ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΗΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ, IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO, ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΥΤΟΚΙΝΩΝ ΜΑΡΙΑ ΣΑΜΑΛΙΔΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2015

2 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES SCHOOL OF BIOLOGY DEPARTMENT OF GENETICS, DEVELOPMENT AND MOLECULAR BIOLOGY DOCTORAL DISSERTATION EFFECT OF ANTIFUNGAL DRUGS ON HEMATOPOIESIS, IN VITRO AND IN VIVO, IN THE PRESENCE OF CYTOKINES MARIA SAMALIDOU BIOLOGIST THESSALONIKI 2015

3 στους δικούς μου...στηρίγματα της ζωής μου Γεώργιο, Δημητρούλα, Θεόδωρο, Σάββα-Αλέξανδρο

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ Αιμοποιητικές πηγές Ρύθμιση της αιμοποίησης Κυτοκίνες Αιμοποιητικά κύτταρα Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα Κύτταρα που δημιουργούν αποικίες ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Αμφοτερικίνη Β Δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β Λιποσωμική αμφοτερικίνη Β Βορικοναζόλη Κασποφουγκίνη ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΗΓΕΣ ΥΛΙΚΟΥ ΜΕΛΕΤΗΣ Πειραματόζωα Άνθρωποι ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΗΜΙΣΤΕΡΕΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (CFU ΔΟΚΙΜΕΣ) Μυελός των οστών ποντικών Απομόνωση Ημιστερεή καλλιέργεια Μυελός των οστών, κινητοποιημένο περιφερικό αίμα και ομφαλιοπλακουντικό αίμα ανθρώπων... 54

5 2.2.1 Απομόνωση Ημιστερεή καλλιέργεια ΈΛΕΓΧΟΣ ΥΠΑΡΞΗΣ ΜΥΚΗΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ Φαρμακοκινητική μελέτη Μικροβιολογική μέθοδος διάχυσης φαρμάκου σε άγαρ Έλεγχος τοξικότητας Έλεγχος τοξικότητας σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΛΥΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΚΟΚΚΙΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Κυτταρομετρία ροής ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΘΕΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΗΣ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗΣ Β, ΤΗΣ ΒΟΡΙΚΟΝΑΖΟΛΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΑΣΠΟΦΟΥΓΚΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ IN VITRO ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗ ΔΕΟΞΥΧΟΛΙΚΗ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗ Β Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων των ποντικών Καταμέτρηση αποικιών CFU-GM, BFU-E και CFU-GEMM των ποντικών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GM αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των BFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GEMM αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στο συνολικό αριθμό των αποικιών Η ΘΕΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΗΣ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗΣ Β, ΤΗΣ ΒΟΡΙΚΟΝΑΖΟΛΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΑΣΠΟΦΟΥΓΚΙΝΗΣ ΔΕΝ ΟΦΕΙΛΕΤΑΙ ΣΤΙΣ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥΣ ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ ΜΕΤΑΞΥ ΜΕΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΚΥΤΟΚΙΝΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΝΕΟΤΕΡΩΝ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΙΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Επίδραση των νεότερων αντιμυκητιασικών απουσία κυτοκινών Επίδραση των νεότερων αντιμυκητιασικών παρουσία μεμονωμένων κυτοκινών... 76

6 4. ΘΕΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΗΣ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗΣ Β, ΤΗΣ ΒΟΡΙΚΟΝΑΖΟΛΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΑΣΠΟΦΟΥΓΚΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ IN VITRO ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗ ΔΕΟΞΥΧΟΛΙΚΗ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗ Β, Η ΟΠΟΙΑ ΔΕΝ ΟΦΕΙΛΕΤΑΙ ΣΤΙΣ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥΣ Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων των ανθρώπων Καταμέτρηση αποικιών CFU-GM, BFU-E, CFU-E και CFU-GEMM των ανθρώπων Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των αποικιών προερχόμενων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα μυελού των οστών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GM αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό του συνόλου των BFU-E και CFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των BFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GEMM αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των αποικιών προερχόμενων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα κινητοποιημένου περιφερικού αίματος Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GM αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό του συνόλου των BFU-E και CFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των BFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GEMM αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των αποικιών προερχόμενων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα ομφαλιοπλακουντικού αίματος Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GM αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό του συνόλου των BFU-E και CFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των BFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-E αποικιών Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GEMM αποικιών Παρακολούθηση ύπαρξης μυκήτων

7 5. ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΗΣ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗΣ Β, ΤΗΣ ΒΟΡΙΚΟΝΑΖΟΛΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΑΣΠΟΦΟΥΓΚΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ IN VIVO Επιλογή των προς χορήγηση δόσεων της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης Φαρμακοκινητική Παρακολούθηση τοξικότητας Παρακολούθηση τοξικότητας σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια Επίδραση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης, μόνων ή μαζί με τον G-CSF, στην ανάκαμψη των κοκκιοκυττάρων σε ποντίκια μετά από υποθανάτια ακτινοβόληση Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των κοκκιοκυττάρων των ποντικών Καταμέτρηση κοκκιοκυττάρων των ποντικών Επίδραση των νεότερων αντιμυκητιασικών μόνων Επίδραση των νεότερων αντιμυκητιασικών σε συνδυασμό με τον G-CSF Επίδραση του G-CSF μόνου ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ

9 Διδακτορική διατριβή Πρόλογος Μαρία Σαμαλίδου Η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στη Μονάδα Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας (Πειραματικό Εργαστήριο) της Αιματολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών (ΜΜΜΟ) του Γενικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης «Γεώργιος Παπανικολάου», σε συνεργασία με τον Τομέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Ευχαριστώ θερμά: τον κ. Δαμιανό Σωτηρόπουλο, Διευθυντή της Αιματολογικής Κλινικής και ΜΜΜΟ του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου», για την ανάθεση αυτής της εργασίας καθώς και για την επίβλεψη, την καθοδήγηση και τη στήριξή του κατά την εκπόνησή της, την κ. Αφροδίτη Σιβροπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ, για την επίβλεψη της διατριβής, το ενδιαφέρον και τις συμβουλές της, τον κ. Τιμολέοντα-Αχιλλέα Βυζαντιάδη, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής του ΑΠΘ, τον κ. Δημήτρη Μπουγιουκλή, Βιολόγο, τον κ. Ιωσήφ Μελετιάδη, Επίκουρο Καθηγητή της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών (ΕΚΠΑ), την κ. Μαρία Σιώπη, Χημικό και υποψήφια διδάκτορα της Ιατρικής Σχολής του ΕΚΠΑ, την κ. Ελένη Σιώτου, Κτηνίατρο του Πειραματικού Εργαστηρίου της Αιματολογικής Κλινικής και ΜΜΜΟ του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου», και τον κ. Νικόλαο Μονοκρούσο, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, για τη βοήθεια και τις συμβουλές τους κατά τη διάρκεια της διατριβής, τον κ. Αχιλλέα Αναγνωστόπουλο, Συντονιστή Διευθυντή της Αιματολογικής Κλινικής και ΜΜΜΟ του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου», για την άδεια πραγματοποίησης αυτής της ερευνητικής εργασίας στο Πειραματικό Εργαστήριο της Κλινικής, την κ. Μαργαρίτα Χατζοπούλου Κλαδαρά και τον κ. Μηνά Αρσενάκη, Καθηγητές του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ, για τη συμμετοχή τους στην Τριμελή Συμβουλευτική Επιτροπή, τον κ. Τιμολέοντα-Αχιλλέα Βυζαντιάδη, τον κ. Μηνά Γιάγκου και την κ. Ελένη Δροσοπούλου, Καθηγητή και Επίκουρη Καθηγήτρια, αντίστοιχα, του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ, και την κ. Βασιλεία Γαρυπίδου-Βρατσκίδου, Καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής του ΑΠΘ, για τη συμμετοχή τους στην Επταμελή Εξεταστική Επιτροπή και τις συμβουλές τους, 9

10 Διδακτορική διατριβή Πρόλογος Μαρία Σαμαλίδου και το Ίδρυμα Μποδοσάκη για την υποστήριξή του με τη χορήγηση υποτροφίας ως υποψήφια διδάκτορα. 10

11 ΠΕΡΙΛΗΨΗ

12 Διδακτορική διατριβή Περίληψη Μαρία Σαμαλίδου H λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη αντιπροσωπεύουν τρεις διαφορετικές κατηγορίες αντιμυκητιασικών φαρμάκων, τα πολυένια, τις αζόλες και τις εχινοκανδίνες αντίστοιχα, με μοναδικό μηχανισμό δράσης, που χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική πρακτική κυρίως για την αντιμετώπιση και πρόληψη των συστηματικών και σοβαρών μυκητιασικών λοιμώξεων. Σε αρκετές περιπτώσεις, τα συγκεκριμένα φάρμακα λαμβάνονται για μεγάλη χρονική περίοδο από τέτοια άτομα, τα οποία πολλές φορές έχουν μειωμένη άμυνα και επομένως υψηλό κίνδυνο εμφάνισης αυτών των λοιμώξεων. Παρά την αποδεδειγμένη μικρότερη τοξικότητα αυτών των τριών νεότερων αντιμυκητιασικών για διάφορους τύπους κυττάρων που εκτίθενται σε αυτά, συγκριτικά με την τοξική και γι αυτό περιορισμένης κλινικής χρήσης παλαιότερη μορφή της αμφοτερικίνης Β, η δράση τους σε αιμοποιητικά κύτταρα, δηλαδή σε κύτταρα τα οποία είναι υπεύθυνα για την αιμοποίηση και έτσι ιδιαίτερα σημαντικά για τον οργανισμό, δεν έχει αποσαφηνιστεί. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης σε αιμοποιητικά κύτταρα. Kύτταρα μυελού των οστών ποντικών C57Bl/6 καλλιεργούνταν σε ημιστερεό μέσο μεθυλκυτταρίνης με ή χωρίς κυτοκίνες, ως κοκτέιλ [παράγοντας αρχέγονων κυττάρων (SCF), ιντερλευκίνη-3 (ΙL-3), παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM- CSF), ιντερλευκίνη-6 (ΙL-6) και ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ)] ή μεμονωμένες [SCF, ή ΙL-3, ή ΙL-6, ή GM-CSF, ή παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων (G-CSF), ή EPO], και παρουσία ή απουσία διάφορων συγκεντρώσεων των αντιμυκητιασικών φαρμάκων δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, βορικοναζόλη και κασποφουγκίνη. Επίσης, μονοπυρηνικά κύτταρα μυελού των οστών ή κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ή ομφαλιοπλακουντικού αίματος υγιών δοτών καλλιεργούνταν σε ημιστερεό μέσο μεθυλκυτταρίνης με ένα κοκτέιλ κυτοκινών (SCF, ΙL-3, GM-CSF και EPO) και παρουσία ή απουσία διάφορων συγκεντρώσεων των τεσσάρων αντιμυκητιασικών. Μετά την παρέλευση του απαιτούμενου χρόνου επώασης, καταμετρούνταν οι αποικίες ώριμων κυττάρων που δημιουργούνταν [μονάδα που δημιουργεί αποικία κοκκιοκυττάρων ή/και μακροφάγων (CFU- GM), ή και μονάδα που δημιουργεί έκρηξη ερυθροειδών (BFU-E), ή και CFU-Ε, ή και CFUκοκκιοκυττάρων-ερυθροειδών-μακροφάγων-μεγακαρυοκυττάρων (CFU-GEMM)]. Ακόμη, μετά 12

13 Διδακτορική διατριβή Περίληψη Μαρία Σαμαλίδου το τέλος της επώασης, καλλιέργειες μεθυλκυτταρίνης με και χωρίς τα αντιμυκητιασικά ελέγχονταν μικροσκοπικά για τυχόν ύπαρξη μόλυνσης και επιστρώνονταν και επωάζονταν σε αγαρούχα θρεπτικά μέσα ανάπτυξης μυκήτων. Πέραν αυτών, τα ελάχιστα επίπεδα στο περιφερικό αίμα διάφορων δόσεων των τριών νεότερων αντιμυκητιασικών φαρμάκων προσδιορίζονταν με μικροβιολογικές μεθόδους διάχυσης φαρμάκου σε άγαρ και ταυτόχρονα παρακολουθούνταν η τυχόν εμφάνιση συμπτωμάτων τοξικότητας (πόνος, απώλεια βάρους και θάνατος) σε φυσιολογικά ποντίκια στα οποία αυτά τα φάρμακα ενίονταν καθημερινά, ενώ ακολουθούσε παρακολούθηση τυχόν σημείων τοξικότητας διάφορων καθημερινώς χορηγούμενων δόσεων των νεότερων αντιμυκητιασικών σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια. Επιπλέον, ο απόλυτος αριθμός των κοκκιοκυττάρων του περιφερικού αίματος προσδιοριζόταν με κυτταρομετρία ροής σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές κατά την ανάκαμψη σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια τα οποία δε λάμβαναν ή λάμβαναν καθημερινά λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, βορικοναζόλη, κασποφουγκίνη, G-CSF και συνδυασμό του G-CSF με το κάθε φάρμακο. In vitro, η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη δεν ήταν τοξικές για τα αιμοποιητικά κύτταρα ενώ, κατά ενδιαφέροντα τρόπο, προκάλεσαν σημαντική αύξηση του αριθμού των CFU-GM αποικιών παρουσία κυτοκινών, δηλαδή δρώντας συνεργικά με αυτές, σε όλες τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν. Αυτή η δράση ήταν αντίθετη προς την εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση τοξικότητα και σημαντική μείωση του αριθμού των αποικιών που προκλήθηκε από τη δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β. Ακόμη, αυτή η επίδραση των τριών νεότερων αντιμυκητιασικών φαρμάκων δεν ήταν απόρροια των αντιμυκητικών ιδιοτήτων τους, μιας και δεν ανιχνεύθηκαν μύκητες σε όλες τις καλλιέργειες που εξετάστηκαν. In vivo, κατά την ενεργοποίηση της αιμοποίησης από την υποθανάτια ακτινοβόληση, η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη δεν ήταν τοξικές για τα κοκκιοκύτταρα στις μέγιστες καλά ανεκτές δόσεις, όπως αυτές καθορίστηκαν από την προκαταρκτική φαρμακοκινητική μελέτη και τον έλεγχο τοξικότητας. Επίσης, τα τρία νεότερα αντιμυκητιασικά προκάλεσαν μη σημαντική μεταβολή του αριθμού των κοκκιοκυττάρων κατά την ανάκαμψη. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μια πιθανή συνέργεια με τον G-CSF, μιας και, παρουσία αυτής της κυτοκίνης, η κασποφουγκίνη οδήγησε σε σημαντική αύξηση του αριθμού των κοκκιοκυττάρων, η βορικοναζόλη προκάλεσε μια αύξηση που δεν ήταν στατιστικά 13

14 Διδακτορική διατριβή Περίληψη Μαρία Σαμαλίδου σημαντική και η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β επέφερε μια μικρότερη από τα δυο προηγούμενα φάρμακα και μη στατιστικά σημαντική αύξηση, συγκριτικά με τον G-CSF μόνο του. Συμπερασματικά, τα ευρήματα αυτής της εργασίας προτείνουν μια πιθανή θετική επίδραση της κασποφουγκίνης, της βορικοναζόλης και της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β στην αιμοποίηση, δρώντας σε συγκεκριμένα αιμοποιητικά κύτταρα, παρουσία κυτοκινών. Αυτά τα δεδομένα παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς υποδεικνύουν έναν πιθανό διαφορετικό τρόπο δράσης για αυτά τα νεότερα αντιμυκητιασικά φάρμακα, πέρα από την αντιμυκητική λειτουργία τους. Έτσι, συμβάλλουν, αφενός, στην απόκτηση γνώσης στο πλαίσιο της ευρύτερης κατανόησης της δράσης αυτών των φαρμάκων στην αιμοποίηση, και αφετέρου, στην κατάδειξη της σημασίας που θα μπορούσαν να έχουν αυτά τα ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιμυκητιασικά ως θεραπευτικές και προφυλακτικές επιλογές για τις σοβαρές λοιμώξεις κυρίως στους οργανισμούς με μειωμένη άμυνα. 14

15 ABSTRACT

16 Διδακτορική διατριβή Abstract Μαρία Σαμαλίδου Liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin represent three different classes of antifungal drugs, polyenes, azoles and echinocandins respectively, with unique mechanism of action, that are widely used in clinical practice mainly for the treatment and prevention of systemic and severe fungal infections. In several cases, these drugs are received for a long time period by such individuals, which often have decreased defense and therefore a high risk of developing these infections. Despite the proven less toxicity of these three modern antifungals for various cell types exposed to them, comparatively with the toxic and hence of limited clinical use older form of amphotericin B, their effect on hematopoietic cells, i.e. on cells that are responsible for hematopoiesis and thus particularly significant for the organism, has not been clarified. The aim of the present doctoral thesis was to investigate the effect of liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on hematopoietic cells. Bone marrow cells from C57Bl/6 mice were cultured in semisolid methylcellulose medium with or without cytokines, as a cocktail [stem cell factor (SCF), interleukin-3 (ΙL-3), granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), interleukin-6 (ΙL-6) and erythropoietin (ΕΡΟ)] or single [SCF, or ΙL-3, or ΙL-6, or GM-CSF, or granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), or EPO], and in the presence or absence of various concentrations of the antifungal drugs amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin. Furthermore, bone marrow or mobilized peripheral blood or umbilical cord blood mononuclear cells from healthy donors were cultured in semisolid methylcellulose medium with a cytokine cocktail (SCF, ΙL-3, GM-CSF and EPO) and in the presence or absence of various concentrations of the four antifungals. After the passage of the required incubation time, the formed colonies of mature cells were counted [colony forming unit granulocyte or/and macrophage (CFU-GM), or even burst forming unit erythroid (BFU-E), or even CFU-E, or even CFU-granulocyte-erythroid-macrophage-megakaryocyte (CFU-GEMM)]. Moreover, after the end of the incubation, methylcellulose cultures with and without the antifungals were inspected microscopically for potential presence of contamination and were plated and incubated onto fungal growth agar media. Apart from these, the trough peripheral blood levels of various doses of the three modern antifungal drugs were determined by drug diffusion bioassays on agar and the potential occurrence of toxicity 16

17 Διδακτορική διατριβή Abstract Μαρία Σαμαλίδου symptoms (pain, weight loss and death) was simultaneously monitored in normal mice in which these drugs were injected daily, followed by observation for potential toxicity signs of various daily administered doses of the modern antifungals in sublethally irradiated mice. Additionally, the absolute number of peripheral blood granulocytes was determined by flow cytometry at specific time points during the recovery in sublethally irradiated mice that were not receiving or were daily receiving liposomal amphotericin B, voriconazole, caspofungin, G- CSF and combination of G-CSF with each drug. In vitro, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin were not toxic for hematopoietic cells and, interestingly, they induced significant increase of the number of CFU-GM colonies in the presence of cytokines, i.e. by acting synergistically with them, at all concentrations tested. This effect was contrary to the concentration-dependent toxicity and the significant decrease of the number of colonies caused by amphotericin B deoxycholate. Moreover, this effect of the three modern antifungal drugs was not the result of their antifungal properties, since no fungi were detected in all cultures examined. In vivo, during the activation of hematopoiesis by the sublethal irradiation, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin were not toxic for granulocytes at the maximum well-tolerated doses, as determined by the preliminary pharmacokinetic study and the toxicity test. Furthermore, the three modern antifungals resulted in no significant change in the number of granulocytes during the recovery. In addition, a possible synergy with G-CSF was observed, since, in the presence of this cytokine, caspofungin led to significant increase of the number of granulocytes, voriconazole induced an increase that was not statistically significant and liposomal amphotericin B caused a smaller than the two previous drugs and non-statistically significant increase, comparatively with G-CSF alone. Conclusively, the findings of this thesis suggest a possible positive effect of caspofungin, voriconazole and liposomal amphotericin B on hematopoiesis, acting on specific hematopoietic cells, in the presence of cytokines. These data are of particular interest, as they indicate a possible different mode of action for these modern antifungal drugs, apart from their antifungal activity. Thus, they contribute, on the one hand, to the knowledge acquisition in the context of the broader understanding of the effect of these drugs on hematopoiesis, and on the other hand, to the demonstration of the significance that these widely used antifungals 17

18 Διδακτορική διατριβή Abstract Μαρία Σαμαλίδου could have as therapeutic and prophylactic options for severe infections mainly in organisms with decreased defense. 18

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

20 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου 1. ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ Το αίμα είναι ο υγρός ιστός που κυκλοφορεί στο καρδιαγγειακό σύστημα εκτελώντας πλήθος λειτουργιών. Αποτελείται από το υγρό μέσο, το πλάσμα, και από τα έμμορφα στοιχεία, τα κύτταρα που κυκλοφορούν και τα οποία έχουν διαφορετικές λειτουργίες. Οι κυριότερες λειτουργίες των ερυθροκυττάρων είναι η μεταφορά οξυγόνου και διοξειδίου του άνθρακα στους ιστούς και στους πνεύμονες αντίστοιχα, των λευκοκυττάρων η άμυνα του οργανισμού και των αιμοπεταλίων η συμβολή στη δημιουργία του θρόμβου κατά τη διάρκεια της πήξης του αίματος. 1 Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα του αίματος έχουν περιορισμένη διάρκεια ζωής και, κατ επέκταση, ανάγκη για συνεχή αναπλήρωση, εν τούτοις είναι τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα, δηλαδή δεν έχουν τη δυνατότητα να πολλαπλασιαστούν. Η αντικατάστασή τους γίνεται από άλλα κύτταρα που βρίσκονται κατά κύριο λόγο εκτός της κυκλοφορίας του αίματος και τα οποία αναφέρονται γενικά ως αιμοποιητικά κύτταρα. Η αιμοποίηση είναι το φαινόμενο εκείνο κατά το οποίο ένα και μοναδικό κύτταρο, το αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο, μπορεί να δημιουργήσει όλες τις ώριμες μορφές κυττάρων που κυκλοφορούν στο αίμα (ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα και αιμοπετάλια), περνώντας μέσα από ενδιάμεσες μορφές αιμοποιητικών κυττάρων και ωριμότερα αυτών κύτταρα, αλλά και τον ίδιο του τον εαυτό (Εικόνα 1). 1,2 20

21 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα 1. Αιμοποίηση (CFU: μονάδα που δημιουργεί αποικία, BFU: μονάδα που δημιουργεί έκρηξη, GEMM: κοκκιοκύτταρο ερυθροειδές μακροφάγο μεγακαρυοκύτταρο, MEG: μεγακαρυοκύτταρο, EO: ηωσινόφιλο, BASO: βασεόφιλο). (τροποποιημένη) 3 Figure 1. Hematopoiesis (CFU: colony forming unit, BFU: burst forming unit, GEMM: granulocyte erythroid macrophage megakaryocyte, MEG: megakaryocyte, EO: eosinophilic, BASO: basophilic). (modified) 3 21

22 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου 1.1 Αιμοποιητικές πηγές Τα αιμοποιητικά κύτταρα είναι εγκατεστημένα στα αιμοποιητικά όργανα. Κατά την εμβρυϊκή ζωή, αυτά τα κύτταρα απαντώνται αρχικά στο λεκιθικό σάκο, ο οποίος συνιστά την αρχική θέση της αιμοποίησης, και από εκεί μεταναστεύουν στο ήπαρ και έπειτα από το ήπαρ στο μυελό των οστών όπου και παραμένει η αιμοποίηση για την υπόλοιπη ζωή του οργανισμού. 4-7 Γι αυτόν το λόγο, στο περιφερικό αίμα του νεογνού κυκλοφορεί υψηλός αριθμός αιμοποιητικών κυττάρων ο οποίος ελαττώνεται τις πρώτες μέρες της ζωής του βρέφους φτάνοντας σε πολύ χαμηλά επίπεδα στα οποία και τελικώς παραμένει μέχρι και στην ενήλικη ζωή Επομένως, το κατ εξοχήν αιμοποιητικό όργανο για τον ενήλικα είναι ο μυελός των οστών, ο οποίος εδρεύει στο εσωτερικό των οστών και στην ενήλικη ζωή κυρίως στα πλατιά οστά, όπως είναι τα οστά της λεκάνης και του κρανίου. 19,20 Σε έναν ενήλικα με φυσιολογικό βάρος, η μάζα του μυελού των οστών ανέρχεται περίπου στα 2,6 kg από τα οποία το 1/4 περίπου είναι αιμοποιητικά κύτταρα με ιδιαίτερα τα αρχέγονα αλλά και τα άωρα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα να αποτελούν πολύ μικρό ποσοστό στο σύνολο των κυττάρων του μυελού. 9,20,21 Επιπλέον, όπως προαναφέρθηκε, τα αιμοποιητικά κύτταρα (αρχέγονα και προγονικά), αλλά και ωριμότερα κύτταρα όπως τα μεγακαρυοκύτταρα, δεν παραμένουν ακίνητα εφ όρου ζωής στο μυελό των οστών, αλλά τουλάχιστον ένα μέρος τους μετακινείται και εισέρχεται στην κυκλοφορία του αίματος με αποτέλεσμα αυτά, υπό φυσιολογικές συνθήκες, να συνεχίζουν να κυκλοφορούν και στο περιφερικό αίμα του ενήλικα σε πολύ χαμηλό ποσοστό. 9,22-29 Ο αριθμός των κυκλοφορούντων αιμοποιητικών κυττάρων είναι δυνατό να αυξηθεί σε ειδικές καταστάσεις, όπως με τη χορήγηση του παράγοντα διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων (granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF) ο οποίος προκαλεί κινητοποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων και έξοδό τους από το μυελό στην 9,27,30-34 περιφέρεια. Εξαιτίας όλων των παραπάνω, ο μυελός των οστών αποτελεί την κλασσική πηγή αιμοποιητικών κυττάρων με κλινική εφαρμογή στις μεταμοσχεύσεις αιμοποιητικών κυττάρων για τη θεραπεία ευρέος φάσματος νοσημάτων, όπως είναι οι λευχαιμίες. Επιπλέον, το κινητοποιημένο περιφερικό αίμα, και το ομφαλιοπλακουντικό αίμα, δηλαδη το αίμα του νεογνού που παραμένει μετά τον τοκετό μέσα στην ομφαλική φλέβα και 22

23 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου στον πλακούντα, συνιστούν δύο πηγές αιμοποιητικών κυττάρων που κερδίζουν όλο και 9,27,35-39 μεγαλύτερο έδαφος στις μεταμοσχεύσεις συγκριτικά με το μυελό. 1.2 Ρύθμιση της αιμοποίησης Σε κανονικές συνθήκες, η παραγωγή των ώριμων κυττάρων του αίματος αντικαθιστά τη φυσιολογική καταστροφή εξαιτίας της καθορισμένης διάρκειας ζωής τους, διατηρώντας έτσι σταθερό τον αριθμό τους. Επιπλέον, σε διάφορες καταστάσεις που διαταράσσουν αυτήν την ισορροπία, όπως κατά την απώλεια αίματος (αναιμία, υποξαιμία) ή τις λοιμώξεις, παράγονται αθρόα αλλά ταυτόχρονα μη ανεξέλεγκτα τα απαραίτητα ώριμα κύτταρα, όπως ερυθροκύτταρα ή λευκοκύτταρα αντίστοιχα στις παραπάνω περιπτώσεις, χωρίς να επηρεάζεται ο αριθμός των 1,40-44 άλλων ώριμων μορφών. Επομένως, η αιμοποίηση ρυθμίζεται ανάλογα με τη ζήτηση. Η αιμοποίηση στον άνθρωπο, όπως και στα υπόλοιπα θηλαστικά, λαμβάνει χώρα εξωαγγειακώς. Τα αιμοποιητικά κύτταρα βρίσκονται στις μυελικές κοιλότητες των οστών και ανάμεσα στις διακλαδώσεις των φλεβικών κολποειδών του μυελού, σχηματίζοντας σε τρισδιάστατη όψη σφηνοειδείς σχηματισμούς ή χορδές που είναι γνωστές ως νησίδες Πιο συγκεκριμένα, αυτά εδρεύουν σε εξειδικευμένα μικροπεριβάλλοντα τα οποία διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της αιμοποίησης και είναι γνωστά ως φωλιές, έννοια που προτάθηκε για πρώτη φορά το 1978 από το Ray Schofield Το μυελικό στρώμα περιέχει πολλούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των οστεοβλαστών, οστεοκλαστών, ινοβλαστών, δικτυοκυττάρων, ενδοθηλιακών κυττάρων, δενδριτικών κυττάρων, μονοκυττάρων, μακροφάγων, λεμφοκυττάρων, χονδροκυττάρων, λιποκυττάρων, μεσεγχυματικών κυττάρων, μυοκυττάρων και κυττάρων του νευρικού ιστού. Αυτά τα κύτταρα, σε συνδυασμό με την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία καθώς και μια πληθώρα άλλων ουσιών προερχόμενων από αυτά τα βοηθητικά κύτταρα και από την κυκλοφορία του αίματος, συμπεριλαμβανομένων και των κυτοκινών, συνθέτουν τα μικροπεριβάλλοντα. Ανάλογα με τα ρυθμιστικά ερεθίσματα, δηλαδή τα κυτταρικά και μοριακά σήματα με τα ανάλογα σηματοδοτικά μονοπάτια, που δέχονται κάθε φορά τα αιμοποιητικά κύτταρα εντός των φωλιών, ελέγχεται η μοίρα τους για διατήρηση της κατάστασης ηρεμίας και, κατ επέκταση, της επαφής με την επιφάνεια στήριξης (με τα υποστηρικτικά κύτταρα), για ανανέωση και για παραγωγή ώριμων κυττάρων που 23

24 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου απελευθερώνονται στην κυκλοφορία (Εικόνα 1.2) Η σημασία των αλληλεπιδράσεων με τα κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος φαίνεται από μια πληθώρα πειραμάτων συγκαλλιέργειας αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων με κύτταρα του μυελικού στρώματος. Εικόνα 1.2. Μυελός των οστών. (τροποποιημένη) 84,85 Figure 1.2. Bone marrow. (modified) 84,85 24

25 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Κυτοκίνες Οι κυτοκίνες επιδρούν στη διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων μέσω της σύνδεσής τους σε ειδικούς υποδοχείς και επακόλουθης ενεργοποίησης των αντίστοιχων μονοπάτιων μεταγωγής του σήματος, ανάλογα με τις ανάγκες του οργανισμού Ο ρόλος τους στην αιμοποίηση είναι τόσο σημαντικός ώστε σε μερικές περιπτώσεις η έλλειψή τους από τον οργανισμό είναι ασυμβίβαστη προς τη ζωή. Πρόκειται για γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες παράγονται από ένα ευρύ φάσμα κυττάρων, κυρίως του μυελού των οστών ή και άλλων οργάνων. Οι κυτοκίνες έχουν τη δυνατότητα να δρουν από το επίπεδο των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων μέχρι τις ωριμότερες μορφές και όντας μόνες τους ή σε συνδυασμό. Η συνέργεια φαίνεται ότι είναι περισσότερο απαραίτητη στα αρχέγονα κύτταρα και στις άωρες μορφές των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Οι κυτοκίνες που δρουν στα αρχέγονα κύτταρα και στις πλέον άωρες μορφές των προγονικών κυττάρων έχουν συνήθως ευρεία δράση, επιδρώντας σε όλες τις κυτταρικές σειρές, σε αντίθεση με αυτές που δρουν στις ωριμότερες μορφές και κατ επέκταση σε συγκεκριμένη κυρίως σειρά Ο παράγοντας αρχέγονων κυττάρων (stem cell factor, SCF) παράγεται από ινοβλάστες και άλλους τύπους κυττάρων του μυελικού στρώματος. Έχει ευρεία δράση, αφού δρα στα αρχέγονα καθώς και στα προγονικά (άωρες μορφές όπως επίσης και δεσμευμένα) αιμοποιητικά κύτταρα συμβάλλοντας στην παραγωγή όλων των ώριμων μορφών κυττάρων. Ωστόσο, από μόνος του έχει μικρή μόνο επίδραση, γι αυτό και εμφανίζει έντονη συνεργική δράση με άλλες περισσότερο εξειδικευμένες κυτοκίνες που δρουν σε ωριμότερες μορφές αιμοποιητικών κυττάρων. 91,92 Η ιντερλευκίνη-3 (interleukin-3, ΙL-3) παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα Τ- λεμφοκύτταρα, καθώς και από τα ενεργοποιημένα κύτταρα-φυσικούς φονιάδες, τα σιτευτικά κύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα μονοκύτταρα και τα κερατινοκύτταρα. Αποτελεί κυτοκίνη ευρέος φάσματος με δράση κυρίως στα προγονικά (άωρα και δεσμευμένα) αλλά και στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, καθώς επίσης και στα μακροφάγα, ηωσινόφιλα, βασεόφιλα, σιτευτικά κύτταρα και μεγακαρυοκύτταρα. Δρα καλύτερα σε συνδυασμό με άλλες κυτοκίνες και προάγει την παραγωγή των ώριμων κυττάρων των διάφορων κυτταρικών σειρών. 93,94 25

26 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Η ιντερλευκίνη-6 (interleukin-6, ΙL-6) παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα, ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα, Τ- και Β-λεμφοκύτταρα, κοκκιοκύτταρα, λεία μυϊκά κύτταρα, ηωσινόφιλα, χονδροκύτταρα, οστεοβλάστες, σιτευτικά κύτταρα, νευρογλοιακά κύτταρα και κερατινοκύτταρα. Αποτελεί πλειοτροπική κυτοκίνη που δρα κυρίως στα άωρα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα αλλά και στα δεσμευμένα για τις διάφορες σειρές προγονικά κύτταρα, καθώς και στα ενεργοποιημένα Τ- και Β-λεμφοκύτταρα και στα περιφερικά μονοκύτταρα. Εμφανίζει δράση κυρίως σε συνδυασμό με άλλες κυτοκίνες και προκαλεί την παραγωγή Τ- και Β-λεμφοκυττάρων, πλασματοκυττάρων, μεγακαρυοκυττάρων, αιμοπεταλίων και ώριμων κυττάρων της κοκκιοκυτταρικής και μονοκυτταρικής σειράς. 95,96 O παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (granulocytemacrophage-colony stimulating factor, GM-CSF) παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα και μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες. Δρα κυρίως στα δεσμευμένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα των ουδετερόφιλων, ηωσινόφιλων και μακροφάγων αλλά και στα δεσμευμένα προγονικά κύτταρα της ερυθράς και μεγακαρυοκυτταρικής σειράς και στα άωρα προγονικά κύτταρα, όπως επίσης και στα ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα και μονοκύτταρα/μακροφάγα. Προκαλεί την παραγωγή των ουδετερόφιλων, ηωσινόφιλων και μακροφάγων και μπορεί να συνεργάζεται με διάφορες κυτοκίνες για την επίτευξη καλύτερου αποτελέσματος, ενώ η συνέργεια είναι απαραίτητη για τη συμβολή του στην παραγωγή των ερυθροκυττάρων και μεγακαρυοκυττάρων. 97,98 O G-CSF παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα, μακροφάγα και ουδετερόφιλα, καθώς και από ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα και άλλα κύτταρα του μυελικού στρώματος. Δρα κυρίως στα δεσμευμένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα της κοκκιοκυτταρικής σειράς προς παραγωγή ουδετερόφιλων αλλά και στα αωρότερα προγονικά κύτταρα που αποδίδουν ώριμα κύτταρα δύο ή και περισσότερων κυτταρικών σειρών, καθώς επίσης και στα ουδετερόφιλα. Η συνεργική δράση που έχει με άλλες κυτοκίνες βοηθά στην καλύτερη απόδοσή του. 99,100 Η ερυθροποιητίνη (erythropoietin, ΕΡΟ) παράγεται κυρίως από τους νεφρούς, καθώς και από το ήπαρ και τα μακροφάγα. Αποτελεί περισσότερο ειδική κυτοκίνη με δράση κυρίως στα δεσμευμένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα της ερυθράς σειράς αλλά ως ένα βαθμό και 26

27 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου στη μεγακαρυοποίηση, όπως επίσης και στα ενδοθηλιακά κύτταρα και Β-λεμφοκύτταρα, ενώ συνεργάζεται με άλλες κυτοκίνες. 101, Αιμοποιητικά κύτταρα Τα αιμοποιητικά κύτταρα συνιστούν έναν ετερογενή πληθυσμό κυττάρων που περιλαμβάνει από τα αρχέγονα κύτταρα μέχρι τις ωριμότερες και πλέον διαφοροποιημένες μορφές (Εικόνα 1) Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα Η ύπαρξη αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1909 από τον Alexander Maximow, αλλά άρχισε να αποκτά επιστημονική βάση από τους Till και McCulloch το ,104 Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα αποτελούν την παρακαταθήκη για το μέλλον των κυττάρων του αίματος, καθώς είναι ικανά να διατηρούν την ομοιόσταση και τη σταθερή κατάσταση όλης της αιμοποίησης με τη συνεχή αναπλήρωση των κυττάρων του αίματος και να υποστηρίζουν την απόκριση σε στρεσσογόνονες συνθήκες (όπως αιμορραγία, μόλυνση, τοξικότητα λόγω εφαρμογής ακτινοβολίας ή χημειοθεραπευτικών, επαγωγή κυτταρικού κύκλου, κινητοποίηση με G-CSF) με την κατεύθυνση προς συγκεκριμένη κυτταρική σειρά. Πρόκειται λοιπόν για πολυδύναμα κύτταρα τα οποία παραμένουν σε εφεδρεία και ανενεργή κατάσταση μέχρι να λάβουν το κατάλληλο σήμα για την παραγωγή ώριμων κυττάρων ανάλογα με τη ζήτηση. Επίσης, τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα είναι ικανά να αυτοανανεώνονται αποφεύγοντας έτσι την εξάντληση του αποθέματός τους Η πολυδυναμία και η αυτοανανέωση οφείλονται στην ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση. Πιο συγκεκριμένα, o πολλαπλασιασμός ενός αρχέγονου αιμοποιητικού κυττάρου οδηγεί στη δημιουργία δύο διαφορετικών κυττάρων: ενός διαφοροποιημένου, που θα συνεχίσει την κλασσική διαδικασία διαδοχικών μιτώσεων και διαφοροποίησης με δυνατότητα παραγωγής των κυττάρων όλων των κυτταρικών σειρών και, κατ επέκταση, όλων των κυττάρων του αίματος, και ενός ίδιου με το μητρικό, που θα πάρει τη θέση του στον πληθυσμό των πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων. Η ύπαρξη αυτών των δύο ιδιοτήτων των 27

28 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου αρχέγονων κυττάρων φαίνεται έμμεσα κατά τη διάρκεια μεταμόσχευσης αλλά και διαδοχικής μεταμόσχευσης αιμοποιητικών κυττάρων ή ακόμη και μεταμόσχευσης ενός και μοναδικού αρχέγονου κυττάρου σε πειραματόζωα που ο μυελός τους έχει καταστραφεί με ακτινοβολία, στα οποία είναι δυνατή η αναγέννηση του μυελού και η παραμονή φυσιολογικής αιμοποίησης εφ όρου ζωής Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα Η μετάβαση από το αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο στο λειτουργικό και κυκλοφορούν κύτταρο του αίματος συμβαίνει μέσα από πολλά στάδια και χαρακτηρίζεται από την προοδευτική απώλεια της ικανότητας αυτοανανέωσης και το βαθμιαίο προσανατολισμό προς συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, λευκή, ερυθρά ή μεγακαρυοκυτταρική, ανάλογα με τις ανάγκες του οργανισμού. Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως δέσμευση και τα κύτταρα που έχουν ήδη 52,112, αποκτήσει συγκεκριμένο προσανατολισμό αναφέρονται ως δεσμευμένα. Η σταδιακή κατεύθυνση προς συγκεκριμένη σειρά με παράλληλη απώλεια της αυτοανανέωσης οφείλεται στο γεγονός ότι κατά τη διάρκεια του κάθε διαδοχικού πολλαπλασιασμού υφίσταται ταυτόχρονα και διαφοροποίηση κατά την οποία δημιουργούνται δύο θυγατρικά κύτταρα που είναι περισσότερο διαφοροποιημένα από το μητρικό. 141,151 Κατ αυτόν τον τρόπο, προκύπτουν πολλές ενδιάμεσες μορφές κυττάρων που βρίσκονται σε διάφορα στάδια διαφοροποίησης, και επομένως διατηρούν σε μεγαλύτερο, μικρότερο ή μηδενικό βαθμό τον πολυδύναμο χαρακτήρα και την ικανότητα αυτοανανέωσης. Τα κύτταρα αυτά είναι γωστά συνολικά ως προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, γιατί στην ουσία αποτελούν προγόνους όλων των κυττάρων του αίματος. Τέτοιου είδους κύτταρα αποτελούν οι πλέον άωρες μορφές προγονικών, οι οποίες πλησιάζουν πολύ περισσότερο στο επίπεδο του αρχέγονου κυττάρου, τα άωρα προγονικά, που είναι μερικώς πολυδύναμα αφού δεν μπορούν να παράγουν κύτταρα όλων των σειρών του αίματος, για παράδειγμα μπορούν να διαφοροποιηθούν και προς τις τρεις μυελικές σειρές αλλά όχι προς τη λεμφική σειρά, ενώ δεν αυτοανανεώνονται, καθώς και τα περισσότερο διαφοροποιημένα προγονικά κύτταρα, τα οποία μπορεί να είναι διδύναμα ή μονοδύναμα και δεν έχουν τη δυνατότητα αυτοανανέωσης. 52,112, ,152 28

29 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Αν και τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, όπως φαίνεται, δεν αποτελούν ενιαίο πληθυσμό, εν τούτοις, μέχρι πριν το στάδιο των βλαστών, μοιάζουν με μικρά λεμφοκύτταρα καθιστώντας έτσι αδύνατη τη μορφολογική τους αναγνώριση ύστερα από χρώση. Το ίδιο ισχύει και για τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. 141,142,152 Ωστόσο, γενικώς τα αιμοποιητικά κύτταρα, λόγω του διαφορετικού σταδίου διαφοροποίησης στο οποίο βρίσκονται, εμφανίζουν και διαφορετικές πρωτεΐνες επιφάνειας στην κυτταρική μεμβράνη τους οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες για την ανοσολογική ταυτοποίησή τους. 52,141, ,153,154 Επιπλέον, είναι δυνατή και η λειτουργική διάκριση γενικώς των προγονικών από τα αρχέγονα κύτταρα, εξαιτίας της κατάστασης ηρεμίας στην οποία βρίσκονται τα δεύτερα. 52,141,145,152,155, Κύτταρα που δημιουργούν αποικίες Τα αιμοποιητικά κύτταρα μπορούν να πολλαπλασιάζονται και να διαφοροποιούνται από άωρες σε ώριμες μορφές in vitro. Ειδικότερα, όταν καλλιεργούνται σε κατάλληλο ημιστερεό υλικό, δημιουργούν συσσωρεύσεις κυττάρων που είναι γνωστές ως αποικίες, ενώ τα κύτταρα που απαρτίζουν κάθε αποικία αποτελούν κλώνους που προέρχονται από ένα και μοναδικό κύτταρο (κλωνογένεση). Αυτά τα κύτταρα αναφέρονται ως μονάδες ή κύτταρα που δημιουργούν αποικίες (colony forming units, CFUs ή colony forming cells, CFCs) και είναι λιγότερο ή περισσότερο διαφοροποιημένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Τα αωρότερα προγονικά κύτταρα διαιρούμενα αποδίδουν δύο κύτταρα που το καθένα διαφοροποιείται προς διαφορετική κυτταρική σειρά, γι αυτό και δημιουργούν μικτές αποικίες οι οποίες αποτελούνται από κύτταρα δύο ή και περισσότερων σειρών, ενώ τα ωριμότερα προγονικά κύτταρα αποδίδουν κύτταρα και κατ επέκταση και αποικίες μόνο μιας σειράς. Τέτοια κύτταρα είναι για παράδειγμα αυτά που δημιουργούν μικτές αποικίες κοκκιοκυττάρωνερυθροκυττάρων-μακροφάγων-μεγακαρυοκυττάρων (CFU-granulocyte-erythroidmacrophage-megakaryocyte, CFU-GEMM), αυτά που δημιουργούν μικτές αποικίες κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (CFU-GM), καθώς και εκείνα που δημιουργούν αποικίες κοκκιοκυττάρων (CFU-G) ή μακροφάγων (CFU-M) ή ερυθροκυττάρων (το αωρότερο burst forming unit erythroid, BFU-E και το ωριμότερο CFU-E) ή μεγακαρυοκυττάρων (CFUmegakaryocyte, CFU-MEG). Οι αωρότερες μορφές προγονικών κυττάρων χρειάζονται σαφώς 29

30 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου περισσότερες μιτώσεις και κατ επέκταση περισσότερο χρόνο προκειμένου να δημιουργήσουν τα ώριμα κύτταρα οπότε και τις αντίστοιχες αποικίες οι οποίες γι αυτόν το λόγο είναι μεγαλύτερες, δηλαδή απαρτίζονται από περισσότερα ώριμα κύτταρα, από αυτές που δημιουργούν οι ωριμότερες μορφές. Επιπλέον, ανάλογα με το είδος του CFC, η αντίστοιχη αποικία παρουσιάζει και άλλα ιδιαίτερα μορφολογικά χαρακτηριστικά που αφορούν στο χρώμα και στη μορφή της καθώς και στο μέγεθος των κυττάρων της (Εικόνα 52, ). 30

31 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα Κύτταρα που δημιουργούν αποικίες Figure Colony forming cells Η παραμονή των κλώνων στην ίδια περιοχή όπου πρωτύτερα είχε πολλαπλασιαστεί το προγονικό τους κύτταρο, δημιουργώντας έτσι την εικόνα αποικίας, επιτυγχάνεται λόγω του μεγάλου ιξώδους του βασικού καλλιεργητικού υλικού, με πιο κοινό εκπρόσωπο τη μεθυλκυτταρίνη. 52, ,163,165,166 Επιπλέον, σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των αποικιών διαδραματίζουν και οι κατάλληλες κυτοκίνες οι οποίες είναι απαραίτητες για τη διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης καθώς και σε πολλές περιπτώσεις και για την ίδια την επιβίωση των κυττάρων. 52,86, ,163,165 Πέρα όμως από τις κυτοκίνες, τόσο η δημιουργία των νέων κυττάρων κατά τη φάση του πολλαπλασιασμού όσο και η λειτουργία αυτών, απαιτούν την παρουσία και διάφορων θρεπτικών συστατικών, τα οποία προέρχονται από φυσική πηγή, όπως είναι ο ορός από το αίμα ζώων, ή είναι τεχνητό μίγμα προερχόμενο από το συνδυασμό των επιμέρους ουσιών ,163,165, Επίσης, αντιοξειδωτικοί παράγοντες, με κυριότερο εκπρόσωπο τη 2-μερκαπτοαιθανόλη, είναι απαραίτητοι για την εξουδετέρωση των ελευθέρων ριζών που παράγονται κατά το μεταβολισμό των κυττάρων και οι οποίες σε υψηλές ,163,165, συγκεντρώσεις είναι τοξικές για αυτά. Καθοριστικής σημασίας για την αποφυγή ανάπτυξης μικροοργανισμών είναι η διασφάλιση άσηπτων συνθηκών μέσω εφαρμογής συγκεκριμένων αρχών οι οποίες συμπληρώνονται με την προφυλακτική χρήση αντιβιοτικών και συνήθως της πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης. 163,165,175,176 Θρεπτικό υλικό, με 31

32 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου πιο σύνηθες το Iscove s modified Dulbecco s medium (IMDM), ισότονο και ισοοσμωτικό ως προς τα κύτταρα, και στο οποίο διαλύονται αυτά καθώς και όλοι οι προαναφερθέντες παράγοντες, είναι επίσης απαραίτητο ,163,165, Τέλος, η ύπαρξη θερμοκρασίας 37 ο C, διοξειδίου του άνθρακα (CO 2 ) σε σταθερά επίπεδα της τάξης του 5%, οξυγόνου και υγρασίας για την αποφυγή της αφυδάτωσης των κυττάρων διασφαλίζουν περαιτέρω τις ιδανικές συνθήκες για την ανάπτυξη των αποικιών ,163,165,172,173,180,181 Η ύπαρξη των CFCs αποδείχτηκε απαραίτητη για πειραματικούς σκοπούς, επειδή παρέχει έναν εύκολο και απλό τρόπο για την ανίχνευση, καταμέτρηση και ταυτοποίηση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων σε δεδομένο κυτταρικό πληθυσμό. Ειδικότερα, δίνεται η δυνατότητα μελέτης των βιολογικών ιδιοτήτων των προγονικών κυττάρων σε συγκεκριμένες καταστάσεις καθώς και μελέτης και σύγκρισης της δράσης μεμονωμένων ή συνδυασμών συγκεκριμένων παραγόντων (όπως κυτοκίνες, φάρμακα) σε αυτά, αξιολογώντας τον αριθμό και τη μορφολογία των αντίστοιχων αποικιών που αναπτύσσονται. Επιπλέον, καθίσταται δυνατή η σύγκριση διαφορετικών κυτταρικών πληθυσμών, όπως για παράδειγμα από μυελό των οστών, περιφερικό και ομφαλιοπλακουντικό αίμα, ως προς την περιεκτικότητά τους σε προγονικά κύτταρα, καθώς και η εξαγωγή διάφορων συσχετίσεων έπειτα από μεταβολές συγκεκριμένων παραμέτρων. Επομένως, μέσω του αποτελέσματος το οποίο προκαλούν, δηλαδή τις αποικίες ώριμων κυττάρων, τα CFCs συνιστούν ένα πολύτιμο εργαλείο τόσο για τη βασική έρευνα όσο και για την εφαρμοσμένη αιματολογία, επιτρέποντας τη μελέτη της αιμοποίησης αλλά και την κλινική εφαρμογή των συμπερασμάτων που προκύπτουν από αυτή, όπως λόγου χάριν ο έλεγχος παραγόντων και κυτταρικών πληθυσμών που μπορούν να 157,158,160,161,164, χρησιμοποιηθούν στις μεταμοσχεύσεις αιμοποιητικών κυττάρων. 32

33 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου 2. ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Στη φύση απαντώνται περισσότερα από αναγνωρισμένα είδη μυκήτων, κάποιοι από τους οποίους είναι συμβιωτικοί μικροοργανισμοί αποτελώντας μέρος της φυσιολογικής μικροχλωρίδας του ανθρώπινου σώματος (όπως η Candida) Λιγότεροι από 200 είναι γνωστό ότι μπορούν να προκαλέσουν μυκητιάσεις στον άνθρωπο με το 90% αυτών των μυκητιάσεων να οφείλεται σε μερικές δεκάδες μυκήτων. Οι μυκητιάσεις είναι αποτέλεσμα της εισβολής ενός μύκητα σε ένα ζώντα οργανισμό και περιλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα λοιμώξεων οι οποίες μπορεί να είναι επιφανειακές, δερματικές, υποδόριες και συστηματικές Σε συγκεκριμένες περιπτώσεις, αυτές οι λοιμώξεις καθίστανται ιδιαίτερα σοβαρές και απειλητικές για τη ζωή αποτελώντας συχνή αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας. Αυτές οι καταστάσεις αφορούν σε ανοσοκατεσταλμένους και ευαίσθητους οργανισμούς περιλαμβάνοντας κυρίως άτομα με κακοήθειες και άτομα που νοσηλεύονται στις μονάδες εντατικής θεραπείας αλλά και ηλικιωμένους, νήπια και νεογνά. Αναλυτικότερα, παράγοντες κινδύνου που ευνοούν την εμφάνιση σοβαρών μυκητιάσεων αποτελούν μεταξύ άλλων η εφαρμογή χημειο- και ακτινοθεραπείας στις αιματολογικές και μη κακοήθειες, η μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων και οργάνων, η ύπαρξη του συνδρόμου της επίκτητης ανοσοανεπάρκειας, η ύπαρξη αυτοάνοσων νοσημάτων, η εφαρμογή χειρουργικών και άλλων επεμβατικών τεχνικών όπως για παράδειγμα η χρήση καθετήρων, η χορήγηση παρεντερικής διατροφής, η διασωλήνωση (μηχανικός αερισμός) και η αιμοκάθαρση και περιτοναϊκή κάθαρση, η εκτεταμένη χορήγηση ευρέος φάσματος αντιβακτηριακών παραγόντων, η ολοένα αυξανόμενη αντοχή σε κάποια από τα διαθέσιμα αντιμυκητιασικά φάρμακα, και η προχωρημένη και πολύ μικρή ηλικία. 197, Οι μυκητιάσεις από Candida και Aspergillus είναι οι πιο κοινές αλλά και άλλοι μύκητες εμπλέκονται συχνά στην ανθρώπινη παθολογία. 197, Σε σύγκριση με τον αριθμό των αντιβακτηριακών φαρμάκων που είναι διαθέσιμα, υπάρχουν πολύ λιγότερες αντιμυκητικές ενώσεις. 201 Αυτή η καθυστέρηση στην ανάπτυξη των αντιμυκητιασικών έναντι των αντιβακτηριακών φαρμάκων είναι αναμενόμενη συνέπεια της κυτταρικής δομής των εμπλεκόμενων μικροοργανισμών. Τα βακτήρια, ως προκαρυώτες, προσφέρουν πολυάριθμους δομικούς και μεταβολικούς στόχους οι οποίοι διαφέρουν από 33

34 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου εκείνους του ανθρώπινου ξενιστή. Αντίθετα, οι μύκητες είναι ευκαρυώτες, και κατ επέκταση οι περισσότεροι παράγοντες που είναι τοξικοί γι αυτούς είναι επίσης τοξικοί για τον ξενιστή. Επιπλέον, επειδή οι μύκητες γενικά αναπτύσσονται αργά και συχνά σε πολυκύτταρες μορφές, είναι δυσκολότερη η ποσοτικοποίησή τους συγκριτικά με τα βακτήρια, περιπλέκοντας έτσι τα πειράματα εκτίμησης των in vitro και in vivo ιδιοτήτων ενός δυνητικού αντιμυκητικού παράγοντα. Παρά τους παραπάνω περιορισμούς, πολυάριθμες πρόοδοι έχουν γίνει για την ανάπτυξη νέων αντιμυκητικών ενώσεων, πιο δραστικών ή καλύτερα ανεκτών, και για την κατανόηση των υπαρχόντων. 204 Τα τελευταία χρόνια, ο αριθμός των αντιμυκητιασικών φαρμάκων αυξάνεται συνεχώς, παράλληλα με την αύξηση της συχνότητας εμφάνισης και του φάσματος των μυκητιάσεων. 201,202,205 Τα πολυένια, οι αζόλες και οι εχινοκανδίνες συνιστούν τις τρεις κύριες κατηγορίες αντιμυκητιασικών φαρμάκων που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη για τη θεραπεία των μυκητιάσεων γενικά, συστηματικών και μη, ενώ κυρίως ενδείκνυνται ως θεραπευτικές και προφυλακτικές επιλογές για τις συστηματικές και σοβαρές λοιμώξεις. 201, Τα πολύενια είναι η παλαιότερη και οι εχινοκανδίνες η νεότερη κατηγορία, ενώ και οι τρεις κατηγορίες περιλαμβάνουν παλιά και νέα μέλη Αμφοτερικίνη Β Η αμφοτερικίνη Β είναι μια αντιμυκητική ένωση η οποία ανήκει στα πολυένια. Εκτός από τη Β, υπάρχει και η αμφοτερικίνη Α, αλλά μόνο η Β χρησιμοποιείται σε κλινικό επίπεδο, επειδή είναι πιο δραστική in vivo. Αυτός ο παράγοντας αποτελεί φυσικό προϊόν του βακτηρίου Streptomyces nodosus που απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1955 από δείγματα εδάφους τα οποία είχαν συλλεχθεί από τη λεκάνη απορροής του Ορινόκου ποταμού στη Βενεζουέλα. Η αμφοτερικίνη Β είναι μια μακροκυκλική ένωση και έχει, όπως υποδηλώνει και το όνομά της, αμφοτερική φύση, καθώς αποτελείται από μια μακριά πολυανθρακική υδρόφιλη αλυσίδα και από μια εξίσου μακριά υδρόφοβη, δηλαδή λιπόφιλη, αλυσίδα που τερματίζεται από ένα αμινοσάκχαρο, τη μυκοζαμίνη (Εικόνα 2.1.1). 212,218 Εξαιτίας της αμφοτερικής της φύσης, αυτή η ένωση παρουσιάζει πολύ μικρή διαλυτότητα στο νερό και στους υδατικούς διαλύτες

35 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα Χημική δομή, μοριακός τύπος και μοριακό βάρος της αμφοτερικίνης Β. 219 Figure Chemical structure, molecular formula and molecular weight of amphotericin B. 219 Η αμφοτερικίνη Β συνιστά αντιμυκητικό παράγοντα ευρέος φάσματος έχοντας ευρεία αντιμυκητική δράση. Αναλυτικότερα, το ευρύ φάσμα δράσης της περιλαμβάνει πολλά είδη του Aspergillus, είδη της Candida, είδη του Cryptococcus και τα Mucorales. Επίσης, είναι αποτελεσματική ενάντια στους δίμορφους μύκητες (Blastomyces dermatitidis, είδη του Coccidioides, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei και Sporothrix schenckii). H Candida lusitaniae και η Candida krusei μπορεί να είναι λιγότερο ευαίσθητες, ενώ το Aspergillus terreus, κάποια είδη του Fusarium, είδη του Scedosporium και είδη του Trichosporon είναι εγγενώς ανθεκτικά. 201,212 Η αμφοτερικίνη Β δρα στους μύκητες με κάποια επιλεκτικότητα, επειδή έχει υψηλότερη συγγένεια για την εργοστερόλη, την κύρια στερόλη των κυτταρικών μεμβρανών των μυκήτων, παρά για τη χοληστερόλη που επικρατεί στα κύτταρα των θηλαστικών (Εικόνα 2.1.2). Οκτώ μόρια αμφοτερικίνης Β αλληλεπιδρούν άμεσα, μέσω των υδρόφοβων αλυσίδων τους, με οκτώ μόρια εργοστερόλης. Η κυκλική διάταξη αυτών των συμπλόκων στην κυτταρική μεμβράνη έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός πόρου ο οποίος περικλείεται από τις οκτώ υδρόφιλες αλυσίδες των μορίων της ένωσης. Η επαγωγή της δημιουργίας των πόρων στις κυτταρικές μεμβράνες των μυκήτων οδηγεί στην αύξηση της διαπερατότητας των 35

36 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου μεμβρανών, στην απώλεια κυτταρικών συστατικών και στον κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 2.1.3). 218, Εκτός από το σχηματισμό πόρων, η αλληλεπίδραση με την εργοστερόλη μπορεί απλά να επάγει μόνο τη δέσμευση, δηλαδή την παγίδευση, αυτής της στερόλης προκαλώντας διαταραχή της σταθερότητας των μεμβρανών. Επιπλέον, ο μηχανισμός δράσης της αμφοτερικίνης Β περιλαμβάνει την επαγωγή οξειδωτικού στρες εντός των μυκητικών κυττάρων με αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο. 218,220,222 Πέρα όμως από την άμεση αντιμυκητική δράση της, η αμφοτερικίνη Β μπορεί να ασκεί ποικίλη ανοσορυθμιστική δράση, παρουσία αλλά και απουσία του μύκητα, η οποία κλινικά συνδέεται με την προστατευτική της δράση, δηλαδή την ενίσχυση της ανοσοαπόκρισης κατά τη μόλυνση, αλλά παράλληλα και με την τυχόν τοξικότητά της στον ξενιστή. 220,222,223 Εικόνα Τρισδιάστατη χημική δομή της αμφοτερικίνης Β, της εργοστερόλης και της χοληστερόλης (γκρι: άνθρακας, γαλάζιο: υδρογόνο, κόκκινο: οξυγόνο, μπλε: άζωτο). Η εργοστερόλη έχει κυλινδρικό σχήμα επιτρέποντας την καλύτερη σύνδεσή της στην υδρόφοβη πλευρά της αμφοτερικίνης Β, αντίθετα με τη χοληστερόλη που έχει σιγμοειδές σχήμα. (τροποποιημένη) 224 Figure Three-dimensional chemical structure of amphotericin B, ergosterol and cholesterol (grey: carbon, light blue: hydrogen, red: oxygen, blue: nitrogen). Ergosterol has a cylindrical shape enabling its better bindng to the hydrophobic side of amphotericin B, unlike cholesterol which has a sigmoid shape. (modified)

37 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα Διάχυση της αμφοτερικίνης Β (κόκκινο) μέσω του μυκητικού κυτταρικού τοιχώματος στην κυτταρική μεμβράνη, σύνδεση με την εργοστερόλη (μωβ) της λιπιδικής διπλοστιβάδας, δημιουργία πόρων, διαφυγή κυτταρικών στοιχείων και λύση του μύκητα. 225 Figure Diffusion of amphotericin B (red) through the fungal cell wall to the cell membrane, binding to lipid bilayer ergosterol (mauve), creation of pores, leak of cell constituents and fungal lysis

38 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β Επειδή, όπως προαναφέρθηκε, η αμφοτερικίνη Β παρουσιάζει πολύ μικρή διαλυτότητα, χορηγείται ως μικυλλιακό εναιώρημα με ένα απορρυπαντικό (επιφανειοδραστικό παράγοντα), το δεοξυχολικό νάτριο. Αυτό το σύμπλοκο αποτελεί τη συμβατική μορφή της αμφοτερικίνης Β φέροντας την εμπορική ονομασία Fungizone, ενώ συνιστά το πρώτο αποτελεσματικό αντιμυκητιασικό φάρμακο το οποίο έγινε για πρώτη φορά διαθέσιμο για κλινική χρήση το 1959 και έκτοτε έχει θεωρηθεί ως ο χρυσός κανόνας στην αντιμυκητιασική προστασία για πολλά χρόνια ,226 Εν τούτοις, η συμβατική αμφοτερικίνη Β είναι ιδιαίτερα τοξική για διάφορους τύπους κυττάρων in vitro, in vivo και στην κλινική πράξη. Λόγω της αυξημένης τοξικότητάς της περιορίζεται η κλινική της χρησιμότητα, αφού συχνά, για την αντιμετώπιση της μυκητίασης, μόνο υποβέλτιστες δόσεις της μπορούν να χορηγηθούν για ανεπαρκή διάρκεια. Μεταξύ άλλων, η νεφροτοξικότητα και η μυελοτοξικότητα είναι οι κυριότερες ανεπιθύμητες ενέργειες του φαρμάκου , Αυτή η τοξικότητα οφείλεται σε μεταβολές της διαπερατότητας των μεμβρανών των νεφρικών κυττάρων και των κυττάρων του μυελού των οστών, εξαιτίας της απελευθέρωσης των μορίων της αμφοτερικίνης Β από το δεοξυχολικό και της αλληλεπίδρασής τους με τη χοληστερόλη αυτών των μεμβρανών. 222,226,227 Επίσης, αυτή η τοξικότητα οφείλεται στη σύνδεση της απελευθερωθείσας από το δεοξυχολικό αμφοτερικίνης Β με τις λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (low-density lipoproteins, LDLs) και στην πρόσληψη αυτών των συμπλόκων από κύτταρα που φέρουν LDL υποδοχείς. Μετά την ενδοκύτωση, η αμφοτερικίνη Β απελευθερώνεται εύκολα από τις LDLs και προκαλεί κυτταρικές μεταβολές και τοξικότητα. 221,222,226 Επιπλέον, η αμφοτερικίνη Β είναι αιμολυτική και όλες οι τοξικές της επιπτώσεις επιδεινώνονται από την τοξική για τις μεμβράνες δράση του δεοξυχολικού. 222,226 Εκτός από τις παραπάνω ανεπιθύμητες ενέργειες, η συμβατική αμφοτερικίνη Β προκαλεί και διάφορες άμεσες αντιδράσεις που σχετίζονται με την έγχυσή της, όπως λόγου χάριν πυρετό, ρίγος, αίσθημα κακουχίας, κεφαλαλγία, κοιλιακό πόνο, ναυτία, εμετό, διάρροια, απώλεια βάρους, μυαλγία και αρθραλγία ,226,227 Αυτές οι αντιδράσεις οφείλονται στις ανοσορυθμιστικές ιδιότητες αυτού του φαρμάκου οι οποίες στην προκειμένη αναφέρονται στην επαγωγή προφλεγμονώδους απόκρισης από τα ανοσοκύτταρα της έμφυτης μη ειδικής άμυνας του ξενιστή ,227,228 38

39 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Λιποσωμική αμφοτερικίνη Β Εξαιτίας του λιπόφιλου χαρακτήρα της αμφοτερικίνης Β και της συγγένειάς της για τα μεμβρανικά λιπίδια, αυτή η ένωση μπορεί να ενσωματωθεί μέσα σε περιέχοντα φωσφολιπίδια λιποσώματα δημιουργώντας ένα σύμπλοκο το οποίο αποτελεί τη λιποσωμική μορφή της αμφοτερικίνης Β και φέρει την εμπορική ονομασία AmBisome ως συνέχεια του αρχικού χαρακτηρισμού VS104 (Εικόνα ). 221,222,226,229,230 Η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β αναπτύχθηκε με σκοπό τη μείωση της τοξικότητας και την αύξηση της αποτελεσματικότητας της συμβατικής μορφής συνιστώντας το νέο χρυσό κανόνα της αντιμυκητιασικής προστασίας με πολυένια, και έγινε για πρώτη φορά διαθέσιμη για κλινική χρήση το ,222,226, Εικόνα Λιποσωμική αμφοτερικίνη Β. (τροποποιημένη) 225,232 Figure Liposomal amphotericin B. (modified) 225,232 Η πρώτη περιγραφή λιποσωμάτων έγινε το 1965 από τους Bangham, Standish και Watkins οι οποίοι περιέγραψαν κλειστές διπλόστιβες δομές που σχηματίζονταν όταν φωσφολιπίδια βρίσκονταν σε νερό. 233 Η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β συνίσταται από μικρά λιποσώματα, αποτελούμενα από υδρογονωμένη φωσφατιδυλοχολίνη σόγιας, χοληστερόλη και διστεαροϋλ-φωσφατιδυλογλυκερόλη, με τα μόρια της αμφοτερικίνης Β να βρίσκονται διασκορπισμένα και σφιχτά ενσωματωμένα παντού στην επιφάνεια της λιπιδικής διπλοστιβάδας με παρόμοιο τρόπο όπως στην κυτταρική μεμβράνη του μύκητα (Εικόνα ). Αυτή η λιποσωμική μορφή της αμφοτερικίνης Β παρουσιάζει σημαντικά μειωμένη τοξικότητα για διάφορους τύπους κυττάρων in vitro, in vivo και στην κλινική πράξη συγκριτικά 39

40 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου με τη συμβατική μορφή αυτής γεγονός που την καθιστά κλινικά απαραίτητη. 221,222,226,229,230 Το βελτιωμένο προφίλ ασφάλειας και ανεκτικότητας της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β συγκριτικά με τις σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες της συμβατικής μορφής οφείλεται κυρίως στα μειωμένα επίπεδα της ελεύθερης αντιμυκητικής ένωσης, στην ελαττωμένη συγγένεια για τις LDLs, και στη στοχευμένη μεταφορά στα σημεία της μόλυνσης με επακόλουθη αποδέσμευση της αμφοτερικίνης Β από το λιπόσωμα και επιλεκτική αλληλεπίδραση αυτής με την κυτταρική μεμβράνη του μύκητα παράλληλα με τη μηδαμινή τοξικότητα του λιποσώματος για τον ξενιστή (Εικόνες και 2.1.3). 221,222,226,229 Επίσης, αντιδράσεις σχετιζόμενες με την έγχυση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β εξασθενούν, γεγονός που οφείλεται στις ανοσορυθμιστικές ιδιότητες αυτού του φαρμάκου οι οποίες στην προκειμένη αφορούν στην επαγωγή αντιφλεγμονώδους απόκρισης ,234 Εικόνα Επιλεκτική μεταφορά της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β στα μυκητικά κύτταρα, δέσμευση στο κυτταρικό τοίχωμα, απομάκρυνση της αμφοτερικίνης Β από το λιπόσωμα και διαταραχή της λιποσωμικής δομής. 225 Figure Selective transfer of liposomal amphotericin B to the fungal cells, binding to the cell wall, dissociation of amphotericin B from the liposome and disruption of the liposome structure

41 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου 2.2 Βορικοναζόλη Η βορικοναζόλη, πρωτύτερα γνωστή ως UK-109,496, είναι ένας αντιμυκητικός παράγοντας ο οποίος ανήκει στις αζόλες. Πρόκειται για μια τριαζόλη δεύτερης γενιάς και συγκεκριμένα για μια συνθετική ένωση η οποία είναι παράγωγο μιας τριαζόλης πρώτης γενιάς, της φλουκοναζόλης. Η βορικοναζόλη αποτελεί την πρώτη από τις νεότερες τριαζόλες η οποία έγινε για πρώτη φορά διαθέσιμη για κλινική χρήση το 2002 με την εμπορική ονομασία 212, VFend. Αυτό το φάρμακο δημιουργήθηκε σε μια προσπάθεια βελτίωσης της αποτελεσματικότητας και μείωσης της τοξικότητας των διαθέσιμων αντιμυκητιασικών 212, φαρμάκων. Ειδικότερα, αυτή η νεότερη τριαζόλη είναι το αποτέλεσμα της συστηματικής προσπάθειας για την ενίσχυση της δραστικότητας και τη διεύρυνση του φάσματος δράσης της φλουκοναζόλης, κάτι που κατέστη δυνατό με την προσθήκη μιας α- μεθυλομάδας και μιας 4-φθοριοπυριμιδίνης στο μόριο της παλαιότερης τριαζόλης (Εικόνα 2.2.1). 212, , Εικόνα Χημική δομή, μοριακός τύπος και μοριακό βάρος της βορικοναζόλης και της φλουκοναζόλης. 244,245 Figure Chemical structure, molecular formula and molecular weight of voriconazole and fluconazole. 244,245 41

42 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Η βορικοναζόλη έχει ένα ευρύ φάσμα δράσης. Παρουσιάζει υψηλή δραστικότητα ενάντια σε είδη του Aspergillus, είδη του Fusarium και είδη του Scedosporium, καθώς και είδη της Candida, είδη του Cryptococcus και είδη του Trichosporon. Επίσης, έχει ισχυρή δράση ενάντια στους δίμορφους μύκητες (B. dermatitidis, είδη του Coccidioides, H. capsulatum και P. marneffei) και σε πολλούς δεματιοειδείς μύκητες, αλλά φαίνεται να μην είναι αποτελεσματική έναντι των Mucorales. 201,236 Η βορικοναζόλη είναι ένας ισχυρός αναστολέας της βιοσύνθεσης της εργοστερόλης των κυτταρικών μεμβρανών των μυκήτων. Αυτή η ένωση δεσμεύεται στο συμπαράγοντα αίμης στο ενεργό κέντρο του εξαρτώμενου από το κυτόχρωμα P-450 ενζύμου λανοστερολ-14- α-απομεθυλάση (Εικόνα 2.2.2), και αναστέλλει τη δράση της εμποδίζοντας κατ αυτόν τον τρόπο τη μετατροπή της λανοστερόλης σε εργοστερόλη. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την εξάντληση της εργοστερόλης και τη συσσώρευση μεθυλιωμένων πρόδρομων στερολών, δηλαδή τοξικών στεροειδών, οδηγώντας στη διαταραχή της δομής και της λειτουργίας των κυτταρικών μεμβρανών και στην αναστολή της ανάπτυξης των μυκήτων (Εικόνα 2.2.3). 212, ,239,241,242,246 Επιπλέον, αυτή η εξάντληση της εργοστερόλης και η συσσώρευση μεθυλιωμένων προδρόμων προκαλεί γενικευμένη ενεργοποίηση της σύνθεσης της χιτίνης, ενός σημαντικού καθοριστικού παράγοντα στη μορφογένεση των μυκήτων η ρύθμιση της σύνθεσης του οποίου είναι κρίσιμη για το σχηματισμό φυσιολογικής δομής κυτταρικού τοιχώματος. Αδιάκριτη σύνθεση χιτίνης μπορεί να έχει δηλητηριώδεις επιπτώσεις στο κυτταρικό τοίχωμα των μυκήτων. 241,247 Η βορικοναζόλη επίσης αναστέλλει το ενζυμικό σύστημα του ανθρώπινου ηπατικού κυτοχρώματος P-450 συνιστώντας έναν αναστολέα των τριών ισοενζύμων του κυτοχρώματος, CYP-2C19, CYP-2C9 και CYP-3A4, των οποίων αποτελεί και υπόστρωμα Ωστόσο, είναι περισσότερο επιλεκτική για τα ένζυμα του κυτοχρώματος P-450 των μυκήτων από ότι για τα διάφορα ενζυμικά συστήματα του κυτοχρώματος P-450 των θηλαστικών. 235 Εκτός όμως από την άμεση αντιμυκητική δράση της, η βορικοναζόλη μπορεί να επιδρά με διάφορους τρόπους στα ανοσοκύτταρα της έμφυτης μη ειδικής άμυνας του ξενιστή προκαλώντας ανοσορύθμιση, παρουσία αλλά και απουσία του 223,238, μύκητα. 42

43 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα Τρισδιάστατη χημική δομή της λανοστερολ-14-α-απομεθυλάσης και της βορικοναζόλης (γκρι: άνθρακας, ανοιχτό μπλε: υδρογόνο, μπλε: άζωτο, κόκκινο: οξυγόνο, ανοιχτό κόκκινο: σίδηρος, λαχανί: φθόριο). Η βορικοναζόλη αλληλεπιδρά με το ένζυμο μέσω σύνδεσης του ατόμου αζώτου του τριαζολικού δακτυλίου της με το άτομο σιδήρου του ενεργού κέντρου του ενζύμου (βέλος) και μέσω δέσμευσης του υπόλοιπου μορίου της στην αποπρωτεΐνη του ενζύμου. (τροποποιημένη) 224 Figure Three-dimensional chemical structure of lanosterol-14-α-demethylase and voriconazole (grey: carbon, light blue: hydrogen, blue: nitrogen, red: oxygen, light red: iron, light green: fluorine). Voriconazole interacts with the enzyme through binding of the nitrogen atom in its triazole ring to the iron atom at the active site of the enzyme (arrow) and through binding of the remainder of its molecule to the apoprotein of the enzyme. (modified) 224 Εικόνα Φυσιολογική σύνθεση εργοστερόλης (αριστερά) και προκαλούμενη από τη βορικοναζόλη αναστολή αυτής ακολουθούμενη από τη συσσώρευση τοξικών στερολών στη μυκητική κυτταρική μεμβράνη (δεξιά). (τροποποιημένη) 252 Figure Normal ergosterol synthesis (left) and voriconazole-induced inhibition of this followed by the accumulation of toxic sterols in the fungal cell membrane (right). (modified)

44 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Η βορικοναζόλη αποτελεί ένα νέο μέτρο στην ανάγκη για αποτελεσματικότερη αντιμυκητιασική προστασία. 212, , Όπως όλα τα φάρμακα, έτσι και η βορικοναζόλη μπορεί να προκαλέσει ανεπιθύμητες ενέργειες, αλλά είναι γενικά καλώς ανεκτή εμφανίζοντας αποδεκτό προφίλ ασφάλειας. 212, Η μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα και η μικρότερη τοξικότητα αυτού του φαρμάκου καθιστούν δυνατή την ευρεία χρήση του σε κλινικό επίπεδο. 212, Κασποφουγκίνη Η κασποφουγκίνη, άλλοτε γνωστή ως ΜΚ-0991 και ακόμη παλαιότερα ως L-743,872, είναι μια αντιμυκητική ένωση η οποία ανήκει στις εχινοκανδίνες. Πρόκειται για ένα ημισυνθετικό κυκλικό λιποπεπτίδιο, παράγωγο της πνευμοκανδίνης Β 0, ενός προϊόντος ζύμωσης του μύκητα Glarea lozoyensis που απομονώθηκε από την κοιλάδα του ποταμού Lozoya στη βόρεια Ισπανία (Εικόνα 2.3.1). Η κασποφουγκίνη είναι ο πρώτος εκπρόσωπος των εχινοκανδινών ο οποίος έγινε για πρώτη φορά διαθέσιμος για κλινική χρήση το 2001 με την εμπορική ονομασία Cancidas. 212, Αυτό το φάρμακο ανταποκρίνεται στις ανάγκες για καλύτερη αντιμυκητιασική προστασία, διαθέτοντας δραστικότητα συγκρίσιμη με αυτήν της 212, αμφοτερικίνης Β και ανεκτικότητα συγκρίσιμη με αυτήν της φλουκοναζόλης. Εικόνα Χημική δομή, μοριακός τύπος και μοριακό βάρος της κασποφουγκίνης. 265 Εικόνα Chemical structure, molecular formula and molecular weight of caspofungin

45 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Η κασποφουγκίνη έχει σχετικά ευρεία αντιμυκητική δράση. Είναι αποτελεσματική ενάντια σε είδη του Aspergillus, αλλά όχι ενάντια στα δερματόφυτα. Έχει μεταβλητή δραστικότητα ενάντια στο Coccidioides immitis, στο H. capsulatum και στους δεματιοειδείς μύκητες. Είναι δραστική ενάντια στα περισσότερα είδη της Candida, αλλά η C. parapsilosis, η C. lusitaniae, η C. guilliermondii και η C. krusei είναι λιγότερο ευαίσθητες. Είδη του Cryptococcus και είδη του Trichosporon, καθώς και είδη του Fusarium και τα Mucorales είναι ανθεκτικά. Επίσης, είναι αποτελεσματική ενάντια στο Pneumocystis carinii. 201,254 Η κασποφουγκίνη είναι επιλεκτικά δραστική έναντι των μυκήτων, καθώς εξειδικευμένα αναστέλλει τη σύνθεση της β-(1,3)-d-γλυκάνης, ενός αναπόσπαστου συστατικού του κυτταρικού τοιχώματος πολλών παθογόνων μυκήτων το οποίο δεν υπάρχει στα κύτταρα των θηλαστικών. Η συνθετάση της β-(1,3)-d-γλυκάνης είναι ένα ένζυμο το οποίο συναντάται στους περισσότερους παθογόνους μύκητες και το οποίο απουσιάζει από τα κύτταρα των θηλαστικών. Πρόκειται για μια μεγάλη παρεμβαλλόμενη μεμβρανική ετεροδιμερή πρωτεΐνη που αποτελείται από μια καταλυτική μεμβρανική υπομονάδα, την Fks p, η οποία δεσμεύει την ενδοκυττάρια UDP-γλυκόζη, και από μια ρυθμιστική υπομονάδα, τη Rho 1 p, η οποία δεσμεύει το ενδοκυττάριο GTP. Αυτό το σύμπλοκο πολυμερίζει την UDP-γλυκόζη σε γλυκάνη η οποία προοδευτικά απελευθερώνεται στην εξωκυττάρια πλευρά προκειμένου μετά να ενσωματωθεί στο κυτταρικό τοίχωμα του μύκητα. Οι αλυσίδες της β-(1,3)-d-γλυκάνης σχηματίζουν ένα συμπαγές τρισδιάστατο πλέγμα που δίνει στο κυτταρικό τοίχωμα το σχήμα και τη μηχανική αντοχή του. Η κασποφουγκίνη δρα ως ειδικός μη συναγωνιστικός αναστολέας του ενζύμου μπλοκάροντας την καταλυτική υπομονάδα Fks p. Η διαταραχή της ακεραιότητας του κυτταρικού τοιχώματος από αυτόν τον παράγοντα οδηγεί σε οσμωτική αστάθεια και τελική λύση του μύκητα (Εικόνες και 2.3.3). 212,254,255,266 Πέρα όμως από την άμεση αντιμυκητική δράση της, η κασποφουγκίνη έχει και ανοσορυθμιστικές ιδιότητες επιδρώντας ποικιλοτρόπως στα ανοσοκύτταρα της έμφυτης μη ειδικής άμυνας του ξενιστή, παρουσία αλλά και απουσία 223,251, του μύκητα. 45

46 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα Συνθετάση της β-(1,3)-d-γλυκάνης, υπεύθυνη για τη σύνθεση της β-(1,3)-d-γλυκάνης και o στόχος της κασποφουγκίνης (τρισδιάστατη χημική δομή γκρι: άνθρακας, γαλάζιο: υδρογόνο, κόκκινο: οξυγόνο, μπλε: άζωτο). (τροποποιημένη) 224 Figure Β-(1,3)-D-glucan synthetase, responsible for the synthesis of β-(1,3)-d-glucan and the target of caspofungin (three-dimensional chemical structure grey: carbon, light blue: hydrogen, red: oxygen, blue: nitrogen). (modified) 224 Εικόνα Φυσιολογική σύνθεση β-(1,3)-d-γλυκάνης (αριστερά) και προκαλούμενη από την κασποφουγκίνη αναστολή αυτής ακολουθούμενη από την αναστολή της σύνθεσης του μυκητικού κυτταρικού τοιχώματος (δεξιά). (τροποποιημένη) 271 Figure Normal β-(1,3)-d-glucan synthesis (left) and caspofungin-induced inhibition of this followed by the inhibition of the fungal cell wall synthesis (right). (modified)

47 Διδακτορική διατριβή Εισαγωγή Μαρία Σαμαλίδου Η αυξημένη αποτελεσματικότητα και η μειωμένη τοξικότητα της κασποφουγκίνης αυξάνουν την κλινική χρησιμότητά της. 212, Αυτό το φάρμακο, έχοντας σημείο-στόχο που εντοπίζεται στο κυτταρικό τοίχωμα και όχι στην κυτταρική μεμβράνη, παρέχει τη δυνατότητα για αποτελεσματικότητα σε λοιμώξεις προκαλούμενες από παθογόνα ανθεκτικά στα προαναφερθέντα αντιμυκητιασικά φάρμακα καθώς και για συνδυαστική δραστικότητα σε περίπτωση που χρησιμοποιηθεί μαζί με αυτά διευκολύνοντας την πρόσβασή τους στα σημεία-στόχους τους στην κυτταρική μεμβράνη. 212, , ,272 Όπως όλα τα φάρμακα, έτσι και η κασποφουγκίνη δε στερείται ανεπιθύμητων ενεργειών, αλλά είναι γενικά πολύ καλώς ανεκτή παρουσιάζοντας ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας λόγω της μειωμένης πιθανότητας εμφάνισης τοξικότητας εξαιτίας του μηχανισμού δράσης που παρατηρείται με την αμφοτερικίνη Β. 212, ,263 47

48 ΣΚΟΠΟΣ

49 Διδακτορική διατριβή Σκοπός Μαρία Σαμαλίδου H λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη αποτελούν τρία αντιμυκητιασικά φάρμακα τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως σε κλινικό επίπεδο κυρίως στη θεραπεία και προφύλαξη από τις συστηματικές και σοβαρές μυκητιασικές λοιμώξεις. Μάλιστα, τέτοια άτομα, με υψηλή συχνότητα εμφάνισης αυτών των λοιμώξεων, είναι δυνατό να λαμβάνουν τα συγκεκριμένα φάρμακα για μακρά χρονική περίοδο. Είναι γνωστό ότι, αυτά τα τρία νεότερα αντιμυκητιασικά είναι λιγότερο τοξικά για διάφορους τύπους κυττάρων, συγκριτικά με την τοξική οπότε και περιορισμένης κλινικής χρησιμότητας παλαιότερη μορφή της αμφοτερικίνης Β. Εν τούτοις, η επίδραση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης σε αιμοποιητικά κύτταρα δεν έχει διασαφηνιστεί. Αυτά τα κύτταρα έχουν μεγάλη σημασία για τον οργανισμό, διότι ευθύνονται για την αιμοποίησή του. Αναμενόμενα, λοιπόν, δημιουργείται η ανάγκη για εξέταση της συμπεριφοράς των παραπάνω νεότερων αντιμυκητιασικών φαρμάκων στη διαδικασία της αιμοποίησης. Συνεπώς, στόχος της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η διερεύνηση της δράσης της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης σε αιμοποιητικά κύτταρα. 49

50 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

51 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου 1. Πηγές υλικού μελέτης Το υλικό μελέτης περιελάμβανε βιολογικά δείγματα που προέρχονταν από πειραματόζωα και από υγιείς ανθρώπους. 1.1 Πειραματόζωα Συγγενικά ποντίκια της σειράς C57Bl/6 διατηρούνταν στην εγκεκριμένη εγκατάσταση εκτροφής και πειραματισμού με κωδικό EL 54 BIO 14 της Μονάδας Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας (Πειραματικό Εργαστήριο) της Αιματολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών (ΜΜΜΟ) του Γενικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης «Γεώργιος Παπανικολάου». Τα ποντίκια διαβίωναν σε συνθήκες τεχνητής φωτοπεριοδικότητας 10 ωρών ημέρας και 14 ωρών νύχτας, θερμοκρασίας ο C και υγρασίας 50 60%. Επίσης, αυτά διατηρούνταν σε ειδικούς κλωβούς από πλέξιγκλας με μεταλλική σχάρα και με στρώση από ροκανίδι έχοντας ελεύθερη πρόσβαση σε τυποποιημένη και καθορισμένης περιεκτικότητας σε θρεπτικά συστατικά τροφή και σε οξινισμένο νερό. Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από τη Διεύθυνση Κτηνιατρικής (Γενική Διεύθυνση Ανάπτυξης, Νομαρχιακή Αυτοδιοίκηση Θεσσαλονίκης, Νομός Θεσσαλονίκης, Περιφέρεια Κεντρικής Μακεδονίας) και εφαρμόστηκαν σε συμφωνία με τις ιδρυματικές και εθνικές οδηγίες περί φροντίδας και χρήσης των πειραματοζώων καθώς επίσης και με τις σχετικές οδηγίες του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και Συμβουλίου. 1.2 Άνθρωποι Υγιή άτομα προσέρχονταν εθελοντικά ως δότες αιμοποιητικών κυττάρων προς μεταμόσχευση στην Αιματολογική Κλινική και ΜΜΜΟ και στη Δημόσια Τράπεζα Βλαστοκυττάρων του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου». Κατόπιν ιατρικής ενημέρωσης, αυτά τα άτομα υπέγραφαν κατά βούληση μια φόρμα συγκατάθεσης με την οποία έδιναν τη γραπτή συναίνεσή τους για χρησιμοποίηση για ερευνητικούς σκοπούς μέρους του μυελού των οστών ή του κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ή του ομφαλιοπλακουντικού αίματος που ούτως 51

52 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου ή άλλως παρείχαν ως μόσχευμα για κλινικούς σκοπούς, σύμφωνα με εγκεκριμένες από την τοπική ιατρική επιτροπή δεοντολογίας διαδικασίες. 2. Απομόνωση και ημιστερεή καλλιέργεια αιμοποιητικών κυττάρων (CFU δοκιμές) 2.1 Μυελός των οστών ποντικών Όλη η διαδικασία γινόταν υπό στείρες συνθήκες και όπως περιγράφεται στο τεχνικό εγχειρίδιο περί των μυϊκών CFU δοκιμών χρησιμοποιώντας μεθυλκυτταρίνη Απομόνωση Φυσιολογικά ποντίκια, ηλικίας 9 έως 12 εβδομάδων, θυσιάζονταν με αυχενική εξάρθρωση έπειτα από αναισθησία με αιθέρα και λαμβάνονταν οι κνήμες τους. Φρέσκος ολικός μυελός των οστών συλλεγόταν με έκπλυση των κνημών μέσω έγχυσης IMDM με 2% ορό εμβρύου βοός (fetal bovine serum, FBS) (αυτά τα αντιδραστήρια από την Gibco Life Technologies, Paisley, Ηνωμένο Βασίλειο) σε αυτές με τη βοήθεια σύριγγας. Έπειτα, με τη σύριγγα διαλύονταν τα συσσωματώματα των κυττάρων και το κυτταρικό εναιώρημα διηθούνταν με φίλτρο με μέγεθος πόρων 70 μm. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση του εναιώρηματος των κυττάρων στις 2500 rpm για 10 min στους 4 ο C και επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 1 ml IMDM με 2% FBS Ημιστερεή καλλιέργεια Τα κύτταρα μυελού των οστών του εναιωρήματος μετρούνταν μικροσκοπικά σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer χρησιμοποιώντας 3% οξικό οξύ με κυανούν του μεθυλενίου (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Καναδάς). Ο αριθμός των κυττάρων / ml εναιωρήματος υπολογιζόταν βάσει του τύπου: αριθμός κυττάρων στα 4 μεγάλα τετράγωνα 52

53 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου της πλάκας Neubauer (με 16 μικρά τετράγωνα το καθένα) / 4 συντελεστή αραίωσης Τα κύτταρα του μυελού των οστών καλλιεργούνταν σε συγκέντρωση 3, κύτταρα / ml σε ημιστερεό μέσο 1% μεθυλκυτταρίνης (Stem Cell Technologies) συμφώνως προς τις οδηγίες του παρασκευαστή. Οι καλλιέργειες γίνονταν παρουσία 15% FBS, 1% αλβουμίνης ορού βοός (bovine serum albumin, BSA Stem Cell Technologies), 10-4 M 2-μερκαπτοαιθανόλης (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Buchs SG, Ελβετία) και IMDM με 1% πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη (Gibco Life Technologies), ενώ περιείχαν και 0,4 ng/ml SCF, 2 ng/ml IL-3, 0,1 ng/ml GM-CSF, 40 ng/ml IL-6 και 1,2 U/ml EPO (αυτές οι κυτοκίνες από την R&D Systems, Minneapolis, MN, ΗΠΑ). Στα πειράματα υπό την παρουσία μεμονωμένων κυτοκινών, 50 ng/ml SCF, ή 10 ng/ml IL-3, ή 10 ng/ml GM-CSF, ή 40 ng/ml IL-6, ή 10 ng/ml G-CSF (R&D Systems), ή 3 U/ml EPO προστέθηκαν. Επίσης, έγιναν και καλλιέργειες απουσία κυτοκινών. Όλες οι καλλιέργειες επιστρώνονταν εις διπλούν σε τρυβλία με διάμετρο 35 mm με ή χωρίς διάφορες συγκεντρώσεις των αντιμυκητιασικών φαρμάκων δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β (60, 600, 6000 ng/ml, Fungizone Gibco Life Technologies), λιποσωμική αμφοτερικίνη Β (6, 60, 600, 6000 ng/ml, AmBisome Gilead Sciences Limited, Carrigtohill, County Cork, Ιρλανδία), βορικοναζόλη (4, 20, 100, 500 ng/ml, VFend Pfizer PGM, Pocé-sur-Cisse, Γαλλία) και κασποφουγκίνη (0,4, 2, 10, 50 ng/ml, Cancidas Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Ολλανδία). Τα τρυβλία των καλλιεργειών τοποθετούνταν σε επωαστικό κλίβανο, όπου επωάζονταν για 7 ημέρες στους 37 o C σε υγρή ατμόσφαιρα με 5% CO 2. Ακολουθούσε καταμέτρηση των αποικιών που δημιουργούνταν με χρήση ανάστροφου μικροσκοπίου και ενός τρυβλίου, το οποίο έφερε γραμμές στη βάση του διαιρώντας την σε μικρά τετράγωνα, εφαρμόζοντας συγκεκριμένα κριτήρια για την ταυτοποίησή τους (Πίνακας 2.1.2). 53

54 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου Πίνακας Τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά αποικιών ώριμων κυττάρων προερχόμενων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα ποντικών. Table Standard morphological features of colonies of mature cells derived from mouse hematopoietic progenitor cells. Τύπος προγονικού αιμοποιητικού κυττάρου CFU-GM BFU-E CFU-GEMM Περιγραφή αντίστοιχης αποικίας Αποικία αποτελούμενη από έως χιλιάδες κοκκιοκύτταρα (προερχόμενη από CFU-G), μακροφάγα (προερχόμενη από CFU-Μ), ή κοκκιοκύτταρα και μακροφάγα (προερχόμενη από CFU-GΜ), τα οποία είναι οργανωμένα σε 1 ή περισσότερες, κοντινές μεταξύ τους, ομάδες. Η αποικία μπορεί να φαίνεται ως ένας πυκνός πυρήνας κυττάρων περιτριγυρισμένος από σκορπισμένα μεμονωμένα κύτταρα. Τα μακροφάγα είναι μεγάλα κύτταρα με ωοειδές ή κυκλικό σχήμα, άχρωμα και εμφανίζουν κοκκώδες ή γκρι κέντρο. Τα κοκκιοκύτταρα είναι στρόγγυλα, άχρωμα, φωτεινά και πολύ μικρότερα και πιο ομοιόμορφα σε μέγεθος από τα μακροφάγα. Αποικία αποτελούμενη από έως χιλιάδες ερυθροβλάστες, οργανωμένους σε 3 ή περισσότερες ομάδες, ενώ μπορεί να έχει έναν πυκνό πυρήνα ή μπορεί οι ομάδες κυττάρων να είναι σχετικά διασκορπισμένες. Τα κύτταρα έχουν κόκκινο, πορτοκαλί ή ανοιχτό καφέ χρώμα, ακανόνιστο σχήμα, είναι μικροσκοπικά και δύσκολο να διακριθούν αφού εμφανίζονται ενωμένα μαζί και όχι ως μεμονωμένα κύτταρα. Αποικία που αποτελείται γενικά από περισσότερα από 500 ώριμα κύτταρα και έχει έναν πολύ πυκνό πυρήνα κυττάρων με ένα δυσδιάκριτο όριο ανάμεσα σε αυτόν και στα περιφερειακά κύτταρα. Οι ομάδες των ερυθροβλαστών είναι συχνά ορατές κατα μήκος της περιφέρειας της αποικίας. Τα μακροφάγα και τα κοκκιοκύτταρα είναι εύκολα αναγνωρίσιμα, ενώ παρατηρούνται και ομάδες μεγακαρυοκυττάρων, τα οποία συνιστούν πολύ μεγάλα, στρόγγυλα και ιδιαίτερα διαυγή σαν σταγόνες νερού κύτταρα. 2.2 Μυελός των οστών, κινητοποιημένο περιφερικό αίμα και ομφαλιοπλακουντικό αίμα ανθρώπων Όλη η διαδικασία γινόταν υπό ασηπτικές συνθήκες και όπως περιγράφεται στο τεχνικό εγχειρίδιο περί των ανθρώπινων CFU δοκιμών χρησιμοποιώντας μεθυλκυτταρίνη

55 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου Απομόνωση Μυελός των οστών, εμπύρηνα κύτταρα από κινητοποιημένο με G-CSF περιφερικό αίμα και εμπύρηνα κύτταρα από ομφαλιοπλακουντικό αίμα υγιών δοτών συλλέγονταν από το προσωπικό του νοσοκομείου ακολουθώντας τις εγκεκριμένες σχετικές ιδρυματικές κατευθυντήριες οδηγίες. Από αυτές τις συλλογές λαμβανόταν φρέσκο δείγμα το οποίο αραιωνόταν με προσθήκη IMDM με 2% FBS σε αναλογία 1:1 και στη συνέχεια εμπλουτιζόταν σε μονοπύρηνα κύτταρα μέσω φυγοκέντρησης διαβάθμισης πυκνότητας με χρήση διαχωριστικού μέσου διαλύματος φικόλης (πυκνότητα 1,077 g/ml Biochrom KG, Berlin, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του παρασκευαστή. Πιο συγκεκριμένα, το κυτταρικό εναιώρημα επιστοιβαζόταν σε ίσο όγκο διαλύματος φικόλης αργά και προσεκτικά ώστε να αποφευχθεί η ανάμειξή τους. Κατ αυτόν τον τρόπο, ήταν εφικτή η δημιουργία δύο στρωμάτων όπου πάνω στο υγρό υψηλής πυκνότητας επικαθόταν το υγρό χαμηλότερης πυκνότητας. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση στις 2500 rpm για 20 min στους 4 ο C μετά το τέλος της οποίας δημιουργούνταν 4 ζώνες, η στιβάδα των κυττάρων που καθίζαναν λόγω της μεγαλύτερης πυκνότητάς τους και η οποία αποτελούνταν από τα ερυθροκύτταρα, τα κοκκιοκύτταρα, τις πρόδρομες μορφές τους, τα μεγακαρυοκύτταρα καθώς και νεκρά κύτταρα, η στιβάδα της φικόλης ακριβώς από πάνω, το χαμηλότερης πυκνότητας νεφελώδες υπόλευκο στρώμα των μονοπυρηνικών κυττάρων απαρτιζόμενο από τα λεμφοκύτταρα, τα μονοκύτταρα και τα αιμοποιητικά κύτταρα, και ακριβώς από πάνω τα αιμοπετάλια και το πλάσμα. Τα μονοπύρηνα κύτταρα της μεσόφασης συλλέγονταν και πλένονταν με προσθήκη ίσου όγκου Hank s balanced salt solution (χωρίς ερυθρό της φαινόλης Gibco Life Technologies) και φυγοκέντρηση στις 1800 rpm για 10 min στους 4 ο C. Ακολουθούσε επαναιώρηση του ιζήματος των μονοπύρηνων κυττάρων σε 1-2 ml IMDM που περιείχε 2% FBS και 1% πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη. 55

56 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου Ημιστερεή καλλιέργεια Τα μονοπυρηνικά κύτταρα μυελού των οστών ή κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ή ομφαλιοπλακουντικού αίματος του εναιωρήματος μετρούνταν μικροσκοπικά σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer χρησιμοποιώντας 3% οξικό οξύ με κυανούν του μεθυλενίου. Ο αριθμός των κυττάρων / ml εναιωρήματος υπολογιζόταν με τη χρήση του τύπου: αριθμός κυττάρων στα 4 μεγάλα τετράγωνα της πλάκας Neubauer / 4 συντελεστή αραίωσης Τα κύτταρα καλλιεργούνταν σε συγκέντρωση 2, κύτταρα / ml σε ημιστερεό μέσο 1% μεθυλκυτταρίνης εμπλουτισμένης με 30% FBS, 1% BSA, 10-4 M 2-μερκαπτοαιθανόλης, 2 mm L-γλουταμίνης, IMDM, καθώς και με 50 ng/ml SCF, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml GM-CSF και 3 U/ml EPO (Stem Cell Technologies), ακολουθώντας τις οδηγίες του παρασκευαστή. Όλες οι καλλιέργειες επιστρώνονταν εις διπλούν σε τρυβλία με διάμετρο 35 mm με ή χωρίς διάφορες συγκεντρώσεις των αντιμυκητιασικών φαρμάκων δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β (60, 600, 6000 ng/ml), λιποσωμική αμφοτερικίνη Β (6, 60, 600, 6000 ng/ml), βορικοναζόλη (4, 20, 100, 500 ng/ml) και κασποφουγκίνη (0,4, 2, 10, 50 ng/ml). Τα τρυβλία των καλλιεργειών τοποθετούνταν σε επωαστικό κλίβανο όπου επωάζονταν για 14 ημέρες στους 37 o C σε υγρό περιβάλλον με 5% CO 2. Ακολουθούσε καταμέτρηση των αποικιών που δημιουργούνταν με χρήση ανάστροφου μικροσκοπίου και ενός τρυβλίου, το οποίο έφερε γραμμές στη βάση του διαιρώντας την σε μικρά τετράγωνα, εφαρμόζοντας συγκεκριμένα κριτήρια για την ταυτοποίησή τους (Πίνακας 2.2.2). Πίνακας Τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά αποικιών ώριμων κυττάρων προερχόμενων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα ανθρώπων. Table Standard morphological features of colonies of mature cells derived from human hematopoietic progenitor cells. 56

57 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου Τύπος προγονικού αιμοποιητικού κυττάρου CFU-GM BFU-E CFU-E CFU-GEMM Περιγραφή αντίστοιχης αποικίας Αποικία αποτελούμενη από έως χιλιάδες κοκκιοκύτταρα (προερχόμενη από CFU-G), μακροφάγα (προερχόμενη από CFU-Μ), ή κοκκιοκύτταρα και μακροφάγα (προερχόμενη από CFU-GΜ), τα οποία είναι οργανωμένα σε 1 ή περισσότερες, κοντινές μεταξύ τους, ομάδες. Η αποικία μπορεί να φαίνεται ως ένας πυκνός πυρήνας κυττάρων με ευδιάκριτα μεμονωμένα κύτταρα στην περιφέρειά της. Τα μακροφάγα είναι μεγάλα κύτταρα με ωοειδές ή κυκλικό σχήμα, άχρωμα και εμφανίζουν κοκκώδες ή γκρι κέντρο. Τα κοκκιοκύτταρα είναι στρόγγυλα, άχρωμα, φωτεινά και πολύ μικρότερα και πιο ομοιόμορφα σε μέγεθος από τα μακροφάγα. Αποικία αποτελούμενη από περισσότερους των 200 έως χιλιάδες ερυθροβλάστες, οργανωμένους σε 1 ή περισσότερες ομάδες, ενώ μπορεί να είναι συμπαγής ή μπορεί οι ομάδες κυττάρων να είναι σχετικά διασκορπισμένες. Τα κύτταρα έχουν κοκκινωπό, σκούρο καφέ, ή πιο απαλό χρώμα, μικρό μέγεθος και είναι δύσκολο να διακριθούν ως μεμονωμένα αφού εμφανίζονται ενωμένα μαζί. Αποικία αποτελούμενη από 8 έως 200 ερυθροβλάστες, οργανωμένους σε 1 ή 2, κοντινές μεταξύ τους, ομάδες. Τα κύτταρα είναι μικρά με κοκκινωπό-πορτοκαλί ή καφέ χρώμα και είναι δύσκολο να διακριθούν ως μεμονωμένα αφού εμφανίζονται ενωμένα μαζί. Αποικία που αποτελείται συνήθως από περισσότερα από 500 ώριμα κύτταρα. Η αποικία εμφανίζεται ως ένας πυκνός πυρήνας, σχηματιζόμενος από ομάδες ερυθροβλαστών, με αναγνωρίσιμα κοκκιοκύτταρα και μακροφάγα στην περιφέρεια, ενώ παρατηρούνται και μεγάλα, στρόγγυλα και άχρωμα μεγακαρυοκύτταρα. 3. Έλεγχος ύπαρξης μυκήτων Κύτταρα μυελού των οστών ποντικών, καθώς και μυελού των οστών, κινητοποιημένου περιφερικού αίματος και ομφαλιοπλακουντικού αίματος ανθρώπων, καλλιεργούνταν με και χωρίς τα αντιμυκητιασικά φάρμακα όπως περιγράφτηκε προηγουμένως. Μετά την παρέλευση του απαιτούμενου χρόνου επώασης, οι καλλιέργειες ελέγχονταν μικροσκοπικά για τυχόν ύπαρξη μόλυνσης και ενοφθαλμίζονταν σε τρυβλία που περιείχαν στερεό θρεπτικό υλικό ανάπτυξης μυκήτων με τη βοήθεια μικροβιολογικού κρίκου. Όλη η διαδικασία γινόταν υπό στείρες συνθήκες και συμφώνως προς τις οδηγίες των παρασκευαστών. Τα ειδικά θρεπτικά υλικά περιελάμβαναν 15 g/l Sabouraud άγαρ εμπλουτισμένου με 40 g/l δεξτρόζης, 10 g/l πεπτονούχου μίγματος και 0,5 g/l 57

58 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου χλωραμφαινικόλης (τελικό ph 5,6 ± 0,2 στους 25 o C Laboratorios Conda S.A., Μαδρίτη, Ισπανία) καθώς και 15 g/l άγαρ εμπλουτισμένου με 30 g/l εκχυλίσματος βύνης και 5 g/l πεπτόνης (τελικό ph 5,4 ± 0,2 στους 25 o C Fluka Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs SG, Ελβετία). Το άγαρ λειτουργούσε ως στερεοποιητικός παράγοντας, η δεξτρόζη, ως ζυμώσιμος υδατάνθρακας, παρείχε άνθρακα και ενέργεια, η πεπτόνη χρησίμευε ως πηγή αζώτου, το πεπτονούχο μίγμα παρείχε άζωτο, βιταμίνες, ανόργανα στοιχεία και αμινοξέα, το εκχύλισμα βύνης περιείχε πολυσακχαρίτες οι οποίοι χρησίμευαν ως πηγή ενέργειας, η χλωραμφαινικόλη, ως ευρέος φάσματος αντιβακτηριακός παράγοντας, ανέστελλε τυχόν ανάπτυξη των περισσότερων βακτηρίων, ενώ και το όξινο ph επίσης συνέβαλλε στη επιλεκτικότητα του θρεπτικού υλικού για μύκητες. Τα τρυβλία επωάζονταν στους 30 o C για 10 ημέρες και ελέγχονταν κάθε 2 ημέρες για την ενδεχόμενη ανάπτυξη μυκήτων. 4. Φαρμακοκινητική μελέτη και έλεγχος τοξικότητας Όλη η διαδικασία γινόταν υπό ασηπτικές συνθήκες και περιελάμβανε τον προσδιορισμό των ελάχιστων επιπέδων (trough) και της τοξικότητας διάφορων δόσεων της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης σε φυσιολογικά ποντίκια καθώς και τη μετέπειτα εξέταση της τοξικότητας αυτών των αντιμυκητιασικών σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια. 4.1 Φαρμακοκινητική μελέτη Διπλάσια αυξανόμενες δόσεις της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β (2,5-40 mg/kg), της βορικοναζόλης (40 80 mg/kg) και της κασποφουγκίνης (1-16 mg/kg) χορηγούνταν ενδοπεριτοναϊκά σε διαφορετικά για κάθε δόση φυσιολογικά θηλυκά ποντίκια ηλικίας 10 έως 12 εβδομάδων, καθημερινά για 4 ημέρες. Την 5 η ημέρα, δηλαδή 24 ώρες μετά από την τελευταία χορήγηση, έπειτα από αναισθησία με αιθέρα, περιφερικό αίμα από κάθε ποντίκι που λάμβανε αντιμυκητιασικό καθώς και από ποντίκια που δε λάμβαναν κάποιο φάρμακο (μάρτυρες) συλλεγόταν μέσω οπισθοκογχικής παρακέντησης σε μη ηπαρινισμένα σωληνάρια μέτρησης μικροαιματοκρίτη. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση του αίματος στις 2300 rpm για 10 58

59 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου min στους 16 ο C μετά το τέλος της οποίας απομονωνόταν ο ορός για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης (ελάχιστα επίπεδα, trough) των συγκεκριμένων αντιμυκητιασικών με μικροβιολογική μέθοδο διάχυσης φαρμάκου σε άγαρ Μικροβιολογική μέθοδος διάχυσης φαρμάκου σε άγαρ Αυτή η μέθοδος, διακρινόμενη από αξιοπιστία, καλή επαναληψιμότητα και τεχνική απλότητα, χρησιμοποιείται ευρέως για τον ποσοτικό προσδιορισμό αντιμυκητιασικών φαρμάκων με σκοπό την παρακολούθηση της θεραπευτικής έκβασης των μυκητιασικών λοιμώξεων και την αποφυγή τοξικών ή αναποτελεσματικών επιπέδων τους στο αίμα. Ειδικότερα, μια αξιολογημένη και καθιερωμένη (διαθέσιμη προς χρήση στο Εργαστήριο Αναφοράς Μυκητολογίας του Οργανισμού Δημόσιας Υγείας Αγγλίας στο Μπρίστολ) μέθοδος 273 εφαρμοζόταν για τη μέτρηση των επιπέδων της βορικοναζόλης και παρόμοιες μέθοδοι εφαρμόζονταν για τον ποσοτικό προσδιορισμό της αμφοτερικίνης Β και της κασποφουγκίνης, ενώ όλη η διαδικασία ήταν σε συμφωνία και με τις οδηγίες των παρασκευαστών. Πιο συγκεκριμένα, κονίδια των πρότυπων στελεχών μικροοργανισμών Paecilomyces variotii (ATCC American Type Culture Collection, Manassas, VA, ΗΠΑ), ευαίσθητου στην αμφοτερικίνη Β, και Candida kefyr (NCPF 3234 National Collection of Pathogenic Fungi at the Public Health England Mycology Reference Laboratory, Bristol, Ηνωμένο Βασίλειο), ευαίσθητου στη βορικοναζόλη και στην κασποφουγκίνη, περιέχονταν σε τρυβλία με στερεό θρεπτικό υλικό. Στην περίπτωση της αμφοτερικίνης Β και της κασποφουγκίνης, τα κονίδια προέρχονταν από εναιωρήματα σε φυσιολογικό ορό συγκέντρωσης CFU / ml και CFU / ml αντίστοιχα, ενώ το θρεπτικό υλικό περιελάμβανε 15 g/l άγαρ (Oxoid Ltd, Basingstoke, Αγγλία) εμπλουτισμένου με Roswell Park Memorial Institute medium 1640 και 0,165 mol/l του ρυθμιστικού διαλύματος 3- μορφολινοπροπανοσουλφονικό οξύ (ph 7 AppliChem, Darmstadt, Γερμανία) σε τρυβλία με διαστάσεις cm. Στην περίπτωση της βορικοναζόλης, τα κονίδια προέρχονταν από εναιώρημα σε απιονισμένο στείρο νερό συγκέντρωσης 10 7 κυττάρων / ml, ενώ το θρεπτικό υλικό περιελάμβανε 15 g/l άγαρ (Scharlau Chemie S.A., Βαρκελώνη, Ισπανία) εμπλουτισμένου με αζωτούχο βάση ζύμης (Fluka Sigma-Aldrich Chemie GmbH), γλυκόζη 59

60 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία) και διάλυμα κιτρικού (Mallinckrodt Chemical Works, Los Angeles, CA, ΗΠΑ) (ph 7) σε τρυβλία με διαστάσεις cm. Ακολουθούσε άνοιγμα οπών διαμέτρου 1 cm (στα cm τρυβλία) και 3 mm (στα cm τρυβλία) στις οποίες μεταφέρονταν εις διπλούν 100 και 25 μl, αντίστοιχα, από δείγματα ορού με γνωστές συγκεντρώσεις των αντιμυκητιασικών φαρμάκων, οι οποίες παρασκευάζονταν με τη χρήση του ορού από τα ποντίκια μάρτυρες (δείγματα βαθμονόμησης), καθώς και από τα υπό εξέταση δείγματα ορού, όπως και από δείγματα ορού που δεν περιείχαν κάποιο φάρμακο (αρνητικοί μάρτυρες). Τα cm και cm τρυβλία επωάζονταν στους 37 ο C για 24 και 18 ώρες αντίστοιχα, και έπειτα μετρώνταν οι διάμετροι των ζωνών αναστολής της μυκητικής ανάπτυξης που δημιουργούνταν ως αποτέλεσμα της διάχυσης των αντιμυκητιασικών γύρω από τις οπές που περιείχαν τα αντίστοιχα δείγματα ορών με τις γνωστές και άγνωστες συγκεντρώσεις αυτών. Βάσει των γνωστών συγκεντρώσεων των φαρμάκων και των αντίστοιχων διαμέτρων των ζωνών αναστολής, κατασκευαζόταν μία πρότυπη καμπύλη για κάθε αντιμυκητιασικό με τη βοήθεια της οποίας προσδιορίζονταν οι άγνωστες συγκεντρώσεις των φαρμάκων των υπό εξέταση δειγμάτων ορού. 4.2 Έλεγχος τοξικότητας Κατά τη διάρκεια των χορηγήσεων των διάφορων δόσεων των νεότερων αντιμυκητιασικών της φαρμακοκινητικής μελέτης όπως επίσης και μετά τη διακοπή αυτών, τα ποντίκια παρακολουθούνταν για τυχόν ορατά σημεία τοξικότητας και συγκεκριμένα για εμφάνιση πόνου, απώλεια βάρους και θάνατο. 4.3 Έλεγχος τοξικότητας σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια Θηλυκά ποντίκια, ηλικίας 10 έως 12 εβδομάδων, δέχονταν υποθανάτια δόση ακτινοβολίας 5 Gy απελευθερωθείσα από συσκευή εκπομπής ακτίνων γ (IBL 437C). Μετά την ακτινοβόληση, τα ποντίκια διατηρούνταν σε αποστειρωμένους κλωβούς με αποστειρωμένο ροκανίδι και είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε αποστειρωμένη τροφή και οξινισμένο νερό που περιείχε 0,02 mg/ml του αντιβιοτικού σιπροφλοξασίνη (Ciprofloxacin/Generics Mylan S.A.S., 60

61 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου Saint-Priest, Γαλλία), για την προφύλαξη από ενδεχόμενες μολύνσεις εξαιτίας της προσωρινής ουδετεροπενίας που εμφάνιζαν. Αυτά λάμβαναν ενδοπεριτοναϊκά διάφορες δόσεις των νεότερων αντιμυκητιασικών φαρμάκων, ίδιες με τις προηγουμένως αναφερθείσες καθώς και ενδιάμεσες αυτών, καθημερινά για 26 ημέρες. Κατά τη διάρκεια και μετά το πέρας αυτών των χορηγήσεων, τα ποντίκια παρακολουθούνταν για τυχόν ορατά σημεία τοξικότητας και συγκεκριμένα για εμφάνιση πόνου, απώλεια βάρους και θάνατο. 5. Προσδιορισμός απόλυτου αριθμού κοκκιοκυττάρων Όλη η διαδικασία γινόταν υπό στείρες συνθήκες και αφορούσε στη μέτρηση του αριθμού των κοκκιοκυττάρων σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια τα οποία δέχονταν ή όχι συγκεκριμένες χορηγήσεις. Αναλυτικότερα, θηλυκά ποντίκια, ηλικίας 10 έως 12 εβδομάδων, ακτινοβολούνταν υποθανάτια (ημέρα 0) με εφαρμογή δόσης 5 Gy, προερχόμενη από συσκευή εκπομπής ακτίνων γ (IBL 437C), με την οποία καθίσταντο ουδετεροπενικά. Μετά την ακτινοβόληση, τα ποντίκια διατηρούνταν σε αποστειρωμένους κλωβούς με αποστειρωμένο ροκανίδι και είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε αποστειρωμένη τροφή και οξινισμένο νερό που περιείχε 0,02 mg/ml του αντιβιοτικού σιπροφλοξασίνη, για την προφύλαξη από ενδεχόμενες μολύνσεις εξαιτίας της προσωρινής ουδετεροπενίας. Κάποια ποντίκια λάμβαναν ενδοπεριτοναϊκά 15 mg/kg λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, ή 60 mg/kg βορικοναζόλης, ή 8 mg/kg κασποφουγκίνης, άλλα ποντίκια ενίονταν υποδόρια με 100 μg/kg G-CSF (φιλγκραστίμη, Granulokine Amgen Europe B.V., Breda, Ολλανδία), ενώ υπήρχαν και ποντίκια στα οποία χορηγούνταν υποδόρια ο G-CSF και ενδοπεριτοναϊκά ένα από τα αντιμυκητιασικά. Ο G-CSF και τα φάρμακα δίνονταν καθημερινά από την ημέρα 1 έως και την ημέρα 26 μετά την ακτινοβόληση. Ποντίκια μάρτυρες λάμβαναν μόνο την υποθανάτια δόση ακτινοβολίας χωρίς μετέπειτα χορήγηση κάποιου παράγοντα. Την 4 η ημέρα πριν την ακτινοβόληση καθώς επίσης και κάθε 3 4 ημέρες έως και την ημέρα 27 μετά την ακτινοβόληση, περιφερικό αίμα από κάθε ποντίκι συλλεγόταν μέσω οπισθοκογχικής παρακέντησης σε ηπαρινισμένα σωληνάρια μέτρησης μικροαιματοκρίτη και ακολουθούσε προσδιορισμός του απόλυτου αριθμού των κοκκιοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής. 61

62 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου 5.1 Κυτταρομετρία ροής Αυτή η τεχνολογία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ευρέως σε πεδία μοριακής βιολογίας, παθολογίας, βιολογίας των φυτών και θαλάσσιας βιολογίας. Πρόκειται για μια ποσοτική, πολυπαραμετρική και αυτοματοποιημένη μέθοδο μέτρησης και ανάλυσης πολλαπλών φυσικών και χημικών χαρακτηριστικών από ένα σωματίδιο, συνήθως κύτταρο, καθώς αυτό περνά από μια κυψελίδα ροής, μέσα από μια μονοχρωματική δέσμη φωτός (λέιζερ). Με αυτόν τον τρόπο, εκτιμάται αποτελεσματικά το μέγεθος, η διαφορετικότητα και το ανάλογο φθοριοχρώμα του. Τα σύγχρονα κυτταρόμετρα ροής έχουν τη δυνατότητα να αναλύουν χιλιάδες σωματίδια ή κύτταρα κάθε λεπτό σε πραγματικό χρόνο και συγχρόνως να τα διαχωρίζουν και να τα απομονώνουν με συγκεκριμένη κατηγοριοποίηση. Ειδικότερα, μια σύμφωνη με τις πρότυπες οδηγίες τεχνική εφαρμοζόταν για την καταμέτρηση των κοκκιοκυττάρων σε κάθε μl περιφερικού αίματος, ενώ όλη η διαδικασία γινόταν ακολουθώντας και τις οδηγίες των παρασκευαστών. Αναλυτικότερα, 50 μl περιφερικού αίματος επωάζονταν για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου με 2 μl του συζευγμένου με την ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη μονοκλωνικού αντισώματος εναντίον του μυϊκού επιφανειακού αντιγόνου της μυελικής διαφοροποίησης Gr-1 (Ly-6G και Ly-6C, κλώνος RB6-8C5 Pharmingen BD Biosciences, San Jose, CA, ΗΠΑ). Το συγκεκριμένο φθοριοχρώμα με το οποίο ήταν σημασμένο το αντίσωμα συνιστά την πιο κοινή φθορίζουσα ουσία και εκπέμπει πράσινο φως όταν διεγείρεται από μπλε λέιζερ. Στη συνέχεια, για την αποτελεσματική ανίχνευση των επιθυμητών κυττάρων στο περιφερικό αίμα, τα δείγματα επωάζονταν για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου με 500 μl 1Χ υπότονου fluorescence-activated cell sorting (FACS) διαλύματος λύσης των ερυθροκυττάρων (BD Biosciences, San Jose, CA, ΗΠΑ) αφού προηγουμένως το 10Χ λυτικό διάλυμα αραιωνόταν με την προσθήκη αποσταγμένου νερού σε αναλογία 1:10. Κατ αυτόν τον τρόπο, ήταν εφικτή η απαλοιφή των παρεμβαλλόμενων κυττάρων διατηρώντας παράλληλα τα λευκοκύτταρα. Η απόκτηση απόλυτων μετρήσεων κυττάρων ακόμα και σε πολύ χαμηλούς αριθμούς επιτρεπόταν με τη μετέπειτα προσθήκη 100 μl φθοριζόντων μικροσφαιριδίων (1047 σφαιρίδια / μl Zebra Bioscience BV, Enschede, Overijssel, Ολλανδία). Πρόκειται για σφαιρίδια από πολυστυρένιο με διάμετρο 5,2 μm και γνωστής συγκέντρωσης, αναγραφόμενης στο φιαλίδιο του αντιδραστηρίου, τα οποία 62

63 Διδακτορική διατριβή Υλικά και Μέθοδοι Μαρία Σαμαλίδου χρησιμεύουν ως πληθυσμός αναφοράς για τον άμεσο προσδιορισμό του απόλυτου αριθμού οποιουδήποτε λευκοκυτταρικού πληθυσμού που τυγχάνει ενδιαφέροντος. Ακολουθούσε άμεση ανάλυση των δειγμάτων σε κυτταρομετρητή ροής. Η απόκτηση των δεδομένων γινόταν χρησιμοποιώντας το κυτταρόμετρο FACSCalibur και η περαιτέρω ανάλυσή τους με το λογισμικό CellQuest Pro 6.0 (BD Biosciences) εφαρμόζοντας μια προτεινόμενη στρατηγική οριοθέτησης. Ο απόλυτος αριθμός των κοκκιοκυττάρων / μl του περιφερικού αίματος υπολογιζόταν με τη χρήση του τύπου: μετρηθείς αριθμός κοκκιοκυττάρων μετρηθείς αριθμός σφαιριδίων συγκέντρωση σφαιριδίων όγκος σφαιριδίων όγκος δείγματος αίματος 6. Στατιστική ανάλυση Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ΗΠΑ) και απεικονίστηκαν γραφικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, ΗΠΑ), όπου ήταν δυνατό. Τα ποσοτικά αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Οι στατιστικές συγκρίσεις έγιναν εφαρμόζοντας το Student s t έλεγχο δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων, για τα in vitro δεδομένα, και το Student s t έλεγχο δύο ανεξάρτητων δειγμάτων, για τα in vivo δεδομένα. Τιμές p < 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. 63

64 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

65 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου 1. Θετική δράση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στην αιμοποίηση in vitro συγκριτικά με τη δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β Για τον προσδιορισμό της δράσης της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης σε αιμοποιητικά κύτταρα in vitro, σε σύγκριση με τη δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, έγιναν CFU δοκιμές στις οποίες κύτταρα μυελού των οστών ποντικών καλλιεργήθηκαν σε ημιστερεό μέσο που περιείχε ένα κοκτέιλ κυτοκινών παρουσία ή απουσία διάφορων συγκεντρώσεων των τεσσάρων αντιμυκητιασικών. 1.1 Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων των ποντικών Τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα των καλλιεργειών ανιχνεύτηκαν και ταυτοποιήθηκαν επί τη βάσει τυπικών μορφολογικών χαρακτηριστικών (Πίνακας 2.1.2) των αποικιών ώριμων κυττάρων που δημιουργούν (Εικόνα 1.1). Οι αποικίες της ίδιας κατηγορίας είχαν παρόμοια εμφάνιση σε όλες τις καλλιέργειες που ελέγχθηκαν. 65

66 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα 1.1. Τυπικές αποικίες ώριμων κυττάρων προερχόμενες από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα ποντικών, CFU-GM (α), BFU-E (β) και CFU-GEMM (γ), που παρατηρήθηκαν σε όλες τις καλλιέργειες. Figure 1.1. Standard colonies of mature cells derived from mouse hematopoietic progenitor cells, CFU- GM (a), BFU-E (b) and CFU-GEMM (c), that were observed in all cultures. 66

67 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου 1.2 Καταμέτρηση αποικιών CFU-GM, BFU-E και CFU-GEMM των ποντικών Η δράση των αντιμυκητιασικών ελέγχθηκε μέσω του αριθμού των αποικιών που αναπτύχθηκαν στις καλλιέργειες που τα περιείχαν Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GM αποικιών Σε συγκέντρωση 60 ng/ml, η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β δεν ήταν τοξική μιας και ο αριθμός των CFU-GM ήταν ισοδύναμος με του μάρτυρα που δεν περιείχε αντιμυκητιασικά (150 ± 19 έναντι 153 ± 19). Αυξανόμενες συγκεντρώσεις, 600 και 6000 ng/ml, προκάλεσαν μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση τοξικότητα οδηγώντας σε σημαντική μείωση του αριθμού των CFU-GM συγκριτικά με το μάρτυρα (134 ± 17 και 105 ± 14 έναντι 153 ± 19, p = 0,002 και 0,003 αντίστοιχα). Σε αντίθεση με τη δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη δεν εμφάνισαν καμία τοξικότητα σε όλες τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν. Κατά ενδιαφέροντα τρόπο, ο αριθμός των CFU-GM αυξήθηκε σημαντικά σε όλες τις καλλιέργειες που τις περιείχαν. Δεν υπήρχε διαφορά στη δυνατότητα σχηματισμού αποικιών μεταξύ των διαφορετικών αντιμυκητιασικών. Η προσθήκη των 6 ng/ml της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, ή 4 ng/ml της βορικοναζόλης, ή 0,4 ng/ml της κασποφουγκίνης στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων ήταν αρκετή για να οδηγήσει σε αύξηση του αριθμού των CFU-GM σε σύγκριση με το μάρτυρα (189 ± 20 ή 191 ± 22 ή 191 ± 24 έναντι 153 ± 19, p = 0,004 ή 0,006 ή 0,011 αντίστοιχα), ενώ οι συγκεντρώσεις των 60 ng/ml, ή 20 ng/ml, ή 2 ng/ml, αντίστοιχα, φάνηκαν να είναι οι βέλτιστες προάγοντας τη μεγαλύτερη αύξηση (208 ± 22 ή 211 ± 22 ή 211 ± 21 έναντι 153 ± 19, p = 0,003 ή 0,007 ή 0,007 αντίστοιχα). Ένα πλατό στην αύξηση του αριθμού των CFU-GM συγκριτικά με το μάρτυρα παρατηρήθηκε για τα 600 και 6000 ng/ml της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β (207 ± 22 και 206 ± 21 έναντι 153 ± 19, p = 0,003 και 0,003 αντίστοιχα), ενώ τα 100 και 500 ng/ml της βορικοναζόλης ή τα 10 και 50 ng/ml της κασποφουγκίνης οδήγησαν σε αύξηση μικρότερη από αυτή στις βέλτιστες συγκεντρώσεις τους αλλά μεγαλύτερη από εκείνη στις χαμηλότερες ελεγχθείσες συγκεντρώσεις τους (206 ± 24 και 203 ± 22 ή 205 ± 21 και 198 ± 21 έναντι 153 ± 19, p = 0,009 και 0,007 ή 0,004 και 0,011 αντίστοιχα), (Εικόνα 1.2.1). 67

68 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό μεταβολής αριθμού CFU-GM συγκριτικά με μάρτυρα (%) Εικόνα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU-GM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ποντικών παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 4 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01). Figure Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-GM colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of mouse bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 4 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01). 68

69 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των BFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των BFU-E αποικιών ήταν παρόμοιος με του μάρτυρα (Διάγραμμα 1.2.2). Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των BFU-E αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ποντικών παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 4 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων. Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of BFU-E colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of mouse bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 4 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test. 69

70 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GEMM αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των CFU-GEMM αποικιών ήταν παρόμοιος με του μάρτυρα (Διάγραμμα 1.2.3). Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU-GEMM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ποντικών παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 4 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων. Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-GEMM colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of mouse bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 4 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test. 70

71 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στο συνολικό αριθμό των αποικιών Από τη στιγμή που ο αριθμός των BFU-E και CFU-GEMM αποικιών δεν επηρεάστηκε πρακτικά από την παρουσία των αντιμυκητιασικών, ενώ ο αριθμός των CFU-GM αποικιών επηρεάστηκε από την παρουσία αυτών, η μεταβολή του αριθμού του συνόλου των αποικιών παρουσία αντιμυκητιασικών συγκριτικά με το μάρτυρα ακολούθησε ένα πρότυπο παρόμοιο με την αντίστοιχη μεταβολή του αριθμού των CFU-GM αποικιών. Έτσι, αν και η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β δεν ήταν τοξική για τα αιμοποιητικά κύτταρα στη χαμηλότερη ελεγχθείσα συγκέντρωση (60 ng/ml: 156 ± 20 έναντι μάρτυρας: 159 ± 19), υψηλότερες συγκεντρώσεις μείωσαν σημαντικά τον αριθμό των αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα (600 και 6000 ng/ml: 140 ± 18 και 108 ± 15 έναντι 159 ± 19, p = 0,005 και 0,002 αντίστοιχα). Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε τοξικότητα για καμιά συγκέντρωση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης. Αυτά τα αντιμυκητιασικά επέφεραν σημαντική αύξηση του αριθμού των αποικιών, κατά παρόμοιο τρόπο μεταξύ τους, με μια κορύφωση στα 60 ng/ml της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, ή στα 20 ng/ml της βορικοναζόλης, ή στα 2 ng/ml της κασποφουγκίνης συγκριτικά με το μάρτυρα (213 ± 22 ή 216 ± 22 ή 216 ± 22 έναντι 159 ± 19, p = 0,003 ή 0,006 ή 0,009 αντίστοιχα). Μικρότερες συγκεντρώσεις αυτών των φαρμάκων επίσης αύξησαν σημαντικά τον αριθμό των αποικιών σε σύγκριση με το μάρτυρα (6 ή 4 ή 0,4 ng/ml: 194 ± 20 ή 196 ± 21 ή 196 ± 25 έναντι 159 ± 19, p = 0,003 ή 0,003 ή 0,014 αντίστοιχα). Υψηλότερες συγκεντρώσεις της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β οδήγησαν σε πλατό (600 και 6000 ng/ml: 211 ± 22 και 209 ± 22 έναντι 159 ± 19, p = 0,004 και 0,003 αντίστοιχα), ενώ υψηλότερες συγκεντρώσεις της βορικοναζόλης ή της κασποφουγκίνης προκάλεσαν μικρότερη από τις προηγούμενες ελεγχθείσες συγκεντρώσεις τους αλλά μεγαλύτερη από τις χαμηλότερες χρησιμοποιηθείσες συγκεντρώσεις τους αύξηση του αριθμού των αποικιών (100 και 500 ή 10 και 50 ng/ml: 210 ± 23 και 207 ± 22 ή 210 ± 21 και 203 ± 22 έναντι 159 ± 19, p = 0,007 και 0,007 ή 0,004 και 0,014 αντίστοιχα), (Εικόνα 1.2.4). 71

72 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό μεταβολής αριθμού αποικιών συγκριτικά με μάρτυρα (%) Εικόνα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στο συνολικό αριθμό των αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, διαμορφούμενου από τις συνεισφορές των επιμέρους κατηγοριών αποικιών, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ποντικών παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 4 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01). Figure Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the total number of colonies comparatively with the control, shaped by the contributions of the individual colony classes, in semisolid cultures of mouse bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 4 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01). 72

73 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Συμπέρασμα Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη όχι μόνο δεν είναι τοξικές για τα αιμοποιητικά κύτταρα αλλά επίσης αυξάνουν τον αριθμό των CFU-GM αποικιών στις καλλιέργειες που τις περιέχουν, σε αντίθεση με την τοξική δράση της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β. Επιδρούν λοιπόν σε συγκεκριμένη κυτταρική σειρά (λευκή) διεγείροντας τα συγκεκριμένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα (CFU- GM) να ξεκινήσουν τη διαδικασία του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης με αποτέλεσμα τη δημιουργία αποικιών ώριμων κυττάρων (κοκκιοκυττάρων μακροφάγων). 2. Η θετική δράση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης δεν οφείλεται στις αντιμυκητικές ιδιότητές τους Για να επιβεβαιωθεί ότι η αύξηση του αριθμού των αποικιών στις καλλιέργειες που περιείχαν τα νεότερα αντιμυκητιασικά δεν προκλήθηκε από την απαλλαγή του καλλιεργητικού περιβάλλοντος από τυχόν μύκητες που θα μπορούσαν να επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, πραγματοποιήθηκαν έλεγχοι για την ύπαρξη μυκήτων όπου όλες οι καλλιέργειες μεθυλκυτταρίνης με ή χωρίς τα αντιμυκητιασικά επιστρώθηκαν σε αγαρούχα θρεπτικά μέσα που ευνοούν την ανάπτυξη των μυκήτων. Δεν ανιχνεύθηκαν μύκητες σε όλες τις καλλιέργειες που ελέγχθηκαν (Εικόνα 2). Εικόνα 2. Αντιπροσωπευτικό τρυβλίο που περιέχει θρεπτικό μέσο ανάπτυξης μυκήτων και την επιστρωμένη καλλιέργεια με ή χωρίς τα αντιμυκητιασικά στο οποίο δεν εντοπίστηκαν μύκητες. Figure 2. Representative dish containing fungal growth medium and the plated culture with or without the antifungals in which no fungi were detected. 73

74 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Συμπέρασμα Αυτά τα δεδομένα μαρτυρούν ότι η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη επάγουν σχηματισμό αποικιών σε καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων που δε διαμεσολαβείται από την παρεμπόδιση της ενδεχόμενης ανάπτυξης μυκήτων. 3. Συνέργεια μεταξύ μεμονωμένων κυτοκινών και των νεότερων αντιμυκητιασικών φαρμάκων στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων Για την περαιτέρω διερεύνηση της θετικής δράσης της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων, έγιναν CFU δοκιμές στις οποίες κύτταρα μυελού των οστών ποντικών καλλιεργήθηκαν σε ημιστερεό μέσο απουσία κυτοκινών ή παρουσία μεμονωμένων κυτοκινών και με ή χωρίς διάφορες συγκεντρώσεις των τριών αντιμυκητιασικών. 3.1 Επίδραση των νεότερων αντιμυκητιασικών απουσία κυτοκινών CFU δοκιμή που πραγματοποιήθηκε απουσία κυτοκινών αλλά παρουσία διάφορων συγκεντρώσεων της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, ή της βορικοναζόλης ή της κασποφουγκίνης δεν προκάλεσε σχηματισμό αποικιών, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα αντιμυκητιασικά δεν μπορούν να ασκήσουν τη θετική δράση τους στον αριθμό των αποικιών από μόνα τους (Εικόνα 3.1). 74

75 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα 3.1. Μηδενική ανάπτυξη αποικιών στα τρυβλία των ημιστερεών καλλιεργειών αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ποντικών απουσία κυτοκινών και με ή χωρίς αυξανόμενες συγκεντρώσεις της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης. Figure 3.1. Null colony growth in the dishes of semisolid cultures of mouse bone marrow hematopoietic cells in the absence of cytokines and with or without increasing concentrations of liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin. 75

76 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου 3.2 Επίδραση των νεότερων αντιμυκητιασικών παρουσία μεμονωμένων κυτοκινών Επί τη βάσει των παραπάνω ευρημάτων, η συνεισφορά κάθε κυτοκίνης μόνης της στη δράση του κάθε αντιμυκητιασικού φαρμάκου διερευνήθηκε με CFU δοκιμές που έγιναν παρουσία μεμονωμένων κυτοκινών και των βέλτιστων, σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα, συγκεντρώσεων των αντιμυκητιασικών. Μόνο αποικίες CFU-GM ήταν σε θέση να αναπτυχθούν, με παρόμοια εμφάνιση σε όλες τις καλλιέργειες που ελέγχθηκαν, οι οποίες ήταν και οι αποικίες ενδιαφέροντος. Δεν ανιχνεύθηκαν αποικίες στις καλλιέργειες που περιείχαν ΕΡΟ. Σε σύγκριση με τις αντίστοιχες καλλιέργειες ελέγχου (κυτοκίνη μόνη της), σημαντική αύξηση του αριθμού των CFU-GM παρατηρήθηκε με όλους τους διαφορετικούς συνδυασμούς που ελέγχθηκαν, εκτός από το συνδυασμό του SCF με τη βορικοναζόλη όπου η αύξηση του αριθμού των αποικιών είχε μια οριακή στατιστική σημαντικότητα (p = 0,058). Αναλυτικότερα, η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη προκάλεσαν αύξηση του αριθμού των CFU-GM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα όντας σε συνδυασμό με τον SCF (113 ± 13, 124 ± 17 και 131 ± 16 έναντι 97 ± 13, p = 0,03, 0,058 και 0,007 αντίστοιχα), την IL-3 (201 ± 27, 208 ± 36 και 215 ± 37 έναντι 179 ± 31, p = 0,006, 0,005 και 0,006 αντίστοιχα), τον GM-CSF (177 ± 17, 173 ± 13 και 180 ± 15 έναντι 147 ± 9, p = 0,032, 0,008 και 0,017 αντίστοιχα), τον G-CSF (75 ± 7, 74 ± 6 και 77 ± 8 έναντι 51 ± 4, p = 0,001, 0,0004 και 0,002 αντίστοιχα), ή την IL-6 (62 ± 7, 58 ± 6 και 66 ± 6 έναντι 44 ± 7, p = 0,006, 0,0003 και 0,002 αντίστοιχα), (Εικόνα 3.2). 76

77 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου EPO 77

78 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου SCF Ποσοστό αύξησης αριθμού CFU-GM συγκριτικά με μάρτυρα (%)

79 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου IL-3 Ποσοστό αύξησης αριθμού CFU-GM συγκριτικά με μάρτυρα (%)

80 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου GM-CSF Ποσοστό αύξησης αριθμού CFU-GM συγκριτικά με μάρτυρα (%)

81 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου G-CSF Ποσοστό αύξησης αριθμού CFU-GM συγκριτικά με μάρτυρα (%)

82 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου IL-6 Ποσοστό αύξησης αριθμού CFU-GM συγκριτικά με μάρτυρα (%)

83 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα 3.2. Επίδραση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU-GM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ποντικών παρουσία μεμονωμένων κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01, *** = p 0,001). Figure 3.2. Effect of liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU- GM colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of mouse bone marrow hematopoietic cells in the presence of single cytokines. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01, *** = p 0.001). Συμπέρασμα Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη σε συνδυασμό με διαφορετικές κυτοκίνες αυξάνουν τον αριθμό των CFU-GM αποικιών στις καλλιέργειες, αλλά δεν έχουν επίδραση όταν χρησιμοποιούνται μόνες τους. Δρουν λοιπόν συνεργικά με τις κυτοκίνες της καλλιέργειας και έτσι ασκούν τη θετική λειτουργία τους στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα (CFU-GM). 4. Θετική δράση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στην ανθρώπινη αιμοποίηση in vitro συγκριτικά με τη δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, η οποία δεν οφείλεται στις αντιμυκητικές ιδιότητές τους Για τη διερεύνηση πιθανής παρόμοιας δράσης της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης σε ανθρώπινα αιμοποιητικά κύτταρα in vitro σε σύγκριση με τη δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, πραγματοποιήθηκαν CFU δοκιμές στις οποίες κύτταρα μυελού των οστών ή κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ή ομφαλιοπλακουντικού αίματος ανθρώπων καλλιεργήθηκαν σε ημιστερεό μέσο που περιείχε ένα κοκτέιλ κυτοκινών παρουσία ή απουσία διάφορων συγκεντρώσεων των τεσσάρων αντιμυκητιασικών. Επίσης πραγματοποιήθηκαν έλεγχοι για τυχόν ύπαρξη μυκήτων όπου όλες οι καλλιέργειες με ή χωρίς 83

84 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου τα αντιμυκητιασικά επιστρώθηκαν σε αγαρούχα θρεπτικά μέσα που ευνοούν την ανάπτυξη των μυκήτων. 4.1 Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων των ανθρώπων Τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα των καλλιεργειών ανιχνεύτηκαν και ταυτοποιήθηκαν επί τη βάσει τυπικών μορφολογικών χαρακτηριστικών (Πίνακας 2.2.2) των αποικιών ώριμων κυττάρων που δημιουργούν (Εικόνα 4.1). Οι αποικίες της ίδιας κατηγορίας είχαν παρόμοια εμφάνιση σε όλες τις καλλιέργειες που ελέγχθηκαν. 84

85 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα 4.1. Τυπικές αποικίες ώριμων κυττάρων προερχόμενες από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα ανθρώπων, CFU-GM (α), BFU-E (β), CFU-E (γ) και CFU-GEMM (δ), που παρατηρήθηκαν σε όλες τις καλλιέργειες. Figure 4.1. Standard colonies of mature cells derived from human hematopoietic progenitor cells, CFU- GM (a), BFU-E (b), CFU-E (c) and CFU-GEMM (d), that were observed in all cultures. 85

86 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου 4.2 Καταμέτρηση αποικιών CFU-GM, BFU-E, CFU-E και CFU-GEMM των ανθρώπων Η δράση των αντιμυκητιασικών ελέγχθηκε μέσω του αριθμού των αποικιών που αναπτύχθηκαν στις καλλιέργειες που τα περιείχαν Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των αποικιών προερχόμενων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα μυελού των οστών Αν και η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β δεν ήταν τοξική για τα αιμοποιητικά κύτταρα στη χαμηλότερη ελεγχθείσα συγκέντρωση (60 ng/ml: 225 ± 55 έναντι μάρτυρας: 226 ± 55), υψηλότερες συγκεντρώσεις μείωσαν σημαντικά τον αριθμό του συνόλου των αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα (600 και 6000 ng/ml: 206 ± 52 και 154 ± 40 έναντι 226 ± 55, p = 0,036 και 0,009 αντίστοιχα). Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε τοξικότητα για καμιά συγκέντρωση των νεότερων αντιμυκητιασικών που ελέγχθηκε. Σε σύγκριση με το μάρτυρα που δεν περιείχε αντιμυκητιασικά, σημαντική αύξηση του αριθμού των αποικιών παρατηρήθηκε στις συγκεντρώσεις των 600 ng/ml της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, ή των 4, 20, 100 και 500 ng/ml της βορικοναζόλης, ή των 0,4 και 50 ng/ml της κασποφουγκίνης (241 ± 56 ή 244 ± 54, 259 ± 57, 257 ± 60 και 248 ± 56 ή 252 ± 54 και 261 ± 56 έναντι 226 ± 55, p = 0,016 ή 0,042, 0,002, 0,043 και 0,009 ή 0,034 και 0,045 αντίστοιχα), αύξηση με οριακή στατιστική σημαντικότητα προκλήθηκε με τα 10 ng/ml της κασποφουγκίνης (261 ± 52 έναντι 226 ± 55, p = 0,059), μη στατιστικά σημαντική αύξηση επιτελέστηκε στα 6 και 60 ng/ml της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, ή στα 2 ng/ml της κασποφουγκίνης (241 ± 63 και 239 ± 61 ή 250 ± 50 έναντι 226 ± 55 αντίστοιχα), ενώ ο αριθμός των αποικιών δε διέφερε με τα 6000 ng/ml της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β (228 ± 48 έναντι 226 ± 55), (Εικόνα 4.2.1). 86

87 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό μεταβολής αριθμού αποικιών συγκριτικά με μάρτυρα (%) Εικόνα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στο συνολικό αριθμό των αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, διαμορφούμενου από τις συνεισφορές των επιμέρους κατηγοριών αποικιών, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01). Figure Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the total number of colonies comparatively with the control, shaped by the contributions of the individual colony classes, in semisolid cultures of human bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01). 87

88 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Πιο αναλυτικά: Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GM αποικιών Σε συγκέντρωση 60 ng/ml, η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β δεν ήταν τοξική μιας και ο αριθμός των CFU-GM ήταν ισοδύναμος με του μάρτυρα (141 ± 38 έναντι 137 ± 37). Αυξανόμενες συγκεντρώσεις, 600 και 6000 ng/ml, προκάλεσαν μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση τοξικότητα οδηγώντας σε σημαντική μείωση του αριθμού των CFU-GM συγκριτικά με το μάρτυρα (126 ± 38 και 96 ± 29 έναντι 137 ± 37, p = 0,047 και 0,007 αντίστοιχα). Σε αντίθεση με τη δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, τα νεότερα αντιμυκητιασικά δεν εμφάνισαν καμία τοξικότητα σε όλες τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν. Επιπλέον, συγκριτικά με το μάρτυρα, ο αριθμός των CFU-GM αυξήθηκε σημαντικά σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν τη λιποσωμική αμφοτερικίνη Β (6, 60, 600 και 6000 ng/ml: 153 ± 43, 150 ± 41, 154 ± 41 και 148 ± 34 έναντι 137 ± 37, p = 0,045, 0,037, 0,023 και 0,039 αντίστοιχα), ή τη βορικοναζόλη (4, 20, 100 και 500 ng/ml: 147 ± 39, 161 ± 41, 163 ± 45 και 160 ± 42 έναντι 137 ± 37, p = 0,037, 0,004, 0,037 και 0,013 αντίστοιχα), ή την κασποφουγκίνη (0,4, 2, 10 και 50 ng/ml: 156 ± 36, 158 ± 39, 167 ± 40 και 160 ± 38 έναντι 137 ± 37, p = 0,04, 0,017, 0,018 και 0,042 αντίστοιχα), (Εικόνα ). 88

89 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό μεταβολής αριθμού CFU-GM συγκριτικά με μάρτυρα (%) Εικόνα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU-GM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01). Figure Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-GM colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01). 89

90 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό του συνόλου των BFU-E και CFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός του συνόλου των BFU-E και CFU-E αποικιών δε διέφερε σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα, εκτός από μια σημαντική μείωσή του, κατά 37%, με την προσθήκη των 6000 ng/ml της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β (54 ± 12 έναντι 86 ± 19, p = 0,012), (Διάγραμμα ). Πιο αναλυτικά: Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των BFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των BFU-E αποικιών δε διέφερε σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα, εκτός από μια σημαντική μείωσή του, κατά 30%, στα 6000 ng/ml της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β (31 ± 8 έναντι 44 ± 10, p = 0,019) και μια αύξησή του με οριακή στατιστική σημαντικότητα, κατά 11%, στα 20 ng/ml της βορικοναζόλης (49 ± 11 έναντι 44 ± 10, p = 0,051), (Διάγραμμα ) Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των CFU-E αποικιών δε διέφερε σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα, εκτός από μια μείωσή του με οριακή στατιστική σημαντικότητα, κατά 47%, με την προσθήκη των 6000 ng/ml της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β (23 ± 6 έναντι 43 ± 11, p = 0,051), (Διάγραμμα ). 90

91 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στο συνολικό αριθμό των αποικιών ερυθροκυττάρων συγκριτικά με το μάρτυρα, διαμορφούμενου από τις συνεισφορές των επιμέρους κατηγοριών αποικιών ερυθροκυττάρων, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05). Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the total number of erythrocyte colonies comparatively with the control, shaped by the contributions of the individual erythrocyte colony classes, in semisolid cultures of human bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05). 91

92 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των BFU- E αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05). Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of BFU-E colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependentpaired-samples Student s t test (* = p<0.05). 92

93 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU- E αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων. Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-E colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependentpaired-samples Student s t test. 93

94 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GEMM αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των CFU-GEMM αποικιών ήταν παρόμοιος με του μάρτυρα (Διάγραμμα ). Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU- GEMM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων. Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-GEMM colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human bone marrow hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependentpaired-samples Student s t test. 94

95 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των αποικιών προερχόμενων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα κινητοποιημένου περιφερικού αίματος Αν και η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β δε φαίνεται να είχε πραγματική τοξική δράση στα αιμοποιητικά κύτταρα στις χαμηλότερες ελεγχθείσες συγκεντρώσεις, μιας και επέφερε μη στατιστικά σημαντική μείωση του αριθμού του συνόλου των αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα (60 και 600 ng/ml: 167 ± 22 και 154 ± 23 έναντι 173 ± 25 αντίστοιχα), η υψηλότερη ελεγχθείσα συγκέντρωση μείωσε σημαντικά τον αριθμό αυτό (6000 ng/ml: 135 ± 21 έναντι 173 ± 25, p = 0,001). Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε τοξικότητα για καμιά συγκέντρωση των νεότερων αντιμυκητιασικών που ελέγχθηκε. Σε σύγκριση με το μάρτυρα που δεν περιείχε αντιμυκητιασικά, σημαντική αύξηση του αριθμού των αποικιών παρατηρήθηκε στις συγκεντρώσεις των 6, 600 και 6000 ng/ml της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, ή των 4, 20 και 100 ng/ml της βορικοναζόλης, ή των 0,4, 2, 10 και 50 ng/ml της κασποφουγκίνης (186 ± 23, 191 ± 23 και 196 ± 29 ή 191 ± 21, 188 ± 24 και 193 ± 24 ή 184 ± 26, 195 ± 23, 187 ± 27 και 196 ± 19 έναντι 173 ± 25, p = 0,011, 0,04 και 0,029 ή 0,02, 0,011 και 0,009 ή 0,005, 0,009, 0,009 και 0,016 αντίστοιχα), ενώ μη στατιστικά σημαντική αύξηση επιτελέστηκε με τα 60 ng/ml της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, ή με τα 500 ng/ml της βορικοναζόλης (181 ± 23 ή 193 ± 27 έναντι 173 ± 25 αντίστοιχα), (Εικόνα 4.2.2). 95

96 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό μεταβολής αριθμού αποικιών συγκριτικά με μάρτυρα (%) Εικόνα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στο συνολικό αριθμό των αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, διαμορφούμενου από τις συνεισφορές των επιμέρους κατηγοριών αποικιών, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01, *** = p=0,001). Figure Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the total number of colonies comparatively with the control, shaped by the contributions of the individual colony classes, in semisolid cultures of human mobilized peripheral blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01, *** = p=0.001). 96

97 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Πιο αναλυτικά: Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GM αποικιών Σε συγκέντρωση 60 ng/ml, η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β δεν ήταν τοξική μιας και ο αριθμός των CFU-GM ήταν ισοδύναμος με του μάρτυρα (94 ± 15 έναντι 96 ± 17). Αυξανόμενες συγκεντρώσεις, 600 και 6000 ng/ml, προκάλεσαν μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση τοξικότητα οδηγώντας σε σημαντική μείωση του αριθμού των CFU-GM συγκριτικά με το μάρτυρα (86 ± 16 και 77 ± 14 έναντι 96 ± 17, p = 0,036 και 0,008 αντίστοιχα). Σε αντίθεση με τη δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, τα νεότερα αντιμυκητιασικά δεν εμφάνισαν καμία τοξικότητα σε όλες τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν. Επιπλέον, συγκριτικά με το μάρτυρα, ο αριθμός των CFU-GM αυξήθηκε σημαντικά σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν τη λιποσωμική αμφοτερικίνη Β (6, 60, 600 και 6000 ng/ml: 108 ± 16, 113 ± 17, 117 ± 17 και 116 ± 18 έναντι 96 ± 17, p = 0,003, 0,0008, 0,0004 και 0,0008 αντίστοιχα), ή τη βορικοναζόλη (4, 20, 100 και 500 ng/ml: 111 ± 18, 110 ± 17, 119 ± 19 και 110 ± 18 έναντι 96 ± 17, p = 0,007, 0,001, 0,0006 και 0,03 αντίστοιχα), ή την κασποφουγκίνη (0,4, 2, 10 και 50 ng/ml: 107 ± 17, 114 ± 16, 111 ± 15 και 113 ± 15 έναντι 96 ± 17, p = 0,0002, 0,005, 0,002 και 0,011 αντίστοιχα), (Εικόνα ). 97

98 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό μεταβολής αριθμού CFU-GM συγκριτικά με μάρτυρα (%) Εικόνα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU-GM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01, *** = p<0,001). Figure Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-GM colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human mobilized peripheral blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01, *** = p<0.001). 98

99 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό του συνόλου των BFU-E και CFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός του συνόλου των BFU-E και CFU-E αποικιών δε διέφερε σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα, εκτός από μια σημαντική μείωσή του, κατά 26%, με την προσθήκη των 6000 ng/ml της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β (48 ± 9 έναντι 65 ± 12, p = 0,019) και μια σημαντική αύξησή του, κατά 11 ή 8% αντίστοιχα, με την προσθήκη των 500 ng/ml της βορικοναζόλης ή των 2 ng/ml της κασποφουγκίνης (72 ± 13 ή 70 ± 12 έναντι 65 ± 12, p = 0,003 ή 0,027 αντίστοιχα), (Διάγραμμα ). Πιο αναλυτικά: Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των BFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των BFU-E αποικιών δε διέφερε σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα, εκτός από μια σημαντική μείωσή του, κατά 24%, στα 6000 ng/ml της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β (45 ± 8 έναντι 59 ± 11, p = 0,018) και μια σημαντική αύξησή του, κατά 8%, στα 500 ng/ml της βορικοναζόλης (64 ± 11 έναντι 59 ± 11, p = 0,006), (Διάγραμμα ) Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των CFU-E αποικιών δε διέφερε σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα, εκτός από μια σημαντική μείωσή του, κατά 57%, με τα 6000 ng/ml της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β (3 ± 1 έναντι 7 ± 1, p = 0,025), (Διάγραμμα ). 99

100 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στο συνολικό αριθμό των αποικιών ερυθροκυττάρων συγκριτικά με το μάρτυρα, διαμορφούμενου από τις συνεισφορές των επιμέρους κατηγοριών αποικιών ερυθροκυττάρων, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01). Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the total number of erythrocyte colonies comparatively with the control, shaped by the contributions of the individual erythrocyte colony classes, in semisolid cultures of human mobilized peripheral blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01). 100

101 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των BFU- E αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01). Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of BFU-E colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human mobilized peripheral blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Twodependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01). 101

102 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU- E αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05). Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-E colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human mobilized peripheral blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Twodependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05). 102

103 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GEMM αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των CFU-GEMM αποικιών ήταν παρόμοιος με του μάρτυρα, (Διάγραμμα ). Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU- GEMM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων κινητοποιημένου περιφερικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων. Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-GEMM colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human mobilized peripheral blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Twodependent-paired-samples Student s t test. 103

104 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των αποικιών προερχόμενων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα ομφαλιοπλακουντικού αίματος Η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β δε φαίνεται να είχε πραγματική δράση στα αιμοποιητικά κύτταρα σε όλες τις ελεγχθείσες συγκεντρώσεις, μιας και επέφερε μη στατιστικά σημαντική μεταβολή του αριθμού του συνόλου των αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα (60, 600 και 6000 ng/ml: 95 ± 9, 82 ± 5 και 72 ± 8 έναντι 89 ± 8 αντίστοιχα). Καμιά συγκέντρωση των νεότερων αντιμυκητιασικών που ελέγχθηκε δεν προκάλεσε τοξικότητα. Επιπλέον, σε σύγκριση με το μάρτυρα που δεν περιείχε αντιμυκητιασικά, σημαντική αύξηση του αριθμού των αποικιών παρατηρήθηκε σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν τη λιποσωμική αμφοτερικίνη Β (6, 60, 600 και 6000 ng/ml: 118 ± 10, 119 ± 12, 135 ± 11 και 135 ± 12 έναντι 89 ± 8, p = 0,004, 0,018, 0,01 και 0,016 αντίστοιχα), ή τη βορικοναζόλη (4, 20, 100 και 500 ng/ml: 114 ± 16, 123 ± 11, 132 ± 12 και 127 ± 11 έναντι 89 ± 8, p = 0,043, 0,007, 0,001 και 0,001 αντίστοιχα), ή την κασποφουγκίνη (0,4, 2, 10 και 50 ng/ml: 113 ± 11, 123 ± 14, 140 ± 16 και 126 ± 16 έναντι 89 ± 8, p = 0,001, 0,005, 0,007 και 0,035 αντίστοιχα), (Εικόνα 4.2.3). 104

105 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό μεταβολής αριθμού αποικιών συγκριτικά με μάρτυρα (%) Εικόνα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στο συνολικό αριθμό των αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, διαμορφούμενου από τις συνεισφορές των επιμέρους κατηγοριών αποικιών, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλιοπλακουντικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p 0,01, *** = p=0,001). Figure Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the total number of colonies comparatively with the control, shaped by the contributions of the individual colony classes, in semisolid cultures of human umbilical cord blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p 0.01, *** = p=0.001). 105

106 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Πιο αναλυτικά: Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GM αποικιών Σε συγκέντρωση 60 ng/ml, η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β δεν ήταν τοξική μιας και ο αριθμός των CFU-GM ήταν ισοδύναμος με του μάρτυρα (62 ± 6 έναντι 63 ± 7). Αυξανόμενες συγκεντρώσεις, 600 και 6000 ng/ml, προκάλεσαν μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση τοξικότητα οδηγώντας σε σημαντική μείωση του αριθμού των CFU-GM συγκριτικά με το μάρτυρα (51 ± 6 και 46 ± 6 έναντι 63 ± 7, p = 0,046 και 0,035 αντίστοιχα). Σε αντίθεση με τη δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, τα νεότερα αντιμυκητιασικά δεν εμφάνισαν καμία τοξικότητα σε όλες τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν. Επιπλέον, συγκριτικά με το μάρτυρα, ο αριθμός των CFU-GM αυξήθηκε σημαντικά σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν τη λιποσωμική αμφοτερικίνη Β (6, 60, 600 και 6000 ng/ml: 81 ± 8, 85 ± 9, 100 ± 7 και 94 ± 7 έναντι 63 ± 7, p = 0,006, 0,006, 0,005 και 0,005 αντίστοιχα), ή τη βορικοναζόλη (4, 20, 100 και 500 ng/ml: 84 ± 11, 93 ± 9, 96 ± 9 και 90 ± 9 έναντι 63 ± 7, p = 0,029, 0,0006, 0,001 και 0,002 αντίστοιχα), ή την κασποφουγκίνη (0,4, 2, 10 και 50 ng/ml: 80 ± 7, 89 ± 11, 105 ± 11 και 86 ± 11 έναντι 63 ± 7, p = 0,00002, 0,004, 0,003 και 0,046 αντίστοιχα), (Εικόνα ). 106

107 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό μεταβολής αριθμού CFU-GM συγκριτικά με μάρτυρα (%) Εικόνα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU-GM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλιοπλακουντικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05, ** = p<0,01, *** = p 0,001). Figure Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-GM colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human umbilical cord blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05, ** = p<0.01, *** = p 0.001). 107

108 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό του συνόλου των BFU-E και CFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός του συνόλου των BFU-E και CFU-E αποικιών δε διέφερε σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα, εκτός από μια σημαντική αύξησή του, κατά 29 και 24% αντίστοιχα, με την προσθήκη των 0,4 και 2 ng/ml της κασποφουγκίνης (22 ± 6 και 21 ± 3 έναντι 17 ± 4, p = 0,042 και 0,037 αντίστοιχα) και μια αύξησή του με οριακή στατιστική σημαντικότητα, κατά 59%, με την προσθήκη των 50 ng/ml της κασποφουγκίνης (27 ± 6 έναντι 17 ± 4, p = 0,055), (Διάγραμμα ). Πιο αναλυτικά: Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των BFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των BFU-E αποικιών δε διέφερε σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα, εκτός από μια αύξησή του με οριακή στατιστική σημαντικότητα, κατά 31%, στα 0,4 ng/ml της κασποφουγκίνης (21 ± 5 έναντι 16 ± 4, p = 0,059), (Διάγραμμα ) Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-E αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των CFU-E αποικιών ήταν παρόμοιος με του μάρτυρα (Διάγραμμα ). 108

109 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στο συνολικό αριθμό των αποικιών ερυθροκυττάρων συγκριτικά με το μάρτυρα, διαμορφούμενου από τις συνεισφορές των επιμέρους κατηγοριών αποικιών ερυθροκυττάρων, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλιοπλακουντικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων (* = p<0,05). Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the total number of erythrocyte colonies comparatively with the control, shaped by the contributions of the individual erythrocyte colony classes, in semisolid cultures of human umbilical cord blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Two-dependent-paired-samples Student s t test (* = p<0.05). 109

110 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των BFU-E αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλιοπλακουντικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων. Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of BFU-E colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human umbilical cord blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Twodependent-paired-samples Student s t test. 110

111 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU-E αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλιοπλακουντικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων. Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-E colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human umbilical cord blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Twodependent-paired-samples Student s t test. 111

112 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Επίδραση των αντιμυκητιασικών στον αριθμό των CFU-GEMM αποικιών Σε όλες τις καλλιέργειες που περιείχαν αντιμυκητιασικά, ο αριθμός των CFU-GEMM αποικιών δε διέφερε σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα, εκτός από μια αύξησή του με οριακή στατιστική σημαντικότητα, κατά 33%, με τα 500 ng/ml της βορικοναζόλης (16 ± 4 έναντι 12 ± 3, p = 0,052), (Διάγραμμα ). Διάγραμμα Επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β, της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στον αριθμό των CFU- GEMM αποικιών συγκριτικά με το μάρτυρα, σε ημιστερεές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλιοπλακουντικού αίματος ανθρώπων παρουσία ενός κοκτέιλ κυτοκινών. Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 5 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Student s t έλεγχος δύο εξαρτημένων κατά ζεύγη δειγμάτων. Diagram Effect of increasing concentrations of amphotericin B deoxycholate, liposomal amphotericin B, voriconazole and caspofungin on the number of CFU-GEMM colonies comparatively with the control, in semisolid cultures of human umbilical cord blood hematopoietic cells in the presence of a cytokine cocktail. Mean ± standard error from 5 independent experiments in duplicate. Twodependent-paired-samples Student s t test. 112

113 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου 4.3 Παρακολούθηση ύπαρξης μυκήτων Δεν ανιχνεύθηκαν μύκητες σε όλες τις καλλιέργειες που εξετάστηκαν (Εικόνα 2). Συμπέρασμα Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, η βορικοναζόλη και η κασποφουγκίνη όχι μόνο δεν είναι τοξικές για τα ανθρώπινα αιμοποιητικά κύτταρα αλλά επίσης αυξάνουν τον αριθμό των CFU-GM αποικιών στις καλλιέργειες που τις περιέχουν, σε αντίθεση με την τοξική δράση της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης Β. Eπιδρούν λοιπόν σε συγκεκριμένη κυτταρική σειρά (λευκή) διεγείροντας τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα αυτής (CFU-GM) να ξεκινήσουν τη διαδικασία του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης με αποτέλεσμα τη δημιουργία αποικιών ώριμων κυττάρων (κοκκιοκυττάρων μακροφάγων). Επιπλέον, αυτά τα δεδομένα μαρτυρούν ότι τα συγκεκριμένα νεότερα αντιμυκητιασικά επάγουν σχηματισμό αποικιών σε καλλιέργειες ανθρώπινων αιμοποιητικών κυττάρων που δε διαμεσολαβείται από την παρεμπόδιση της ενδεχόμενης ανάπτυξης μυκήτων. 5. Δράση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης στην αιμοποίηση in vivo Για να διαπιστωθεί αν τα νεότερα αντιμυκητιασικά έχουν παρόμοια δράση in vivo, διεξήχθησαν σε ποντίκια, αρχικά, προκαταρκτικά πειράματα για τον καθορισμό των χορηγούμενων δόσεων των αντιμυκητιασικών και, στη συνέχεια, κύρια πειράματα μελέτης της επίπτωσης αυτών των δόσεων στον αριθμό των κοκκιοκυττάρων. 113

114 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου 5.1 Επιλογή των προς χορήγηση δόσεων της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης Για τον έλεγχο της τοξικότητας και της ανεκτικότητας των νεότερων αντιμυκητιασικών μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγησή τους σε ποντίκια, έγινε φαρμακοκινητική μελέτη η οποία περιελάμβανε τη μέτρηση των ελάχιστων επιπέδων (trough) στο αίμα διάφορων δόσεων με τη μικροβιολογική μέθοδο προσδιορισμού συγκέντρωσης φαρμάκου με διάχυση σε άγαρ. Παράλληλα, παρακολουθούνταν η εμφάνιση συμπτωμάτων τοξικότητας σε αυτά τα ποντίκια. Ακολούθησε παρατήρηση ορατών συμπτωμάτων τοξικότητας σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια Φαρμακοκινητική Τα ελάχιστα επίπεδα (trough) των 2,5, 5, 10, 20 και 40 mg/kg της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, των 40 και 80 mg/kg της βορικοναζόλης και των 1, 2, 4, 8 και 16 mg/kg της κασποφουγκίνης, όπως προσδιορίστηκαν, με τη βοήθεια των αντίστοιχων πρότυπων καμπυλών, από τις μετρηθείσες διαμέτρους των αντίστοιχων ζωνών αναστολής που δημιούργησαν, βρέθηκαν να είναι 0,44, 0,57, 0,96, 2,41 ± 0,32 και 5,94 mg/l, αντίστοιχα, για τη λιποσωμική αμφοτερικίνη Β, 0,6 και 4,5 mg/l, αντίστοιχα, για τη βορικοναζόλη και 0,55 ± 0,05, 1,1 ± 0,1, 2 ± 0,82, 4,83 ± 0,83 και 9,66 ± 1,66 mg/l, αντίστοιχα, για την κασποφουγκίνη (Εικόνα 5.1.1). 114

115 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου α Λιποσωμική αμφοτερικίνη Β β Χορηγηθείσα δόση σε ποντίκια (mg/kg) γ Συγκέντρωση σε ορό αίματος (άγνωστα ή γνωστά δείγματα) (mg/l) 2, ,5 ± 0, ,25 8 0,5 11, Διάμετρος ζώνης αναστολής μυκητικής ανάπτυξης (mm) δ 115

116 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου α Βορικοναζόλη β Χορηγηθείσα δόση σε ποντίκια (mg/kg) γ Συγκέντρωση σε ορό αίματος (άγνωστα ή γνωστά δείγματα) (mg/l) ,5 0,2 10 0,5 15,5 1 18,5 4 24, Διάμετρος ζώνης αναστολής μυκητικής ανάπτυξης (mm) δ 116

117 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου α Κασποφουγκίνη β Χορηγηθείσα δόση σε ποντίκια (mg/kg) γ Συγκέντρωση σε ορό αίματος (άγνωστα ή γνωστά δείγματα) (mg/l) 1 12,1 ± 0,1 2 13,1 ± 0, ± 0,4 8 15,3 ± 0, ,4 ± 0,1 0, Διάμετρος ζώνης αναστολής μυκητικής ανάπτυξης (mm) δ 117

118 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Εικόνα Δημιουργία ζώνης αναστολής γύρω από κάθε γνωστή ή άγνωστη συγκέντρωση κάθε αντιμυκητιασικού (α), μέτρηση των διαμέτρων αυτών (β), κατασκευή των πρότυπων καμπυλών (γ) και προσδιορισμός, βάσει αυτών, των συγκεντρώσεων των άγνωστων δειγμάτων (δ). Μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από 2 ανεξάρτητα διπλά πειράματα. Figure Formation of inhibition zone around every known or unknown concentration of each antifungal (a), measurement of their diameters (b), construction of the standard curves (c) and quantification, based on these, of the concentrations of the unknown samples (d). Mean ± standard error from 2 independent experiments in duplicate Παρακολούθηση τοξικότητας Ταυτόχρονη παρατήρηση τυχόν εμφανών σημείων τοξικότητας των παραπάνω δόσεων των νεότερων αντιμυκητιασικών, κατά τη διάρκεια και μετά το πέρας των χορηγήσεων της φαρμακοκινητικής μελέτης, έδειξε ότι όλες οι δόσεις των τριών φαρμάκων ήταν γενικώς καλά ανεκτές (χωρίς εμφανή σημεία τοξικότητας) Παρακολούθηση τοξικότητας σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια Μετέπειτα παρατήρηση τυχόν εμφανών σημείων τοξικότητας των αντιμυκητιασικών, κατά τη διάρκεια και μετά το τέλος των χορηγήσεων αυτών σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, έδειξε ότι οι μέγιστες καλά ανεκτές δόσεις της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης ήταν τα 15, 60 και 8 mg/kg αντίστοιχα. Συμπέρασμα Αυτά τα δεδομένα συνηγορούν υπέρ της επιλογής των 15 mg/kg της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, των 60 mg/kg της βορικοναζόλης και των 8 mg/kg της κασποφουγκίνης, ως ασφαλών ενδοπεριτοναϊκώς χορηγούμενων δόσεων σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια για περίπου 1 μήνα, για τη διεξαγωγή των κύριων in vivo πειραμάτων. 118

119 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου 5.2 Επίδραση της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και της κασποφουγκίνης, μόνων ή μαζί με τον G-CSF, στην ανάκαμψη των κοκκιοκυττάρων σε ποντίκια μετά από υποθανάτια ακτινοβόληση Για να εξακριβωθεί αν υπάρχει αντιστοιχία της παρατηρηθείσας in vitro δράσης των νεότερων αντιμυκητιασικών με ανάλογη in vivo δράση αυτών στην αιμοποίηση, εκτελέστηκαν πειράματα προσδιορισμού του απόλυτου αριθμού των κοκκιοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές σε υποθανατίως ακτινοβολημένα ποντίκια, τα οποία δε λάμβαναν κάποιον παράγοντα ή λάμβαναν ένα εκ των τριών αντιμυκητιασικών μόνο του, στην επιλεχθείσα από τα προηγούμενα προκαταρκτικά πειράματα δόση, ή G-CSF μόνο του, ή συνδυασμό του G-CSF με ένα εκ των τριών φαρμάκων Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των κοκκιοκυττάρων των ποντικών 5.2.1). Τα κοκκιοκύτταρα ανιχνεύτηκαν με κυτταρομετρία ροής με το αντίσωμα Gr-1 (Εικόνα 4 η ημέρα πριν την ακτινοβόληση 13 η ημέρα μετά την ακτινοβόληση 119

120 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου 27 η ημέρα μετά την ακτινοβόληση μάρτυρας αντιμυκητιασικό G-CSF G-CSF + αντιμυκητιασικό Εικόνα Αντιπροσωπευτικά στικτογράμματα του αριθμού των κοκκιοκυττάρων που παρατηρήθηκε στις ομάδες των ποντικών με κυτταρομετρία ροής σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές. Figure Representative dot plots of the number of granulocytes that was observed in the groups of mice by flow cytometry at specific time points. 120

121 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Καταμέτρηση κοκκιοκυττάρων των ποντικών Η δράση των αντιμυκητιασικών ελέγχθηκε μέσω του αριθμού των κοκκιοκυττάρων που παρατηρήθηκε κατά την ανάκαμψη στα ποντίκια που τους χορηγήθηκαν Επίδραση των νεότερων αντιμυκητιασικών μόνων Η εφαρμογή της υποθανάτιας δόσης των 5 Gy οδήγησε στην πτώση του αριθμού των κοκκιοκυττάρων, ο οποίος και παρέμεινε πολύ χαμηλός από την ημέρα 3 έως την ημέρα 13 μετά την ακτινοβόληση στις ομάδες που έλαβαν κασποφουγκίνη, ή βορικοναζόλη, ή λιποσωμική αμφοτερικίνη Β και στους αντίστοιχους μάρτυρες [ημέρες 4, 3, 6, 9, 13: (κασποφουγκίνη) 1087 ± 103 έναντι 1213 ± 85, 295 ± 54 έναντι 237 ± 45, 143 ± 34 έναντι 162 ± 30, 185 ± 62 έναντι 161 ± 29, 124 ± 19 έναντι 86 ± 15, ή (βορικοναζόλη) 1339 ± 173 έναντι 1331 ± 146, 188 ± 23 έναντι 194 ± 29, 196 ± 46 έναντι 193 ± 34, 398 ± 111 έναντι 346 ± 72, 75 ± 47 έναντι 96 ± 37, ή (λιποσωμική αμφοτερικίνη Β) 1198 ± 91 έναντι 1190 ± 94, 147 ± 18 έναντι 121 ± 17, 116 ± 25 έναντι 162 ± 36, 139 ± 57 έναντι 188 ± 57, 74 ± 5 έναντι 120 ± 34, αντίστοιχα]. Κατά την ανάκαμψη, ο αριθμός των κοκκιοκυττάρων δε διέφερε σημαντικά ανάμεσα στις ομάδες που έλαβαν φάρμακο και στους αντίστοιχους μάρτυρες [ημέρες 16, 20, 23, 27: (κασποφουγκίνη) 187 ± 32 έναντι 158 ± 20, 363 ± 75 έναντι 295 ± 37, 736 ± 64 έναντι 565 ± 79, 1406 ± 100 έναντι 1101 ± 169, ή (βορικοναζόλη) 367 ± 115 έναντι 205 ± 42, 576 ± 138 έναντι 520 ± 94, 929 ± 181 έναντι 959 ± 165, 1352 ± 219 έναντι 1180 ± 171, ή (λιποσωμική αμφοτερικίνη Β) 224 ± 55 έναντι 233 ± 32, 450 ± 27 έναντι 435 ± 92, 855 ± 23 έναντι 843 ± 174, 1340 ± 39 έναντι 1324 ± 287, αντίστοιχα], (Εικόνα 5.2.2) Επίδραση των νεότερων αντιμυκητιασικών σε συνδυασμό με τον G-CSF Η υποθανάτια ακτινοβόληση προκάλεσε την ελάττωση του αριθμού των κοκκιοκυττάρων, ο οποίος και διατηρήθηκε σε πολύ χαμηλά επίπεδα από την ημέρα 3 έως την ημέρα 13 μετά την εφαρμογή της στις ομάδες που έλαβαν κασποφουγκίνη, ή βορικοναζόλη, ή λιποσωμική αμφοτερικίνη Β σε συνδυασμό με G-CSF και στις αντίστοιχες 121

122 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου που έλαβαν μόνο G-CSF [ημέρες 4, 3, 6, 9, 13: (κασποφουγκίνη + G-CSF) 1099 ± 65 έναντι 1192 ± 84, 226 ± 35 έναντι 242 ± 39, 142 ± 20 έναντι 106 ± 12, 81 ± 16 έναντι 83 ± 16, 239 ± 53 έναντι 119 ± 19, ή (βορικοναζόλη + G-CSF) 1364 ± 118 έναντι 1338 ± 91, 184 ± 22 έναντι 207 ± 30, 111 ± 21 έναντι 147 ± 26, 127 ± 52 έναντι 181 ± 65, 89 ± 21 έναντι 105 ± 27, ή (λιποσωμική αμφοτερικίνη Β + G-CSF) 1186 ± 124 έναντι 1176 ± 224, 237 ± 38 έναντι 149 ± 22, 65 ± 26 έναντι 105 ± 22, 80 ± 10 έναντι 116 ± 33, 89 ± 16 έναντι 129 ± 41, αντίστοιχα], (Εικόνα 5.2.2). Κατά την ανάκαμψη, η συγχορήγηση του G-CSF και της κασποφουγκίνης, συγκριτικά με τη λήψη μόνο του G-CSF, οδήγησε σε σημαντική αύξηση του αριθμού των κοκκιοκυττάρων τις ημέρες 13 (239 ± 53 έναντι 119 ± 19, p = 0,037), 20 (2145 ± 395 έναντι 1029 ± 131, p = 0,01) και 23 (3213 ± 370 έναντι 1736 ± 270, p = 0,003), ενώ επίσης υψηλότερες αλλά μη στατιστικά σημαντικές ήταν οι μετρήσεις των ημερών 16 (622 ± 82 έναντι 454 ± 89) και 27 (2697 ± 257 έναντι 2125 ± 216), (Εικόνα 5.2.2α). Ο συνδυασμός της βορικοναζόλης με τον G-CSF αύξησε, κατά τη διάρκεια της ανάκαμψης, τον αριθμό των κοκκιοκυττάρων σε όλα τα χρονικά σημεία μετά την ημέρα 16, σε σύγκριση με τον G-CSF μόνο του, αλλά αυτή η αύξηση δεν ήταν στατιστικά σημαντική (ημέρες 16, 20, 23, 27: 776 ± 212 έναντι 728 ± 189, 1805 ± 505 έναντι 1416 ± 279, 2255 ± 449 έναντι 1757 ± 264, 2510 ± 456 έναντι 1864 ± 204, αντίστοιχα), (Εικόνα 5.2.2β). Μη σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε, κατά την ανάκαμψη, μεταξύ των ομάδων που έλαβαν συνδυασμό της λιποσωμικής αμφοτερικίνης Β με τον G-CSF και G-CSF μόνο του (ημέρες 16, 20, 23, 27: 738 ± 28 έναντι 723 ± 146, 1329 ± 211 έναντι 1313 ± 223, 1743 ± 574 έναντι 1514 ± 188, 2614 ± 692 έναντι 2419 ± 353, αντίστοιχα), (Εικόνα 5.2.2γ) Επίδραση του G-CSF μόνου Καθώς προειπώθηκε, τις πρώτες 2 εβδομάδες μετά την εφαρμογή της υποθανάτιας δόσης ακτινοβολίας, ο αριθμός των κοκκιοκυττάρων ήταν πολύ μικρός, όπως συνέβη και στις άλλες ομάδες. Κατά τη διάρκεια της ανάκαμψης, όπως αναμενόταν , ο αριθμός αυτός ήταν σημαντικά υψηλότερος σε όλες τις χρονικές στιγμές μετά την ημέρα 13, συγκριτικά με το μάρτυρα (ημέρες 16, 20, 23, 27 της εικόνας 5.2.2α ή β ή γ: p = 0,004, 0,000022, 0,0007, 0,001 ή 0,02, 0,009, 0,022, 0,02 ή 0,007, 0,003, 0,02, 0,049 αντίστοιχα), (Εικόνα 5.2.2). 122

123 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό αύξησης αριθμού κοκκιοκυττάρων (%) 123

124 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό αύξησης αριθμού κοκκιοκυττάρων (%) 124

125 Διδακτορική διατριβή Αποτελέσματα Μαρία Σαμαλίδου Ποσοστό αύξησης αριθμού κοκκιοκυττάρων (%) 125