση των επιπέδων κατόπιν μαστεκτομής και αντίστροφη συσχέτιση Εndostatin και αγγειοβρίθειας του όγκου 419. Επίσης, υψηλότερα επίπεδα Εndostatin στο πλάσμα έχουν συσχετισθεί με καλύτερη πρόγνωση στον καρκίνο του μαστού 420. Πρόσφατες πειραματικές μελέτες με αγωγή με Εndostatin έχουν επιδείξει την ισχυρή αντι-νεοπλασματική της δράση Αντίθετα, σε διάφορους άλλους τύπους κακοήθων νεοπλασμάτων, όπως στο μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα 424, στο αδενοκαρκίνωμα του νεφρού 425, στο σάρκωμα μαλακών μορίων 426, στο καρκίνωμα του ενδομητρίου 427 και ωοθηκών 428 και στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα 429 έχουν παρατηρηθεί υψηλότερα επίπεδα Endostatin σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες. Επιπλέον, υπάρχουν εργασίες που συσχετίζουν τα αυξημένα επίπεδα Εndostatin με χειρότερη πρόγνωση και κλινική πορεία 148,426,428,430,431. Αυξημένα επίπεδα Εndostatin πλάσματος έχουν επίσης ανιχνευθεί και σε μη-νεοπλασματικές διεργασίες όπως στην υπερπλασία του ενδομητρίου 427 και σε διάφορες καλοήθεις νόσους του μαστού 419. Τα αντιφατικά αυτά ευρήματα μπορούν να εξηγηθούν ως αποτέλεσμα ενός αγγειορυθμιστικού μηχανισμού, όπου η αύξηση της Εndostatin είναι αποτέλεσμα έντονης αγγειογενετικής δραστηριότητας σε μια προσπάθεια καταστολής αυτής 431,432. Πρέπει εδώ να τονιστεί ότι η πλειονότητα των εργασιών που προαναφέρθηκαν μελετούν τη συγκέντρωση της Εndostatin στο πλάσμα, ενώ στη δική μας εργασία, μελετάται η Endostatin σε κυτταρικό επίπεδο με τεχνικές ανοσοϊστοχημείας. Επίσης, στις εργασίες αυτές έχουν χρησιμοποιηθεί υγιείς ιστοί ως μάρτυρες, εν αντιθέσει με τη δική μας μελέτη, όπου ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν καλοήθη νεοπλάσματα. 106

107 Με βάση τα αποτελέσματα αυτά δεν είναι δυνατή η ασφαλής πραγματοποίηση συγκρίσεων παρά μόνο με εργασίες με παρόμοιες τεχνικές διερεύνησης, όπου τα αποτελέσματα είναι συμβατά 418. Στην παρούσα μελέτη δεν διαπιστώθηκε κάποια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης μεταξύ VEGF και Endostatin. Οι Hajitou και συνεργάτες 186 διαπίστωσαν, αρνητική συσχέτιση μεταξύ VEGF και Endostatin σε πειραματικές κυτταρικές σειρές, την οποία και απέδωσαν σε άμεση καταστολή της παραγωγής της VEGF από την Endostatin. Αντίθετα οι Morimoto και συνεργάτες 431 διαπίστωσαν θετική συσχέτιση Εndostain και VEGF, με ανοσοενζυμικές σειρές σε γλοιώματα. Collagen XVIII Όσον αφορά στην έκφραση του Collagen XVIII διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά (p=0.02) μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όγκων, με τους καλοήθεις όγκους να παρουσιάζουν μεγαλύτερο συνολικό σκορ. Όσο αφορά στη θετικότητα ήταν παρόμοια, ενώ η ένταση της χρώσης ήταν μεγαλύτερη για τους καλοήθεις όγκους, χωρίς όμως η διαφορά αυτή να είναι στατιστικώς σημαντική. Στη διεθνή βιβλιογραφία τα αποτελέσματα ποικίλλουν σχετικά με την σχέση Collagen XVIII και νεοπλασιών. Όσον αφορά τα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων καθώς δεν υπάρχουν άλλες σχετικές μελέτες δεν υπάρχουν δεδομένα για την έκφραση του Collagen XVIII. Όσον αφορά στα νεοπλάσματα κεφαλής και τραχήλου, οι Nikitakis και συνεργάτες παρατήρησαν αυξημένη έκφραση του Collagen XVIII σε λιγότερο επιθετικά μη-μεταστατικά ακανθοκυτταρικά καρκινώματα, σε σχέση με κακοηθέστερα μεταστατικά καρκινώματα 418. Σε άλλα όργανά, όπως στις ωοθήκες οι Guenther και συνεργάτες παρατήρησαν ισχυρή έκφραση σε κύτταρα από καρκίνωμα ωοθηκών. Επίσης, σε καρκινώματα του παχέος εντέρου παρατηρήθηκε μόνο στο κύτταρα της θεμέλιας ουσίας 433. Στο μημικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα η έκφραση του στους ιστούς σχετίσθηκε με την Endostatin του πλάσματος, κακή πρόγνωση και χαρακτηρίστηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας 424 Αντιθέτως, στο ηπατοκυτταρικό καρκινώμα εξέλιξη της 107

108 νόσου σχετίζεται με ελάττωση της έκφρασης του Collagen XVIIΙ, το οποίο σχετίζεται αρνητικά με την MVD 434. Επίσης, στατιστικώς σημαντική (p<0.001) ήταν και η σχέση που διαπιστώθηκε μεταξύ του συνολικού σκόρ του Collagen XVIII και της Endostatin. Το εύρημα αυτό είναι συμβατό με τον θεωρητικό μηχανισμό παραγωγής της Endostatin από το Collagen XVIII, όπου αύξηση του τελικού προϊόντος σχετίζεται με ανάλογη αύξηση του προδρόμου μορίου. Heat Shock Protein 47 Όσο αφορά στην έκφραση της Heat Shock Protein 47 (HSP-47) διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όγκων, με τους καλοήθεις όγκους να παρουσιάζουν μεγαλύτερο συνολικό σκορ (p= ), μεγαλύτερη θετικότητα (p=0.0067) και ένταση χρώσης (p=0.0249). Ο ρόλος της HSP-47 στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων δεν έχει μελετηθεί έως σήμερα Οι Lee και συνεργάτες 341 παρατήρησαν αυξημένη έκφραση της HSP-47 σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα του στόματος, χωρίς όμως συσχέτιση με το στάδιο ή τη διαφοροποίηση. Επίσης, παρατήρησαν μειωμένα επίπεδα HSP-47 στα καρκινώματα με μεταστατική τάση, σε σχέση με τα μη-μεταστατικά. Παρόμοια αποτελέσματα παρατήρησαν και οι Nikitakis και συνεργάτες 418. Σε νεοπλάσματα άλλων ανατομικών περιοχών, οι Nese και συνεργάτες 435 παρατήρησαν αυξημένη εμφάνιση σε διηθητικά πορογενή καρκινώματα μαστού και σε αδενοκαρκινώματα προστάτη. Επίσης, η μελέτη των Araki και συνεργατών κατέληξε στην παρατήρηση ότι κύτταρα από καρκίνωμα του παχέος εντέρου, σχετιζόμενου με ελκώδη κολίτιδα παρουσιάζουν επίσης αύξηση του HSP Υπάρχει όμως σημαντικός αριθμός εργασιών όπου αν και η HSP-47 ανιχνεύεται σε νεοπλασματικές νόσους, συσχετίζεται όμως με λιγότερο επιθετικό χαρακτήρα. Οι Kwon και συνεργάτες παρατήρησαν αυξημένη έκφραση σε πρώιμα καρκινώματα οισοφάγου 436. Σε μια μελέτη σε κύτταρα νευροβλαστώματος παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της HSP-47 και του Collagen I και IV, τα οποία σχετίζονταν 108

109 αντιστρόφως με την ογκογενετικότητα 437. Η έκφραση της Hsp-47 στην επιφάνεια καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων συσχετίστηκε με μειωμένη κινητικότητα και διηθητικότητα από τους Hebert και συνεργάτες 438. Σε εκτενείς μελέτες σε σαρκώματα παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της HSP-47 στις λιγότερο επιθετικές μορφές Η κακοήθης εξαλλαγή ινοβλαστών σχετίστηκε με μειωμένη έκφραση της HSP-47 στην μελέτη των Nakai και συνεργατών 446. Τα ευρήματα μας συνηγορούν υπέρ της τελευταίας θεωρίας, ότι δηλαδή η HSP-47 παρατηρείται αυξημένη σε καλοήθεις έναντι κακοήθων νεοπλασμάτων σιελογόνων αδένων. Ο πιθανός μηχανισμός δράσης είναι μέσω της παραγωγής της Endostatin, θεωρία η οποία επιβεβαιώνεται περεταίρω από τα ευρήματα μας, καθώς παρατηρήσαμε στους καλοήθεις όγκους στατιστικά σημαντική αύξηση της ανοσοέκφρασης του Endostatin. Σε παρόμοια συμπεράσματα κατέληξαν και οι Nikitakis και συνεργάτες 418. Επιπλέον, το γεγονός ότι η πλειονότητα των καλοήθων όγκων ήταν πλειόμορφα αδενώματα, που παρουσιάζουν ινώδη κάψα και στρώμα μπορεί να σχετίζεται με την αυξημένη έκφραση της HSP-47, λόγω της συμμετοχής της στον σχηματισμό ινωδών δομών. MVD-FVIIIR:Ag Η αγγειοβρίθεια των όγκων μελετήθηκε με χρώση του ενδοθηλιακού δείκτη FVIIIR:Ag και υπολογισμό της MVD. Η MVD μετρήθηκε κατά τις αρχές που διατύπωσε ο Weidner 202, υπολογίζοντας τον μέσο όρο των αγγείων από 5 οπτικά πεδία σε μεγάλη μεγέθυνση (x200). Επίσης, μετρήθηκε η έντασης της χρώσης του FVIIIR:Ag. Αμφότερες οι μετρήσεις έγιναν με την χρήση ψηφιακής ανάλυσης εικόνας, μια τεχνική αντικειμενική καθώς και με υψηλό ποσοστό ακρίβειας 18,207,217,399,447. Από τη στατιστική ανάλυση δεν προέκυψε κάποια σημαντική συσχέτιση για την MVD, αλλά για την ένταση της χρώσης προέκυψε στατιστικώς σημαντική διαφορά, με τα κακοήθη νεοπλάσματα να έχουν εντονότερη χρώση (p=0.013) 109

110 Η ένταση της χρώσης του ενδοθηλιακού δείκτη δεν αξιολογείται συνήθως στις εργασίες μελέτης της αγγειοβρίθειας νεοπλασμάτων. Όμως, ορισμένοι μελετητές υποστηρίζουν ότι τα ιστολογικά χαρακτηριστικά των αγγείων των νεοπλασματικών όγκων υποβοηθούν την κατανόηση της νεοαγγειογένεσης 255. Σε αυτά τα πλαίσια διάφοροι μελετητές έχουν αξιολογήσει την ένταση της χρώσης σε όλο το εύρος της ιστολογικής τομής σε νεοπλάσματα άλλων οργάνων 448,449. Ορισμένες μελέτες έχουν διαπιστώσει συσχέτιση εντάσεως και προγνώσεως Σε παρόμοια ευρήματα κατέληξαν και οι Luukkaa και συνεργάτες για τα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων, όπου αυξημένη ένταση χρώσης σχετίζονταν με κακή πρόγνωση 209. Τα ευρήματα αυτά είναι συμβατά με τις δικές μας παρατηρήσεις σύμφωνα με τις οποίες τα κακοήθη νεοπλάσματα παρουσιάζουν εντονότερη χρώση του FVIIIR:Ag σε σχέση με τα καλοήθη. Η απουσία διαφοράς της MVD μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων που διαπιστώσαμε στην έρευνα μας έρχεται σε αντίθεση με σειρά μελετών στους σιελογόνους αδένες. Οι Costa και συνεργάτες 255 μελέτησαν την MVD σε αδενοκυστικά, μυοεπιθηλιακά και βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα, με τη χρήση των ενδοιθηλιακών δεικτών CD34 και CD105. Παρατήρησαν ότι η MVD ήταν μειωμένη σε νεοπλάσματα με μυοεπιθηλιακή διαφοροποίηση. Οι Cardoso και συνεργάτες 269 μελέτησαν την MVD με το δείκτη ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων CD105 και διαπίστωσαν διαφορά μεταξύ φυσιολογικών αδένων, καλοήθων και κακοήθων όγκων. Οι Luukkaa και συνεργάτες 209 μελέτησαν την MVD και τη μορφολογία των αγγείων με το δείκτη CD34 σε 37 αδενοκυστικά και 18 βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα, στη μελέτη τυς παρατηρήθηκε ότι η MVD ήταν αυξημένη στα βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα. Αυξημένη MVD στα κακοήθη νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων παρατήρησαν και άλλοι μελετητές χρησιμοποιώντας είτε το δείκτη CD31 256, είτε τον CD34 268, είτε τον δείκτη CD Οι Dhanuthai και συνεργάτες 221 συνέκριναν την MVD κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων χρησιμοποιώντας τον δείκτη CD105 και τον CD31, βρήκαν δε στατιστικώς σημαντικές διαφορές μόνο με τη χρήση του CD105. Στον καρκίνο του μαστού, όπου έχει εκτενώς διερευνηθεί η MVD, μια μετανάλυση από τον Uzzan 230 σε 43 μελέτες με συνολικό αριθμό 8936 ασθενών κατέληξε στο συμπέρασμα ότι ο FVIIIR:Ag είναι υποδεέστερος του CD31 και του CD34 για 110

111 υπολογισμό της MVD. Παρόμοιες συγκρίσεις έκαναν και οι Sullivan και συνεργάτες 217 σε 652 περιστατικά καρκίνου του μαστού συγκρίνοντας την MVD με βάση τους δείκτες CD31, CD34 και FVIIIR:Ag. Μόνο η ΜVD με βάση το CD31 συσχετίσθηκε με τα συνήθη προγνωστικά κριτήρια και την κλινική πορεία της νόσου. Οι Wang και συνεργάτες 216 κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ο ενδοθηλιακός δείκτης FVIIIR:Ag εκφράζεται κυρίως στα ώριμα μεσαία και μεγάλα αγγεία, ενώ ο CD31 αναδεικνύει και ώριμα αλλά και ανώριμα, μικρότερης διαμέτρου αγγεία. Με βάση τα δεδομένα αυτά και την παρατήρηση ότι συστηματικά ο CD31 αναδεικνύει περισσότερα αγγεία από τον FVIIIR:Ag ορισμένοι συγγραφείς τον θεωρούν ως καλύτερο δείκτη νεοαγγειογένεσης 201,216,453,454. Θεωρούμε πιθανό ότι η διαφορά των αποτελεσμάτων μας με τα της λοιπής βιβλιογραφίας μπορεί να σχετίζεται με την επιλογή του FVIIIR:Ag ως ενδοθηλιακού δείκτη. Η τεχνική του υπολογισμού της MVD έχει διάφορες υποκειμενικές παραμέτρους, όπως την εκτίμηση των hot-spots και τον διαχωρισμό αγγείων που βρίσκονται σε επαφή 221. Όπως αναπτύχθηκε και στην ενότητα σχετικά με την MVD στο Γενικό μέρος οι ανεπάρκειες αυτές της μεθόδου είναι γνωστές και για τον λόγο αυτό κατά καιρούς έχουν προταθεί διάφορες εναλλακτικές τεχνικές προκειμένου να αξιολογηθεί η αγγειοβρίθεια με αντικειμενικότερους τρόπους. Η χρήση της ψηφιακής ανάλυσης εικόνας που εφαρμόστηκε στην παρούσα μελέτη παρέχει δυνατότητα τυποποίησης των αποτελεσμάτων και επαναληψιμότητας, καθώς οι φωτογραφίες των αγγειακών hot-spots αποθηκεύονται στο σύστημα. Επιπλέον, τα συστήματα ανάλυσης εικόνας μπορούν να διακρίνουν τουλάχιστον 256 συνεχόμενες διαβαθμίσεις εντάσεως, παρέχοντας πληρέστερες και ακριβείς πληροφορίες σε ελάχιστο χρόνο για την ένταση της μετρούμενης χρώσης. Αντιθέτως το ανθρώπινο μάτι μπορεί να διακρίνει λιγότερο από 200 αποχρώσεις. Η τεχνική αυτή έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορες μελέτες με ενδιαφέροντα αποτελέσματα 399,400,455,456. Οι Sullivan και συνεργάτες 217 χρησιμοποίησαν σύστημα ανάλυσης εικόνας για την μελέτη της MVD και διαπίστωσαν παρόμοια αποτελέσματα μεταξύ των παθολογοανατομικών μετρήσεων και των μετρήσεων του συστήματος. 111

112 10. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η παρούσα μελέτη παρά την πρωτοτυπία της παρουσιάζει ορισμένες αδυναμίες: 1. Το δείγμα της μελέτης αποτελείται από περιστατικά κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων, με αποτέλεσμα να μην γίνεται συγκριτική μελέτη με φυσιολογικούς ιστούς σιελογόνων αδένων. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι φυσιολογικοί σιελογόνοι αδένες σπανίως αφαιρούνται. Οι σχετικώς περιορισμένες περιπτώσεις σιελογόνων αδένων χωρίς νεόπλασμα που εξαιρούνται συνήθως χαρακτηρίζονται ιστολογικά από χρόνια φλεγμονή και δεν είναι φυσιολογικοί. 2. Το δείγμα, λόγω της τυχαιοποίησής του, δεν είχε κατάλληλη σύνθεση ώστε να μπορούν να μελετηθούν όλες κλινικοπαθολογοανατομικές παράμετροι (π.χ. βαθμός διαφοροποίησης). 3. Δεν έγινε συσχέτιση των αποτελεσμάτων με την επιβίωση των ασθενών. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η μελέτη ήταν αναδρομική από αρχειακό υλικό με αποτέλεσμα τα δεδομένα να είναι ελλειπή. 4. Με βάση τα πρόσφατα δεδομένα υπάρχουν άλλοι νεότεροι ενδοθηλιακοί δείκτες που υπερτερούν του FVIIIR:Ag 112

113 11. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων παρατηρήθηκε ότι: Η έκφραση του VEGF αυξάνεται στα κακοήθη νεοπλάσματα ανάλογα με το στάδιο κατά ΤΝΜ και την παρουσία εξωπαρεγχυματικής διήθησης Η αντι-αγγειογόνος Endostatin και το πρόδρομο μόριό της Collagen XVIII παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση στα καλοήθη νεοπλάσματα σε σχέση με τα κακοήθη. Παρατηρείται στατιστικώς σημαντική σχέση μεταξύ της έκφρασης Endostatin και Collagen XVIII Η HSP-47, η οποία μετέχει στην τελική διαμόρφωση του Collagen XVIII, παρουσιάζει αυξημένη έκφραση στα καλοήθη νεοπλάσματα Ο παράγοντας FVIIIR:Ag παρουσιάζει αυξημένη ένταση ανοσοχρώσης στα κακοήθη νεοπλάσματα, χωρίς όμως να παρατηρείται διαφορά στην αντίστοιχη MVD μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όγκων Η αυξημένη έκφραση της Endostatin και του Collagen XVIII στα καλοήθη νεοπλάσματα πιθανώς αποτελεί μέρος ενός αντι-αγγειογόνου μηχανισμού 113

114 12. ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ Η παρούσα μελέτη συμβάλλει στην προσπάθεια διερεύνησης της νεοαγγειογένεσης στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων και αναδεικνύει τη σχέση της έκφρασης του VEGF με κλασικούς προγνωστικούς δείκτες όπως το στάδιο κατά ΤΝΜ και η παρουσία εξωπαρεγχυματικής διήθησης. Επίσης διαπιστώνει την παρουσία αυξημένης έκφρασης αντι-αγγειογόνων μορίων στα καλοήθη νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων και την αντίστοιχη απουσία της στα κακοήθη. Μελέτη σε κυτταροκαλλιεργειες με καταστολή συγκεκριμένων αντι-αγγειογόνων μορίων, θα βοηθήσει ώστε να διερευνηθούν οι βιολογικές επιπτώσεις της απουσίας τους. Περαιτέρω έρευνα να μπορεί να συνεχιστεί σε πειραματόζωα με καταστολή ή επαγωγή της παραγωγής των μορίων αυτών ώστε να διερευνηθούν οι σχέσεις των παραγόντων και οι σχετιζόμενοι μηχανισμοί της νεοαγγειογένεσης. Υπάρχουν ήδη μελέτες στις οποίες μελετήθηκε ο ρόλος της HSP47 σε knock-out κυτταρικές σειρές και πειραματόζωα 330,331. Η επέκταση των πειραμάτων αυτών και στην καταστολή των υπόλοιπων μορίων τα οποία μελετήσαμε σε νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων θα βοηθήσει στην κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών. Μία πιθανή ερμηνεία των ευρημάτων μας είναι η ύπαρξη ενός αντι-αγγειογόνου μηχανισμού στα καλοήθη νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων, με αύξηση της HSP-47 η οποία προκαλεί αυξημένη σύνθεση Collagen XVIII, με επακόλουθη αυξημένη σύνθεση της Endostatin και τελικό αποτέλεσμα την καταστολή της αγγειογένεσης. Πιθανόν ο ανωτερω μηχανισμός να καταστέλλεται στα κακοήθη νεοπλάσματα με αποτέλεσμα την επαγωγή της αγγειογένεσης (Εικόνα 13). Οι στοχευμένες θεραπείες που βρίσκονται πλέον σε εφαρμογή αποτελούν απόδειξη ότι η αντιμετώπιση του καρκίνου μέσω ειδικών αντι-αγγειογόνων σκευασμάτων είναι δυνατή. Παράδειγμα αποτελεί η εστιασμένη αντι-vegf αγωγή, η οποία είναι αποτελεσματική στην αντιμετώπιση ορισμένων κακοήθων όγκων Μέσα στα πλαίσια αυτά, απαιτείται διεξοδική και εις βάθος μελέτη των μηχανισμών και των μορίων που μετέχουν στην νεοπλασματική νεοαγγειογένεση. 114

115 Εικόνα 13. Πιθανή ερμηνεία αγγειογενετικών μηχανισμών στα νεοπλάσματα των σιελογόνων αδένων 115